專(zhuān)利名稱(chēng)：真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白之用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白使用于免疫治療及降低血糖的用途。
背景技術(shù)：
靈芝屬植物(Genus Ganoderma)是稀有且珍貴的中藥材，在中國(guó)泛稱(chēng)為″靈芝″已經(jīng)使用5000年，目前使用中的靈芝包括G.lucidum(紅色)、G.applanatum(棕色)、G.tsugae(紅褐色)、G.sinense(黑色)及G.oregonense(深棕色)。
靈芝有抗過(guò)敏(Chen H.Y et al.，J.Med.Mycol.1992；33505-512)、保肝(Lin J.M.et al.，Am J Chin Med.1993；21(1)59-69)、抗癌(Wasser SP，CritRev Immunol 1999.1965-96)與增加免疫力等功能(Kino，J Biol.Chem.1989.264(1)472-8)。然而，靈芝在利用上，都以直接萃取(Horner W.E.etal.，Allergy 1993；48110-116)或是利用萃取之小分子(Kawagishi H.，et al.，Phytochemistry 1993；32239-241)的方式為之。
由可食菌類(lèi)(例如靈芝Ganoderma Lucidium，草菇Volvariella Volvacea，金針菇Flammulina Velutipes)分離出具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，有相似的氨基酸序列，這些蛋白質(zhì)被命名為真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIPs，F(xiàn)ungalImmunomodulatory Proteins，Ko J.L.，Eur.J.Biochem.1995；228224-249)。
Lin與其同仁由松杉靈芝(Ganoderma tsugae)菌絲中純化出命名為FIP-gts之免疫調(diào)節(jié)蛋白(Lin，W.H.，et al.，J Biol Chem.1997.272，20044-20048)；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有從松杉靈芝菌絲體中純化的FIP-gts有免疫調(diào)節(jié)之功效，松杉靈芝子實(shí)體純化的FIP-gts則無(wú)；選殖FIP-gts基因后發(fā)現(xiàn)其脫氧核醣核酸序列(DNA sequence)與靈芝中發(fā)現(xiàn)的LZ-8一樣，同時(shí)因此二分子皆具有免疫調(diào)節(jié)功效，顯示為同一蛋白質(zhì)。
以Garnier分析法預(yù)測(cè)FIP-gts之二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，此蛋白有兩個(gè)α-螺旋，七個(gè)β-折片與一個(gè)β-轉(zhuǎn)折，以SDS-PAGE分析，此分子之分子量為13kDa，以20μM戊二醛(glutaraldehyde)進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的結(jié)合方式(protein-protein conjugates)分析，F(xiàn)IP-gts為兩個(gè)相同亞基所組成的雙聚體結(jié)構(gòu)(homo dimer)，分子量為26kDa。
此外，以芽細(xì)胞形成活性分析(Blast-formation stimulatory activity assay，BFSA)發(fā)現(xiàn)三個(gè)真菌蛋白具有活性，除了由靈芝發(fā)現(xiàn)的蛋白外，由金針菇(Flammulina velutipes)與草菇(Volvariella volvacea)中發(fā)現(xiàn)的凝血蛋白都具有部分免疫調(diào)節(jié)功能(Hsu，C.-I.，Study on the Fungal ImmunomodulatoryProteins.1996.Department of Medical Technology，College of medicine.NTU，Taipei)。這些蛋白之分子量都差不多是13kDa而且其凝血功能并不是通過(guò)組氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸三種氨基酸所造成，它們屬于與碳水化合物(carbohydrates)連結(jié)的凝集素(Lectin)。
自然殺手細(xì)胞是另一種致死淋巴球，就如同細(xì)胞毒性T細(xì)胞，他們皆包含充滿(mǎn)有毒化學(xué)物質(zhì)的顆粒，他們之所以被稱(chēng)為″自然″殺手細(xì)胞是因?yàn)椴幌窦?xì)胞毒性T細(xì)胞，他們?cè)谡归_(kāi)攻擊前，不需要去辨識(shí)一個(gè)特異的抗原。他們以腫瘤細(xì)胞作為目標(biāo)，并保護(hù)正常細(xì)胞對(duì)抗很多種類(lèi)之具感染力的細(xì)菌或微生物，在許多免疫缺失的疾病中，包括艾滋病，自然殺手細(xì)胞的功能是異常的。自然殺手細(xì)胞亦可能通過(guò)分泌高濃度、具有影響力的淋巴因子，促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)。
細(xì)胞毒性T細(xì)胞及自然殺手細(xì)胞都靠接觸時(shí)進(jìn)行目標(biāo)消滅。殺手細(xì)胞結(jié)合到它的目標(biāo)，以它的武器瞄準(zhǔn)，隨后傳遞將可產(chǎn)生致死爆裂的化學(xué)物質(zhì)使目標(biāo)細(xì)胞膜產(chǎn)生破洞，使得液體流進(jìn)流出，最后導(dǎo)致細(xì)胞爆裂。
直到最近，免疫抗癌的治療方法仍存在著三種形式手術(shù)、化學(xué)治療或放射性治療。然而，在所有這些形式中，會(huì)導(dǎo)致經(jīng)常性及有害的副作用。因此，這三種治療方式對(duì)癌癥病人言，并不是最佳的治療方式，特別是那些癌癥末期的病患。例如，化療及放射性治療的劑量過(guò)度，常會(huì)導(dǎo)致傷害并縮短生命。
最近幾年，一個(gè)第四種抗癌的免疫治療方法開(kāi)始流行。這第四種方法可實(shí)際加強(qiáng)每個(gè)病人體內(nèi)的天然抗癌免疫力。此第四種方法使用的是自身體內(nèi)的自然殺手(natural killer，NK)細(xì)胞，它是身體內(nèi)最強(qiáng)、最有效的免疫細(xì)胞，比殺手T細(xì)胞要強(qiáng)約5萬(wàn)倍。NK免疫治療法無(wú)疑地在未來(lái)會(huì)變得越來(lái)越流行。
自然殺手細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要成份，監(jiān)視并對(duì)抗特定病毒、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及轉(zhuǎn)型細(xì)胞(Trinchieri G.Adv Immunol 1989；47187-376；FrenchAR，Yokoyama WM.Curr Opin Immunol 2003；1545-51；Smyth MJ et al.，Nat Immunol 2001；2293-299)。自然殺手細(xì)胞運(yùn)用細(xì)胞媒介的毒性作用通過(guò)不同細(xì)胞激素(例如IFNg、GM-CSF及TNF-h)及化學(xué)激素(例如MIP-1family及RANTES)的釋放，而做為先天及后天免疫反應(yīng)的橋梁(Biron CA.Curr Opin Immunol 1997；924-34.；Biron CA et al.，Annu Rev Immunol1999；17189-220)。一來(lái)不像T細(xì)胞，自然殺手細(xì)胞殺死病毒感染或惡性轉(zhuǎn)型細(xì)胞，不需要事先活化，并且也不受MHC的限制。因此自然殺手細(xì)胞被認(rèn)為惡性腫瘤，特別是位于造血起源的惡性腫瘤，實(shí)行轉(zhuǎn)移治療時(shí)，最可能的治療方法(Robertson MJ，Ritz J.Blood 1990；762421-38)。失去或表現(xiàn)變化的第1類(lèi)MHC抗原的腫瘤細(xì)胞，可以逃離細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)。但他們很可能輕易的被自然殺手細(xì)胞消滅。然而，惡性腫瘤細(xì)胞經(jīng)常會(huì)發(fā)展對(duì)抗宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)的策略，包括抑制第1類(lèi)MHC細(xì)胞來(lái)避開(kāi)免疫檢測(cè)、增加Fas-L的表達(dá)來(lái)殺死反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，以及產(chǎn)生抑制性的激素如TGF-h(Garcia-Lora A et al.，J Cell Physiol 2003；195346-55.；Kim R et al.，Cancer 2004；1002281-91.)。所以，移動(dòng)的自然殺手細(xì)胞對(duì)增加宿主限制惡性腫瘤發(fā)展的能力是重要的，尤其當(dāng)后天免疫系統(tǒng)處于“無(wú)反應(yīng)性”(anergy)及“耐受”(tolerance)的狀態(tài)時(shí)。
在腫瘤發(fā)展上，巨噬細(xì)胞及嗜中性細(xì)胞皆能同時(shí)視為英雄及惡棍。這些細(xì)胞皆能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用及依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)以及腫瘤生長(zhǎng)抑制細(xì)胞激素的分泌(Marek Jakóbisiak et al.，Immunology Letters December 15，2003pp103-122)。
最近，草藥治療已越發(fā)被認(rèn)為是對(duì)付惡性腫瘤的另一種可行的療法(Risberg T et al.，J Clin Oncol 1998；16(1)6-12.)。在這些治療方法中，藥用蘑菇在全世界民俗醫(yī)學(xué)中有悠久的歷史。在亞洲，靈芝(Ganoderma tsugae，G.tsugae)，一種擔(dān)子菌綱蘑菇，是最受歡迎的化學(xué)防癌用的蘑菇之一。很多生物活性的組成部分已經(jīng)從這個(gè)蘑菇的不同的部分鑒定出來(lái)，包括子實(shí)體，菌絲，孢子和培養(yǎng)基。
G.lucidum的兩個(gè)主要的生物活性成分是多糖體和三帖類(lèi)(triterpenes)。其多糖體具有在試管內(nèi)和在活體內(nèi)的抗癌效應(yīng)，這是通過(guò)一個(gè)免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制(Wang SY et al.Int J Cancer 1997；70(6)699-705.)。一些研究人員表示三帖類(lèi)一般擁有抗氧化作用(Zhu M，Chang Q，et al.，Phytother Res 1999；13(6)529-531.)、保肝作用以及抗高血壓的生物活性(Kim DH et al.，BiolPharm Bull 1999；22(2)162-164.)。最近，有研究報(bào)告指出靈芝Ganodermaspp.具有預(yù)防腫瘤的細(xì)胞毒性之活性。一種靈芝Ganoderma tsugae的三帖類(lèi)，在人類(lèi)肝癌細(xì)胞Hep3B中，被發(fā)現(xiàn)會(huì)引起細(xì)胞凋亡和使細(xì)胞循環(huán)中止，但是分子機(jī)制尚未經(jīng)調(diào)查(Gan KH et al.，J Nat Prod1998；61(4)485-487.)。
端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞內(nèi)催化端粒DNA的合成及延長(zhǎng)(Greider CW et al.，Nature 1989；337(6205)331-337)。這個(gè)酶在大多數(shù)的惡性腫瘤里會(huì)專(zhuān)一的被活化，但是在正常體細(xì)胞里經(jīng)常是不活化的，因此在正常細(xì)胞的細(xì)胞分裂期間，端粒會(huì)逐漸的縮短(Kim NW，et al.，Science 1994；266(5193)2011-2015.)。細(xì)胞需要一個(gè)機(jī)制維持端粒穩(wěn)定性來(lái)克服因復(fù)制所導(dǎo)致的衰老。端粒酶的活性可能因此成為細(xì)胞不朽或致癌生成的速率決定步驟或關(guān)鍵步驟，且超過(guò)90％活體內(nèi)的人類(lèi)癌細(xì)胞表達(dá)出端粒酶活性(Harley CB，et al.，Curr Opin Genet Dev 1995；5(2)249-255.)。做為核醣核蛋白的復(fù)合體，端粒酶在人體內(nèi)由兩個(gè)主要的亞單位組成。這些是RNA的模板及反轉(zhuǎn)錄酶亞單位，分別由hTR及hTERT基因編碼。值得注意的是，沒(méi)有端粒酶活性的肺癌病患，比有端粒酶活性的，活在明顯較佳的預(yù)后狀態(tài)(Wu TC，et al.，Lung Cancer 2003；41(2)163-169.)。這顯示對(duì)肺癌患者言，端粒酶的活性是重要的預(yù)后因子。

發(fā)明內(nèi)容
除非特別定義，所有的技術(shù)與科學(xué)名詞與現(xiàn)有認(rèn)知與公知技術(shù)相同。雖然本發(fā)明的材料與方法與公知技術(shù)類(lèi)似或相同，然而以下將詳述或測(cè)試本發(fā)明的較佳方法與材料。以下將定義本發(fā)明中使用之專(zhuān)有名詞。
本發(fā)明提供一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白用來(lái)進(jìn)行免疫治療的用途，該蛋白質(zhì)內(nèi)含氨基酸序列SEQ ID No1MSDTALFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN或SEQ ID No3SATSLTFQLAYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFPKVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPSGGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPDTGNSEEYIIAEWKKT。
本發(fā)明之真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可從Ganoderma species，Volvariellavolvacea或重組微生物中獲得(例如重組大腸桿菌或酵母菌)。較佳的Ganoderma species實(shí)施例為Ganoderma tsugae。
本發(fā)明之真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的用途能用來(lái)做為緩和癌癥病患的疼痛或副作用的輔佐物。
本發(fā)明之真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的用途能用刺激或活化免疫功能。
因此，本發(fā)明之免疫功能是由挑選自下列群組之機(jī)制所造成，此群組是由自然殺手細(xì)胞之活化、巨噬細(xì)胞之活化以及血清抗體之增殖所組成。而本發(fā)明較佳具體化之功能是通過(guò)自然殺手細(xì)胞之活化以及端粒酶之抑制所造成。
本發(fā)明之真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以拿來(lái)設(shè)計(jì)成下列劑型，其中包括口服溶液、口服膠囊、口服藥片或是口服藥丸，是以口服方式服用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)FIP-gts的互補(bǔ)脫氧核醣核酸(cDNA)序列與LZ-8完全相同(SEQ ID NO1)，并且有抗癌作用。本發(fā)明同時(shí)披露以FIP-gts處理的癌細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞活性，顯示FIP-gts可當(dāng)成抗癌藥物。
本發(fā)明并且發(fā)現(xiàn)以FIP-gts處理的癌細(xì)胞會(huì)降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2，metalloproteinases-2)之表達(dá)，MMP-2是肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移(metastasis)有關(guān)的重要酶。MMP-2的抑制是抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的前兆。
名詞“免疫調(diào)節(jié)”不限于刺激或活化免疫功能(例如活化自然殺手細(xì)胞及巨噬細(xì)胞或增加血清里IgG或IgM抗體的生成)，或治療或預(yù)防因轉(zhuǎn)移而成的癌癥，或通過(guò)抑制端粒酶催化亞單位來(lái)壓抑端粒酶活性的癌癥。
真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白所能治療的癌癥是選自下列群組，包含肺癌、骨癌、乳癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌及腸胃道癌。
在其它的實(shí)施例中，依據(jù)本發(fā)明的FIP-gts能融合至一個(gè)抗腫瘤藥劑或一個(gè)檢測(cè)標(biāo)簽。如此可允許FIP-gts導(dǎo)向藥劑或檢測(cè)卷標(biāo)到腫瘤細(xì)胞，并因此能做到腫瘤的傷害/摧毀或檢測(cè)。因此，F(xiàn)IP-gts適合用于利用化療或外科手術(shù)進(jìn)行的人類(lèi)或動(dòng)物身體的治療方法(例如，放射免疫引導(dǎo)之外科方法，RIGS)，或?qū)嵤┰谌祟?lèi)或動(dòng)物身體的治療方法。特別的是，F(xiàn)IP-gts適合用于腫瘤的外科手術(shù)或治療，或腫瘤的診斷等方面的治療。
連結(jié)FIP-gts的抗腫瘤藥劑可以是任何破壞或傷害FIP-gts已經(jīng)結(jié)合的腫瘤，或在FIP-gts已經(jīng)結(jié)合的細(xì)胞環(huán)境。例如，抗腫瘤藥劑可以是具毒性的化療藥劑或放射性同位素、可以活化前驅(qū)藥或細(xì)胞激素的酶。
已為在所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所知之適當(dāng)?shù)幕熕巹╝nthracycline(例如daunomycin及doxorubicin)、vindesine、neocarzinostatin、cis-platinum、chlorambucil、cytosine arabinoside、5-fluorouridine、melphalan、ricin及calicheamicin。
適當(dāng)?shù)姆派湫酝凰乇挥脕?lái)做為抗病毒藥劑已為在所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。
接上FIP-gts的抗腫瘤藥劑可能也是活化前驅(qū)藥的酶。這會(huì)使得失活的前驅(qū)藥活化，在指引的部位形成細(xì)胞毒性的形式。在臨床的運(yùn)用上，F(xiàn)IP-gts-酶的給合體注射入病患體內(nèi)，可聚積在目標(biāo)腫瘤的區(qū)域。被注射入體內(nèi)的前驅(qū)藥因此轉(zhuǎn)變成具細(xì)胞毒性的藥物，在區(qū)域性酶的影響下，聚積在目標(biāo)腫瘤的區(qū)域。
因此，本發(fā)明也提供一個(gè)用于免疫治療的方法，其成份為注射入病患體內(nèi)，達(dá)有效劑量的本發(fā)明之片段或各種多肽。
基于本發(fā)明之FIP-gts含有可用來(lái)做RIGS以及診斷的檢測(cè)標(biāo)簽。RIGS包含注射一個(gè)標(biāo)定的蛋白質(zhì)進(jìn)入病患體內(nèi)，之后以外科手術(shù)移除任何該蛋白質(zhì)所結(jié)合之組織。因此，貼上標(biāo)簽之FIP-gts可引導(dǎo)外科醫(yī)師找到組織。
此接合FIP-gts的檢測(cè)標(biāo)簽可能是一個(gè)成像的藥劑，用來(lái)做出圖像的諸如半衰期短的放射性同位素，例如111ln、125I或99mTc。
目前，端粒酶抑制的研究聚焦于(1)直接導(dǎo)向核心端粒酶的組成物(Hahn WC et al，.Nat Med 1999；5(10)1164-1170)；(2)端粒導(dǎo)向(Zhang RG etal.，Cell Res 2002；12(1)55-62)；(3)作為端粒酶抑制物的天然組成及小分子(Naasani I et al.，Biochem Biophys Res Commun 1998；249(2)391-396)和(4)端粒酶調(diào)節(jié)機(jī)制的干擾(Kawagoe J et al.J Biol Chem2003；278(44)43363-43372)。
所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以合理推斷此醫(yī)藥組合物之施與對(duì)象，可以為脊椎動(dòng)物，適當(dāng)?shù)膶?duì)象為患癌癥或是有罹癌風(fēng)險(xiǎn)之人類(lèi)。然而，實(shí)施例中之?dāng)⑹觯瑢⒑蠪IP-gts之醫(yī)藥組合物施用在體外培養(yǎng)的脊椎動(dòng)物癌癥細(xì)胞，并以簡(jiǎn)單的細(xì)胞侵蝕分析(cellular invasion assay)與傷害/復(fù)原分析(heal wounded assay)證實(shí)具體有效；這些結(jié)果，可以合理推及治療脊椎動(dòng)物。
可以將包含F(xiàn)IP-gts之用藥組合物以任何公知路徑注入脊椎動(dòng)物體內(nèi)，包括通過(guò)靜脈，皮下，腫瘤內(nèi)，肌肉，穿皮貼片，脊髓內(nèi)或是顱內(nèi)等路徑進(jìn)入體內(nèi)，施行之方法可以快速的以注射施行，或是通過(guò)浸潤(rùn)或緩釋劑長(zhǎng)期釋放藥效。
包含F(xiàn)IP-gts之用藥組合可預(yù)期以公知方法調(diào)制成適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥組合物，其中之一是將其溶在生理食鹽水中，另外也預(yù)期可以以適當(dāng)?shù)妮d體例如符合生理濃度之無(wú)毒鹽溶液，百分之五的葡萄糖溶液，滅菌水等，都可以配制適當(dāng)含F(xiàn)IP-gts的醫(yī)藥組合物。適當(dāng)?shù)木彌_溶液也可以調(diào)置成含F(xiàn)IP-gts的醫(yī)藥組合物，如果需要，可進(jìn)一步冷凍干縮于注射瓶中，等需要用時(shí)再以滅菌水還原，并注射。主要的溶劑為水，或是非水溶劑二者擇其一。
含F(xiàn)IP-gts的醫(yī)藥組合物的載體可包含醫(yī)藥允許之賦形劑(excipients)，以調(diào)整適當(dāng)之酸堿值，含水量，粘稠度，干凈度，色澤，滅菌度，穩(wěn)定度，溶解速度或是配方之味道。相同的，此藥學(xué)上可接受載體可包含醫(yī)藥允許之賦形劑，以調(diào)整藥物吸收，與穿過(guò)血腦障壁(blood-brainbarrier)之能力；這些賦形劑是以習(xí)慣上制備非腸胃用藥的方式，以單劑，多重劑量或是以持續(xù)或間隔直接浸潤(rùn)之劑型制備。
組成含有FIP-gts醫(yī)藥組合物的特定口服配方也是需要深思熟慮的。這些配方最好與適當(dāng)?shù)奈矬w結(jié)合，包括載劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、乳化劑、懸浮劑、甜味劑、芳香劑、緩釋劑及壓縮成藥錠或包裝成固體形式或軟件形式的膠囊?；蚩伤剂繉⑦@些配方設(shè)計(jì)成下列劑型，如口服液、口服膠囊或口服藥丸。或者除了口服方法外，也可考慮將這些配方設(shè)計(jì)成灌腸劑、栓劑、植入物、貼布、乳液或藥膏。一些適當(dāng)載劑、賦型劑及稀釋劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇(sorbitol)、甘露蜜醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯膠(gum acacia)、磷酸鈣(calcium phosphate)、褐藻膠(alginates)、硅酸鈣(calcium silicate)、微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、明膠(gelatin)、糖漿(syrup)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥苯甲酯及羥基安息香酸鹽(methyl-andpropyl-hydroxybenzoates)、滑石粉(talc)、鎂(magnesium)、硬酯酸(stearate)、水、礦物油與其它適當(dāng)物質(zhì)。此配方可以額外加入潤(rùn)滑劑、保濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑與香料。此醫(yī)藥組合可以依公知技術(shù)制備成將活性物質(zhì)FIP-gts制成施行后可以迅速、持久或是緩釋劑型，此配方同時(shí)包括可以減少蛋白質(zhì)分解、核酸或其它分解的物質(zhì)，或是可以加速吸收的物質(zhì)，如接口活性劑。此醫(yī)藥組合物也可以包括與聚乙二醇(PolyethyleneGlycol，PEG)、白蛋白(albumin)或是其它可以增進(jìn)FIP-gts在血液中的穩(wěn)定性的物質(zhì)。
包含F(xiàn)IP-gts之用藥組合可以在脊椎動(dòng)物中以有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的劑量施用，專(zhuān)一的劑量以適當(dāng)?shù)捏w重、體表面積或是病人體積估算。此劑量同時(shí)依施用方法估算。近一步的計(jì)算用藥劑量可依公知技術(shù)者決定，這樣的計(jì)算可以由公知方法合理推演。例如，以明膠-酶譜法分析(gelatin-zymography assay)推算。此劑量同時(shí)依熟悉公知之醫(yī)師估算，依個(gè)別病人之特性包括年齡、體重、對(duì)藥物反應(yīng)、病人之病況與投藥方法決定。投藥之劑量可以依據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)、劑型與投藥路徑?jīng)Q定。
含有FIP-gts的組合物喂食給BALB/c老鼠，測(cè)試其對(duì)自然殺手細(xì)胞活性、巨噬細(xì)胞活性及血清抗體生成的效應(yīng)。與不同劑量群組比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FIP-gts可促進(jìn)自然殺手細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血清抗體生成的活化。
本發(fā)明提供一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白用來(lái)降低病患之血糖之用途，該蛋白質(zhì)內(nèi)含氨基酸序列SEQ ID No1MSDTALFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN或SEQ ID No3SATSLTFQLAYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFPKVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPSGGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPDTGNSEEYIIAEWKKT。
本發(fā)明中，該病患不限第一或二型糖尿病病患，特指針對(duì)遭受第二型糖尿病患。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明此發(fā)明之具體施行，而非限制此發(fā)明之范圍。


圖1是A549細(xì)胞以FIP-gts處理過(guò)后的形態(tài)改變。A549細(xì)胞以不同濃度(0、1、2、4及10μg/ml)的FIP-gts處理并在不同時(shí)間(6、12、24及72hrs)觀察之結(jié)果。
圖2是人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞株A375在以FIP-gts處理過(guò)后的形態(tài)改變。細(xì)胞以0、4及16μg/ml的FIP-gts處理0、24及48小時(shí)，并在以相位差照相機(jī)照相(x100)。
圖3是A549以FIP-gts處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度。A549細(xì)胞以不同濃度(0、1、2、4及10μg/ml)的FIP-gts處理并在48小時(shí)后以錐蟲(chóng)藍(lán)染劑染色，估算存活之細(xì)胞。數(shù)據(jù)以中位數(shù)加三重復(fù)之標(biāo)準(zhǔn)差(顯著性學(xué)生T檢驗(yàn)，*p＜0.05)圖4是A549以FIP-gts處理后的細(xì)胞群落形成(Colony forming)效應(yīng)(A)以細(xì)胞群落形成分析不同濃度(0、0.4、1及2μg/ml)的FIP-gts處理后，A549細(xì)胞在無(wú)法固定的培養(yǎng)基上之生長(zhǎng)狀況。(B)細(xì)胞群落數(shù)量以解剖顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)，每細(xì)胞群落最少要有50顆細(xì)胞。數(shù)據(jù)以中位數(shù)加三重復(fù)之標(biāo)準(zhǔn)差(顯著性學(xué)生T檢驗(yàn)，*p＜0.05)圖5是以FIP-gts處理后A549在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期進(jìn)程。以10％之DMEM使細(xì)胞再懸浮(A)以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞并以Cellquest軟件搜集數(shù)據(jù)。(B)資料以ModFit LT 3.0分析。數(shù)據(jù)以中位數(shù)加三重復(fù)之標(biāo)準(zhǔn)差(顯著性學(xué)生T檢驗(yàn)，*p＜0.05)圖6是A549細(xì)胞分別以0、2、4及10μg/ml后的p21及procaspase-3表達(dá)。細(xì)胞溶解產(chǎn)物在48小時(shí)后及表達(dá)時(shí)收集，并以Western印跡法做分析。
圖7是以FIP-gts處理后A549的移行能力分析。以移液器之藍(lán)色尖頭在長(zhǎng)滿(mǎn)的A549上刮一道傷痕(箭頭指示原始傷口之大小)，培養(yǎng)72或96小時(shí)后固定細(xì)胞并以Giemsa染劑染色。
圖8是以FIP-gts處理后A549中MMP-2之活性。(A)A549細(xì)胞以不同濃度(0、1、2、4及10μg/ml)的FIP-gts處理24小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，以明膠-酶譜法分析MMP-2之活性。(B)MMP-2的活性以密度分析儀量化(densitomertic analysis)，量化之?dāng)?shù)據(jù)以中位數(shù)加三重復(fù)之標(biāo)準(zhǔn)差(顯著性學(xué)生T檢驗(yàn)，*p＜0.05)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一改變細(xì)胞形態(tài)A549細(xì)胞株屬于人類(lèi)肺癌表皮細(xì)胞，此肺癌細(xì)胞株因?yàn)榫哂懈叨纫菩心芰?migratory capability)而相當(dāng)惡性。本發(fā)明以A549肺癌細(xì)胞株當(dāng)癌癥模型，研究癌細(xì)胞對(duì)FIP-gts之反應(yīng)。
首先，本發(fā)明以顯微鏡觀察以FIP-gts處理過(guò)后的細(xì)胞形態(tài)改變，A549細(xì)胞分別以不同濃度(0、1、2、4及10μg/ml)的FIP-gts處理并在不同時(shí)間觀察并以照相紀(jì)錄其細(xì)胞形態(tài)變化(圖一)。
A549細(xì)胞在2、4或10μg/ml的FIP-gts處理之下，細(xì)胞形態(tài)在6小時(shí)后就有顯著變化，細(xì)胞形態(tài)由觸角狀的緊貼(adhering with little tentacles)狀態(tài)，變成圓形且貼附性差(round and loosly-attached)的形態(tài)，這些圓形細(xì)胞會(huì)因?yàn)檩p微搖動(dòng)培養(yǎng)皿而漂起。72小時(shí)之后，沒(méi)有藥物處理或是以低濃度FIP-gts處理的A549細(xì)胞形態(tài)攤平擴(kuò)散并完全覆蓋培養(yǎng)皿的表面，相反的以高濃度FIP-gts處理的A549細(xì)胞無(wú)法覆蓋培養(yǎng)皿的表面，而且許多細(xì)胞呈現(xiàn)圓形的形態(tài)(圖二)；正常肺組織細(xì)胞株BEAS-2B在0、2、4或10μg/ml的FIP-gts處理之下并不會(huì)有細(xì)胞形態(tài)的改變，沒(méi)有藥物處理或是以FIP-gts處理的BEAS-2B細(xì)胞在24小時(shí)里有相同的生長(zhǎng)速度，而且?guī)缀跬瑫r(shí)完全覆蓋培養(yǎng)皿的表面(圖二)。以正常肺組織細(xì)胞株BEAS-2B當(dāng)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞不會(huì)被FIP-gts影響，可以在生長(zhǎng)24小時(shí)后完全覆蓋培養(yǎng)皿的表面。
使用人類(lèi)黑色素惡性腫瘤細(xì)胞株A357進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以松杉靈芝蛋白處理之A357細(xì)胞，似乎失去細(xì)胞與細(xì)胞之間的附著力，細(xì)胞不再是緊密地互相接觸，而是雜亂地散布(圖2)。分別以0、4以及16μg/ml松杉靈芝蛋白處理A357細(xì)胞，并觀察24、48以及72小時(shí)，發(fā)現(xiàn)所用的松杉靈芝蛋白濃度愈高，有愈多的細(xì)胞變成圓形(圖2)，圖2顯示16μg/ml的松杉靈芝蛋白能夠大大地抑制細(xì)胞附著性以及細(xì)胞成長(zhǎng)。如前文所述，證實(shí)松杉靈芝蛋白是通過(guò)重組細(xì)胞架構(gòu)，而改變細(xì)胞之移動(dòng)性與附著性。
實(shí)施例二細(xì)胞存活能力分析(Cell viability assay)進(jìn)一步證實(shí)上述之實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明以錐蟲(chóng)藍(lán)(trypan blue)染色以檢查細(xì)胞存活能力。本發(fā)明以與前述實(shí)驗(yàn)相同的FIP-gts濃度(0、1、2、4與10μg/ml的FIP-gts)處理細(xì)胞48小時(shí)，然后加入錐蟲(chóng)藍(lán)，活細(xì)胞不會(huì)被錐蟲(chóng)藍(lán)染色，本發(fā)明以計(jì)算沒(méi)被染色的細(xì)胞(活細(xì)胞)數(shù)量當(dāng)成細(xì)胞之存活能力。
本發(fā)明在6厘米培養(yǎng)皿中分別接種(inoculated)2×105H1355與A549細(xì)胞，H1355細(xì)胞株是一般研究新陳代謝之細(xì)胞模型，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，更換新的培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入不同濃度的FIP-gts(0、1、2、4與10μg/ml)。
在48小時(shí)后收集FIP-gts藥物處理的細(xì)胞，把舊的培養(yǎng)液移除并將細(xì)胞收集在15ml離心管中，細(xì)胞以1×PBS清洗兩次，于室溫下離心1分鐘后，將細(xì)胞再懸浮(resuspended)于0.5ml的TE緩沖溶液中，以原來(lái)之培養(yǎng)液中和此溶液，將細(xì)胞移到15ml離心管，以800rpm離心5分鐘，上清液去除并丟棄，細(xì)胞以0.5ml之1×PBS打散，取出20μl細(xì)胞，并加入5μl錐蟲(chóng)藍(lán)溶液染色，再以細(xì)胞計(jì)數(shù)器算出細(xì)胞數(shù)量。
細(xì)胞之存活率以48小時(shí)后沒(méi)有處理FIP-gts(0μg/ml FIP-gts)之細(xì)胞數(shù)為基準(zhǔn)(100％)，而48小時(shí)后，不同濃度的FIP-gts(1、2、4與10μg/ml)處理的細(xì)胞存活率分別為98.2％、94.8％、80.0％與60.3％(圖三)，此結(jié)果與下述之MTS細(xì)胞活性分析法分析結(jié)果一致，這兩個(gè)實(shí)施例證實(shí)FIP-gts對(duì)A549肺癌細(xì)胞株有毒殺作用，并且會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)與降低細(xì)胞存活率。
實(shí)施例三計(jì)算細(xì)胞數(shù)量-細(xì)胞群落形成(Colony forming)本實(shí)驗(yàn)將以細(xì)胞群落形成(Colony forming)法分析FIP-gts對(duì)癌細(xì)胞之毒殺作用，A549細(xì)胞以不同濃度的FIP-gts(0、0.4、2與10μg/ml)，F(xiàn)IP-gts藥物處理24小時(shí)后，再將處理后之細(xì)胞以每6cm培養(yǎng)皿殖入400顆細(xì)胞培養(yǎng)12天。
首先，本發(fā)明在6厘米培養(yǎng)皿中分別接種(inoculated)2×105A549細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，更換新的培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入不同濃度的FIP-gts(0、0.4、1、2與10μg/ml)(圖四)。處理24小時(shí)后細(xì)胞以1×PBS清洗兩次，藥物處理的細(xì)胞再重新置入，1ml的TE緩沖溶液加入并在37℃靜置1分鐘，以打散細(xì)胞。序列稀釋以精準(zhǔn)估算細(xì)胞數(shù)，在以每6cm培養(yǎng)皿殖入400顆細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)12天后，細(xì)胞以1×PBS清洗兩次，再以0℃，2ml 95％乙醇加入個(gè)別培養(yǎng)皿中，在室溫靜置20min，再將乙醇倒掉，個(gè)別培養(yǎng)皿中再加入2ml10％Giemsa染色，室溫靜置30min，將10％Giemsa染劑倒掉并收集，以清水沖洗染色的細(xì)胞，晾干并觀察。
A549細(xì)胞之存活率以沒(méi)有處理FIP-gts(0μg/ml FIP-gts)之細(xì)胞數(shù)為基準(zhǔn)(100％)，不同濃度的FIP-gts(0.4、1、2與10μg/ml)處理的A549細(xì)胞存活率分別為97.3％、91.5％、69.6％及39.0％(圖四A、圖四B)，除了以1μg/ml FIP-gts處理的細(xì)胞外，其它實(shí)驗(yàn)組的存活率皆顯著下降(標(biāo)準(zhǔn)T檢驗(yàn)，p＜0.05)，與本發(fā)明的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相似，因此本發(fā)明認(rèn)為，F(xiàn)IP-gts對(duì)A549癌細(xì)胞有毒殺作用，并抑制其細(xì)胞群落形成。
實(shí)施例四流式細(xì)胞儀本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以FIP-gts處理的細(xì)胞會(huì)降低存活率，而其可能機(jī)制也許是FIP-gts抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或是FIP-gts誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(apoptosis)；為了進(jìn)一步了解FIP-gts之抑癌機(jī)制，本發(fā)明以流式細(xì)胞儀分析FIP-gts對(duì)細(xì)胞之影響。
首先，本發(fā)明在6厘米培養(yǎng)皿中分別接種(inoculated)5×105細(xì)胞，加入5ml培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，以1×PBS清洗兩次，更換新的培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入不同濃度的FIP-gts(0、2、4與10μg/ml)，處理24與48小時(shí)后以下列程序收集細(xì)胞a.將舊的培養(yǎng)液移入15ml離心管。
b.以冷的1×PBS清洗兩次。
c.將細(xì)胞以1×Trypsin-EDTA處理，由培養(yǎng)皿分離下來(lái)。
d.將舊的培養(yǎng)液加入，停止1×胰蛋白酶-EDTA反應(yīng)，將細(xì)胞沖下并移入15ml離心管。
e.以800rpm離心5min，倒掉上清液，以1×PBS清洗兩次。
f.加入冷的lml 70％乙醇，一面加一面搖晃，置入4℃冰箱隔夜處理，以安定細(xì)胞。
g.以800rpm離心5min，倒掉上清液。
h.以冷的1×PBS清洗兩次，倒掉上清液，并盡可能干燥。
i.在避光狀態(tài)下在每離心管加入1ml碘化丙啶(propidium iodide)混合物1×PBS 550μl5％Triton X-100200μl250μg/ml碘化丙啶 200μl10mg/ml RNaseA 50μl最終濃度為1％Triton X-100，0.5mg/ml RNase A and 4μg/ml PIj.室溫靜置30min。
k.將過(guò)大的細(xì)胞塊以40μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，將單細(xì)胞懸浮液置入流式細(xì)胞儀分析管中。
為了分析細(xì)胞中的DNA含量，本發(fā)明以FACSCalibur(BECTONDICKINSON)細(xì)胞流速儀檢測(cè)被PI染到的DNA釋放出波長(zhǎng)617nm的紅色熒光，再將檢測(cè)之?dāng)?shù)據(jù)以CELL Quest程序收集，并以Mod Fit 3.0程序分析細(xì)胞周期。
以流式細(xì)胞儀分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以FIP-gts處理的細(xì)胞，最少有30％會(huì)停在細(xì)胞周期的G1期。停在細(xì)胞周期的G1期細(xì)胞數(shù)量增加，會(huì)讓分布于細(xì)胞周期的S期細(xì)胞數(shù)量減少，換句話(huà)說(shuō)，F(xiàn)IP-gts抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。少數(shù)細(xì)胞停在次G1期，以FIP-gts處理的細(xì)胞第二天，有最大量的細(xì)胞比例(大約1.6％)停在次G1期，此現(xiàn)象顯示，F(xiàn)IP-gts降低細(xì)胞存活率主因?yàn)槭辜?xì)胞停在細(xì)胞周期的G1期，然而同時(shí)有部分細(xì)胞會(huì)進(jìn)入細(xì)胞凋亡。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞G1期現(xiàn)象隨著FIP-gts處理濃度提高而增加，所有分布于各細(xì)胞周期之細(xì)胞數(shù)為100％，24小時(shí)后，不同濃度的FIP-gts(0、l、2、4與10μg/ml)處理的A549細(xì)胞產(chǎn)生G1期之比率分別為58.2％、59.1％、62.0％、64.0％及75.5％，停在細(xì)胞周期的G1期細(xì)胞數(shù)量增加，會(huì)讓分布于細(xì)胞周期的S期細(xì)胞數(shù)量減少，相同F(xiàn)IP-gts處理?xiàng)l件下，A549細(xì)胞分布于細(xì)胞周期的S期之比率分別為32.8％、30.9％、30.1％、27.2％及18.2％(圖五A，圖五B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，細(xì)胞G1期現(xiàn)象隨著FIP-gts處理時(shí)間增加而增加，48小時(shí)后，相同F(xiàn)IP-gts處理?xiàng)l件下的A549細(xì)胞產(chǎn)生G1中止之比率分別為60.2％、68.8％、72.6％、76.1％及82.1％，停在細(xì)胞周期的G1期細(xì)胞數(shù)量增加，會(huì)讓分布于細(xì)胞周期的S期細(xì)胞數(shù)量減少，相同F(xiàn)IP-gts處理?xiàng)l件下，A549細(xì)胞分布于細(xì)胞周期的S期之比率分別為31.8％、25.1％、23.0％、20.0％及13.8％，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，F(xiàn)IP-gts會(huì)使A549細(xì)胞停在細(xì)胞周期的G1期(圖五A，圖五B)。
我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)A549細(xì)胞以10μg/ml的FIP-gts處理后，少數(shù)細(xì)胞會(huì)停在次G1期，意指部分細(xì)胞會(huì)進(jìn)行細(xì)胞凋亡，10μg/ml的FIP-gts處理24與48小時(shí)后，分別有0.9％與1.6％A549細(xì)胞會(huì)停在次G1期(圖五B)。
實(shí)施例五Western印跡法細(xì)胞中的p53蛋白會(huì)受到胞外刺激(如UV照射，化療藥物順鉑(cisplatin)處理)活化而穩(wěn)定，p53會(huì)進(jìn)一步活化其下游基因，包括p21與Bax。p21基因主要抑制細(xì)胞周期進(jìn)入G1期(Zhong，X et.al.，2004.Int.J.Cancer)，本發(fā)明以Western印跡法發(fā)現(xiàn)，以FIP-gts處理細(xì)胞48小時(shí)后，p53基因蛋白會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)p21基因之蛋白質(zhì)。此結(jié)果顯示FIP-gts會(huì)使A549細(xì)胞中的p21活化而停在細(xì)胞周期的G1期。
目前已知有三個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的途徑，分別是經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum，ER)，死亡受體(death receptor)與線粒體(mitochodria)，這三個(gè)途徑都會(huì)造成半胱氨酸天門(mén)冬氨酸特異性蛋白酶-3(procaspase-3，32kDa)被切割，產(chǎn)生活化型caspase-3(17kDa)。Caspase-3是caspase序列反應(yīng)的最終執(zhí)行者，它會(huì)造成細(xì)胞凋亡，DNA斷裂，細(xì)胞核聚集與形成核涵體(nuclear inclusions)(Di Pietro，R.，et al.(2004)Int JImmunopathol Pharmacol 17(2)181-190)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞以高濃度FIP-gts處理時(shí)，會(huì)讓procaspase-3量減少，而產(chǎn)生活化的caspase-3。
本發(fā)明從流式細(xì)胞儀結(jié)果發(fā)現(xiàn)FIP-gts會(huì)讓培養(yǎng)的細(xì)胞停在細(xì)胞周期G1期，同時(shí)會(huì)造成一部分的細(xì)胞凋亡，因此本發(fā)明將進(jìn)一步檢驗(yàn)細(xì)胞以FIP-gts處理后相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量的改變。
a.檢體制備本發(fā)明在6厘米培養(yǎng)皿中分別以5×105細(xì)胞密度接種(inoculated)A549細(xì)胞，加入5ml培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，分別加入不同濃度的FIP-gts(0，2，4與10μg/ml)處理48小時(shí)后將細(xì)胞由培養(yǎng)皿移至離心管，以1×PBS清洗兩次，到去上清液，再加入細(xì)胞緩沖液(10mM EDTA、10mM EGTA、5mM NaF、10％甘油(glycerol)、1mM DTT、400mM KCl、0.4％ Triton X-100、20mM鈉β-甘油磷酸、0.1mM Na3VO4、1mMPMSF/DMSO、3μg/ml蛋白酶抑制劑(aprotinin)、2μg/ml胃蛋白酶抑制劑(pepstatin A)、2μg/ml亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)、1X磷酸水解酶抑制者組成物I(phosphatase inhibitor cocktail I)(Sigma，P2850)；1X磷酸水解酶抑制者組成物II(Sigma，P5726))以溶解細(xì)胞。將細(xì)胞溶解反應(yīng)混合物至于冰上，并以超音波均質(zhì)機(jī)(ultrasonic homogenizer)在4℃將細(xì)胞均質(zhì)化，重復(fù)此動(dòng)作兩次，每次間隔超過(guò)10分鐘；以12000rpm，4℃進(jìn)行20min條件離心后，將上清液移至已滅菌1.5ml離心管，并檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。將檢體加入2X SDS樣本緩沖液(200mM Tris pH6.8、8％SDS、40％甘油、2.86M 2-mercaptoethenol及適量的溴酚藍(lán)(bromophenol blue))，并以95℃加熱。上述步驟須再兩小時(shí)間完成。
b.蛋白質(zhì)定量本發(fā)明以Bio-Rad溶液定量蛋白質(zhì)，Bio-Rad試劑首先以H2O以4∶1稀釋?zhuān)藶锽io-Rad蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑，將2μl檢體加入498μl Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑，37℃反應(yīng)20min，以光度計(jì)(spectrophotometer)檢測(cè)595nm波長(zhǎng)之吸收，檢測(cè)值與以牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品繪出之曲線比較，算出蛋白質(zhì)含量(μg/μl)；BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取2、4、6、8、10μg BSA分別置入498、496、494、492與490μl之Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑，以光度計(jì)(spectrophotometer)檢測(cè)595nm波長(zhǎng)之吸收，繪制出光吸收與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)曲線。由此方法，可以計(jì)算檢體蛋白質(zhì)之含量。
c.SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)表1以下列配方制備分離膠體(Runningf/separating gel)

表2制備3％堆積膠體(Stacking gel)

將檢體以SDS-PAGE電泳分析時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)漬膜Hybond-P membrane(Pharmacia)，將膜以甲醇浸泡15秒，以ddH2O清洗10min，再將膜以轉(zhuǎn)漬溶液中浸泡(transfer buffer20％甲醇、192mM甘氨酸、25mMTris-HCl，pH 9.2)10min。SDS-PAGE電泳后將電泳膠小心移出，置于Hoefer Semiphor Transfer以標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒌鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)漬至轉(zhuǎn)漬膜上，轉(zhuǎn)漬后，將轉(zhuǎn)漬膜浸入封閉緩沖液(Blocking buffer)(5％脫脂奶粉在TTBS緩沖液中50mM Tris，0.2％ Tween 20，150mM NaCl，pH 7.5)37℃反應(yīng)一小時(shí)。抗體檢測(cè)將具專(zhuān)一性的抗體加入在上述封閉過(guò)的轉(zhuǎn)漬膜上(blocked Hybond-Pmembrane)，以含3％ BSA的1X TTBS緩沖液稀釋下列一級(jí)多株抗體(primary polyclonal antibody)anti-caspase-3(1∶500，Cayman)、anti-COX-2(1∶1000，Cayman#160106)，以含5％脫脂速溶奶粉的1X TTBS緩沖液稀釋下列一級(jí)多株抗體anti-BAX(1∶8000，R&D)、p53(1∶500，DAKO)、p21(1∶500，Zymed)，將轉(zhuǎn)漬膜置入含稀釋抗體之緩沖溶液，4℃搖晃反應(yīng)16小時(shí)，將轉(zhuǎn)漬膜以100ml含3％脫脂速溶奶粉1X TTBS緩沖液洗兩次，以含3％脫脂速溶奶粉的1X TTBS緩沖液稀釋的二級(jí)抗體(anti-rabbit IgG-HRP(1∶5000，Cell Signaling#7074)，抗-老鼠IgG-HRP(1∶10000，Chemicon AP 124P))，再將轉(zhuǎn)漬膜分別置入含稀釋二級(jí)抗體之緩沖溶液，室溫?fù)u晃反應(yīng)一小時(shí)，重復(fù)清洗步驟。準(zhǔn)備冷光呈色劑(NEN、NEL 105、1∶1與強(qiáng)化發(fā)光劑(Enhanced luminol reagent)及氧化劑(Oxidizingreagent)，混合5min)將轉(zhuǎn)漬膜呈色，并以X-ray底片顯像。
G1期中最重要的檢查者是p21蛋白，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以不同濃度的FIP-gts(0、2、4與10μg/ml)處理48小時(shí)后p21表達(dá)量顯著增加(圖六)，已知p21會(huì)被p53活化，Western印跡法結(jié)果顯示p53表達(dá)量會(huì)被FIP-gts誘導(dǎo)(圖六)，因此本發(fā)明認(rèn)為的細(xì)胞存活率分別為FIP-gts會(huì)誘導(dǎo)p53表達(dá)，進(jìn)一步增加p21的量與造成G1期。
進(jìn)一步分析FIP-gts是否會(huì)抑制細(xì)胞分化或是對(duì)細(xì)胞有毒殺作用，本發(fā)明以Western印跡法檢驗(yàn)caspase-3表達(dá)量。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以10μg/ml濃度的FIP-gts處理48小時(shí)后procaspase-3減少(圖六)，而FIP-gts處理后procaspase-3會(huì)活化成caspase-3，讓細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡，意指細(xì)胞數(shù)的降低不是因?yàn)榧?xì)胞凋亡的增加，而是細(xì)胞分化被抑制。
實(shí)施例六傷害/復(fù)原分析(Wound healing assay)利用傷害/復(fù)原分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)FIP-gts可以有效抑制肺癌細(xì)胞的移行能力。
本發(fā)明在24孔培養(yǎng)皿中分別以2×105細(xì)胞密度接種(inoculated)A549細(xì)胞，讓細(xì)胞生長(zhǎng)致幾乎完全覆蓋培養(yǎng)皿，更換含0.5％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；用移液器之藍(lán)色尖頭在長(zhǎng)滿(mǎn)的A549上刮一道傷痕，以1×PBS清洗，更換新的培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入不同濃度的FIP-gts(0、1、2、4與10μg/ml)處理，每24小時(shí)照一次相紀(jì)錄細(xì)胞生長(zhǎng)。
一般而言，癌癥細(xì)胞在其轉(zhuǎn)移之前，他會(huì)有移行能力(正常細(xì)胞不太會(huì)移動(dòng))，本發(fā)明以傷害/復(fù)原分析檢驗(yàn)細(xì)胞以不同濃度的FIP-gts(0、1、2、4與10μg/ml)處理后，其移行能力是否增加。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞以FIP-gts處理48小時(shí)后，移行能力并沒(méi)有顯著的變化；當(dāng)分別以0、1、2μg/ml的FIP-gts處理72小時(shí)后，細(xì)胞可以往被劃開(kāi)的區(qū)域生長(zhǎng)，而分別以4、10μg/ml的FIP-gts處理72小時(shí)后，細(xì)胞移行能力幾乎沒(méi)有顯著的變化；96小時(shí)后，沒(méi)有FIP-gts藥物處理的細(xì)胞可以覆蓋大約1/3的劃開(kāi)區(qū)域，以低濃度FIP-gts藥物處理的細(xì)胞有些微移行能力，然而高濃度FIP-gts藥物處理的細(xì)胞不會(huì)移行(圖七)。
利用傷害/復(fù)原分析，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)FIP-gts可以有效抑制肺癌細(xì)胞的移行能力；當(dāng)FIP-gts藥物處理濃度達(dá)4、10μg/ml時(shí)細(xì)胞不會(huì)移行。
實(shí)施例七明膠-酶譜法(Gelatin Zymography)分析當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移(metastasis)時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶(metaloproteinase，MMP)將細(xì)胞間質(zhì)(extracellular matrix)消化，將細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)分開(kāi)，并提供其移行能力，目前已知MMP-2與MMP-9大量表達(dá)于惡性癌癥(Johnsen，M.，etal.，Curr Opin Cell Biol，1998.10，pp.667-671)。MMP-2與MMP-9之表達(dá)量與癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移(metastasis)有密切之關(guān)聯(lián)(Curran，S.and Murray，G.I.(2000)Eur J Cancer，Vol.36，pp.1621-1630.，Liabakk，N.B.，et al.，Cancer Res，1996.56，pp.190-196)。
為了避免培養(yǎng)液血清(Serum)中的MMP-2與MMP-9干擾，本發(fā)明已無(wú)血清培養(yǎng)液將A549細(xì)胞饑餓處理后，再加FIP-gts藥物處理，以分析其MMP蛋白質(zhì)之活性；為了進(jìn)一步確認(rèn)明膠-酶譜法分析的細(xì)胞密度結(jié)果，本發(fā)明以Bio-Rad試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以高濃度的FIP-gts藥物處理可以抑制MMP-2表達(dá)量，而此FIP-gts藥物處理抑制效應(yīng)隨劑量增加而顯著。
本發(fā)明在24孔培養(yǎng)皿中分別以1×105細(xì)胞密度接種(inoculated)A549細(xì)胞，隔天更換無(wú)血清培養(yǎng)液，并以不同濃度的FIP-gts(0、2、4與10μg/ml)處理，培養(yǎng)24小時(shí)，移除培養(yǎng)液培養(yǎng)并以1×PBS清洗兩次。以CE緩沖溶液收集細(xì)胞并以Bio-Rad試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。在55℃下，以2g明膠溶于100m二次水中來(lái)制備2％明膠。
表3以0.1％明膠來(lái)制備8％SDS-PAGE gel。

將凝膠以Western印跡法制備，置于電泳槽中，將培養(yǎng)液與5X染劑(0.1％SDS、104mM Tris-HCl pH 6.8、50％甘油(或25g庶糖)，0.125％溴酚藍(lán))混合，加在電泳膠上并開(kāi)始進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后以清洗液(40mMTris-HCl pH 8.5、0.2M NaCl、10mM CaCl2、2.5％ Triton X-100)于室溫清洗電泳膠30分鐘兩次，再與反應(yīng)緩沖溶液(40mM Tris-HCl pH 8.5、0.2MNaCl、10mM CaCl2、0.01％ NaN3)37℃反應(yīng)12小時(shí)，以考馬斯藍(lán)(0.2％Coomassie blue R-250、50％甲醇、10％醋酸)染色30分鐘，再以10％醋酸及20％甲醇退染。退染后，以50％ ddH2O、50％甲醇及0.33％甘油干燥，并將電泳膠以年糕紙封在Plexiglas板并風(fēng)干。
細(xì)胞的移行能力與MMP蛋白質(zhì)分泌有關(guān)，在此，本發(fā)明以明膠-酶譜法分析細(xì)胞以FIP-gts藥物處理后MMP-2的活性是否被改變；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)FIP-gts濃度升高，MMP-2表達(dá)量顯著的下降(學(xué)生T檢驗(yàn)，p＜0.05)，以沒(méi)有處理FIP-gts(0μg/ml FIP-gts)之MMP表達(dá)量為基準(zhǔn)(100％)，不同濃度的FIP-gts(1、2、4與10μg/ml)處理的MMP表達(dá)量分別為95.7％、90.3％、73.6％與29.8％(圖八)，因此本發(fā)明認(rèn)為FIP-gts可以通過(guò)調(diào)控MMP-2蛋白而抑制癌細(xì)胞的移行能力。
實(shí)施例八反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)分析(Reverse Transcriptase PolymeraseChain Reactions，RT-PCR)以高濃度FIP-gts處理細(xì)胞會(huì)造成MMP蛋白表達(dá)量減少，本發(fā)明以RT-PCR以檢測(cè)金屬蛋白酵素的組織抑制因子-1(TIMP-1，Tissue Inhibitorof MetalloProteinase)與血纖維蛋白溶原活化抑制劑-1(PAI-1，PlasminogenActivator Inhibitor-1)的基因轉(zhuǎn)錄，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞以不同濃度的FIP-gts(0、2、4與10μg/ml)處理24小時(shí)后，TIMP-1(圖十)與PAI-1(圖十三)之信使核醣核酸(mRNA)下降，而TIMP-2不被影響(圖十二)，因此本發(fā)明認(rèn)為，F(xiàn)IP-gts可以通過(guò)調(diào)控MMP-2mRNA減少(圖十一)而通過(guò)增加TIMP-1抑制其它的MMP蛋白(例如MMP-9)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
以Promega RT-PCR kit進(jìn)行RT-PCR1μg全部RNA以70℃加熱10min.，再置于冰上冷卻。然后以下列配方進(jìn)行反應(yīng)25mM MgCl2 4μl、5×MMLV緩沖液4μl、10mM dNTP混合物2μl核糖核酸酶抑制劑(Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor)0.5μl、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl、寡(dT)15引物1μl及加入不含核酸酶的水，直到總量達(dá)到20μl。
表4 RT-PCR所需之核酸引物(Primer)

實(shí)施例九增加細(xì)胞激素的表達(dá)人類(lèi)周邊血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞(PBMCs)以0、1.25、2.5、5及10μg/ml FIP-gts處理。在48小時(shí)后以ELISA測(cè)量人類(lèi)PBMCs的細(xì)胞激素表達(dá)。發(fā)現(xiàn)到當(dāng)增加FIP-gts處理的濃度后，細(xì)胞激素IL-2、IFN-γ、TNF-α及IL-4的表達(dá)會(huì)跟著增加(表5)。
表5人類(lèi)PBMCs以FIP-gts處理的細(xì)胞激素表達(dá)的增加

實(shí)施例十比較在三種不同細(xì)胞株上的FIP效應(yīng)用來(lái)看FIP效應(yīng)的三種癌細(xì)胞株人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、人類(lèi)乳癌細(xì)胞株MDA231及人類(lèi)黑色素瘤癌細(xì)胞株A375(表6)。FIP-gts效應(yīng)的評(píng)估，遵循著實(shí)施例1所披露的實(shí)驗(yàn)步驟，是以觀察受FIP-gts處理后的細(xì)胞形態(tài)改變進(jìn)行；遵循著實(shí)施例3所披露的實(shí)驗(yàn)步驟，是以測(cè)量細(xì)胞增殖的抑制進(jìn)行；及遵循著實(shí)施例4所披露的實(shí)驗(yàn)步驟，是以測(cè)量菌落形成的抑制進(jìn)行。
表6在不同癌細(xì)胞株上FIP-gts的效應(yīng)

實(shí)施例十一材料與方法動(dòng)物品系由中國(guó)臺(tái)灣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(National Laboratory Animal Center inTaiwan)所購(gòu)買(mǎi)之4～5周大的BALB/c公鼠。
FIP-gts劑量低劑量200微克/公斤重/天，高劑量600微克/公斤重/天；陽(yáng)性對(duì)照組劑量(以臺(tái)灣市售之靈芝粉為對(duì)照組)300毫克/公斤重/天喂食周期，喂食途徑與喂食期間初期，以高劑量FIP-gts為喂食配方，接著以中劑量與低劑量稀釋高劑量的配方；從測(cè)試第一天起，每一試驗(yàn)組每天由口部喂食持續(xù)6星期。
分析方法1.自然殺手細(xì)胞(natural killer cells)活性分析(非專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)功能測(cè)試)小鼠喂食FIP-gts六周后，取出其胰臟，以流式細(xì)胞儀分析喂食FIP-gts不同劑量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間自然殺手細(xì)胞(natural killer cells)活性的差異。
2.巨噬細(xì)胞(Macrophages)活性分析(非專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)功能測(cè)試)小鼠喂食FIP-gts六周后，由其腹部取出巨噬細(xì)胞(Macrophages)，以巨噬細(xì)胞吞噬以熒光標(biāo)定的大腸桿菌(E.coli.)，再以流式細(xì)胞儀分析喂食FIP-gts不同劑量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間巨噬細(xì)胞(Macrophages)活性的差異。
3.血清抗體的制造(非專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)功能測(cè)試)小鼠喂食FIP-gts前與被宰殺后，采取其血液以分析血液中免疫球蛋白濃度變異，以分析喂食FIP-gts不同劑量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間的差異。
4.細(xì)胞激素之分泌量分析(專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)功能測(cè)試)
在經(jīng)過(guò)10星期之服用松杉靈芝蛋白以及兩次之注射卵蛋白素(OVA，ovalbumin)之后，宰殺該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以洋刀豆血球凝集素(Con A，Concanavalin A)、脂多醣(LPS，Lipopolysaccharide)或是卵蛋白素刺激其脾臟細(xì)胞，在經(jīng)過(guò)48～72小時(shí)培養(yǎng)后，以″酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)″測(cè)量細(xì)胞激素之含量，把每一組劑量所測(cè)得的數(shù)值與陰性對(duì)照組作比較，若p值小于0.05，即代表有顯著差異。
5.血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白分析(專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)功能測(cè)試)在研究松杉靈芝蛋白之前，先將該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫、再激活，并在宰殺該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前，自后眼窩采取血液樣本。以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)量血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白生成量。把每一組劑量所測(cè)得的數(shù)值與陰性對(duì)照組作比較，若p值小于0.05，即代表有顯著差異。
結(jié)果1.自然殺手細(xì)胞(natural killer cells)活性分析(非專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)測(cè)試)小鼠宰殺后，取出其胰臟以分析其自然殺手細(xì)胞(natural killer cells)活性；與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組在E/T比值(Effector/Target ratio)小于12.5不具有顯著性，與陰性對(duì)照組比較，喂食高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組在E/T比值小于25具有顯著性，與陰性對(duì)照組比較，喂食低、高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組在E/T比值小于50具有顯著性。實(shí)驗(yàn)顯示FIP-gts增加自然殺手細(xì)胞的活性。(表7)表7

此試驗(yàn)以流式細(xì)胞儀分析自然殺手細(xì)胞之細(xì)胞毒殺活性(cytotoxicityassay)。
(*)表示與陰性對(duì)照組之統(tǒng)計(jì)分析之顯著性E反應(yīng)者細(xì)胞，T目標(biāo)細(xì)胞A陰性對(duì)照組 B喂食低劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組C喂食高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組D陽(yáng)性對(duì)照組2.巨噬細(xì)胞(Macrophages)活性分析(非專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)測(cè)試)小鼠宰殺后，由其腹部取出巨噬細(xì)胞，以FITC綠色熒光標(biāo)定的大腸桿菌(FITC-E.coli)加在取出之巨噬細(xì)胞，讓其吞噬，再以流式細(xì)胞儀分析巨噬細(xì)胞活性；與陰性對(duì)照組比較，喂食低、高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組的感染劑量(MOI，multiplicity of infection)＝30時(shí)具有顯著性；實(shí)驗(yàn)顯示FIP-gts增加巨噬細(xì)胞的活性。(表.8)表8.

此試驗(yàn)以流式細(xì)胞儀分析巨噬細(xì)胞之吞噬活性。
(*)表示與陰性對(duì)照組比較之統(tǒng)計(jì)分析之顯著性MOImultiplicity of infection，感染劑量A陰性對(duì)照組 B喂食低劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組C喂食高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組C陽(yáng)性對(duì)照組3.血清抗體的獲得(非專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)測(cè)試)小鼠喂食FIP-gts前與被宰殺后，采取其血液以分析血液中免疫球蛋白濃度變化，以分析喂食FIP-gts不同劑量實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間的差異。血清中免疫球蛋白G(IgG)的濃度在喂食FIP-gts前顯示與陰性對(duì)照組比較，喂食高劑量FIP-gts與陽(yáng)性對(duì)照組都有統(tǒng)計(jì)顯著差異，而血清中免疫球蛋白M(IgM)的濃度在喂食不同劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)顯著差異。(表.9)
表9


此實(shí)驗(yàn)以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分析(ELISA，enzyme-link immunosorbentassay)血清中的免疫球蛋白。
(*)表示與陰性對(duì)照組比較之統(tǒng)計(jì)分析之顯著性(p＜0.05)A陰性對(duì)照組 B喂食高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組4.細(xì)胞激素之分泌量(專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié)測(cè)試)以刺激物(洋刀豆血球凝集素或脂多醣或卵蛋白素)刺激脾臟細(xì)胞，在經(jīng)過(guò)48～72小時(shí)培養(yǎng)之后，以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞激素之含量。在經(jīng)過(guò)洋刀豆血球凝集素之刺激后，介白質(zhì)素-2于低濃度的松杉靈芝蛋白組之分泌量，明顯高于陰性對(duì)照組之分泌量；在經(jīng)過(guò)卵蛋白素之刺激后，介白質(zhì)素-2于每一種濃度的松杉靈芝蛋白組與陽(yáng)性對(duì)照組之分泌量，明顯高于高于陰性對(duì)照組之分泌量。
在經(jīng)過(guò)洋刀豆血球凝集素之刺激后，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)于每一種濃度的松杉靈芝蛋白組與陽(yáng)性對(duì)照組之分泌量，明顯高于高于陰性對(duì)照組之分泌量。在經(jīng)過(guò)卵蛋白素之刺激后，干擾素-γ(IFN-γ)于高濃度的松杉靈芝蛋白組與陽(yáng)性對(duì)照組之分泌量，明顯高于高于陰性對(duì)照組之分泌量。
上述結(jié)果呈現(xiàn)于表10，松杉靈芝蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞機(jī)素之分泌表10、脾臟之細(xì)胞激素分泌量

以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)量脾臟細(xì)胞激素之含量。
*表示與陰性對(duì)照組比較之統(tǒng)計(jì)分析之顯著性A陰性對(duì)照組 B喂食低劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組C喂食高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組D陽(yáng)性對(duì)照組5.血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白生成量(專(zhuān)一性免疫調(diào)節(jié))在研究松杉靈芝蛋白之前，將該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先進(jìn)行免疫、再激活，并在宰殺該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前，自后眼窩采取血液樣本。以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)量血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白生成量。
在研究、先免疫以及再激活前，抗卵蛋白素之免疫球蛋白G(IgG)、抗卵蛋白素之免疫球蛋白M(IgM)以及抗卵蛋白素之免疫球蛋白E(IgE)于每一組的條件下，并無(wú)顯著差異。
在宰殺動(dòng)物前，抗卵蛋白素之免疫球蛋白G于每一種濃度的松杉靈芝蛋白組與陽(yáng)性對(duì)照組之生成量，明顯高于高于陰性對(duì)照組之生成量?？孤训鞍姿刂庖咔虻鞍譓于高濃度的松杉靈芝蛋白組與陽(yáng)性對(duì)照組之生成量，明顯高于高于陰性對(duì)照組之生成量。但是卵蛋白素之免疫球蛋白E于每一組之生成量，沒(méi)有明顯差異。
上述結(jié)果表示于表11中，松衫靈芝蛋白可以促進(jìn)血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白的生成量。
表11、血清中抗卵蛋白素之免疫球蛋白生成量(特異性免疫調(diào)節(jié)測(cè)試)

以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)量抗血清中卵白質(zhì)素之免疫球蛋白生成量。
*表示與陰性對(duì)照組比較之統(tǒng)計(jì)分析之顯著性EU＝(A樣本-A陰性對(duì)照組)/(A陽(yáng)性對(duì)照組-A陰性對(duì)照組)A陰性對(duì)照組 B喂食低劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組C喂食高劑量FIP-gts實(shí)驗(yàn)組D陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)施例十二FIP-gts或FIP-fve對(duì)第二型糖尿病小鼠血糖之影響每六只雄鼠一組，分別接受以下測(cè)試；分組一沒(méi)有注射Strptozotocin(100mg/kg)分組二注射Strptozotocin(100mg/kg)分組三注射Strptozotocin(100mg/kg)及FIP-gts 2μg/200μl/只分組四注射Strptozotocin(100mg/kg)及FIP-fve 50μg/200μl/只FIP-fve是由Flammulina velutipes(金針菇)中所制得。
流血試驗(yàn)測(cè)血糖。
F喂食FIP-gts(2μg/200μl/只)或FIP-fve(50μg/200μl/只)血糖測(cè)試之實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(mg/dl)；分組一分組二分組三分組三七天141.7±2 238.3±91 146.3±35 150.3±40十四天 125.3±8 270.7±80 207.7±75 176.7±59以上結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)IP-gts或FIP-fve明顯降低由化學(xué)物質(zhì)引發(fā)第二型糖尿病的小鼠的血糖值。
序列表<110>益生生技開(kāi)發(fā)股份有限公司<120>真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白之用途<130>6P04098-TW<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>111<212>PRT<213>Ganoderma specisis<400>1Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys1 5 10 15Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn20 25 30Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr35 40 45Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser50 55 60Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr65 70 75 80Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val85 90 95Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn100 105 110<210>2<211>111<212>PRT<213>Ganoderma tsugae<400>2Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys1 5 10 15Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr35 40 45Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser50 55 60Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr65 70 75 80Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val85 90 95Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn100 105 110<210>3<211>114<212>PRT<213>Flammulina velutiipes<400>3Ser Ala Thr Ser Leu Thr Phe Gln Leu Ala Tyr Leu Val Lys Lys Ile1 5 10 15Asp Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Thr Pro Ser Ser Tyr20 25 30Ile Asp Asn Leu Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Lys Tyr Ser35 40 45Tyr Arg Val Val Val Asn Gly Ser Asp Leu Gly Val Glu Ser Asn Phe50 55 60Ala Val Thr Pro Ser Gly Gly Gln Thr Ile Asn Phe Leu Gln Tyr Asn65 70 75 80Lys Gly Tyr Gly Val Ala Asp Thr Lys Thr Ile Gln Val Phe Val Val85 90 95Ile Pro Asp Thr Gly Asn Ser Glu Glu Tyr Ile Ile Ala Glu Trp Lys100 105 110Lys Thr
權(quán)利要求
1.一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白用來(lái)進(jìn)行免疫治療之用途，該蛋白質(zhì)內(nèi)含氨基酸序列SEQ ID No1MSDTALFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN或SEQ ID No3SATSLTFQLAYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFPKVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPSGGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPDTGNSEEYIIAEWKKT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之用途，其中此蛋白是自Ganoderma屬或是Flammulina velutipes(金針菇)中所獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之用途，其中此蛋白是由重組的大腸桿菌或酵母菌所提供。
4.依據(jù)專(zhuān)利申請(qǐng)范圍1之用途，其中是用來(lái)做為減輕癌癥病患疼痛或副作用的輔佐物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之用途，其中免疫治療是針對(duì)刺激或活化免疫的功能。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述之用途，其中免疫功能是由選自自然殺手細(xì)胞之活化、巨噬細(xì)胞之活化以及血清抗體之增殖之機(jī)制所組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述之用途，其中此功能是通過(guò)自然殺手細(xì)胞之活化以及端粒酶之抑制所造成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述之用途，其中此蛋白是以口服方式服用。
9.一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白用來(lái)進(jìn)行免疫治療之用途，該蛋白質(zhì)內(nèi)含氨基酸序列SEQ ID No1MSDTALFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN或SEQ ID No3SATSLTFQLAYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFPKVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPSGGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPDTGNSEEYIIAEWKKT。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述之用途，其中該病患遭受第二型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白使用于免疫治療、活化自然殺手細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或增加細(xì)胞激素及血清抗體治療及降低血糖的用途。
文檔編號(hào)A61K36/06GK1939532SQ20061012704
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者陳子智, 柯俊良 申請(qǐng)人:益生生技開(kāi)發(fā)股份有限公司