專利名稱：碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用的制作方法
碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用技賴域本發(fā)明涉及碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用，特別是在新 型抗癌藥物研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。背*駄碳納米管是圓柱狀大分子，半徑甚至小至幾個(gè)納米，它們包括單層或者 多層的曲面。碳納米管的顯著特點(diǎn)是具有高比表面，這使其具備了作為分子轉(zhuǎn)運(yùn)載體的條件(文獻(xiàn)l. Bianco A, Prato M. (2003) Adv. Mater. 15: 1765-1768.)碳納米管自身的轉(zhuǎn)運(yùn)能力再加上適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾和其固有的 光學(xué)特性極有可能衍生出一系列在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和癌癥治療方面的新材料(文 獻(xiàn)2. KamN， 0'ConnellM， Wisdom JA， Dai HJ. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 11600-11605.文獻(xiàn)3. Wu W， Wieckowski S, Pastorin G， Benincasa M， Klumpp C， Briand JP, Gennaro R, Prato M， Bianco A. (2005) Angew. Chem.-Int. Edit. 44: 6358—6362.)?；熓悄壳白钣行У闹委煇盒阅[瘤的方法。然而，癌細(xì)胞能同時(shí)對各 種藥物產(chǎn)生抵抗性的能力(稱為多藥耐藥性)已經(jīng)成為化療成功的一個(gè)重要 障礙。30多年的多藥耐藥研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些癌細(xì)胞逃脫化療的途徑和機(jī) 理(文獻(xiàn)4. Gottesman MM, Fojo T， Bates SE. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:48-58.)。 一些能量依賴的多藥耐藥究基因已經(jīng)在癌組織得到確認(rèn)，在 人體中，三種主要的多藥耐藥泵分別是滲透性糖蛋白(Pgp)，多藥耐藥相 關(guān)蛋白質(zhì)和在囊泡中的肺癌耐藥相關(guān)蛋白。Pgp是一個(gè)眾所周知的藥物外 排泵，表達(dá)并分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞膜中。它也是被研究得最清楚的多藥耐藥 泵，是一個(gè)170kDa的蛋白質(zhì)，包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域包含六 個(gè)疏水的跨膜區(qū)域和--'個(gè)高度保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)。這兩個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn) 決定了 Pgp是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC (ATP-binding cassette)家族成員。Pgp與ATP 結(jié)合后，利用ATP水解產(chǎn)生的能量進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對疏水性抗腫瘤藥有較 強(qiáng)的外排作用。實(shí)驗(yàn)表明它能將大量的結(jié)構(gòu)不相似的化合物泵出細(xì)胞膜。 諸如蒽環(huán)類化合物，蒽醌類化合物，紫杉醇，長春堿以及熒光試劑 Rhodaminel23(Rhol23)等都是Pgp的底物。^ Pgp與抗腫瘤藥物結(jié)合后， 通過ATP提供的能量，將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度 不斷下降，其細(xì)胞毒作用因而減弱甚至喪失，最終出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象(文獻(xiàn)5. Hamilton K0， Backstrom G， Yazdanian MA， Audus Kl" (2001)丄Pharm. Sci. 90: 647-658.文獻(xiàn)6. Swerts K， De Moerloose .B， Dhooge C， Laureys G, Benoit. Y, Philippe J. (2006) Eur.丄Cancer 42: 295-309)。
納米新材料對于導(dǎo)入和轉(zhuǎn)運(yùn)生物藥物分子是極為有效的，它是指在三維結(jié)構(gòu)中有 一維的長度在1-100納米之間或者具有納米結(jié)構(gòu)的材料。由于具有小尺寸效應(yīng)，它們可以有效地克服細(xì)胞膜的屏障，特別是在多藥耐藥研究方面(文獻(xiàn)7. KamN， LiuZA, Dai HJ. (2006) Angew. Chem.-Int. Edit. 45: 577-581.)。-些藥物運(yùn)載系統(tǒng)已經(jīng)對醫(yī)療技術(shù)產(chǎn)生了巨大的影響， 大大提高了現(xiàn)有藥物的性能，并催生了許多全新的治療方法(文獻(xiàn)8. LaVan DA， McGuire T， Langer R. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 1184-1191)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于將Pgp的底物分子Rho123等抗癌藥物鍵合到碳納米 管上，鍵合后的碳納米管可以均勻地、穩(wěn)定地分布于溶液中并以內(nèi)吞的模 式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并分布于細(xì)胞中，抑制Pgp對Rho123的外排。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明，鍵合在碳納米管上之前的藥物分子在白血病多藥耐藥細(xì)胞系(K562A) 和其母細(xì)胞系(K562S)中的分布差異很大，而鍵合之后其分布差異顯著減 小，這說明K562A上高表達(dá)的Pgp會(huì)將大量的底物分子排出細(xì)胞，而并沒 有將鍵合在碳納米管上的底物分子大量泵出細(xì)胞，從而證明碳納米管可以 作為載體并應(yīng)用于抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中，并可用于體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。這為研制 新型的抗癌藥物提供了新的思路，同是將促進(jìn)納米材料在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和多藥 耐藥機(jī)理方面的研究。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用，所述碳納米管制備過程 為，于120'C下將10-20 mg碳納米管與20-30 mL體積比1/3的強(qiáng)酸(質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為69%濃冊03和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98. 3%濃貼0》在攪拌回流的條件下反應(yīng)30 min-4 h;氧化后的碳納米管和強(qiáng)酸的混合溶液用水按照1: 20稀釋，在 8000轉(zhuǎn)下離心以去除未被氧化的碳納米管，仍溶解在溶液中的即是所需的 碳納米管。所述碳納米管作為載體擔(dān)載抗癌藥物過程為，室溫下1-2mg碳納米管與 l-5mg EDC在攪拌的條件下與1. 5-4. 5 mg藥物分子反應(yīng)12-24 h鍵合。所述碳納米管直徑約為10-30納米，長度約為20-500納米，所鍵合的藥物須是Pgp的底物，同時(shí)分子上有氨基且氨基不是活性位點(diǎn)，如羅丹 明123(Rhodamine123)、阿霉素(Doxorubicin)或鹽酸尼莫司汀(Nimustine hydrochloride)，每克碳納米管可鍵合0. 45-1. 6克藥物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1. 將碳納米管充分氧化，使其具有優(yōu)良的水溶性。未經(jīng)氧化的碳納米 管由于沒有親水基團(tuán)而水溶性很差。通過強(qiáng)酸氧化的方法可以在碳納米管 端口引入羧基，從而極大提高了碳納米管的水溶性，使其可以均勻地、穩(wěn) 定地分布于溶液中。2. 碳納米管作為載體鍵合Pgp的底物分子(特別是抗癌藥物)后作用于
多藥耐藥細(xì)胞系時(shí)可以有效抑制PgP的外排作用。作用過程中，碳納米管作為抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體時(shí)仍可d遍勻ii、穩(wěn)定地分布于溶液中，并可以通 過內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而不會(huì)被排出。3. 釆用共價(jià)鍵合的方式將藥物分子固載于碳納米管上，可以有效避免 脫落。由于游離的抗癌藥物分子在細(xì)胞中會(huì)被Pgp大量排出，而當(dāng)將其以 共價(jià)鍵合的方式固載于碳納米管上后即可有效避免外排。4. 本發(fā)明證明碳納米管可以作為載體并應(yīng)用于抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)屮，這為 研制新型的抗癌藥物提供了新的思路，同是將促進(jìn)納米^"料在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和 多藥耐藥機(jī)理方面的研究。附圉說明

圖1碳納米管的TEM圖(A和B放大50， 000倍，C放大25， 000倍)； 圖2藥物分子鍵合到碳納米管上的示意圖；圖3藥物分子鍵合到碳納米管上前(A)后(B)在K562A和K562S中的分布。實(shí)施例1通過催化化學(xué)氣相沉積法制得的碳納米管為多壁碳納米米管，未氧化 前是很長很粗的線狀結(jié)構(gòu)，見附圖1A。于120'C下將10-20邁g拔納米管與 20-30 mL體積比1/3的強(qiáng)酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69%濃剛03和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98. 3%濃 H2S0》在攪拌回流的條件反應(yīng)30邁in-4 h。碳納米管變短變細(xì)，其長度從 幾微米縮短到幾百納米，直徑降到20納米左右，見附圖1B。氧化后的碳 納米管和強(qiáng)酸的混合溶液用水按照l: 20稀釋，在8000轉(zhuǎn)下離心以去除未 被氧化的碳納米管，仍溶解在溶液中的即是所需的碳納米管，直徑在10-30 納米，長度在20-500納米范圍內(nèi)。見附圖1C。藥物分子鍵合過程簡單，先經(jīng)上述強(qiáng)酸氧化在碳納米管末端引入羧基， 室溫下lmg碳納米管與lmg EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride]在攪拌的條件下與1.5 mg藥物分子反應(yīng)24 h鍵合。詳細(xì)示意圖見附圖2。所鍵合的藥物須是Pgp的底物，同時(shí)分子上 有氨基且氨基不是活性位點(diǎn)，例如羅丹明123 (Rhod咖ine123)、阿霉素 (Doxorubicin)和鹽酸尼莫司汀(Nimustine hydrochloride)。每克碳納米 管可鍵合1.1克羅丹明123。溫育吋間和溫度的選擇。碳納米管可以在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞，所以 溫育時(shí)間以l h為宜。同時(shí)由于是以內(nèi)吞的模式進(jìn)入細(xì)胞，因而溫度影響 較大，考慮到細(xì)胞的耐受能力，選擇37'C為宜。在K562細(xì)胞孵育溶液中加入鍵合在碳納米管上的Rho123濃度為25 "g/mL,在37'C下溫育1 h，然后洗凈細(xì)胞外面的殘余，測定細(xì)胞中的藥 物分子。其在K562A和K562S中的分布如圖3所示，圖3A是;藥物分子本身
和K562A和K562S孵育后的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，分布在K562S中的Rho123 的量是在K562A中的22. 69倍。閣犯為翁物分子鍵合到碳納米管上之后和 K562A和K562S孵育時(shí)的結(jié)果，分布在K562S中的鍵合到碳納米管上的 Rho123僅是在K562A中的2. 97倍。通過比較可以看出碳納米管有效地抑 制了Pgp外排底物的作用。由于碳納米管作為抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體時(shí)仍可以均勻地、穩(wěn)定地分布于 溶液中，鍵合藥物分子后作用于K562A和K562S時(shí)可以起到抑制Pgp外排 的作用，這為研制新型的抗癌藥物提供了新的思路，同是將促進(jìn)納米材料 在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和多藥耐藥機(jī)理方面的研究。實(shí)施例2按照實(shí)施例1，氧化后的碳納米管可以按照同樣步驟鍵合阿霉素，每 克碳納米管可鍵合0. 76-1. 60克阿霉素。 實(shí)施例3按照實(shí)施例1，氧化后的碳納米管可以按照同樣步驟鍵合鹽酸尼莫司 汀，每克碳納米管可鍵合0.45-0.90克鹽酸尼莫司汀。
權(quán)利要求
1. 碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
2. 按照權(quán)利要求1所述碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用， 其特征在于所述碳納米管制備過程為，于120'C下將10-20 mg碳納米管 與20-30 mL體積比1/3的強(qiáng)酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為699&濃HNO:,和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98. 3% 濃H2SO》在攪拌回流的條件下反應(yīng)30 min-4 h;氧化后的碳納米管和強(qiáng)酸 的混合溶液用水按照l: 20稀釋，在8000轉(zhuǎn)下離心以去除未被氧化的碳納 米管，仍溶解在溶液中的即是所需的碳納米管。
3. 按照權(quán)利要求2所述碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用， 其特征在于所述碳納米管作為載體擔(dān)載抗癌藥物過程為，室溫下l-2mg 碳納米管與l-5mg EDC在攪拌的條件下與1. 5-4. 5 mg藥物分子反應(yīng)12-24 h鍵合。
4. 按照權(quán)利要求2所述碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用， 其特征在于所述碳納米管直徑約為10-30納米，長度約為20-500納米， 所鍵合的藥物須是滲透性糖蛋白的底物，同時(shí)分子上有氨基且氨基不是活 性位點(diǎn)。
5. 按照權(quán)利要求2所述碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用， 其特征在于所鍵合的藥物是羅丹明123、阿霉素或鹽酸尼莫司汀，每克 碳納米管可鍵合0. 45-1. 6克藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及碳納米管作為載體在抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。本發(fā)明中合成的氧化碳納米管可以鍵合上不同的抗癌藥物，鍵合后的藥物分子可以透過細(xì)胞膜并在細(xì)胞中分布而不會(huì)被排出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沒有鍵合碳納米管的藥物分子在多藥耐藥細(xì)胞系和其母細(xì)胞系中的分布差異很大，而在鍵合之后其分布差異顯著減小，這說明多藥耐藥細(xì)胞系上高表達(dá)的滲透性糖蛋白沒有將鍵合在碳納米管上的藥物分子大量泵出細(xì)胞外，碳納米管有效地抑制了滲透性糖蛋白外排的作用，從而證明碳納米管可以作為載體并應(yīng)用于抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中，這為研制新型的抗癌藥物提供了新的思路，同是將促進(jìn)納米材料在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和多藥耐藥機(jī)理方面的研究。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101209349SQ20061013509
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日
發(fā)明者亮 孔, 華 肖, 鄒漢法 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所