專利名稱：雷氏大疣蛛毒素的藥物應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雷氏大疣蛛毒素的藥物應(yīng)用，特別是其用于制備抗癌藥物的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近些年來，關(guān)于動(dòng)物毒素的抗腫瘤作用研究報(bào)道比較多的是蝎毒、蛇毒和蜂毒。同樣，很多蜘蛛在防衛(wèi)和捕食時(shí)能從螯牙尖端排放毒素，蜘蛛毒腺組織分泌用于捕食和防衛(wèi)的毒液中含有豐富的蛋白質(zhì)與多肽組分，有許多生物活性成分具有較高的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值和醫(yī)藥應(yīng)用前景，這使得蜘蛛毒素的研究應(yīng)用成為可能。目前，以化學(xué)模式為主體的藥學(xué)科學(xué)已迅速轉(zhuǎn)向以生物學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的新模式，在此形式下，多肽類藥物的市場(chǎng)應(yīng)用研究更具有廣闊的發(fā)展前景。眾所周知，化療藥物以細(xì)胞毒作用為主，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮直接殺傷作用。與化學(xué)抗癌藥物相比，中藥抗腫瘤有其自身特點(diǎn)和一定優(yōu)勢(shì)，綜合現(xiàn)有的中藥抗腫瘤研究結(jié)果，更廣闊的研究方向有活性組分的分離提取，毒素活性蛋白多肽的結(jié)構(gòu)與功能研究，并在此基礎(chǔ)上研制臨床及研究試劑，為蛋白酶、血小板受體、抗癌多肽結(jié)構(gòu)與功能研究提供良好的基礎(chǔ)知識(shí)，同時(shí)，為臨床抗癌藥物、鎮(zhèn)痛等的治療開辟了新的途徑。動(dòng)物毒液自古就有藥用的記載，但是文獻(xiàn)中研究蜘蛛毒素離子通道的比較多，對(duì)于蜘蛛抗癌蛋白抗腫瘤的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雷氏大疣蛛毒素的藥物應(yīng)用，特別是其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的。研究發(fā)現(xiàn)存在于生物體的多肽已有數(shù)萬種，所有的細(xì)胞都能合成多肽。同時(shí)，幾乎所有細(xì)胞也都受多肽調(diào)節(jié)，它涉及激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖等各個(gè)領(lǐng)域。蜘蛛毒素是一種復(fù)雜混合物，其化學(xué)成分較多，但其主要成分是多肽和蛋白質(zhì)，包括多肽神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、酶、激素類似物、凝集活性肽和抗菌肽等。蜘蛛毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞多靶點(diǎn)效應(yīng)的主要機(jī)制包括直接抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞、影響腫瘤細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞生長(zhǎng)周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路、影響腫瘤細(xì)胞化學(xué)成分及代謝、增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的抗腫瘤免疫功能等。此外，蜘蛛毒液中還含有多胺類以及ATP、核苷酸、氨基酸、單胺類等低分子量物質(zhì)和無機(jī)鹽等。這正是蜘蛛毒素在抗癌藥物中應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。
本發(fā)明包括以下內(nèi)容一、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的制備方法用一個(gè)固定在鐵架臺(tái)上，內(nèi)徑3cm、高5cm的塑料杯作為毒液接受器，持大鑷子從側(cè)面夾住成年雌性蜘蛛胸部，讓蜘蛛張開鰲肢并伸入杯內(nèi)，然后用脈沖電流刺激鰲肢基部3-5秒，誘使其將螯牙刺入軟管內(nèi)排毒。它即用觸肢緊緊抱住杯壁，將鰲爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。經(jīng)反復(fù)誘使其排毒后，毒液用一次性微量注射器抽取，經(jīng)離心去除沉淀，收集到1.5ml離心管中，冰凍3～4h后，立即放入冷凍干燥機(jī)中經(jīng)真空冷凍干燥得到略帶黃色的干粉，即為粗毒，于-20℃保存。
真空冷凍干燥后，使用時(shí)用不加牛清的RPMI 1640培養(yǎng)基溶劑溶解，一次性小濾器過濾除菌。制備雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的用具使用一次性醫(yī)用微量注射器，保證了蜘蛛毒素不被污染。
以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，按Lowry法測(cè)定雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果是每毫克毒素含0.836毫克蛋白質(zhì)，即蛋白含量是83.6％。
二、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)溶劑的選擇經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)表明使用“不加牛清的RPMI 1640培養(yǎng)基”效果好于“D-Hank’s緩沖液”和“醫(yī)用五蒸水”。因此，本發(fā)明中使用的溶劑是“不加牛清的RPMI 1640培養(yǎng)基”。
三、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)及藥用機(jī)理分析1、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)體外抑瘤實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腫瘤細(xì)胞，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)按1∶1稀釋消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將終密度1×104個(gè)/mL的腫瘤細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180μL，培養(yǎng)12h。分別加入陰性對(duì)照D-Hank’s緩沖液、陽(yáng)性對(duì)照順珀DDP及不同濃度雷氏大疣蛛抗癌蛋白(10，20，40μg/mL)各20μL，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞。置于飽和濕度、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48h，各培養(yǎng)孔加入1mg/mLMTT 10μL，4h后棄去培養(yǎng)上清，D-Hank’s緩沖液充分洗滌細(xì)胞，每孔加入150μL DMSO，振蕩器上振蕩10min，充分溶解甲膜(Formazan)結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度A值，測(cè)定波長(zhǎng)λ＝570nm，參考波長(zhǎng)λ＝630nm，計(jì)算相對(duì)于陰性對(duì)照的生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算公式為抑制率(CI)＝(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100％。同時(shí)判斷IC50。
通過MTT法作出的生長(zhǎng)曲線可以得出雷氏大疣蛛蛛毒素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)50％時(shí)的濃度約為20μg/mL(48h)。
2、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第一代移植瘤BALB/C裸小鼠，常規(guī)碘酊和酒精消毒每只裸鼠接種部位的皮膚，用帶用1mL注射器抽取癌5×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液200μL，在無菌條件下，接種于裸鼠的前左側(cè)腿上部皮下，拔出針頭，用酒精棉球壓住針眼處片刻，防止液體流出。接種瘤細(xì)胞后，將裸小鼠送回?zé)o特殊病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。第一代移植瘤共接種20只裸鼠。
第二代移植瘤自接種至出現(xiàn)肉眼可見的瘤結(jié)節(jié)的時(shí)間為潛伏期。隔日觀察與測(cè)量腫瘤的體積大小，當(dāng)?shù)谝淮浦擦龀闪霾⑸L(zhǎng)至10-15mm3時(shí)，將荷瘤裸鼠用1％硫噴妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下切取腫瘤組織。清洗液清洗，立即放入含無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，修剪腫瘤組織，用無血清培養(yǎng)液洗滌兩次，將一部分移植瘤組織切成解剖顯微鏡下約1×1×2mm大的組織塊，供種植；一部分放入固定液中固定；其余放液氮罐中凍存。整個(gè)工作均在超凈工作臺(tái)上完成。移植時(shí)仍然采取皮下注射的方法，用改制的12號(hào)針頭套管針(針尖角度為75度)將腫瘤組織塊接種于裸鼠的后左側(cè)腿上部皮下，整個(gè)過程在30min內(nèi)完成。接種瘤組織塊后，將裸小鼠送回?zé)o特殊病原體飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。第二代移植瘤共接種50只裸鼠。建立了人腫瘤細(xì)胞BALB/C裸鼠移植瘤模型，在裸鼠尾部皮下靜脈分別注射1.0，2.0，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)。注射雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)實(shí)驗(yàn)組比只注射不加牛清的RPMI 1640培養(yǎng)基的對(duì)照組荷瘤裸鼠腫瘤的增長(zhǎng)均受到明顯抑制，在給藥第21d與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；1.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)對(duì)腫瘤增長(zhǎng)的抑制作用明顯，與對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P＜0.05)。2.0μg/g，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)與對(duì)腫瘤增長(zhǎng)的抑瘤強(qiáng)度明顯，與對(duì)照組相比，瘤重量、瘤體積、抑瘤率明顯減少，具有顯著性差異(P＜0.01)。
3、急性毒理試驗(yàn)預(yù)備實(shí)驗(yàn) 取小鼠30只，按簡(jiǎn)化機(jī)率單位法隨機(jī)等分為5組，造原始記錄表，項(xiàng)目包括劑量組、編號(hào)、體重、性別、注射量、注射時(shí)間、反應(yīng)、死亡時(shí)間。隨機(jī)取樣，蛛毒用生理鹽水溶解，按上述劑量進(jìn)行腹腔注射，注射體積為每只小鼠0.2mL左右，對(duì)照組注射生理鹽水，連續(xù)觀察7d。
正式實(shí)驗(yàn) 按寇氏krber法。每組10只，稱取小鼠體重，按0.2mL/10g腹腔注射雷氏大疣蛛蛛毒。各組注射液濃度根據(jù)小鼠25g平均體重水平來計(jì)算確定，高低劑間距為1∶0.85。觀察2周并記錄大鼠中毒表現(xiàn)和死亡情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果為用雷氏大疣蛛抗癌蛋白注射小鼠腹腔后，小鼠反應(yīng)與預(yù)備試驗(yàn)基本相同。小鼠中毒表現(xiàn)為四肢抽搐頻率先慢后快，雙眼變得呆滯，呼吸頻率加快后減慢，隨后胸部和腹部劇烈抽搐，最后心臟搏動(dòng)停止，死亡的小鼠集中在注射后1h之內(nèi)。雷氏大疣蛛抗癌蛋白對(duì)昆明種雌、雄小鼠經(jīng)腹腔注射半致死量LD50為1.15mg/kg，LD50的95％可信度為1.09-1.29mg/kg，對(duì)照組無異常反應(yīng)。
4、藥用機(jī)理分析對(duì)雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及急性毒理試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)對(duì)癌細(xì)胞的增殖具有抑制的作用?；熕幬镆约?xì)胞毒作用為主，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮直接殺傷作用。雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的抑制腫瘤細(xì)胞作用正是具備了化療藥物這一特點(diǎn)。蜘蛛做為常見的生物資源，雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)有待進(jìn)一步研發(fā)成多肽類生化抗腫瘤藥物，本發(fā)明無疑將有嶄新的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。近年來用生物技術(shù)開發(fā)的多肽類、蛋白質(zhì)生物大分子藥物不斷涌現(xiàn)，這為雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)用于多肽類生化抗腫瘤藥物走向市場(chǎng)提供了廣闊的空間。
本發(fā)明取得的積極效果是實(shí)驗(yàn)證明雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)在體外和體內(nèi)都可以高效地直接殺滅肝腫瘤細(xì)胞從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。雷氏大疣蛛毒素的體內(nèi)抑瘤特性，發(fā)現(xiàn)較高劑量(4.0μg/g)和低劑量(1.0μg/g)組裸鼠未發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀。1.0，2.0，4.0μg/g三個(gè)劑量對(duì)荷瘤裸鼠體重及肝腎脾腦等重要臟器的重量及形態(tài)學(xué)方面均未見顯著的影響。提示1.0-4.0μg/g濃度實(shí)驗(yàn)組雷氏大疣蛛毒素不能夠迅速通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)，有望開發(fā)成一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外其他系統(tǒng)腫瘤的藥物。而如果大于4.0μg/g濃度實(shí)驗(yàn)組雷氏大疣蛛毒素也許有可能迅速通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)，則有可能將該生化藥物開發(fā)成一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)以內(nèi)腫瘤的藥物，則不需要考慮如何阻斷其迅速通過血腦屏障而直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明。
實(shí)施例雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的制備用一個(gè)固定在鐵架臺(tái)上，內(nèi)徑3cm、高5cm的塑料杯作為毒液接受器，持大鑷子從側(cè)面夾住成年雌性蜘蛛胸部，讓蜘蛛張開鰲肢并伸入杯內(nèi)，然后用脈沖電流刺激鰲肢基部3-5秒，誘使其將螯牙刺入軟管內(nèi)排毒。它即用觸肢緊緊抱住杯壁，將鰲爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。經(jīng)反復(fù)誘使其排毒后，毒液用一次性微量注射器抽取，經(jīng)離心去除沉淀，收集到1.5ml離心管中，不加牛清的RPMI 1640培養(yǎng)基溶解經(jīng)真空冷凍干燥得到略帶黃色的干粉，冰凍3～4h后，立即放入冷凍干燥機(jī)中經(jīng)真空冷凍干燥得到略帶黃色的干粉，即為粗毒，于-20℃保存。一次性小濾器過濾除菌、除去不溶物，制成靜脈注射液針劑。
藥物應(yīng)用將雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)用于抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖。以治療肝癌為例建立了人腫瘤細(xì)胞BALB/C裸鼠肝癌移植瘤模型，在裸鼠尾部皮下靜脈分別注射1.0，2.0，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)。以靜脈注射液用量每體重1.0μg/g，2.0μg/g，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)對(duì)腫瘤增長(zhǎng)的抑瘤強(qiáng)度明顯，與對(duì)照組相比，瘤重量、瘤體積、抑瘤率明顯減少，具有顯著性差異。
權(quán)利要求
1.一種雷氏大疣蛛毒素的藥物應(yīng)用，其特征是作為抗癌藥物應(yīng)用。
2.按權(quán)利要求1所述的雷氏大疣蛛毒素的藥物應(yīng)用，其特征是制成靜脈注射液針劑作為抗肝癌藥物應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的抗癌藥物應(yīng)用。通過生物物理手段，從異紡蛛科Hexathelidae的雷氏大疣蛛Macrothele raveniZhu，Li & Song，2000的毒腺中采集并冷凍干燥得到固體晶體雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)，以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，按Lowry法測(cè)定雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)含量，結(jié)果是每毫克含0.836毫克蛋白質(zhì)，即蛋白含量是83.6％。實(shí)驗(yàn)證明雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)在體外和體內(nèi)能高效地直接殺滅肝腫瘤細(xì)胞從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)不但可用于制備癌癥患者的治療藥物，并有望開發(fā)成一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外其它系統(tǒng)腫瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1965865SQ20061010217
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月22日
發(fā)明者高莉, 孫捷, 沈金寶, 單保恩, 朱寶成 申請(qǐng)人:河北師范大學(xué)