專利名稱：：空間誘變高產(chǎn)高效菌種及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及空間誘變的高產(chǎn)高效菌種,特別是關(guān)于一種空間誘變高產(chǎn)高效菌種及用途。
背景技術(shù)：
：普通的Str印tomycesfradiae9904S+-86菌株所生產(chǎn)的藥物泰樂菌素是一種動(dòng)物專用的廣譜抗生素，是世界公認(rèn)的治療畜禽支原體病的首選藥物，它的強(qiáng)抗支原體特性，良好的促生長作用及其低毒無殘留的特點(diǎn)，使其在國際上被廣泛的應(yīng)用于畜禽飼養(yǎng)業(yè)?，F(xiàn)國際、國內(nèi)市場(chǎng)總需求約21620多噸。目前我國自己的生產(chǎn)規(guī)模僅有1000噸左右，因此每年要花費(fèi)大量的金額從國外進(jìn)口。并且，目前，所有從事泰樂菌素生產(chǎn)的公司，發(fā)酵菌種的發(fā)酵單位都不高，僅為7500u/ml單位，國際先進(jìn)水平為11000u/ml。因而，提高菌種的發(fā)酵單位成為絕大多數(shù)公司研究開發(fā)的重點(diǎn)。利用衛(wèi)星搭載微生物菌種研究其在太空中的生長和遺傳變異，從60年代開始至今已經(jīng)有近50年的歷史。從1957年以來已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)百次的空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，幾乎均為搭載微生物的研究。在載人飛行之前，前蘇聯(lián)和美國利用軌道衛(wèi)星作了大量的微生物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種鏈霉菌的菌落生長速度提高了6倍。美國試驗(yàn)了細(xì)菌細(xì)胞生長的變化和空間飛行后的細(xì)菌原噬菌體的誘導(dǎo)作用，并在地面進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)懸浮生長的微生物細(xì)胞在空間和地面以不同的速度繁殖，單一的高能重粒子就能促進(jìn)噬菌體的繁殖速率及引起突變率的增加。所有的空間試驗(yàn)表明宇宙射線、微重力、磁場(chǎng)等空間因素對(duì)不能誘變和難誘變的菌種具有較強(qiáng)的誘變作用。從1987年863高科技計(jì)劃開始，中國科學(xué)院等單位先后搭載了10多種微生物材料。對(duì)赤霉素產(chǎn)生菌、雙加氧酶產(chǎn)生菌經(jīng)空間處理后，篩選出效價(jià)提高10%以上的菌株。纖維素酶、果膠酶、淀粉酶的產(chǎn)生菌選出效價(jià)成倍提高的菌株。1990年10月有成功的利用衛(wèi)星搭載慶大霉素生產(chǎn)菌，獲得效價(jià)提高27-37%的高產(chǎn)株系。1992年衛(wèi)星搭載的莫能霉素菌種，獲得二株特大抑菌圈的株系，微生物搭載了NIKKO霉素、雙歧桿菌菌種取得了很好的效果。1994年搭載頭孢霉素?；富蚬こ叹@得酶活性比對(duì)照高4.35倍。1996年，遼寧微生物所搭載7種食用菌菌種進(jìn)行空間誘變育種，其中6個(gè)菌種都選出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的菌株，特別在靈芝空間處理的材料中，選出了子實(shí)體產(chǎn)量比對(duì)照組提高了75.3%。優(yōu)級(jí)品率達(dá)到88.9%、纖維酶活力提高33%的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株。由此可見利用太空環(huán)境進(jìn)行空間育種已經(jīng)成為一種提髙菌種生產(chǎn)性能的新技術(shù)和新手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種空間誘變高產(chǎn)高效菌種及其用途，本發(fā)明通過利用太空的特殊環(huán)境使菌種遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，從而優(yōu)選出正變異、遺傳性穩(wěn)定的菌種，并將優(yōu)選的正向突變菌株作為生產(chǎn)菌種，該正向突變菌種產(chǎn)量高,用途廣，有效率高。本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)一種空間誘變高產(chǎn)高效菌種及用途，其特征是所述菌株(Str印t咖ycesfradiae9904S+-86)的保藏號(hào)為CGMCCNo.1687。所述的菌株在制備泰樂菌素中的用途。所述的菌株在制備酒石酸泰樂菌素中的用途。所述的菌株在制備磷酸泰樂菌素中的用途。所述泰樂菌素的制備方法是；將選出的Str印tomycesfradiae9904S+-86菌種進(jìn)行太空搭載，經(jīng)過太空誘變選育的T廣156菌株作為生產(chǎn)菌種；經(jīng)一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵,將發(fā)酵液提純,最終生產(chǎn)出太空誘變菌種生產(chǎn)的泰樂菌素。本發(fā)明的特點(diǎn)是由于本發(fā)明將Str印tomycesfradiae9904S+-86菌種搭載返回式太空飛行器(宇宙飛船或返回式衛(wèi)星)，利用太空中微(零)重力、宇宙射線、交變磁場(chǎng)、高真空、高熱深冷等因素的綜合作用，使菌株的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)斷裂，基因組發(fā)生重排，從而產(chǎn)生新的菌株。返回地面后，對(duì)經(jīng)過太空搭載的菌株進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，通過研究其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、遺傳穩(wěn)定性、中試生產(chǎn)指標(biāo)等內(nèi)容，優(yōu)選出其中的正變異、遺傳特性穩(wěn)定的菌種，經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵后得到目標(biāo)藥物泰樂菌素。該菌種已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.1687。(見附頁)特別是Str印tomycesfradiae9904S+-86菌株經(jīng)太空搭載誘變，地面上的篩選、分離和純化后，選育出發(fā)酵單位更高、所分泌的泰樂菌素含量更高的髙產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)菌株T廠156菌株。在原有菌種發(fā)酵單位的基礎(chǔ)上，通過空間誘變比出發(fā)菌株9904S+—86提高74.6%，對(duì)高產(chǎn)菌株的菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特征等方面進(jìn)行了研究試管斜面生長情況、菌絲形態(tài)、孢子及孢子絲形態(tài)、孢子發(fā)芽狀況等。最后得出搭載菌株和對(duì)照菌株相比，菌株的培養(yǎng)特征發(fā)生變化，搭載菌株氣生菌絲較地面對(duì)照株豐盛，顏色變深，有淺黃色可溶性色素產(chǎn)生，而且搭載菌株的孢子比地面對(duì)照株豐富，染色均勻。將搭載菌株和對(duì)照菌株分別在高氏一號(hào)瓊脂、Bennetts瓊脂、甘油天門冬素瓊脂、無機(jī)鹽淀粉瓊脂及燕麥粉瓊脂五種培養(yǎng)基上的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、可溶性色素等特征作比較。并對(duì)搭載菌株和對(duì)照菌株的生理生化特征進(jìn)行了比較生長試驗(yàn)、降解試驗(yàn)、十七種碳源(丙二酸鈉、檸檬酸鹽、L-阿拉伯糖、A-甲基-葡萄糖、棉籽糖、鼠李糖、葡萄糖等)的利用情況。通過中國科學(xué)院微生物研究所對(duì)搭載菌株及出發(fā)菌株的全細(xì)胞蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搭載菌株與對(duì)照菌株的全細(xì)胞蛋白指紋圖譜也有顯著差異在培養(yǎng)120小時(shí)的蛋白圖譜中，97KD分子量以上附近有一條帶存在差異；在培養(yǎng)48小時(shí)，97KD附近搭載菌株一個(gè)蛋白首先大量表達(dá)，到72小時(shí)，地面對(duì)照菌株才有同樣的表達(dá)量；培養(yǎng)48小時(shí)后，搭載菌株在66KD附近有一個(gè)蛋白開始大量表達(dá)，而地面對(duì)照菌株的蛋白量還很低；在40KD附近，培養(yǎng)48小時(shí)，搭載菌株的一個(gè)蛋白表達(dá)已經(jīng)開始減弱，而地面對(duì)照菌株的蛋白量還較高。通過生產(chǎn)試驗(yàn)，T1-156在工業(yè)化生產(chǎn)條件下的發(fā)酵單位穩(wěn)定提高，較原始出發(fā)菌株高出18%。結(jié)合菌株傳代穩(wěn)定性等試驗(yàn)，說明該菌株已發(fā)生了遺傳性變異，是經(jīng)太空誘變后所選育的泰樂菌素髙產(chǎn)菌株。該突變菌株在遺傳上穩(wěn)定，有較強(qiáng)的生產(chǎn)適應(yīng)性。該菌種經(jīng)過神舟系列飛船航天搭載太空誘變，由北京中科院微生物所和西北大學(xué)生物系對(duì)菌種進(jìn)一步篩選培養(yǎng)育種形成遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，變異特征明顯的髙產(chǎn)高效菌種。上述所書內(nèi)容見中國科學(xué)院微生物檢驗(yàn)所關(guān)于泰樂菌素生產(chǎn)菌弗氏鏈霉菌"神舟飛船返回式科學(xué)與技術(shù)試驗(yàn)衛(wèi)星"搭載菌株與地面對(duì)照菌株生理生化及全細(xì)胞蛋白SDS--PAGE分析泰樂菌素空間誘變育種實(shí)驗(yàn)研究弗氏鏈霉菌(str印tomycesfradiae)在空間條件下的變異規(guī)律，并篩選高產(chǎn)菌株應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。將弗氏鏈霉菌(Str印tomycesfradiae)9940S+-86經(jīng)神舟一號(hào)飛船搭載進(jìn)行太空誘變育種，統(tǒng)計(jì)篩選結(jié)果初步探討泰樂菌素產(chǎn)生菌在空間條件下的變異規(guī)律。復(fù)篩后得到37株效價(jià)較出發(fā)菌株提高20%以4:的菌株，其中總效價(jià)較出發(fā)菌株提高74.6%。泰樂菌素是大環(huán)內(nèi)酯類禽畜專用抗生素，用于防治呼吸道及消化系統(tǒng)的感染，具有抗菌譜廣、療效高、毒性低、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，廣泛作為獸藥和飼料添加劑，是國家規(guī)劃重點(diǎn)發(fā)展的獸藥產(chǎn)品。目前國內(nèi)的生產(chǎn)菌種(生產(chǎn)效價(jià)大多在10000單位以下)與國際上同類高產(chǎn)菌種(美國禮來公司的生產(chǎn)效價(jià)可以達(dá)到17000單位)相比，其生產(chǎn)效價(jià)仍有很大差距，因此培育屬于我們國家自已的優(yōu)良泰樂菌素生產(chǎn)菌種也是發(fā)展國民經(jīng)濟(jì)的迫切需要。在微生物誘發(fā)突變育種研究中，尋找突變率高、突變譜廣的誘變?cè)词且豁?xiàng)非常重要的工作。我國是世界上第三個(gè)掌握返回式衛(wèi)星技術(shù)的國家，在空間資源利用方面占有極大優(yōu)勢(shì)。1987年以來，我國共發(fā)射了18顆返地衛(wèi)星和4艘宇宙飛船，每次均搭載微生物材料進(jìn)行研究。中國科學(xué)院微生物所、遺傳所、上海植物生理所和解放軍獸醫(yī)大學(xué)等單位搭載了近30種微生物材料[1]，不同的試驗(yàn)結(jié)果表明微生物在空間環(huán)境下可能產(chǎn)生不同性狀的變異，其中一些成果已在生產(chǎn)上應(yīng)用。為了避免研究工作的重復(fù)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)的侵犯，本公司1999年將泰樂菌素生產(chǎn)菌株搭載"神舟一號(hào)"飛船，進(jìn)行太空誘變育種研究，以期通過航天環(huán)境和地面微生物菌種篩選技術(shù)相結(jié)合，篩選得到性狀優(yōu)良的菌種。1材料1.1供試菌種弗氏鏈霉菌(streptomycesfradiae)菌株"神舟"一號(hào)飛船搭載菌株9940S+-86，由西安亨通光華制藥有限公司菌種中心通過孢子分離純化傳代獲得，作為本研究的出發(fā)菌株；1.2培養(yǎng)基斜面、平板和茄子瓶培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)基、均為本中心自行設(shè)計(jì)篩選的培養(yǎng)基。檢定II號(hào)培養(yǎng)基(北京陸橋試劑公司提供)檢定培養(yǎng)基將已配好的檢定II號(hào)培養(yǎng)基按下層150ml，上層(含1%檢定菌)100ml的比例倒入檢定盤中制成。2研究方法2.1飛船搭載太空誘變將供試菌株接入己滅好菌的2mL凍存管中，密封于抗壓樹脂管中，于飛船發(fā)射前40h裝艙，進(jìn)行空間實(shí)驗(yàn)，同時(shí)將每次飛船搭載的菌株設(shè)置為地面對(duì)照樣品。"神舟"一號(hào)飛船搭載處理的篩選實(shí)驗(yàn)以0((99405+-86)為對(duì)照。飛船參數(shù)見表1:表l菌種搭載飛船參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2菌種初篩2.2.1菌落形態(tài)觀察從搭載的小試管中挖取一塊菌種，接入放有玻璃珠的100ml無菌三角瓶中，加入無菌水20ml。放入400r/min的振蕩器上振蕩30min，稀釋涂布，28'C培養(yǎng)至獲得單細(xì)胞菌落，觀察菌落形態(tài)(見圖1)。2.2.2抑菌圈測(cè)定將劃線培養(yǎng)7天的單菌落打塊，一一對(duì)應(yīng)放于檢定培養(yǎng)基上，33'C培養(yǎng)20hr，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑(d)。根據(jù)d值判定活性強(qiáng)弱。發(fā)酵液活性用紙片法測(cè)定。2.2.3化學(xué)效價(jià)的測(cè)定將抑菌圈大的菌落接入搖瓶，按以下程序培養(yǎng)，提取泰樂菌素，加0.1M鹽酸稀釋，于290nm處測(cè)定其紫外吸收值。菌落挖塊種瓶-發(fā)酵瓶-泰樂菌素提取紫外分光光度法測(cè)定化學(xué)效價(jià)。2.3菌種復(fù)篩將初篩效價(jià)髙的菌種進(jìn)行復(fù)篩，并通過HPLC法測(cè)定泰樂菌素的總效價(jià)。2.4中試2.5生產(chǎn)試驗(yàn)2.6統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x土s表示，多組比較用ANOVA方差分析，以P<0.05為差別顯著性的界限。3結(jié)果3.1菌株分離搭載菌種經(jīng)神舟一號(hào)飛船搭載處理后，均采用稀釋涂布的方法進(jìn)行了存活菌株的分離，共計(jì)進(jìn)行12次分離，得到3043個(gè)純菌株，結(jié)果見表2。表2"神舟"號(hào)飛船菌株分離結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注該實(shí)驗(yàn)以原始菌種9940S+-86(未在太空環(huán)境中處理)作為對(duì)照菌種3.2高產(chǎn)菌株選育通過對(duì)分離菌株初篩得到3043個(gè)變異菌株，將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到泰樂菌素總效價(jià)較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高30%以上的菌株127株；對(duì)這127株進(jìn)行復(fù)篩結(jié)果表明有37株遺傳性狀穩(wěn)定且效價(jià)較出發(fā)菌株提高74.6%以上。部分復(fù)篩菌株的泰樂菌素產(chǎn)量與提高比例見表3(表中菌種號(hào)"T"后的數(shù)字同第一次搭載的神舟飛船序號(hào)，"-"出現(xiàn)次數(shù)顯示生產(chǎn)菌株搭載的次數(shù))。表3"神舟"一號(hào)飛船部分復(fù)篩菌株的泰樂菌素提高比例<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.3中試3.4生產(chǎn)試驗(yàn)通過生產(chǎn)試驗(yàn)，T1-156在工業(yè)化生產(chǎn)條件下的發(fā)酵單位穩(wěn)定提高，較原始出發(fā)菌株髙出80.6%。3.5菌株搭載后的形態(tài)分化和產(chǎn)量的關(guān)系搭載后，菌株的形態(tài)變異明顯，且產(chǎn)量變異與形態(tài)變異有一定的相關(guān)性，一般高產(chǎn)或高效菌株在成熟后菌落豐厚，呈饅頭狀，但直徑較小，見圖1，部分菌株形態(tài)與產(chǎn)量提高比例見表4。表6部分菌株形態(tài)變異與產(chǎn)量提髙比例菌株號(hào)菌株形態(tài)提高比例(%).CK(9940S+-86)太陽花狀/T1-47車輪狀10.3T1-783草帽狀48.5T1-156梅花狀80.6泰樂菌素搭載菌株的形態(tài)見附圖示意圖，附圖中A為照菌株形態(tài)〔太陽花形態(tài))；B是照菌株形態(tài)〔車輪狀(T1-47)形態(tài))；C是照菌株形態(tài)〔草帽狀(T1-783));D是照菌株形態(tài)(梅花狀(T1-156))，附片所生產(chǎn)示的泰樂菌素生產(chǎn)菌的產(chǎn)量與對(duì)照菌種相比從左到右依次提高了10.3%、48.5%、80.6%。4討論經(jīng)"神舟"一號(hào)飛船搭載及地面篩選，本研究目前篩選得到搖瓶效價(jià)比出發(fā)菌株提高80.6%。另外，通過對(duì)比"神舟"一號(hào)飛船搭載菌株復(fù)篩結(jié)果，初步探討泰樂菌素產(chǎn)生菌在空間條件下的變異規(guī)律以及航天搭載后產(chǎn)量變異和形態(tài)變異的關(guān)系。結(jié)論如下4.1空間條件對(duì)泰樂菌種有誘變效應(yīng)本試驗(yàn)研究了泰樂菌素生產(chǎn)菌經(jīng)"神舟"一號(hào)飛船搭載處理后的變異情況。表3明顯顯示空間搭載使泰樂菌素產(chǎn)量在搖瓶狀態(tài)下穩(wěn)定提髙，初步證明空間條件對(duì)弗氏鏈霉菌有誘變作用。4.2搭載后產(chǎn)量變異和形態(tài)變異存在相關(guān)性原始菌株和產(chǎn)量較低的菌株菌落多呈葵花型或車輪型(見圖l),直徑較大，一般鏡檢呈孢子鏈或孢子絲，高產(chǎn)菌落則多呈饅頭型，較厚，直徑小，鏡檢游離孢子多。本規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，將為今后的菌種篩選工作提供良好的作用。總之，空間條件極其復(fù)雜，其特有的高真空、微重力、強(qiáng)輻射、交變磁場(chǎng)對(duì)生物是很好的誘變因素。通過航天搭載處理，得到了在小試、中試甚至生產(chǎn)上能夠穩(wěn)定遺傳的泰樂菌素生產(chǎn)菌種，為利用航天搭載技術(shù)為尋找具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物制藥菌種提供了可能。下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖1是泰樂菌素搭載菌株的形態(tài)示意圖2測(cè)定菌株的孢子絲形態(tài)示意圖3是孢子染色情況示意圖4是測(cè)定菌株培養(yǎng)特征示意圖5是測(cè)定菌株的培養(yǎng)特征及色素示意圖6是測(cè)定菌株的全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE指紋圖譜。圖l中A是照菌株形態(tài)(太陽花形態(tài))；B是照菌株形態(tài)(車輪狀(T1-47));C是照菌株形態(tài)(草帽狀(Tl-783));D是照菌株形態(tài)(梅花狀(Tl-156))。具體實(shí)施例方式菌種選育在研究出9904S+-86菌株生長規(guī)律的基礎(chǔ)上，選定較合適生長時(shí)期的菌種,采用平皿生長的菌落、浸入其它物質(zhì)中的菌懸液、帶菌的砂土等方法，于1999年11月21日搭載"神舟一號(hào)"宇宙飛船。在太空軌道(近地點(diǎn)高度200公里、遠(yuǎn)地點(diǎn)高度350公里)進(jìn)行了21小時(shí)的在軌飛行。太空的特殊條件主要體現(xiàn)為微重力、高真空、高輻射、交變磁場(chǎng)等特殊環(huán)境。在外層空間飛行的菌種被置于一個(gè)與地球上的生態(tài)環(huán)境完全不同的環(huán)境中，主要包括來自磁場(chǎng)俘獲的電子、質(zhì)子及低能重粒子；來自銀河系的宇宙射線如質(zhì)子、粒子及更重的高能重粒子；來自太陽磁暴的質(zhì)子及重粒子等。這些粒子作用于微生物細(xì)胞核中的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致雙鏈斷裂。微重力、高真空環(huán)境可使DNA的堿基序列發(fā)生重組，即基因組的重組和變異。變異后產(chǎn)生的新菌株，其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物、遺傳性狀及蛋白表達(dá)、中試生產(chǎn)指標(biāo)等均會(huì)發(fā)生不同程度的變化。在宇宙飛船返回地面后，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，僅優(yōu)選出其中正向變異且遺傳特性穩(wěn)定的菌株，經(jīng)培育制成生產(chǎn)菌種。這種經(jīng)航天搭載誘變后選育出的菌種已經(jīng)在2006年4月17日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCCNo.1687。實(shí)驗(yàn)及中試生產(chǎn)結(jié)果表明，通過空間誘變，在原有菌種發(fā)酵單位的基礎(chǔ)上，通過空間誘變，獲得在搖瓶狀態(tài)下發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高74.6%,在工業(yè)化試生產(chǎn)中發(fā)酵單位穩(wěn)定提高18%、產(chǎn)品的A組分提高5.7i(達(dá)到88.5%),該突變菌株在遺傳上穩(wěn)定，有較強(qiáng)的生產(chǎn)適應(yīng)性。制備方法太空誘變菌種生產(chǎn)泰樂菌素的過程本發(fā)明所述的太空誘變菌種生產(chǎn)的泰樂菌素是由以下方法制備太空菌種篩選一~^太空菌種制備一"^一級(jí)發(fā)酵一^^二級(jí)發(fā)酵---三級(jí)發(fā)酵一"^發(fā)酵液提純,最終生產(chǎn)出泰樂菌素。一級(jí)發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物為一級(jí)種子液，二級(jí)發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物為二級(jí)種子液，三級(jí)發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物是泰樂菌素發(fā)酵液。①太空菌種制備以經(jīng)過空間誘變育種精心選育的弗氏鏈霉菌作為生產(chǎn)菌種。A.生產(chǎn)斜面的制備種子斜面培養(yǎng)基采用TYB型瓊脂培養(yǎng)基玉米淀粉0.55.0%，硝酸鉀0.012.0%，磷酸氫二鉀0.0010.20%，硫酸鎂0.00100.20%，硫酸亞鐵0.00100.20%，氯化鈉0.0010~0.30%，瓊脂1.03%。將培養(yǎng)基用純化水配好后分裝，120.0'C125.(TC，壓力0.1100.150MPa，滅菌30分鐘后，在無菌條件下接種典型單菌落，制成生產(chǎn)斜面。B、種瓶培養(yǎng)斜面培養(yǎng)TYGL培養(yǎng)基豆粕O.12.0%,玉米漿O.11.5%，重質(zhì)碳酸鈣0.11.5%。培養(yǎng)基滅菌溫度118125'C，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.1100.130Mpa。將培養(yǎng)好的斜面菌種在無菌條件下采取瓊脂挖塊法接入種瓶中，15'C37'C培養(yǎng)20小時(shí)100小時(shí)。②發(fā)酵過程A、一級(jí)發(fā)酵a、一級(jí)種子罐培養(yǎng)基豆粕27%，玉米漿18%，重質(zhì)碳酸鈣15%。b、培養(yǎng)基滅菌溫度118125'C，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.1100.130Mpa。c、在無菌條件下，將種瓶收集于接種瓶中，利用壓差法接入已滅菌的一級(jí)種子罐中，20'C37t:培養(yǎng)20小時(shí)120小時(shí)，制成一級(jí)種子液。B、二級(jí)發(fā)酵a、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基豆粕27%,玉米漿18%，重質(zhì)碳酸鈣15%。b、培養(yǎng)基滅菌溫度118125。C，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.1100.130Mpa。c、將一級(jí)種子液接入已滅菌的二級(jí)種子罐中，15'C37'C培養(yǎng)20小時(shí)90小時(shí)，制成二級(jí)種子液。C三級(jí)發(fā)酵a、發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕0.57%，豆油1555%，魚粉525%，玉米粉5~28%，甜菜堿鹽酸鹽0.051.5%，磷酸氫二銨0.051.5%，氯化鈷0.0010.005%。b、培養(yǎng)基滅菌溫度118125'C，時(shí)間30分鐘，蒸汽壓力0.1100.130Mpa。c、將二級(jí)種子液接入已滅菌的發(fā)酵罐中，在15'C37'C,培養(yǎng)80小時(shí)260小時(shí)，放入提煉工序。③發(fā)酵液提純發(fā)酵完畢后，首先進(jìn)入酸化工序，在發(fā)酵液的酸化過程中，先用飲用水將發(fā)酵液?jiǎn)挝幌♂屩?098%，并在1立方米的發(fā)酵液中加入1-6公斤的硅藻土，用1060%硫酸鋁溶液調(diào)節(jié)料液pH3.006.20，再進(jìn)行板框過濾。濾液用5%30%氨水回調(diào)pH至3.57.5，再復(fù)濾。然后按復(fù)濾液醋酸丁酯=(1.55.5):l混合，控制pH7.011.0，用高速離心機(jī)經(jīng)二次逆流萃取，萃取后的溶媒相，加酸進(jìn)行反萃取(如果要生產(chǎn)磷酸泰樂菌素則反萃取液用1.0%11.0%磷酸，如果要生產(chǎn)酒石酸泰樂菌素則反萃取液用1.0%11.0%酒石酸)。調(diào)節(jié)反萃取液pH1.006.50，分相，水相再精制，精制液經(jīng)鈦棒過濾器和微孔膜過濾，送至離心式噴霧干燥塔內(nèi)，使料液霧化與熱風(fēng)接觸干燥即得成品。實(shí)施例l:按上述工藝用太空誘變菌種生產(chǎn)的泰樂菌素1000克；制成1000克袋裝。實(shí)施例2:按上述工藝取太空誘變菌種生產(chǎn)的泰樂菌素950g,糊精50g，攪勻，制粒，化驗(yàn)合格后，裝袋，流通蒸汽滅菌121'C，30分鐘，制成1000顆粒劑。實(shí)施例3:按上述工藝用太空誘變菌種生產(chǎn)的酒石酸泰樂菌素(發(fā)酵液提純反萃取液用1.0%11.0%酒石酸)950g，糊精50g,攪勻，制粒，化驗(yàn)合格后，裝袋，流通蒸汽滅菌121'C,30分鐘，制成1000g顆粒劑。實(shí)施例4:按上述工藝用太空誘變菌種生產(chǎn)的磷酸泰樂菌素(發(fā)酵液提純反萃取液用1.0%11.0%磷酸)950g，糊精50g，攪勻，制粒，化驗(yàn)合格后，裝袋，流通蒸汽滅菌12rC，30分鐘,制成1000g顆粒劑。上述方法制得本品的檢驗(yàn)酒石酸泰樂菌素的內(nèi)銷檢測(cè)(標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中國獸藥典200O版二部)性狀本品為白色至淡黃色粉末。本品在氯仿中易溶，在水或甲醇中溶解，在乙醚中幾乎不溶。鑒別(1)取本品約3mg，加吡啶7.5ml，醋酐2.5ml使溶解，放置約10分鐘，溶液顯綠色。(2)取本品約3mg，加丙酮2ml溶解后，加鹽酸1ml，溶液由淡紅色漸變?yōu)樯钭仙?3)取本品，加1mol/L鹽酸溶液溶解并制成1ml中含20ug的溶液，照分光光度法測(cè)定，在290nm的波長處有最大吸收。(4)本品的水溶液顯酒石酸鹽鑒別(1)項(xiàng)的反應(yīng)。檢査酸堿度取本品，加水制成每lml中含25mg的溶液，依法測(cè)定，pH值應(yīng)為5.0~7.2。酪胺取本品50rag，加甲醇5ral使溶解，加l(^吡啶溶液2ml，2%茚三酮溶液2ml，用錫箔密封，置85'C水浴中加熱30分鐘，迅速冷卻，移至25ml量瓶中，加水至刻度，作為供試品溶液；另取每lml中含酪胺32ug的酪胺甲醇溶液5ml，同法制備，作為對(duì)照溶液。立即照分光光度法，在570nm的波長處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸收度，其供試品的酪胺值不得大于0.32%。有關(guān)組分照高效液相色譜法測(cè)定。用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑；取高氯酸鈉，加40%乙腈溶液制成0.85mol/L的溶液，并用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為290mn。理論板數(shù)按泰樂菌素A組分峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，泰樂菌素C組分峰和B組分峰的分離度應(yīng)符合要求。取本品適量，精密稱定，加50%乙腈溶液制成每1ml中含0.4mg的溶液，濾過。精密量取續(xù)濾液10ul,注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。泰樂菌素有關(guān)組分保留時(shí)間依次為C、B、D、A,按峰面積歸一化法計(jì)算，含泰樂菌素A應(yīng)不低于85%,泰樂菌素A、B、C、D之和應(yīng)不低于95M。干燥失重取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在6(TC減壓干燥至恒重，減失重量不得過4.0%。熾灼殘?jiān)”酒?.0g，依法檢查，遺留殘?jiān)坏眠^2.0%。重金屬取熾灼殘?jiān)?xiàng)下遺留的殘?jiān)?，依法檢查，含重金屬不得過百萬分之二十。效價(jià)測(cè)定精密稱取本品適量，加滅菌水制成每lml中約含1000單位的溶液，照抗生素微生物檢定法測(cè)定。1000泰樂菌素單位相當(dāng)于lmg的CJW^7。，按干燥品計(jì)算，每1mg的效價(jià)不得少于850泰樂菌素單位。酒石酸泰樂菌素的出口檢測(cè)(標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)歐洲藥典5.4)性狀本品為白色至淡黃色粉末。本品在水和氯仿中易溶，微溶于無水酒精，在無機(jī)酸的稀溶液中溶解。鑒別(1)照紅外分光光度法測(cè)定，與酒石酸泰樂菌素歐洲標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致。(2)照髙效液相色譜法測(cè)定，檢品色譜圖的主要峰及相對(duì)保留時(shí)間與對(duì)照溶液(a)的色譜圖一致。(3)取本品約30mg，加0.15ml水，吡啶7.5ml，醋酐2.5ml使溶解，放置約10分鐘，溶液顯綠色。檢查酸堿度取本品，加純化水制成每lml中含25mg的溶液，依法測(cè)定，pH值應(yīng)為5.0~7.2。酪胺取本品50mg至25ml容量瓶中，加3.4g/L的磷酸溶液5.Oml使溶解，加l.Oral吡啶，2.0ml飽和茚三酮溶液(約40g/L)，用鋁箔密封，置85。C水浴中加熱30分鐘，迅速冷卻，加水至刻度，作為供試品溶液；另取5邁1含酪胺32mg/L的酪胺磷酸溶液(3.4g/L)，同法制備，作為對(duì)照溶液，同時(shí)作空白。立即照分光光度法，在570nm的波長處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸收度，其供試品溶液的吸光度不大于標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。有關(guān)組分照高效液相色譜法測(cè)定，所用溶液應(yīng)臨用前新制。供試品溶液取20.0mg樣品用乙腈水為1:1(體積比)的混合溶液溶解并稀釋到100.Oml。對(duì)照溶液a:取2mg泰樂菌素鑒定峰對(duì)照品(含泰樂菌素A、B、C、D)用乙腈水為1:1(體積比)的混合溶液溶解并稀釋到10ml。對(duì)照溶液b:取2mg泰樂菌素對(duì)照品及2mg泰樂菌素D對(duì)照品用乙腈水為1:1(體積比)的混合溶液溶解并稀釋到10ml。用0.20m長的不銹鋼色譜注，內(nèi)徑4.6mm,用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(5um);取乙腈200g/L的髙氯酸鈉溶液為40:60(體積比)，并用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5的溶液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為290nm，柱溫35'C,進(jìn)樣量20ul。進(jìn)20ul的對(duì)照溶液b,在記錄的色譜圖中泰樂菌素A的保留時(shí)間約在12分鐘，泰樂菌素A與泰樂菌素D的分離度應(yīng)不小于2.0。進(jìn)20ul的對(duì)照溶液a及供試品溶液，用泰樂菌素鑒定峰對(duì)照品色譜圖及對(duì)照溶液a的色譜圖確定供試品的泰樂菌素A、B、C、D。按峰面積歸一化法計(jì)算各組分百分比，含泰樂菌素A應(yīng)不低于85.0M，泰樂菌素A、B、C、D之和應(yīng)不低于95.0%。干燥失重取本品1.OOOg，在60'C減壓(不超過0.7kPa)干燥3小時(shí)，減失重量不得過4.0%。熾灼殘?jiān)”酒?.0g,依法檢查，遺留殘?jiān)坏眠^2.0%。乙酸丁酯殘留照氣相色譜法測(cè)定。色譜條件色譜柱HP-INNOWAX柱，30ramX0.53mmXlum;柱溫60°C;檢測(cè)器(FID)溫度300°C;進(jìn)樣口溫度16(TC;載氣高純氮?dú)膺M(jìn)樣量1PL儲(chǔ)備溶液精密稱取0.2176g乙酸丁酯于lOmL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度。每lml儲(chǔ)備溶液含醋酸丁酯21.76mg.標(biāo)準(zhǔn)溶液取lOOuL儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度。每lml標(biāo)準(zhǔn)溶液含醋酸丁酯217.6ug。樣品溶液將0.4g檢測(cè)樣品放入10niL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液各lul注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，用外標(biāo)法計(jì)算乙酸丁酯含量。乙酸丁酯殘留不超過0.5%。相關(guān)物質(zhì)照組分項(xiàng)下的方法測(cè)定。單個(gè)未知雜質(zhì)不超過《2.5%,總雜質(zhì)不超過《5.0%。(出口美國指標(biāo))堆密度依法測(cè)定，堆密度應(yīng)為0.280.36g/raL。(出口美國指標(biāo))粒度依法測(cè)定，100目通過率不低于97%。(出口美國指標(biāo))鋁離子用熒光分光光度法測(cè)定供試品溶液的熒光強(qiáng)度(L)、對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度(12)及空白溶液的熒光強(qiáng)度U3),激發(fā)光波長為392nm，發(fā)射光波長為518nm。供試品溶液的熒光強(qiáng)度(I,—13)應(yīng)不大于對(duì)照溶液的熒光強(qiáng)度(12—13)(50ppra)。供試品溶液取本品5.0g，置50ml容量瓶中，加鹽酸硝酸為3:1的混合溶液20ml消化后，加水稀釋至刻度。取10ml轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次加入20ml、10ml的5g/L8-羥基喹啉的氯仿溶液萃取，合并氯仿層，并用氯仿稀釋至50ml。同法制備空白溶液。對(duì)照溶液照供試品溶液的制備方法，用0.05X的鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml代替樣品制備對(duì)照溶液。鎳離子照原子吸收分光光度法，使用鎳空心陰極燈，檢測(cè)波長232.0nm。分別測(cè)定供試品溶液、對(duì)照溶液及空白溶液的吸光度，按回歸方程計(jì)算供試品溶液中鎳的含量。供試品溶液所含的鎳應(yīng)不超過0.0001%(1ppra)。供試品溶液取本品10.0g，置50ml容量瓶中，加入3%醋酸溶液溶解并稀釋至刻度。全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入2.0ml飽和吡咯烷二硫代氨基甲酸銨溶液(約10g/L)和10.Oral甲基異丁基酮，在避光條件下振搖30秒中，靜置分層，取甲基異丁基酮層并用甲基異丁基酮定容至10ml。對(duì)照溶液照供試品溶液的制備方法，分別用0.5ml、l.Oml、1.5mi的鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液(10ppmNi)代替樣品制備3個(gè)對(duì)照溶液?？瞻兹芤赫展┰嚻啡芤旱闹苽浞椒?，用甲基異丁基酮代替樣品制備空白溶液。鈷離子用原子吸收分光光度法，選擇鈷空心陰極燈，測(cè)試波長240.7咖，取樣品溶液9ml，加3%硝酸溶液lral作為供試品溶液；另取樣品溶液9ml，加鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液lml作為混合溶液，分別測(cè)定供試品溶液的吸光度(Ii)、混合溶液的吸光度(12)及空白溶液的吸光度(13)。供試品溶液的吸光度(L一13)不得大于加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度(12—I》(1ppm)。樣品溶液取供試品約12g，精密稱定，置坩鍋中，于電爐上碳化后于高溫電阻爐中65(TC，灰化2h，加鹽酸-硝酸溶液(3:1)20ml，加熱保持微沸15分鐘，時(shí)時(shí)補(bǔ)充鹽酸-硝酸溶液(3:1)保持殘?jiān)鼭櫇?，冷卻，過濾，加水定容于25raL容量瓶中，即得樣品溶液。同法制備空白溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液取鈷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(lOOOPg/raL)1.00raL于100mL容量瓶中，用3%硝酸溶液稀釋定容，搖勻，即得濃度為10.0Pg/mL的鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液。效價(jià)測(cè)定用泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，照抗生素微生物檢定法測(cè)定。按干燥品計(jì)算，每lmg的效價(jià)不得少于850泰樂菌素單位。磷酸泰樂菌素檢測(cè)(引用標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)業(yè)部獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)。)本品為泰樂菌素磷酸鹽，按干燥品計(jì)算，每1mg的效價(jià)不得少于830泰樂菌素單位。性狀本品為白色或類白色粉末。本品在氯仿中易溶，在水或甲醇中溶解，在乙醚中幾乎不溶。鑒別(1)取本品約3mg，加丙酮2ml溶解后，加鹽酸1ml，溶液由淡紅色漸變?yōu)樯钭仙?2)取本品，加鹽酸液(lmol/L)制成每lml中含20ug的溶液，照分光光度法(附錄17頁)測(cè)定，在290nm波長處有最大吸收。(3)本品的水溶液顯磷酸鹽的鑒別反應(yīng)。(附錄16頁)檢査酸堿度取本品，加水制成每2.5%的溶液，依法測(cè)定(附錄40頁)，pH值應(yīng)為5.07.2。酪胺取本品50mg，加甲醇5ml使溶解，加1(^吡啶溶液2ml，2呢茚三酮溶液2ml，用錫箔密封，置85'C水浴中加熱30分鐘，迅速冷卻，移至25ral量瓶中，加水至刻度，作為供試品溶液。同法制備不含供試品的空白溶液。另取每lml中含酪胺32yg的酪胺甲醇溶液5ml，同法制備，作為對(duì)照溶液。立即照分光光度法(附錄17頁)在570nm波長處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸收度，其供試品的酪胺值不得大于0.32%。有關(guān)組分照高效液相色譜法(附錄24頁)測(cè)定。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充抓取高氯酸鈉，加40%乙腈溶液制成0.85nol/L的溶液，并用1bk)1/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為290咖。理論板數(shù)按泰樂菌素A峰計(jì)算應(yīng)不低于2000,泰樂菌素C峰和B峰的分離度應(yīng)符合要求。測(cè)定法取本品適量，精密稱定，加水-乙腈溶液(1:1)制成每1al中含400ug的溶液，濾過，精密量取續(xù)濾液IOwl,注入高效液相色譜儀。泰樂菌素有關(guān)組分保留時(shí)間依次為C、B、D、A，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計(jì)算，含泰樂菌素A應(yīng)不低于85%，泰樂菌素A+B+C+D應(yīng)不低于95%。干燥失重取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在60TC減壓干燥至恒重，減失重量不得過4.5%(附錄57頁)。熾灼殘?jiān)”酒穕.0g，依法檢査(附錄59頁)，遺留殘?jiān)坏眠^4.59L重金屬取熾灼殘?jiān)?xiàng)下遺留的殘?jiān)婪z查(附錄54頁，第二法)，含重金屬不得過百萬分之二十。效價(jià)測(cè)定取本品適量，精密稱定，加滅菌水制成每1nl中約含1000單位的溶液，再用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋成濃度范圍為每1ul中含2.5~10.0單位。照抗生素微生物檢定法(附錄68頁，二劑量法)測(cè)定，即得。附件材料h中國科學(xué)院微生物檢驗(yàn)所關(guān)于泰樂菌素生產(chǎn)菌弗氏鏈霉菌"神舟飛船返回式科學(xué)與技術(shù)試驗(yàn)衛(wèi)星"搭載菌株與地面對(duì)照菌株生理生化及全細(xì)胞蛋白SDS""PAGE分析目的1菌株的生理生化特征測(cè)定2菌株的全細(xì)胞蛋白SDS-聚丙酰胺凝膠分析(SDS-PAGE)材料與方法1測(cè)定菌株泰樂菌素生產(chǎn)菌氟氏鏈霉菌(SfwptoWKes^Kfere)搭載菌株編號(hào)"E-T-HG-0402";地面對(duì)照菌株編號(hào)"E-D-HG-0401"。2測(cè)試菌株的形態(tài)學(xué)特征觀察測(cè)定菌株在高氏一號(hào)瓊脂、燕麥粉瓊脂、ISP4、Beimett's培養(yǎng)基平皿上插片培養(yǎng)12d后，對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并觀察菌落及菌絲形態(tài)。3測(cè)試菌株的生理生化特征測(cè)定參照《BERGEY，SMANUALofSystematicBacteriology》Vol4.和《放線菌的分類和鑒定》的描述進(jìn)行生理生化特征測(cè)定。4測(cè)定菌株的全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE分析；4.1菌體細(xì)胞的培養(yǎng)和收集測(cè)定菌株在Bennett's培養(yǎng)基平皿上28'C培養(yǎng)72h待菌株生長、檢査純度后，轉(zhuǎn)接Bennett's培養(yǎng)基斜面，28C培養(yǎng)48h,用2nl0.1M,pH7.0碟酸緩沖液轉(zhuǎn)入裝有50mlBe皿ett's液體培養(yǎng)基(用0.OIM，pH7.0磷酸緩沖液配制)的2501三角瓶中，28'C180rpm搖瓶培養(yǎng)48h;用相同接種量再次轉(zhuǎn)接Bennetfs液體培養(yǎng)基(801/500ml三角瓶，用磷酸緩沖液0.01MpH7.0配制)于28TC,18Qrpa培養(yǎng)，分別于36、48、72、96及120h后，10，OOOrpa離心收集菌體，用NaPBS緩沖液洗滌2次。4.2全細(xì)胞蛋白的提取離心洗滌好的細(xì)胞加入900MlSTB緩沖液(sampletreatmentbuffer),置冰浴預(yù)冷，不需混合；于冰浴中按預(yù)備實(shí)驗(yàn)的到的條件超聲破碎細(xì)胞(冰浴，1抑W功率，超聲破碎30sec,間歇30sec，共超聲破碎40min);加入100rt20%的SDS,旋渦混勻，96'C保溫10min后冰浴冷卻，10000rpm離心8nin,上清液既為蛋白樣品，于-20T:保存。4.3全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE分析采用不連續(xù)膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，濃縮膠(上膠)濃度為分離膠(下膠)濃度為12%,在20t:恒溫電泳槽中20mA恒流電泳至膠下沿約0.5M時(shí)結(jié)束；完成電泳后，倒去電泳槽中的緩沖液，小心卸下膠版，取出凝膠；置于3X三氯乙酸(TCA)溶液中60rp姐固定15min。棄去固定液，加入新的考馬斯亮藍(lán)染液，60rpm室溫染lh。然后將凝膠轉(zhuǎn)入脫色液中，60rpm脫色(這一步重復(fù)3次)，觀察凝膠的蛋白圖譜，直至條帶清晰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.培養(yǎng)特征觀察a.測(cè)定菌株的革蘭氏染色均為陽性。b.測(cè)定菌株菌絲多分枝，基內(nèi)菌絲無橫隔，不斷裂；氣生菌絲多分枝、不豐盛；孢子絲少，柔曲，鉤端到蠊旋，有的短孢子絲末端稍膨大見圖2。插片染色鏡檢地面對(duì)照菌株著色不均勻，孢子少；搭載菌株著色均勻，孢子量大見圖3。c.培養(yǎng)特征測(cè)定菌株在不同培養(yǎng)基上的特征見表l,圖4、5表1測(cè)定菌株在5種培養(yǎng)基的培養(yǎng)特征<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.生理生化特征生理生化的特征見表23.全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE分析SDS-PAGE得到的蛋白指紋圖譜見圖6a.在培養(yǎng)120h的蛋白圖譜中，(1)97KD分子量以上附近有一條帶存在差異見圖6-A;b.在培養(yǎng)48h時(shí)，97KD附近搭載菌株一個(gè)蛋白首先大量表達(dá)，到72h時(shí)，地面對(duì)照才有同樣的表達(dá)量見圖6-B;c.培養(yǎng)48h時(shí)培養(yǎng)48h后，搭載菌株在66KD附近有一個(gè)蛋白開始大量表達(dá)，而地面對(duì)照菌的蛋白量還很低見圖6C;d.在40KD附近，培養(yǎng)48h時(shí)，搭載菌株的一個(gè)蛋白表達(dá)已經(jīng)開始減弱，而地面對(duì)照菌的蛋白量還比較高見圖6-D。表2測(cè)定菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>b:比陰性對(duì)照稍好，但不顯著總結(jié)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明搭載菌株與地面對(duì)照菌株比較，菌株的培養(yǎng)特征發(fā)生變化，搭載菌株氣絲較地面對(duì)照豐盛，顏色較深，有淺黃色可溶性色素產(chǎn)生見圖3，4;搭載菌株的孢子比地面對(duì)照豐富，染色均勻。搭載菌株的全細(xì)胞蛋白指紋圖譜也有顯著差異:搭載菌株與地面對(duì)照有一個(gè)蛋白條帶差異，及三個(gè)蛋白條帶的表達(dá)時(shí)續(xù)差別。權(quán)利要求1、空間誘變高產(chǎn)高效菌種及用途，其特征是所述菌株(Streptomycesfradiae9904S+-86)的保藏號(hào)為CGMCCNo.1687。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株在制備泰樂菌素中的用途。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的菌株在制備酒石酸泰樂菌素中的用途。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的菌株在制備磷酸泰樂菌素中的用途。5、所述泰樂菌素的制備方法是優(yōu)選Streptomycesfradiae9904S+-86菌種進(jìn)行太空搭載,經(jīng)過太空誘變精心選育的T廠156菌株作為生產(chǎn)菌種；經(jīng)一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵，將發(fā)酵液提純,最終生產(chǎn)出太空誘變菌種生產(chǎn)的泰樂菌素。全文摘要本發(fā)明涉及空間誘變的高產(chǎn)高效菌種，特別是關(guān)于一種空間誘變高產(chǎn)高效菌種及用途，其特征是所述菌株(Streptomycesfradiae9904S⁺-86)的保藏號(hào)為CGMCCNo.1687，以及該菌株在制備泰樂菌素中的用途。本發(fā)明通過利用太空的特殊環(huán)境使菌種遺傳性質(zhì)發(fā)生變異，從而優(yōu)選出正變異、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌種，并將優(yōu)選的正向突變菌株作為生產(chǎn)菌種，該正向突變菌種產(chǎn)量高，用途廣，有效率高。文檔編號(hào)A61K33/06GK101116671SQ20061010445公開日2008年2月6日申請(qǐng)日期2006年8月2日優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日發(fā)明者恒趙申請(qǐng)人:恒趙