專利名稱：大良姜提取物及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及姜科Zingiberaceae山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga Willd.的根莖大良姜的醇提取物、超臨界CO2萃取提取物和水蒸汽蒸餾提取物及提取制備方法，大良姜提取物的主要成分及質(zhì)量控制方法及大良姜提取物制成的制劑及在制備新靶點(diǎn)Rev蛋白抑制劑抗HIV感染藥物和抗結(jié)核菌感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大良姜，又名大高良姜、良姜、山姜、山姜頭、廉姜，為姜科Zingiberaceae山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga Willd.的根莖。大良姜生長在熱帶、亞熱帶氣候，主要分布于我國的廣東、廣西、海南、臺灣、云南等省區(qū)。
大良姜(紅豆蔻)最早記載于《藥性論》，謂其主治“冷氣腹痛，消瘴霧毒氣，去宿食，溫腹腸，吐瀉，痢疾?？唷⑿?，多食令人舌粗，不思飲食?！睋?jù)后來的本草記載，古代已有把大良姜(紅豆蔻)與本屬植物(特別是與高良姜)混用的情況，本草多認(rèn)為紅豆蔻與高良姜來源于同一植物，紅豆蔻為果，高良姜為根，如《開寶本草》曰“紅豆蔻生南海諸谷，高良姜子也……”，《證類本草》曰。“紅豆蔻……云是良姜子……”等，以致《本草綱目》把紅豆蔻與高良姜合并為一項(xiàng)。
據(jù)考證，古代把大良姜(紅豆蔻)與本屬植物(特別是與高良姜)混用，現(xiàn)代有關(guān)調(diào)查結(jié)果還表明，目前大良姜還與喙花姜Rhynchanthus beesinanus、益智Alpinia oxyphylla Miq.、距花姜A Calcarata Rosc.的根莖常被一同混作高良姜應(yīng)用。但是，現(xiàn)代有關(guān)研究結(jié)果表明，大良姜與以上易混淆品無論是在組織形態(tài)、外觀性狀、顯微鑒別、理化鑒別、主要成分及含量方面還是在藥理活性等方面均有顯著差異。
在我國，除了少量用于采收果實(shí)作“紅豆蔻”外，大良姜主要被民間用于飲食調(diào)料的制作，尚未見大良姜成片規(guī)范化種植，主要依靠生于山野溝谷蔭濕林下或灌木叢中及草叢中的大良姜野生資源。《廣西中藥志》記載大良姜具有“溫胃散寒止痛作用。用于治心胃氣痛，胃寒冷及傷食吐瀉?！蔽覈耖g用大良姜治療消化道疾病如胃潰瘍、消化不良、大腸疾病等，但更多是作為一種特殊的風(fēng)味調(diào)料品和中藥配伍的成分，一直缺乏對其提取物及其制劑、有效成分分析、藥理藥效、安全性等系統(tǒng)研究。
大良姜中含揮發(fā)油、黃酮類成分和淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、無機(jī)鹽、微量金屬元素等。大良姜中的黃酮成分主要為檞皮素、檞皮素-3-甲醚、山柰酚、山柰素、異鼠李素、高良姜素、高良姜素-3-甲醚等。大良姜中的揮發(fā)油成分主要為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯、1’-乙酰氧基丁香酚乙酸酯、1’-羥基胡椒酚乙酸酯、桂皮酸甲酯、桉葉素、樟腦、蒎烯、丁香酚、倍半萜、倍半萜醇及倍半萜醛等，其中主要成分是1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯，占揮發(fā)油相對含量的90％以上，也是大良姜具有獨(dú)特的辛辣香味的主要組分(yang XG，[J].J Agric FoodChem，1999，471657～1662)，具有抗腫瘤(Moffatt J，A，etal.[J].Carcinogenesis，2000，212151-2157；zheng Q et al.[J].J Cancer ResClin Oncol，2002，128539～546)、抗細(xì)菌(Janssen A M，[J].plantaMed，1985(6)507～511)、抗真菌(Ficker C E，et al.[J].JEthnophamacal，2003，85589～593)、抗?jié)?Mitsuis，et al.[J].Chem PhamBull，1976，242377～2382)、抗氧化(Kubota K，et al.[J].Spec Publ R SocChem，2001，274601～607)、抗炎(Nakamura Y，[J].Cancer Res，1998，584832-4839)等生物活性，尚未見大良姜及其提取抗HIV感染和抗結(jié)核作用的報(bào)道。
目前，人體免疫缺陷病毒(HIV)感染引起獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)的治療方法研究主要集中在有限的藥物靶點(diǎn)上，即HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶、HIV蛋白酶、HIV整合酶。許多已知的抗HIV感染化合物不但具有嚴(yán)重的毒副作用，而且藥物的耐受性和依從性也越來越差。
據(jù)2006年11月全球流行病學(xué)調(diào)研報(bào)告顯示，全球的艾滋病患者約有30％合并結(jié)核感染，非洲的部分地區(qū)更達(dá)到60％，這兩種感染可以相互促進(jìn)，發(fā)病率和死亡率相當(dāng)高，并且都易出現(xiàn)耐藥、藥物不良反應(yīng)較多等情況，使得艾滋病患者的結(jié)核病防治困難加劇。報(bào)告指出，近年來艾滋病的廣泛傳播和迅速流行，導(dǎo)致結(jié)核病和艾滋病雙重感染的人數(shù)增加，艾滋病與結(jié)核病合并癥的防治應(yīng)引起高度重視。而目前的抗結(jié)核藥物毒副作用大，耐受性差，影響結(jié)核病的有效防治。因此，開發(fā)安全、有效的新靶點(diǎn)抗HIV感染藥物和防治結(jié)核病藥物成為遏制艾滋病及結(jié)核病并發(fā)癥的當(dāng)務(wù)之急。
HIV的繁殖需要其基因的有效表達(dá)，而HIV基因的有效表達(dá)依賴于它的一種調(diào)節(jié)蛋白-Rev蛋白。Rev蛋白增加HIV的mRNAs在細(xì)胞漿內(nèi)的積聚，后者經(jīng)從細(xì)胞核到細(xì)胞漿的傳遞而編碼HIV的結(jié)構(gòu)蛋白，由于Rev蛋白是HIV繁殖的關(guān)鍵因素，抑制Rev蛋白功能可以阻斷HIV繁殖，因此，Rev蛋白抑制劑成為一種具有廣闊前景的新的治療戰(zhàn)略，見圖1。
由于Rev蛋白是HIV的一種沒有細(xì)胞對應(yīng)體的蛋白，所以，抑制Rev蛋白功能的幾種不同方法被用于抑制HIV繁殖的研究。在慢性感染細(xì)胞中反義寡核苷酸抑制Rev蛋白功能的作用已被用于抑制HIV(Matsukura，M.et al.1989)。HIV的Rev蛋白的顯性轉(zhuǎn)移變異(Bevec，D.et al.1992)、細(xì)胞的Rev蛋白協(xié)同子eIF-5A的顯性陰轉(zhuǎn)變異(Bevec，D.et al.1996)、抑制Rev蛋白單鏈抗體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Duan，L.et al.1994)以及RRE誘變劑(Lee，L.et al.1992)都顯示抑制HIV在細(xì)胞內(nèi)感染的作用。新霉素被發(fā)現(xiàn)可以阻斷Rev-RRE的結(jié)合而具有抑制Rev蛋白功能作用(Zapp，M.L.et al.1993)；小蘗霉素B被證實(shí)具有阻斷Rev蛋白的核外輸出信號與受體蛋白CRM1相結(jié)合而對HIV的繁殖顯示出強(qiáng)大的抑制作用(Wolff，B.et al.1997)。盡管新霉素和小蘗霉素在體外具有顯著的生物活性，但都由于毒性特別大而不適合發(fā)展為藥物。因此，篩選安全。有效的Rev蛋白抑制劑新靶點(diǎn)抗HIV感染藥物對于遏制艾滋病具有極其重要的意義。
發(fā)明目的從天然產(chǎn)物中篩選安全、有效、抗耐藥性強(qiáng)的Rev蛋白抑制劑新靶點(diǎn)抗HIV感染藥物和抗結(jié)核藥物，達(dá)到克服抗HIV感染和抗結(jié)核化學(xué)藥物安全性和耐受性差的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為達(dá)到上述目的，我們建立了一種快速、準(zhǔn)確、微量的分裂酵母Schizosa-ccharomyces pombe(S.pombe)Rev蛋白抑制劑新靶點(diǎn)抗HIV感染藥物篩選模型。這種酵母可以表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、SV40T抗原的核定位信號(NLS)、綠色螢光蛋白(GFP)及Rev蛋白的核外輸出信號(NES)融合的蛋白。
我們采用這種篩選模型對700多種海洋生物和天然植物的提取物進(jìn)行Rev蛋白抑制劑新靶點(diǎn)抗HIV感染藥物篩選試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜科Zingiberaceae山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga Willd.的根莖大良姜的提取物具有極其顯著的抗HIV感染活性。進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果表明，大良姜提取物不僅對臨床最新分離的HIV-1毒株和臨床最新分離的HIV-1變異毒株具有顯著抑制作用，而且還與已知抗HIV感染藥物具有良好的協(xié)同作用，并且不顯示任何細(xì)胞毒性。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)大良姜提取物具有抗結(jié)核活性。
本發(fā)明所述的大良姜提取物為姜科Zingiberaceae山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga Willd.的根莖大良姜的乙醇和甲醇提取物、超臨界CO2萃取提取物和水蒸汽蒸餾提取物及其提取制備方法，大良姜提取物的主要成分及質(zhì)量控制方法及大良姜提取物制成的制劑在制備新靶點(diǎn)Rev蛋白抑制劑抗HIV感染藥物和抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
1.大良姜乙醇提取物及制備方法取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用2～10倍量50％～90％的乙醇加熱回流提取2次，每次1～3小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用1～5倍量2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取1～3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，即得大良姜乙醇提取物。
2.大良姜甲醇提取物及制備方法取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用5～10倍甲醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收甲醇，得提取液；提取液用1～5倍量2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取1～3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，即得大良姜甲醇提取物。
3.大良姜超臨界CO2萃取提取物及制備方法取大良姜，切碎，粉碎成粗粉在，置超臨界CO2萃取器中，萃取溫度為30℃～50℃，萃取壓力為10MPa～20MPa，分離壓力為10MPa～20MPa，分離溫度為30℃～50℃，萃取分離時(shí)間為2～6小時(shí)，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，即得大良姜超臨界CO2萃取提取物。
4.大良姜水蒸汽蒸餾提取物及制備方法取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，加2～10倍量水，加熱蒸餾提取1～6小時(shí)，收集蒸餾液；蒸餾液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，即得大良姜水蒸汽蒸餾提取物。
5.大良姜提取物中主要成分的確證(1)大良姜提取物中主要成分的精制純化用制備液相精制純化主要成分。制備條件為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水(50∶50)為流動相，用制備柱，取大良姜提取物用甲醇溶解，注入制備液相色譜儀，在254nm波長處收集分離精制純化品，即得。
(2)大良姜提取物中主要成分的確證采用元素分析、紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁共振譜測定分析解析，確證上述大良姜提取物的精制純化品為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯，結(jié)構(gòu)式為 分子式為C13H14O4，分子量為234.25，見圖2～圖12。
6.大良姜提取物質(zhì)量控制方法(1)性狀大良姜提取物為油狀物。在甲醇中溶解。
(2)鑒別取含量測定項(xiàng)下的供試品溶液，照中國藥典2005年版一部附錄VA紫外-可見分光光度法測定，供試品溶液在204nm和254nm的波長處有最大吸收。
(3)含量測定照中國藥典2005年版一部附錄VD高效液相色譜法測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水(50∶50)為流動相，檢測波長為254nm。
測定法取大良姜提取物2ml，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以二個相鄰主峰的峰面積之和，按歸一化法計(jì)算大良姜提取物中1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(C13H14O4)含量，即得。
7.大良姜提取物制成的制劑采用常規(guī)制劑技術(shù)，將大良姜提取物制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
8.大良姜提取物在制備新靶點(diǎn)Rev蛋白抑制劑抗HIV感染藥物中的應(yīng)用(1)用于檢測Rev蛋白功能抑制作用的分裂酵母菌SchizosaccharomycesPombe的制備。
Schizosaccharomyces Pombe(s.pombe)分裂酵母菌被用于本研究。含有野生型nmt1啟動子(該啟動子在沒有維生素B1的培養(yǎng)液中能夠有力地引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄)的pREP1質(zhì)粒被用于s.pombe酵母菌的轉(zhuǎn)化。為了能在s.pombe酵母菌中看見細(xì)胞核質(zhì)間的傳送，編碼谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(GST)、SV40T抗原的核定位信號(NLS)、綠色螢光蛋白(GFP)及Rev蛋白的核外輸出信號(NES)的融含蛋白的基因被導(dǎo)入到s.pombe酵母菌中。通常，在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)都能看到綠色螢光，當(dāng)?shù)鞍准?xì)胞核外輸送被抑制時(shí)，綠色螢光集中在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)幾乎看不見螢光，因而可用于Rev蛋白抑制劑體外篩選模型，見圖13。
(2)大良姜提取物阻斷REV蛋白傳送作用取引入融合蛋白的s.pombe酵母菌在缺VitB1的培養(yǎng)液中30℃培養(yǎng)3小時(shí)，加入1％大良姜提取物的二甲亞砜溶液，混勻，在30℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，在螢光顯微鏡下檢測GST-NLS-GFP-REV NES融合蛋白的螢光分布情況。
(3)大良姜提取物抗HIV感染作用①細(xì)胞培養(yǎng)及HIV-1 NL4-3、JR-CSF病毒液的制備取人T淋巴細(xì)胞株MT4細(xì)胞、H9細(xì)胞置10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加50μg/mlNormocin、50μg/ml G-418培養(yǎng)；另取人外周血單核細(xì)胞(PBMC)在含有20％胎牛血清(FBS)和4μg植物血凝素(PHA)的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。三天后，將PHA激發(fā)過的PBMC用PBS(磷酸緩沖液)沖洗3次，然后在含有20％FBS和10U/ml白細(xì)胞介質(zhì)-2的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。質(zhì)粒PNL4-3、πSVJR-CSF在人上皮293T細(xì)胞中表達(dá)HIV-1的全長基因。在質(zhì)粒pNL4-3、πSVJR-CSF轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后三天，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用P24 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))來測定病毒的產(chǎn)生量。
②P24 ELISA用Perkin Elmer公司生產(chǎn)的HIV-1 P24 ELISA試劑測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的HIV-1 P24的量。
③抗病毒活性測定MT4細(xì)胞、H9細(xì)胞、PBMC細(xì)胞分別感染HIV-1 IIIB、NL4-3和JR-CSF病毒。用PBS沖洗細(xì)胞2次，然后加入新鮮培養(yǎng)的病毒液及不同濃度的大良姜提取物溶液，培養(yǎng)7天后檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中P24的產(chǎn)生量，并觀察大良姜提取物與基它抗HIV感染藥物的協(xié)同作用。
④大良姜提取物細(xì)胞毒性測定用Promega公司生產(chǎn)的Cell Titer 96aqueous cell proliferstion assay檢測大良姜提取物的細(xì)胞毒性。在96孔平皿培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入1×105個細(xì)胞，然后加入不同濃度的大良姜提取物溶液，培養(yǎng)48～72小時(shí)后，每孔加入20μl MTS(2ml)t吩嗪硫酸甲酯(PMS)100μl的混合液，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)3小時(shí)，用分光光度計(jì)在490nm的波長處測定培養(yǎng)液的吸收度，計(jì)算細(xì)胞毒性。
9.大良姜提取物在制備抗結(jié)核桿菌感染藥物中的應(yīng)用(1)最小抑菌濃度(MIC)測定取結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、強(qiáng)毒人型結(jié)核桿菌(H37RV)培養(yǎng)液接種于結(jié)核桿菌簡單綜合培養(yǎng)基試管中，加入不同濃度的大良姜提取物甲醇溶液，搖勻，37℃培養(yǎng)14天，觀察各管結(jié)核桿菌生長情況，計(jì)算大良姜提取物對各結(jié)核桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。
(2)大良姜提取物對感染結(jié)核桿菌小鼠的保護(hù)作用取體重為16～18g經(jīng)結(jié)核桿菌素試驗(yàn)結(jié)果為陰性的小鼠，雌雄各半，每只靜脈注射接種H37RV結(jié)核桿菌培養(yǎng)液0.2ml后隨機(jī)分組，小鼠在靜脈感染的第3天開始口服灌胃給予大良姜提取物，每天3次，連續(xù)3天，觀察半數(shù)動物的死亡時(shí)間T50，并與生理鹽水空白對照組及異煙肼陽性對照組比較。
實(shí)施例1取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用8倍量75％的乙醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用等量10∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物1。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物1制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例2取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用5倍量80％的乙醇加熱回流提取2次，每次1.5小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用2倍量5∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取2次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用5∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物2。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物2制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例3取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用10倍量50％的乙醇加熱回流提取2次，每次3小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用5倍量2∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物3。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物3制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例4取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用2倍量90％的乙醇加熱回流提取2次，每次1小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用3倍量8∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取1次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用8∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物4。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物4制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例5取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用8倍量甲醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用等量10∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物5。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物5制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例6取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用5倍量甲醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用3倍量5∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取2次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用5∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫洗脫劑分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物6。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物6制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例7取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用10倍量甲醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用5倍量2∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物7。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物7制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例8取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用3倍量甲醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用2倍量8∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取1次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用8∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物8。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物8制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例9取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，置超臨界CO2萃取器中，萃取溫度為33℃，萃取壓力15Mpa，分離壓力10Mpa，分離溫度40℃，萃取分離時(shí)間為4小時(shí)，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物9。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物9制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例10取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，置超臨界CO2萃取器中，萃取溫度為40℃，萃取壓力10Mpa，分離壓力15Mpa，分離溫度35℃，萃取分離時(shí)間為2小時(shí)，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用5∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物10。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物10制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例11取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，置超臨界CO2萃取器中，萃取溫度為45℃，萃取壓力20Mpa，分離壓力20Mpa，分離溫度50℃，萃取分離時(shí)間為5小時(shí)，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物11。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物11制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例12取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，置超臨界CO2萃取器中，萃取溫度為50℃，萃取壓力15Mpa，分離壓力20Mpa，分離溫度40℃，萃取分離時(shí)間為6小時(shí)，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用8∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物12。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物12制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例13取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，加10倍量水，加熱蒸餾提取3小時(shí)，收集蒸餾液；蒸餾液以硅膠層析柱為固定相，用10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物13。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物13制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例14取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，加8倍量水，加熱蒸餾提取1小時(shí)，收集蒸餾液；蒸餾液以硅膠層析柱為固定相，用5∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物14。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物14制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例15取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，加5倍量水，加熱蒸餾提取5小時(shí)，收集蒸餾液；蒸餾液以硅膠層析柱為固定相，用8∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物15。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物15制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
實(shí)施例16取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，加2倍量水，加熱蒸餾提取6小時(shí)，收集蒸餾液；蒸餾液以硅膠層析柱為固定相，用2∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥，得大良提取物16。采用常規(guī)制劑方法將大良姜提取物16制成軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑。
工業(yè)實(shí)用性1.大良姜提取物提取收率、提取物鑒別檢查和提取物中的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酯(C13H14O4)含量測定結(jié)果見表1。
表1.大良姜提取物提取收率、鑒別、含量測定結(jié)果 2.大良姜提取物抗HIV感染作用(1)對細(xì)胞感染HIV-1的抑制作用用HIV標(biāo)準(zhǔn)病毒IIIB株100TCID50病毒量感染MT4、H9、PBMC三種細(xì)胞。大良姜提取物與對照藥品齊多夫定(AZT)不同濃度的抗病毒結(jié)果如下①M(fèi)T4細(xì)胞 大良姜提取物的半數(shù)有效濃度(IC50)為2.2微摩爾，選擇指數(shù)(SI)為25，見圖14。
②H9細(xì)胞 大良姜提取物的IC50為17微摩爾，治療指數(shù)為15.9，見圖15。
③PBMC細(xì)胞 大良姜提取物的IC50為6.2微摩爾，SI為6.4，見圖16。
(2)對細(xì)胞感染HIV-1時(shí)間的影響用HIV-1標(biāo)準(zhǔn)病毒III-B株20TCID50病毒量感染MT4、H9、PBMC細(xì)胞。感染病毒不同時(shí)間，測定三種細(xì)胞培養(yǎng)液中P24抗原的量，見圖17、圖18、圖19。結(jié)果表明，感染病毒5-7天后P24抗原的量已達(dá)穩(wěn)定。故細(xì)胞培養(yǎng)抗病毒試驗(yàn)選擇感染病毒5-7天，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中P24抗原的量。
用HIV-1 NL4-3、HIV-1 JR-CSF同時(shí)感染PBMC細(xì)胞，結(jié)果顯示大良姜提取物對X4HIV-1及R5HIV-1均有極強(qiáng)的抑制作用，HIV-1感染24小時(shí)內(nèi)，大良姜提取物顯示極強(qiáng)的抗病毒作用，見圖20。
(3)大良姜提取物與抗HIV感染藥物去羥基苷的相互作用選擇抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑去羥基苷(ddI)和大良姜提取物，試驗(yàn)結(jié)果表明，大良姜提取物明顯增強(qiáng)ddI的抗病毒效果，具有良好的協(xié)同作用，見圖21。
(4)大良姜提取物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)大良姜提取物對MT4、H9和PBMC細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果見圖22、圖23、圖24，結(jié)果表明大良姜提取物在0.5微摩爾～4微摩爾的有效抗病毒濃度范圍內(nèi)對宿主細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。
3.大良姜提取物抗結(jié)核桿菌的作用(1)大良姜提取物最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果表明，大良姜提取物對三種結(jié)核桿菌均有顯著抑制作用，見表2。
表2.大良姜提取物MIC測定結(jié)果

(2)大良姜提取物對感染結(jié)核桿菌小鼠的保護(hù)作用結(jié)果表明大良姜提取物顯著延長感染結(jié)核桿菌小鼠的死亡時(shí)間，見表3。
表3.大良姜提取物對感染結(jié)核桿菌小鼠的保護(hù)作用試驗(yàn)結(jié)果

說明書


附圖1為Rev蛋白抑制劑抗HIV感染作用機(jī)理示意圖附圖2為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯紫外光譜圖附圖3為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯紅外光譜圖附圖4為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯高效液相色譜圖附圖5為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯質(zhì)譜圖附圖6～附圖12為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯核磁共振譜圖附圖13為Rev蛋白抑制劑S.pombe酵母菌體外篩選模型示意圖附圖14為大良姜提取物、齊多夫定(AZT)對MT4細(xì)胞感染HIV-1的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果附圖15為大良姜提取物、齊多夫定(AZT)對H9細(xì)胞感染HIV-1的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果附圖16為大良姜提取物、齊多夫定(AZT)對PBMC細(xì)胞感染HIV-1的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果附圖17為MT4細(xì)胞感染HIV-1的時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果附圖18為H9細(xì)胞感染HIV-1的時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果附圖19為PBMC細(xì)胞感染HIV-1的時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果附圖20為大良姜提取物對PBMC細(xì)胞感染HIV-1 NL4-3、HIV-1JR-CSF的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果附圖21為大良姜提取物與抗HIV感染藥物去羥基苷(ddI)的協(xié)同作用試驗(yàn)結(jié)果附圖22為大良姜提取物對MT4細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果附圖23為大良姜提取物對H9細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果附圖24為大良姜提取物對PBMC細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.大良姜提取物，其特征在于它是姜科Zingiberaceae山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga Willd.的根莖大良姜乙醇和甲醇提取物、超臨界CO2萃取提取物、水蒸汽蒸餾提取物。
2.權(quán)利要求1所述的大良姜提取物，其特征在于它是取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用2～10倍量50％～90％的乙醇加熱回流提取2次，每次1～3小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收乙醇，得提取液；提取液用1～5倍量2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取1～3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥后制成的大良姜乙醇提取物。
3.權(quán)利要求1所述的大良姜提取物，其特征在于它是取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，用5～10倍甲醇加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并二次提取液，減壓回收甲醇，得提取液；提取液用1～5倍量2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯萃取劑萃取1～3次，減壓回收萃取劑，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥后制成的大良姜甲醇提取物。
4.權(quán)利要求1所述的大良姜提取物，其特征在于它是取大良姜，切碎，粉碎成粗粉在，置超臨界CO2萃取器中，萃取溫度為30℃～50℃。萃取壓力為10MPa～20MPa，分離壓力為10MPa～20MPa，分離溫度為30℃～50℃，萃取分離時(shí)間為2～6小時(shí)，收集萃取液；萃取液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥后制成的大良姜超臨界CO2萃取提取物。
5.權(quán)利要求1所述的大良姜提取物，其特征在于它是取大良姜，切碎，粉碎成粗粉，加2～10倍量水，加熱蒸餾提取1～6小時(shí)，收集蒸餾液；蒸餾液以硅膠層析柱為固定相，用2～10∶1的正己烷-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫分離純化，收集洗脫液，減壓真空干燥制成的大良姜水蒸汽蒸餾提取物。
6.權(quán)利要求1所述的大良姜提取物，其特征在于它的主要成分為1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯，其結(jié)構(gòu)式為 分子式為C13H14O4，分子量為234.25。
7.權(quán)利要求6所述的大良姜提取物中主要成分1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的含量測定方法為高效液相色譜法，其特征在于它的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水為流動相，檢測波長為254nm；測定法為取大良姜提取物2ml，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以二個相鄰主峰的峰面積之和，按歸一化法計(jì)算大良姜提取物中1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯含量的方法。
8.大良姜提取物在醫(yī)藥中的應(yīng)用，其特征在于用它制成的軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑在制備Rev蛋白抑制劑抗HIV感染藥物中的應(yīng)用。
9.大良姜提取物在醫(yī)藥中的應(yīng)用，其特征在于用它制成的軟膠囊劑、滴丸劑、片劑、膠囊劑、栓劑、氣霧劑、噴劑、粉霧劑、微型膠囊劑、脂質(zhì)體制劑、注射劑在制備抗結(jié)核桿菌感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及姜科Zingiberaceae山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga Willd.的根莖大良姜的乙醇和甲醇提取物、超臨界CO
文檔編號A61K9/08GK1958057SQ20061014913
公開日2007年5月9日 申請日期2006年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月16日
發(fā)明者葉英, 劉孝樂, 錢進(jìn), 許軍, 彭紅, 陶琳 申請人:南昌弘益科技有限公司