專利名稱：抗丙肝病毒感染的dna疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子微生物學、感染免疫領域，特別是涉及一種抗丙肝病毒感染的DNA疫苗的制備及其應用。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝病最重要的病因之一[1]，我國也是丙型肝炎高發(fā)地區(qū)之一，HCV感染者約占總人口的3.2％。急性HCV感染者中大約有80％的患者會成為慢性持續(xù)性感染者[2]，其中20％的患者經(jīng)歷20～30年后可進展為肝硬化，1～5％患者可進展為肝細胞性肝癌(HCC)。丙肝病毒有明顯的遺傳學和表型的不同[3]，而且丙肝病毒僅能感染人類及黑猩猩，這就使針對丙肝的研究陷入困境。針對HCV感染的經(jīng)典治療方案只有用α干擾素或將α干擾素和核普類似物病毒哇合用[4]，但該療法有較大缺陷，副作用較大[5]。因此，開發(fā)新型有效的丙肝疫苗已迫在眉睫。HCV包膜蛋白包括E1和E2兩個糖蛋白，它們在感染中發(fā)揮著重要的作用，尤其是在HCV病毒的合成、粘附、侵襲中都起到了非常重要的作用[6]；它們不僅僅參與蛋白粒子的裝配，而且在病毒入侵宿主細胞的過程中，以及包膜糖蛋白和細胞表面受體的結合在細胞膜與病毒粒子膜之間的融合中起到了非常重要的作用[7-8]。E1糖蛋白共有5個潛在的保守的N-糖基化位點，分別位于第196，209，234，305以及325個氨基酸處，其中第五個位點不參與糖基化。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，該疫苗能夠提高宿主特異性的細胞免疫反應，達到臨床使用效果，從而可以作為預防和治療HCV的新型DNA疫苗，并且該疫苗制備簡單，易于推廣。
本發(fā)明解決其技術問題采用以下的技術方案本發(fā)明提供的抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，由以下方法制得利用分子克隆的技術，構建一種表達HCV包膜糖蛋白E1的重組DNA疫苗，在此基礎上構建E1的六個N-糖基化突變體M1-M6，通過比較E1的重組DNA疫苗和E1的六個N-糖基化突變體M1-M6，選用其中免疫原性最強的N-糖基化突變體M2作為抗丙肝病毒感染的DNA疫苗。
本發(fā)明提供的抗丙肝病毒感染的DNA疫苗在制備用于預防HCV病毒感染的DNA疫苗中的應用。
本發(fā)明具有以下的主要優(yōu)點臨床研究證明了細胞免疫應答在防止病人體內病毒持續(xù)感染方面發(fā)揮著重要的作用，我們的研究顯示HCV E1包膜糖蛋白的N-糖鏈可以限制宿主的細胞免疫應答。用HCV E1蛋白的編碼基因構建的E1-M2突變體重組DNA疫苗可以作為HCV的治療性和預防性的疫苗。HCV E1上的糖基可能遮蔽病毒的T細胞表位以及B細胞表位，從而使病毒逃避免疫識別。作為免疫原性增強的DNA疫苗，E1糖基化突變體M2制備簡單，應用方便，效果顯著，具有較好的應用前景。


圖1為E1及其突變體氨基酸位點示意圖。
圖2和圖3E1及其突變體真核表達產(chǎn)物的免疫印跡(Western Blot)鑒定結果的示意圖。
圖4為LDH實驗檢測DNA免疫小鼠的CTL反應結果的示意圖。
圖4中縱坐標CTL活性(％)；橫坐標效應細胞與靶細胞比例。
圖5為DNA免疫后的體內腫瘤形成抑制實驗結果的示意圖。
圖5中縱坐標腫瘤體積(mm3)；橫坐標注射腫瘤細胞后天數(shù)。
圖6和圖7顯示了用ELISPOT的方法檢測E1特異性的細胞因子IFN-γ(A)和IL-4(B)分泌細胞的數(shù)目。
圖6中縱坐標每次106脾細胞中IFN-γ產(chǎn)生的細胞數(shù)；橫坐標組別；圖中陰影表示未刺激；圖中空框表示用E1蛋白刺激。
圖7中縱坐標每次106脾細胞中IL-4產(chǎn)生的細胞數(shù)；橫坐標組別；圖中陰影表示未刺激；圖中空框表示用E1蛋白刺激。
具體實施例方式
本發(fā)明利用分子克隆的技術，成功構建了表達HCV包膜糖蛋白E1的重組DNA疫苗，并在此基礎上構建了E1的六個N-糖基化突變體(M1-M6)，將它們作為DNA疫苗，研究糖基化對機體免疫應答的影響。發(fā)現(xiàn)E1-M2可以提高宿主特異性的細胞免疫反應，可以作為抗HCV病毒的免疫反應的新型有效DNA疫苗。
上述E1的重組DNA疫苗由包括以下步驟制得(1)HCV E1的原核表達載體的制備先以HCV全基因組作為模板，進行PCR反應，獲得HCV E1 DNA片段，進行HCVE1原核表達載體pGEX-KG-HCV-E1的構建。
然后將得到的pGEX-KG-HCV-E1經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序，保存測序正確的克隆。
(2)HCV E1的真核表達載體的制備將獲得的HCV E1片段克隆入真核表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B中。
所述E1的六個N-糖基化突變體M1-M6是基于步驟(2)的基礎上進行構建。
所述E1的六個N-糖基化突變體M1-M6是用RT-PCR和Western Blot的方法檢測其真核表達產(chǎn)物。
本發(fā)明提供的所述N-糖基化突變體M2重組DNA疫苗，其在制備用于預防HCV病毒感染的DNA疫苗中的應用。
下面結合實施例和附圖對本發(fā)明的制備方法作進一步說明。
1.HCV包膜糖蛋白E1的原核表達載體的構建、表達與鑒定及抗體制備以HCV全基因組作為模板，進行PCR反應，獲得HCV E1 DNA片段，進行HCV E1原核表達載體pGEX-KG-HCV-E1的構建，其構建方法是提取pGEX-KG質粒DNA，將得到的pGEX-KG及E1 DNA片段用限制性內切酶EcoRI和HindIII消化，分別回收pGEX-KG和E1，在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接目的片斷E1和載體pGEX-KG，16℃，16小時。將連接產(chǎn)物進行轉化，挑取單個克隆，加入到3ml含有氨芐青霉素(50μg/ml)的無菌液體LB中，37℃，16小時。提取質粒DNA pGEX-HCV-E1，然后將得到的pGEX-KG-HCV-E1經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序，保存測序正確的克隆。
將高表達水平的pGEX-HCV-E1重組質粒菌株接種于含50μg/ml的Amp抗菌素的2XTY培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)至OD6001-2之間，加入IPTG至終濃度0.1mM誘導，30℃振蕩培養(yǎng)4小時濃縮菌株后超聲破碎，加入TritonX-100至終濃度為1％，輕混30分鐘后，離心取上清，加入Gluthathion-Sepharose 4B室溫輕混30分鐘后用PBS洗滌三次，即得到純化的GST-E1-Sepharose 4B。
pGEX-HCV-E1原核表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測取適量純化的HCV E1蛋白，進行HCV E1的兔多克隆抗體的制備，并用Western Blot鑒定HCV E1的兔多克隆抗體。
2.HCV E1真核表達質粒pcDNA3.1(-)/Myc-His B-E1的構建將獲得的HCV E1片段克隆入真核表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B中，其方法是以HCV全基因組作為模板，進行PCR反應，獲得HCV E1 DNA片段；提取pcDNA3.1(-)/Myc-His B質粒DNA，將得到的pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1 DNA片段用限制性內切酶EcoRI和BamHI消化，分別回收pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1，在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接目的片斷E1和載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B，16℃，16小時。
將連接產(chǎn)物進行轉化，挑取單個克隆，加入到3ml含有氨芐青霉素(50μg/ml)的無菌液體LB中，37℃，16小時。提取質粒DNA pcDNA3.1(-)/Myc-His B-E1，然后將得到的pcDNA3.1(-)/Myc-His B-HCV-E1經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序，保存測序正確的克隆。
并在上述的基礎上，構建HCV E1的六個糖基化突變體的真核表達載體(見圖1)，其中E1-M1，E1-M2，E1-M3和E1-M4是單突變體，E1-M5和E1-M6是雙突變體。
所述E1的六個N-糖基化突變體M1-M6的構建方法是以重組質粒pcDNA3.1(-)/Myc-His B-HCV-E1為模板，以含突變位點的寡聚核苷酸鏈為引物，分別進行兩次PCR反應。具體包括以下步驟
(1)以第一個糖基化位點的點突變?yōu)槔瑑蓚€反應體系為下列反應體系將合成突變體的前段產(chǎn)物E1-1U10×Taq DNA Polymerase buffer5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP1μl上游引物E1S(20μM) 1μl下游引物p2(20μM)1μl模板 1μlTaq DNA Polymerase 1μl滅菌雙蒸水 37μl總體積 50μl下列反應體系將合成突變體的后段產(chǎn)物E1-1D10×Taq DNA Polymerase buffer5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP1μl上游引物p1(20μM)1μl下游引物E1A(20μM) 1μl模板 1μlTaq DNA Polymerase 1μl滅菌雙蒸水 37μl總體積 50μl在Taq DNA Polymerase的作用下，95℃預變性2分鐘，95℃36秒、55℃36秒、68℃1分24秒，共進行28個循環(huán)，72℃終延伸5分鐘。
引物序列如下pair 1p1(5′-CTACCAAGTGCGCGATTCCTC-3′)and p2(5′-GAGGAATCGCGCACTTGGTAG-3′)；pair 2p3(5′-GATTGCCCTGATTCG AGTATTG-3′)and p4(5′-CAATACTCGAATCAGGGCAATC-3′)；pair 3p5，(5′-GTTCGCGAG GGTGACGCCTCGAGGTCTTG-3′)and p6(5′-CAAGACCTCGAGGCGTCACCCTCG CGAAC-3′)；pair 4p7(5′-GACGCAAAGCTGCGATTGTTCTATCTAC-3′)and p8(5′-GTAGATAGAACAATCGCAGCTTTGCGTC-3′)；上述序列中有下劃線的堿基代表N-糖基化位點，斜體表示的堿基代表突變位點。
(2)分別回收兩次PCR產(chǎn)物E1-1U及E1-1D，以作為下次PCR反應的模板。
具體方法是以E1-1U及E1-1D作為PCR反應的模板，以E1S和E1A作為引物，進行PCR反應。將得到的PCR產(chǎn)物和載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B用EcoRI和BamHI進行酶切。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳、回收，再將回收產(chǎn)物電轉化入大腸桿菌DH5α中。
(3)挑選克隆、提取質粒DNA、用EcoRI和BamHI酶切進行鑒定并進行瓊脂糖凝膠電泳初步篩選陽性克隆。
(4)初步得到的、酶切鑒定正確的克隆送至上海博亞生物技術有限公司測序，得到四個單點突變體，分別命名為M1/M2/M3/M4。在單點突變體M1、M3的基礎上，用M1和M3分別作為PCR的模板，用類似單點突變體構建的方法得到了雙點突變體M5和M6，其中M5為第一個和第二個糖基化位點的聯(lián)合突變，M6為第三個和第四個糖基化位點的聯(lián)合突變。E1及其突變體真核表達產(chǎn)物的免疫印跡(Western Blot)鑒定進行CT26細胞的培養(yǎng)與傳代，將重組質粒DNA轉染CT26細胞，獲得穩(wěn)定表達HCVE1蛋白的細胞系，并用RT-PCR方法和Western Blot檢測穩(wěn)定表達E1野生型及六個突變體的CT26細胞內E1的表達。本鑒定結果圖2為收獲轉染質粒DNA的CT26細胞并用Western Blot分析。將質粒注射小鼠48h后，檢測注射部位小鼠肌肉組織E1及其突變體的表達(見圖3)。
3.所述E1的六個N-糖基化突變體M1-M6是用RT-PCR和Western Blot的方法檢測其真核表達產(chǎn)物，具體是(1)RT-PCR方法檢測穩(wěn)定表達E1野生型及六個突變體的CT26細胞內E1的表達1)樣品處理培養(yǎng)細胞收獲細胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。
2)加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置5min。
3)4℃離心，12000g×15min，取上清。
4)加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。
5)4℃離心，12000g×10min，棄上清。
6)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。
7)晾干，加入適量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。
8)RNA定量，用DNA酶消化殘余的DNA。
9)取RNA11μl(總量為0.1-5μg)，加入美國天美(Promega)公司生產(chǎn)的oligo(dT)18primer 1μl，70℃作用5min后，冰上放置以冷卻混合物。
10)依次加入下列物質
5×reaction buffer 4μlRibolockTMRibonuclease 1μlinhibitor10mM dNTP mix 2μl總體積 20μl11)37℃作用5min，加入美國天美(Promega)公司生產(chǎn)的RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase 1μl，42℃作用60min后，70℃加熱10min以終止反應，12)用得到得cDNA作為模板，以E1S和E1A作為引物，進行PCR反應，反應體系見前述內容。
13)在Taq DNA Polymerase的作用下，進行PCR反應，反應條件是A.95℃，5min，B.95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84sec；共28個循環(huán)，C.72℃，5min。
14)將得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。
(2)真核表達產(chǎn)物的Western Blot檢測收獲細胞，按常規(guī)方法裂解細胞，得到細胞裂解液，制備12％濃縮膠，以及5％分離膠。常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳，當示蹤跡跑出樣品孔后1小時，停止電泳，按照順序進行Western Blot，30V，過夜，取出硝酸纖維膜，按照常規(guī)方法操作，最后用HRP-羊抗兔二抗，以及底物DAB顯色。
4.E1野生型和六個糖基化位點突變體的重組DNA疫苗分別免疫BALB/C小鼠，用ELISPOT方法以及腫瘤形成抑制試驗和LDH法進行特異性CTL的功能檢測。
(1)重組質粒DNA免疫BALB/C小鼠大劑量提取質粒DNA，使用0.5％鹽酸普魯卡因(100μl/只)預先處理BALB/C小鼠，于雙側后腿股四頭肌注射(8組)，三天后相同的部位注射提取的高純度質粒DNA。免疫分組以及每組注射劑量如表1所示。DNA免疫，共四次，每次間隔10天。末次免疫后第10天處死老鼠，部分全血用于分離血清，用于檢測抗體滴度；另一部分全血抗凝室溫，放置用于其它指標的檢測。
(2)LDH實驗檢測DNA免疫小鼠的CTL反應小鼠細胞毒性T細胞(CTL)殺傷活性效應細胞為免疫小鼠的脾細胞。靶細胞為穩(wěn)定轉染了E1-WT及M1-M6各突變體的CT26細胞。將培養(yǎng)板250g離心4分鐘，以混勻效靶細胞。37℃孵育4小時。加入10μl裂解液到靶細胞最大LDH釋放組及體積校正組。繼續(xù)培養(yǎng)45分鐘，250g離心4分鐘，每孔吸取50μl上清到酶標板相應孔中。解凍稀釋液，恢復至室溫后，加入底物瓶內，混勻后，每孔加50μl稀釋底物，37℃孵育30分鐘。每孔加入50μl終止液，1小時內讀板。特異性殺傷效率按以下公式計算特異性殺傷率(％)＝(實驗組釋放-實驗組自發(fā)釋放-靶細胞自發(fā)釋放)/靶細胞最大釋放-靶細胞自發(fā)釋放)×100％。
由圖4可知，本發(fā)明和陰性對照組IL-2相比，各實驗組的CTL反應明顯增強。但野生型pE1和pE1-M1或pM3-M6各組之間未見明顯差異(結果未顯示)。與野生型相比，pE1-M2免疫小鼠的體外CTL反應明顯增強(p＜0.05)。
(3)DNA免疫后的體內腫瘤形成抑制實驗腫瘤形成抑制實驗可以在一定程度上反映小鼠體內的細胞免疫功能，即體內的特異性CTL反應。小鼠的分組及免疫同前，在末次免疫的第十天，于小鼠背部接種2×106個表達相應抗原的的CT26細胞(其與BALB/C小鼠具有相同MHC表型)，定期觀察腫瘤大小及成瘤率。
實驗結果見圖5我們在DNA免疫組小鼠背部以2×106的密度接種表達相應抗原的與BALB/C小鼠具有相同MHC表型的CT26細胞。各個實驗組的腫瘤體積均小于陰性對照IL-2組或空載組(p＜0.05)。而且，pE1-M2組小鼠的腫瘤體積是各個實驗組中體積最小的，其與E1-WT組相比，p＜0.05。
6.ELISPOT實驗包被板子，分離小鼠脾細胞，調整細胞濃度至2×106個/孔。封閉ELISPOT培養(yǎng)板，加入已準備好的細胞，細胞總數(shù)在2×105個/孔。37℃5％CO2溫箱孵育12h。依次加入生物素標記的檢測抗體和酶標記的抗體(GABA)，加入顯色劑顯色后，觀察斑點的形成。去除顯色液，使用去離子水清洗ELISPOT板。室溫干燥ELISPOT板，在倒置顯微鏡下觀察結果或使用自動酶聯(lián)斑點圖像分析儀進行分析。
實驗結果顯示在經(jīng)過E1蛋白的刺激后，各實驗組活性細胞的數(shù)目都明顯高于刺激前的水平。實驗組DNA免疫小鼠的E1特異性的細胞因子IFN-γ和IL-4的分泌細胞的數(shù)量都比陰性對照組的水平要高(p＜0.05)，而且同野生型相比，突變體pE1-M2組產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)目明顯增加(p＜0.05)。各實驗組產(chǎn)生IL-4的細胞數(shù)目與野生型相比沒有顯著性差異。圖6為產(chǎn)生IFN-γ的T細胞數(shù)目/106脾細胞。圖7為產(chǎn)生IL-4的T細胞數(shù)目/106脾細胞。*p＜0.05，與Vector組相比；**p＜0.05，與pE1-WT組相比。
附表表1 免疫組別及注射劑量

參考文獻1.Lee，S.H.，Kim，Y.K.，Kim，C.S.，Seol，S.K.，Kim，J.，Cho，S.，Song，Y.L.，Bartenschlager，R.，and Jang S.K..E2 of hepatitis C virus inhibits apoptosis.[J].J.Immunol.2005，1758226-8235.
2.Nunez，M.，and V.Soriano.Current concepts in the management and treatment of hepatitisC in HIV-infected patients.[J].Ann.Hepatol，2005，4(3)151-160.
3.Goffard，A.Pathogenesis of chronic hepatitis Cimmunological features of hepatic injuryand viral persistence.[J].Hepatology，1999，30(3)595-601.
4.Fuster，D.，J.A.Huertas，G.Gomez，R.Sola，J.Gonzalez Garcia，J.Vilaro，E.Pedrol，L.Force，J.Tor，G.Sirera，S.Videla，R.Planas，B.Clotet，C.Tural，and Peg-Tox ResearchGroup.Short communication.Baseline factors associated with haematological toxicity thatleads to a dosage reduction of pegylated interferon-alpha2a and ribavirin in HIV-andHCV-coinfected patients on HCV antiviral therapy.[J].Antivir.Ther，2005，10841-847.
5.Thevenot T，V.Di Martino，F(xiàn).Lunel-Fabiani，C.Vanlemmens，M-C.Becker，J-P.Bronowicki，S.Bresson-Hadni，J-P.Miguet.Complementary treatments of chronic viralhepatitis C.[J].Gastroenterol Clin Biol，2006，30(2)197-214.
6.Dubuisson，J.，and C.M.Rice.Hepatitis C virus glycoprotein foldingdisulfide bondformation and association with calnexin.[J].J.Virol，1996，70778-786.
7.Goffard，A.，Callens，N.，Bartosch，B.，Wychowski，C.，Cosset，F(xiàn).L.，Montpellier，C.，andDubuisson，J.2005.Role of N-linked glycans in the functiohs of hepatitis C virus envelopeglycoproteins.[J].J.Virol，798400-8409.
8.Slater-Handshy，T.，Droll，D.A.，F(xiàn)an，X.，Di Bisceglie，A.M.，Chambers，T.J.HCV E2glycoproteinmutageiesis of N-linked glycosylation sites and its effects on E2 expressionand processing.[J].Virology，2004，319(1)36-48.
權利要求
1.一種抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，其特征是由以下方法制得利用分子克隆的技術，構建一種表達HCV包膜糖蛋白E1的重組DNA疫苗，在此基礎上構建E1的六個N-糖基化突變體M1-M6，通過比較E1的重組DNA疫苗和E1的六個N-糖基化突變體M1-M6，選用其中免疫原性最強的N-糖基化突變體M2作為抗丙肝病毒感染的DNA疫苗。
2.如權利要求1所述的疫苗，其中所述E1的重組DNA疫苗由包括以下步驟制得(1)HCV E1的原核表達載體的制備先以HCV全基因組作為模板，進行PCR反應，獲得HCV E1 DNA片段，進行HCVE1原核表達載體pGEX-KG-HCV-E1的構建，其構建方法包括以下步驟提取pGEX-KG質粒DNA，將得到的pGEX-KG及E1 DNA片段用限制性內切酶EcoRI和HindIII消化，分別回收pGEX-KG和E1，在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接目的片斷E1和載體pGEX-KG，16小時，將連接產(chǎn)物進行轉化，挑取單個克隆，加入到3ml含有濃度為50μg/ml氨芐青霉素的無菌液體LB中，37℃，16小時，提取質粒DNA pGEX-HCV-E1，然后將得到的pGEX-KG-HCV-E1經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序，保存測序正確的克隆，(2)HCV E1的真核表達載體的制備將獲得的HCV E1片段克隆入真核表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B中，其方法是以HCV全基因組作為模板，進行PCR反應，獲得HCV E1 DNA片段；提取pcDNA3.1(-)/Myc-His B質粒DNA，將得到的pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1 DNA片段用限制性內切酶EcoRI和BamH I消化，分別回收pcDNA3.1(-)/Myc-His B及E1，在T4 DNA連接酶的作用下，16℃連接目的片斷E1和載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B，16℃，16小時，將連接產(chǎn)物進行轉化，挑取單個克隆，加入到3ml含有氨芐青霉素(50μg/ml)的無菌液體LB中，37℃，16小時，提取質粒DNA pcDNA3.1(-)/Myc-His B-E1，然后將得到的pcDNA3.1(-)/Myc-HisB-HCV-E1經(jīng)酶切鑒定正確后進行測序，保存測序正確的克隆。
3.如權利要求1或2所述的疫苗，其中所述E1的六個N-糖基化突變體M1-M6是基于權利要求2所述HCV E1的真核表達載體的制備基礎上進行構建，其方法是以重組質粒pcDNA3.1(-)/Myc-His B-HCV-E1為模板，以含突變位點的寡聚核苷酸鏈為引物，分別進行兩次PCR反應，具體包括以下步驟(1)以第一個糖基化位點的點突變?yōu)槔瑑蓚€反應體系為下列反應體系將合成突變體的前段產(chǎn)物E1-1U10×Taq DNA Polymerase buffer5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP1μl上游引物E1S(20μM) 1μl下游引物p2(20μM)1μl模板 1μlTaq DNA Polymerase 1μl滅菌雙蒸水 37μl總體積 50μl下列反應體系將合成突變體的后段產(chǎn)物E1-1D10×Taq DNA Polymerase buffer5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP1μl上游引物p1(20μM)1μl下游引物E1A(20μM) 1μl模板 1μlTaq DNA Polymerase 1μl滅菌雙蒸水 37μl總體積 50μl在Taq DNA Polymerase的作用下，95℃預變性2分鐘，95℃36秒、55℃36秒、68℃1分24秒，共進行28個循環(huán)，72℃終延伸5分鐘，(2)分別回收兩次PCR產(chǎn)物E1-1U及E1-1D，以作為下次PCR反應的模板，具體是以E1-1U及E1-1D作為PCR反應的模板，以E1S和E1A作為引物，進行PCR反應；將得到的PCR產(chǎn)物和載體pcDNA3.1(-)/Myc-His B用EcoRI和BamH I進行酶切；酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳、回收，再將回收產(chǎn)物電轉化入大腸桿菌DH5α中，(3)挑選克隆、提取質粒DNA、用EcoRI和BamHI酶切進行鑒定并進行瓊脂糖凝膠電泳初步篩選陽性克隆，(4)初步得到的、酶切鑒定正確的克隆送至上海博亞生物技術有限公司測序，得到四個單點突變體，分別命名為M1/M2/M3/M4；在單點突變體M1、M3的基礎上，用M1和M3分別作為PCR的模板，用類似單點突變體構建的方法得到了雙點突變體M5和M6，其中M5為第一個和第二個糖基化位點的聯(lián)合突變，M6為第三個和第四個糖基化位點的聯(lián)合突變。
4.如權利要求3所述的疫苗，其中所述E1的六個N-糖基化突變體M1-M6是用RT-PCR和Western Blot的方法檢測其真核表達產(chǎn)物，具體是(1)RT-PCR方法檢測穩(wěn)定表達E1野生型及六個突變體的CT26細胞內E1的表達1)樣品處理培養(yǎng)細胞收獲細胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min，2)加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置5min，3)4℃離心，12000g×15min，取上清，4)加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min，5)4℃離心，12000g×10min，棄上清，6)加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉淀；4℃，7500g×5min，棄上清，7)晾干，加入適量的DEPC H2O溶解，65℃促溶10-15min，8)RNA定量，用DNA酶消化殘余的DNA，9)取RNA11μl(總量為0.1-5μg)，加入美國天美公司的oligo(dT)18primer 1μl，70℃作用5min后，冰上放置以冷卻混合物，10)依次加入下列物質5×reaction buffer 4μlRibolockTMRibonuclease 1μlinhibitor10mM dNTP mix 2μl總體積 20μl11)37℃作用5min，加入美國天美公司的RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase1μl，42℃作用60min后，70℃加熱10min以終止反應，12)用得到的DNA作為模板，以E1S和E1A作為引物，進行PCR反應，反應體系是10×Taq DNA Polymerase buffer5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP1μl上游引物(20μM) 1μl下游引物(20μM) 1μl模板 1μlTaq DNA Polymerase 1μl滅菌雙蒸水 37μl總體積 50μl13)在Taq DNA Polymerase的作用下，進行PCR反應，反應條件是A.95℃，5min，B.95℃，36sec；60℃，36sec；72℃，84sec；共28個循環(huán)，C.72℃，5min，14)將得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，(2)真核表達產(chǎn)物的Western Blot檢測收獲細胞，按常規(guī)方法裂解細胞，得到細胞裂解液，制備12％濃縮膠，以及5％分離膠；常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳，當示蹤跡跑出樣品孔后1小時，停止電泳，按照順序進行Western Blot，30V，過夜，取出硝酸纖維膜，按照常規(guī)方法操作，最后用HRP-羊抗兔二抗，以及底物DAB顯色。
5.權利要求1所述N-糖基化突變體M2重組DNA疫苗在制備用于預防HCV病毒感染的DNA疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明是抗丙肝病毒感染的DNA疫苗的制備及其應用。本發(fā)明利用分子克隆的技術，構建一種表達HCV包膜糖蛋白E1的重組DNA疫苗，在此基礎上構建E1的六個N－糖基化突變體M1－M6，并選用其中N－糖基化突變體M2作為抗丙肝病毒感染的DNA疫苗，和在制備用于預防HCV病毒感染的DNA疫苗中的應用。本發(fā)明的優(yōu)點是實驗顯示HCV E1包膜糖蛋白的N－糖鏈可以限制宿主的細胞免疫應答，其糖基可能遮蔽病毒的T細胞表位以及B細胞表位，從而使病毒逃避免疫識別；用E1糖基化突變體M2可以作為HCV的治療性和預防性的增強免疫原性的DNA疫苗，并且E1糖基化突變體M2制備簡單，應用方便，效果顯著，具有較好的應用前景。
文檔編號A61P1/00GK1943789SQ20061012486
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權日2006年10月26日
發(fā)明者章曉聯(lián), 劉敏 申請人:武漢大學