專利名稱：：槐耳菌質(zhì)提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物提取物領(lǐng)域。更具體地涉及槐耳菌質(zhì)提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：槐耳(槐蛾)是我國民間重要藥用真菌，其學(xué)名為7ys歷e&sroZ^/^op力j7sMurr.，它僅生長于老齡中國槐5bp力oraj'3p077ica樹干上。按Ainsworth等1973年分類系統(tǒng)，屬擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina，多孔菌科Polyporaceae，栓菌屬。由于天然槐耳的稀缺，現(xiàn)多用其人工培養(yǎng)物一一槐耳菌質(zhì)?；倍|(zhì)組成復(fù)雜，包括槐耳菌絲體和培養(yǎng)基質(zhì)?；倍|(zhì)的主要活性成分是多糖和多糖蛋白(PS-T)，其主要功效是治療或輔助治療腫瘤性疾病。以往的提取工藝，如煎煮和高溫濃縮，提取過程時(shí)間長、溫度高，還要使用一些有機(jī)溶劑，這樣不僅會使最終產(chǎn)品顏色加深，而且破壞多糖蛋白的結(jié)構(gòu)，影響治療效果。傳統(tǒng)工藝獲得的槐耳菌質(zhì)水提濃縮物多糖含量低，約12%?；钚越M分純度相對較低，因此用藥劑量大，每天要服用約25克濃縮物。含有大量雜質(zhì)，如小分子成分，尤其是無機(jī)鹽，口感較差。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種活性組分(多糖和多糖結(jié)合蛋白)含量高的槐耳菌質(zhì)提取物，以確保制備治療腫瘤藥物療效的穩(wěn)定，并可具有更明確的質(zhì)量控制指標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種槐耳菌質(zhì)提取物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述提取物的制備方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述提取物的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種槐耳菌質(zhì)提取物，它含有多糖和多糖結(jié)合蛋白，其中總多糖含量為45—55%，總多糖和結(jié)合蛋白含量為50—80%。在另一優(yōu)選例中，所述的總多糖含量為48—55°%，總多糖和結(jié)合蛋白含量為60—80%。在另一優(yōu)選例中，蛋白質(zhì)含量為15—40%，酸水解后氨基酸總量為10_20%。在另一優(yōu)選例中，所述的槐耳菌質(zhì)提取物有三個(gè)主要分子量段組分，所述的分子量段組分的多糖重均分子量分別為60000士5000Da，10000土2000Da和4000±1000Da。在另一優(yōu)選例中，所述的分子量段組分的多糖重均分子量分別為60000±2000Da，10000土1000Da和4000土500Da。在另一優(yōu)選例中，它的多糖、蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合蛋白分子量分布為3000—2000000Da。在另一優(yōu)選例中，所述的槐耳菌質(zhì)提取物三個(gè)主要分子量段組分的高效液相保留時(shí)間分別為19.5—20.5分鐘、21—22分鐘和22.5—24.5分鐘；所述的高效液相測定條件為固定相TSKgelG4000PWXL(7.8mmX30cm);流動相0.7%硫酸鈉水溶液；流速0.6ml/rain。在另一優(yōu)選例中，所述的槐耳菌質(zhì)提取物中多糖的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為1-4:1-2:卜3:3-6:8-19:3-13。在另一優(yōu)選例中，所述的單糖組成中還含有微量鼠李糖。在另一優(yōu)選例中，所述的槐耳菌質(zhì)提取物由下述制備方法獲得a.將槐耳菌質(zhì)用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2—70%的無機(jī)鹽溶液或2—70%的水醇溶液；b.將密度為l一l.4的提取液超濾或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；c.將截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌質(zhì)提取物。在另一優(yōu)選例中，所述的提取物是由下述的制備方法獲得的a'.將槐耳菌質(zhì)用水浸提，料液比1:2—20，得到浸提液；b，.浸提液用l一30kDa的超濾膜超濾，所得截留液即為槐耳菌質(zhì)水溶性提取物。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種組合物，它包括(i)治療有效量的上述的槐耳菌質(zhì)提取物；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸劑、散劑、微囊、納米粒、注射劑或糖漿劑。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種上述的槐耳菌質(zhì)提取物的制備方法，它包括步驟a.將槐耳菌質(zhì)用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2—70%的無機(jī)鹽溶液或2—70%的水醇溶液；b.將密度為l一l.4的提取液超濾或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；c.將截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌質(zhì)提取物。在另一優(yōu)選例中，所述的水性溶液包括水、0.2—2%的無機(jī)鹽溶液或2—20%的水醇溶液。在另一優(yōu)選例中，步驟a中的提取溫度為4一9(TC。在另一優(yōu)選例中，步驟b中可將提取液濃縮到密度1一1.4。在另一優(yōu)選例中，步驟b中用50—95X乙醇溶液沉淀。在另一優(yōu)選例中，步驟b中在將一定密度的提取液過濾或離心后用l一30kDa超濾膜超濾。在另一優(yōu)選例中，步驟c中將截留液或沉淀物進(jìn)行減壓真空干燥或噴霧干燥。在另一優(yōu)選例中，所述的制備方法包括步驟a'.將槐耳菌質(zhì)用水，料液比1:2—20，得到提取液；b，.用l一30kDa的超濾膜超濾，所得截留液即為上述的槐耳菌質(zhì)提取物。在另一優(yōu)選例中，步驟a'中在4一9(TC浸提1一5次，每次浸提1一10小時(shí)，然后合并浸提液。在另一優(yōu)選例中，離心速度為5000—15000g;用0.25"m—0.5um的微濾膜過濾或離心。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種上述的槐耳菌質(zhì)提取物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤是指臨床常見的胃癌、食道癌、結(jié)腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚癌、鼻咽癌、惡性黑色素瘤、白血病等。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種含活性組分(多糖和多糖結(jié)合蛋白)高的槐耳菌質(zhì)提取物，它確保所制備的治療腫瘤的藥物療效穩(wěn)定，并可具有更明確的質(zhì)量控制指標(biāo)。圖1顯示多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2顯示槐耳菌質(zhì)提取物中組分的分子量分布情況。具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在一定溫度下用水或稀無機(jī)鹽溶液或稀醇溶液反復(fù)提取槐耳菌質(zhì)后，所得的提取液經(jīng)過離心或過濾，超濾截留或乙醇沉淀后，便能獲得含活性組分高的槐耳菌質(zhì)提取物。所得到的槐耳菌質(zhì)提取物的總多糖和結(jié)合蛋白含量可達(dá)50%以上，由該提取物獲得的制劑可大大減少用藥劑量。如本文所用，術(shù)語"多糖"是指槐耳菌質(zhì)提取物中游離的多糖，是本發(fā)明提供的提取物中的活性成分/活性部位。如本文所用，術(shù)語"多糖結(jié)合蛋白"或"蛋白結(jié)合多糖"是指槐耳菌質(zhì)提取物中多糖與蛋白的結(jié)合物，是本發(fā)明提供的提取物中的活性成分/活性部位。如本文所用，術(shù)語"總多糖"是指槐耳菌質(zhì)提取物中活性成分/活性部位中的游離的多糖和與其它大分子結(jié)合的多糖的總和。如本文所用，術(shù)語"結(jié)合蛋白"是指槐耳菌質(zhì)提取物中其它大分子與蛋白的結(jié)合物中的蛋白。如本文所用，術(shù)語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……構(gòu)成"、和"由……構(gòu)成"。如本文所用，術(shù)語"基本上由……構(gòu)成"指在組合物中，除了含有必要成分或必要組份之外，還可含有少量的且不影響有效成分的次要成分和/或雜質(zhì)。例如，可以含有甜味劑以改善口味、抗氧化劑以防止氧化，以及其他本領(lǐng)域常用的添加劑。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語"治療有效量"是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如稀釋劑、賦型劑和水等。填充劑如淀粉、甘露糖、糊精、乳糖、微晶纖維素等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮；潤濕劑如甘油等；崩解劑如甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂和碳酸氫鈉；表面活性劑如十六垸醇、十二垸基磺酸鈉、土溫-80等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鎂或鈣、微粉硅膠和聚乙二醇。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如色素、香味劑和甜味劑等?；倍|(zhì)提取物本發(fā)明提供的槐耳菌質(zhì)提取物中含有多糖、多糖結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)等，其中的活性成分/活性部位是多糖和多糖結(jié)合蛋白。所述的多糖和結(jié)合蛋白以提取物計(jì)含量達(dá)50—80wt%，由高效液相色譜(HPLC)測定的分子量分布情況顯示，提取物中的多糖、蛋白質(zhì)、蛋白多糖分子量大多分布于2500—4600Da、10000—20000Da和40000—80000Da處。提取物中的單糖組成包括巖藻糖(Fuc.)、阿拉伯糖(Ara.)、木糖(Xyl.)、甘露糖(Man.)、半乳糖(Gal.)、葡萄糖(Glu.)和微量鼠李糖，其中葡萄糖的摩爾百分比為40—60%，半乳糖的摩爾百分比為15—30%，甘露糖的摩爾百分比為10—20%，阿拉伯糖的摩爾百分比為5—10%，巖藻糖或木糖的摩爾百分比為2—6%;優(yōu)選地，葡萄糖的摩爾百分比為45—55%，半乳糖的摩爾百分比為20—25%，甘露糖的摩爾百分比為12—18%，阿拉伯糖的摩爾百分比為6—8%，巖藻糖或木糖的摩爾百分比為3—5%。所述的結(jié)合蛋白質(zhì)以提取物計(jì)含量為15—40wt%?；倍|(zhì)提取物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供的提取物有槐耳菌質(zhì)由水性溶液提取后，經(jīng)超濾截留或用50一95%的有機(jī)溶劑沉淀得到。具體地，是將槐耳菌質(zhì)放入水或70%以下含水的有機(jī)溶劑或無機(jī)鹽溶液中，在4一9(TC浸提或回流提取。提取液合并后離心或過濾，取上清或?yàn)V過液，或?qū)⑸锨逡夯驗(yàn)V過液直接或濃縮到一定密度后，離心或用微濾膜過濾，然后用l一30kDa的超濾膜超濾或50—95%醇沉淀，截留液或沉淀物減壓真空干燥或噴霧干燥，得到槐耳菌質(zhì)提取物。本發(fā)明獲得的槐耳菌質(zhì)提取物，總多糖和結(jié)合蛋白質(zhì)含量由水提濃縮物的百分之十幾提高到50%以上，使原來每日服用25克水提濃縮物的日劑量降低到5克以下，并且抑制腫瘤的活性還略有提高。所述的水性溶液包括水、0.2—70%的無機(jī)鹽溶液或2—70%的水醇溶液，優(yōu)選水、0.2—2%的無機(jī)鹽溶液或2—20%的水醇溶液。所述的無機(jī)鹽選自但不限于鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽。其中優(yōu)選鈉鹽、鹽酸鹽，更優(yōu)選NaCl。所述的水醇溶液選自但不限于乙醇溶液、甲醇溶液，優(yōu)選乙醇溶液?；倍|(zhì)提取物用途本發(fā)明的槐耳菌質(zhì)提取物具有明顯的抑制腫瘤生長的作用。對于藥品而言，其治療組分的純度與療效和用藥量密切相關(guān)。本發(fā)明得到的提取物總多糖和結(jié)合蛋白含量大于50%，純度的提高，確保了在治療腫瘤疾病方面的穩(wěn)定療效，質(zhì)量控制指標(biāo)明確。本發(fā)明槐耳菌質(zhì)提取物應(yīng)用在腫瘤治療或輔助治療方面，可與一種或多種藥學(xué)可接受的載體(輔料)配制成藥劑。所述的腫瘤是指臨床常見的胃癌、食道癌、結(jié)腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚癌、鼻咽癌、惡性黑色素瘤、白血病等。本發(fā)明提供的組合物可通過口服、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。制成制劑時(shí)，可將其制成片劑如腸溶片、胃溶片、咀嚼片、口含片、泡騰片、分散片、速崩片等；膠囊劑如腸溶膠囊、胃溶膠囊、硬膠囊和軟膠囊等；顆粒劑；滴丸劑；散劑；微囊如腸溶微囊、胃溶微囊；納米粒；注射劑如注射液、大輸液、凍干粉等；糖漿劑等。本發(fā)明槐耳菌質(zhì)提取物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴(yán)重程度等而變化，其日劑量按提取物量計(jì)可以是l一1000mg/kg體重，優(yōu)選5—400mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯谩１景l(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的槐耳菌質(zhì)提取物活性組分明確，質(zhì)量可控；2、本發(fā)明提供的制備槐耳菌質(zhì)提取物的方法工藝簡單，所得產(chǎn)品多糖和結(jié)合蛋白含量高；3、本發(fā)明提供的槐耳菌質(zhì)提取物由于活性成分純度高，用于治療各種類型的腫瘤療效可靠，并且?guī)缀鯚o副作用。4、本發(fā)明提供的槐耳菌質(zhì)提取方法有利于規(guī)?；a(chǎn)。以下通過特定的具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過實(shí)施例所揭示的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明也可通過其它不同的具體實(shí)施例加以施行或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。本發(fā)明選用槐耳Tra/z/efesro力/z2J'o/7/^7aMurr.的人工培養(yǎng)物——槐耳菌質(zhì)。實(shí)施例l取槐耳菌質(zhì)適當(dāng)粉碎，加入12倍水，在4一9(TC浸提3次，8h/次。合并浸提液濃縮到一定密度后，離心，上清液用l一30kDa的超濾膜超濾，截留液減壓真空干燥，得到槐耳菌質(zhì)熱水浸提超濾提取物，總多糖和結(jié)合蛋白含量78.4%。組分分析結(jié)果1.槐耳菌質(zhì)熱水浸提超濾提取物總多糖含量為52.7%2.槐耳菌質(zhì)熱水浸提超濾提取物結(jié)合蛋白質(zhì)含量為25.7%3.槐耳菌質(zhì)水溶性提取物多糖分子量分布(1)色譜條件色譜柱TSKgelG4000PWX1,(7.8mmX30cm);柱溫35°C;RI內(nèi)部加熱器40°C;流動相0.7%硫酸鈉水溶液;流速0.6ml/min。(2)結(jié)果a.校準(zhǔn)曲線取不同分子量右旋糖苷用去離子水配制成濃度約2mg/ml的溶液，200ul定量環(huán)分別手動進(jìn)樣。結(jié)果見圖l和表2。表1分子量標(biāo)定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b.槐耳菌質(zhì)水溶性提取物多糖分子量測定。結(jié)果見圖2。表2T二20.428段多糖分子量測試報(bào)告<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果表明，槐耳菌質(zhì)水溶性提取物中主要含有3個(gè)分子量段組分，分子量分布從3932—60754Da?；倍|(zhì)提取物，多糖含量比清膏明顯提高，組成成分主要為中等大小分子和大分子多糖、多糖蛋白和蛋白質(zhì)。4.槐耳水溶性提取物組成單糖及摩爾比見表5表5槐耳水溶性提取物單糖組成及摩爾比<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5.槐耳菌質(zhì)水溶性提取物氨基酸含量見表6表6槐耳水溶性提取^f勿中17種常見氨基酸含量(％)測定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2取槐耳菌質(zhì)IOOO克放入一定的容器中，加18升水，于80C浸提4次，不時(shí)攪拌，每次提取8小時(shí)。過濾、合并，濃縮至密度1.15得到提取液。微孔濾膜過濾后用8kDa的超濾膜超濾，截留液減壓真空干燥，得到槐耳菌質(zhì)水溶性提取物37.5克，總多糖和結(jié)合蛋白含量79.5%。實(shí)施例3取槐耳菌質(zhì)1000克放入一定的容器中，加18升生理鹽水，于6(TC浸提4次，不時(shí)攪拌，每次提取10小時(shí)。過濾、合并，濃縮至密度1.03得到提取液。微孔濾膜過濾后用8kDa的超濾膜超濾，截留液減壓真空干燥，得到槐耳菌質(zhì)生理鹽水提取物40.2克，總多糖和結(jié)合蛋白含量74.3%。實(shí)施例4取槐耳菌質(zhì)1000克放入一定的容器中，加18升10%乙醇，于8(TC浸提4次，不時(shí)攪拌，每次提取8小時(shí)。過濾、合并，濃縮至密度1.IO得到提取液。離心后用加入乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到80%，然后于4r放置12小時(shí)后濾出沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后減壓干燥，得到槐耳菌質(zhì)醇沉提取物52克，總多糖和結(jié)合蛋白含量69.6%。實(shí)施例5取槐耳菌質(zhì)1000克放入一定的容器中，加18升水，于8(TC浸提4次，不時(shí)攪拌，每次提取8小時(shí)。過濾、合并，濃縮至密度1.15得到提取液。離心后用加入乙醇，使醇沉濃度達(dá)到80%，然后于4t:放置12小時(shí)后濾出沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后減壓干燥，得到槐耳菌質(zhì)醇沉提取物48克，總多糖和結(jié)合蛋白含量53.9%。實(shí)施例6槐耳菌質(zhì)提取物抑癍試驗(yàn)抑制腫痏活性一、樣品制備1.實(shí)施例1制得的槐耳菌質(zhì)提取物①；2.槐耳清膏槐耳菌質(zhì)的熱水提取濃縮至一定密度而成。二、對小鼠肉痏重的影響1、對小鼠肉癯s，癍重的影響昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22克，所有小鼠均于右前肢腋部皮下接種l:4稀釋的S,8。瘤細(xì)胞液0.2ral/鼠。接種腫瘤后隨機(jī)分為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺化療組、槐耳清膏組、槐耳菌質(zhì)水溶性提取物組和超濾濾過液組。于接種腫瘤后次日開始，給藥組分別腹腔注射給予槐耳清膏、槐耳菌質(zhì)提取物和超濾濾過液，劑量均以清膏計(jì)，4.5g清膏/kg，荷瘤對照組腹腔注射給予同體積的生理鹽水，陽性藥組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，連續(xù)7天，其余小鼠均連續(xù)給藥10天。于末次給藥后24小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，剝離肉瘤，電子天平稱重。計(jì)算各組小鼠瘤重平均值及抑瘤率。結(jié)果見表9。對照組平均瘤重一試驗(yàn)組平均瘤重抑瘤率(％)=-----------------xl00%對照組平均瘤重表7槐耳菌質(zhì)提取物對小鼠肉瘤S180的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與荷瘤對照組比較(t-檢驗(yàn)),*P〈0.05,**P<0.01，***P<0.0012、對小鼠肝癌H22癍重的影響昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22克，所有小鼠均于右前肢腋部皮下接種l:4稀釋的肝癌H22瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠。接種腫瘤后隨機(jī)分為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺化療組、槐耳清膏組、槐耳菌質(zhì)水溶性提取物組和超濾濾過液組。于接種腫瘤后次日開始，給藥組分別腹腔注射給予槐耳清膏、槐耳菌質(zhì)提取物和超濾濾過液，劑量均以清膏計(jì)，4.5g清膏/kg，荷瘤對照組腹腔注射給予同體積的生理鹽水，陽性藥組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，連續(xù)7天，其余小鼠均連續(xù)給藥10天。于末次給藥后24小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，剝離肉瘤，電子天平稱重。計(jì)算各組小鼠瘤重平均值及抑瘤率。本試驗(yàn)共進(jìn)行三批。結(jié)果見表10。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與荷瘤對照組比較(t-檢驗(yàn))，*P<0.05，"P<0.01，"*P<0.0013、對小鼠Lewis肺痛痏重及抑癍率的影響C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重18-22克，取皮下接種Lewis肺癌瘤株14天的荷瘤小鼠，無菌操作下取出瘤塊稱重，按瘤塊重量加入滅菌生理鹽水，于組織勻漿器中研磨，組織和生理鹽水的比例為lg:4ml，配成混懸液(鏡檢含瘤細(xì)胞數(shù)2x107ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接種0.2ml/鼠。將接種瘤液的小鼠分為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺化療組、槐耳清膏組、槐耳菌質(zhì)提取物組和超濾濾過液組。于接種腫瘤后次日開始，給藥組分別腹腔注射給予槐耳清膏、槐耳菌質(zhì)水溶性提取物和超濾濾過液，劑量均以清膏計(jì)，4.5g清膏/kg，陽性藥組給予環(huán)磷酰胺30mg/kg，連續(xù)7天，其余小鼠均給藥14天。于末次給藥后24小時(shí)，脫頸椎處死小鼠，剝離肉瘤，千分之一電子天平稱取瘤重。計(jì)算各組小鼠瘤重平均值及抑瘤率。結(jié)果見表ll。對照組平均瘤重一試驗(yàn)組平均瘤重抑瘤率(％)=-----------------xioo°/。對照組平均瘤重表9槐耳水溶性提取物對小鼠Lewis肺癌瘤的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注與荷瘤對照組比較(t-檢驗(yàn))，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.0014、對裸鼠乳腺癌MCF7癍重及抑癀率的影響B(tài)ALB/c/nu小鼠，雌，16—18g，適應(yīng)環(huán)境3天。無菌條件下，將人乳腺癌MCF7細(xì)胞在5y。C02、37'C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于對數(shù)生長期用胰酶和EDTA混合消化液消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X107個(gè)/ral,然后無菌操作下種植到裸鼠背部右肩胛皮下，0.2ml/只。觀察移植瘤生長情況，待瘤塊直徑為10mm左右，按體積隨機(jī)均衡分組，接種腫瘤后隨機(jī)分為荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺化療組、槐耳清膏組、槐耳菌質(zhì)提取物組和超濾濾過液組。每組均為6只。分組后次日，開始給藥，劑量均以清膏計(jì)，4.5g清膏/kg。除CTX為ip給藥外(腹腔注射，每次30mg/kg，隔日給藥，連續(xù)8次)，其余均ig10ml/kg，對照組ig等量生理鹽水，每d給藥l次。藥后20d，處死，剝離瘤塊，稱重。根據(jù)瘤塊重計(jì)算抑瘤率。表10.槐耳水溶性提取物對裸鼠乳腺癌MCF7的抑制作用(x±s，n=6:><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注與荷瘤對照組比較(t-檢驗(yàn))，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001三、結(jié)果槐耳菌質(zhì)提取物和槐耳清膏按4.5g清膏/kg的劑量腹腔注射給藥，對實(shí)體瘤S，、肝癌H^Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重有減輕作用，而對于乳腺癌MCF7荷瘤裸鼠口服給藥，對腫瘤也有明顯抑制作用。結(jié)果表明，槐耳菌質(zhì)提取物和清膏均具明顯的抗腫瘤作用?；倍|(zhì)提取物對幾種試驗(yàn)?zāi)[瘤的抑制率均較清膏為高。而膜超濾濾過液對試驗(yàn)?zāi)[瘤抑瘤作用均較弱，說明槐耳菌質(zhì)提取物制備工藝中去掉的大部分組分幾乎為無效組分，使有效成分得到進(jìn)一步富集。本發(fā)明獲得的槐耳菌質(zhì)提取物，總多糖和結(jié)合蛋白含量由水提濃縮物的百分之二十幾提高到50%以上，使原來每日服用25克水提濃縮物的日劑量降低到5克以下，并且抑制腫瘤的活性還略有提高。實(shí)施例7—10參照實(shí)施例6的方法，將實(shí)施例2—5制得的槐耳菌質(zhì)提取物②一⑤進(jìn)行試驗(yàn)，得到類似的結(jié)果。表明由本發(fā)明提供的方法獲得的槐耳菌質(zhì)提取物具有有效的抑瘤作用。實(shí)施例11一15槐耳口服液的制備實(shí)施例1-5制得的槐耳菌質(zhì)提取物①一⑤50克苯甲酸鈉2克取實(shí)施例l-5制得的槐耳菌質(zhì)提取物①一⑤，加苯甲酸鈉，加注射用水適量，加熱溶解，放冷。再加注射用水1000ml，攪拌，用0.45um微孔濾膜過濾，罐裝，封口，滅菌，即得。實(shí)施例16—20槐耳膠囊的制備實(shí)施例1-5制得的槐耳菌質(zhì)提取物①一⑤500克糊精425克羧甲基纖維素鈉60克硬脂酸鎂15克取實(shí)施例l-5制得的槐耳菌質(zhì)提取物①一⑤，糊精，羧甲基纖維素鈉，硬脂酸鎂混合均勻，過80目篩，用干式制粒機(jī)制粒，用60目篩整粒，灌于膠囊中，即得。實(shí)施例21—25槐耳注射液的制備實(shí)施例1-5制得的槐耳菌質(zhì)提取物①一⑤500克土溫-80lml注射用水加水至1000ral實(shí)施例1-5制得的槐耳菌質(zhì)提取物①一⑤100克，加注射用水800ml，溶解，除熱源后，用1%氫氧化鈉調(diào)pH至6—7，加lml土溫-80，補(bǔ)加注射用水至1000ml，低溫靜置，0.22um微孔濾膜過濾，灌封，滅菌，即得。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種槐耳菌質(zhì)提取物，其特征在于，它含有多糖和多糖結(jié)合蛋白，其中總多糖含量為45-55％，總多糖和結(jié)合蛋白含量為50-80％。2.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，它有三個(gè)主要分子量段組分，所述的分子量段組分的多糖重均分子量分別為60000士5000Da，10000土2000Da和4000土1000Da。3.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，它的三個(gè)主要分子量段組分的高效液相保留時(shí)間分別為19.5—20.5分鐘、21—22分鐘和22.5—24.5分鐘；所述的高效液相測定條件為固定相TSKgelG4000PWXL(7.8mmX30cm);流動相0.7%硫酸鈉水溶液；流速0.6ml/min。4.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，所述多糖的單糖組成為阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為1-4:1-2:1-3:3-6:8-19:3-13。5.—種槐耳菌質(zhì)提取物，其特征在于，由下述制備方法獲得a.將槐耳菌質(zhì)用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2—70%的無機(jī)鹽溶液或2—70。％的水醇溶液；b.將密度為l一l.4的提取液超濾或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；c.將截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌質(zhì)提取物。6.—種組合物，其特征在于，它包括(i)治療有效量的如權(quán)利要求1所述的槐耳菌質(zhì)提取物；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。7.—種如權(quán)利要求1所述的槐耳菌質(zhì)提取物的制備方法，其特征在于，它包括步驟a.將槐耳菌質(zhì)用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2—70%的無機(jī)鹽溶液或2—70%的水醇溶液；b.將密度為l一l.4的提取液超濾或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；c.將截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌質(zhì)提取物。8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟b中在將一定密度的提取液過濾或離心后用l一30kDa超濾膜超濾。9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟C中將截留液或沉淀物進(jìn)行減壓真空干燥或噴霧干燥。10.—種如權(quán)利要求1所述的槐耳菌質(zhì)提取物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種槐耳菌質(zhì)提取物，該提取物為一種治療腫瘤的藥物，含有游離蛋白質(zhì)、多糖和蛋白多糖。本發(fā)明還公開了這種提取物的制備方法和它的醫(yī)藥用途。本發(fā)明提供的槐耳菌質(zhì)提取物活性組分明確，質(zhì)量可控；活性成分純度高，用于治療各種類型的腫瘤療效可靠，并且?guī)缀鯚o副作用。本發(fā)明提供的制備方法工藝簡單，所得產(chǎn)品進(jìn)一步富集了有效組分。文檔編號A61K36/06GK101204405SQ20061014774公開日2008年6月25日申請日期2006年12月22日優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日發(fā)明者徐無為,陸正鑫申請人:啟東蓋天力藥業(yè)有限公司