專利名稱：三價鐵卟啉短肽化合物在抗冠心病藥物制備中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種三價鐵卟啉及衍生物新的醫(yī)藥用途，進一步講是在抗冠心病藥物制備中的應用，屬于生物制藥技術領域。
背景技術：
本發(fā)明所涉及的三價鐵卟啉及衍生物包括血紅素—短肽、亞血紅素—短肽，是以鐵卟啉為輔基的微過氧化物酶，包括由細胞色素C(Cyt C)水解而來的八肽(簡稱MP-8)、九肽(簡稱MP-9)、十一肽(簡稱MP-11)。它們均含有共價結合的血紅素，并在肽段中含有一個組氨酸殘基，人們發(fā)現(xiàn)它們是一類很好的過氧化物酶模擬物。它們具有較好的抗氧化活性，而且已經(jīng)在體外白內(nèi)障誘導模型中得到了驗證，但在抗冠心病藥物制備中的應用經(jīng)檢索未見文獻公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了三價鐵卟啉及衍生物在抗冠心病藥物制備中的應用。
本發(fā)明所說的三價鐵卟啉—短肽化合物包括亞血紅素(Deuterohemin，用Dh表示)、短肽(用X表示)；亞血紅素與短肽間的連接方式是亞血紅素上的羧基與肽鏈上的氨基以酰胺鍵相連。
上述結構可以是單體，即亞血紅素上的兩個羧基之一與肽鏈連接，兩種單體形式為同分異構體，結構如A.、B所示；也可以是雙體，雙體形式為亞血紅素上的兩個羧基均與肽鏈連接，結構如C所示。
三價鐵卟啉—短肽化合物的結構式如下D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-ArgD3.Dh-β-Ala-His-Ala-LysD4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-LysD5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-AlaD6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-AlaD7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-AlaD8.Dh-β-Ala-Arg-Ala-Arg-AlaD9.Dh-β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-ArgD10.Dh-β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala本發(fā)明的化合物具有強心，抗心衰升高血壓活性，按照常規(guī)的制藥技術，可以將其制備成任何一種常規(guī)藥劑，例如片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、噴霧劑、口服液、混懸液、透皮吸收劑、注射劑等。
做為含有本發(fā)明化合物組合藥，其組成為含有治療有效量的本發(fā)明化合物，所說的化合物在藥物組合物當中可以是單獨使用，也可以與其他藥物配合使用。
本發(fā)明的藥物組合物除了含有上述化合物之外，還含有常規(guī)的藥物賦形劑，例如粘合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、調(diào)味劑、增溶劑、溶劑、防腐劑等。
以下藥理實驗證明本發(fā)明具有治療冠心病的藥理活性和醫(yī)療效果實驗例1、三價鐵卟啉—短肽化合物對心肌細胞過氧化損傷的保護作用1.三價鐵卟啉—短肽化合物D1～D10保護作用的研究利用體外培養(yǎng)的心肌細胞觀察不同濃度的D1～D10的保護作用，采用的濃度為15μmol·L-1。
表1DhHP-6濃度對抗心肌細胞損傷的作用

表2LDH漏出量的測定

結論三價鐵卟啉—短肽化合物D1～D10與空白對照組相比，對心肌細胞的氧化損傷均具有較好的保護作用。
2.三價鐵卟啉—短肽化合物D1～D10對Ca2+-ATP酶的影響利用體外培養(yǎng)的心肌細胞H2O2損傷模型，觀察D1～D10對心肌細胞Ca2+-ATP酶變化的影響。

ATP酶是存在于組織及細胞器膜上的一種蛋白酶，在物質(zhì)運輸、能量轉換以及信息傳遞方面具有重要作用，其活力的大小是細胞能量代謝及功能有無損傷的重要標志。測定體外培養(yǎng)心肌細胞Ca2+-ATP酶發(fā)現(xiàn)，損傷組心肌細胞膜Ca2+-ATP酶活性降低，由于細胞膜鈣泵和肌漿網(wǎng)泵功能障礙，使胞外Ca2+內(nèi)流失控，而胞內(nèi)Ca2+的排出、貯存障礙，最終造成細胞內(nèi)鈣超載，細胞內(nèi)游離鈣是細胞信號傳遞途徑的成員之一，與細胞凋亡的早期信號有關，研究表明，多種刺激因子作用細胞后，在細胞發(fā)生凋亡前都有細胞內(nèi)游離鈣的持續(xù)升高，但心肌收縮蛋白對鈣有其特有的反應性，有能耐受長時間的鈣超載，而此時如果細胞處于低鈣環(huán)境，則可抑制或延遲細胞凋亡的發(fā)生，說明Ca2+在細胞凋亡和氧化損傷中具有重要作用。
模型組心肌細胞Ca2+-ATP酶的活性明顯低于正常對照組，表明損傷引起心肌細胞鈉泵和鈣泵功能受損，影響心肌細胞離子跨膜轉運和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。三價鐵卟啉—短肽化合物D1～D10給藥組可提高Ca2+-ATP酶的活性，提示三價鐵卟啉—短肽化合物D1～D10可保護心肌細胞鈣泵功能，減輕損傷程度。
實驗例2、本實驗通過大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討亞血紅素短肽化合物D1～D10抗心肌缺血再灌注損傷的作用，為其開發(fā)利用提供科學依據(jù)。
1.材料與方法1.1動物Wistar大鼠，雄性，體重250～280g，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK-2002-0001。
1.2藥物、試劑亞血紅素短肽化合物D1～D10，吉林大學生命科學學院研制提供，以生理鹽水配制所需濃度使用；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)(雙縮脲法)測定試劑盒，為南京建成生物工程所產(chǎn)品，批號分別為20060618、20060622、20060624。
1.3實驗方法1.3.1實驗分組 將雄性Wistar大鼠隨機分為組，每組10只。分別為空白組、模型組(心肌缺血再灌注損傷組)、給藥組(亞血紅素短肽化合物D1～D10)。其中空白對照組、模型組腹腔注射生理鹽水20ml/kg，給藥組腹腔注射DhHP-601～61020mg/20ml/kg。
1.3.2觀察指標及方法 將麻醉好的大鼠固定在大鼠板上，插上電極，自左側4～5肋間開胸，暴露心臟，剪開心包膜，使心臟跳出，在心臟左心房和肺動脈圓錐間(冠狀動脈左前降支處)穿線，立即將心臟放回到胸腔，待心電圖穩(wěn)定點后再用膠管結扎管脈，除空白組僅穿線不結扎外，其余各組均以0號線立即結扎冠脈，開胸時間不超過30s。各組動物結扎30min，然后松解結扎線進行再灌注。再灌注120min后，結扎后心電圖會出現(xiàn)心肌缺血圖形，表現(xiàn)為S-T段抬高，J點上移，以此圖形作為心肌缺血標準。結扎30min后剪去膠管使缺血再通，再通成功后心電圖形應表現(xiàn)為缺血圖形減輕或恢復正常。再通時間為2h。再灌2h后立即腹主動脈采血(2-3ml)，測血清CPK、LDH、GOT活性。同時取血后剖取大鼠心臟，用生理鹽水洗凈心腔內(nèi)積血，去掉心房組織及脂肪，稱重，制備心肌勻漿，嚴格按試劑盒方法操作測SOD活性及MDA含量。實驗過程觀察心電圖S-T段(J點)變化情況。
1.4統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，用組間t檢驗法進行統(tǒng)計分析。
2實驗結果
2.1亞血紅素短肽化合物D1～D10對心肌缺血-再灌注模型大鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及谷草轉氨酶(GOT)活性的影響。
結果見表1。模型組與空白對照組相比，血清CK、LDH及GOT活性均明顯增加(P＜0.001)，表明大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建成。亞血紅素短肽化合物D1～D10 20mg·kg-1組均能明顯降低血清CK、LDH及GOT活性，與模型組比較差異顯著(P＜0.001)。
表1亞血紅素短肽化合物D1～D10對心肌缺血-再灌注模型大鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及谷草轉氨酶(GOT)活性的影響

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012.2亞血紅素短肽化合物D1～D10對心肌缺血-再灌注模型大鼠心肌SOD活性及MDA含量的影響結果見表2。模型組與空白對照組相比，心肌SOD活性明顯下降，MDA含量明顯增加(P＜0.001)，表明大鼠心肌缺血再灌注損傷時伴有體內(nèi)自由基的堆積和抗氧化酶活性的降低。亞血紅素短肽化合物D1～D10均能明顯降低心肌MDA含量，增加心肌SOD活性(P＜0.01或P＜0.001)。
表2亞血紅素短肽化合物D1～D10對心肌缺血-再灌注模型大鼠心肌SOD活性及MDA含量的影響

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012.3亞血紅素短肽化合物D1～D10對心肌缺血-再灌注模型大鼠心電圖S-T段(J點)變化情況的影響結果見表3。模型組與空白對照組相比，大鼠心電圖S-T段明顯抬高，J點上移(P＜0.001)，此圖形為心肌缺血圖形。表明大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建成。D1～D10 20mg·kg-1組均能使大鼠心電圖S-T段抬高，J點上移明顯降低(P＜0.001)。表明D1～D10可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷。
表3亞血紅素短肽化合物D1～D10對缺血-再灌注模型大鼠心電圖S-T段(J點)變化情況的影響

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0013討論實驗表明，亞血紅素短肽化合物D1～D10能明顯降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CK，LDH、GOT活性，對缺血再灌注心肌具有明顯保護作用。心肌缺血再灌注損傷時，不僅氧自由基生成增多，而且對自由基的清除能力減低，從而造成心肌組織中產(chǎn)生的自由基大量蓄積，引起心肌組織的嚴重損傷。亞血紅素短肽化合物D1～D10能明顯降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清心肌MDA含量，提高心肌SOD活性，提示其可能通過抑制脂質(zhì)過氧化過程，并同時提高內(nèi)源性抗氧化酶活性而減輕自由基對心肌的損傷。此外，亞血紅素短肽化合物D1～D10能使心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖抬高的S-T段(J點上移)明顯降低，心電圖形表現(xiàn)為缺血圖形減輕或恢復正常，表明亞血紅素短肽化合物D1～D10可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷。以上結果對于開發(fā)亞血紅素短肽化合物D1～D10治療冠心病(急性心肌梗塞)具有重要意義。
體外測活實驗表明，三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物可以在抗壞血酸存在下清除體系中的過氧化氫，具有過氧化物酶的活性；同時三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物在保護心肌線粒體抵抗氧化損傷作用的研究中，進一步在亞細胞水平上驗證三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物的抗氧化功能。在更進一步的實驗中，利用體外培養(yǎng)的心肌細胞，建立H2O2氧化損傷模型，通過臺盼藍染色和MTT比色法評價細胞活力、培養(yǎng)液中LDH含量反應細胞膜的完整性、測定的心肌細胞才Ca2+-ATP酶反應細胞鈣泵功能、丫啶橙染色判斷細胞凋亡的發(fā)生、基因表達判斷凋亡及衰老的發(fā)生。從細胞生理功能、生化代謝以及形態(tài)結構改變水平觀察三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物抗心肌細胞氧化損傷的作用。
實驗結果證明，在大量氧化性物質(zhì)存在的體系中(H2O2100μmol·L-1)，三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物(15μmol·L-1)可起到保護心肌細胞的作用。測量的各項宏觀指標中，APX模擬酶保護組要明顯好于H2O2損傷組?；虮磉_水平的結果表明，三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物起到了抑制細胞凋亡的功效，并且在信號轉導方面也起到了一定的積極作用。證明了三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物對心肌細胞抗H2O2損傷起到了明顯的保護。
綜合以上實驗結果，三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物在體外測活體系、亞細胞水平、及組織器官水平均具有較好的抗氧化活性，同時又是一類具有過氧化物酶活性的新化合物。并且，產(chǎn)品的純度較高，毒性??；對過氧化氫的穩(wěn)定性好；更容易被機體吸收，通過各種膜組織進入機體細胞中，具有很高的生物利用度。因此三價鐵卟啉及衍生物—短肽化合物將會成為有效的治療冠心病的新的具有酶學活性的化合物。
具體實施例方式
實施例1稱取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala- Arg -Ala -Arg -Ala ； D9. Dh- β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg ； D10. Dh- β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一種100mg，溶于1000ml 0.9％氯化鈉溶液，混合均勻后，分裝成0.1mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中密封，滅菌制成產(chǎn)品。
實施例2稱取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala- Arg -Ala -Arg -Ala； D9.Dh-β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg ； D10.Dh-β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一種100mg，溶于1000ml水中制成水溶液，混合均勻后，分裝成0.1mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中密封，滅菌，凍干制成成品。
實施例3稱取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala- Arg -Ala-Arg -Ala ； D9.Dh-β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg ； D10.Dh-β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一種100mg，藥用淀粉0.5kg，按公知的膠囊制備技術和裝備制成膠囊，每粒10mg。其它項目應符合中華人民共和國藥典2000年版膠囊項下要求。
實施例4稱取D1.Dh-β-Ala-His；D2.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg；D3.Dh-β-Ala-His-Ala-Lys；D4.Dh-β-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys；D5.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Ala-Ala；D6.Dh-β-Ala-His-Ala-Arg-Arg-Ala；D7.Dh-β-Ala-His-Ala-Thr-Ile-Arg-Ala；D8.Dh-β-Ala- Arg -Ala -Arg -Ala ； D9.Dh-β-Phe-His-Gly-Met-Trp-Pro-Thr-Ala-Ala-Thr-Leu-Arg ； D10.Dh-β-Lys-Trp-Pro-Glu-Gln-Lys-Gly-Lys-Arp-Pro-Arg-Ala的其中一種100mg，微晶纖維素560g，無水乳糖380g，硬脂酸鎂200g，氧化硅30g，按公知的制片技術和裝備制成片劑，每片10mg。其它項目應符合中華人民共和國藥典2000年版片劑項下要求。
權利要求
1.三價鐵卟啉及衍生物在抗冠心病藥物制備中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開三價鐵卟啉及衍生物在抗冠心病藥物制備中的新用途。本發(fā)明所說的三價鐵卟啉－短肽化合物包括亞血紅素(Deuterohemin，用Dh表示)、短肽(用X表示)；亞血紅素與短肽間的連接方式是亞血紅素上的羧基與肽鏈上的氨基以酰胺鍵相連。上述結構可以是單體，即亞血紅素上的兩個羧基之一與肽鏈連接，兩種單體形式為同分異構體；也可以是雙體，雙體形式為亞血紅素上的兩個羧基均與肽鏈連接。
文檔編號A61K31/409GK1961883SQ20061013168
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權日2006年11月30日
發(fā)明者李惟, 王麗萍, 陳曉光 申請人:王麗萍