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艾葉多糖提取物的用途的制作方法

文檔序號(hào):1082179閱讀:707來源:國(guó)知局
專利名稱:艾葉多糖提取物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種艾葉提取物的用途,具體地說,涉及一種艾葉多糖提取物的用途。
背景技術(shù)
艾(學(xué)名Artemisia argyi),菊科,多年生草本植物。其葉(艾葉)入藥,主要功能散寒止痛,溫經(jīng)止血。
艾葉中包含有揮發(fā)油、腺嘌呤、膽堿、鞣質(zhì)、黃酮、甾醇、萜類、多糖和微量元素等組分。Seo等從艾葉中提取獲得黃酮類化合物,并發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤活性(Planta Med,2003,69,3;J.ofEthno.2005,3,26;Jour.OfAgri.And Food Chem.2000,42,8);Lee和Ha等人發(fā)現(xiàn)艾葉的水提物及甲醇提取物具有能抑制某些腫瘤細(xì)胞增生的作用(Jour.OfBiochem.And Mole.Biol.,1999,6,23;Natural Product Sciences,1997,3,1)。然迄今為止,對(duì)艾葉多糖提取物的用途未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于,提供一種艾葉多糖提取物的用途。
本發(fā)明采用適合于艾葉多糖提取的提取方法,對(duì)生藥艾葉(未經(jīng)煎煮的艾葉)進(jìn)行提取后獲得艾葉多糖提取物。首次發(fā)現(xiàn)所得艾葉多糖提取物對(duì)小鼠移植性Heps腫瘤和Eac腫瘤均有明顯的抑制作用,且可以提高荷瘤小鼠NK細(xì)胞的活性。這就預(yù)示著本發(fā)明所提取得艾葉多糖提取物具有抗腫瘤活性和明顯的增強(qiáng)免疫功能作用,并且有明顯的劑量依賴性,可用于抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能藥品的制備。
本發(fā)明所說的艾葉多糖提取物的提取方法,包括如下步驟(1)將生藥艾葉用水煎煮0.5~2小時(shí),過濾,保留濾液;(2)向由步驟(1)所得的濾液中加入沉淀劑,使沉淀劑在濾液中的濃度為65v/v%~80v/v%,得沉淀物,過濾,保留沉淀物;(3)將由步驟(2)所得的沉淀物與水混合,離心,保留上清液;(4)將由步驟(3)所得的上清液進(jìn)行脫蛋白(脫蛋白的方法可采用Sevag法、三氯醋酸法或表面活性劑法,具體參見張惟杰編《復(fù)合多糖生化研究技術(shù)》,上海科學(xué)技術(shù)出版社,1987)后獲得上清液,向該上清液中加入沉淀劑后得沉淀物,過濾,所得沉淀物經(jīng)洗滌和干燥后即為目標(biāo)物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟(1)中艾葉與水的重量比為1∶(5~15),更優(yōu)選為1∶(9~12);在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟(1)中所說濾液的pH值控制在5.0~8.0為宜;在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中,其中所說的沉淀劑為甲醇、乙醇或丙酮,最佳的沉淀劑為乙醇;在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟(4)中所說的洗滌是依次用無水乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)行洗滌;在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟(4)中所說的干燥為真空干燥、干燥溫度為50℃。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1取生藥艾葉2.0kg,煎煮提取兩次,每次1小時(shí),每次加10倍量水,合并2次濾液。濾液于50℃減壓濃縮至500mL,加入乙醇,使其濃度為65v/v%,靜置12小時(shí)后,離心20分鐘,棄上清液,沉淀物于50℃下減壓干燥。干燥后的沉淀物與400mL的去離子水混合,再加入200mL10wt%的三氯醋酸溶液,充分?jǐn)嚢?,放?小時(shí)后離心20分鐘,棄沉淀,向清液中加入乙醇,使其濃度為75v/v%,醇沉(靜置)24小時(shí)后離心得取沉淀物,將所得沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、和乙醚進(jìn)行洗滌,再經(jīng)50℃下真空干燥得艾葉多糖提取物24g。
實(shí)施例2取生藥艾葉2.0kg,煎煮提取兩次,每次1小時(shí),每次加10倍量水,合并2次濾液。濾液于50℃減壓濃縮至500mL,加入乙醇,使其濃度為80v/v%,靜置12小時(shí)后,離心20分鐘,棄上清液,沉淀物于50℃下減壓干燥。干燥后的沉淀物與400mL的去離子水混合,采用Sevag法脫蛋白,共處理7次。向經(jīng)Sevag法脫蛋白后所得的清液中加入乙醇,使其濃度為75v/v%,醇沉(靜置)24小時(shí)后離心得取沉淀物,將所得沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、和乙醚進(jìn)行洗滌,再經(jīng)50℃下真空干燥得艾葉多糖提取物38g。
對(duì)實(shí)施例1或?qū)嵤├?所提取的艾葉多糖提取物進(jìn)行有關(guān)抗腫瘤藥效學(xué)及毒理學(xué)研究,具體如下實(shí)施例3按實(shí)施例1所述的提取方法提取的艾葉多糖提取物(簡(jiǎn)稱AYTP)靜脈注射對(duì)小鼠移植性腫瘤Heps的抑制作用
取ICR小白鼠(18-22g,雌雄各半;由中國(guó)科學(xué)院上海試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)40只,按移植性腫瘤研究法接種Heps實(shí)體型,接種24小時(shí)后稱鼠重,隨機(jī)分為4組,每組10只,雌雄各半,空白對(duì)照組與環(huán)磷酰胺(CTX,30mg/kg)組分別為陰、陽(yáng)生對(duì)照組。AYTP組設(shè)高、低二個(gè)劑量組(100、50mg/kg)。接種24小時(shí)后靜脈注射給藥,隔天一次,共給藥4次,于停藥后第2天小鼠稱重,處死荷瘤小鼠并分離瘤塊,稱瘤重,計(jì)算各組平均瘤重,按下列公式求出腫瘤抑制率(抑瘤率),并將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。結(jié)果見表1。

表1

*P<0.05**P<0.01 與空白對(duì)照組比較由表1可知與空白對(duì)照組相比,多糖AYTP各劑量組、CTX組均有顯著抑制Heps的腫瘤生長(zhǎng)作用(P<0.01),其中多糖AYTP各劑量組對(duì)動(dòng)物體重影響較大(P<0.01)。陽(yáng)性藥CTX對(duì)移植瘤的抑制作用也很明顯(P<0.01),對(duì)小鼠體重影響也較大。
實(shí)施例4AYTP靜脈注射對(duì)小鼠移植性腫瘤Eac的抑制作用取ICR小白鼠(18-22g,雌雄各半;由中國(guó)科學(xué)院上海試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)40只,按移植性腫瘤研究法接種Eac實(shí)體型;接種24小時(shí)后稱鼠重,隨機(jī)分為4組空白對(duì)照組(生理鹽水)、AYTP100mg/kg、AYTP50mg/kg、CTX30mg/kg,每組10只,雌雄各半;接種24小時(shí)后尾靜脈注射給藥,給藥體積0.4ml/20g;隔天一次,共給藥4次,于停藥后第2天小鼠稱重,處死荷瘤小鼠并分離瘤塊,稱瘤重,所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果見表2表2

**P<0.01 與空白對(duì)照組比較由表2可知與空白對(duì)照組相比,AYTP各劑量組均可顯著抑制小鼠移植瘤Eac的生長(zhǎng)(P<0.01),但100,50mg/kg劑量組對(duì)動(dòng)物體重影響較大(P<0.01)。陽(yáng)性藥CTX對(duì)移植瘤的抑制作用也很明顯(P<0.01),對(duì)小鼠體重影響也較大。
實(shí)施例5AYTP的急性毒性實(shí)驗(yàn)急性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)六個(gè)劑量組,每劑量組10只小鼠(18-22g,雌雄各半;由中國(guó)科學(xué)院上海試驗(yàn)動(dòng)物中心提供),藥物劑量按等比遞增,比值0.8,分別為245.76、307.2、384、480、600、750mg/kg,尾靜脈注射,給藥體積0.4ml/只,一次注射后,在24小時(shí)后多次觀察,連續(xù)觀察7天。記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)情況和死亡動(dòng)物的分布,死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行尸檢,并記錄病變情況,若有肉眼可見病變組織時(shí),需進(jìn)行該組織的病理形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)果用Bliss統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LD50值,結(jié)果見表3。
表3

由表3可知小鼠靜脈注射給藥后中毒癥狀為茸毛卷臥,步履蹣跚,活動(dòng)減少,嗜睡,呼吸減慢。死亡動(dòng)物解剖,各臟器未見明顯異常。結(jié)果表明艾葉多糖毒性較小,安全范圍大。
實(shí)施例6AYTP誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)首先將制備好的脾細(xì)胞(來源于ICR小白鼠)懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,100μl/孔。然后加入樣品,100μl/孔,每份樣品的每一濃度(終濃度分別為100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL)復(fù)3孔;同時(shí),設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,其中陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖終濃度為50μg/mL,陰性對(duì)照僅加RPMI-1640完全培養(yǎng)基(GIBCO生命技術(shù)公司產(chǎn)品)。將加好樣品的細(xì)胞板置5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)44小時(shí)。取出細(xì)胞板,加MTT,20μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。取出細(xì)胞板,離心(3,000rpm×5min),棄上清液;加DMSO,100μl/孔,37℃振蕩裂解細(xì)胞10min;用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD492值,結(jié)果見表4。
表4

平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)由見表4可知AYTP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)增殖作用,且有顯著的劑量依賴性。
實(shí)施例7AYTP對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的影響采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒對(duì)細(xì)胞因子含量進(jìn)行測(cè)定(ELISA試劑盒專門用于測(cè)定IFN-γ、IL-2和TNF-α的含量變化),研究AYTP各部位對(duì)細(xì)胞因子的誘生作用,結(jié)果見表5~7。
表5艾葉多糖對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響結(jié)果

表6艾葉多糖對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響結(jié)果

表7艾葉多糖對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5~7。艾葉多糖各部位對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α有明顯的促進(jìn)作用,并且有明顯的劑量依賴性。
以實(shí)施例2所述的提取方法提取的艾葉多糖提取物重復(fù)實(shí)施例3~7的實(shí)驗(yàn)可得相同的結(jié)論,在此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種艾(Artemisia argyi)葉多糖提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.一種艾(Artemisia argyi)葉多糖提取物在制備增強(qiáng)免疫功能的藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1或2所說的應(yīng)用,其特征在于,其中所說的艾葉多糖提取物的提取方法包括如下步驟(1)將生藥艾葉用水煎煮0.5~2小時(shí),過濾,保留濾液;(2)向由步驟(1)所得的濾液中加入沉淀劑,使沉淀劑在濾液中的濃度為65v/v%~80v/v%,得沉淀物,過濾,保留沉淀物;(3)將由步驟(2)所得的沉淀物與水混合,離心,保留上清液;(4)將由步驟(3)所得的上清液進(jìn)行脫蛋白后獲得上清液,向該上清液中加入沉淀劑后得沉淀物,過濾,所得沉淀物經(jīng)洗滌和干燥后即為目標(biāo)物。
4.如權(quán)利要求3所說的應(yīng)用,其特征在于,步驟(1)中生藥艾葉與水的重量比為1∶(5~15)。
5.如權(quán)利要求4所說的應(yīng)用,其特征在于,其中生藥艾葉與水的重量比為1∶(9~12)。
6.如權(quán)利要求3所說的應(yīng)用,其特征在于,步驟(1)中所說濾液的pH值控制在5.0~8.0。
7.如權(quán)利要求3所說的應(yīng)用,其特征在于,其中所說的沉淀劑為甲醇、乙醇或丙酮。
8.如權(quán)利要求7所說的應(yīng)用,其特征在于,其中所說的沉淀劑為乙醇。
9.如權(quán)利要求3所說的應(yīng)用,其特征在于,步驟(4)中所說的洗滌是依次用無水乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)行洗滌。
10.如權(quán)利要求3所說的應(yīng)用,其特征在于,步驟(4)中所說的干燥為真空干燥,干燥溫度為50℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種艾(Artemisia argyi)葉多糖提取物的用途。所說的艾葉多糖提取物對(duì)小鼠移植性Heps腫瘤和Eac腫瘤均有明顯的抑制作用,且可以提高荷瘤小鼠NK細(xì)胞的活性。這就預(yù)示著本發(fā)明所提取得艾葉多糖提取物具有抗腫瘤活性和明顯的增強(qiáng)免疫功能作用,并且有明顯的劑量依賴性,可用于抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能藥品的制備。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1962698SQ20061011845
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2006年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者藍(lán)閩波, 何正有, 鄭穎, 袁慧慧, 劉建文, 翟大宇, 魏冬 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)
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