專利名稱：長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治肝衰竭藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)、基因功能應(yīng)用領(lǐng)域，涉及重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因的新藥用用途，具體涉及長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFR)對急性及亞急性肝衰竭肝的預(yù)防和治療用途。
背景技術(shù)：
暴發(fā)性肝功能衰竭(fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)是指病前患者無肝病而短期內(nèi)出現(xiàn)大量肝細(xì)胞壞死或肝功能嚴(yán)重?fù)p害，并在首發(fā)癥狀出現(xiàn)后8周或黃疸出現(xiàn)后10天內(nèi)發(fā)生肝性腦病的一種綜合征。其特點為起病急，病前危重，缺乏有效治療手段，死亡率高。
肝細(xì)胞的急性炎癥和壞死可導(dǎo)致兩種不同的疾病急性肝炎和暴發(fā)性肝功能衰竭(又稱急性肝功能衰竭)。在急性肝炎中，由肝炎病毒造成的肝炎稱為急性病毒性肝炎；由酒精引起的肝炎稱為急性酒精性肝炎。雖然肝細(xì)胞壞死普遍存在于上述肝炎中，但壞死程度輕，不足以造成肝臟正常功能的運轉(zhuǎn)障礙。FHF與各種類型的急性肝炎區(qū)別在于前者發(fā)生十分嚴(yán)重的肝細(xì)胞快速壞死，導(dǎo)致殘存的正常肝細(xì)胞不能維持肝臟功能的正常運轉(zhuǎn)而發(fā)生肝功能衰竭，由此引發(fā)急遽增高的死亡率。
在我國引起FHF的主要原因是肝炎病毒感染，其次為藥物及毒物中毒，缺血缺氧，代謝紊亂，自身免疫性肝炎等等。目前尚沒有特異性針對阻斷肝細(xì)胞急性壞死發(fā)生的藥物，因此無法有效防止因大面積肝細(xì)胞壞死所造成的肝功能衰竭，F(xiàn)HF死亡率一直難以降低。臨床上迫切需要具有特異性快速阻止肝細(xì)胞急性壞死的藥物以治療肝功能衰竭。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TNFα與其受體結(jié)合是激活肝細(xì)胞壞死的始發(fā)通路，在肝細(xì)胞損傷機制中占有重要地位。如果阻斷TNFα與其受體結(jié)合，也就阻斷了肝細(xì)胞壞死的始發(fā)通路，從而使藥物治療FHF成為可能。
目前直接阻斷TNFα與其受體結(jié)合的TNFα抑制劑主要有兩類TNFα單克隆抗體，可溶性TNFα受體類似物。這些TNFα抑制劑進入體內(nèi)可以與TNFα結(jié)合，從而從理論上阻止血液或細(xì)胞間液中TNFα與肝細(xì)胞膜上TNFα受體結(jié)合而激活肝細(xì)胞壞死通路。
近來有研究發(fā)現(xiàn)，TNFα單克隆抗體除阻斷TNFα與I型受體結(jié)合外，還同時激活細(xì)胞膜上TNFα導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡的特點，因此不適合作為候選藥物。
常規(guī)可溶性TNFα受體在一定程度上可降低絕大多數(shù)輕度肝細(xì)胞壞死、急性肝炎動物模型死亡率。但是，并且本領(lǐng)域人員至今無法得知其效果不理想的原因。因此，目前還難以在實踐上將可溶性TNFα受體應(yīng)用于臨床治療。
綜上，本領(lǐng)域迫切需要找到TNFα受體對于肝細(xì)胞壞死療效差的關(guān)鍵所在，以進一步對TNFα受體進行改良，使之能有效、快速阻止大面積肝細(xì)胞急性壞死的發(fā)生。從而在臨床上真正成為用于防治急性、亞急性肝衰竭的良藥。
發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的第一方面，申請人提供了長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治大面積肝細(xì)胞壞死或肝衰竭藥物中的用途。所述的肝衰竭是急性和/或亞急性肝衰竭。
在本發(fā)明的第二方面，如上述第一方面所述的用途，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體的半衰期為24-140小時(更優(yōu)選的，為24-72小時)。
在本發(fā)明的第三方面，如上述第一方面所述的用途，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體選自a.人I型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白(更優(yōu)選的，為人I型腫瘤壞死因子α受體的羧基末端與IgGFc片段的氨基末端相連接)，b.人II型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白(更優(yōu)選的，為人II型腫瘤壞死因子α受體的羧基末端與IgGFc片段的氨基末端相連接)，c.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，d.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，e.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，f.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，h.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，i.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，j.人I型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白，或k.人II型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白。
在本發(fā)明的第四方面，如上述第一方面所述的的用途，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體可使肝細(xì)胞的IL-6水平下降(or下降至)40-50％；或使肝細(xì)胞的MIP-2水平下降50-60％；或使肝細(xì)胞的bcl-xl水平下降30-45％；或使肝細(xì)胞的NF-κB水平下降30-45％。
在本發(fā)明的第五方面，一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有人肝細(xì)胞生長因子(huHGF)、還原型谷胱甘肽及苦參堿。
(i)有效量(如0.00001-50wt％，更優(yōu)選的為0.0001-20wt％，最優(yōu)選的為0.001-10wt％)的選自下組的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體a.人I型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，b.人II型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，c.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，d.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，e.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，f.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，h.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，i.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，j.人I型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白，或k.人II型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白；以及(ii)藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第六方面，如上述第五方面所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物中還含有有效量的(如0.00001-50wt％，更優(yōu)選的為0.0001-20wt％，最優(yōu)選的為0.001-10wt％)一種或多種選自以下的藥物人肝細(xì)胞生長因子(huHGF)、還原型谷胱甘肽及苦參堿。
在本發(fā)明的第七方面，一種預(yù)防或治療肝細(xì)胞壞死或肝衰竭的方法，其特征在于，給予需要治療的人員有效量(如0.00001-50wt％，更優(yōu)選的為0.0001-20wt％，最優(yōu)選的為0.001-10wt％)的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體。本文所述的肝衰竭是急性和/或亞急性肝衰竭。
在本發(fā)明的第八方面，如上述的第七方面所述的方法，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體選自下組a.人I型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，b.人II型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，c.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，d.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，e.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，f.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，h.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，i.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，j.人I型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白，或k.人II型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過長期而廣泛的研究和試驗，首次發(fā)現(xiàn)防治大面積肝細(xì)胞急性壞死需要可溶性TNFα受體對肝細(xì)胞持續(xù)、穩(wěn)定的阻斷作用。即需在機體的血液及肝臟中維持穩(wěn)定、持久的可溶性TNFα受體濃度。而對于急性肝炎中的輕度肝細(xì)胞壞死，作用時間短、脈沖型的常規(guī)TNFα受體即可取得效果。因此本發(fā)明人揭示了常規(guī)可溶性TNFα受體無法有效阻止急性肝衰竭中大面積急性肝細(xì)胞壞死的原因在于其在機體內(nèi)半衰期短，不穩(wěn)定，而無法維持穩(wěn)定、持久抗肝細(xì)胞壞死的作用。因此，本發(fā)明人通過多種方法對TNFα受體進行改造，制備了一類可在機體血液及肝臟中維持穩(wěn)定、持續(xù)治療作用的長效的TNFα受體，有效延長了TNFα受體作為活性部分在體內(nèi)的作用時間，大幅提高了TNFα受體防治急性肝細(xì)胞壞死的療效，從而首次使改良后的TNFα受體可應(yīng)用于大面積肝細(xì)胞壞死引起的急性、亞急性肝衰竭?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供重組可性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因的新的藥用用途，尤其是重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因或修飾HusTNFR蛋白質(zhì)后形成的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFR)的預(yù)防和治療急性及亞急性肝衰竭的新用途。
本發(fā)明的進一步目的在于提供一種可較常規(guī)可溶性TNFα受體進一步大幅降低急性肝衰竭死亡率的藥物。主要是通過延長可溶性TNFα受體藥物的半衰期，延長藥物的作用時間，以提高臨床治療療效。
本發(fā)明采用長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體通過急性、亞急性肝衰竭的經(jīng)典動物模型，對小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭進行干預(yù)，結(jié)果顯示，干預(yù)組與模型組的病死率分別為0和80％。
上述腫瘤壞死因子(TNF)為腫瘤壞死因子α與相應(yīng)細(xì)胞膜受體結(jié)合的重組長效可溶性蛋白，包括長效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFRI)及長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFRII)，其半衰期較普通人重組可溶性I型(HusTNFRI)及II型腫瘤壞死因子α受體(HusTNFRII)延長10倍以上。其存在形式是(1)HusTNFRI或HusTNFRII羧基末端連接人免疫球蛋白IgGFc片段，或(2)在氨基或羧基末端連接PEG，或(3)PEG-脂質(zhì)體包裹HusTNFRI或HusTNFRII，或(4)在氨基或羧基末端連接人血清白蛋白。所述的LHusTNFRI及LHusTNFRII，其預(yù)防及治療急性、亞急性肝衰竭的療效明顯好于HusTNFRI或HusTNFRII。
所述的急性、亞急性肝衰竭的動物模型采用經(jīng)典的D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素皮內(nèi)注射大(小)鼠方法制做。所述動物模型48小時內(nèi)其因肝衰竭而導(dǎo)致的死亡率高達(dá)60-80％。
本發(fā)明的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體通過a.人I型TNFα受體(TNFR)與人IgG1Fc片段融合基因表達(dá)的重組蛋白，或b.人II型TNFα受體與人IgG1Fc片段融合基因表達(dá)的重組蛋白，或c.人I型TNFα受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接，或d.人I型TNFα受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接，或e.人II型TNFα受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接，或f.人II型TNFα受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接，或h.PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型TNFα受體蛋白，或i.PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型TNFα受體蛋白，或j.人I型TNFα受體與人血清白蛋白融合基因表達(dá)的重組蛋白，或k.人II型TNFα受體與人血清白蛋白融合基因表達(dá)的重組蛋白制備長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(LHusTNFR)，用于預(yù)防D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型動物(簡稱急性肝衰竭動物)，使急性肝衰竭動物的死亡率由80％下降至0％。使用LHusTNFR預(yù)防和治療D-氨基半乳糖與內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠亞急性肝衰竭模型動物(簡稱亞急性肝衰竭動物)使亞急性肝衰竭動物的死亡率由80％下降至0％。結(jié)果顯示，較長半衰期的I型或/和II型長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體，具有良好預(yù)防和治療模型動物急性及亞急性肝衰竭的療效，明顯降低模型動物死亡率。表明長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體對急性及亞急性肝衰竭肝具有預(yù)防和治療用途?？蛇M一步制備大幅降低急性肝衰竭死亡率的藥物。
本發(fā)明中，(1)SEQ ID NO1的I型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼I型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO1的1-172位)的基因與編碼人免疫球蛋白γ1鏈Fc段(IgG1Fc)氨基酸(即SEQ ID NO1的173-403(優(yōu)先與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選攜帶I型TNFR-IgG1Fc融合片段的陽性克隆，核苷酸序列分析驗證基因是否正確。
(2)SEQ ID NO2的II型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼II型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO2的1-235位)的基因與編碼人免疫球蛋白γ1鏈Fc段(IgG1Fc)氨基酸(即SEQ ID NO2的236-467位)與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選攜帶II型TNFR-IgG1Fc融合片段的陽性克隆，核苷酸序列分析驗證基因是否正確。
將上述的I型及II型TNFR-IgG1Fc的cDNA片段與表達(dá)載體重組，形成組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pET28等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用啤酒酵母菌BL21等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化LHusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的I型或II型LHusTNFR-IgG1Fc。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照<分子克隆實驗指南>(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，紐約冷泉港實驗室出版社)。
(3)將編碼I型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO1的1-172位)的cDNA與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒(SEQ ID NO3)。
本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pET28等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌BL21等。上述表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化I型HusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的I型HusTNFR。
將分子量(molecular weight，MW)2,0000以上的有活性的mPEG聯(lián)接至I型HusTNFR的氨基端或羧基端，合成長效I型HusTNFR。本發(fā)明不限于特定的mPEG。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用mPEG2-ALD，MW4,0000(Shearwatercorporation，New Jersey，USA)與I型HusTNFR的氨基端聯(lián)接。使用mPEG2-NHSeaster，MW4,0000(Shearwater corporation，New Jersey，USA)與I型HusTNFR的羧基端聯(lián)接。
反應(yīng)式mPEG-CHO+RNH2+NaCNBH3--→mPEG-CH2-NHR反應(yīng)條件為PH7.9時間為12小時。
(4)將編碼II型sTNFR(人)膜外氨基酸1-235的cDNA與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒(SEQ ID NO4)。
本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用原核表達(dá)載體，例如pET28等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌BL21等。上述表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化II型HusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的II型HusTNFR。
將分子量(molecular weight，MW)2,0000以上的有活性的mPEG聯(lián)接至I型HusTNFR的氨基端或羧基端，合成長效II型HusTNFR。本發(fā)明不限于特定的mPEG。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用mPEG2-ALD，MW4,0000(Shearwatercorporation，New Jersey，USA)與II型HusTNFR的氨基端聯(lián)接。使用mPEG2-NHSeaster，MW4,0000(Shearwater corporation，New Jersey，USA)與II型HusTNFR的羧基端聯(lián)接。
反應(yīng)式mPEG-CHO+RNH2+NaCNBH3--→mPEG-CH2-NHR反應(yīng)條件為PH7.9時間為12小時。
(5)將長循環(huán)脂質(zhì)體-聚乙二醇衍生磷脂分別包封I型HusTNFR或II型HusTNFR，合成長效I型及II型HusTNFR。
在三乙胺催化的條件下，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(分子量744.04，美國Aanti Polar Lipids)與NHS-PEG3540-MAL(Nhydroxysulfosuccinimide-polyoxyethylene(MW3540)-maleimide)(分子量3477，美國Aanti PolarLipids)及TEA以摩爾比1∶1∶0.1在25℃條件下，反應(yīng)6小時，經(jīng)離心、蒸干及真空干燥得到DOPE-PEG-MAL(分子量為4108.04)將上述制備的DOPE-PEG-MAL與EPC(L-α-Phosphatidylcholine，MW760.09)、cholesterol(MW386.67)及mPEG-2000-DOPE(MW得到2801.51)(美國Aanti Polar Lipids)在氯仿反應(yīng)體系中以摩爾比200∶20∶10∶1，40℃水浴，100-150r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。在蒸干有機溶劑后加入PBS(PH 7.4)，室溫下充分水化。用Mini Extruder反復(fù)擠壓，過100nm濾膜15次，即得到長循環(huán)脂質(zhì)體-聚乙二醇衍生磷脂。
將溶于PBS的SEQ ID NO3的I型HusTNFR或SEQ ID NO4的II型HusTNFR加入上述長循環(huán)脂質(zhì)體-聚乙二醇衍生磷脂的PBS溶液中，4℃旋渦振蕩30min，通過CL-4B(Pharmacia，USA)去除游離的I型HusTNFR或II型HusTNFR，得到長效I型及II型HusTNFR。
(6)SEQ ID NO5的I型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼I型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO1的1-172位)的基因、G(n)S-linker(即173-182)與編碼人血清白蛋白氨基酸(即SEQ ID NO5的183-791與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選攜帶I型TNFR-人血清白蛋白融合片段的陽性克隆，核苷酸序列分析驗證基因是否正確。
(7)SEQ ID NO6的II型LHusTNFR基因的制備方法，包括將編碼II型TNF(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO2的1-235位)的基因、G(n)S-linker(即236-245)與編碼人血清白蛋白氨基酸(即SEQ ID NO6的246-854與相關(guān)質(zhì)粒重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選攜帶II型TNFR-人血清白蛋白融合片段的陽性克隆，核苷酸序列分析驗證基因是否正確。
將上述的I型及II型TNFα受體-人血清白蛋白的融合cDNA片段與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達(dá)質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用酵母真核表達(dá)載體，例如啤酒酵母或pichia酵母等。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用啤酒酵母菌BL21等。
本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細(xì)胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化LHusTNFR，經(jīng)適當(dāng)復(fù)性后即獲得有活性的LHusTNFR。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照<分子克隆實驗指南>(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，紐約冷泉港實驗室出版社)。
經(jīng)體內(nèi)半衰期試驗論證，上述方法制備的不同形式的LHusTNFR，其半衰期均大于24小時(為24-140小時)，達(dá)到長效的要求。而一般的可溶性腫瘤壞死因子α受體的半衰期僅為50分鐘至2小時。
本發(fā)明采用基因工程方法對LHusTNFR進行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有高效抗急性、亞急性肝衰竭的功能。與常規(guī)HusTNFR性質(zhì)比較表明，LHusTNFR半衰期明顯延長，預(yù)防及治療急性、亞急性肝衰竭，降低死亡率的療效明顯提高。
本發(fā)明還提供了一種治療肝細(xì)胞壞死或肝衰竭的藥物組合物，它含有上述的長效可溶性腫瘤壞死因子α受體，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可直接用于肝細(xì)胞壞死或肝衰竭的治療。此外，還可同時使用其它相關(guān)的治療劑。這類治療劑包括但不限于人肝細(xì)胞生長因子(huHGF)、還原型谷胱甘肽及苦參堿。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的長效可溶性腫瘤壞死因子α受體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明的長效可溶性腫瘤壞死因子α受體施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如<分子克隆實驗指南>(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，紐約冷泉港實驗室出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1以I型HusTNFR-IgG1Fc為代表的長效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(I型LHusTNFR)預(yù)防小鼠急性(爆發(fā)性)肝衰竭的實驗分別以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)或Con-A(T cell mitogensconcanavalin A)皮下注射制作小鼠爆發(fā)性肝衰竭模型，48小時死亡率分別為80％與50％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過上述制備的I型LHusTNFR(方法(1)制備的I型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS組)或BALB/c小鼠(Con-A組)，劑量均為12.5mg/kg，為長效I型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS組)或BALB/c小鼠(Con-A組)，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)I型受體預(yù)防組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。16小時后預(yù)防組及對照組同時皮下注射GaIN/LPS或Con-A后觀察48小時。48小時后，三組死亡率分別為GaIN/LPS模型對照組80％(Con-A模型對照組為50％)，常規(guī)I型受體預(yù)防組50％(Con-A組為30％)，長效I型受體預(yù)防組0％(Con-A組為0)。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示，長效I型受體對GaIN/LPS急性肝衰預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降82.3％，44％；78.1％，52.2％；84.3％，37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示I型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效I型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)I型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例2以II型HusTNFR-IgG1Fc為代表的長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)預(yù)防小鼠急性(爆發(fā)性)肝衰竭的實驗分別以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)或Con-A(T cell mitogensconcanavalin A)皮下注射制作小鼠爆發(fā)性肝衰竭模型，48小時死亡率分別為80％與50％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過本發(fā)明制備的II型LHusTNFR(方法(2)制備的II型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS組)或BALB/c小鼠(Con-A組)，劑量均為12.5mg/kg，為長效II型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS組)或BALB/c小鼠(Con-A組)，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體預(yù)防組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。16小時后預(yù)防組及對照組同時皮下注射GaIN/LPS或Con-A后觀察48小時。皮下注射GaIN/LPS 48小時后，三組死亡率分別為GaIN/LPS模型對照組80％(Con-A模型對照組為50％)，常規(guī)I型受體預(yù)防組50％(Con-A組為30％)，長效I型受體預(yù)防組0％(Con-A組為0)。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xLmRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示，長效II型受體對GaIN/LPS急性肝衰竭預(yù)防組與常規(guī)II型受體預(yù)防組與對照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xLmRNA水平分別下降78.3％，44％；72.1％，52.2％；77.3％，37.8％，NF-kB水平分別下降78.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與II型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜II型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效II型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例3以II型HusTNFR-人血清白蛋白為代表的長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)預(yù)防小鼠急性(爆發(fā)性)肝衰竭的實驗分別以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)或Con-A(T cell mitogensconcanavalin A)皮下注射制作小鼠爆發(fā)性肝衰竭模型，48小時死亡率分別為80％與50％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過本發(fā)明制備的II型LHusTNFR(方法(6)制備的II型LHusTNFR-人血清白蛋白為預(yù)防藥物)皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS組)或BALB/c小鼠(Con-A組)，劑量介于為5-30mg/kg，為長效II型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS組)或BALB/c小鼠(Con-A組)，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體預(yù)防組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。16小時后預(yù)防組及對照組同時皮下注射GaIN/LPS或Con-A后觀察48小時。皮下注射GaIN/LPS 48小時后，三組死亡率分別為GaIN/LPS模型對照組80％(Con-A模型對照組為50％)，常規(guī)I型受體預(yù)防組50％(Con-A組為30％)，長效I型受體預(yù)防組0％(Con-A組為0)。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示，長效II型受體對GaIN/LPS急性肝衰竭預(yù)防組中IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平均比對照組與常規(guī)II型受體預(yù)防組明顯下降，下降幅度介于30-60％之間。NK-κB分別下降60％及32％。上述結(jié)果顯示II型TNFR-人血清白蛋白通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效II型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例4以I型HusTNFR-IgG1Fc為代表的長效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(I型LHusTNFR)預(yù)防大鼠亞急性肝衰竭的實驗以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過本發(fā)明制備的I型LHusTNFR(方法(1)制備的I型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為長效I型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)I型受體預(yù)防組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。16小時后預(yù)防組及對照組同時皮下注射GaIN/LPS后觀察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三組死亡率分別為對照組60％，常規(guī)I型受體預(yù)防組44％，長效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示長效I型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降90.5％，46.7％；78.1％，52.2％；84.3％，37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示I型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效I型可溶性TNFα受體預(yù)防亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)I型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例5以II型HusTNFR-IgG1Fc為代表的長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)預(yù)防大鼠亞急性肝衰竭的實驗以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過本發(fā)明制備的I型LHusTNFR(方法(2)制備的II型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為長效II型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體預(yù)防組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。16小時后預(yù)防組及對照組同時皮下注射GaIN/LPS后觀察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三組死亡率分別為對照組60％，常規(guī)II型受體預(yù)防組44％，長效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示長效II型受體預(yù)防組與常規(guī)II型受體預(yù)防組與對照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降88.5％，46.7％；68.1％，52.2％；78.3％，37.8％，NF-kB水平分別下降92.1％及37.5％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效II型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例6以II型HusTNFR-人血清白蛋白為代表的長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)預(yù)防大鼠亞急性肝衰竭的實驗以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
通過本發(fā)明制備的II型LHusTNFR(方法(6)制備的II型LHusTNFR-人血清白蛋白為預(yù)防藥物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量5-30mg/kg，為長效II型受體預(yù)防組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體預(yù)防組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。16小時后預(yù)防組及對照組同時皮下注射GaIN/LPS后觀察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三組死亡率分別為對照組60％，常規(guī)II型受體預(yù)防組44％，長效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示長效II型受體對GaIN/LPS急性肝衰竭預(yù)防組中IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平均比對照組與常規(guī)II型受體預(yù)防組明顯下降，下降幅度介于25-55％之間。NK-κB分別下降51％及27％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效II型可溶性TNFα受體預(yù)防急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例7以II型HusTNFR-IgG1Fc為代表的長效人重組可溶性I型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(I型LHusTNFR)治療大鼠亞急性肝衰竭的實驗以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
采用皮下注射GaIN/LPS制作亞急性肝衰竭大鼠模型。8小時后皮下注射I型LHusTNFR(方法(1)制備的I型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)，劑量12.5mg/kg，為長效I型受體治療組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)I型受體治療組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。觀察一周。GaIN/LPS注射后一周，三組死亡率分別為對照組60％，常規(guī)I型受體預(yù)防組30％，長效I型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示長效I型受體預(yù)防組與常規(guī)I型受體預(yù)防組與對照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降90.5％，46.7％；78.1％，52.2％；84.3％，37.8％，NF-kB水平分別下降87.4％及37.5％。上述結(jié)果顯示I型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與I型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效I型可溶性TNFα受體治療亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)I型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例8以II型HusTNFR-IgG1Fc為代表的長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)治療大鼠亞急性肝衰竭的實驗以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
采用皮下注射GaIN/LPS制作亞急性肝衰竭大鼠模型。8小時后皮下注射II型LHusTNFR(方法(1)制備的II型LHusTNFR-IgG1Fc為預(yù)防藥物)，劑量12.5mg/kg，為長效II型受體治療組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體治療組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。觀察一周。GaIN/LPS注射后一周，三組死亡率分別為對照組60％，常規(guī)II型受體預(yù)防組30％，長效II型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示長效II型受體預(yù)防組與常規(guī)II型受體預(yù)防組與對照組相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分別下降89％，44.3％；76％，49％及83％、35.2％，NF-kB水平分別下降79.6％及36％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與II型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效II型可溶性TNFα受體治療亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
實施例9以II型HusTNFR-人血清白蛋白為代表的長效人重組可溶性II型腫瘤壞死因子(TNF)α受體(II型LHusTNFR)治療大鼠亞急性肝衰竭的實驗以D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亞急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝臟大體標(biāo)本顯示肝臟嚴(yán)重充血、腫大；HE染色的病理切片顯示大面積、重度的肝細(xì)胞壞死。
采用皮下注射GaIN/LPS制作亞急性肝衰竭大鼠模型。8小時后皮下注射II型LHusTNFR(方法(6)制備的II型LHusTNFR-人血清白蛋白為預(yù)防藥物)，劑量5-30mg/kg，為長效II型受體治療組；常規(guī)HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，劑量12.5mg/kg，為常規(guī)II型受體治療組；對照組為皮下注射相同體積生理鹽水的同類小鼠。觀察一周。GaIN/LPS注射后一周，三組死亡率分別為對照組60％，常規(guī)II型受體預(yù)防組30％，長效II型受體預(yù)防組0％。大體病理顯示長效I型受體預(yù)防組肝臟僅輕度充血腫脹，HE染色顯示肝細(xì)胞呈輕度、點灶狀壞死，未見對照組大面積肝細(xì)胞壞死。提取肝臟總RNA及核蛋白，運用real-time PCR檢測IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA檢測NF-kB水平。結(jié)果顯示長效II型受體對GaIN/LPS急性肝衰竭預(yù)防組中IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平均比對照組與常規(guī)II型受體預(yù)防組明顯下降，下降幅度介于20-50％之間。NK-κB分別下降41％及24％。上述結(jié)果顯示II型可溶性TNFα受體通過阻斷急性肝衰竭中TNFα與II型受體的結(jié)合，抑制TNFα通過對肝細(xì)胞膜I型受體向胞核傳導(dǎo)信號導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死而發(fā)生的亞急性肝衰竭。結(jié)果同時表明長效II型可溶性TNFα受體治療亞急性肝衰竭的效果較常規(guī)II型可溶性TNFα受體有大幅提高。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>李，海<120>長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治肝衰竭藥物中的用途<130>li2005<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>403<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1 5 1015Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys20 2530Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser35 4045Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys50 55 60Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp65 70 75 80
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp85 90 95Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly100 105 110Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys115 120 125His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn130 135 140Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu145 150 155160Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Glu Pro Lys Ser Cys165 170 175Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly180 185 190Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met195 200 205Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His210 215 220Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val225 230 235240His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr245 250 255
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly260 265 270Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile275 280 285Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val290 295 300Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser305 310 315320Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu325 330 335Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro340 345 350Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val355 360 365Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met370 375 380His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser385 390 395400Pro Gly Lys<210>2<211>467
<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser15 10 15Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys20 25 30Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr35 40 45Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu50 55 60Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser65 70 75 80Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys85 90 95Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys100 105 110Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala115 120 125Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro130 135 140Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala165 170 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val180 185 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr195 200 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly210 215 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys225 230 235240Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr305 310 315320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Pro Gly Lys465<210>3<211>171<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>3Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1 510 15Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys20 25 30Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser35 40 45Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys50 55 60Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp65 70 75 80Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp85 90 95Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly100 105 110Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys115 120 125His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn130 135 140Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu145 150 155160Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr165 170
<210>4<211>235<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser1510 15Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys20 25 30Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr35 40 45Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu50 55 60Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser65 70 75 80Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys85 90 95Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys100 105 110Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala115 120 125Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155160Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala165 170 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val180 185 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr195 200 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly210 215 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp225 230 235<210>5<211>790<212>PRT<213>人類<400>5Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1510 15
Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys20 25 30Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser35 40 45Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys50 55 60Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp65 70 75 80Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp85 90 95Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly100 105 110Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys115 120 125His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn130 135 140Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu145 150 155 160Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Met Gly Gly Gly Gly165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe180 185 190Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His195 200 205Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe210 215 220Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro225 230 235 240Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys245 250 255Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His260 265 270Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr275 280 285Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn290 295 300Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu305 310 315 320Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu325 330 335
Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro340 345 350Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala355 360 365Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu370 375 380Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys385 390 395 400Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe405 410 415Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu420 425 430Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr435 440 445Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp450 455 460Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu465 470 475 480Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala485 490 495
Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala500 505 510Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys515 520 525Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro530 535 540Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr545 550 555 560Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala565 570 575Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu580 585 590Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe595 600 605Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser610 615 620Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser625 630 635 640Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp645 650 655
Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr660 665 670Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn675 680 685Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro690 695 700Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr705 710 715 720Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu725 730 735Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val740 745 750Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp755 760 765Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser770 775 780Gln Ala Ala Leu Gly Leu785 790<210>6<211>854<212>PRT
<213>人類<400>6Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser15 10 15Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys20 25 30Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr35 40 45Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu50 55 60Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser65 70 75 80Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys85 90 95Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys100 105 110Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala115 120 125Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155 160Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala165 170 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val180 185 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr195 200 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly210 215 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe245 250 255Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His260 265 270Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe275 280 285Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro290 295 300
Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys305 310 315 320Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His325 330 335Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr340 345 350Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn355 360 365Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu370 375 380Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu385 390 395 400Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro405 410 415Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala420 425 430Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu435 440 445Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys450 455 460
Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe465 470 475 480Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu485 490 495Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr500 505 510Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp515 520 525Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu530 535 540Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala545 550 555 560Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala565 570 575Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys580 585 590Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro595 600 605Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr610 615 620
Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala625 630 635 640Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu645 650 655Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe660 665 670Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser675 680 685Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser690 695 700Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp705 710 715 720Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr725 730 735Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn740 745 750Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro755 760 765Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr770 775 780
Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu785 790 795 800Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val805 810 815Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp820 825 830Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser835 840 845Gln Ala Ala Leu Gly Leu850
權(quán)利要求
1.長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體在制備防治大面積肝細(xì)胞壞死或肝衰竭藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體的半衰期為24-140小時。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體選自a.人I型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，b.人II型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，c.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，d.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，e.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，f.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，h.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，i.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，j.人I型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白，或k.人II型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體可使肝細(xì)胞的IL-6水平下降或下降至40-50％；或使肝細(xì)胞的MIP-2水平下降50-60％；或使肝細(xì)胞的bcl-xl水平下降30-45％；或使肝細(xì)胞的NF-κB水平下降30-45％。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝衰竭是急性和/或亞急性肝衰竭。
6.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有人肝細(xì)胞生長因子、還原型谷胱甘肽及苦參堿。(i)有效量如0.00001-50wt％選自下組的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體a.人I型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，b.人II型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，c.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，d.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，e.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，f.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，h.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，i.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，j.人I型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白，或k.人II型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白；以及ii藥學(xué)上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物中還含有有效量如0.00001-50wt％的一種或多種選自以下的藥物人肝細(xì)胞生長因子、還原型谷胱甘肽及苦參堿。
8.一種預(yù)防或治療肝細(xì)胞壞死或肝衰竭的方法，其特征在于，給予需要治療的人員有效量如0.00001-50wt％的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體選自下組a.人I型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，b.人II型腫瘤壞死因子α受體與人IgG1Fc片段的融合蛋白，c.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，d.人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，e.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白氨基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，f.人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白羧基端與PEG聯(lián)接的產(chǎn)物，h.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人I型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，i.用PEG-脂質(zhì)體混合物包埋人II型腫瘤壞死因子α受體蛋白的產(chǎn)物，j.人I型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白，或k.人II型腫瘤壞死因子α受體與人血清白蛋白的融合蛋白。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的肝衰竭是急性和/或亞急性肝衰竭。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)、基因功能應(yīng)用領(lǐng)域，涉及重組可溶性腫瘤壞死因子α受體(HusTNFR)基因的新藥用用途，本發(fā)明采用I型或II型長效人重組可溶性腫瘤壞死因子α受體，通過急性、亞急性肝衰竭的經(jīng)典動物模型，對小鼠暴發(fā)性肝功能衰竭進行干預(yù)，結(jié)果顯示，其半衰期延長10倍以上，具有良好預(yù)防和治療模型動物急性及亞急性肝衰竭的療效，明顯降低模型動物死亡率。其預(yù)防和治療急性及亞急性肝衰竭的療效較非長效HusTNFR有明顯提高。
文檔編號A61P1/16GK1951496SQ20061014199
公開日2007年4月25日 申請日期2006年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者李海 申請人:李海