專利名稱：海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備和使用方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖密度加大，養(yǎng)殖水域環(huán)境逐漸惡化，疾病的發(fā)生也越來越頻繁。細(xì)菌性疾病成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見、危害最嚴(yán)重的病害之一，常導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類的大量死亡，其中弧菌病(Vibrosis)又是海水魚養(yǎng)殖中最常見、危害最大的疾病，給海水魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
長期以來，傳統(tǒng)防治方法一般是使用化學(xué)藥物和抗生素，大量使用這些藥物容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，破壞養(yǎng)殖水體的微生態(tài)系統(tǒng)，還會造成藥物在養(yǎng)殖動物體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖動物的品質(zhì)。因此，開發(fā)高效、安全的疫苗對魚類進(jìn)行有效免疫接種才是防治細(xì)菌病最有效最經(jīng)濟(jì)的方法。在現(xiàn)有的技術(shù)中，目前只有鰻弧菌菌體疫苗以及最小弧菌偶聯(lián)亞單位疫苗的生產(chǎn)和應(yīng)用。鰻弧菌菌體疫苗，由于存在毒力容易反彈、使用劑量大、機(jī)體的免疫應(yīng)答水平較低等原因而導(dǎo)致免疫效果不佳。最小弧菌偶聯(lián)亞單位疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較專一抗最小弧菌的特異性，對其他弧菌致病菌引起的疾病防御作用較差，在生產(chǎn)應(yīng)用中存在非常明顯的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備和使用方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備方法，可用作多種海水魚類提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的抗弧菌的疫苗，所用菌種為溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌中的二種或二種以上的菌種；該制備方法包含3個主要的步驟，分別為細(xì)菌的培養(yǎng)、胞外產(chǎn)物的提取、疫苗的制備。
所述海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備方法，按以下步驟(1)細(xì)菌的培養(yǎng)弧菌用含2％NaCl且起始pH 7.2的胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基TSB活化，于28℃下，150r/min下振蕩培養(yǎng)18h；然后取1mL菌液涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基TSA，于28℃下靜置培養(yǎng)18h；(2)胞外產(chǎn)物的提取每皿中加入4mL pH 7.2的PBS，洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min，上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物ECP，置4℃冰箱保存。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度；(3)疫苗的的制備濃度為0.05mg/ml的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 該海水魚致病弧菌亞單位疫苗的使用方法(1)浸泡法幼苗期間宜進(jìn)行浸泡免疫。方法為將需要免疫的魚放入盛有疫苗的容器里，浸泡時間為一天；(2)注射法幼魚階段可進(jìn)行腹腔注射免疫，注射劑量為0.1ml/尾；(3)口服免疫幼魚階段還可進(jìn)行口服疫苗。每100千克魚每天0.05ml拌飼投喂，連喂3天。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果1.多組分菌苗的免疫效果好于單一組分菌苗；2.海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗高效安全，無藥物殘留污染。同時，感染成分被除去，有關(guān)殘余毒性或毒性回復(fù)的隱患不再存在；3.本弧菌疫苗中含有病原體的一部分，因而這種疫苗在化學(xué)性質(zhì)上更為確定，免疫特異性更為穩(wěn)定；
4.本亞單位疫苗對多種弧菌致病菌引起的疾病均有防御作用；5.海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗廣譜抵抗各種海水魚致病弧菌的侵襲感染，其適用對象為各種海水養(yǎng)殖魚類；6.本疫苗使用方便，可以多途徑免疫接種，可在幼苗期間進(jìn)行浸泡免疫，又可在幼魚階段進(jìn)行注射免疫，還可進(jìn)行口服免疫。
7.本疫苗免疫保護(hù)率為86-92％，具體保護(hù)效果見下表表1疫苗在網(wǎng)箱養(yǎng)殖石斑魚中浸泡免疫的試用效果

表2疫苗在網(wǎng)箱養(yǎng)殖紅笛鯛中注射免疫的試用效果

表3疫苗在網(wǎng)箱養(yǎng)殖紫紅笛鯛中口服免疫的試用效果


具體實(shí)施方式
本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1分別將溶藻弧菌和哈氏弧菌先采用胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)活化，28℃下，150r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后取1mL菌液分別涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA)，于28℃下靜置培養(yǎng)18h。然后，分別提取溶藻弧菌和哈氏弧菌胞外產(chǎn)物。方法為用pH 7.2的PBS洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min。上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。接著分別制備溶藻弧菌和哈氏弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。方法為分別將濃度為0.05mg/ml的溶藻弧菌和哈氏弧菌的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆?。最后將制得的溶藻弧菌和哈氏弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗等比例混合，得到致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。
實(shí)施例2分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌先采用胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)活化，28℃下，150r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后取1mL菌液分別涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA)，于28℃下靜置培養(yǎng)18h。然后，分別提取溶藻弧菌、哈氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌胞外產(chǎn)物。方法為用pH 7.2的PBS洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min。上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。
接著分別制備溶藻弧菌、哈氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。方法為分別將濃度為0.05mg/ml的溶藻弧菌、哈氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈髮⒅频玫娜茉寤【?、哈氏弧菌和?chuàng)傷弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗等比例混合，得到致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。
實(shí)施例3
分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌先采用胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)活化，28℃下，150r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后取1mL菌液分別涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA)，于28℃下靜置培養(yǎng)18h。然后，分別提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌胞外產(chǎn)物。方法為用pH 7.2的PBS洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min。上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。接著分別制備溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。方法為分別將濃度為0.05mg/ml的溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和鰻弧菌的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆?。最后將制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌、?chuàng)傷弧菌和鰻弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗等比例混合，得到致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。
實(shí)施例4分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌先采用胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)活化，28℃下，150r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后取1mL菌液分別涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA)，于28℃下靜置培養(yǎng)18h。然后，分別提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌胞外產(chǎn)物。方法為用pH 7.2的PBS.洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min。上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。接著分別制備溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。方法為分別將濃度為0.05mg/ml的溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈髮⒅频玫娜苋茉寤【?、哈氏弧菌、?chuàng)傷弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗等比例混合，得到致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。
實(shí)施例5分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌先采用胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)活化，28℃下，150r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后取1mL菌液分別涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA)，于28℃下靜置培養(yǎng)18h。然后，分別提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌胞外產(chǎn)物。方法為用pH 7.2的PBS洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min。上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。接著分別制備溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。方法為分別將濃度為0.05mg/ml的溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆?。最后將制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌、?chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗等比例混合，得到致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。
實(shí)施例6分別將溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌先采用胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)活化，28℃下，150r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后取1mL菌液分別涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基(TSA)，于28℃下靜置培養(yǎng)18h。然后，分別提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌胞外產(chǎn)物。方法為用pH 7.2的PBS洗下菌液，4℃下10000r/min離心30min。上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物(ECP)。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。接著分別制備溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。方法為分別將濃度為0.05mg/ml的溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈髮⒅频玫娜茉寤【?、哈氏弧菌、?chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗等比例混合，得到致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗。
權(quán)利要求
1.一種海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備方法，其特征在于可用作多種海水魚類提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的抗弧菌的疫苗，所用菌種為溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌中的二種或二種以上的菌種；該制備方法包含3個主要的步驟，分別為細(xì)菌的培養(yǎng)、胞外產(chǎn)物的提取、疫苗的制備。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備方法，其特征在于按以下步驟(1)細(xì)菌的培養(yǎng)弧菌用含2％NaCl且起始pH 7.2的胰胨大豆胨液體培養(yǎng)基TSB活化，于28℃下，150r/min下振蕩培養(yǎng)18h；然后取1mL菌液涂布于鋪有無菌玻璃紙的含2％NaCl且起始pH為7.2的胰胨大豆胨瓊脂平板培養(yǎng)基TSA，于28℃下靜置培養(yǎng)18h；(2)胞外產(chǎn)物的提取每皿中加入4mL pH7.2的PBS，洗下菌液，于4℃下10000r/min離心30min，上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲取弧菌胞外產(chǎn)物ECP，置4℃冰箱保存。用紫外分光光度計(jì)測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度；(3)疫苗的的制備濃度為0.05mg/ml的胞外產(chǎn)物，加入0.1％的福爾馬林，60℃滅活1h，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.據(jù)權(quán)利要求1方法制備的海水魚致病弧菌亞單位疫苗的使用方法，其特征在于(1)浸泡法幼苗期間宜進(jìn)行浸泡免疫。方法為將需要免疫的魚放入盛有疫苗的容器里，浸泡時間為一天；(2)注射法幼魚階段可進(jìn)行腹腔注射免疫，注射劑量為0.1ml/尾；(3)口服免疫幼魚階段還可進(jìn)行口服疫苗。每100千克魚每天0.05ml拌飼投喂，連喂3天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗的制備和使用方法，可用作多種海水魚類提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的抗弧菌的疫苗，所用菌種為溶藻弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌和河流弧菌中的二種或二種以上的菌種；該制備方法步驟分別為細(xì)菌的培養(yǎng)、胞外產(chǎn)物的提取、疫苗的制備。本發(fā)明所制備海水魚致病弧菌胞外產(chǎn)物亞單位疫苗中含有病原體的一部分，免疫特異性更為穩(wěn)定，且感染成分被除去，有關(guān)殘余毒性或毒性回復(fù)的隱患不再存在。本疫苗適用于預(yù)防魚類的皮膚潰瘍、眼球混濁及由該幾種病原引起的其它疾病。因此可廣泛用于海水魚養(yǎng)殖，并具有提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的效果，免疫保護(hù)率可達(dá)86－92％。
文檔編號A61P31/04GK101020050SQ200610124338
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者簡紀(jì)常, 龐歡瑛, 左鳳琴, 吳灶和 申請人:廣東海洋大學(xué)