專利名稱：：高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年，心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前中國(guó)有高血壓患者l億多人，冠心病患者一千多萬(wàn)。心血管疾病逐漸成為危害人民健康的"第一殺手"。尋找和研制有效的心血管疾病治療藥一直是藥物研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥在本領(lǐng)域己顯示了很強(qiáng)的優(yōu)越性，其中較為著名的是丹參及其制劑。丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥之一,有長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。丹參注射液是臨床上治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞、缺血性中風(fēng)等疾病的常用藥物。本發(fā)明人開(kāi)展了丹參的水溶性成分的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)丹參的水溶性有效成分均以鹽的形式存在于生藥材中，這些成分主要為丹參乙酸鎂及其同系物紫草酸鎂、迷迭香酸鈉、丹參乙酸二鉀、異丹參乙酸二鉀、丹參素鉀和紫草酸二鉀等。通過(guò)活性篩選和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丹參乙酸鎂和它的同系物均為活性成分，其中以丹參乙酸鎂藥理作用最強(qiáng)，它是丹參的主要活性成分，并首次闡明以丹參乙酸鎂為主要成分的多酚酸鹽是丹參中最重要的有效活性部位，本發(fā)明人已申報(bào)專利200510028740.7。經(jīng)本發(fā)明人進(jìn)一步研究，丹參多酚鹽除了目前臨床用于治療冠心病等癥狀之處，又發(fā)現(xiàn)了它用于治療腦缺血和缺氧等的新適應(yīng)癥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究設(shè)計(jì)高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人將高含量丹參多酚酸鹽5mg/kg大鼠靜脈給藥后，對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷造成局部腦缺血模型的梗塞面積較生理鹽水組減小(P<0.05)。高含量丹參多酚酸鹽10、20mg/kg組能顯著減小大鼠局部腦缺血造成的腦梗塞面積(PO.Ol)。另外將沙土鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注可造成全腦缺血再灌模型，靜脈注射高含量丹參多酚酸鹽5、10mg/kg組沙土鼠分別在缺血再灌注6h、24h和2h的行為學(xué)評(píng)分明顯低于生理鹽水組評(píng)分(P0.05)。高含量丹參多酚酸鹽20mg/kg組在2h、24h評(píng)分明顯低于同時(shí)間生理鹽水組評(píng)分(P0.05)，在4、6h評(píng)分與生理鹽水組相比有顯著差異(PO.Ol)。高含量丹參多酚酸鹽能降低沙土鼠在缺血再灌注24h累積死亡率。本發(fā)明人又取小鼠分別單次靜脈注射高含量丹參多酚酸鹽10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg以及燈盞細(xì)辛注射液22.5mg/kg，5分鐘后觀察各組小鼠低壓缺氧的存活時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果高含量丹參多酚酸鹽和燈盞細(xì)辛注射液對(duì)低壓缺氧小鼠存活時(shí)間的延長(zhǎng)作用有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本發(fā)明人還將高含量丹參多酚酸鹽(12.5-400(ig/ml)對(duì)去甲腎上腺素誘發(fā)的兔基底動(dòng)脈血管環(huán)收縮反應(yīng)具有較顯著的舒張作用，EC50值為58.5pg/ml。同時(shí)在缺氧24hr復(fù)氧4hr后，PC-12細(xì)胞受到損傷，高含量丹參多酚酸鹽100、300、1000pg/ml可以明顯改善細(xì)胞活力，對(duì)于PC-12細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有一定的保護(hù)作用。因此上述結(jié)果表明高含量丹參多酚酸鹽具有治療腦缺血、缺氧的新適應(yīng)癥。本發(fā)明的高含量丹參多酚酸鹽是通過(guò)下列方法制備的(1)丹參煎煮提取丹參藥材粉碎后，依次以丹參生藥重量的4倍量、2倍量和2倍量的水先后煎煮三次，每次2小時(shí)，合并三次提取液，冷至室溫，離心過(guò)濾，濾液備用；(2)樹脂分離將濾液緩緩流過(guò)裝有丹參生藥重量的3倍量的1300—1大孔樹脂吸附柱，吸附完畢后，先用丹參生藥重量的6倍量水洗去糖、蛋白質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽；再以丹參生藥重量的6倍量20%乙醇除去非丹參乙酸鹽的丹參多酚酸鹽類化合物，用薄層檢測(cè)控制收集富含丹參乙酸鹽的50%乙醇洗脫液；(3)二次醇沉將富含丹參乙酸鹽的50%乙醇洗脫液，減壓濃縮至1/10的丹參生藥量后，攪拌下徐徐加入9/10丹參生藥量的無(wú)水乙醇，靜置兩小時(shí)后，離心棄去沉淀；濾液濃縮至l/20的丹參生藥量后，加入相當(dāng)于19/20丹參生藥量的無(wú)水乙醇，靜置兩小時(shí)，作為第二次醇沉，離心棄去沉淀，濾液減壓濃縮至干，制得高含量丹參多酚酸鹽；(4)高含量丹參多酚酸鹽粉針劑制備-高含量丹參多酚酸鹽粉末溶于40倍量水，通過(guò)0.2-0.4iim的超濾膜，濾液灌裝于瓶?jī)?nèi)，冷凍千燥后即得產(chǎn)品。上述高含量丹參多酚酸鹽粉針劑，其特征在于該粉針劑中丹參乙酸鎂的含量為50%-95%，多酚酸鹽有效部位含量近100%。其中所述步驟(2)的樹脂為1300-1大孔樹脂、D101型、AB-8型或RA型樹脂。本發(fā)明首次公開(kāi)了高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血缺氧藥物中的應(yīng)用。所述的藥物是以高含量丹參多酚酸鹽為活性成份與藥用載體組成的注射劑。在臨床上有較大的應(yīng)用價(jià)值。圖1.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)去甲腎上腺素或氯化鉀誘導(dǎo)收縮的兔腦基底動(dòng)脈血管的舒張作用。圖2.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)缺氧復(fù)氧后PC-12細(xì)胞LDH釋放率的影響。具體實(shí)施例方式實(shí)施l.對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷造成局部腦缺血模型的治療作用試驗(yàn)?zāi)康挠^察高含量丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷造成局部腦缺血模型的影響。受試藥物名稱高含量丹參多酚酸鹽(原料藥)提供單位上海綠谷制藥有限公司批號(hào)050701含量含丹參乙酸鎂為81.1%配制方法高含量丹參多酚酸鹽原料藥用生理鹽水分別配成5、10、20mg/ml，臨用時(shí)新鮮配制。對(duì)照樣品名稱燈盞細(xì)辛注射液提供單位云南省生物制藥廠批號(hào)20041224含量含總黃酮45mg(10ml/支)性狀棕色澄明液體動(dòng)物來(lái)源，種屬，品系Wistar大鼠，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003，飼養(yǎng)合格證號(hào)SYXK(滬)2003-0029。體重280土20g性別$動(dòng)物總數(shù)50只試驗(yàn)方法大鼠用7%水合氯醛(400mg/kg，ip)麻醉后，仰位固定于手術(shù)板上。頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)至暴露頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)分支，仔細(xì)分離ECA并將其枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈分支用電凝器電凝并剪斷，分離到舌動(dòng)脈和頜動(dòng)脈分叉處結(jié)扎；分離ICA并將其顱外段唯一分支翼腭突動(dòng)脈(Pterygopalatine)結(jié)扎。用動(dòng)脈夾夾住ECA自CCA發(fā)出的起始處，在ECA遠(yuǎn)端靠結(jié)扎處剪開(kāi)小口，插入一根直徑為0.26111111的尼龍絲并疏松結(jié)扎，剪斷ECA;以鑷子夾住ECA斷端并拉直使尼龍絲在ICA部分的長(zhǎng)度應(yīng)為22mm左右，說(shuō)明尼龍絲已到達(dá)ICA分支到大腦中動(dòng)脈(MCA)處，阻斷了MCA的血液供應(yīng)；將尼龍絲固定后，縫合手術(shù)切口，同時(shí)給予生理鹽水或試藥。缺血6h后，將大鼠斷頭處死，迅速取出大腦，去除小腦和腦干后用4。C生理鹽水沖洗，去血污。將大腦自后向前切為厚度為2mm的冠狀切片，立即置于2XTTC生理鹽水中，避光37'C孵育30min。然后用10%中性甲醛固定已染色腦片1h。未受損的腦組織染為紅色，梗塞區(qū)則因線粒體損害而不染色，呈白色。將腦片拍照掃描，用計(jì)算機(jī)輔助圖象分析儀(T一90)按求不規(guī)則圖形面積法測(cè)出每片腦片面積及梗塞區(qū)的面積，計(jì)算出梗塞灶的面積占總面積的百分比。劑量設(shè)置本品擬推薦臨床劑量為100—200mg/次靜脈滴注，按人體重70kg計(jì)算，最大臨床劑量為1.4—2.8mg/kg/天；按大鼠體表面積折算相應(yīng)劑量為6_12mg/kg，故本試驗(yàn)中低劑量設(shè)為5mg/kg，低、中、高劑量之比為l:2:4，相應(yīng)的中、高劑量分別為10和20mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照用燈盞細(xì)辛注射液，劑量為15mg/kg。另設(shè)生理鹽水對(duì)照組。每組動(dòng)物數(shù)Wistar大鼠10只。溶劑對(duì)照靜脈注射生理鹽水按0.1ml/100g給藥。給藥途徑靜脈注射給藥。給藥次數(shù)均單次給藥。觀察指標(biāo)及觀察時(shí)間觀察腦片總面積，梗塞灶面積，梗塞灶面積/腦片總面積之比。觀察時(shí)間為給藥后6小時(shí)。數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用^土SD表示，Student/test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果生理鹽水對(duì)照組腦局灶性梗塞灶面積為117.5±30.0，梗塞灶面積/腦片總面積比值為0.192±0.045。高含量丹參多酚酸鹽5mg/kg靜脈給藥后，其腦局灶性梗塞灶面積為96.8±30.0(與對(duì)照組比較P>0.05)，梗塞灶面積/腦總面積比值為0.146±0.043,較生理鹽水組降低(P<0.05)。高含量丹參多酚酸鹽10、20mg/kg組能顯著減小大鼠局部腦缺血造成的腦梗塞面積(PO.Ol)。見(jiàn)表l和圖l。結(jié)論高含量丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠局部腦缺血造成的腦梗塞有治療作用。表1.高賴丹參多酚鵬靜脈注麟藥對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷模型的影響(x土SD，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*P〈0.05，**P〈0.01與生理鹽水組比較實(shí)施2.對(duì)沙土鼠雙側(cè)總動(dòng)脈結(jié)扎再灌注^全腦缺血模型的治療作用試驗(yàn)?zāi)康挠^察高含量丹參多酚酸鹽對(duì)沙土鼠缺血再灌模型的影響受試藥物名稱高含量丹參多盼酸鹽(原料藥)提供單位上海綠谷制藥有限公司批號(hào)050701含量含丹參乙酸鎂為81.1%。配制方法高含量丹參多酚酸鹽原料藥用生理鹽水分別配成5、10、20mg/ml，臨用時(shí)新鮮配制。對(duì)照樣品名稱燈盞細(xì)辛注射液提供單位云南省生物制藥廠批號(hào)20041224含量含總黃酮45mg(10ml/支)性狀棕色澄明液體動(dòng)物來(lái)源，種屬，品系沙土鼠，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003，飼養(yǎng)合格證號(hào)SYXK(滬)2003-0029。體重70士15g性別$動(dòng)物總數(shù)50只試驗(yàn)方法沙土鼠用乙醚麻醉后，切開(kāi)頸中線皮膚，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈20min后，進(jìn)行再灌注，同時(shí)給藥。在手術(shù)過(guò)程中及未清醒以前，將沙土鼠置于加熱板上保持體溫在37°C。沙土鼠缺血再灌注行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表l.沙土鼠缺血再灌注模型行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>劑量設(shè)置本品擬推薦臨床劑量為100—200mg/次靜脈滴注，按人體重70kg計(jì)算，最大臨床劑量為1.4一2.8mg/kg/天；按大鼠體表面積折算相應(yīng)劑量為6—12mg/kg，故本試驗(yàn)中低劑量設(shè)為5mg^cg，低、中、高劑量之比為l:2:4，相應(yīng)的中、高劑量分別為10和20mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照用燈盞細(xì)辛注射液，劑量為15mg/kg。另設(shè)生理鹽水對(duì)照組。每組動(dòng)物數(shù)沙土鼠10只。溶劑對(duì)照靜脈注射生理鹽水按0.1ml/100g給藥。給藥途徑靜脈注射給藥。給藥次數(shù)均單次給藥。觀察指標(biāo)及觀察時(shí)間分別觀察生理鹽水組和給藥組動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分及累積死亡數(shù)。觀察時(shí)間分別為缺血再灌注后2，4，6，24小時(shí)。數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)行為學(xué)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)用^士SD表示，Mann-WhitneyUtest進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；累積死亡率用％表示，卡方檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果缺血再灌注后對(duì)照組或試藥組分別靜脈注射生理鹽水和試藥。高含量丹參多酚酸鹽5、10mg/kg組沙土鼠分別在缺血再灌注6h、24h和2h的行為學(xué)評(píng)分明顯低于生理鹽水組評(píng)分(P0.05)。高含量丹參多酚酸鹽20mg/kg組在2h、24h評(píng)分明顯低于同時(shí)間生理鹽水組評(píng)分(P0.05),在4、6h評(píng)分與生理鹽水組相比有顯著差異(PO.Ol)。高含量丹參多酚酸鹽能降低沙土鼠在缺血再灌注24h累積死亡率，但無(wú)顯著性差異。陽(yáng)性對(duì)照燈盞細(xì)辛注射液1.5mg/kg組沙土鼠在缺血再灌注2h、4h、6h的行為學(xué)評(píng)分與生理鹽水組相比有明顯差異(P0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2和3。結(jié)論高含量丹參多酚酸鹽對(duì)沙土鼠缺血再灌注造成全腦缺血損傷有保護(hù)作用。表2.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)沙土鼠，后行為學(xué)評(píng)分的影響(x土SD)組別劑量(mg/kg)鼠數(shù)給藥后時(shí)間(h)(只)24624生理鹽7jC對(duì)照0.1ml/100g106.7±6.68.3±8.112.4±8314.7±8.6高含量丹參多酚酸鹽102肚1.42肚1.14.8±5.7*5.6±7.7*10102.3±1.4*3.1±2.26.5±7.66.9±7.020101紙3*2.3±2.2**2.0±2.3**5.4±7.8*燈盞細(xì)辛注射液15102.6±2.2*3.0±2.8*4紙8*7.6±8.6*P<0.05，**P<0.01與生理鹽水組比較表3.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)沙土鼠缺血，后的累積死亡率的影響組別劑量鼠數(shù)_給藥后時(shí)間(h)生理鹽水對(duì)照0.1ml/100g1010%30%50%70%高含量丹參多酚酸鹽5100010%20%10100010%20%20100010%30%燈盞細(xì)辛注射液15100010%30%*P<0.05與生理鹽水組比較實(shí)施3.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)小鼠低壓缺氧能力的影響試驗(yàn)?zāi)康挠^察藥物對(duì)小鼠低壓缺氧存活時(shí)間的影響。受試藥物名稱高含量丹參多酚酸鹽(原料藥)提供單位上海綠谷制藥有限公司批號(hào)050701含量含丹參乙酸鎂為81.1%。配制方法高含量丹參多酚酸鹽原料藥用生理鹽水分別配成l、2、4mg/ml，臨用時(shí)新鮮配制。對(duì)照樣品名稱燈盞細(xì)辛注射液提供單位云南省生物制藥廠批號(hào)20041224含量含總黃酮45mg(10ml/支)性狀棕色澄明液體空白對(duì)照注射用生理鹽水動(dòng)物來(lái)源，品系，種屬昆明種小鼠，由中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)合格i正號(hào):SYXK(滬)2003—0029體重1820g性別$動(dòng)物總數(shù)78只試驗(yàn)方法將給藥組4只小鼠與對(duì)照組1只小鼠放入密封玻璃容器，負(fù)壓為0.6kPa(358mbar)，觀察小鼠呼吸停止作為死亡，以秒表記錄小鼠存活時(shí)間。劑量設(shè)置本品擬推薦臨床劑量為100—200mg/次靜脈滴注，按人體重70kg計(jì)算，最大臨床劑量為1.4—2.8mg/kg/天；按大鼠體表面積折算相應(yīng)劑量為13—26mg/kg,故本試驗(yàn)中低劑量設(shè)為10mg/kg，低、中、高劑量之比為l:2:4，相應(yīng)的中、高劑量分別為20和40mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照用燈盞細(xì)辛注射液，劑量為22.5mg/kg。另設(shè)生理鹽水對(duì)照組。每組動(dòng)物數(shù)15-16只給藥途徑單次靜脈給藥觀察指標(biāo)和觀察時(shí)間單次靜脈注射后5分鐘進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠低壓缺氧時(shí)的存活時(shí)間。數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用^土5Z表示，Studentttest進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果高含量丹參多酚酸鹽和燈盞細(xì)辛注射液對(duì)低壓缺氧小鼠存活時(shí)間的延長(zhǎng)作用有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表l。表l.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)小鼠低壓缺氧存活時(shí)間的影響組另u齊u量(mg/kg，iv)小鼠數(shù)存活時(shí)間(秒)空白對(duì)照組0.1ml/10g15777±332高含量丹參多酚酸10151736±693"20161674±576**40161605±841**燈盞細(xì)辛注射液22.5161423±779**結(jié)論高含量丹參多酚酸鹽對(duì)低壓缺氧小鼠存活時(shí)間有顯著延長(zhǎng)作用。實(shí)施4.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)兔基底動(dòng)脈血管環(huán)張力的影響試驗(yàn)?zāi)康挠^察高含量丹參多酚酸鹽對(duì)腦血管環(huán)張力的作用。受試藥物名稱高含量丹參多酚酸鹽(原料藥)提供單位上海綠谷制藥有限公司批號(hào)050701含量含丹參乙酸鎂為81.1%。配制方法高含量丹參多酚酸鹽原料藥用蒸餾水分別配成5、10、20mg/ml，臨用時(shí)新鮮配制。實(shí)驗(yàn)藥品和試劑去甲腎上腺素(購(gòu)自Sigma公司)用蒸餾水臨用時(shí)新鮮配制。戊巴比妥鈉(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)用生理鹽水配制。氯化鉀等其它試劑均為市售分析純。動(dòng)物來(lái)源，種屬，品系新西蘭兔，由上海和平特種動(dòng)植物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2004-0004，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所動(dòng)物詞養(yǎng)合格證號(hào)SYXK(滬)2003-0029。體重23kg性別3動(dòng)物總數(shù)10只實(shí)驗(yàn)方法及步驟兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后，頸動(dòng)脈放血，迅速開(kāi)顱取出基底動(dòng)脈，放置于盛有K-H液培養(yǎng)皿中，剔去結(jié)締組織后制成長(zhǎng)2mm動(dòng)脈環(huán)，置于37'C恒溫的灌流浴槽中，持續(xù)通含有95%02+5%<:02混合氣體，血管張力信號(hào)經(jīng)張力換能器輸入PowerLab系統(tǒng)(ADInstruments)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析處理與處理。給予前負(fù)荷0.3g，動(dòng)脈環(huán)平衡1.52.0h，每20min更換一次新鮮K-H液。在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，加入60mo1/LKC1檢驗(yàn)血管環(huán)的反應(yīng)性(反復(fù)刺激23次)，收縮良好的用于實(shí)驗(yàn)。兔基底動(dòng)脈血管,分別以去甲腎上腺素(NA)、KC1預(yù)收縮后給予不同劑量的高含量丹參多酚酸鹽觀察其張力變化，并計(jì)算EQo值。觀察指標(biāo)記錄血管張力，以誘導(dǎo)劑(KC1或NA)引起收縮張力為100%效應(yīng)，以加入試藥后血管張力值計(jì)算血管張力百分率(％)。數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用^士&D表示，Studentftest進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果高含量丹參多酚酸鹽對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)兔腦基底動(dòng)脈血管收縮的影響記錄靜息動(dòng)脈環(huán)張力后，加入5-10mo1/L去甲腎上腺素收縮至最大值。累計(jì)加入12.5、25、50、100、200和400嗎/ml高含量丹參多酚酸鹽，描記量效曲線，計(jì)算其EC5o值為58.5pg/ml(結(jié)果見(jiàn)表l，圖1)。高含量丹參多酚酸鹽對(duì)氯化鉀誘導(dǎo)兔腦基底動(dòng)脈血管收縮的影響記錄靜息動(dòng)脈環(huán)張力后，加入KC160mol/L收縮至最大值。向浴槽中以累計(jì)濃度方式加入IOO、200、400和800)Ltg/ml高含量丹參多酚酸鹽，觀察藥物的量效關(guān)系，經(jīng)計(jì)算，EC5o值為1839pg/ml(結(jié)果見(jiàn)表2，圖l)。結(jié)論高含量丹參多酚酸鹽濃度依賴性地舒張基底動(dòng)脈血管，對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的血管收縮具有顯著的拮抗作用。表1.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)收縮后的腦基底動(dòng)脈血管張力變化(n=10)高含量丹參多酚血管張力百分率對(duì)照組血管張力百分率酸鹽(嗎/ml)(%)(蒸餾水nl)(%)12.582.07±10.35*12.596.56±8.042570.23±17.06**2592.96士10.815063.58±19.31**5096.20±9.2010041.87±19.08**10088.00±12.5120027.21士24.01"200訓(xùn)8±10.354004.15±6.77**40086.67±10.99高含量丹參多酚酸鹽各濃度與相應(yīng)等體積蒸餾水對(duì)照組相比*P<0.05,**P<0.01.表2.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)氯化鉀誘導(dǎo)收縮后的腦基底動(dòng)脈血管張力變化(n=10)_藥物濃度(^g/ml)_血管張力百分率(％)10096.0±19.620093.2±19.940087.9±22.280068.1±20.5*一次給蒸餾水800nl實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血管張力百分率為98.98±9.94%。高含量丹參多酚酸鹽各濃度與此值相比*P<0.05.實(shí)施5.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)缺氧復(fù)氧后誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞損傷的影響試驗(yàn)?zāi)康挠^察丹參酚酸鹽對(duì)缺氧復(fù)氧后PC-12細(xì)胞損傷的影響受試藥物名稱高含量丹參多酚酸鹽(原料藥)提供單位上海綠谷制藥有限公司批號(hào)050701含量含丹參乙酸鎂為81.1%。配制方法高含量丹參多酚酸鹽原料藥用生理鹽水分別配成5、10、20mg/ml，臨用時(shí)新鮮配制。細(xì)胞來(lái)源，種屬，品系大鼠嗜鉻腎上腺細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC-12)。由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所神經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)方法及步驟(1)PC-12細(xì)胞用含10%小牛血清，5%馬血清的DMEM在37°C，5%0)2濕熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2天的單層PC-12經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化液消化后，種在24孔板上，密度為105ceUs/ml。隨機(jī)分為8組①正常對(duì)照組，②損傷對(duì)照組，③一⑧高含量丹參多酚酸鹽3、10、30、100、300、1000ng/ml各濃度組。24h后，用D-Hanks液(NaCl8.00g/l，KC10.40g/l，Na2HP04.H200.06g/l，KH2HP040.06g/l，NaHC030.35g/1,Phenolred0.02g/1)漂洗2次，孵育在含1%BSA的290fiL含1%BSA的Krebs液(NaCl120mM，KC15.6mM,MgS041.2mM，NaH2P041.2mM，NaHC0325mM,glucose10mM，CaCl22.5mM)中。正常對(duì)照組在正常條件下培養(yǎng)28hr，其他組置于37"密閉的有機(jī)玻璃盒中充95。/。N2+5。/。C02混合氣缺氧培養(yǎng)。24hr后，損傷對(duì)照組不加藥，給藥組中加入高含量丹參多酚酸鹽，終濃度分別為1000，300，100，30，10和3pg/rnl，各組終體積為300nL，不足者以含1%BSA的Krebs液補(bǔ)足。再?gòu)?fù)氧(21%02)(2)LDH的釋放率檢測(cè)空白組標(biāo)準(zhǔn)組樣品組2|xml/ml丙酮酸20|xl蒸餾水70|il5(^1各樣品基質(zhì)緩沖液250^1250^1輔酶I溶液混勻，37"水浴15min2，4二硝基苯肼溶液250^1250pl混勻，37。C水浴15min0.4mol/LNaOH溶液250(^12500pl混勻，室溫放置3min440腿，lcm光徑測(cè)定吸光度A440LDH活力(U/L)=[(Sample-Blank)/(Standard-Blank)l*2nmol/ml*1000ml20^150)^12500jxl計(jì)算公式LDH釋放率=胞外LDH/(胞內(nèi)LDH+胞外LDH)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用^tSD表示，StudenUtest進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺氧復(fù)氧對(duì)PC-12細(xì)胞造成顯著損傷，損傷組LDH釋放率較正常組增加24%(PO.01);高含量丹參多酚酸鹽(3—1000嗎/ml)表現(xiàn)濃度依賴性的降低PC-12細(xì)胞LDH釋放率的作用，濃度為100、300、1000|ig/ml時(shí)，細(xì)胞LDH釋放率分別為0.410±0.025(P<0.05)、0.388±0.029(P<0.01)、0.382±0.028(P<0.01)。提示高含量丹參多酚酸鹽可以減輕細(xì)胞損傷，對(duì)于PC-12細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有一定的保護(hù)作用。結(jié)論高含量丹參多酚酸鹽能抑制PC-12細(xì)胞因缺氧復(fù)氧引起的LDH釋放率的升高，對(duì)缺氧復(fù)氧引起的PC-12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。表3.高含量丹參多酚酸鹽對(duì)缺氧復(fù)氧后PC-12細(xì)胞LDH釋放率的影響(n=6)組別_LDH釋放率_正常對(duì)照組(常氧)0.355±0.019損傷對(duì)照組(缺氧復(fù)氧)缺氧復(fù)氧+高含量丹參多酚酸鹽3pg/ml缺氧復(fù)氧+高含量丹參多酚酸鹽lOpg/ml缺氧復(fù)氧+高含量丹參多酚酸鹽30pg/ml缺氧復(fù)氧+高含量丹參多酚酸鹽100pg/ml缺氧復(fù)氧+高含量丹參多酚酸鹽300pg/ml缺氧復(fù)氧+高含量丹參多酚酸鹽1000|ag/ml0.440±0.01,0.435±0.0160.419±0.0200.416±0.0350.410±0.025*0.388±0,029**0.382±0.028**與正常對(duì)照組比較弁弁PO.01;與損傷對(duì)照組比較*PO.05;**P<0.01,權(quán)利要求1.一種高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的高含量丹參多酚酸鹽是通過(guò)下列方法制備的-(1)丹參煎煮提取-丹參藥材粉碎后，依次以丹參生藥重量的4倍量、2倍量和2倍量的水先后煎煮三次，每次2小時(shí)，合并三次提取液，冷至室溫，離心過(guò)濾，濾液備用；(2)樹脂分離-將濾液緩緩流過(guò)裝有丹參生藥重量的3倍量的1300"I大孔樹脂、D101型、AB-8型或RA型樹脂吸附柱，吸附完畢后，先用丹參生藥重量的6倍量水洗去糖、蛋白質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽；再以丹參生藥重量的6倍量20%乙醇除去非丹參乙酸鹽的丹參多酚酸鹽類化合物，用薄層檢測(cè)控制收集富含丹參乙酸鹽的50%乙醇洗脫液；(3)二次醇沉將富含丹參乙酸鹽的50%乙醇洗脫液，減壓濃縮至1/10的丹參生藥量后，攪拌下徐徐加入9/10丹參生藥量的無(wú)水乙醇，靜置兩小時(shí)后，離心棄去沉淀；濾液濃縮至l/20的丹參生藥量后，加入相當(dāng)于19/20丹參生藥量的無(wú)水乙醇，靜置兩小時(shí)，作為第二次醇沉，離心棄去沉淀，濾液減壓濃縮至干，制得高含量丹參多酚酸鹽；(4)高含量丹參多酚酸鹽粉針劑制備高含量丹參多酚酸鹽粉末溶于40倍量水，通過(guò)0.2-0.4nm的超濾膜，濾液灌裝于瓶?jī)?nèi)，冷凍干燥后即得產(chǎn)品。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物是以高含量丹參多酚酸鹽作為活性成分與藥用載體制得的注射劑。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血、缺氧藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的高含量丹參多酚酸鹽粉針劑中丹參乙酸鎂的含量為50%-95%，多酚酸鹽有效部位含量近100%。全文摘要本發(fā)明提供了高含量丹參多酚酸鹽在制備治療腦缺血缺氧藥物中的應(yīng)用。所述的藥物是以高含量丹參多酚酸鹽為活性成份與藥用載體組成的注射劑。在臨床上有較大的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61K36/537GK101209281SQ20061014809公開(kāi)日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月27日優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日發(fā)明者劉梅英,王逸平申請(qǐng)人:綠谷(集團(tuán))有限公司;上海綠谷制藥有限公司;上海綠谷生命園醫(yī)藥有限公司