專利名稱：生長(zhǎng)因子的治療用途和特別用于內(nèi)膜增生治療的輸送裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)因子的治療應(yīng)用，尤其涉及血管內(nèi)膜增生和其它病癥特別是高血壓的治療和預(yù)防。本發(fā)明也涉及能用于輸送活性劑的一種裝置。
背景技術(shù)：
內(nèi)膜增生是血管內(nèi)皮和內(nèi)彈性膜之間、尤其是在內(nèi)膜層中或動(dòng)脈中的細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)。內(nèi)膜增生通常是由血管壁中的平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖引起的。
當(dāng)發(fā)生內(nèi)膜增生時(shí)，可導(dǎo)致內(nèi)膜層或管壁的從頭增厚，即狹窄。于是，血管壁可變?yōu)殚]塞。
同樣，當(dāng)血管中的梗阻被清除后，手術(shù)后發(fā)生的內(nèi)膜增生可導(dǎo)致動(dòng)脈再次變?yōu)殚]塞。這被稱為再狹窄。
當(dāng)手術(shù)期間血管例如動(dòng)脈變形或被干擾時(shí)，通常發(fā)生動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。例如，通常在進(jìn)行將靜脈與動(dòng)脈吻合的旁路移植物移植之后以及外科吻合術(shù)之后，內(nèi)膜增生能導(dǎo)致從頭狹窄。能引起狹窄的手術(shù)方法的兩個(gè)實(shí)例是冠狀旁路移植和膝上股-動(dòng)脈旁路移植。
同樣，用于清除血管中梗阻的氣囊血管成形術(shù)方法例如氣囊血管成形術(shù)方法之后可發(fā)生再狹窄。
內(nèi)膜增生是否在不同手術(shù)方法之后導(dǎo)致狹窄和再狹窄，至今仍是一個(gè)主要問題。
動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病是歐洲和北美洲死亡的最主要的原因，并引起非常顯著的發(fā)病率，它是由阻止或減少血流的動(dòng)脈腔閉塞、疊加于動(dòng)脈粥樣斑之上的血栓、以及導(dǎo)致動(dòng)脈瘤膨脹和最終破裂的末梢栓塞、動(dòng)脈壁消弱所引起的。根據(jù)部位和疾病的分布，存在治療的幾個(gè)選擇，動(dòng)脈旁路移植是最常用的外科干預(yù)方法。對(duì)于冠狀動(dòng)脈疾病，現(xiàn)在這已成為最常用的外科方法，在美國(guó)自1990年以來每年進(jìn)行＞200,000例手術(shù)，在英國(guó)每年進(jìn)行＞20,000例手術(shù)。在主動(dòng)脈、腎、腸系膜和外周血管中，外科旁路療法的負(fù)擔(dān)繼續(xù)增加，在美國(guó)和歐洲手術(shù)率為每100,000人口中35-70例。結(jié)合起來，每年進(jìn)行的外科旁路療法的數(shù)量接近100萬。
在手術(shù)后的前24個(gè)月中，有非常顯著數(shù)量的動(dòng)脈旁路移植失敗(閉塞)。引用的數(shù)值范圍從20％到30％。這意味著對(duì)于每年在英國(guó)進(jìn)行的所有心臟和外周動(dòng)脈旁路療法(大約25,000-30,000例)，預(yù)期兩年內(nèi)有6,000到7,000例失敗?！爸刈?re-do)”方法的失敗率甚至更高。失敗的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用同樣如此，據(jù)計(jì)算在美國(guó)，冠狀療法后失敗率甚至從33％到25％的適度降低就可從衛(wèi)生保健預(yù)算中節(jié)省7.5億美元。
手術(shù)后5年內(nèi)移植失敗有三個(gè)主要原因。第一個(gè)被認(rèn)為是在手術(shù)的30天內(nèi)較早發(fā)生(＜5％)，代表技術(shù)錯(cuò)誤(例如不良的吻合技術(shù))。24個(gè)月之后的較晚時(shí)期的失敗通常是最初動(dòng)脈粥樣硬化過程發(fā)展的結(jié)果。然而，正是1到24個(gè)月之間閉塞的那些移植物造成了大多數(shù)的失敗(＜70％)。在這些情況中，由SMC內(nèi)膜增生引起動(dòng)脈腔的進(jìn)行性收縮，即狹窄，最終導(dǎo)致完全閉塞。一般地，SMC內(nèi)膜增生位于遠(yuǎn)端動(dòng)脈吻合處周圍和與吻合處相對(duì)的天然血管壁周圍。因此這是在此部位的主要病理，而不是如血管成形術(shù)后可發(fā)生的在以前內(nèi)膜增生部位的再狹窄。SMC內(nèi)膜增生可發(fā)生于更近端的動(dòng)脈吻合處，并沿移植物本身發(fā)生。
血管成形術(shù)后的再狹窄可導(dǎo)致甚至更高的失敗率，在血管成形術(shù)后的前6個(gè)月中為20％到50％。狹窄和再狹窄都是手術(shù)后留下的主要問題。
迄今為止，已測(cè)試了許多治療或預(yù)防內(nèi)膜增生的方法，但沒有一種是臨床上滿意的。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是天然發(fā)生的蛋白質(zhì)。在人類中，至少存在121個(gè)、165個(gè)、189個(gè)和206個(gè)氨基酸的四種形式。Houck等人，分子內(nèi)分泌學(xué)(Molecular Endocrinology)(1991)卷5，12號(hào)，1806-1814頁，發(fā)表了四種形式的人VEGF的cDNA和氨基酸序列。也發(fā)表了部分基因組序列。Leung等人，科學(xué)(1989)2461306-1309中，也發(fā)表了人VEGF的cDNA序列，以及牛VEGF的cDNA序列。
這四種形式在此被稱為VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189和VEGF-206。應(yīng)當(dāng)理解該編號(hào)指每一例子中成熟蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量。翻譯后的蛋白質(zhì)也包括26個(gè)氨基酸的前序列，實(shí)際上該前序列在細(xì)胞內(nèi)加工期間被切除。
已知VEGF在血管生成中起作用，它刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的分裂，提高內(nèi)皮的通透性，并在視網(wǎng)膜血管中充當(dāng)內(nèi)皮“存活因子”。例如，重組蛋白形式的VEGF或當(dāng)從質(zhì)粒中表達(dá)時(shí)，VEGF在向缺血肢動(dòng)脈內(nèi)注射后能誘導(dǎo)新血管的發(fā)育。這一特性能使其應(yīng)用于修復(fù)在手術(shù)中損傷了內(nèi)皮的動(dòng)脈。因此，Asahara等人，循環(huán)(Circulation)(1995)912793，在使動(dòng)脈內(nèi)皮裸露的血管成形術(shù)后將VEGF通過插管輸送至大鼠頸動(dòng)脈的內(nèi)部；發(fā)現(xiàn)VEGF刺激該動(dòng)脈的再內(nèi)皮化(reendothelialisation)，這隨后似乎有助于內(nèi)膜增生的抑制。
WO-A-9013649公開了VEGF蛋白質(zhì)和基因，并提出了其用于治療血管上皮創(chuàng)傷、糖尿病潰瘍和血管創(chuàng)傷的用途。WO-A-9102058中描述了VEGF片段，以及它們?cè)谘苌珊蛢?nèi)血管表面再內(nèi)皮化例如在潰瘍的治療中的應(yīng)用。
GB-A-2298577公開了用于動(dòng)靜脈旁路移植療法的一種非限制性的、有孔的、外用斯滕特印模。該斯滕特印模具有對(duì)腔的大小及對(duì)中間和內(nèi)膜增厚的有利作用。
WO-A-9423668公開了一種將試劑局部輸送至血管內(nèi)的裝置，包括一個(gè)在其兩個(gè)元件之間形成的儲(chǔ)存器。其應(yīng)用需要植入，即切開血管然后將該裝置固定于血管壁。該裝置是部分有孔的。其儲(chǔ)存器與腔內(nèi)血流直接接觸。這具有感染的危險(xiǎn)。
US-A-3797485公開了一種將藥物輸送至血管外膜表面的裝置。其具有永久壁和用于輸送液體形式藥物的透皮管。目的是藥物應(yīng)通至另一部位。
發(fā)明概述本發(fā)明設(shè)法治療和/或預(yù)防上述所有病癥，因?yàn)樗鼈冇蓛?nèi)膜增生所引起。令人吃驚地，已鑒定了VEGF的性質(zhì)，表明它能用來在不同方面對(duì)抗內(nèi)膜增生。
將一個(gè)套環(huán)放置于兔動(dòng)脈的外部周圍。這種方法通常引起兔動(dòng)脈中的內(nèi)膜增生，導(dǎo)致動(dòng)脈壁的增厚，這類似于分流手術(shù)后人動(dòng)脈中發(fā)生的狹窄。當(dāng)將套環(huán)用于使用質(zhì)粒/脂質(zhì)體載體向動(dòng)脈壁輸送編碼VEGF的DNA時(shí)，VEGF基因在動(dòng)脈壁中包括內(nèi)皮層中過量表達(dá)。內(nèi)膜增生被抑制。已發(fā)現(xiàn)外膜套環(huán)適用于所有測(cè)試的基因輸送系統(tǒng)的動(dòng)脈基因轉(zhuǎn)移。
這證明VEGF除了在內(nèi)皮損傷的情況下刺激再內(nèi)皮化外，還能在當(dāng)內(nèi)皮完整或基本上完整時(shí)出現(xiàn)內(nèi)膜增生的情況下抑制內(nèi)膜增生。因此，它不僅可潛在地用于抑制血管成形術(shù)后的再狹窄，而且可用于預(yù)防或治療其它手術(shù)狀況中的從頭狹窄。因此在新發(fā)現(xiàn)和以前的發(fā)現(xiàn)之間存在著差異，以前發(fā)現(xiàn)VEGF刺激內(nèi)皮的再生長(zhǎng)或愈合。可能是新發(fā)現(xiàn)起因于VEGF作用的一種不同的機(jī)制。
此外，新發(fā)現(xiàn)證明，能將有效的試劑輸送到血管外部以治療內(nèi)膜增生。這有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。特別是，治療劑不會(huì)如腔內(nèi)輸送一樣被血流從增生部位洗去。一種輸送儲(chǔ)存器能保持于血管周圍，不需要損傷血管內(nèi)皮的任何腔內(nèi)操作(這些操作本身能引發(fā)內(nèi)膜增生)。
更具體而言，本發(fā)明使對(duì)抗SMC內(nèi)膜增生的試劑能直接用于動(dòng)脈壁的外膜表面(即最靠近外中膜內(nèi)的細(xì)胞)。使用的任何試劑能特異地應(yīng)用于最可能發(fā)展內(nèi)膜增生損傷的部位，因?yàn)檫@些部位在手術(shù)期間易于暴露。
VEGF通過僅在EC和單核細(xì)胞上表達(dá)的特異的高親和酪氨酸激酶受體flk-1/KDR和flt-1介導(dǎo)其已知的作用。不拘泥于理論，認(rèn)為VEGF在增生抑制中的作用也可能是通過相同的受體所介導(dǎo)的。因此，本發(fā)明也擴(kuò)展到與VEGF結(jié)合的受體的其它激動(dòng)劑、或具有相同作用機(jī)制的其它物質(zhì)在治療或預(yù)防內(nèi)膜增生中的應(yīng)用。與建議用于內(nèi)膜增厚治療的許多其它生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子相比，VEGF受體的特異定位也賦予VEGF的一個(gè)有利條件；VEGF的作用對(duì)EC更特異，因?yàn)樵诓淮嬖趩魏思?xì)胞時(shí)，動(dòng)脈壁中的高親和力VEGF受體只在EC上表達(dá)。
例如，已發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮完全地或基本上未損傷的情況下，內(nèi)膜增生的VEGF抑制機(jī)理至少部分地通過一氧化氮(NO)途徑，因?yàn)樵谏鲜鎏篆h(huán)模型中NO合成抑制劑L-NAME的施用抵消了VEGF對(duì)內(nèi)膜增生的作用。因此，VEGF刺激NO產(chǎn)生。
也可能是VEGF具有歸因于其抑制內(nèi)膜增生的其它生物學(xué)作用。特別是，已發(fā)現(xiàn)VEGF的過量表達(dá)刺激前列環(huán)素的產(chǎn)生、胞質(zhì)磷脂酶A2的激活和EC分泌馮威勒布蘭特因子。情況可能是VEGF對(duì)NO產(chǎn)生的刺激及其對(duì)前列環(huán)素產(chǎn)生的刺激協(xié)同作用抑制內(nèi)膜增生。
VEGF作用刺激NO和前列環(huán)素產(chǎn)生的發(fā)現(xiàn)也建議，VEGF和與VEGF結(jié)合的受體之激動(dòng)劑將用于其它NO相關(guān)的病癥和/或前列環(huán)素相關(guān)的病癥的治療。特別是，F(xiàn)orte等人，柳葉刀(1997)349837-42，顯示患高血壓的個(gè)體中NO水平低。因此VEGF可用于不同形式的高血壓的預(yù)防或治療。同樣，VEGF可用于動(dòng)脈粥樣硬化的治療。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，具有任何發(fā)現(xiàn)于VEGF的特定性質(zhì)的試劑，可用于治療或預(yù)防內(nèi)膜增生如狹窄的藥物的制造。該試劑可以以植入物的形式提供。更具體而言，該試劑刺激NO或前列環(huán)素的產(chǎn)生；它可以是與VEGF結(jié)合的受體的一種激動(dòng)劑，如VEGF本身或其片段，或可以是編碼這種激動(dòng)劑的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，用于向患者血管輸送治療劑的一種裝置，包括一個(gè)適合在血管周圍提供密封部分的主體，試劑保存于該裝置內(nèi)或與該裝置結(jié)合，以便在使用中該試劑能與血管的外膜表面接觸。該裝置可以是生物可降解的，并且不需要永久性的透皮輸送管。
發(fā)明描述如上建議的及實(shí)施例所示，多種試劑包括一氧化氮合成酶和編碼它的核酸均適合在本發(fā)明中的用途。該試劑在此通常被描述為VEGF蛋白質(zhì)或核酸，那些參照和VEGF本身的參照以實(shí)施例的方法給出。上述VEGF的任何形式可用于本發(fā)明的目的。
在此，這些VEGF蛋白質(zhì)序列的參照被認(rèn)為是指包含前序列的序列和缺少前序列的序列。含或不含前序列的VEGF蛋白質(zhì)都適合于本發(fā)明的實(shí)施。同樣，VEGF核酸(DNA和RNA)序列的參照涉及編碼前序列的序列和不編碼前序列的序列。
應(yīng)當(dāng)指出，Houck等人，出處同前，發(fā)表了VEGF-165的序列，其包含位點(diǎn)141的氨基酸天冬酰胺(N或Asn)(Houck等人的表示法中的115，其對(duì)應(yīng)于成熟蛋白質(zhì))。Houck等人指出此氨基酸在VEGF-121、VEGF-189和VEGF-206中是賴氨酸(K或Lys)，Houck等人引用的(VEGF-206的)cDNA序列支持了這一點(diǎn)。因此，在本發(fā)明中，位點(diǎn)141的氨基酸可以是天冬酰胺(N或Asn)或賴氨酸(Lys或K)。在本發(fā)明的核酸序列中每個(gè)氨基酸由適當(dāng)?shù)娜?lián)體密碼子所編碼(對(duì)于DNA，對(duì)賴氨酸密碼子可以是AAA或AAG，對(duì)于天冬酰胺是AAT或AAC)。這特別應(yīng)用于VEGF-165。
四種形式由相同的基因所編碼，但通過RNA水平上的不同剪接而產(chǎn)生。因此，存在一種全長(zhǎng)形式的人VEGF和三種已知的截短形式。VEGF-121和VEGF-165是可溶的，并且是分泌形式。同樣，26個(gè)氨基酸的前序列是疏水性的，并且認(rèn)為其降低蛋白質(zhì)的溶解性，因此，不含前序列的VEGF的形式是優(yōu)選的，因?yàn)轭A(yù)期它們有較高的溶解性。所有形式的VEGF都適于本發(fā)明的實(shí)施，盡管分泌形式是優(yōu)選的。適于本發(fā)明實(shí)施的VEGF蛋白質(zhì)也可來源于其它種，盡管人VEGF是優(yōu)選的。例如，已克隆了小鼠、兔和母牛的VEGF，其序列是可得到的。
對(duì)于參照，應(yīng)當(dāng)指出，VEGF-121、165、189和206在本領(lǐng)域中也被稱為VEGF-120、164、188和205。
VEGF蛋白質(zhì)和核酸(DNA和RNA)是用于本發(fā)明實(shí)施的合適的試劑。
當(dāng)使用VEGF蛋白質(zhì)時(shí)，具有SEQ ID No.2(VEGF-121)、4(VEGF-165)、6(VEGF-189)或8(VEGF-206)的氨基酸序列的VEGF蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。VEGF的分泌形式是優(yōu)選的，因此特別優(yōu)選的是VEGF-121和VEGF-165。
在本發(fā)明的實(shí)施中，優(yōu)選地使用編碼VEGF-121、VEGF-165、VEGF-189或VEGF-206的VEGF DNA，例如具有SEQ ID No.1、3、5或7的序列的VEGF DNA。編碼人VEGF的分泌形式的DNA序列是優(yōu)選的。因此，SEQ ID No.1和3的DNA序列是特別優(yōu)選的。
然而，適于本發(fā)明實(shí)施的VEGF DNA和蛋白質(zhì)不限于那些特定的序列。進(jìn)而，本發(fā)明也提供其它緊密相關(guān)的DNA和蛋白質(zhì)序列的應(yīng)用。
本發(fā)明的DNA序列可在許多方面與SEQ ID No.1、3、5或7的序列相關(guān)。例如，適于本發(fā)明實(shí)施的DNA序列可以是編碼SEQ ID No.2、4、6或8蛋白質(zhì)的相同蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)并序列。
另外，本發(fā)明的DNA序列可與SEQ ID No.1、3、5或7的序列基本上同源，并編碼這樣一種蛋白質(zhì)，其在氨基酸序列上不同于SEQ ID No.2、4、6或8的蛋白質(zhì)，但編碼具有VEGF活性的蛋白質(zhì)。一般地，用于本發(fā)明的DNA序列具有與SEQ ID No.1、3、5或7的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同源性。
同樣，用于本發(fā)明的VEGF DNA序列可編碼保留VEGF活性的VEGF的片段。即，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為至少15個(gè)氨基酸，例如可達(dá)40個(gè)或更多的氨基酸。合適的片段的實(shí)例是長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸，例如SEQ ID No.6所示的活性VEGF蛋白質(zhì)的序列1-20、11-30、21-40、31-50、41-60、51-70、61-80、71-90、81-100、91-110、101-120、111-130、121-140、131-150、141-160、151-170、161-180、171-190、181-200、191-210和196-215。
用于本發(fā)明的DNA序列可以是例如基因組DNA或cDNA或基因組DNA和cDNA的雜化物，或者它們可以是合成的或半合成的。它們可來源于任何種類的生物，盡管編碼人VEGF的DNA是優(yōu)選的。它們可以是單鏈或雙鏈的。編碼SEQ ID No.2、4、6和8的蛋白質(zhì)的基因組DNA是特別優(yōu)選的。
假如用于本發(fā)明的DNA序列編碼具有VEGF活性的蛋白質(zhì)，它們可以由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或替代而不同于SEQ ID No.1、3、5或7所示的序列。同樣，假如它們編碼具有VEGF活性的蛋白質(zhì)，它們相對(duì)于SEQ ID No.1、3、5或7可以被截短或者延伸一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
RNA序列也適于本發(fā)明的實(shí)施。特別是，本發(fā)明提供對(duì)應(yīng)于SEQ IDNo.1、3、5或7的RNA序列的應(yīng)用；這些是優(yōu)選的RNA序列。本發(fā)明也提供在上述關(guān)于DNA序列的任何方面涉及這些序列的RNA序列的應(yīng)用。本發(fā)明的RNA序列可以是單鏈或雙鏈的。本發(fā)明的RNA可以是任何來源的。例如，它們可以來源于任何種類的生物，盡管編碼人VEGF特別是編碼具有SEQ ID No.2、4、6或8所示序列的人VEGF的RNA是優(yōu)選的。也可使用合成的DNA，及半合成的RNA。另外，可使用DNA轉(zhuǎn)錄形式的體內(nèi)或體外細(xì)菌質(zhì)粒。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在適于本發(fā)明實(shí)施的RNA序列中，T殘基將被U代替。
用于本發(fā)明的VEGF蛋白質(zhì)由如上所述本發(fā)明的DNA或RNA序列所編碼。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)是SEQ ID No.2、4、6和8的蛋白質(zhì)，盡管本發(fā)明也提供具有緊密相關(guān)序列的其它蛋白質(zhì)的應(yīng)用，該序列不同于SEQ ID No.2、4、6或8的序列，但具有VEGF活性。
根據(jù)本發(fā)明，由于在此范圍內(nèi)它涉及內(nèi)膜增生的治療或預(yù)防，所以VEGF活性是完全或部分地抑制或預(yù)防血管中特別是動(dòng)脈中內(nèi)膜增生的能力。如上所述，在序列上略微不同于天然發(fā)生的VEGF的蛋白質(zhì)保留此性質(zhì)，盡管程度上不一定象VEGF一樣。同樣，這些蛋白質(zhì)可以顯示比天然發(fā)生的VEGF更強(qiáng)的VEGF活性。VEGF的激動(dòng)劑，例如肽、類肽或其它小分子也有類似的情況。
由于在此范圍內(nèi)本發(fā)明涉及VEGF的其它性質(zhì)，所以VEGF活性是除VEGF之外的分子再現(xiàn)那些性質(zhì)的能力。例如，由于在此范圍內(nèi)本發(fā)明涉及VEGF對(duì)抗NO-相關(guān)病癥的活性以刺激NO產(chǎn)生，所以VEGF活性包括刺激NO產(chǎn)生的能力。由于在此范圍內(nèi)本發(fā)明涉及VEGF對(duì)抗前列環(huán)素-相關(guān)病癥的活性，所以VEGF活性包括刺激前列環(huán)素產(chǎn)生的能力。適于本發(fā)明實(shí)施的VEGF蛋白質(zhì)一般也顯示本領(lǐng)域已知的VEGF的一種或多種生物學(xué)性質(zhì)，如在體外和/或體內(nèi)促進(jìn)動(dòng)脈EC增殖的能力，或者同與VEGF結(jié)合的受體結(jié)合并以VEGF的方式激活它們的能力。
適于本發(fā)明實(shí)施的VEGF蛋白質(zhì)可以與SEQ ID No.2、4、6或8的VEGF基本上同源，一般至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同源。
假如適于本發(fā)明實(shí)施的VEGF蛋白質(zhì)具有VEGF的活性，它們可以由于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替代而不同于SEQ ID No.2、4、6或8所示的序列。同樣，假如它們具有VEGF的活性，它們相對(duì)于SEQID No.2、4、6或8可以被截短一個(gè)或多個(gè)氨基酸或者延伸一個(gè)或多個(gè)氨基酸。關(guān)于替代，保守替代是優(yōu)選的。一般地，保守替代是這樣一種替代，其中替代的氨基酸與天然發(fā)生的VEGF中存在的氨基酸有相似的性質(zhì)，例如在電荷和/或大小和/或極性和/或疏水性方面。同樣，保守替代對(duì)蛋白質(zhì)的VEGF活性一般有很小的影響或沒有影響。
用于本發(fā)明的、在序列上不同于天然發(fā)生的VEGF的VEGF蛋白質(zhì)，可以被蛋白質(zhì)工程改造為在活性上不同于天然發(fā)生的VEGF。例如，可將它們改造為具有更強(qiáng)的VEGF活性。一般使用本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)在核酸水平上進(jìn)行這些操作。
作為如上所述使用VEGF蛋白質(zhì)的一種備擇方法，使用VEGF激動(dòng)劑是可能的。其應(yīng)用于在此所述的所有醫(yī)學(xué)應(yīng)用，特別是動(dòng)脈粥樣硬化的治療。
通常，VEGF激動(dòng)劑是同與VEGF結(jié)合的受體結(jié)合的一種分子，并且基本上具有如在此所述的導(dǎo)致VEGF活性的相同作用。特別是，激動(dòng)劑可以結(jié)合flk-1/KDR或flt-1受體。因此本發(fā)明的激動(dòng)劑被稱為VEGF的激動(dòng)劑和與VEGF結(jié)合的受體的激動(dòng)劑。
VEGF激動(dòng)劑可以具有任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，VEGF激動(dòng)劑可以是例如可達(dá)10個(gè)、可達(dá)20個(gè)、可達(dá)50個(gè)或可達(dá)100個(gè)氨基酸的肽或多肽。激動(dòng)劑同樣可以是修飾的肽或類肽。可進(jìn)行任何合適的修飾，包括糖基化、硫化、COOH-酰胺化和乙?；鏝-端乙?；?。另外，或備擇地，可以存在修飾的氨基酸和/或L-氨基酸。
某些優(yōu)選的激動(dòng)劑是具有VEGF活性的、如上所述任選地修飾的VEGF的片段。一個(gè)特別優(yōu)選的VEGF的激動(dòng)劑片段由SEQ ID No.4的氨基酸1到20(M-H)組成；Ahmed等人，實(shí)驗(yàn)室研究(Lab.Invest.)(1997)76779報(bào)道，該肽是人滋養(yǎng)層細(xì)胞中Flt-1受體的一種激動(dòng)劑。
其它相關(guān)的激動(dòng)劑也可衍生自VEGF的N-端區(qū)。例如，就SEQ ID No.4而言，VEGF的肽激動(dòng)劑可以包含VEGF的N-端(氨基酸1號(hào))，并且具有可達(dá)25到30個(gè)、30到40個(gè)、40到50個(gè)或50到100個(gè)氨基酸范圍的VEGF的氨基酸序列。同樣，優(yōu)選的激動(dòng)劑可衍生自VEGF的N-端區(qū)，但包含截短形式的N-端。例如，代替開始于SEQ ID No.4的氨基酸1號(hào)，它們可開始于SEQ ID No.4的氨基酸2、3、4、5、6、7、8、9或10號(hào)，并且具有可達(dá)25到30個(gè)、30到40個(gè)、40到50個(gè)或50到100個(gè)氨基酸范圍的VEGF的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽激動(dòng)劑也可衍生自VEGF序列的其它部分。例如，進(jìn)一步優(yōu)選的一種肽激動(dòng)劑是由SEQ ID No.6的VEGF-189序列的氨基酸145到169(R-P)構(gòu)成的肽。
其它相關(guān)的激動(dòng)劑也可衍生自VEGF的該區(qū)。例如，就SEQ ID No.6而言，VEGF的肽激動(dòng)劑可以具有區(qū)域從大約135到155個(gè)氨基酸至大約160到180個(gè)氨基酸的VEGF的氨基酸序列。例如，由該區(qū)衍生的肽激動(dòng)劑可具有區(qū)域從大約135到140個(gè)、140到145個(gè)或145到150個(gè)氨基酸至大約160到165個(gè)、165到170個(gè)或170到175個(gè)氨基酸的VEGF序列。
如上所述的VEGF的肽片段優(yōu)選地具有10到20個(gè)、20到25個(gè)、25到30個(gè)、30到40個(gè)或40到50個(gè)氨基酸的總長(zhǎng)度。
其它優(yōu)選的激動(dòng)劑是HIV Tat蛋白質(zhì)的片段。HIV Tat蛋白質(zhì)模擬VEGF的激動(dòng)劑作用，并能通過Flk-1/KDR受體作用刺激內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成；見Albini等人，癌基因(Oncogene)(1996)12289-297，和自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)(Nature Medicine)(1996)2(12)1321-1375。因此，由HIV-1 Tat序列衍生的肽如HIV Tat蛋白質(zhì)的氨基酸46-60已顯示刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移；見Albini等人，癌基因(1996)12289-297。由HIV-1Tat蛋白質(zhì)的氨基酸41到65構(gòu)成的肽是本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的肽激動(dòng)劑。
本發(fā)明的激動(dòng)劑也可具有在上述對(duì)于VEGF蛋白質(zhì)的任何方面不同于天然發(fā)生的VEGF的氨基酸序列，只要保留它們的激動(dòng)劑性質(zhì)。
本發(fā)明的激動(dòng)劑是肽時(shí)，為了根據(jù)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)治療，它們可以由編碼它們的核酸序列在體內(nèi)產(chǎn)生。因此，如此處所述，可以通過基因治療輸送編碼激動(dòng)劑的核酸。
另外，能使用非肽的VEGF激動(dòng)劑。例如，可以使用模擬與其受體相互作用的VEGF部分的形態(tài)之小分子。
在本發(fā)明的實(shí)施中，可以將VEGF、編碼VEGF的核酸或者VEGF激動(dòng)劑或編碼VEGF激動(dòng)劑的核酸以任何合適的形式輸送至血管中，優(yōu)選的為動(dòng)脈中?？梢砸圆慌c載體結(jié)合的“裸露”形式或通過基因治療載體輸送核酸。優(yōu)選的是通過任何合適的基因治療載體輸送它們。特別是，可使用病毒或非病毒載體。
合適的病毒載體包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、痘苗病毒和桿狀病毒。合適的非病毒載體包括寡核苷酸、質(zhì)粒、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、pH-敏感的脂質(zhì)體、脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)復(fù)合物、免疫脂質(zhì)體、脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)-聚賴氨酸衍生物、水-油乳劑、聚乙烯亞胺和dendrimer。優(yōu)選的載體包括莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)-衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒、包含假型皰疹性口腔類病毒蛋白質(zhì)-G(VSV-G)的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、質(zhì)粒和質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物。
適當(dāng)時(shí)，可一起使用兩個(gè)或多個(gè)型的載體。例如，一種質(zhì)粒載體可以與脂質(zhì)體結(jié)合使用。合適的脂質(zhì)體包括，例如，包含二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、3β-[N′-[N′，N′-二甲氨基乙烷]氨甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)或帶正電荷的脂(N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三乙基銨(DOTMA)的脂質(zhì)體。
本發(fā)明的病毒載體優(yōu)選地是失能的，例如，是復(fù)制-缺損型。即，它們?nèi)鄙購(gòu)?fù)制所需的一個(gè)或多個(gè)功能基因，這阻止了它們?cè)隗w內(nèi)的不受控制的增殖，并且避免了病毒感染的不希望的副作用。優(yōu)選地，除最小基因組元件外去除所有的病毒基因組，最小基因組元件是將摻入VEGF核酸的病毒基因組包裝入病毒外殼和殼體所需的。例如，希望刪除除長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和包裝信號(hào)之外的所有病毒基因組。至于腺病毒，一般在E1區(qū)中、任選地在一個(gè)或多個(gè)E2、E3和/或E4區(qū)中進(jìn)行刪除。
也可通過任何合適的技術(shù)使本發(fā)明的病毒失能。例如，基因組缺失可包括復(fù)制所需基因的完全去除，或僅僅部分去除。完全去除是優(yōu)選的。通常，優(yōu)選的缺失是病毒基因早期轉(zhuǎn)錄所需基因的缺失。
也可使用復(fù)制型自體限制或自體破壞的病毒載體。
通常，用于本發(fā)明的VEGF核酸包含于一種表達(dá)構(gòu)建體中，該構(gòu)建體確保其優(yōu)選地被通過如上所述的載體輸送到動(dòng)脈后能在體內(nèi)表達(dá)。這些構(gòu)建體一般包括一個(gè)能引導(dǎo)VEGF核酸表達(dá)的啟動(dòng)子(和任選地該啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)基因)、一個(gè)翻譯起始密碼子和與啟動(dòng)子有效連接的VEGF核酸。優(yōu)選地，這些組分以5′-3′方向排列。
該構(gòu)建體也可包含任何其它合適的組分。例如，該構(gòu)建體可包含編碼信號(hào)序列的核酸，于是定位于相對(duì)于VEGF核酸的這種位置，以使其翻譯時(shí)能將表達(dá)的VEGF蛋白質(zhì)引導(dǎo)至特定的細(xì)胞型或細(xì)胞區(qū)室。任何這種信號(hào)序列一般定位于緊鄰VEGF核酸的3′端或5′端，以使信號(hào)序列和VEGF蛋白質(zhì)被翻譯為在C-或N-端含信號(hào)序列的單一融合蛋白。
該構(gòu)建體也可包含增強(qiáng)啟動(dòng)子提供的表達(dá)程度的增強(qiáng)子?？墒褂迷鰪?qiáng)所選啟動(dòng)子提供的表達(dá)的任何增強(qiáng)子。例如，對(duì)于CMV早期基因啟動(dòng)子，可使用CMV早期基因增強(qiáng)子。
任選地，該構(gòu)建體可包含VEGF核酸3′端的轉(zhuǎn)錄終止子?？墒褂萌魏魏线m的終止子。
任選地，該構(gòu)建體可包含有效連接至VEGF核酸3′端的聚腺苷酸化信號(hào)序列。
任選地，該構(gòu)建體可包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，例如抗生素抗性基因，以允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞在培養(yǎng)中的篩選。例如，可以依抗生素抗性按順序篩選細(xì)胞。
任選地，該構(gòu)建體可包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，或其它非編碼序列，例如位于VEGF核酸的3′端或5′端。
可使用任何合適的啟動(dòng)子控制本發(fā)明的核酸表達(dá)。通常，優(yōu)選地使用病毒啟動(dòng)子或適于在所治療的個(gè)體種群中起作用的啟動(dòng)子。因此，對(duì)于人類患者，優(yōu)選地使用病毒啟動(dòng)子，特別是由感染人類的病毒衍生的啟動(dòng)子，或由人類基因衍生的啟動(dòng)子。任選地，一種啟動(dòng)子可以與任何合適的增強(qiáng)子結(jié)合使用。
希望地，使用“強(qiáng)”啟動(dòng)子，即保證本發(fā)明的VEGF蛋白質(zhì)高水平表達(dá)的啟動(dòng)子。希望實(shí)現(xiàn)VEGF蛋白質(zhì)過量表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，任選地與CMV增強(qiáng)子結(jié)合；人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；猿猴病毒40(SV40)早期基因啟動(dòng)子；勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子；和逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子。
啟動(dòng)子和其它構(gòu)建體組分與VEGF核酸有效地連接。于是將其定位，以使它們能發(fā)揮對(duì)VEGF核酸表達(dá)的作用。例如，對(duì)于啟動(dòng)子，將啟動(dòng)子相對(duì)于VEGF核酸定位，以使其能引導(dǎo)VEGF核酸的表達(dá)。希望地，定位構(gòu)建體組分以允許它們發(fā)揮對(duì)表達(dá)的最大作用。
可以將本發(fā)明中使用的核酸或構(gòu)建體通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法摻入病毒基因組。然后可將病毒基因組通過任何合適的方法包裝入病毒外殼或殼體。特別是，可使用任何合適的包裝細(xì)胞系產(chǎn)生本發(fā)明的病毒載體。這些包裝系互補(bǔ)本發(fā)明的復(fù)制缺損型病毒基因組，因?yàn)樗鼈円话惆〒饺肫浠蚪M的、已從復(fù)制缺損型基因組中刪除的基因。因此，包裝系的使用允許本發(fā)明的病毒載體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生。合適的包裝系包括PA317細(xì)胞、ψ-2細(xì)胞、CRE細(xì)胞、CRIP細(xì)胞、E-86-GP細(xì)胞、Fly細(xì)胞、293系細(xì)胞和293GP細(xì)胞的衍生物。
對(duì)于非病毒載體，可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法將核酸摻入非病毒載體。
如所希望的，可選擇載體特別是病毒載體以實(shí)現(xiàn)核酸或構(gòu)建體向待治療的患者細(xì)胞基因組中的整合，或?qū)⒑怂峄驑?gòu)建體游離地留在胞質(zhì)中。整合型載體是優(yōu)選的。
為實(shí)現(xiàn)對(duì)增生的治療，可以以任何合適的方式對(duì)動(dòng)脈施用如上所述的優(yōu)選地與病毒或非病毒載體結(jié)合的用于本發(fā)明的VEGF蛋白質(zhì)或VEGF核酸。例如，可以例如通過腔，對(duì)血管如動(dòng)脈的外壁或?qū)ρ軆?nèi)皮如動(dòng)脈內(nèi)皮施用VEGF或編碼VEGF的核酸。局部基因轉(zhuǎn)移可能優(yōu)于重組VEGF蛋白質(zhì)的施用，因?yàn)樽⑷氲膹?fù)合物被血流迅速?zèng)_洗掉，在血液中半壽期短。
一旦輸送，本發(fā)明的VEGF核酸即被表達(dá)，產(chǎn)生VEGF蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)隨后實(shí)現(xiàn)內(nèi)膜增生的治療或預(yù)防。表達(dá)可發(fā)生于任何細(xì)胞型中或血管型中如動(dòng)脈壁中。
優(yōu)選地，表達(dá)發(fā)生于這樣一個(gè)位置，即，使表達(dá)的VEGF能到達(dá)血管如動(dòng)脈的內(nèi)皮。例如，表達(dá)可發(fā)生于平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮中。最優(yōu)選地，表達(dá)至少發(fā)生于血管如動(dòng)脈的內(nèi)皮中。
例如，可以通過直接注射增生的部位周圍以治療或預(yù)防，或通過注射入血管如動(dòng)脈的腔中，將VEGF蛋白質(zhì)或核酸輸送至血管如動(dòng)脈的外部。
更優(yōu)選的，通過放置于鄰近所治療的增生部位的血管、如動(dòng)脈外部的植入物，輸送VEGF蛋白質(zhì)或核酸，這種植入物包含VEGF蛋白質(zhì)或核酸、或載體，并提供試劑的儲(chǔ)存器?？梢栽趯⒅踩胛镆胨委煹幕颊咧盎蛑?，將VEGF蛋白質(zhì)或核酸(優(yōu)選的與載體結(jié)合)引入植入物。例如，該植入物可以固定于血管附近，隨后通過例如注射將VEGF蛋白質(zhì)或核酸引入植入物。
優(yōu)選地，放置植入物與血管如動(dòng)脈直接接觸。當(dāng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體輸送VEGF核酸時(shí)，這是特別優(yōu)選的。因?yàn)檠艿奈锢碜冃慰烧T導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖，這提高了通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因轉(zhuǎn)移的效率。這種增殖，像增生本身誘導(dǎo)的增殖一樣，可被VEGF蛋白質(zhì)或核酸的輸送克服或至少可以改善。同樣，當(dāng)其靶細(xì)胞分裂時(shí)使用顯示提高的基因轉(zhuǎn)移效率的其他載體時(shí)，對(duì)于植入物優(yōu)選的是與動(dòng)脈接觸。例如，細(xì)胞增殖也可提高質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)移效率。
這些植入物可以是任何合適的形式。優(yōu)選的，該植入物是套環(huán)的形式，其部分地或完全地、優(yōu)選的為完全地在待治療或預(yù)防的增生部位或靠近該部位環(huán)繞動(dòng)脈。
血管外基因輸送避免了如氣囊導(dǎo)管插入術(shù)或高壓液體的方法，這些方法可導(dǎo)致內(nèi)皮的損傷或裸露。優(yōu)選地通過硅膠或生物可降解的植入物應(yīng)用轉(zhuǎn)染的基因，優(yōu)選的是通過靠近血管外側(cè)放置的套環(huán)，優(yōu)選地是通過在血管外側(cè)周圍放置的套環(huán)。內(nèi)皮遭受很小的損傷或沒有損傷。這是此輸送形式的最主要的優(yōu)點(diǎn)。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明直接將載體應(yīng)用于套環(huán)內(nèi)的血管外膜表面時(shí)，保持與外膜的緊密接觸。在兔動(dòng)脈中，一個(gè)單獨(dú)的套環(huán)一般導(dǎo)致手術(shù)后7-14天內(nèi)新內(nèi)膜的形成。該套環(huán)也在外膜表面保持高濃度的載體。
植入物優(yōu)選的套環(huán)可以由任何合適的材料制成。硅膠植入物，即包含硅膠的植入物是一種優(yōu)選的選擇。最優(yōu)選的是生物可降解的植入物。可以使用任何合適的生物可降解的材料。
在植入物如套環(huán)內(nèi)，可以以任何方式包含VEGF蛋白質(zhì)或核酸。優(yōu)選的，植入物如套環(huán)的結(jié)構(gòu)使VEGF蛋白質(zhì)或核酸與血管壁直接接觸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，植入物的結(jié)構(gòu)在血管壁和植入物壁之間留有一個(gè)空間。至于套環(huán)，植入物于是在血管周圍形成一個(gè)空的容器?？蓪EGF核酸或蛋白質(zhì)引入該空間，以使他們與血管壁接觸。優(yōu)選地，植入物的末端與血管壁接觸，因而防止了VEGF核酸或蛋白質(zhì)的溢出。優(yōu)選地，套環(huán)的外壁對(duì)于VEGF核酸或蛋白質(zhì)是不通透的或基本上不通透的，因而防止或至少限制了其進(jìn)入周圍組織，并確保其向血管的輸送。
任選地，包含VEGF核酸或蛋白質(zhì)的空間可以通過一層或多層對(duì)VEGF或核酸通透的或半通透的材料與血管壁分開。如果打算逐步輸送并希望限制將VEGF蛋白質(zhì)或核酸向血管壁輸送的速率，這可以是希望的。
任選地，可以設(shè)計(jì)植入物如套環(huán)以用作滲透泵。
任選地，VEGF可包含于套環(huán)內(nèi)的介質(zhì)中，如固體或凝膠介質(zhì)。這有助于防止VEGF蛋白質(zhì)或核酸進(jìn)入組織。假如這樣，套環(huán)的外壁不必需要與植入物末端的血管接觸。
另外，可以將VEGF核酸或蛋白質(zhì)包被于植入物表面上，該植入物在使用中與血管接觸。另外，可以將VEGF核酸或蛋白質(zhì)分散于整個(gè)植入物結(jié)構(gòu)中。
植入物以該方式特別是以套環(huán)的方式應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)是(i)它們提供一個(gè)允許持續(xù)輸送的輸送儲(chǔ)存器；(ii)不需要腔內(nèi)操作，并且動(dòng)脈內(nèi)皮保持完整；以及(iii)如上所述，植入物產(chǎn)生的變形(例如在套環(huán)的情況下的收縮)可提高基因輸送的效率。
本發(fā)明的裝置通常包括一個(gè)主體，該主體至少包括第一個(gè)基本上不通透的主體部分，該主體部分的形狀適合于在使用中沿縱向延伸，并至少部分地環(huán)繞第一個(gè)該血管，第一個(gè)主體部分包括適于在使用中密封第一個(gè)血管外膜表面的縱向間隔的密封部分，和在密封部分之間的一個(gè)中間部分，該密封部分適于在使用中包含至少一種試劑并對(duì)第一個(gè)血管的外膜表面輸送該試劑。
現(xiàn)在將參照附圖，僅以實(shí)施例的方式描述根據(jù)本發(fā)明的裝置的優(yōu)選實(shí)施方案，其中

圖1是一個(gè)示意圖，是在血管周圍的本發(fā)明的一個(gè)裝置的縱向剖視圖；圖2是一個(gè)示意圖，是沿圖1所示A-A線的相同實(shí)施方案的剖視圖；圖3顯示位于頭尾相接的吻合部位周圍的裝置之第二個(gè)實(shí)施方案的主體示意圖；圖4是圖3的實(shí)施方案的縱向剖視圖；圖5是與圖4相似的視圖，但顯示該實(shí)施方案的修飾形式；以及密封部分的一種備擇的結(jié)構(gòu)；圖6顯示位于末端與側(cè)面結(jié)合的吻合部位周圍的裝置之第三個(gè)實(shí)施方案的立體示意圖；圖7是圖6的實(shí)施方案的縱向剖視圖；圖8顯示位于側(cè)面與側(cè)面結(jié)合的吻合部位周圍的裝置之第四個(gè)實(shí)施方案的主體示意圖；圖9是圖8的實(shí)施方案的縱向剖視圖；圖10顯示位于側(cè)面與側(cè)面結(jié)合的吻合部位周圍的裝置之第五個(gè)實(shí)施方案的主體示意圖，顯示一個(gè)部分包埋的血管；以及圖11是圖10的實(shí)施方案的縱向剖視圖。
作為背景，當(dāng)天然血管通常被動(dòng)脈粥樣化所堵塞或顯著狹窄時(shí)，通常用動(dòng)脈旁路移植物以恢復(fù)或改善流向組織的血流。無論使用自體的靜脈或動(dòng)脈，或合成材料如滌淪(Dacron)或聚四氟乙烯(PTFE)，通常以三種方式之一將移植物與天然血管吻合“頭尾相接”(圖4)；“末端與側(cè)面結(jié)合”(圖7)；或“側(cè)面與側(cè)面結(jié)合的”(圖9)。在這些技術(shù)中，末端與側(cè)面結(jié)合和側(cè)面與側(cè)面結(jié)合的比頭尾相接的更常用。血流方向以箭頭表示。
圖1和圖2顯示血管壁2之內(nèi)的血液1和一個(gè)包括空隙3的外膜套環(huán)，空隙3由例如生物可降解材料的壁4所圍成。套環(huán)5在套環(huán)的末端接觸血管壁?？梢砸匀缦滤龅南嗤绞綄⒈緦?shí)施方案用于其它實(shí)施方案。
圖3和圖4所述實(shí)施方案據(jù)顯示應(yīng)用于頭尾相接的吻合術(shù)。該裝置包括一個(gè)通常為管狀的主體12，該主體在使用中沿由移植物13與天然血管14頭尾相接的吻合所形成的血管縱向延伸，并環(huán)繞此血管。
如圖4最清晰所見，該裝置的主體12具有配備于相對(duì)端的縱向間隔的密封部分15。當(dāng)在使用中該裝置位于頭尾相接的吻合部位16時(shí)，這些密封部分15密封移植物13和天然血管14的外膜表面。主體12的材料在密封部分15的徑向厚度大于在中間部分17的厚度。因此，當(dāng)密封部分15密封移植物13和血管14的外膜表面時(shí)，在該裝置主體12的內(nèi)面與移植物13和血管14圍成的端部的外膜表面之間形成一個(gè)空間。該空間構(gòu)成密封儲(chǔ)存器18，并顯示與吻合部位16縱向?qū)φ?br> 該儲(chǔ)存器能使包含一種或多種試劑的藥物制劑在吻合部位16與移植物和血管13、14的外膜表面接觸。如制劑是液體或凝膠的形式，例如能夠使用皮下注射針和注射器穿過主體12的壁將其注射入密封儲(chǔ)存器18。該制劑所含的試劑有利地具有抗-增生作用，以對(duì)抗在吻合部位16及相鄰區(qū)域處的平滑肌細(xì)胞內(nèi)膜增生。
藥物制劑不必是液體或凝膠的形式，例如它可以是具有類似于牙膏的稠度的軟膏。因而它保持與所接觸的脈動(dòng)的外膜表面相接觸，收縮血管。
為了將裝置定位于吻合部位16上，圓柱體12在被吻合之前可以在移植物13和血管14之一上軸向滑動(dòng)。因而醫(yī)生能將移植物13和血管14在吻合部位16處連接在一起，然后將主體12在吻合部位16上向回滑動(dòng)，以占據(jù)圖4所示的位置，使密封部分15能密封各自的外膜表面。
另外，如示，該裝置的主體12可以具有沿其全部長(zhǎng)度的縱向狹縫19。這樣，醫(yī)生不需將裝置12引入患者體內(nèi)即可將移植物13和血管14吻合。一旦成功完成吻合術(shù)，醫(yī)生即能選擇一種適當(dāng)大小的主體12，將其應(yīng)用于吻合的移植物和血管周圍，方法是沿狹縫19打開柔韌性主體12，在吻合的移植物和血管13、14上滑動(dòng)，然后例如使用常規(guī)的“組織膠”，如名稱為Tisseal所售的凝血酶膠或基于氰基異丁烯酸的膠，將主體的相對(duì)的縱向邊緣在狹縫19處密封在一起。
為了集中儲(chǔ)存器18內(nèi)所含藥物制劑的作用，并且避免其試劑向周圍組織的滲漏，主體12對(duì)制劑是基本上不通透的。有利地，其材料也是經(jīng)過一定時(shí)間可生物降解的，例如1到5天的階段，到此時(shí)制劑中的活性劑可能已耗盡。也選擇其材料，以便不引起周圍組織的過于嚴(yán)重的反應(yīng)。
用作主體的合適材料的實(shí)例包括明膠、藻酸鹽或膠原蛋白。這些材料也賦予主體的柔韌性，并使裝置能夠通過模塑法或擠壓法而制造。
主體12的壁材料有利地也是自密封(self-sealing)的，以便在密封的儲(chǔ)存器18需要被皮下注射針穿孔時(shí)，保持其完整性。備擇地或另外，移除針頭后壁中顯示的任何漏隙可以用“組織膠”等密封。
可提供一系列不同大小的主體12以適應(yīng)不同大小的血管。下肢血管通常具有大約6-8mm的外徑。冠狀血管通常具有大約3-5mm的外徑。因此，范圍大約3-10mm直徑的一系列主體尺寸可從外科醫(yī)生的無菌袋中獲得。另外，可以改變主體的大小以影響儲(chǔ)存器18的體積。儲(chǔ)存器18的合適尺寸可高達(dá)10ml，優(yōu)選地2-5ml。
為適應(yīng)脈動(dòng)血流引起的血管13、14的擴(kuò)張，至少主體的密封部分15能方便地被伸展，以便適應(yīng)血管壁的擴(kuò)張。非常希望通過該裝置避免血管壁的收縮而同時(shí)保持密封完整。
圖5說明了不同的密封部位。主體12材料的徑向厚度沿主體的長(zhǎng)度是不變的，中間部分17相對(duì)于主體12在密封部分15處的內(nèi)徑是內(nèi)部囊性的。兩個(gè)密封部分15都是由縱向延伸的尾狀物構(gòu)成的，例如，在大約8-15mm的軸向長(zhǎng)度“X”上，每個(gè)密封部分分別接觸移植物13和血管14的外膜表面。密封部分15的這些長(zhǎng)尾狀物能夠以“瓣閥”的方式起作用，以助于密封儲(chǔ)存器18，盡管希望確定沒有通過“瓣閥”的血流。另外，這些尾狀物可以以類似于圖4所示的方式向內(nèi)折疊(未顯示)，以加倍主體在端部的厚度，形成徑向主體厚度大于中間部分主體厚度的密封部分。
為了形成或助于形成不滲透液體的密封，醫(yī)生可以例如使用上述類型的膠如“組織膠”將密封部分15粘附至外膜表面。然而，這不是關(guān)鍵。例如，如果選擇密封部分15處的主體12的大小以匹配血管13、14的圍長(zhǎng)，那么不必要使用任何膠。替代地，醫(yī)生可依靠主體12在密封部分15處的內(nèi)徑與外膜表面直徑之間的徑向干擾。圖5的長(zhǎng)尾密封部分實(shí)施方案尤其如此。然而，密封部分在血管上不應(yīng)太緊，以至收縮血管。
圖6和圖7說明了與末端與側(cè)面結(jié)合的吻合術(shù)結(jié)合使用的裝置的一個(gè)實(shí)施方案。這些附圖顯示了一個(gè)具有第一個(gè)主體部分21和第二個(gè)主體部分22的主體20，它們以小于90°的角度分支形成一個(gè)通常是Y-形的主體。應(yīng)當(dāng)理解，第一個(gè)和第二個(gè)主體部分21、22可以以可達(dá)90°和包括90°的其它分支夾角彼此交叉，后一種情況中主體通常是T-形。醫(yī)生可以方便地獲得一系列不同大小和不同形狀的主體，從中他可以選擇最適合吻合血管的分布和大小的裝置。例如，第一個(gè)主體部分21可以是大約1-10cm長(zhǎng)；第二個(gè)主體部分22可以是1-5cm長(zhǎng)。
第一個(gè)主體部分21通常是管狀的，并顯示環(huán)繞天然血管23。第二個(gè)主體部分22通常也是管狀的，并顯示環(huán)繞以末端與側(cè)面結(jié)合的方式在吻合部位29與天然血管23相吻合的移植物24。如圖7所見，第一個(gè)主體部分21的相對(duì)端具有密封部分25，第二個(gè)主體部分22的末端具有密封部分26。在較早的實(shí)施方案中，可方便地使用“組織膠”將這些密封部分25、26分別與血管23和移植物24的外膜表面密封。
圖7顯示在第一個(gè)主體部分21的內(nèi)面與血管23外膜表面之間形成的密封儲(chǔ)存器27。儲(chǔ)存器27延伸至第二個(gè)主體部分22的內(nèi)部。于是該密封儲(chǔ)存器27與吻合部位29對(duì)正?？墒褂闷は伦⑸溽樅妥⑸淦鞣奖愕貙?duì)儲(chǔ)存器27注射包含活性劑的液體藥物制劑。
為便于該裝置向血管23和移植物24的安裝，可向醫(yī)生提供在無菌包裝中的該裝置的主體20，此無菌包裝包括兩個(gè)對(duì)稱的半部分，其在圖7所示剖面的平面上分裂并對(duì)稱。在這種情況下，在將移植物24與血管23吻合后，醫(yī)生需要將兩個(gè)相同的主體半部分裝配在一起，并且使用例如前述的膠將相同的半部分的相對(duì)邊緣封閉在一起。
另外，如圖6所示，只有第一個(gè)主體部分21可具有縱向狹縫28。這樣醫(yī)生能在移植物24的端部之上滑動(dòng)第二個(gè)主體部分22。于是醫(yī)生能將移植物24的游離端與血管23吻合，然后將第二個(gè)主體部分22滑動(dòng)回移植物24，覆蓋吻合部位29，使用狹縫28將血管23裝進(jìn)第一個(gè)主體部分21的中心，由此將其環(huán)繞。醫(yī)生然后能在狹縫28處將第一個(gè)主體部分21的相對(duì)縱向邊緣互相封閉，形成密封儲(chǔ)存器27。
應(yīng)當(dāng)理解，其它構(gòu)造可用于主體部分21和22。例如，可分開提供第一個(gè)和第二個(gè)主體部分21和22，并且它們能僅在患者原位彼此固定以形成密封的儲(chǔ)存器27。
圖8和圖9說明適用于側(cè)面與側(cè)面結(jié)合的吻合術(shù)情況的裝置的一個(gè)實(shí)施方案。該裝置的主體30顯示包含第一個(gè)主體部分31，第二個(gè)和第三個(gè)主體部分32、33從該部分分支。如圖8所示此分支形成了通常X形的主體。
所有三個(gè)主體部分31、32、33在外形上通常是管狀的。除另外第三個(gè)主體部分33外，該裝置通常類似于圖6和圖7所示的裝置。
第一個(gè)主體部分31環(huán)繞閉塞的天然血管34，并通過密封部分35與其外膜表面密封。第二個(gè)和第三個(gè)主體部分32、33環(huán)繞移植物36，并于各自的密封部分37、38處與移植物的外膜表面密封。如圖9所最清晰地顯示，密封部分35、37、38的作用是形成在主體30的內(nèi)面與包圍的血管的外膜表面之間的密封儲(chǔ)存器39，該儲(chǔ)存器39可以前述的方式至少部分地裝入了藥物制劑。
為便于圖8和圖9所示裝置的安裝，方便地以至少兩個(gè)部分的形式向醫(yī)生提供該裝置。例如，可以與包含第二和第三個(gè)主體部分32、33的第二個(gè)組件分開提供第一個(gè)主體部分31。通過提供含縱向狹縫的主體部分(未顯示)，可安裝主體部分以環(huán)繞血管34和移植物36，然后沿縱向狹縫密封，并沿接觸線相互密封，以提供在吻合點(diǎn)40周圍的密封的儲(chǔ)存器39。
圖10和圖11顯示圖8和圖9所示裝置的一種變體(對(duì)于通用部分使用相同的參數(shù))。本發(fā)明的裝置的一個(gè)特別合適的應(yīng)用是在冠狀動(dòng)脈分流移植術(shù)中。在這種情況下，如示，第一個(gè)血管34可以是部分地包埋于心臟壁50中的冠狀動(dòng)脈。圖8和圖9所示形式的裝置不能安裝于部分包埋的冠狀動(dòng)脈34，因?yàn)榈谝粋€(gè)主體部分不能在動(dòng)脈34周圍完全伸展。因此，在圖10和圖11的實(shí)施方案中，當(dāng)沿縱向范圍的橫截面觀察時(shí)，主體31的第一個(gè)主體部分51不能描繪一個(gè)完整的圓；替代地，其通常是弓形的。在所示的實(shí)施方案中，其描繪一個(gè)大約180°的弧。這使第一個(gè)主體部分51能僅安裝于部分-包埋的冠狀動(dòng)脈34的暴露部分，以僅僅部分地環(huán)繞它。在此排列中，醫(yī)生例如通過組織膠將第一個(gè)主體部分51的縱向延伸邊緣41如所示與冠狀動(dòng)脈34的外膜壁密封，或與心臟壁50的表面密封。
圖10和圖11的裝置也應(yīng)用于其它手術(shù)方法，其中第一個(gè)血管是一個(gè)動(dòng)脈，該動(dòng)脈部分包埋于動(dòng)脈所供給的器官的壁中。這些器官包括腦、膀胱和子宮。
盡管所說明的實(shí)施方案集中于該裝置在吻合部位向血管以及向鄰近部位輸送試劑的應(yīng)用，但本發(fā)明不限于這些應(yīng)用。例如，該裝置可以更一般地用于向非吻合血管的外膜表面輸送試劑。例如，氣囊血管成形術(shù)后，可以將圖3至5所示的一種裝置形式置于動(dòng)脈外面周圍、氣囊血管成形術(shù)部位附近，以通過該動(dòng)脈的外膜表面向其輸送一種或多種試劑。
在上述實(shí)施方案中，顯示密封的儲(chǔ)存器采取血管外膜表面與至少第一個(gè)主體部分的內(nèi)面之間的徑向空間或間隙的形式，該空間在使用中至少部分地裝入藥物制劑。然而，這一空間不是必需的。例如，在一個(gè)備擇的實(shí)施方案中，主體可具有一個(gè)通常不通透的柔韌性外層和一個(gè)用該制劑浸滲并準(zhǔn)備在使用中與外膜表面接觸的柔韌性內(nèi)層。
例如，其外層可以由固體膠原蛋白制成，內(nèi)層由與之交聯(lián)的海綿樣的膠原蛋白制成，海綿樣層能夠用包含所輸送試劑的藥物制劑所浸滲。在此情況中，可向醫(yī)生提供已浸滲過的制劑的該裝置，或者可在安裝后例如通過如前所述的注射用制劑濕潤(rùn)該裝置。
另外，可將該試劑包被于主體內(nèi)表面上，該表面在使用中恰好與血管接觸。另外，可將試劑分散至整個(gè)主體的結(jié)構(gòu)中。
希望的是該裝置的主體具有抵抗扭轉(zhuǎn)力的足夠強(qiáng)度。為此目的，例如該主體可用內(nèi)層如膠原蛋白膜或縱向、橫向或螺旋的肋所構(gòu)成?？商峁?chǔ)存器再分為區(qū)室的肋，以提供附加的穩(wěn)定性。
這些蛋白質(zhì)或核酸可用于由任何臨床情況引起的內(nèi)膜增生的治療或預(yù)防。例如，治療任何類型手術(shù)方法后產(chǎn)生的增生是可能的，這些手術(shù)方法包括血管成形術(shù)，如氣囊血管成形術(shù)；分流手術(shù)，如將靜脈與動(dòng)脈吻合的冠狀分流手術(shù)；其它吻合方法，如腿部的吻合術(shù)；以及動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)，如頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)。治療與動(dòng)脈損傷或高血壓如肺動(dòng)脈高血壓相關(guān)的內(nèi)膜增生也是可能的。本發(fā)明提供任何類型血管中如動(dòng)脈或靜脈中內(nèi)膜增生的治療，優(yōu)選地是動(dòng)脈。
根據(jù)本發(fā)明，治療或改善確定的內(nèi)膜增生或從發(fā)生時(shí)預(yù)防內(nèi)膜增生是可能的。同樣，減少發(fā)生的內(nèi)膜增生的可能性、或減少確定的內(nèi)膜增生或可能發(fā)生的增生之嚴(yán)重程度是可能的。根據(jù)本發(fā)明的治療可發(fā)生于手術(shù)方法之前、期間或之后，例如為了減少手術(shù)后發(fā)生增生的機(jī)會(huì)。
優(yōu)選地，以預(yù)防或治療從頭狹窄為目的施用VEGF核酸或蛋白質(zhì)。然而，它也能用于治療或預(yù)防再狹窄。
優(yōu)選地以包含藥學(xué)可接受的載體的藥物制劑形式輸送本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸。可以使用任何合適的藥物制劑。
例如，合適的制劑可包括無菌注射水溶液和非水溶液，該溶液可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、殺菌抗生素和使制劑與接受者的血液等滲的溶質(zhì)；并且可包括可包含懸浮劑和增稠劑的無菌水懸液和非水懸液。該制劑可存在于單位劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿和管瓶中，并可貯存于冷凍的或冷凍干燥的(凍干的)條件下，使用前只需加入無菌液體載體，例如注射用水。
應(yīng)當(dāng)理解，除了以上特別提到的成分之外，考慮到所述制劑的類型，本發(fā)明的制劑可包含本領(lǐng)域中的其它常規(guī)試劑。在可能的制劑中，無菌的不含致熱原的水溶液和非水溶液是優(yōu)選的。
可以以任何合適的劑量并使用任何合適的劑量方案輸送蛋白質(zhì)、核酸和載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，根據(jù)許多因素，劑量和方案可使之適合于確保對(duì)所治療的特殊病癥的最佳治療。這些因素可以是年齡、性別和所治療的患者的臨床癥狀。
對(duì)于編碼VEGF的裸露核酸或包含這些核酸的構(gòu)建體的輸送，一般的劑量是每次施用0.1-5000μg，例如50-2000μg，如50-100μg、100-500μg或500-2000μg。對(duì)于VEGF蛋白質(zhì)的輸送，合適的劑量包括1-1000μg，如1-10μg、10-100μg、100-500μg或500-1000μg。
通過病毒或非病毒載體用于VEGF核酸輸送的劑量將依賴于許多因素，包括載體將VEGF核酸輸送至細(xì)胞的效率，和VEGF核酸在細(xì)胞中表達(dá)的效率。
例如，可以用104到1014cfu或pfu/ml的劑量輸送病毒載體，例如104到106、106到108、108到1010、1010到1012或1012到1014cfu或pfu/ml。105到109cfu或pfu/ml左右的劑量是優(yōu)選的。術(shù)語pfu(蝕斑形成單位)用于某些病毒，包括腺病毒，并對(duì)應(yīng)于病毒溶液的感染性，其測(cè)定方法是感染適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物，以及通常48小時(shí)后的感染細(xì)胞蝕斑數(shù)量的測(cè)定。術(shù)語cfu(集落形成單位)應(yīng)用于其它病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，其是通過本領(lǐng)域已知的方法通常在用選擇性標(biāo)記物溫育14天后測(cè)定的。測(cè)定病毒溶液的cfu或pfu滴度的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知。
對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒，105到106cfu/ml左右的劑量是特別優(yōu)選的。對(duì)于假型逆轉(zhuǎn)錄病毒，107cfu/ml左右的劑量是特別優(yōu)選的。對(duì)于腺病毒，109pfu/ml左右的劑量是特別優(yōu)選的。
同樣，這些劑量可包含于本發(fā)明的植入物內(nèi)用于逐步輸送(gradualdelivery)。
也可如上所述以任何合適的劑量、通過任何施用方法輸送與非病毒載體結(jié)合的VEGF核酸，或從植入物中逐步輸送。合適的劑量一般是0.1-1000μg的核酸，例如1-100μg、100-500μg或500-1000μg、1000-2000μg、2000-3000μg或3000-5000μg。優(yōu)選的劑量是5-50μg左右，如10-20μg。
用藥日程也將根據(jù)例如施用途徑、接受者的種類和接受者的病癥而不同。然而，應(yīng)設(shè)想延續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月時(shí)段的單次施用和多次施用。同樣，如上所述，可以通過適于安裝至血管、優(yōu)選地動(dòng)脈周圍的植入物，實(shí)現(xiàn)VEGF蛋白質(zhì)和核酸的輸送；優(yōu)選地，該植入物是套環(huán)的形式。這種植入物將實(shí)現(xiàn)逐步輸送。例如，輸送可以發(fā)生于數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月的時(shí)間。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸也可通過任何施用形式施用，例如局部、皮膚、腸胃外、肌肉內(nèi)、皮下或透皮施用，或通過直接注射入血流、直接注射入動(dòng)脈壁或其周圍或通過對(duì)粘膜組織直接應(yīng)用。優(yōu)選地，如上所述通過植入物施用。
可在任何哺乳動(dòng)物中使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)、核酸和載體治療內(nèi)膜增生。對(duì)人類患者的治療是優(yōu)選的。
本發(fā)明也提供用于治療或預(yù)防內(nèi)膜增生的試劑盒。這些試劑盒包含(i)一種試劑，如以上所述的、優(yōu)選地與載體結(jié)合的VEGF蛋白質(zhì)或核酸；和(ii)本發(fā)明的一種植入物，其以套環(huán)的形式，可以將VEGF蛋白質(zhì)或核酸引入其中。優(yōu)選地，如上所述以包含藥學(xué)可接受的載體的藥物制劑形式提供VEGF核酸或蛋白質(zhì)。組分(i)和(ii)可以以任何合適的方式包裝。也可包括本領(lǐng)域已知的其它組分，例如標(biāo)準(zhǔn)試劑和/或溶液和/或裝置。
本發(fā)明也提供治療或預(yù)防內(nèi)膜增生的方法，包括對(duì)需要這種治療的患者施用無毒性的有效量的本發(fā)明之VEGF蛋白質(zhì)、核酸或激動(dòng)劑。以在此所述的方法實(shí)現(xiàn)這種治療。
如上所述，本發(fā)明的植入物，尤其是以套環(huán)形式的植入物，也能用于VEGF之外的試劑向血管如動(dòng)脈的輸送。用此方法可輸送任何合適的試劑，以實(shí)現(xiàn)希望的治療目的。
已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物、MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒、VSV-G逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒導(dǎo)致在加套環(huán)的動(dòng)脈中的表達(dá)。腺病毒的基因轉(zhuǎn)移率最高，假型VSV-G逆轉(zhuǎn)錄病毒也產(chǎn)生相對(duì)高的轉(zhuǎn)染效率。以前未證明復(fù)制-缺損型VSV-G逆轉(zhuǎn)錄病毒在動(dòng)脈基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。在腺病毒轉(zhuǎn)染動(dòng)脈的某些內(nèi)皮細(xì)胞中看到表達(dá)。由于發(fā)生從外膜到內(nèi)膜的侵入，這些結(jié)果引出使用VEGF之外的基因通過腔外基因轉(zhuǎn)移在人類疾病中改變內(nèi)皮功能的一般可能性。這也可用于可擴(kuò)散的或分泌的基因產(chǎn)物在外膜和外中膜中的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物于是在動(dòng)脈壁其它處起作用。優(yōu)選地，如上所述，這種輸送實(shí)現(xiàn)內(nèi)膜增生的治療，盡管它也可實(shí)現(xiàn)其它的或備擇的治療目的。
以此方式輸送的優(yōu)選的治療劑包括在動(dòng)脈壁中刺激一氧化氮(NO)產(chǎn)生的VEGF之外的蛋白質(zhì)。實(shí)現(xiàn)內(nèi)膜增生的治療或預(yù)防的NO合成酶尤其是可誘導(dǎo)的NO合成酶(iNOS)的輸送是特別優(yōu)選的。
其它優(yōu)選的治療劑包括激活內(nèi)皮VEGF受體的激動(dòng)劑(見上)。這些激動(dòng)劑一般是合成小分子。也可使用包含VEGF蛋白質(zhì)肽片段的肽。在此情況中，如以上對(duì)于VEGF所述，可通過肽本身的輸送或編碼它們的核酸的輸送來實(shí)現(xiàn)治療。優(yōu)選地是通過相同途徑輸送，即通過在此所述的植入物輸送，盡管它們能被系統(tǒng)性輸送。
優(yōu)選地，治療劑將是編碼藥學(xué)活性多肽或蛋白質(zhì)的核酸的形式。更優(yōu)選地，如上所述，該核酸將包含于一個(gè)構(gòu)建體中。再更優(yōu)選地，將通過如上所述的載體(如以上所述的病毒或非病毒載體)將核酸或構(gòu)建體輸送至動(dòng)脈。
因此，動(dòng)脈外的基因轉(zhuǎn)移能用于遺傳物質(zhì)向血管壁優(yōu)選地動(dòng)脈壁的輸送。從實(shí)施例中能看到，能從外膜一側(cè)實(shí)現(xiàn)中間SMC的變化以及甚至內(nèi)皮的變化，這使得用于血管例如動(dòng)脈疾病治療的新方法的發(fā)展。
因此，本發(fā)明提供NOS(任選地iNOS)或編碼NOS(任選地iNOS)的核酸的應(yīng)用，用于治療或預(yù)防血管內(nèi)膜增生的藥物的制造；其中如以上對(duì)于VEGF所述，以植入物優(yōu)選地以套環(huán)的方式提供NOS蛋白質(zhì)或核酸。
本發(fā)明也提供試劑盒，其包含(i)NOS(任選地iNOS)蛋白質(zhì)或核酸；和(ii)本發(fā)明的一種植入物。這些試劑盒如以上對(duì)于VEGF所述。它們適于血管內(nèi)膜增生的治療或預(yù)防。
本發(fā)明也提供治療血管內(nèi)膜增生的一種方法，包括將包含NOS蛋白質(zhì)或核酸的本發(fā)明的植入物植入待治療或預(yù)防的增生附近，由此實(shí)現(xiàn)NOS蛋白質(zhì)或核酸的輸送。
如以上對(duì)于VEGF所述，NOS核酸優(yōu)選地與載體相結(jié)合。如以上對(duì)于VEGF所述進(jìn)行治療，劑量和藥物制劑也如以上對(duì)于VEGF所述。
本發(fā)明也提供包含NOS(任選地iNOS)蛋白質(zhì)或核酸的本發(fā)明的植入物。
VEGF在動(dòng)脈壁中刺激NO和前列環(huán)素產(chǎn)生的發(fā)現(xiàn)也提示，VEGF和VEGF受體的激動(dòng)劑將用于其它NO-相關(guān)的和/或前列環(huán)素-相關(guān)的病癥的治療。
特別是，VEGF和與VEGF結(jié)合的受體之激動(dòng)劑可以用來治療高血壓。Forte等人，柳葉刀(1997)349837-42，發(fā)現(xiàn)低NO水平是患有原發(fā)性(即系統(tǒng)性)高血壓的個(gè)體的特征。已知NO放松血管壁；Forte等人建議，削弱的NO產(chǎn)生減少了這種放松，導(dǎo)致血管的收縮，并因此提高了血壓。另外，在患原發(fā)性高血壓的個(gè)體中，前列環(huán)素的水平可能被抑制。
由于VEGF刺激NO和前列環(huán)素產(chǎn)生，所以它可以用于治療高血壓。更明確地，本發(fā)明的一種試劑可以用于特別感興趣的三種疾病的治療。
第一種是原發(fā)性高血壓，即任何部位或全身的系統(tǒng)性高血壓。對(duì)于是系統(tǒng)性病癥的原發(fā)性高血壓的治療，優(yōu)選地是通過基因治療以系統(tǒng)的方式輸送本發(fā)明的VEGF蛋白質(zhì)或激動(dòng)劑，例如通過編碼VEGF蛋白質(zhì)或激動(dòng)劑的VEGF核酸的系統(tǒng)輸送。
第二種是肺心病，即肺動(dòng)脈中高血壓引起的右心衰竭。這是可治療的，方法是施用如此處所述的VEGF核酸、蛋白質(zhì)和激動(dòng)劑，特別是經(jīng)一個(gè)動(dòng)脈套環(huán)(見上)將VEGF DNA輸送至動(dòng)脈，隨后DNA表達(dá)在動(dòng)脈壁中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
第三種是原發(fā)性肺高血壓，即肺中的高血壓。這通常最終導(dǎo)致心力衰竭和死亡，而且目前僅可通過連續(xù)前列環(huán)素灌輸或肺移植的方法來治療。在此，優(yōu)選的治療技術(shù)將是用編碼VEGF或其激動(dòng)劑的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染肺組織，由此在體內(nèi)產(chǎn)生VEGF并刺激NO和/或前列環(huán)素的產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明提供一種試劑在藥物制造中的應(yīng)用，該試劑選自血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、編碼VEGF的核酸、VEGF的激動(dòng)劑和編碼與VEGF結(jié)合的受體的激動(dòng)劑之核酸分子，所制造的藥物用于刺激一氧化氮(NO)或前列環(huán)素體內(nèi)的產(chǎn)生。
本發(fā)明的試劑盒，包括VEGF蛋白質(zhì)或核酸、或與VEGF結(jié)合的受體的激動(dòng)劑或編碼這些激動(dòng)劑的核酸，也適用于高血壓的治療。
本發(fā)明也提供一種治療或預(yù)防高血壓的方法，包括對(duì)患者施用無毒性的有效量的本發(fā)明VEGF蛋白質(zhì)、核酸或激動(dòng)劑。如在此所述實(shí)現(xiàn)這種治療。對(duì)于原發(fā)性肺高血壓，如在此所述，優(yōu)選的方法是用編碼VEGF的核酸或編碼與VEGF結(jié)合的受體的激動(dòng)劑之核酸轉(zhuǎn)化肺組織。
根據(jù)本發(fā)明能治療的另一種病癥是動(dòng)脈粥樣硬化，其可以是NO-相關(guān)的和/或前列環(huán)素-相關(guān)的病癥。涉及動(dòng)脈粥樣硬化的治療，優(yōu)選地使用如此處所述的VEGF激動(dòng)劑。
因此，本發(fā)明提供一種試劑在藥物制造中的應(yīng)用，該試劑選自血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、編碼VEGF的核酸、VEGF的激動(dòng)劑和編碼與VEGF結(jié)合的受體激動(dòng)劑的核酸分子，所制造的藥物用于通過刺激NO和/或前列環(huán)素體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療。
本發(fā)明也提供一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，包括對(duì)患者施用無毒性的有效量的本發(fā)明之VEGF蛋白質(zhì)、核酸或激動(dòng)劑。如在此所述實(shí)現(xiàn)這種治療。
對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的治療，一個(gè)優(yōu)選的輸送模式是，本發(fā)明的VEGF蛋白質(zhì)、或優(yōu)選地本發(fā)明的VEGF激動(dòng)劑的經(jīng)口服輸送，例如以片劑的形式。
以下實(shí)施例說明了本發(fā)明。使用以下縮寫B(tài)SA -牛血清白蛋白DMEM -Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基FCS -胎牛血清HUVEC-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IgG -免疫球蛋白GMAP激酶 -促分裂原-激活的蛋白激酶mAb -單克隆抗體
PBS -磷酸緩沖鹽溶液PGI2-前列環(huán)素cPLA2-胞質(zhì)磷脂酶A2PIGF -胎盤生長(zhǎng)因子SDS PAGE -十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳VEGF -血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子vWF -馮威勒布蘭特因子VSMC -血管平滑肌細(xì)胞實(shí)施例1使用插入頸動(dòng)脈周圍的硅套環(huán)，研究了內(nèi)皮細(xì)胞(EC)-特異的VEGF基因轉(zhuǎn)移對(duì)內(nèi)膜增厚的作用，該套環(huán)既作為引起內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑又作為基因和載體的儲(chǔ)存器。該模型保持EC的完整性，并允許不需任何血管內(nèi)操作的直接的血管外基因轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例1.1基因轉(zhuǎn)移通過在全身麻醉下在動(dòng)脈周圍插入一個(gè)惰性硅套環(huán)，在32只新西蘭白兔中誘導(dǎo)內(nèi)膜增厚(Booth等人，動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis)(1989)76257-268)。套環(huán)定位5天后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，方法是在麻醉下輕輕打開該套環(huán)，并向該套環(huán)(即在動(dòng)脈外膜表面)內(nèi)注射500μl質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物。該研究的任何步驟中不涉及血管內(nèi)操作步驟。
質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物將25μg pCMV5-VEGF-164質(zhì)粒(包含小鼠VEGF cDNA(Breier等人，發(fā)育(Development)(1992)114521-32；核苷酸1-583))與25μlLipofectin(BRL)復(fù)合，用林格液稀釋至500μl。在基因轉(zhuǎn)移前將復(fù)合物置于室溫至少15分鐘。據(jù)以前測(cè)定，在本研究所使用的濃度上，質(zhì)粒/Lipofectin復(fù)合物在體外對(duì)兔主動(dòng)脈EC無毒性。用相似的包含大腸桿菌lacZ cDNA(Kalnins等人，出處同前)(核苷酸1-3100)表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染對(duì)照動(dòng)脈。使用Qiagen Mega柱從大腸桿菌培養(yǎng)物(DH5α)中分離用于本研究的質(zhì)粒，并用三次酚/氯仿抽提和一次乙醇沉淀純化(Ausubel等人，編，《分子生物學(xué)通用方案》(Current Protocolsin Molecular Biology)New York，NYGreene Publishing Associates andJohn Wiley & Sons(1991)4.2.3-4.2.4)。將其調(diào)節(jié)至1μg/μl，分析其無任何微生物或內(nèi)毒素污染(鱟試驗(yàn)，檢測(cè)下限0.2ng)。基因轉(zhuǎn)移操作3天(n＝8)、7天(n＝12)和14(n＝12)天后處死動(dòng)物；仔細(xì)去除動(dòng)脈，將其分為三個(gè)相等部分將近側(cè)三分之一在4％多聚甲醛/PBS中浸沒-固定15分鐘，并包埋于OCT化合物中(Miles Scientific)(Yla-Herttuala等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)(1995)952692-2698)。中端三分之一如上固定4小時(shí)，在15％蔗糖中漂洗48小時(shí)，并包埋于石蠟中。將遠(yuǎn)端三分之一直接包埋于OCT化合物中，并在液氮中冷凍。在4個(gè)動(dòng)脈中，遠(yuǎn)端三分之一用于mRNA分離和RT-PCR(見下)。從中段部分隨機(jī)選擇的10個(gè)切片用來由兩名不知道樣品來源的獨(dú)立觀察者進(jìn)行內(nèi)膜/中膜厚度比的測(cè)定(Yla-Herttuala等人，動(dòng)脈粥樣硬化(1989)6230-236)。使用兩個(gè)獨(dú)立測(cè)定的平均值計(jì)算結(jié)果(平均值±SD)。通過ANOVA分析各組之間內(nèi)膜/中膜厚度比的差異，隨后進(jìn)行改良的t-檢驗(yàn)(*p＜0.05)。
RT-PCR將基因轉(zhuǎn)移7天后收集的VEGF(n＝2)和lacZ(n＝2)轉(zhuǎn)染動(dòng)脈的末梢部分用來進(jìn)行mRNA分離(Micro-FastTrack，Invitrogen)，并如述(Hiltunen等人循環(huán)(Circulation)(1995)923297-3303)使用隨機(jī)六堿基引物(cDNA循環(huán)試劑盒，Invitrogen)用AMLV反轉(zhuǎn)錄酶(每反應(yīng)5U，Boehringer)反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。用Taq聚合酶(Boehringer)和對(duì)轉(zhuǎn)染的pCMV5-VEGF-164構(gòu)建體特異的引物，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR(5’-引物SEQ ID No.9；3’-引物SEQ ID No.10；PCR循環(huán)參數(shù)除最后一個(gè)循環(huán)5分鐘外，1分鐘90℃，1分鐘60℃，1分鐘72℃)。在VEGF-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中可見到具有預(yù)期長(zhǎng)度(547nt)的擴(kuò)增片段。DNA大小標(biāo)記(1kb梯度，BRL)顯示于凝膠兩側(cè)。
拍攝顯微照片，顯示VEGF或lacZ基因轉(zhuǎn)移7天后兔頸動(dòng)脈的特征。轉(zhuǎn)染動(dòng)脈的免疫染色證明用lacZ-質(zhì)粒/脂質(zhì)體(SMC-特異的MAbHHF-35，1∶500稀釋，Enzo Diagnostics)轉(zhuǎn)染的對(duì)照動(dòng)脈顯示典型的內(nèi)膜增厚；用VEGF質(zhì)粒/脂質(zhì)體(SMC-特異的MAb HHF-35)轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈僅顯示有限的動(dòng)脈增厚；在所有研究的血管節(jié)段中存在內(nèi)皮(A的連續(xù)部分，EC-特異的MAb CD31，稀釋1∶50，DAKO)；在VEGF-和lacZ-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中沒有檢測(cè)到炎癥的證據(jù)(巨噬細(xì)胞特異的MAb RAM-11，稀釋1∶500，DKO)；基因轉(zhuǎn)移14天后在VEGF-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈外膜中見到新血管形成(蘇木精-曙紅染色)。
親和素-生物素辣根過氧化物酶系統(tǒng)(Vector Elite，Vector Labs)用于免疫染色(Yla-Herttuala等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1990)876959-6963)。免疫染色的對(duì)照包括用非相關(guān)的類和非相關(guān)種-匹配的免疫球蛋白的溫育，省略第一抗體的溫育。如述(Yla-Herttuala等人(1990)，出處同前)使用從pBluescript SK質(zhì)粒(Stratagene)合成的反義VEGF核探針(583nt)進(jìn)行原位雜交。簡(jiǎn)要地，用蛋白酶K預(yù)處理石蠟包埋的部分，將其乙?；?，并用35-S-UTP(DuPont，NEN)-標(biāo)記的核探針(6×106cpm/ml)在52℃雜交16小時(shí)。雜交后用0.1×SSC在60℃洗滌30分鐘。使用放射自顯影進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)(Eastman-Kodak NAB-2)。用非雜交的有義核探針(Yla-Herttuala等人(1990)，出處同前)進(jìn)行的對(duì)照雜交顯示陰性結(jié)果。切片用蘇木精復(fù)染。
實(shí)施例1.2如實(shí)施例1.1所述進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。從VEGF(n＝5)或lacZ(n＝5)基因轉(zhuǎn)移前一天開始，在飲用水中對(duì)兔施用L-NAME(70mg/kg/天)?；蜣D(zhuǎn)移7天后處死動(dòng)物，如上所述分析內(nèi)膜/中膜厚度比和組織學(xué)(Yla-Herttuala等人，動(dòng)脈硬化(Arteriosclerosis)(1986)6230-236；Yla-Herttuala等人，(1990)，出處同前)。消除內(nèi)膜增厚的差異。
實(shí)施例1.3用無血清培養(yǎng)基洗HUVEC的鋪滿培養(yǎng)物兩次，將培養(yǎng)物在所示濃度的重組人VEGF存在下與該培養(yǎng)基溫育15分鐘，或與10ng/ml VEGF溫育所示時(shí)間。在某些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用100μM L-NAME預(yù)處理1小時(shí)，隨后用或不用10ng/ml VEGF處理10分鐘。去除培養(yǎng)基，通過加入10mMTris/HCl(pH7.6)、50mM EDTA、50mM NaCl、30mM焦磷酸鈉、50mMNaF、0.1mM Na3VO4、1mM PMSF和1％Triton X-100(裂解緩沖液)，使細(xì)胞在4℃快速裂解。15000×g離心10分鐘澄清裂解物，通過將澄清的裂解物與PY20抗-磷酸酪氨酸mAb在4℃溫育2小時(shí)，進(jìn)行免疫沉淀。通過將裂解物與蛋白A-瓊脂糖再溫育1小時(shí)收集免疫沉淀物。用裂解緩沖液洗免疫沉淀物三次，然后用2×SDS-PAGE加樣緩沖液提取蛋白質(zhì)。SDS-PAGE后，將免疫沉淀的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜上，然后用PY20 mAb進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果顯示VEGF誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于VEGF受體的主要205kD蛋白質(zhì)的磷酸化(于100、125、145、190和205處的主要酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì))。L-NAME消除了對(duì)VEGF的應(yīng)答。
以25ng/ml的濃度加入重組VEGF，時(shí)間可達(dá)2小時(shí)(亞硝酸鹽產(chǎn)生從c.16μM的內(nèi)膜水平增加，保持于1.8-2μM)?；蛘咭运镜?、2.5、25ng/ml的濃度共進(jìn)行10分鐘。加入25ng/ml VEGF10分鐘后，測(cè)定L-NAME(100μM)預(yù)處理(1小時(shí))對(duì)VEGF應(yīng)答的影響。使用毛細(xì)管檢測(cè)法測(cè)定亞硝酸鹽的產(chǎn)生(Leone等人，《一氧化氮研究方法》(Methodsin Nitric Oxide Research)，F(xiàn)eelisch和Stanler編，John Wiley & Sons，NewYork(1996)499-508)。在VEGF存在下水平升至c.19和c.2.1μM；加入L-NAME降至對(duì)照水平(c.17μM)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與lacZ-轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)脈相比，在手術(shù)一周后VEGF基因轉(zhuǎn)移顯著降低了內(nèi)膜增厚(分別是，內(nèi)膜/中膜比0.3對(duì)1.1，＜0.05)。兩周后效果降低，這可能是因?yàn)檫@樣一個(gè)事實(shí)，質(zhì)粒/脂質(zhì)體-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移一般僅誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的暫時(shí)表達(dá)，最大蛋白質(zhì)表達(dá)在基因轉(zhuǎn)移后2-3天之間(Nabel等人，生理學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Physiol.)(1994)56741-761)。
動(dòng)脈的免疫組化分析顯示，內(nèi)膜增厚幾乎全部由SMC組成。內(nèi)皮層出現(xiàn)于所有研究的區(qū)段。在轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中沒有檢測(cè)到相反的作用或炎癥。
使用對(duì)轉(zhuǎn)基因特異的引物通過RT-PCR以及通過原位雜交，確證了轉(zhuǎn)染的VEGF的表達(dá)。大多數(shù)VEGF和lacZ表達(dá)發(fā)生于成纖維細(xì)胞和SMC的外膜和外中膜?；蜣D(zhuǎn)移14天后在三個(gè)VEGF-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中看到外膜新血管形成。在lacZ-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中未檢測(cè)到新血管形成。
以前顯示，使用套環(huán)模型的lacZ-質(zhì)粒/脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)移在0.05％的動(dòng)脈細(xì)胞中導(dǎo)致局部基因轉(zhuǎn)移。盡管基因轉(zhuǎn)移率低，但套環(huán)內(nèi)部產(chǎn)生的分泌形式的VEGF在局部動(dòng)脈微環(huán)境中導(dǎo)致生物學(xué)作用，這如基因轉(zhuǎn)移14天后三個(gè)VEGF-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中新血管形成的出現(xiàn)所示。在急性缺氧中，認(rèn)為分泌的VEGF通過擴(kuò)散到達(dá)EC，并與EC上的VEGF受體結(jié)合。
假定VEGF對(duì)內(nèi)膜增厚的抑制作用是由于直接或間接VEGF-誘導(dǎo)的EC-衍生因子，或是由于隨后能抑制SMC增殖的活性。特別是，假定VEGF對(duì)內(nèi)膜增厚的作用是通過NO途徑所介導(dǎo)的。在一系列新西蘭白兔(n＝8)中，通過在基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)期間對(duì)動(dòng)物施用NO合成酶抑制劑L-NAME，測(cè)試了這一假設(shè)。發(fā)現(xiàn)L-NAME消除了VEGF轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈和lacZ-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈之間內(nèi)膜增厚的差異。動(dòng)脈壁中VEGF的主要靶細(xì)胞是EC。具有VEGF受體的其它細(xì)胞型僅僅是單核細(xì)胞，但是如用特異性抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)所判斷的，在這些情況下加套環(huán)的動(dòng)脈中不存在單核細(xì)胞。
這些結(jié)果(內(nèi)膜增厚差異的能力)與通過刺激NO產(chǎn)生VEGF-誘導(dǎo)的內(nèi)膜增厚之抑制相一致。因此要核查在EC培養(yǎng)物中VEGF是否能直接刺激NO產(chǎn)生。VEGF在1-25ng/ml濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)于VEGF受體的主要205kDa蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。如亞硝酸鹽水平的測(cè)定所監(jiān)測(cè)的，VEGF向培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的添加引起時(shí)間-和濃度-依賴的NO產(chǎn)生的增加。VEGF對(duì)NO產(chǎn)生的作用早至VEGF加入30秒后即可看到，5分鐘后達(dá)到最大，可保持達(dá)2小時(shí)。5ng/ml時(shí)獲得VEGF的半數(shù)最大作用(half maximal)。VEGF-誘導(dǎo)的磷酸化和NO產(chǎn)生在100μM L-NAME存在時(shí)完全消除。因此，可能是VEGF基因轉(zhuǎn)移刺激了轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈EC中NO的產(chǎn)生，并經(jīng)NO-介導(dǎo)的機(jī)制至少部分地限制了SMC的增殖。此發(fā)現(xiàn)與以前的用內(nèi)皮NO合成酶cDNA對(duì)動(dòng)脈的轉(zhuǎn)染降低了內(nèi)膜增厚的觀察相一致(Von der Leyon等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1995)921137-1141)。
Callow等人(出處同前)和Asahara等人(出處同前)推斷，VEGF蛋白質(zhì)的施用刺激裸露動(dòng)脈中EC的增殖，但未研究參與內(nèi)膜增厚抑制的實(shí)際機(jī)理。在加套環(huán)的頸動(dòng)脈中，在解剖學(xué)完整的內(nèi)皮存在下，刺激內(nèi)膜增厚。因此，在此報(bào)道的動(dòng)脈VEGF基因轉(zhuǎn)移對(duì)內(nèi)膜增厚的的抑制作用不可能是因?yàn)閂EGF-刺激的再內(nèi)皮化。根據(jù)這些結(jié)果，VEGF能在HUVEC中直接誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，這是VEGF能抑制內(nèi)膜增厚的一種機(jī)制。VEGF也可刺激能負(fù)調(diào)節(jié)SMC增殖的其它因子的產(chǎn)生，包括TGF-β或前列環(huán)素。
實(shí)施例2使用質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物用于基因輸送，使用應(yīng)用于外膜的硅膠套環(huán)，將莫洛尼鼠類白血病毒-衍生的(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄病毒、包含假型皰疹性口腔炎病毒蛋白-G(VSV-G)的逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒輸送至兔頸動(dòng)脈。使用套環(huán)是因?yàn)?)它提供了一種基因輸送儲(chǔ)存器；2)不用進(jìn)行腔內(nèi)操作，內(nèi)皮始終保持解剖學(xué)完整；以及3)套環(huán)的安裝誘導(dǎo)了動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC)的增殖，并提高了需要靶細(xì)胞增殖處的逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移率。
基因轉(zhuǎn)移使用新西蘭白兔(1.8-2.5kg)。麻醉劑是芬太尼-氟茴哌丁酮(0.3ml/kg)/咪達(dá)唑侖(1mg/kg)(Yla-Herttuala等人，臨床研究雜志(1995)952692-2698)。中線頸切口暴露出左頸動(dòng)脈。將一個(gè)生物學(xué)惰性的2cm硅膠套環(huán)(MediGene Oy，Kuopio，芬蘭)放置于頸動(dòng)脈周圍，以使其在一端輕輕接觸外膜(Booth等人，出處同前)。套環(huán)手術(shù)4-5天后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。為了基因轉(zhuǎn)移，將動(dòng)物再麻醉。將已通過手術(shù)重新暴露的套環(huán)輕輕地打開，裝入500μl基因轉(zhuǎn)移液(見下)。關(guān)閉切口，隨后分析動(dòng)脈的基因轉(zhuǎn)移率。
組織學(xué)分析仔細(xì)去除加套環(huán)的動(dòng)脈，將其分為三個(gè)相等部分將近端三分之一在4％多聚甲醛/PBS(pH7.4)中浸沒-固定15分鐘，隨后包埋于OCT化合物中(Miles Scientific，USA)。中端三分之一在4％多聚甲醛/PBS(pH7.4)中浸沒-固定4小時(shí)，在15％蔗糖(pH7.4)中漂洗48小時(shí)，并包埋于石蠟中。將遠(yuǎn)端三分之一包埋于OCT化合物中，并加工為冷凍切片。用X-gal對(duì)隨機(jī)選擇的10個(gè)切片的β-半乳糖苷酶活性染色12小時(shí)，用于基因轉(zhuǎn)移率的測(cè)定(Nabel等人，科學(xué)(1990)2491285-1288；Yla-Herttuala等人，(1995)，出處同前)?；蜣D(zhuǎn)移率計(jì)算為含β-半乳糖苷酶的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)、20個(gè)隨機(jī)選擇的100×視野中核總數(shù)的比例。從每三分之一部分的加套環(huán)動(dòng)脈中隨機(jī)選擇的切片，用于進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞型和/或內(nèi)膜/中膜厚度比的分析(Booth等人，出處同前)。
使用以下抗體鑒定細(xì)胞型SMCHHF-35mAb(1∶500稀釋，EnzoDiagnostics，美國(guó))、α-肌動(dòng)蛋白mAb(1∶1000稀釋；Sigma ChemicalCo.)；巨噬細(xì)胞RAM-11mAb(1∶1000稀釋；Dako，美國(guó))、抗-CD68mAb(1∶250稀釋；Dako)；內(nèi)皮細(xì)胞抗-CD31mAb(1∶50稀釋；Dako)；多形核白細(xì)胞抗-CD45 mAb(1∶100稀釋；Dako)；以及抗-兔T-細(xì)胞MCA805 mAb(1∶1000稀釋；Dako)。親和素-生物素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)用于信號(hào)檢測(cè)(Vector laboratories)(Yla-Herttuala等人，(1995)，出處同前)。免疫染色后，將組織切片用蘇木精負(fù)染。
增殖指數(shù)的測(cè)定使用5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記測(cè)定加套環(huán)的動(dòng)脈中的增殖指數(shù)(Soma等人，動(dòng)脈硬化和血栓形成(Arterioscler.Thromb.)(1993)13571-578)。簡(jiǎn)要地，處死前3小時(shí)對(duì)新西蘭白兔(n＝12)注射BrdU(40mg/kg體重)。將頸動(dòng)脈在70％的乙醇中固定過夜，并包埋于石蠟中。碘化乙錠染色核后，使用FITC-標(biāo)記的抗-小鼠IgG(Dako)染色系列切片(每只動(dòng)物20個(gè)切片)以檢測(cè)BrdU。標(biāo)記指數(shù)計(jì)算為BrdU-陽性核的百分?jǐn)?shù)。對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行假手術(shù)用作對(duì)照。
質(zhì)粒/脂質(zhì)體將pCMV-β-半乳糖苷酶(lacZ)表達(dá)質(zhì)粒(Promega)與Lipofectin(BRL)如下復(fù)合25μg質(zhì)粒與25μl Lipofectin試劑緩慢混合，用林格液稀釋至500μl。在質(zhì)粒/Lipofectin溶液中未發(fā)現(xiàn)沉淀。將混合物置于室溫至少15分鐘，并在兩小時(shí)之內(nèi)用于基因轉(zhuǎn)移。檢查質(zhì)粒制劑中不存在脂多糖的污染(鱟試驗(yàn)，Sigma Chemical Co.)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒含LacZ的pLZRNL MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒(Yla-Herttuala等人，(1995)，出處同前；Miyanohara等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1988)856538-6542)或LacZ VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Yee等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1994)919564-9568)用于本研究。兩者中，LacZ的表達(dá)由5′LTR驅(qū)動(dòng)。復(fù)制-缺損型LZRNL兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒被包裝于PA317細(xì)胞中，并如述以5×105cfu/ml的滴度使用(Yla-Herttuala等人，(1995)，出處同前)。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Yee等人，出處同前)在293GP細(xì)胞中產(chǎn)生復(fù)制缺損型VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒。使用超離心濃縮假型逆轉(zhuǎn)錄病毒，并以1×107cfu/ml的滴度使用。使用前，檢查逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑不含任何細(xì)菌污染物或輔助病毒(Yee等人，出處同前)。
腺病毒載體E1-缺失的復(fù)制缺損型腺病毒用于本研究(Gosh-Choudhury等人，基因(1986)50161-171；Simari等人，臨床研究雜志(1996)98225-235)。使用同源重組將位于一個(gè)β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和一個(gè)CMV增強(qiáng)子之下的核導(dǎo)向β-半乳糖苷酶cDNA克隆至腺病毒基因組的E1-缺失區(qū)(Gosh-Choudhury等人，出處同前；Simari等人，出處同前)。在293細(xì)胞中產(chǎn)生復(fù)制缺損型腺病毒，并通過超離心濃縮。1×109pfu/ml的滴度用于基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。分析腺病毒制劑不含輔助病毒或細(xì)菌污染物(Gosh-Choudhury等人，出處同前)。
結(jié)果外膜套環(huán)導(dǎo)致手術(shù)7-14天后新內(nèi)膜增生。整個(gè)研究中內(nèi)皮保持解剖學(xué)完整。BrdU標(biāo)記顯示手術(shù)3天后23％的峰增生指數(shù)。新內(nèi)膜完全由SMC組成。質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物導(dǎo)致基因向外膜和外中膜的可檢測(cè)的轉(zhuǎn)移，效率小于0.01％。未轉(zhuǎn)染的或脂質(zhì)體-處理的加套環(huán)動(dòng)脈顯示無β-半乳糖苷酶活性著色。
無套環(huán)時(shí)外膜逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率較低，這也許是因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移僅發(fā)生于增殖細(xì)胞中。復(fù)制缺損型MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移率低(小于0.01％)。VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率是0.1％。使用MMLV和VSV-G逆轉(zhuǎn)錄病毒，在外膜和外中膜中觀察到β-半乳糖苷酶著色。
復(fù)制-缺損型腺病毒顯示有效的基因轉(zhuǎn)移，在外膜和外中膜中檢測(cè)到β-半乳糖苷酶著色。令人感興趣的是，在某些內(nèi)皮細(xì)胞和某些內(nèi)膜細(xì)胞中也觀察到著色。由于lacZ腺病毒構(gòu)建體包含一個(gè)β-半乳糖苷酶的核定位信號(hào)，所以強(qiáng)烈的X-gal著色位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核中。從分析的切片中著色核的總數(shù)估計(jì)，基因轉(zhuǎn)移率大約是10％。在VSV-G逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒-轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中看到一些炎癥細(xì)胞。在質(zhì)粒/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的動(dòng)脈中看不到炎癥細(xì)胞。
在本實(shí)施例中，用所有基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)均發(fā)生β-半乳糖苷酶(lacZ)標(biāo)記基因向外膜和外中膜的轉(zhuǎn)移。腺病毒也將β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)移至某些內(nèi)皮細(xì)胞。5天后，腺病毒載體產(chǎn)生最高的基因轉(zhuǎn)移率，可達(dá)10％的細(xì)胞顯示β-半乳糖苷酶活性。假型VSV-G逆轉(zhuǎn)錄病毒在完成外膜和外中膜中0.1％細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方面也是有效的。質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物和MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒感染＜0.01％的細(xì)胞。任何基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中均未觀察到相反的組織反應(yīng)。
因此，復(fù)制-缺損型腺病毒、VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒和質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物能用于使用套環(huán)方法的向動(dòng)脈壁轉(zhuǎn)移基因。對(duì)中間SMC甚至內(nèi)皮的作用能從外膜側(cè)部實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，檢測(cè)了VEGF對(duì)PGI2的刺激。
細(xì)胞培養(yǎng)從Clonetics獲得HUVEC，并在廠商自帶的補(bǔ)加2％FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或者HUVEC通過膠原酶消化從新鮮臍帶生長(zhǎng)，并培養(yǎng)于1％明膠包被的含補(bǔ)加20％ FCS和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物的培養(yǎng)基199的平板上(Wheeler-Jones等人，生物化學(xué)雜志(Biochem J.)(1996)315407-416)。用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，通過用0.05％胰蛋白酶/0.02％ EDTA于37℃處理5分鐘分散HUVEC原代培養(yǎng)物，然后再涂板于90mm、60mm或35mm塑料平皿中、或24-孔平板上。將培養(yǎng)物保持于含5％CO2和90％空氣的37℃潮濕環(huán)境中，6-8天后或當(dāng)細(xì)胞形成鋪滿的單層時(shí)使用該培養(yǎng)物。
PGI2測(cè)定將24-孔板中HUVEC的鋪滿培養(yǎng)物在無血清M199(pH7.4)中洗兩次，并暴露于含VEGF的培養(yǎng)基。通過6-酮基-PGF1a的放射免疫測(cè)定定量細(xì)胞上清液中的PGI2含量，6-酮基-PGF1a是如前所述(Wheeler-Jones等人，出處同前)的PGI2的穩(wěn)定的分解產(chǎn)物。
花生四烯酸釋放基本上如述(Domin和Rozengurt，生物化學(xué)雜志(1993)2688927-8934)測(cè)定花生四烯酸的釋放。鋪滿的HUVEC培養(yǎng)物與[5，6，8，9，11，12，14，15-3H]花生四烯酸(1mCi/ml，211Ci/mmol)溫育24小時(shí)。然后用培養(yǎng)基199洗細(xì)胞兩次，并在補(bǔ)加0.3％ BSA(基本上不含脂肪酸)和VEGF或凝血酶的1ml該培養(yǎng)基中溫育。處理后，去除培養(yǎng)基，在微量離心機(jī)中以16,000×g離心5分鐘，通過閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)測(cè)定上清液中的放射性。
Western印跡法如上所述和結(jié)果及圖例中所述，進(jìn)行因子對(duì)細(xì)胞休眠培養(yǎng)物的處理和細(xì)胞裂解。SDS-PAGE后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Immobilon膜(MilliporeInc.)。為了MAP激酶測(cè)定，使用5％在PBS、pH7.2中的脫脂奶粉封閉膜，并在含所示第一抗體(1mg/ml)的PBS/0.05％吐溫-20中溫育3-5小時(shí)。為了用抗體對(duì)cPLA2進(jìn)行免疫印跡，將膜在含0.2％(w/v)I-封閉(Tropix)的TBST 50mM Tris/HCl、150mM NaCl、0.02％(v/v)吐溫20 pH7.4(TBST)中封閉3小時(shí)，然后與第一抗血清在TBST中溫育。然后在TBST中洗膜6次(每次洗滌10分鐘)，并在含HRP-結(jié)合的第二抗體的TBST中溫育1小時(shí)。根據(jù)廠商說明使用HRP-結(jié)合的抗-小鼠或抗-兔IgG和ECLTM試劑通過化學(xué)發(fā)光法將免疫反應(yīng)帶顯色。
MAP激酶測(cè)定如述用因子處理細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS快速洗兩次，立即通過加入100ml煮沸的2×SDS-PAGE加樣緩沖液提取細(xì)胞。刮取收集細(xì)胞提取物，加熱至95℃10分鐘，在12.5％丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠上電泳。轉(zhuǎn)移至Immobilon膜后，用一種抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡，該抗體特異地識(shí)別由Tyr204的磷酸化所激活的p42和p44 MAP激酶(Erk-1和Erk-2)(Payne等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)(1991)10885-892)。cPLA2遷移率變動(dòng)分析將60nm平皿中的鋪滿的休眠HUVEC在無血清培養(yǎng)基199(pH7.4)中洗兩次，隨后如圖例所詳述接觸含因子的培養(yǎng)基指定的時(shí)間。如前所述制備細(xì)胞裂解物(Wheeler-Jones等人，出處同前)。經(jīng)SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至膜后用cPLA2的多克隆抗血清進(jìn)行免疫印跡(BorschHaubold等人，生物化學(xué)雜志(1995)27025885-25892；和Kramer等人，生物化學(xué)雜志(1996)27127723-27729)。
vWF分泌的測(cè)定如述用ELISA測(cè)定從用因子處理的HUVEC鋪滿培養(yǎng)物中獲得的培養(yǎng)基樣品中的vWF分泌(Wheeler-Jones等人，出處同前)。平板用抗-vWFmAb CLBRAg35包被，該測(cè)定法的較低檢測(cè)限度是大約1.0mU/ml。
材料重組VEGF從UBI或R&D系統(tǒng)獲得。重組PIGF是Werner Risau教授的贈(zèng)品，并且也從R&D系統(tǒng)獲得。多克隆cPLA2抗血清由RuthKramer博士(Eli Lilly，Indianapolis)惠贈(zèng)。抗-vWF mAb CLBRAg35是J.A.Van Mourik博士(中心血液實(shí)驗(yàn)室(Central Blood Laboratory)，阿姆斯特丹(Amsterdam)，荷蘭)的贈(zèng)品。p42/p44 MAP激酶激活的磷酸化形式的抗體購(gòu)自New England Biolabs Inc.。[5，6，8，9，11，12，14，15-3H]花生四烯酸、ECLTM試劑和HRP-結(jié)合的抗-小鼠IgG來自Amersham，英國(guó)。山羊抗-兔HRP-結(jié)合的IgG從Pierce Inc獲得。使用的所有其它試劑是可獲得的最純等級(jí)。
結(jié)果用VEGF處理HUVEC的鋪滿培養(yǎng)物，處理可長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)的不同時(shí)間，在這些時(shí)間時(shí)去除培養(yǎng)基，測(cè)定6-酮基-PGF1a的存在，6-酮基-PGF1a是PGI2的穩(wěn)定的代謝分解產(chǎn)物。VEGF引起PGI2時(shí)間-依賴性增長(zhǎng)的產(chǎn)生，這在早至因子加入15分鐘后即可檢測(cè)到，可持續(xù)增長(zhǎng)達(dá)60分鐘，其后可保持達(dá)2小時(shí)。在所檢查的時(shí)程中對(duì)照細(xì)胞僅顯示PGI2產(chǎn)生的較少增長(zhǎng)。VEGF刺激PGI2產(chǎn)生也是濃度-依賴性的。60分鐘的溫育后，可于5ng/ml濃度時(shí)檢測(cè)到PGI2合成的增長(zhǎng)，在10ng/ml時(shí)是半數(shù)-最大量，于15ng/ml濃度時(shí)達(dá)到最大。一直指出，VEGF-誘導(dǎo)的PGI2合成在25ng/ml時(shí)經(jīng)歷較小的降低。
也檢查了VEGF-相關(guān)的因子PIGF(Flt-1 VEGF受體的一種特異性配體)是否能在HUVEC中引起PGI2合成。在5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，PIGF刺激的PGI2合成明顯弱于VEGF。也將VEGF和PIGF兩者的應(yīng)答與凝血酶相對(duì)比，凝血酶是內(nèi)皮細(xì)胞和血小板中前列腺素類合成的一種有效的誘導(dǎo)劑。在幾個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，直接將VEGF、PIGF和凝血酶的作用在平行培養(yǎng)物中對(duì)比，用25ng/ml VEGF、60ng/ml PIGF和1U/ml凝血酶60分鐘溫育所產(chǎn)生的6-酮基-PGF1a的平均增長(zhǎng)倍數(shù)，分別是未刺激的平均對(duì)照水平的2.0倍、1.3倍和4.4倍。
如果PGI2合成的VEGF刺激是通過同種型PLA2的激活所介導(dǎo)的，預(yù)期VEGF將引起花生四烯酸從細(xì)胞中的快速動(dòng)用。為測(cè)試這一點(diǎn)，將HUVEC與放射性標(biāo)記的花生四烯酸預(yù)溫育24小時(shí)，隨后用VEGF攻擊不同時(shí)間。VEGF引起釋放至預(yù)標(biāo)記細(xì)胞的培養(yǎng)基中的標(biāo)記物增多，這在因子加入10分鐘后明顯，并在30分鐘后達(dá)到最大。如在平行培養(yǎng)物中所測(cè)定的，VEGF-刺激的花生四烯酸釋放的時(shí)程與凝血酶非常相似。VEGF-刺激的花生四烯酸釋放的濃度-依賴性與從PGI2產(chǎn)生所獲得的非常相似，半數(shù)最大作用在濃度為2.5-5ng/ml時(shí)，最大值在濃度為10-20ng/ml時(shí)。類似于凝血酶和VEGF刺激PGI2產(chǎn)生的相對(duì)能力，VEGF-誘導(dǎo)的最大花生四烯酸釋放一直低于從凝血酶所獲得的。在4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，VEGF和凝血酶引起標(biāo)記的花生四烯酸的釋放比未刺激的基礎(chǔ)水平分別有1.6倍和3.4倍的平均增長(zhǎng)。PIGF不引起花生四烯酸從預(yù)標(biāo)記的HUVEC中釋放的可檢測(cè)到的顯著增長(zhǎng)。
VEGF-刺激的花生四烯酸快速釋放的一種可能的機(jī)制是，PLA2的胞質(zhì)形式所催化的花生四烯酸的直接酶釋放。cPLA2可被MAP激酶-依賴的磷酸化所激活，類似于包括MAP激酶的其它酶的磷酸化和激活，cPLA2向其激活形式的轉(zhuǎn)化可以通過對(duì)SDS-PAGE凝膠中從快遷移向慢遷移形式的遷移率變動(dòng)來檢測(cè)。因此，使用cPLA2的特異性抗體通過HUVEC提取物的Western印跡分析測(cè)定應(yīng)答VEGF的cPLA2的激活(BorschHaubold等人，出處同前；和Kramer等人，出處同前)。在未刺激對(duì)照HUVEC的提取物中，cPLA2的抗體識(shí)別兩個(gè)大約相等亮度的分離帶，并以大約Mr 97,000遷移。盡管cPLA2具有85kDa的預(yù)測(cè)分子量，但以前報(bào)道該蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中以97kDa帶遷移(BorschHaubold等人，出處同前；和Kramer等人，出處同前)。
25ng/ml的VEGF引起cPLA2慢遷移形式的免疫反應(yīng)性顯著增長(zhǎng)，及伴隨的快遷移形式的相對(duì)降低，這在VEGF加入2分鐘后可檢測(cè)到，15分鐘后達(dá)到最大，并可保持達(dá)60分鐘。在5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，VEGF總是導(dǎo)致cPLA2的較慢-遷移形式的免疫反應(yīng)性顯著增長(zhǎng)。VEGF-誘導(dǎo)的cPLA2的電泳遷移率降低也是濃度-依賴的，在2.5ng/ml時(shí)有慢遷移形式的顯著增長(zhǎng)，最大增長(zhǎng)在測(cè)試的最高濃度5-10ng/ml。盡管VEGF導(dǎo)致cPLA2的較快遷移形式水平明顯降低，但該類型在檢測(cè)的所有VEGF濃度和治療時(shí)間都是明顯的。凝血酶也引起cPLA2從較快到較慢遷移形式的遷移率的顯著變動(dòng)，兩種形式都正好與在VEGF-處理的HUVECs提取物中檢測(cè)到的那些共遷移。在相同實(shí)驗(yàn)中VEGF與凝血酶的作用的直接比較顯示，類似于從PGI2合成和花生四烯酸釋放所獲得的結(jié)果，凝血酶引起cPLA2的凝膠阻滯增加更顯著，以及實(shí)際上的該酶的較快-遷移形式完全消失。PIGF不引起免疫反應(yīng)性cPLA2從較快到較慢遷移形式的可檢測(cè)的遷移率變動(dòng)。
進(jìn)一步檢查了是否VEGF也誘導(dǎo)HUVEC分泌vWF。VEGF刺激時(shí)間-和濃度-依賴的vWF產(chǎn)生。早至向細(xì)胞中加入25ng/ml VEGF 30分鐘后在HUVEC培養(yǎng)基中即可檢測(cè)到vWF，并在所檢測(cè)的時(shí)程中繼續(xù)增長(zhǎng)，3小時(shí)后達(dá)到2.5倍于對(duì)照細(xì)胞的水平。VEGF作用的濃度-依賴性類似于由PGI2產(chǎn)生所獲得的，半數(shù)最大應(yīng)答在濃度大約10ng/ml，最大作用在所檢測(cè)的最高濃度25ng/ml。類似于由PGI2合成所獲得的結(jié)果，VEGF的作用盡管總是弱于凝血酶但是與之有可比性(圖12A)。與VEGF相反，PIGF不引起對(duì)HUVEC中vWF分泌的可檢測(cè)到的刺激。VEGF與PIGF對(duì)HUVEC在趨化室中遷移作用的比較顯示，盡管VEGF刺激趨化性的濃度-依賴性增加，但PIGF在濃度范圍5-60ng/ml不引起可檢測(cè)到的增長(zhǎng)。
VEGF在HUVEC中激活p42/p44 MAP激酶。假定MAP激酶參與其它因子對(duì)cPLA2的激活，那么這引起MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)可介導(dǎo)VEGF-誘導(dǎo)的PGI2合成和cPLA2激活的可能性。檢查了鋪滿HUVEC中VEGF-刺激的p42/p44 MAP激酶活性的激活之濃度-依賴性。細(xì)胞與低至0.5ng/ml濃度的VEGF接觸15分鐘導(dǎo)致可檢測(cè)的活性增長(zhǎng)，半數(shù)最大增長(zhǎng)的濃度在1和5ng/ml之間，最大作用在10ng/ml濃度時(shí)，持續(xù)可達(dá)50ng/ml。與VEGF的顯著作用相反，在1-60ng/ml濃度范圍中的PIGF在HUVEC中幾乎不引起可檢測(cè)的MAP激酶活性的提高，即便有的話也很小。用MAP激酶激酶的一種選擇性抑制劑PD98059預(yù)處理30分鐘，完全抑制p42/p44 MAP激酶的VEGF刺激(Dudley等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1995)927686-7689)，MAP激酶激酶是特異地磷酸化和激活p42/p44 MAP激酶的雙特異性蘇氨酸和酪氨酸激酶。抑制劑的作用是濃度-依賴的，在5mM有高于50％的抑制，在10-20mM濃度時(shí)MAP激酶活性降低至未刺激的對(duì)照水平。
最初通過檢測(cè)PD98059對(duì)PGI2合成的作用研究MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)在VEGF-誘導(dǎo)的花生四烯酸動(dòng)用途徑中的作用。用30mM PD98059對(duì)HUVEC預(yù)處理30分鐘，完全抑制了由隨后用25ng/ml VEGF或1U/ml凝血酶溫育60分鐘所誘導(dǎo)的PGI2產(chǎn)生。PD98059對(duì)VEGF-誘導(dǎo)的PGI2合成的作用是濃度-依賴的，半數(shù)最大作用濃度大約為5mM，在濃度為10mM有對(duì)刺激的PGI2產(chǎn)生的最大抑制作用。也應(yīng)指出，PD98059使VEGF-處理的細(xì)胞中的PGI2產(chǎn)生降至在對(duì)照細(xì)胞中所測(cè)值以下，盡管此作用僅在抑制劑濃度大于10mM時(shí)才是明顯的。
其次測(cè)試了PD98059是否對(duì)VEGF-誘導(dǎo)的cPLA2電泳遷移率的降低有作用。用25mM PD98059預(yù)處理完全阻斷了VEGF-刺激的cPLA2慢-遷移形式的增多。類似于PD98059對(duì)PGI2合成的作用，該抑制劑不僅逆轉(zhuǎn)了VEGF-依賴的cPLA2凝膠遷移率的降低，而且使慢-遷移形式的免疫反應(yīng)性降低至對(duì)照水平以下，并使較快-遷移形式的免疫反應(yīng)性升高至對(duì)照水平之上。
通過測(cè)試VEGF-刺激的vWF的產(chǎn)生是否也對(duì)PD98059的抑制敏感，研究了PD98059之作用對(duì)于VEGF-誘導(dǎo)的cPLA2激活和PGI2合成的選擇性。與PD98059對(duì)cPLA2激活和PGI2合成的作用相反，用25mM MAP激酶激酶抑制劑對(duì)HUVEC的預(yù)處理既不防止也不顯著減少由隨后加入VEGF所引起的vWF的分泌。PD98059對(duì)基礎(chǔ)vWF分泌或?qū)δ?刺激的vWF分泌都沒有作用。
總結(jié)VEGF刺激時(shí)間依賴性和濃度依賴性的PGI2合成的增長(zhǎng)，這在15分鐘內(nèi)可檢測(cè)到，60分鐘后在濃度10ng/ml時(shí)有半數(shù)最大值，濃度在15ng/ml時(shí)有最大值。在10個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，25ng/ml濃度時(shí)60分鐘后，VEGF-刺激的平均最大PGI2合成兩倍于基礎(chǔ)水平。VEGF-相關(guān)因子胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)誘導(dǎo)較弱的1.3倍的增長(zhǎng)。凝血酶(1U/ml，60分鐘)誘導(dǎo)4.4倍于對(duì)照水平的平均最大增長(zhǎng)。VEGF刺激花生四烯酸從HUVEC中的釋放，具有與PGI2合成所獲得的相似的濃度-依賴性，但具有更快的動(dòng)力學(xué)半數(shù)最大花生四烯酸動(dòng)用發(fā)生于10分鐘后，30分鐘后最大。使用SDS-PAGE的遷移率變動(dòng)作為激活標(biāo)記的胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)激活測(cè)定顯示，VEGF以時(shí)間依賴和濃度依賴的方式刺激cPLA2的活性早至2分鐘即發(fā)生cPLA2的慢-遷移和激活形式的增多，濃度低至2.5ng/ml即可檢測(cè)到，15分鐘后及濃度為5ng/ml時(shí)達(dá)到最大。類似于誘導(dǎo)PGI2合成的其它試劑，VEGF也引起HUVEC中馮威勒布蘭特因子(vWF)分泌的時(shí)間依賴和濃度依賴的顯著增長(zhǎng)，這在30分鐘內(nèi)即可檢測(cè)到，濃度在10ng/ml時(shí)有半數(shù)最大，用25ng/ml VEGF處理后3小時(shí)達(dá)到對(duì)照水平的2.5倍。VEGF誘導(dǎo)p42/p44 MAP激酶的快速和短暫的激活，這在濃度低至1ng/ml時(shí)即可檢測(cè)到，并在5-10ng/ml達(dá)到最大。相反，PIGF對(duì)MAP激酶活性幾乎沒有作用。PD98059(MAP激酶激酶的一種選擇性抑制劑)引起VEGF-刺激的MAP激酶活性、PGI2合成和cPLA2凝膠阻滯的完全抑制，但對(duì)VEGF-誘導(dǎo)的vWF分泌沒有作用。這些發(fā)現(xiàn)提供了VEGF能通過cPLA2-介導(dǎo)的花生四烯酸的釋放刺激PGI2合成的第一手證據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)也顯示，此生物合成途徑的VEGF刺激可通過，至少是部分通過p42/p44 MAP激酶的激活發(fā)生。
在此所示的結(jié)果顯示，VEGF在HUVEC中刺激PGI2產(chǎn)生的明顯的時(shí)間依賴和濃度依賴性增加。VEGF的作用弱于凝血酶，盡管對(duì)這兩種因子的應(yīng)答變化因數(shù)僅2.5。如經(jīng)凝膠阻滯測(cè)定所判斷的，VEGF刺激花生四烯酸從人內(nèi)皮細(xì)胞的快速動(dòng)用，以及cPLA2的快速激活。用于測(cè)定VEGF對(duì)花生四烯酸動(dòng)用的作用之方法基于3H-標(biāo)記物從用3H-花生四烯酸預(yù)標(biāo)記的細(xì)胞中的釋放。由于是用培養(yǎng)基中存在的BSA進(jìn)行花生四烯酸釋放的研究，所以從HUVEC釋放的主要產(chǎn)物非?？赡苁?H-花生四烯酸。VEGF-誘導(dǎo)的PGI2產(chǎn)生、花生四烯酸釋放和cPLA2激活的濃度-依賴性彼此類似(都在5-10ng/ml范圍內(nèi))。這些結(jié)果說明花生四烯酸釋放和PGI2合成的VEGF刺激是通過該因子在HUVEC中的高親和力受體所介導(dǎo)的。
花生四烯酸釋放和cPLA2遷移率變動(dòng)都比PGI2合成更快地發(fā)生，這符合這種觀點(diǎn)，即增長(zhǎng)的PGI2產(chǎn)生很可能是(至少部分是)提高的cPLA2活性，以及隨后的細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸可得量的提高的直接后果，細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸是組成酶COX-1的底物。由于已知VEGF刺激磷脂酶C-g酪氨酸磷酸化和磷酸肌醇代謝，所以包括磷脂酶C-g(和/或磷脂酶D)和二酰-和單酰甘油脂酶連續(xù)作用的其它機(jī)制完全可能也可有助于VEGF-誘導(dǎo)的PGI2合成之花生四烯酸動(dòng)用。
也研究了VEGF-相關(guān)因子PIGF(Flt-1的一種特異配體)是否能刺激PGI2的產(chǎn)生。結(jié)果提示PIGF能誘導(dǎo)PGI2合成，但弱于VEGF。未檢測(cè)到PIGF對(duì)花生四烯酸釋放或cPLA2遷移率變動(dòng)的顯著作用。由于PIGF僅與Flt-1 VEGF受體高親和力地結(jié)合，所以這些結(jié)果最符合這樣一個(gè)結(jié)論，即HUVEC中VEGF對(duì)PGI2產(chǎn)生的刺激主要由KDR/Flk-1受體所介導(dǎo)，但Flt-1也可有助于該途徑的刺激。然而，任何Flt-1-介導(dǎo)的PGI2合成似乎包括不同于cPLA2磷酸化的一種機(jī)制。至少有兩種解釋能說明對(duì)PIGF的這種相對(duì)較低的應(yīng)答。Flt-1誘導(dǎo)較弱的應(yīng)答，和/或Flt-1以比KDR/Flk-1更低的水平存在。
在此所述的這些結(jié)果顯示，VEGF以時(shí)間依賴和濃度依賴的方式誘導(dǎo)vWF的分泌。VEGF對(duì)vWF分泌作用的濃度-依賴性與對(duì)PGI2合成和花生四烯酸動(dòng)用的濃度依賴性非常一致。與PIGF對(duì)PGI2合成的相對(duì)弱的作用相反，PIGF不刺激HUVEC釋放vWF的可檢測(cè)的增長(zhǎng)。
VEGF引起cPLA2電泳遷移率快速變動(dòng)的發(fā)現(xiàn)，與p42/p44 MAP激酶增強(qiáng)的磷酸化和由此的激活相一致。在此所述的發(fā)現(xiàn)也支持了這一點(diǎn)，即已知在血小板中刺激cPLA2磷酸化和激活的凝血酶導(dǎo)致HUVEC中cPLA2遷移率的相似的變動(dòng)。在此所述的結(jié)果也顯示VEGF激活p42/p44MAP激酶，并且MAP激酶激酶的選擇性抑制劑PD98059對(duì)該途徑的抑制，阻斷了PGI2的產(chǎn)生和VEGF誘導(dǎo)的cPLA2之凝膠阻滯增強(qiáng)。PD98059的作用至少部分地是選擇性的，因?yàn)樗鼘?duì)VEGF或凝血酶所刺激的vWF分泌都沒有作用。
與VEGF的顯著作用相反，PIGF不能顯著提高M(jìn)AP激酶的活性。PIGF刺激MAP激酶活性的明顯無能大致符合這種情況該因子對(duì)PGI2產(chǎn)生的作用比VEGF的作用較弱，并且符合該因子促進(jìn)cPLA2凝膠阻滯的明顯無能。
HUVEC中PGI2產(chǎn)生的測(cè)定顯示存在明顯基礎(chǔ)水平的合成。有趣地，MAP激酶激酶抑制劑也消除未刺激的對(duì)照細(xì)胞中PGI2的產(chǎn)生。與通過MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活對(duì)PGI2生成的介導(dǎo)相一致，PD98059也使cPLA2的慢-遷移磷酸化形式的水平降低至對(duì)照水平以下，并且使快-遷移低磷酸化形式的水平升高至對(duì)照水平之上。MAP激酶活性的測(cè)定提示顯著水平的基礎(chǔ)活性也可被PD98059抑制。這些發(fā)現(xiàn)提示MAP激酶的激活不僅可擔(dān)負(fù)VEGF-和凝血酶-依賴的cPLA2的激活，而且基礎(chǔ)MAP激酶活性對(duì)于組成型cPLA2活性和PGI2的產(chǎn)生也是需要的。
似乎可能的是，其它信號(hào)傳遞機(jī)制可有助于PGI2合成和花生四烯酸釋放的VEGF刺激，包括細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]的升高。
迄今為止VEGF主要被認(rèn)為是一種促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的血管生成因子。在此所示的發(fā)現(xiàn)顯示其它的活性，并因此可具有對(duì)于內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)和對(duì)于VEGF功能理解的重要應(yīng)用，以及用于血管疾病如狹窄、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的治療和預(yù)防的用途。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名EUROGENE有限公司(B)街道Marquis house，67/68 Jermyn Street(C)城市倫敦(D)州N/A(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)SW1Y 6NY(ii)發(fā)明名稱生長(zhǎng)因子的治療用途和特別用于內(nèi)膜增生治療的輸送裝置(iii)序列數(shù)目10(iv)計(jì)算機(jī)可讀信息(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朩O未知(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度441個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(iii)反義非
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..441(xi)SEQ ID NO1的序列描述ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC 48Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG144Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG192Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Lau Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG240Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC288Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC336Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT384Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAA TGT GAC AAG432Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys130 135 140CCG AGG CGG441Pro Arg Arg145
(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度147個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys130 135 140Pro Arg Arg145(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度573個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(iii)反義非(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..573(xi)SEQ ID NO3的序列描述ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC 48Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu150 155 160TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly165 170 175GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG144Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln180 185 190 195CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG192Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu200 205 210TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG240Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu215 220 225ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC288Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro230 235 240ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC336Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His245 250 255CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT384Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys260 265 270 275
GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAA CCC TGT GGG432Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Pro Cys Gly280 285 290CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG480Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr295 300 305TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG528Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln310 315 320CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG573Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg325 330 335(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度191個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO4的序列描述Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn AsP Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Pro Cys Gly130 135 140Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr145 150 155 160Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln165 170 175Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg180 185 190(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度645個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(iii)反義非(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..645(xi)SEQ ID NO5的序列描述ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC48
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu195 200 205TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly210 215 220GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG144Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln225 230 235CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG192Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu240 245 250 255TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG240Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu260 265 270ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC288Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro275 280 285ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC336Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His290 295 300CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT384Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys305 310 315GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAA AAA TCA GTT432Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val320 325 330 335CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAA AAA CGA AAG CGC AAG AAA TCC CGG TAT480Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr340 345 350AAG TCC TGG AGC GTG CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT528Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His355 360 365TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA576
Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys ser Cys Lys Asn Tnr370 375 380GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC624Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn GLu Arg Thr Cys385 390 395AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG645Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg400 405(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度215個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO6的序列描述Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Cln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val130 135 140Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr145 150 155 160Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His165 170 175Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr180 185 190Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys195 200 205Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg210 215(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度696個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(iii)反義非(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..696(xi)SEQ ID NO7的序列描述ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTC GCC TTG CTG CTC48Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu220 225 230
TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA 96Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly235 240 245GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG144Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln250 255 260CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG192Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu265 270 275TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCG CTG240Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu280 285 290 295ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAC TGT GTG CCC288Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro300 305 310ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC336Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His315 320 325CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT384Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys330 335 340GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA AAA AAA TCA GTT432Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val345 350 355CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAA AAA CGA AAG CGC AAG AAA TCC CGG TAT480Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr360 365 370 375AAG TCC TGG AGC GTG TAC GTT GGT GCC CGC TGC TGT CTA ATG CCC TGG528Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp380 385 390AGC CTC CCT GGC CCC CAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG576Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys395 400 405
CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC624His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn410 415 420ACA GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT672Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr425 430 435TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG696Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg440 445(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度232個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO8的序列描述Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110
Gln Cly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val130 135 140Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr145 150 155 160Lys ser Trp ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp165 170 175Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys180 185 190His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn195 200 205Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr210 215 220Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg225 230(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(iii)反義非(xi)SEQ ID NO9的序列描述
TCGATCCATG AACTTTCTGC 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(iii)反義非(xi)SEQ ID NO10的序列描述TCCGTTTAAC TCAAGCTGCC 20
權(quán)利要求
1.一種用于將治療劑向患者血管輸送的裝置，其包括一個(gè)適于在血管周圍提供密封部分的主體，其試劑保存于該裝置內(nèi)或與該裝置相結(jié)合，以便在使用中該試劑與血管外膜表面接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其定義主體壁和血管外膜表面之間的一個(gè)儲(chǔ)存器，該儲(chǔ)存器至少部分地裝入包含待輸送試劑的一種藥物制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的裝置，其中該制劑是可注射入儲(chǔ)存器的液體或凝膠的形式，或糊劑的形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的裝置，其中主體部分的材料是自密封的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任何一項(xiàng)的裝置，其中該儲(chǔ)存器能包含可達(dá)10ml的液體，優(yōu)選地至少2-5ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任何一項(xiàng)的裝置，其中主體材料的厚度沿其長(zhǎng)度通常是恒定的，其儲(chǔ)存器在使用中由第一個(gè)主體部分的囊所形成，其位于與血管密封的間隔部分之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任何一項(xiàng)的裝置，其中主體材料在中間部分的厚度小于在與血管密封的間隔密封部分的厚度，降低的厚度形成了儲(chǔ)存器。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中主體的內(nèi)表面包含一種海綿樣材料，該材料能用包含該試劑的藥物制劑所浸滲。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中主體的內(nèi)表面用包含該試劑的一種藥物制劑所浸滲。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中主體的材料是生物可降解的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中的裝置，其中該材料是明膠、藻酸鹽或膠原蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體是模塑的或擠出的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中主體包括柔性的密封部分，這些部分能適應(yīng)脈動(dòng)血流引起的血管擴(kuò)張。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體包括8-15mm長(zhǎng)的伸長(zhǎng)密封部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體通常是管狀的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體具有兩個(gè)通常為管狀的部分，它們分支形成通常Y-形或T-形的主體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體具有三個(gè)通常為管狀的部分，它們至少在使用中分支，形成通常X-形的主體。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的裝置，其中一個(gè)主體部分在其縱向范圍的橫截面通常是弧形的，以便當(dāng)血管部分地包埋于組織時(shí)，能使其環(huán)繞第一個(gè)血管的暴露部分，并且在使用中排列第一個(gè)主體部分的縱向-延伸邊緣使之與第一個(gè)血管的外膜壁或與相鄰組織密封。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體具有一個(gè)縱向狹縫，以利于其在血管上的安裝。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其中該主體包括一個(gè)內(nèi)層或螺旋狀加固件，以增強(qiáng)抗扭強(qiáng)度。
全文摘要
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可用于內(nèi)膜增生、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化的治療，以及對(duì)用產(chǎn)生一氧化氮或前列環(huán)素的試劑治療敏感的病癥的治療。代替VEGF，可以施用等效試劑如VEGF受體的激動(dòng)劑，同樣可用編碼這種激動(dòng)劑的核酸。例如可以使用一種裝置經(jīng)過血管的外膜表面成功地施用該試劑，該裝置定義了主體壁與血管外膜表面之間的一種儲(chǔ)存器，該儲(chǔ)存器至少部分地裝入了包含所輸送的試劑的藥物制劑。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1981887SQ20061009280
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期1997年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月1日
發(fā)明者J·F·馬丁, S·拉-赫?qǐng)D尤拉, S·G·E·巴克爾 申請(qǐng)人:Ark治療學(xué)有限公司