專利名稱：人心肌肌鈣蛋白Ⅰ亞基核酸適配子及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及利用分子生物學技術SELEX技術設計和制備一組與人心肌肌鈣蛋白I亞基(cTn I)高特異性和高親和力的人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子及應用。
背景技術：
心血管疾病是危害我國人民健康和生命的重大致死性疾病，根據衛(wèi)生部2000年的統(tǒng)計，在我國城市中，每十萬人中就有二百三十五人死于心腦血管疾病，占各類疾病引起的死亡的首位。且每年以2％的速度遞增。急性心肌梗死(AMI)則是造成心血管病人死亡的主要原因。WHO建議的AMI診斷標準有三條(1)缺血性胸痛的臨床病史；(2)心電圖的動態(tài)演變，出現(xiàn)Q波或QS波，持續(xù)一天以上；(3)心肌壞死的血清心肌標志物濃度的動態(tài)改變。至少符合其中兩條即可診斷為AMI。然而大量的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，約有25％的AMI病人發(fā)病早期沒有典型的臨床癥狀，約50％左右的AMI病人缺乏心電圖(ECG)的特異改變，在AMI發(fā)作的早期漏診。在這種情況下，心肌損傷生化標志物的檢測在診斷AMI時尤為重要。AMI病人在發(fā)病的最初2小時內得到溶栓治療最為有效，延遲治療會影響治療效果。因而，研制一種高度靈敏、高特異性、快速的早期心肌損傷血清標志物診斷試劑，是目前提高心肌梗死的早期診斷率與提高治療效果、降低病死率的迫切需要。
肌鈣蛋白(Tn)是心肌與骨骼肌的收縮調節(jié)蛋白，cTn是心肌肌鈣蛋白，由cTnI、cTnT和cTnC三個亞單位組成。在個體發(fā)生的全過程中，無論骨骼肌受到任何病理刺激，均不表達cTnI，所以cTnI具有高度的心肌特異性。cTn是心肌細胞的特異性蛋白，一般在血液中含量極低，幾乎測不到，心肌損傷時cTn釋放入血，所以cTnT/I檢測心肌損傷具有很高敏感性和特異性，是當前心肌損傷特異性最高的生化標志物。肌鈣蛋白升高的程度比CK-MB的參考標準還要高5-10倍。cTnI尤其對微小心肌損傷(MMD)的檢測有特殊的臨床價值。因此用cTnI以診斷心肌梗死和心肌細胞損傷，可以代替CK-MB，是目前診斷AMI新的“金標準”。cTnI的檢測除了在急性冠狀動脈綜合癥(包括隱性心絞痛和不穩(wěn)定心絞痛，急性心肌梗死等)診斷中的重要作用，而且在心肌缺血損傷的臨床診斷和預后判斷中的應用更為廣泛。如心肌炎、心肌創(chuàng)傷、手術期心臟并發(fā)癥、膿毒血癥導致的左心衰竭等等。此外還可用于溶栓治療效果觀察，心肌損傷面積的估計，心臟移植后排異反應觀察，某些藥物療效觀察等。cTnT試劑盒只有羅氏公司(Roche)一家生產。cTnI比較多，有Beckman、Access、Abbott Axym、Baxter Strautus等公司。通過對以上公司測試儀器和試劑的性能測試分析，發(fā)現(xiàn)不同廠家測定cTnI值具有很大的差異，有的相差30倍以上，而且易受不同因素的影響。許多有識之士提出應對cTnI分析法進行標準化，以使cTnI的檢測結果具有可比性。于是國際臨床醫(yī)學基金部(IFCC)最近決定建立制定心肌損傷標志物標準的委員會(C-SMCD)，致力于心肌損傷物標準的提議和建立。然而，現(xiàn)有基于抗體的檢測技術存在固有的局限性，如①不同廠家、不同抗體、不同批次生產抗體效價的不同；②抗體在保存、使用時有嚴格條件，諸如溫度、pH值、滲透壓的限制；③在進行反應時，有很多干擾因素的存在。造成cTnI的檢測的標準化很難建立?，F(xiàn)在，科學家不約而同的把注意力聚焦到分子生物學新技術在臨床檢測的應用上。
SELEX技術(系統(tǒng)進化指數富集技術)是90年代初研制的一種新的組合化學技術。其基本原理就是利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其中隨機序列一般長度在20～40bp左右，文庫容量在1014～1015之間。由于單鏈隨機寡核苷酸片段特別是RNA易形成發(fā)卡、口袋、假節(jié)、G-四聚體等二級結構，能與蛋白質、小肽，甚至金屬離子結合，形成具有很強結合力的復合物。這種方法具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的核酸適配子具有許多優(yōu)勢a.本身是寡核苷酸，分子量較小可以化學合成，節(jié)約成本；b.具有比抗體更高的親和性和特異性；c.便于標記，在不同部位有選擇性的標記；d.穩(wěn)定性好，重復性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配子在臨床檢測及診斷中具有良好的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子替代抗體在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
本發(fā)明的第三個目的是提供第二種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子。
本發(fā)明的第四個目的是提供第二種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
本發(fā)明的技術方案概述如下一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，是具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。
所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述結構
所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述結構 所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述結構 也可以是與SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子的核苷酸序列同源序列占60％以上，使其具有相同功能。
也可以是用SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子的核苷酸序列雜交的寡核苷酸序列，使其具有相同功能。
也可以是用SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子的核苷酸序列轉錄的RNA序列。
所述核苷酸序列的任何位置的A或G或C或T或U被稀有堿基甲基化嘌呤或二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后，使其具有相同功能。
所述核苷酸序列的任何位置進行磷酸化或甲基化或氨基化或巰基化或同位素化或結合生物素或結合地高辛或結合熒光物質或結合納米發(fā)光材料或酶標記修飾，使其具有相同功能。
一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列。它們在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
本發(fā)明的優(yōu)點是具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢1)本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學合成，節(jié)約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特異性；3)便于標記且可以在不同部位有選擇性的標記；4)重復性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感。因此，SELEX技術具有良好的應用前景，特別是在抗體工程領域。


圖1為檢測一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子與cTn I的特異性結合的凝膠阻滯試驗圖。
圖2為一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子檢測cTn I狹縫法結果。
圖3為一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子檢測cTn I印跡法結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。
SEQ ID No.1所述的核苷酸序列cccctgcagg tgattttgct caagtcgaga gcggtgcatc tagggtctct agctcgggaaagtatcgcta atcaggcgga t 81SEQ ID No.2所述的核苷酸序列cccctgcagg tgattttgct caagtgctta atcgagggta tcgtggggca gttgggaggg 60agtatcgcta atcaggcgga t 81
SEQ ID No.3所述的核苷酸序列cccctgcagg tgattttgct caagtgccgt caacatgtcc tagtaggggt ctcaggggtg 60agtatcgcta atcaggcgga t 81本發(fā)明中用于SELEX的單鏈DNA隨機庫及引物由invitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為35個堿基的隨機序列5’CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’，庫容量為1014以上，引物15’CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCAAGT3’，引物25’-biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT3’，引物35’biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT3’，引物45’-ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3’。cTn I為實驗室原核表達純化，硝酸纖維素濾膜購于密理博(MilliPore)公司，寡核苷酸的純化試劑購天為時代公司，PCR試劑盒和T載體購于普洛麥格(Promega)公司。
實施例2一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子的篩選制備用PCR制備ssDNA文庫PCR反應體系為10×擴增緩沖液 10ul4種dNTP混合物 各200umol/L引物1 100pmol (5’CCCCT GCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’)引物2 100pmol (5’-biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGAT ACT3’)模板DNA 1ug (5’CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’)Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至 100ulPCR反應條件為94℃預變性3min，然后94℃變性40s，65℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃延伸7min.
將PCR擴增得到3’端帶有生物素的dsDNA文庫，dsDNA產物經分離純化，與鏈親和素磁珠結合；然后用0.15mol/L的NaOH使dsDNA變性解鏈，磁分離；液體經乙醇沉淀，溶于TE緩沖液中。98℃加熱2min，冰上1min，室溫5min，測定吸光度(A)值，作為篩選的ssDNA文庫。
100pmol隨機ssDNA文庫和5nmol(tRNA+鮭魚精DNA)加入20ul對照His-磁珠(0.1mg)反篩去除與背景結合的ssDNA。在100ul結合buffer 25℃結合40min，磁分離；然后轉移液體與His-cTnI磁珠(0.1mg)37℃結合40min，用沖洗緩沖液洗6次，洗去未結合的ssDNA，再加洗脫緩沖液于80℃作用10min，洗脫下與cTnI蛋白結合的ssDNA，經酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。將ssDNA溶解于20ul TE緩沖液中，將ssDNA用經PCR擴增成dsDNA。經生物素-鏈親和素磁珠分離ssDNA，用作下一輪篩選的ssDNA文庫，重復篩選20輪。
實施例3凝膠阻滯試驗檢測一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子與cTn I的結合將獲得的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子(序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列)95℃變性5min，迅速冰水浴5min，加入結合緩沖液10μl，加入不同量cTnI(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7μg)，37℃30min(水浴)。上樣到5％聚丙烯酰胺凝膠，電泳，銀染觀察結果。如圖1一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子與cTnI結合后發(fā)生凝膠滯后現(xiàn)象。無蛋白的無凝膠滯后現(xiàn)象。
不同量0μg，0.1μg，0.2μg，0.3μg，0.4μg，0.5μg，0.6μg，0.7μg的cTn I與篩選的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子100pmol孵育后進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染結果顯示0μg蛋白處，一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子沒有與蛋白作用，泳動較快，無凝膠滯后現(xiàn)象。而有蛋白的泳道，一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子與cTn I結合后發(fā)生凝膠滯后現(xiàn)象，表明篩選得到的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子與cTn I有特異性結合。(圖1中，1為復合物，2為自由適配子)(也可以用上述方法檢測序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述的核苷酸序列與cTn I的結合。)實施例4狹縫硝酸纖維素膜過濾法測定cTn I將不同量(0，0.01，0.04，0.06μg)的cTn I與5’標記生物素的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子(序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列)混合，37℃水浴1h。將cTn I和標記核酸適配子的混合物加到孔徑0.45μm硝酸纖維素膜膜上。洗去未結合的核酸適配子，加辣根過氧化酶標記的鏈親和素于膜上，37℃溫育30min。洗滌后，用發(fā)光顯跡液發(fā)光，暗室內用X光片曝光，X光片顯影定影。結果如圖2沒有蛋白的沒有顯跡，有cTn I的顯示明顯的條帶。
如圖所示從左到右的cTn I量為0μg，0.02μg，0.04μg，0.06μg，在0μg狹縫處沒有顯示條帶，在0.012μg，0.04μg，0.06μg處有cTn I的狹縫處顯示明顯的條帶，表明篩選到的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子與cTn I特異結合，可用于cTn I的檢測。(也可以用上述方法檢測序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述的核苷酸序列與cTn I的結合。)實施例5印跡法檢測cTn I將cTn I樣品(0.01，0.02，0.03，0.04μg)與加樣緩沖液混合，采用Bio-rad的mini-YE電泳系統(tǒng)分析，分離膠濃度12％，濃縮膠5％的SDS-PAGE上電泳，將膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上。用5’標記生物素的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子(序列表中SEQID No.1所述的核苷酸序列)與膜孵育，洗滌后用辣根過氧化酶標記的鏈親和素孵育，洗滌后用發(fā)光顯跡液發(fā)光，暗室內用X光片曝光，X光片顯影定影。結果如圖3顯示明顯的條帶，表明一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子可替代抗體用于cTn I的檢測。(也可以用上述方法檢測序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所述的核苷酸序列與cTn I的結合。)
實施例6一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列或序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列。
SEQ ID No.4所述的核苷酸序列cgagagcggt gcatctaggg tctctagctc gggaa 35SEQ ID No.5所述的核苷酸序列gcttaatcga gggtatcgtg gggcagttgg gaggg 35SEQ ID No.6所述的核苷酸序列gccgtcaaca tgtcctagta ggggtctcag gggtg 35SEQ ID No.4所述的核苷酸序列與SEQ ID No.1所述的核苷酸序列第36至60的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子具有相同的功能。
SEQ ID No.5所述的核苷酸序列與SEQ ID No.2所述的核苷酸序列第36至60的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子具有相同的功能。
SEQ ID No.6所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3所述的核苷酸序列第36至60的堿基順序一致，這兩個序列所示的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子具有相同的功能。
權利要求
1.一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ IDNo.3所述的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是所述SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列具有下述結構 所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述結構 所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述結構
3.根據權利要求1所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是與所述核苷酸序列同源序列占60％以上，使其具有相同功能。
4.根據權利要求1所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是與所述核苷酸序列雜交的寡核苷酸序列。
5.根據權利要求1所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是所述核苷酸序列轉錄的RNA序列。
6.根據權利要求1或5所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是在所述核苷酸序列的任何位置的A或G或C或T或U被稀有堿基甲基化嘌呤或二氫尿嘧啶或次黃嘌呤置換后，使其具有相同功能。
7.權利要求1至5之一所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
8.權利要求6所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
9.一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列。
10.權利要求9所述的一種人心肌肌鈣蛋白I亞基核酸適配子，其特征是在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上的應用或用于cTnI的分離純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人心肌肌鈣蛋白Ⅰ亞基核酸適配子及應用，一種人心肌肌鈣蛋白Ⅰ亞基核酸適配子具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列，一種人心肌肌鈣蛋白Ⅰ亞基核酸適配子可以在cTnI早期檢測和臨床心肌損傷的診斷上應用或用于cTnI的分離純化，本發(fā)明人心肌肌鈣蛋白Ⅰ亞基核酸適配子是寡核苷酸，分子量較小，可以化學合成，成本低；具有比抗體更高的親和性和特異性；便于標記且可以在不同部位有選擇性的標記；重復性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即對高溫和劇烈條件不敏感，因此，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K31/7088GK1974594SQ20061012944
公開日2007年6月6日 申請日期2006年11月16日 優(yōu)先權日2006年11月16日
發(fā)明者弓景波, 吳淑慶, 錢令嘉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所