專利名稱：：芳香硝基化合物在制備治療病毒性肝炎藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及病毒性肝炎的治療領域，更具體的是本發(fā)明涉及3-硝基-4-碘-苯甲酰胺及其衍生物單獨和合并其他抗病毒化合物在治療病毒性肝炎中的應用。
背景技術：
：病毒性肝炎(viralheptitis)是由多種肝炎病毒引起的常見傳染病，具有傳染性強、傳播途徑復雜、流行面廣泛，發(fā)病率較高等特點。臨床上主姜表現(xiàn)為乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、肝腫大及肝功能損害，部分病人可有黃疽和發(fā)熱。有些患者出現(xiàn)蕁麻疹、關節(jié)痛或上呼吸道癥狀。病毒性肝炎分甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎五種。以往所謂的非甲非乙型肝炎(NANBH)經(jīng)血行感染者稱輸血后非甲非乙型肝炎(PT-NANBH)，通過糞-口感染的稱為腸道傳播的非甲非乙型肝炎(ET-NANBH),近年來經(jīng)分子生物學技術研究，證實上述非甲非乙型肝炎的病原引起病毒性肝炎者有二種類型，前者稱丙型肝炎(hepatitisC;HC),后者稱戊型肝炎(hepatitisE;HE)。急性肝炎病人大多在6個月內恢復，乙型、丙型和丁型肝炎易變?yōu)槁?，少?shù)可發(fā)展為肝硬化，極少數(shù)呈重癥經(jīng)過。慢性乙型、丙型肝炎與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生有密切關系。病毒性肝炎的治療應根據(jù)不同病原、不同臨床類型及組織學損害區(qū)別對待。各型肝炎的治療原則均以足夠的休息、營養(yǎng)為主，輔以適當藥物，避免飲酒、過勞和損害肝臟藥物。急性肝炎急性肝炎一般為自限性，多可完全康復。以一般治療及對癥支持治療為主，一般不采用抗病毒治療，急性丙型肝炎則是例外，因急性丙型肝炎容易轉為慢性，早期應用抗病毒藥能顯著降低轉慢率。慢性肝炎根據(jù)病人具體情況采用綜合性治療方案，包括合理的休息和營養(yǎng)，心理平衡，改善和恢復肝功能，調節(jié)機體免疫，抗病毒，抗纖維化等治療。藥物治療的康則是合理用藥，避免損害肝臟藥物。藥物種類包括(1)改善和恢復肝功能類，如維生素類、還原型谷胱甘肽、肝泰樂、五味子類(聯(lián)苯雙酯等)、山豆根類(苦參堿等)、甘草提取物(甘草酸苷等)、垂盆草、齊墩果酸、月參、茵枝黃、門冬氨酸鉀鎂、前列腺素E1、腺苷蛋氨酸、低分子右旋糖酐、苯巴比妥、山莨菪堿、皮質激素等。(2)兔疫調節(jié)類，如胸腺素或胸腺肽、轉移因子、特異性免疫核糖核酸等。(3)抗肝纖維化類，主要有丹參、冬蟲垔草、核仁提取物、Y干擾素等。(4)抗病毒類目的是抑制病毒復制，減少傳染性，改蕃或減輕肝損害，.提髙生活質量，減少或延緩肝硬化、肝衰竭或HCC的發(fā)生。符合適應癥者應盡可能進行抗病毒治療。最近發(fā)表的亞太慢性肝病治療共識(2005)認為，持續(xù)的病毒抑制是減少肝損害和病情進展的關鍵。抗病毒類藥物主要有a、干擾素a(a-IFN〉是目前國內外公認的抑制病毒復制有效、治療慢性乙型肝炎和丙型肝炎的藥物，但療效不滿意，持久有效率約20-40%。a-IFN的抗病毒作用主要通過兩方面，一是作用于靶細胞膜上的受體，激活一系列蛋白酶基因，這些酶具有抑制病毒蛋白合成的作用，從而抑制病毒核酸合成，起到抑制病毒復制的作用；另一方面是a*IFN具有免疫調節(jié)作用，可通過提高特異性CTL的活性，殺傷淸除病毒感染細胞。a-IFN的缺點是抗病毒作用比較弱，而毒副作用比較多，除了可能引起流感樣癥候群之外，還可引起白細胞、血小板減少，且有脫發(fā)、抑郁等情況發(fā)生，患者耐受性較差，適應證較窄,肝功能矢代償患者不能應用，b、核苷類似物:核苷類似物是一類抗病毒藥物，通過核苷酸的競爭性作用摻入病毒的DNA鏈，抑制DNA多聚酶和逆轉錄酶，起到抑制病毒復制的作用。此類藥物有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定、衣曲西他濱、克拉夫定、替諾夫定等，前3種己在國內、外被批準上市。核苷(酸)類似物的優(yōu)點為抗乙肝病毒作用快而強，不良反應少，適應癥廣,可口服，缺點是無固定ff程，須長期用藥，停藥后易復發(fā)且可能發(fā)生病情惡化，甚至出現(xiàn)危及生命的肝功能失代償，還易發(fā)生病毒耐藥變異,導致耐藥，尤其以拉米夫定導致病毒變異率最高(第一年服藥后，17%患者發(fā)生病毒變異)。C、其他抗病毒藥物泛昔洛韋(famciclovir):效果遜于拉米夫定，每R口服三次，每次0.5mg?？共《局委熓锹圆《拘愿窝字委煹年P鍵，但目前的抗病毒藥物效果并不令人滿意，因此，人們希望能夠發(fā)現(xiàn)更加有效、更加安全、副作用更少的能針對性殺滅肝炎病毒的藥物。我們發(fā)明的這組化合物能夠有效地殺滅肝炎病毒，而且不會產(chǎn)生耐藥。中國專利申請CN200410067715披露了芳香硝基化合物用于艾滋病的治療，其作用機理不同于目前用于艾滋病治療的逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。芳香硝基化合物作為核殼體蛋白p7抑制劑，作用于HIV病毒核殼體蛋白p7的鋅指結構，而完整的鋅指結構對于保持HIV病毒的感染性是必須的。鋅指結構被芳香硝基化合物破壞后，HIV病毒就失去了感染性。4-碘-3-硝基苯甲酰胺屬于芳香硝基化合物類的核殼體蛋白p7抑制劑，結構式如下圖所示，具有抗HIV病毒的活性，但是其在肝炎治療領域的應用目前還沒有報導。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>因此，發(fā)明更加有效，更加安全和副作用更小的藥物，能夠更有效的抑制病毒繁殖和生長是本發(fā)明的目的。本發(fā)明提供了芳香硝基化合物在制備治療病毒性肝炎藥物中的應用，該應用的特征是單獨給予芳香硝基化合物藥學上可接受形式的組合物，其中芳香硝基化合物具有下列通式結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>或其藥學上可接受形式的組合物，其中RI;R2和R3各自獨立地選自氫基、羥基、鹵素、慨基、硝基、(C,-C6)烷塞、(C,-C6)烷氧基、(C3-C7)環(huán)烷基或苯基。其中一個特別優(yōu)選的化合物為4-碘-3-硝基苯甲BJt胺。本發(fā)明主要用于治療病毒性肝炎。該藥主要通過作用于病毒核殼體蛋白fe鋅指結構，抑制肝炎病毒的復制、裝配，顯著而特異的抑制病毒的增生；而且鋅指結構是病毒核殼體蛋白的保守結構，不能突變，因而，該藥的使用不會使病毒出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。因此；該化合物可以
發(fā)明內容用來治療各種病毒引起的各類急慢性肝炎。在實際使用中，這些化合物和它們藥理上可以接受的鹽類，在有效劑量上可以單獨或者合并使用，通過合適的劑型顯著而有效的抑制各種肝炎病毒復制和分泌或者防止病毒的在晡乳動物中的感染。關于使用的劑型，可以根據(jù)治療目的采用各種臨床上可以接收到的劑型，例如口服、靜脈、局部、皮下用藥的方式。這里優(yōu)選的劑型是口服和靜脈。根據(jù)所采用的劑型，劑型可以采用固體，半固體，液體的形式，可以做成片劑，膠囊，緩釋劑，粉劑，針劑等。在口服劑型中，除了本發(fā)明的活性化合物之外，還可以使用各種醫(yī)藥上可以允許使用的輔料例如甘露糖，果糖，淀粉，纖維等。液體制劑，特別是針劑一般是把活性物質例如4-碘-3-硝基苯甲酰胺溶解或者分散在藥用溶劑如水，鹽，液體右旋糖酐，甘油，乙醇等做成溶解液或者懸浮液.如果需要，劑型里也可以適當加上一些添加劑如增濕劑或者乳化劑，PH緩沖劑等，如果需要，也可制成脂質體。上面的任何劑型藥物活性成分占整個劑型的1-99%。制備以上劑型的方法，對于這方面的專業(yè)人員來說，都是非常熟悉的，這些方法有關專業(yè)書籍上都是非常明白和詳細的。不管采用任何劑型，都要保證能夠到達有效治療病人的劑量。所謂有效劑量就是能夠阻止病人疾病發(fā)展或者減輕病人癥狀的用藥量。實際使用的劑量將依據(jù)病人的具體情況而決定，這些境況包括病人的體質，體重，疾病的嚴重程度等。然而，有效地劑量可能在1一20mg/kg，優(yōu)選1-10mg/kg。本發(fā)明提供了一個治療抑制肝炎病毒的方法。該方法使病人體內病毒量減少，特別是對乙型肝炎和丙型肝炎?；钚曰衔锘蛘呋钚晕镔|的代謝物和病毒相互作用，抑制病毒復制，或者滅活病毒。所謂減少包括把病毒完全從病人體內排除，或者病人體內感染病毒滴度降低。其中一個最優(yōu)體現(xiàn)就是病人血中病毒數(shù)量的降低；另外一個體現(xiàn)是可以降低耐藥病毒的滴度.還有一個體現(xiàn)就是降低病人細胞內病毒顆粒數(shù)目。具體實施例方式實施例1硝基芳香化合物的合成4-碘-3-硝基苯甲酰胺制備1025mg4-碘-3-硝基苯甲酸(由Che邁icaAltaLtd.,Edmonton^Alberta,Canada提供)溶解于10mlN，N-二甲基甲酰胺中，冷卻到IOC然后加入0.76ml氣化亞砜，室溫下攪拌1小時，然后加入到預先冷卻的20ml濃氨水中，得黑黃色混合物，攪拌5分鐘后加入50ml預先冷卻的去離子水，出現(xiàn)亮黃色沉淀，冰浴條件下冷卻IO分鐘，抽濾出沉淀，冷水淋洗后真空干燥，得500.4mg粗品，乙腈中重結晶得415.2mg4-碘-3-硝基苯甲酰胺，熔點152-155'C。HNMR(DMSO)67.67(bs，1H，號胺基團中的一個非等價質子)，7.84，7.85和7.86,7.87(dd，1H，芳環(huán)第5位氨)，8.22和8.24(d芳環(huán)第6位氫)，8.22(酰胺基團中的另一個非等價質子)，8.35和8.36(4芳環(huán)第2位氡)實施例2:抗乙型肝炎的體外實驗研究材料4-碘-3-硝基苯甲酰胺實驗時用DMSO配成適當濃度，檢測時用培養(yǎng)液3倍稀釋,共8個稀釋度。陽4對照藥拉咪夫定由葛蘭素威康公司生產(chǎn)。方法藥物對細胞毒性試驗用0.6%胰蛋白酶將HepG2.2.15細胞分散成單個細胞懸液,用含10%胎牛血淸的DMEM培養(yǎng)基配成濃度為3xl()5個/邁l的細胞懸液，按0.1ml/L分種于96孔板,置37X:、飽和濕度、5。/。C02培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，2天后換含藥培養(yǎng)液O.lml/孔，每個濃度四孔。將藥物原液作系列倍比稀釋成8個濃度。置37X:、飽和濕度、5°/。C02培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)，并設不加藥物的對照；12天后收集上淸，備作ELISA法測定HBsAg、HBeAg。所余細胞用MTT法測藥物細胞毒性。測定藥物對細胞生長的半數(shù)毒性濃度按Mosmann建立的MTT法檢測[2]。向吸去上清的細胞孔中加入0.4g/LMTT的無血清培養(yǎng)液O.lmI/孔，37卩培養(yǎng)4h，去上清，用二甲基亞砜溶解甲月替顆粒，測570nm波長下的吸光度A值。細胞破壞百分率distroy=(A細胞組一A實驗組)/(A細胞組一A空白組)xiOO%，50%毒性濃度(TC5())為細胞半數(shù)毒性濃度。細胞上清中HBsAg、HBeAg的檢測用所留取第12d的細胞上清液，做ELISA法測定，采用華美生物工程公司生產(chǎn)的酶聯(lián)檢測試劑盒檢測。藥物對抗原的抑制百分率inhibitory(A細胞組一A實驗組)/(A細胞組一A空白組)xl00%,50%抑制濃度(IC5())為HBsAg或HBeAg以抑制率為50%時的藥物濃度。'細胞DNA抽提液檢測HBV-DNA:裂解細胞，離心，.加RNAase,離心沉淀核心顆粒，然后提取病毒DNA,用DNA信號擴增技術，定量檢測HBVDNA。結結果本實驗選擇HBsAg、HBeAg作為藥物效果的初步篩選指標，通過MTT法檢測細胞毒性，并相應計算出選擇指數(shù)(SI)來評價藥物臨床應用前景，SI=TCWIC5n。其中SI>2為有效低毒，2>51>1為低效有毒，SKl為毒性作用。對HepG2.2.15細胞的毒性作用對細胞半數(shù)毒性濃度為64.15ug/ml，對H印G2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用實驗結果見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實驗通過4-碘-3-硝基苯甲酰胺直接作用于HepG2.2.15細胞，培養(yǎng)12d后觀察其對HBsAg和HBeAg分泌的抑制情況來初步評價其體外抗HBV作用。結果顯示，4-碘-3-硝基苯甲酰胺對HepG2.2.15細胞半數(shù)毒性濃度為64.15ug/ml，對HBsAg抑制IC50為18.48ug/ml,SI為3.47;對DNA復制的抑制IC鄰為6.65Wg/ml，SI為9.65，顯示其對HBsAg和病毒得復制均有顯著的抑制作用。目前廣泛使用的拉米夫定抑制病毒DNA復制的ICso為81.18ngAnl.SI為24.64,通過比較說明，4-碘-3-硝基苯甲酰胺比拉米夫定具有更低的起效濃度，另外，拉米夫定只是抑制病毒DNA的復制，而4-碘-3-硝基苯甲酰胺除了抑制病毒DNA的復制外，還能夠抑制HbsAg的分泌，因此比拉米夫定具有更好的抑制乙肝病毒的作用。實施例2:抗丙型肝炎的體外實驗研究主要材料4嶺-3-硝基苯甲酰胺實驗時用DMSO配成適當濃度，檢測時用含2%血清的培養(yǎng)液10倍稀釋，共5個稀釋度。干擾素a2b由廣東麗珠生物公司生產(chǎn)。實驗方法取Replicon細胞生長良好的培養(yǎng)瓶，用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液計數(shù)調整為l*105cell/ml。接種24孔板，lml/孔。置入培養(yǎng)箱37C過夜，棄去上清，然后再加入4_碘-3-硝基苯甲鵬胺，樣品從10um/L開始，10倍稀釋5個濃度，干擾衆(zhòng)10*11;嵐，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中始終保持培養(yǎng)液總體積不變，作用72小時后，收集細胞，Ttizol法提取病4總RNA,在每個孔中加入0.5011&0液，打碎后吸入1.511|1的離心管中，加入0.21111的氧仿，蓋緊離心管，用手劇烈裙蕩離心管15秒.止后取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加O.Sml異丙醉的比例加入異丙酵，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘，棄去上請液，按每mlTxizol液加入至少lml的比例加入75K乙酵，禍旋混勻，4t下7500g離心5分鐘.小心棄去上淸液，然后室溫或真空干煤5-10分鐘，注意不耍干燥過分，否則會降低RNA的溶解度，然后將RNA溶于水中，必要時可551C"601C水溶IO分鐘，貯存于70%乙酵并保存于-701C,熒光定量PCR反應在反應體系內加入以下試劑5*R-PCRBu￡fer5.0ul，250mMMg^OJul,10mMdNTP0.75ul,2*SYBPGkoiI熒光染料l.Oul，10>3*CaIibrationl.Oul，5U/ulHSEx-Tbq,0.25ul,模板l.Oul，10uM引物(HCVs:5，-TgTggAACCggTgTAC-3'.HCVas:5'"CnAA鵬TrAggATTCgTgCTCAr-3:)l.Oul,補充雙蒸水至25ul體系。按照以下程序進行PCR反應訴1C:恥sec:訴1G:5sec,抑1C:加sec,40個循環(huán)；訴t::lmin,55T::lmin,10sec,80個flj^Fi41C:保溫數(shù)ii處理數(shù)據(jù)結果取得是三個復孔的平均值，ECo使用Logit法計算.各反應組收獲的HCVRqdecon細敏的HCVRNA拷貝數(shù)結果如下，并于對照組比較，計算抑制率和EC知，結果見表2，表27721細胞內和培養(yǎng)上淸中HCVRNA的檢<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>該實驗結果表明4-碘-3-硝基苯甲酰胺在體外體系對HCV病毒的復制具有一定的抑制作用，可以抑制HCV病毒的復制。盡管其對HCV的抑制效果不如干擾素，但是與干擾素相比，干擾素是一個大分子的生物制品，其生產(chǎn)工藝復雜，產(chǎn)品本身不穩(wěn)定，產(chǎn)品的保藏和運輸都需要特殊的設備，生產(chǎn)成本高昂，另外干擾素的毒副作用很多，臨床使用劑型主要為注射劑，因而病人的順應性較低；而4-碘-3-硝基苯甲酰胺是一個小分子化合物，性質穩(wěn)定，大規(guī)模生產(chǎn)的成本很低，其可以制成片劑、膠囊等常規(guī)劑型，病人服用非常方便，另外，由于其核干擾素的作用機理不同，可以和干擾素合用，治療效果更好。權利要求1.芳香硝基化合物在制備治療病毒性肝炎藥物中的應用，其中芳香硝基化合物具有下列通式結構式id="icf0001"file="A2006101186920002C1.gif"wi="48"he="38"top="43"left="74"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>或其藥學上可接受形式的組合物，其中R1，R2和R3各自獨立地選自氫、羥基、鹵素、氰基、硝基、(C3-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C7)環(huán)烷基或苯基。2.根據(jù)權利要求l所述的應用，其特征是所述的芳香硝基化合物為4>碘-3-硝基苯甲酰胺。3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征是所述病毒性肝炎為乙型肝炎。4.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征是所述病毒性肝炎為丙型肝炎。5.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征是給予芳香硝基化合物的途徑為口服或非胃腸道結構式:給藥方式。全文摘要本發(fā)明涉及芳香硝基化合物在制藥領域的新用途。特別是芳香硝基化合物在治療病毒性肝炎中的應用。芳香硝基化合物單用或合并常用抗病毒性肝炎藥物能有效地抑制肝炎病毒的復制和分泌。芳香硝基族化合物可以顯著抑制肝炎病毒在哺乳類動物身上的復制和分泌。該類化合物特別適用于治療乙型肝炎病毒和丙型肝炎所導致的疾病。該發(fā)明描述了治療乙型肝炎和丙型肝炎病人的具體方法。文檔編號A61K31/166GK101190211SQ20061011869公開日2008年6月4日申請日期2006年11月23日優(yōu)先權日2006年11月23日發(fā)明者萬維勤,勞苑子,章承繼,趙新永,陳車生申請人:上海富?？粕晁帢I(yè)有限公司