專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種生物支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型生物支架的制備方法。是采用一種或兩種以上具有抑制內(nèi)膜增生作用的基因或寡核苷酸用電泳的方法使之負(fù)載于涂層支架上，通過(guò)該支架局部緩慢釋放作用于血管病變部位，用以預(yù)防和治療血管內(nèi)支架成形術(shù)支架內(nèi)的再狹窄。技術(shù)背景心臟病是威脅人類(lèi)健康的三大殺手之一，每年導(dǎo)致數(shù)十萬(wàn)人死亡，而動(dòng)脈粥樣硬化引起血管狹窄或閉塞是造成缺血性心臟病(冠心病)的主要原因。自上世紀(jì)70年代以來(lái)，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)己被廣泛地應(yīng)用于治療冠心病。雖然PTCA治療冠心病臨床效果令人滿(mǎn)意，但其手術(shù)并發(fā)癥卻嚴(yán)重限制了PTCA的發(fā)展。據(jù)報(bào)道而PTCA后被擴(kuò)張的冠狀動(dòng)脈在36個(gè)月內(nèi)發(fā)生再狹窄的概率則高達(dá)30—50%。血管內(nèi)支架成形術(shù)能有效地控制PTCA后血管彈性回縮所導(dǎo)致的再狹窄，可顯著降低介入治療時(shí)急性或亞急性缺血并發(fā)癥，但是支架的長(zhǎng)期置入，刺激血管平滑肌細(xì)胞遷移并大量增殖，引起內(nèi)膜組織增生，而導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄(ISR)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，支架植入后仍有20—30%的再狹窄率。如何解決支架內(nèi)再狹窄成為冠心病介入治療的熱點(diǎn)和難題。目前認(rèn)為再狹窄主要是一種損傷愈合反應(yīng)，其可能的機(jī)制有(1)血管內(nèi)的血栓形成；(2)血管壁的彈性回縮；(3)治療后局部的炎癥反應(yīng)；(4)新內(nèi)膜的形成包括中層平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，細(xì)胞外基質(zhì)的增生。盡管采用切割球囊擴(kuò)張、定向旋切、激光血管成形術(shù)、血管內(nèi)放射等治療方法，但是再狹窄率仍然在10%以上。血栓形成和新生內(nèi)膜組織的過(guò)度增生是引起支架內(nèi)再狹窄的兩個(gè)主要原因，因此，抑制血栓的形成和組織增生成為防治支架再狹窄的兩個(gè)重要途徑。鑒于此，人們用具有抗凝血、消炎和抑制增生等藥物預(yù)防再狹窄，取得了一定的效果。特別是藥物洗脫支架的應(yīng)用，使支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率大大降低。但是，臨床數(shù)據(jù)表明，盡管藥物支架大大降低了支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生，但是有遲發(fā)性血栓形成，導(dǎo)致急性心肌梗死。病理研究表明，藥物支架在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)，也抑制了血管內(nèi)皮的修復(fù)，使基底膜長(zhǎng)期暴露于血流的作用之下，從而導(dǎo)致遲發(fā)性血栓形成。近年來(lái)，隨著細(xì)胞生物學(xué)及基因重組技術(shù)的發(fā)展，冠心病的基因治療研究己取得很大的進(jìn)展，成為當(dāng)今心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?；蛑委熓侵笇⒕幋a具有某種生物活性物質(zhì)(一般是蛋白質(zhì)或肽)的基因，人為地轉(zhuǎn)移到人體器官或組織細(xì)胞內(nèi)，使其在局部表達(dá)該活性物質(zhì)，從而達(dá)到相應(yīng)的治療或預(yù)防目的的療法?；蛑委煹幕经h(huán)節(jié)包括選擇目的基因；構(gòu)建表達(dá)載體和目的基因的導(dǎo)入。針對(duì)再狹窄的可能機(jī)制，許多學(xué)者嘗試用基因治療來(lái)防止再狹窄。他們采用靜脈注射、局部直接注射、基因埋線(xiàn)、球囊導(dǎo)管導(dǎo)入、應(yīng)用轉(zhuǎn)化細(xì)胞包被冠狀內(nèi)支架等基因?qū)敕椒?，研究包括血管?nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)基因、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)基因、細(xì)胞分裂調(diào)控基因(c一myc)、抗癌基因(p53)、一氧化氮合成酶基因(eNOS)、以及antisense、decoyOND禾口RNA干擾技術(shù)等基因治療手段用于再狹窄的防治。但是臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不盡人意，究其原因，上述基因?qū)敕椒ㄈ狈Σ∽兘M織的導(dǎo)向性，基因的有效利用量少，基因藥物在病變局部的濃度較低，維持有效濃度的時(shí)間較短，而且副作用大，難以發(fā)揮治療性作用。由此，人們想到以涂層支架為載體，將治療性基因負(fù)載于支架上，通過(guò)支架的定位作用，達(dá)到目的基因在靶血管部位的定向緩釋?zhuān)瑥亩_(dá)到治療再狹窄的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種生物支架的制備方法。本發(fā)明方法制得的生物支架是指負(fù)載一種或二種以上的目的基因或/和寡核苷酸的洗脫支架。本發(fā)明生物支架的制備方法，是以涂層支架為載體，采用電泳法將治療性的一種或二種以上的目的基因或/和寡核苷酸負(fù)載于涂層支架上。制備方法的歩驟是先采用已有技術(shù)制得涂層支架將支架分別用丙酮和純水清洗，晾干，然后在支架表面均勻地噴涂一層生物可降解高分子，將涂層支架放于真空干燥箱中，在37'C干燥24小時(shí)，然后用交聯(lián)劑處理涂層支架72h,用蒸餾水洗去殘余的交聯(lián)劑，再將帶有涂層的支架放于真空干燥箱中，在37'C干燥24小時(shí)；然后將涂層支架固定在電泳裝置中的惰性正極上，插入含一種或二種以上的目的基因或寡核苷酸和緩沖液組成的溶液中，在〉0-5V的電壓，〉0-0.6mA電流下，電泳1-100分鐘，電壓最佳為5V，電流最佳為0.4mA，取出，晾干，重復(fù)進(jìn)行電泳直到達(dá)到需要的負(fù)載量，通常為250-600ug。電泳裝置見(jiàn)圖l，電泳裝置是直流電泳。所述目的基因是抑制炎癥、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或抑制血管平滑肌增殖的基因，例如編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因(VEGF)、編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因(FGF)等。所述目的寡核苷酸是抑制血管平滑肌增殖的寡核苷酸，例如decoyE2F或decoyNF-kB等。所述的目的基因還可以是血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)基因、細(xì)胞分裂調(diào)控基因(c-myc)、抗癌基因(p53)或一氧化氮合成酶基因(eNOS)。所述緩沖液是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、TE緩沖液、TAE緩沖液、TBE緩沖液、TEN緩沖液或生理鹽水。所述支架為血管支架，包括冠脈血管支架、頸動(dòng)脈血管支架、顱內(nèi)血管支架、大動(dòng)脈血管支架或外周血管支架等，支架還可以為食道支架、膽道支架和尿道支架等。所述支架的材質(zhì)是不銹鋼、鉻鈷合金、鎳鈦合金或其它生物醫(yī)用高分子材質(zhì)。本發(fā)明方法在5V電壓，0.3mA電流下電泳3min，涂層支架上的目的基因負(fù)載量可達(dá)250ug(參見(jiàn)實(shí)施例l);而采用普通的浸涂法，涂層支架在室溫下浸沒(méi)吸附24h,支架上的有效吸附量也只有9ug;用本發(fā)明方法制備的涂層支架有效釋放時(shí)間長(zhǎng)達(dá)50小時(shí)，而普通的浸涂法制備的涂層支架其有效釋放時(shí)間只有6小時(shí)。兩種方法制備的支架負(fù)載量和釋放動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2和圖3。本發(fā)明的關(guān)鍵是采用一種電化學(xué)沉積手段，將一種或二種以上具有不同作用機(jī)理的目的基因或/和寡核苷酸牢固結(jié)合到涂有生物可降解高分子的支架上。用此方法制備的基因洗脫支架具有以下的優(yōu)點(diǎn)1)目的基因或寡核苷酸的負(fù)載量可控；2)目的基因或寡核苷酸的釋放動(dòng)力學(xué)可控；3)可以負(fù)載多種治療性的目的基因或/和寡核苷酸；4)負(fù)載多種治療性目的基因或/和寡核苷酸的比例可控。本發(fā)明方法制備的基因或/和寡核苷酸洗脫支架具有緩釋作用，可以大大提高治療性目的基因或/和寡核苷酸在靶血管的定向?qū)胄剩瑥亩佑行У仡A(yù)防和治療PTCA后冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄。而且本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，操作容易，制作速度快，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。圖1為本發(fā)明方法中使用的電泳裝置示意圖。圖2為本發(fā)明方法制備的基因洗脫支架負(fù)載量250yg的釋放動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)圖。圖3為采用用普通浸涂法制備的基因洗脫支架負(fù)載量9yg的釋放動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1編碼VEGF基因洗脫支架的制備0.48g明膠加入到20ml純水中，溶解后混合均勻，然后噴涂于不銹鋼支架表面，在空氣中干燥24h。將支架置于含37%的分析純甲醛中，反應(yīng)72h，用蒸餾水洗去殘余的交聯(lián)劑，再將帶有涂層的支架放于真空干燥箱中，在37'C干燥24小時(shí)；然后將支架固定在鉑電極上，插入含7mg/L的編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因的PBS(137mmol/LNaCL,2.7腿ol/LKCL,10mmol/LN^HPCM,2mmol/LKH2P04)溶液中，在5V的電壓，0.3mA電流下電泳3min，取出，晾干，重復(fù)進(jìn)行電泳，直到達(dá)到250ug的負(fù)載量。再將支架置于真空烘箱中，室溫下抽真空干燥24小時(shí)。實(shí)施例2編碼FGF基因洗脫支架的制備配制5%的殼聚糖溶液，然后噴涂于不銹鋼支架表面，在空氣中干燥24h。然后將支架固定在鎢電極上，插入含6mg/L的編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)基因的TAE(40mmol/LTris-乙酸，lmmol/LEDTA，pH8.0)溶液中，在3V的電壓，0.4mA電流下電泳5min，取出，晾干，重復(fù)進(jìn)行電泳，直到達(dá)到500ug的負(fù)載量。再將支架置于真空烘箱中，室溫下抽真空干燥24小時(shí)。實(shí)施例3編碼HGF基因洗脫支架的制備將鉻鈷合金支架分別用丙酮和純水清洗，晾干，浸入1%聚乙烯醇和2%膠原的混合溶液，取出，空氣中晾干，反復(fù)3次，直到涂層重量達(dá)800ug。將支架置于含25%的分析純戊二醛溶液中，反應(yīng)24h，用蒸餾水洗去殘余的交聯(lián)劑，再將帶有涂層的支架放于真空干燥箱中，在37'C干燥24小時(shí)；然后將支架固定在鉑電極上，插入含8mg/L的編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因的TE(100mmol/LTris-HCl,10腿ol/LEDTA，pH8.0)溶液中，在10V的電壓，0.3mA電流下電泳lmin，取出，晾干，重復(fù)進(jìn)行電泳，直到達(dá)到300ug的負(fù)載量。再將支架置于真空烘箱中，室溫下抽真空干燥24小時(shí)。實(shí)施例4decoyE2F寡核苷酸洗脫支架的制備將鎳鈦合金支架分別用異丙醇和純水超聲清洗3次，晾干，浸入10%聚賴(lài)氨酸溶液中，取出，空氣中晾干，反復(fù)3次，直到涂層重量達(dá)800ug。將支架置于含25%的分析純氧化甘油醛溶液中，反應(yīng)48h，用蒸餾水洗去殘余的交聯(lián)劑，再將帶有涂層的支架放于真空干燥箱中，在37'C干燥24小時(shí)；然后將支架固定在金電極上，插入含9mg/L的decoyE2F寡核苷酸的生理鹽水中，在IV的電壓、0.5mA電流下電泳10min，取出，晾干，重復(fù)進(jìn)行電泳，直到達(dá)到300ug的負(fù)載量。再將支架置于真空烘箱中，室溫下抽真空24小時(shí)，再真空包裝，低溫保存。實(shí)施例5decoyNF-kB和decoyE2F寡核苷酸洗脫支架的制備配制5%明膠的水溶液，噴涂大動(dòng)脈血管支架，涂層重量達(dá)800ug，真空干燥后備用。分別配制含8mg/L的decoyNF-kB和decoyE2F寡核苷酸的TEN緩沖液(10mmol/LTris-HCl，0.l謹(jǐn)ol/LEDTA,0lmol/LNaCl，pH80)，然后將兩種溶液以不同的體積比例混合，4'C低溫保存，作為核酸電泳液。將明膠涂層血管支架連接到鉑電極上，在5V的恒壓，0.2mA電流下電泳5min，重復(fù)進(jìn)行電泳，直到寡核苷酸的負(fù)載量達(dá)到400ug，用超純水沖洗支架，去除吸附的核酸，自然涼干，再室溫真空干燥24h;所得支架負(fù)載的核酸中，decoyNF-kB和decoyE2F比例可以通過(guò)電泳液中decoyNF-kB和decoyE2F的相對(duì)含量來(lái)精確調(diào)節(jié)。實(shí)施例6編碼VEGT基因和HGF基因洗脫支架的制備配制0.5%聚乳酸的氯仿溶液，噴涂顱內(nèi)血管支架，涂層重量達(dá)1000ug。分別配置濃度為8ug/ml的編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因的TBE(22.5mmol/LTris-硼酸，0.1mmol/LEDTA，pH8.0)溶液。將噴涂有聚乳酸涂層的血管支架連接于鉑電極，先以2.5V的恒定電壓，0.5mA電流，在含VEGF基因的電泳液中電泳5min，重復(fù)2次，負(fù)載100ug的VEGF基因，所得基因支架再在含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因的電泳液中以2.5V的恒定電壓，0.3mA電流，電泳5min，重復(fù)6次，負(fù)載300ug的HGF基因；用PBS沖洗后冷凍干燥，滅菌后真空低溫(-2(TC)保存，所得基因支架上VEGF基因和HGF基因的重量比為1:3。實(shí)施例7具有多重治療作用的基因洗脫支架的制備配置0.5%聚乙二醇的水溶液，將冠脈血管支架反復(fù)浸涂，直到涂層重量達(dá)到800ug，真空干燥。分別配制編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)基因、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)基因和一氧化氮合成酶(eNOS)基因的TAE溶液，然后將各種基因溶液按照等摩爾濃度的比例混合，以混合的基因溶液作為電泳液，將上述聚乙二醇涂層支架在0.05V的恒定電壓，0.02mA電流下電泳100min，重復(fù)進(jìn)行電泳，使負(fù)載的基因重量達(dá)600ug，即得具有多重治療作用的基因洗脫支架。實(shí)施例8decoyE2F寡核苷酸和VEGF基因洗脫支架的制備0.48g明膠加入到40ml純水中，溶解后混合均勻，然后噴涂于鎳鈦合金支架表面，在空氣中干燥48h。配置含7mg/L的編碼VEGF基因的PBS溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0，以此為電泳液；將明膠涂層支架連接到金電極上，接到直流恒壓電泳儀的正極，IOV電壓，0.6mA電流，電泳lmin，重復(fù)3次，負(fù)載200ug的VEGF基因。再在含7mg/L的decoyE2F寡核苷酸的TEN溶液中以1V電壓、0.2mg電流、電泳10min，重復(fù)2次，負(fù)載100ug的decoyE2F寡核苷酸。所得寡核苷酸和基因洗脫支架先快速釋放decoyE2F寡核苷酸，然后再釋放VEGF基因，同時(shí)具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和促進(jìn)內(nèi)皮化的雙重作用；實(shí)施例9動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以35-45kg的小型豬為動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)decoyE2F寡核苷酸洗脫支架的效果。豬被麻醉并置于手術(shù)臺(tái)上后，頸部、右腹股溝部備皮、消毒、鋪巾，經(jīng)外科手術(shù)方法暴露右股動(dòng)脈并植入7F引導(dǎo)鞘管。系統(tǒng)肝素化前，采集血標(biāo)本以分析血漿化學(xué)組成，全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(包括血小板及不同分化狀態(tài)的白細(xì)胞)，以及血凝數(shù)據(jù)包括ACT及血漿纖維蛋白原。經(jīng)鞘管給肝素200單位/kg并確證ACT>300秒，且于支架植入過(guò)程中維持之。系統(tǒng)肝素化后約5分鐘，第二次測(cè)定ACT以確保ACT〉300秒。若ACT<300秒，加用肝素(在導(dǎo)管操作過(guò)程中及過(guò)程結(jié)束時(shí)至少再測(cè)一次ACT)之后植入7F引導(dǎo)導(dǎo)管并調(diào)整位置以便于支架植入操作。于冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射200pg硝酸甘油后記錄可控制的冠狀動(dòng)脈造影檢査，觀(guān)測(cè)冠狀動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)后，通過(guò)觀(guān)測(cè)參考2.8mm直徑引導(dǎo)導(dǎo)管選擇左冠狀動(dòng)脈前降支及右冠狀動(dòng)脈近端段以其中央部直徑約2.8mm的節(jié)段為支架植入位點(diǎn)，每只動(dòng)物將植入兩枚支架。準(zhǔn)備好對(duì)照明膠涂層組，自攜載decoyE2F支架組。攜載支架的釋放導(dǎo)管經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管循0.014英寸的引導(dǎo)鋼絲送至釋放支架的所擬靶部位，調(diào)整充盈加壓設(shè)備以適宜的充盈壓(9-10atm)充盈球囊并釋放支架到血管壁。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程記錄中記錄支架植入的情況。隨后在另一個(gè)所選部位植入第二枚支架。28天后，處死動(dòng)物取出含有支架的血管樣本，進(jìn)行光鏡觀(guān)察和電鏡觀(guān)察。結(jié)果表明(見(jiàn)表1)。E2F組，相比較對(duì)照組，顯著降低了試驗(yàn)冠脈的內(nèi)膜面積和狹窄比例。表1動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.一種生物支架的制備方法，是以涂層支架為載體，將治療性目的基因負(fù)載于涂層支架上，其特征在于是采用電泳法將一種或二種以上目的基因或/和寡核苷酸負(fù)載于涂層支架上，其步驟是將涂層支架固定于電泳裝置中的正極上，插入含目的基因或寡核苷酸和緩沖液組成的溶液中，在電壓＞0-10V，電流＞0-0.6mA下電泳1-100分鐘，取出，晾干，重復(fù)進(jìn)行電脈，直到達(dá)到需要的負(fù)載量。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述目的基因是抑制炎癥、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖或抑制血管平滑肌增殖的基因。3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述目的基因是編碼血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因或編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述目的寡核苷酸是抑制血管平滑肌增殖的寡核苷酸。5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述目的寡核苷酸是decoyE2F或decoyNF-kB。6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述目的基因是血小板衍生生長(zhǎng)因子基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因、胰島素樣生長(zhǎng)因子基因、細(xì)胞分裂調(diào)控基因、抗癌基因或一氧化氮合成酶基因。7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述電泳裝置是直流電泳。8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述電壓是5V。9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述電流是0.4mA。10.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液是磷酸緩沖鹽溶液、TE緩沖液、TAE緩沖液、TBE緩沖液、TEN緩沖液或生理鹽水。11.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述支架為血管支架，包括冠脈血管支架、頸動(dòng)脈血管支架、顱內(nèi)血管支架、大動(dòng)脈血管支架或外周血管支架。12.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述支架為食道支架、膽道支架或尿道支架。13.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述支架的材質(zhì)是不銹鋼、鉻鈷合金、鎳鈦合金或其它生物醫(yī)用高分子材質(zhì)。14.一種負(fù)載有多種目的基因或/和寡核苷酸的洗脫支架，通過(guò)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述制備方法獲得。全文摘要一種生物支架的制備方法，是以涂層支架為載體，采用電泳法將治療性的一種或二種以上的目的基因或/和寡核苷酸負(fù)載于涂層支架上。該制備方法簡(jiǎn)單，操作容易，制作速度快，成本低，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。制得的基因或/和寡核苷酸的洗脫支架具有以下優(yōu)點(diǎn)目的基因或寡核苷酸的負(fù)載量和釋放動(dòng)力學(xué)可控，可以負(fù)載多種治療性的基因或/和寡核苷酸，且它們的比例可控。制得的支架可以大大提高目的基因或/和寡核苷酸在靶血管的定向?qū)胄剩瑥亩佑行У仡A(yù)防和治療PTCA后冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)的再狹窄。文檔編號(hào)A61L31/16GK101209360SQ20061014826公開(kāi)日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者唐智榮,羅七一,鄭步中申請(qǐng)人:微創(chuàng)醫(yī)療器械(上海)有限公司