專利名稱：：一種重組人表皮生長因子噴霧劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物制劑及其制備方法，具體涉及一種重組人表皮生長因子噴霧劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：人表皮生長因子(hEGF)是人體重要的多肽，它具有多種生物學(xué)功能，例如可與表皮細胞上特異的受體結(jié)合，將信息傳遞入細胞，改變細胞內(nèi)的酸堿度和游離鈣度，從而促進糖酵解和蛋白質(zhì)合成以及增加某些專一性基因轉(zhuǎn)錄，促進DNA復(fù)制和細胞分裂。因此，hEGF可促進表皮細胞、神經(jīng)細胞和器官組織上皮細胞生長；可促進新生胎兒齒、骨與各器官的生長；可促進肝細胞再生；可促進胃腸道黏膜細胞生長和保護胃腸道黏膜受損。重組人表皮生長因子(rhEGF)是通過基因工程技術(shù)將大腸桿菌或酵母分泌表達而來的，其制品純度可達98%。重組人表皮生長因子屬于分子量超過500道的大分子多肽類藥物。因該類藥物分子量大，親水性強且?guī)щ姾?，所以將其透皮給藥吸收存在難點。目前，市售的深圳市華生原基因工程發(fā)展有限公司生產(chǎn)的"金因肽"噴霧劑所用原料是重組人表皮生長因子的衍生物，為增加穩(wěn)定性而對rhEGF蛋白做了一定的修飾。但是經(jīng)過修飾的rhEGF比原構(gòu)型的rhEGF效價低，而且沒有從根本上解決rhEGF在室溫貯存的穩(wěn)定性問題。市售的rhEGF噴霧劑只能于28°C低溫條件保存，不宜于隨身攜帶，使用不方便。另外，市售的rhEGF系普通的溶液制劑，透皮吸收率低。例如在深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合早期，創(chuàng)面出現(xiàn)水腫，表面存在壞死組織，從而使局部應(yīng)用的rhEGF無法穿透該層組織作用到皮膚的上皮細胞，造成治療起效慢，傷口愈合時間長。而且，市售rhEGF噴霧劑是以10%的甘油和1.0%甘露醇為保護劑，因此對甘油、甘露醇有過敏史者不宜使用，且使用時會出現(xiàn)紅疹等過敏反應(yīng)。因此，目前急需一種新的rhEGF噴霧劑，它并沒有上述缺陷
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種重組人表皮生長因子(rfiEGF)噴霧劑，所述rhEGF保持了蛋白的原有構(gòu)型，且效價高，可常溫貯存，便于使用。所述噴霧劑透皮吸收率高，起效快，傷口愈合時間短。本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組人表皮生長因子噴霧劑的制備方法。本發(fā)明一方面提供了一種重組人表皮生長因子噴霧劑，它包括重組人表皮生長因子、表面活性劑、保護劑以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述噴霧劑包含傳遞體，且至少80%的傳遞體的粒徑是均一的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，至少85%、較好至少90%、更好至少95%、最少至少99%的所述傳遞體的粒徑是均一的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述重組人表皮生長因子的用量是0.5-20ug/ml，較好為l-15ug/ml，更好為2-10ug/ml。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，表面活性劑包括磷脂類、聚氧乙烯氧丙烯共聚物類、吐溫-80、司盤-85、油酸、膽酸鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述表面活性劑的用量為0.05-0.5g/ml，較好為0.1-0.4g/ml,更好為0.15-0.25g/ml。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑包括聚乙二醇類、白蛋白、P-環(huán)糊精及其衍生物，聚維酮，玻璃酸鈉，羥丙基甲基纖維素中的一種或多種。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑的用量為0.01-0.5g/ml，較好為0.02-0.3g/ml，更好為0.05-0.15g/ml。本發(fā)明另一方面提供了一種制備所述重組人表皮生長因子噴霧劑的方法，所述方法包括(a)用水溶解重組人表皮生長因子，并分散在保護劑中，得到溶液A;(b)用溶劑溶解表面活性劑，得到溶液B;(c)將溶液A加入到溶液B中，攪拌混勻得到溶液C;(d)將溶液C經(jīng)超聲霧化器在1.0-2.5MHz頻率下于10-60。C超聲霧化后，通入正在攪拌的緩沖液中，或者，將溶液C加入緩沖液后再攪拌，得到的所述噴霧劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述超聲霧化的頻率為1.5-1.7MHz;和/或，超聲霧化的溫度為15-50°C，更好為20-4(TC。本發(fā)明還提供了一種由本發(fā)明所述方法制備的重組人表皮生長因子噴霧劑。本發(fā)明的重組人表皮生長因子噴霧劑比普通的水溶性制劑具有許多優(yōu)點(1)本發(fā)明重組人表皮生長因子噴霧劑的物理、化學(xué)穩(wěn)定性以及生物學(xué)穩(wěn)定性更好。(2)本發(fā)明重組人表皮生長因子噴霧劑使大分子多肽類藥物能很容易透過皮膚屏障，進入皮膚深層甚至進入體循環(huán)而發(fā)揮作用，有利于治療深層皮膚損傷。具體實施方式在本發(fā)明中，所用術(shù)語"傳遞體"指一種自聚集泡囊，其主要成分為磷脂和表面活性劑，所述傳遞體的粒徑多在10-100納米之間，外觀為膠體溶液。所述傳遞體通過自身膜的高度變形性，以滲透壓差為驅(qū)動力，能穿透比它本身小數(shù)倍孔道的類脂聚集體。例如，將所述傳遞體非封閉地涂抹于皮膚上，可透過直徑約為0.4納米的皮膚角質(zhì)層孔道。在本發(fā)明中，所述術(shù)語"均一"表示用激光散射粒度分布測定儀測定粒徑時為一個峰。本發(fā)明提供了一種重組人表皮生長因子噴霧劑，它包括重組人表皮生長因子、表面活性劑、保護劑以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述噴霧劑包含傳遞體，且至少80%的傳遞體的粒徑是均一的。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述重組人表皮生長因子在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。它可從商業(yè)市場上購得。在本發(fā)明的一個實例中，所述重組人表皮生長因子購自中科院上海生物化學(xué)研究所。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述重組人表皮生長因子的用量在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述結(jié)合常識可以直接推導(dǎo)出其具體的用量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述重組人表皮生長因子的用量是0.5-20Pg/ml，較好為l-15wg/ml，更好為2-10yg/ml。通常，以所述噴霧劑的總重量計，所述重組人表皮生長因子在噴霧劑中的百分含量為0.000005-0.0002重量％，較好為0.00001-0.00015重量％，更好為0.00002-0.0001重量％。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述表面活性劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述，可以直接推導(dǎo)出哪些表面活性劑可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述表面活性劑包括磷脂類(例如卵磷脂等)、聚氧乙烯氧丙烯共聚物類(例如PluronicF-68等)中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，所述表面活性劑選自吐溫-80、司盤-85、油酸、膽酸鹽中的一種或多種。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述表面活性劑的用量是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接推導(dǎo)出其具體用量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述表面活性劑的用量為0.05-0.5g/ml，較好為0.1-0.4g/ml重量份，更好為0.15-0.25g/ml。通常，以所述噴霧劑的總重量計，所述表面活性劑的百分含量為5-20重量％，較好為7.5-15重量％，更好為10-12重量％。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述保護劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接推導(dǎo)出哪些保護劑可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑包括聚乙二醇類(例如PEG400等)和白蛋白中的一種或多種。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，所述保護劑選自P-環(huán)糊精及其衍生物、聚維酮、玻璃酸鈉、羥丙基甲基纖維素中的一種或多種。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述保護劑的用量是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接推導(dǎo)出其具體用量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑的用量為0.01-0.5g/ml，較好為0.02-0.3g/ml，更好為0.05-0.15g/ml。通常，以所述噴霧劑的總重量計，所述表面活性劑的百分含量為1-5重量％，較好為1.5-4重量％，更好為2-3重量％。其中，如果存在白蛋白的話，所述白蛋白的重量百分含量通常為0.001-0.05重量％，較好為0.005-0.03重量％，更好為0.008-0.02重量％，最好為0.01重量％。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述藥學(xué)上可接受的載體是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接推導(dǎo)出哪些藥學(xué)上可接受的載體可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑和緩沖液等。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述溶劑是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接得到哪些溶劑可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述溶劑包括短鏈醇(例如C1-C6醇，如乙醇、丙二醇等)。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述緩沖液是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接得到哪些緩沖液可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述緩沖液包括lOmmol的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述溶劑的用量是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接得到其具體用量。通常，所述溶劑的用量只要能溶解上述重組人表皮生長因子、表面活性劑和保護劑即可。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述溶劑的用量為0.001-lg/ml，較好為0.005-0.5g/ml，更好為0.01-0.2g/ml，最好為0.03-0.05g/ml。在本發(fā)明的噴霧劑中，所述緩沖液的用量是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以直接得到其具體用量。通常，所述緩沖液用于將所述重組人表皮生長因子的含量調(diào)節(jié)到所需的水平，例如0.5-20Ug/ml。在本發(fā)明中，所述噴霧劑包含傳遞體，且至少80%的所述傳遞體的粒徑是均一的，較好至少85%、至少90%、至少95%、至少99%的所述傳遞體的粒徑是均一的。本發(fā)明還提供了一種制備所述重組人表皮生長因子噴霧劑的方法，所述方法包括(a)用水溶解重組人表皮生長因子，并分散在保護劑中，得到溶液A;(b)用溶劑溶解表面活性劑，得到溶液B;(c)將溶液A加入到溶液B中，攪拌混勻得到溶液C;(d)將溶液C經(jīng)超聲霧化器在1.0-2.5MHz頻率下于10-6(TC超聲霧化后，通入正在攪拌的緩沖液中，或者，將溶液C加入緩沖液后再攪拌，得到的所述噴霧劑。在上述方法中，得到所述溶液A的步驟是常規(guī)的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，首先用去離子水溶解重組人表皮生長因子，并攪拌約4小時，得到溶液；然后將所得溶液分散于保護劑中，于40-5(TC攪拌4-8小時，得到所述溶液A。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，首先用去離子水溶解重組人表皮生長因子和一部分保護劑(例如白蛋白等)，同時攪拌約4小時，得到溶液；將所得溶液分散在剩余保護劑(例如PEG400等)中，于40-5(TC攪拌4-8小時，得到所述溶液A。在所述步驟(d)中，所述超聲霧化器的頻率通常為1.0-2.5MHz，較好為1.5-1.7MHz。另夕卜，超聲霧化的溫度通常為10-60°C，較好為15-50°C，更好為20-40°C。在所述步驟(d)中，攪拌所述緩沖液的攪拌器轉(zhuǎn)速并沒有具體限定，只要能將所述溶液C充分分散于緩沖液中即可。通常，所述轉(zhuǎn)速為10-100rpm，較好為20-80rpm，更好為50-75rpm。在上述方法中，所得噴霧劑的pH為5.0-7.0。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述pH為6.0-6.8，較好為6.2。下面結(jié)合實施例細說明本發(fā)明，這些實施例只是用于舉例說明的目的，并沒有限制本發(fā)明的范圍。實施例測試方法使用HORIBA公司的LA-950型號激光散射粒度分布測定儀測定傳遞體的粒徑及粒徑分布。使用1%磷鉬酸負染色制備樣品，通過透射電鏡觀測傳遞體的形態(tài)。rhEGF含量測定使用放射免疫分析藥盒(購自北京華清生化技術(shù)研究所)，利用均相競爭抑制原理，即抗hEGF抗體與1251-hEGF和EGF標(biāo)準(zhǔn)(或待測樣品)于4""C孵育24小時后，加入分離劑，離心棄上清液，用放射免疫Y計數(shù)器(購自上海核福光電儀器有限公司，SN-682型)測定放射性計數(shù)，根據(jù)logitB/BO-log標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中hEGF濃度。包封率的測定包封率測定通過葡聚糖凝膠柱色譜法測定，柱層析條件為SephadexG-50(17cmx3cm);洗脫液為lOmmol磷酸鹽緩沖液(pH6.2),流速1毫升/分鐘，溫度為室溫(25°C)。每3毫升收集一次層析液，測定rhEGF的含量，分別得經(jīng)柱分離出的載體包裹含藥量和總藥量，根據(jù)下列公式計算包封率。包封率X二經(jīng)柱分離的載體包裹含藥量/總藥量x100^體外透皮率的測定離體鼠皮的制備取體重為150-170g的SD大鼠，用8%的硫化鈉溶液背部脫毛，然后用生理鹽水洗凈皮膚，自然飼養(yǎng)24小時。次日實驗前處死，立即剝離腹部皮膚，接著分離皮下脂肪和組織。選用無破損的皮膚浸泡于生理鹽水中，置于冰箱內(nèi)冷藏(0—4°C)12小時后備用。離體透皮試驗將大鼠皮膚自然固定在改良的Franz擴散池上(擴散面積S=2.5cm2)，使皮膚表面面向給藥室，皮膚里層與接受液(即生理鹽水，接受池容積10ml)剛好接觸。將所述樣品均勻噴在鼠皮表面。將擴散池置于恒溫磁力攪拌器內(nèi)，使溫度控制在37土rC，轉(zhuǎn)速為30r'min—、攪拌12h后取接收液10ml。將所取得接收液用0.45nm的微孔濾膜過濾，進行rhEGF的含量測定，計算透皮量。透皮吸收率％=透皮量/給藥量><100%。實施例1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，并采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器于4(TC攪拌5小時，得到溶液A。將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司藥用注射級)和上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用乙醇(購自上海振興化工一廠藥用級)溶解，得溶液B。將溶液A加入溶液B中，經(jīng)78HW-1型磁力恒溫攪拌器于室溫攪拌1小時，采用NS1001L型高壓均質(zhì)機高壓均質(zhì)后，得到溶液C。將溶液C經(jīng)MDSIN大霧量型超聲波霧化器(型號M230852,霧化頻率1.5-1.7MHz，霧化溫度40°C)超聲霧化后，通入正在攪拌(H型電動攪拌機，上海瑞柯坤泰貿(mào)易有限公司)的磷酸鹽緩沖液中，待溶液C完全加入后再攪拌1小時。取樣測pH值(PHS-3C型pH計)，將pH值控制在5.0-7.0范圍內(nèi)。藥液經(jīng)囊式過濾器粗濾后，經(jīng)0.20pm微孔濾膜(購自PALL公司的無菌過濾膜)除菌，每瓶灌裝l(telml。實施例2重組人表皮生長因子噴霧劑(每1000瓶)(5000IU/ml)活性成分艦GF50mg表面活性劑卵磷脂1kg表面活性劑PluronicF-680.5kg溶劑丙二醇0.5kg保護劑PEG-4000.5kg保護劑白蛋白lg緩沖液lOmmol磷酸鹽緩沖液10L(pH6.2)加至用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后將該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器在5(TC下攪拌6小時，得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司藥用注射級)和上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例l。實施例3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后將該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器在45'C攪拌8小時，得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用注射級)和P上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用上述重量的丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例l。實施例4重組人表皮生長因子噴霧劑(每1000瓶)(5000IU/ml)活性成分艦GF50mg表面活性劑卵磷脂2kg溶劑丙二醇0.5kg保護劑PEG-4000.5kg保護劑白蛋白lg緩沖液lOmmol磷酸鹽緩沖液10L(pH6.2)加至用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后將該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器在47'C攪拌4小時，得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用注射級)用上述重量的丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例l。實施例5重組人表皮生長因子噴霧劑(每1000瓶)(5000IU/ml)活性成分rhEGF50mg表面活性劑卵磷脂2kg表面活性劑PluronicF-680.5kg溶劑丙二醇0.5kg保護劑PEG-4000.5kg緩沖液lOmmol磷酸鹽緩沖液10L(pH6.2)加至用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后將該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器在44'C攪拌7小時，得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用注射級)和P上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用上述重量的丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例1。實施例6<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>用水50ml溶解上述重量的rhEGF(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用注射級)和P上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用上述重量的丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例l。實施例7重組人表皮生長因子噴霧劑(每1000瓶)(2000IU/ml)活性成分rhEGF20mg表面活性劑卵磷脂1kg表面活性劑PluronicF-680.5kg溶劑丙二醇0.5kg保護劑PEG-4000.5kg保護劑白蛋白lg溶劑lOmmol磷酸鹽緩沖液亂(pH6.2)加至用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后將該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器在47'C攪拌4小時，得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用注射級)和P上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用上述重量的丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例l。實施例8重組人表皮生長因子噴霧劑(每1000瓶)(10000IU/ml)活性成分rhEGF廳mg表面活性劑卵磷脂1kg表面活性劑PluronicF-680.5kg溶劑丙二醇0.5kg保護劑PEG-4000.5kg保護劑白蛋白lg溶劑lOmmol磷酸鹽緩沖液10L(pH6.2)加至用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后將該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，釆用78HW-1型磁力恒溫攪拌器在47'C攪拌4小時，得到溶液A。再將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司，藥用注射級)和P上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用上述重量的丙二醇(購自上海浦順進出口有限公司，藥用級)溶解，得溶液B。其余步驟同實施例l。實施例l一8所得噴霧劑中傳遞體的粒徑分布數(shù)據(jù)見表1:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例9重組人表皮生長因子噴霧劑(每1000瓶)(5000IU/ml)活性成分艦GF50mg表面活性劑卵磷脂lkg表面活性劑PluronicF-680.5kg溶劑乙醇0.3kg保護劑PEG-4000.5kg保護劑人血白蛋白lg緩沖液lOmmol磷酸鹽緩沖液10L(pH6.2)加至用水50ml溶解上述重量的重組人表皮生長因子(購自中科院上海生物化學(xué)研究所)和上述重量的人血白蛋白(購自上海生物制品研究所)得到溶液，將所得溶液攪拌4小時。然后該溶液分散于上述重量的PEG400(購自北京市海淀會友化工，藥用級)中，并采用78HW-1型磁力恒溫攪拌器于4(TC攪拌5小時，得到溶液A。將上述重量的卵磷脂(購自上海太偉藥業(yè)有限公司藥用注射級)和上述重量的PluronicF-68(購自BASF公司)用乙醇(購自上海振興化工一廠藥用級)溶解，得溶液B。將溶液A加入溶液B中，經(jīng)78HW-1型磁力恒溫攪拌器于室溫攪拌1小時，采用NS1001L型高壓均質(zhì)機高壓均質(zhì)后，得到溶液C。將溶液C經(jīng)MDSIN大霧量型超聲波霧化器(型號M230852,霧化頻率1.5-1.7MHz，霧化溫度40°C)超聲霧化后完全加入磷酸鹽緩沖液中，然后再攪拌(H型電動攪拌機，上海瑞柯坤泰貿(mào)易有限公司)l小時。取樣測pH值(PHS-3C型pH計)，將pH值控制在5.07.0范圍內(nèi)。藥液經(jīng)囊式過濾器粗濾后，經(jīng)0.2(Vm微孔濾膜(購自PALL公司的無菌過濾膜)除菌，每瓶灌裝l(klml。實施例10制備工藝的確定如實施例1所示配方和方法制備重組人表皮生長因子噴霧劑，不同的是如下表2所示改變制備工藝。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由以上數(shù)據(jù)可見，實施例1和實施例9的制備工藝較傳統(tǒng)技術(shù)取得的效果好,而實施例1中的制備工藝較實施例9中的制備工藝更好，制備的傳遞體粒徑更均一。實施例11超聲霧化參數(shù)的確定如實施例1所示配方和方法制備重組人表皮生長因子噴霧劑，不同的是如下表3和4所示改變制備工藝。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>由上表3可知，當(dāng)采用超聲霧化法時，超聲強度不宜過大，當(dāng)強度超過2.5MHz時，所制備的傳遞體被部分破壞，包封率有所下降。另外，超聲強度不宜過小，當(dāng)強度小于1.0MHz時，傳遞體不能充分分散于緩沖液中，其粒徑有所增加。由上表4可知，當(dāng)采用超聲霧化法時，超聲霧化溫度不宜過高，當(dāng)溫度超過6(TC時，傳遞體的包封率明顯下降。實施例12表面活性劑的篩選如實施例1所示配方和方法制備重組人表皮生長因子噴霧劑，不同的是使用如下表5所示的表面活性劑。表5表明活性劑種類用量(wt%)包封率(％)透皮吸收率(％)磷脂15%12.533.63'磷脂:膽酸鈉腦:5%46.7420.35磷脂:PluronicF-68腦:5%55.9753.71磷脂:吐溫8010%:5%21.3317.84磷脂:司盤80腦:5%13.615.47磷脂:油酸鈉10%:5%17.158.64磷脂:聚氧乙烯蓖麻油腦:5%25.7213.69磷脂:十二烷基硫酸鈉腦:5%9.117.86如實施例1所示配方和方法制備重組人表皮生長因子噴霧劑，不同的是使用如下表6所示的表面活性劑及其用量。_表6表面活性劑種類用量(wt%)包封率(％)磷脂:PluronicF-6810%:5%55.97磷脂:PluronicF-6810%:10%58.63磷脂:PluronicF-685%:10%25.38透皮吸收率(％)53.7154.3339.52由上表可知，單獨使用磷脂作為表面活性劑，則透皮吸收率低；當(dāng)使用混合表面活性劑時，包封率和透皮吸收率最佳。另外，通過比較不同比例的混合表面活性劑(磷脂:PluronicF-68)制得的噴霧劑的包封率和透皮吸收率，發(fā)現(xiàn)磷脂:PluronicF-68之比優(yōu)選大于2:1。實施例13如實施例1所示配方和方法制備重組人表皮生長因子噴霧劑，不同的是使用如下表7所示的保護劑。_^_保護劑種類_不使用保護劑PEG-400人血白蛋白PEG-400+人血白蛋白零天包封率(％)41.6255.8443.1156.72保存時間活性測定(IU/瓶)0天5.05x1044.91x1045.16x1045.07x10440。C1個月3.43x1044.26x1044.08x1045.01x104由上表可知，PEG400和人血白蛋白對rhEGF都有保護作用。在高溫(例如40°C)條件下，能使rhEGF免受失活。而且，聯(lián)合使用PEG400和人血白蛋白的作用更佳。因此，加入保護劑(例如PEG400和人血白蛋白)后，可使重組人表皮生長因子噴霧劑的貯存穩(wěn)定性提高，從而克服了現(xiàn)有制劑需低溫貯存的缺陷。實施例14穩(wěn)定性實驗rhEGF噴霧劑經(jīng)穩(wěn)定性考驗后的活性測定考驗時間實施例70月l月2月3月6月9月12月18月活性測定，25。C2.012.111.941.992.051.972.091.92(xl03IU/ml)活性測定，40°C2.011.942.052.142,08-.....(xl03IU/ml)考驗時間實施例l0月l月2月3月6月9月12月18月活性測定，25°C5.154.974.654.724.765.164.754.83(xl03IU/ml)活性測定,40°C5.154.674.884.874.95--——(xl03IU/ml)考驗時間實施例80月l月2月3月6月9月12月18月活性測定，25。C10.139.8710.099.9110.039.9510.179.93(xl03IU/ml)活性測定，40°C10.1310.089.9410.119.84———(xl03IU/ml)考驗時間金因肽*0月l月2月3月6月9月12月18月2.111.922.051.961.651.321.040.752.111.731.641.210.94--*:深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司生產(chǎn)的rhEGF噴霧劑，其效價約為2000IU/ml活性測定25。C(xl03IU/ml)活性測定340。C(xl03IU/ml)金因肽噴霧劑規(guī)格為2000IU/ml，25'C時不到9個月效價下降了500IU/ml，40"C時不到3個月效價下降了500IU/ml。實施例7噴霧劑規(guī)格為2000IU/ml，在25"C和4(TC下保存，效價幾乎沒有下降，效價范圍在5000±500IU/ml內(nèi)。實施例1和實施例8噴霧劑規(guī)格分別為5000IU/ml和10000IU/ml，在25"C和4(TC下保存后，效價幾乎沒有下降，效價變化范圍在士500IU/ml內(nèi)。由以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的rhEGF噴霧劑在25。C保存18個月，和在40"C下保存6個月，各項指標(biāo)與O月比較無顯著差異，從而表明本發(fā)明的rhEGF噴霧劑在25"C溫度可以穩(wěn)定保存至少18個月，在4(TC溫度可以穩(wěn)定保存至少6個月。而金因肽貯存條件為2-8'C，在25'C和4(TC下貯存時，效價明顯下降。因此，與市售產(chǎn)品相比，本產(chǎn)品在常溫下貯存穩(wěn)定，方便貯存使用。實施例15:治療燒傷的效果1.試驗對象使用健康成年SD大鼠，體重200260g，雌雄各半。2.動物模型及實驗分組使用5只大鼠為正常對照組。另取136只大鼠于實驗前1天進行背部脫毛，實驗當(dāng)天用25g/L戊巴比妥鈉溶液麻醉(35mg/kg)，并用8(TC熱水浸燙15秒，每組大鼠背部脊柱兩測對稱部位各制作2個直徑約為2cm的圓形深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面，其中左側(cè)為L區(qū)，右側(cè)為R區(qū)，通過病理切片進行證實為(以下稱燒傷)。燒傷后立即向腹腔內(nèi)注射乳酸鈉林格液5ml。大鼠燒傷后分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。按創(chuàng)面處理方法的不同將大鼠隨機分為4組。不同創(chuàng)面處理方法分組分組試驗區(qū)代碼處理方法給藥均為600IU或等量鹽水大鼠數(shù)量(只)A組對照區(qū)AL無菌等滲鹽水34給藥區(qū)AR實施例1所得噴霧劑B組對照給藥區(qū)BL金因肽34給藥區(qū)BR實施例1所得噴霧劑C組及時給藥區(qū)CL創(chuàng)面?zhèn)罅⒓从媒鹨螂挠盟?4延遲給藥區(qū)CR創(chuàng)面?zhèn)蟮?天用金因肽用藥D組及時給藥區(qū)DL創(chuàng)面?zhèn)罅⒓从脤嵤├脟婌F劑用藥34延遲給藥區(qū)DR創(chuàng)面?zhèn)蟮?天用實施例所得噴霧劑用藥各組創(chuàng)面清創(chuàng)后，除敷料上使用的藥物不同外其余處理相同，均在無菌操作下進行，每天換藥1次直至創(chuàng)面愈合。3.標(biāo)本采集在傷后第7、10、14天，分別取創(chuàng)面組織標(biāo)本，每組每個時相點各8只大鼠。創(chuàng)面標(biāo)本存放于-8(TC冰箱待用。4.檢測指標(biāo)創(chuàng)面愈合時間和創(chuàng)面愈合率(1)每組10只大鼠，每天觀察創(chuàng)面愈合情況，以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合時間的依據(jù)。(2)每組于傷后第7、10、14天采用透明膠片描記加稱重法測定局部創(chuàng)面面積，按下列公式計算創(chuàng)面愈合率=((原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積)X100%。5.結(jié)果5丄創(chuàng)面愈合率統(tǒng)計結(jié)果傷后不同時間各組大鼠創(chuàng)面愈合率的比較(％，^土s)試驗組鼠數(shù)(只)傷后時間(天)71014A組AL826.2±3.139.1±4.258.2±2.7AR843.4±2.5△61.7士4.7A81.5土5.6AB組BL833.8±2.643.5±4.369.1±5.5BR844,2±2.9△63.8±3.6△84.9±7.1△C組(X833.1±3.443.2±4.467.7±4.5CR832.7±3.142.4±4.868.5±5.2D組DL843.7±3.162.4±3.983.2±4.9DR836.2±3.4△51.6士2.8A72.6±5.3△注與自身對照創(chuàng)面比較，A0.05》P〉0.01分析A組和B組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)rhEGF噴霧劑用藥組創(chuàng)面與對照創(chuàng)面相比，各時相點創(chuàng)面愈合面積百分比明顯增加，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異。而且本發(fā)明的rhEGF噴霧劑比市售產(chǎn)品各時相點創(chuàng)面愈合面積百分比明顯增加，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異。分析C組和D組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)燒傷后立即或傷后第5天開始使用rhEGF，市售產(chǎn)品中兩者在促進創(chuàng)面愈合的作用上無明顯區(qū)別，而本發(fā)明的rhEGF噴霧劑燒傷后立即用藥比傷后第5天開始用藥有顯著差別。5.2.不良反應(yīng)觀察本試驗過程中，觀察到的不良反應(yīng)情況如下表。試驗組咳嗽昏厥L側(cè)R側(cè)A組0000B組1010C組2132D組0000與市售產(chǎn)品相比，本發(fā)明rhEGF噴霧劑的皮膚滲透力強，在深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合早期也能起到快速促進皮膚愈合的作用，利于縮短創(chuàng)面愈合的時間。另外，與市售產(chǎn)品相比，本發(fā)明rhEGF噴霧劑的不良反應(yīng)較少。權(quán)利要求1.一種重組人表皮生長因子噴霧劑，它包括重組人表皮生長因子、表面活性劑、保護劑以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述噴霧劑包含傳遞體，且至少80％的傳遞體的粒徑是均一的。2.如權(quán)利要求1所述的噴霧劑，其特征在于至少85%、較好至少90%、更好至少95%、最好至少99%的所述傳遞體的粒徑是均一的。3.如權(quán)利要求1所述的噴霧劑，其特征在于所述重組人表皮生長因子的用量是0.5-20ug/ml，較好為l-15"g/ml，更好為2-10ug/ml。4.如權(quán)利要求l所述的噴霧劑，其特征在于所述表面活性劑包括磷脂類(例如卵磷脂等)、聚氧乙烯氧丙烯共聚物類(例如PluronicF-68等)、吐溫-80、司盤-85、油酸、膽酸鹽中的一種或多種。5.如權(quán)利要求1所述的噴霧劑，其特征在于所述表面活性劑的用量為0.05-0.5g/ml，較好為0.1-0.4g/ml，更好為0.15-0.25g/ml。6.如權(quán)利要求l所述的噴霧劑，其特征在于所述保護劑包括聚乙二醇類(例如PEG400等)、白蛋白、(3-環(huán)糊精及其衍生物，聚維酮，玻璃酸鈉，羥丙基甲基纖維素中的一種或多種。7.如權(quán)利要求1所述的噴霧劑，其特征在于所述保護劑的用量為0.01-0.5g/ml，較好為0.02-0.3g/ml，更好為0.05-0.15g/ml。8.—種制備所述重組人表皮生長因子噴霧劑的方法，所述方法包括(a)用水溶解重組人表皮生長因子，并分散在保護劑中，得到溶液A;(b)用溶劑溶解表面活性劑，得到溶液B;(c)將溶液A加入到溶液B中，攪拌混勻得到溶液C;(d)將溶液C經(jīng)超聲霧化器在1.0-2.5MHz頻率下于10-6(TC超聲霧化后，通入正在攪拌的緩沖液中，或者，將溶液C加入緩沖液后再攪拌，得到的所述噴霧劑。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述超聲霧化的頻率為1.5-1.7MHz;和/或，超聲霧化的溫度為15-50°C，更好為20-40'C。10.—種由權(quán)利要求8所述方法制備的重組人表皮生長因子噴霧劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種重組人表皮生長因子噴霧劑，它包括重組人表皮生長因子、表面活性劑、保護劑以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述噴霧劑包含傳遞體，且至少80％的傳遞體的粒徑是均一的。本發(fā)明還提供了制造上述噴霧劑的方法。文檔編號A61K9/12GK101209242SQ20061014797公開日2008年7月2日申請日期2006年12月26日優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日發(fā)明者周明慧,夏凌云,潘鄰霖,陳彬華,原高申請人:信誼藥廠