專利名稱：透明質(zhì)酸用于軟骨細(xì)胞抗氧化與增生的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸(hyaluronic acid、義名玻璃質(zhì)酸)用于改善軟骨細(xì) 胞的氧化損害，進而促進軟骨細(xì)胞增生的用途。本發(fā)明還涉及透明質(zhì)酸用于制 造供治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥品，及提供改善關(guān)節(jié)炎病癥的口服性食品或飲料 的用途。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)是提供生物體骨架活動的樞紐。關(guān)節(jié)內(nèi)相鄰的兩骨骼面覆蓋一層有彈 性、表面光滑的軟骨，其在骨骼實際接觸并活動摩擦?xí)r，具有吸收震動及減少 摩擦力的作用，以促使關(guān)節(jié)的活動順暢。為增加軟骨接觸面的滑動順暢，關(guān)節(jié) 內(nèi)含有粘稠的關(guān)節(jié)液具有像潤滑油一般的功效。在軟骨和關(guān)節(jié)液中，有種重 要成分透明質(zhì)酸。關(guān)節(jié)液含0.15% (w/v)水狀溶液的透明質(zhì)酸，主要由關(guān)節(jié)滑 膜細(xì)胞(synoviocyte)制造，是 -種大分子的長鏈聚醣類，其功能為l.以水 溶液形態(tài)存在于關(guān)節(jié)液中，提供粘稠度(Pathophysiology. 2003， 9:215-220); 2.與一些葡糖胺聚糖分子(Glucosaminoglycan、 GAG等)結(jié)合形成蛋白聚糖 (Proteoglycan)，作為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一；3.在軟骨中提 供軟骨細(xì)胞附著及生存的骨千；4.會受氧化物質(zhì)的毒性而破壞其結(jié)構(gòu)(參見， 例如Arthritis & Rheumatism.2003， 48:3151-3158)，而其中的最后一項，H前 正日益受到重視。因為關(guān)節(jié)運動的機械性損耗或老化等其它因素，會降低代謝性氧化劑和增 加氧化物或自由基等，而造成軟骨細(xì)胞的傷害。由于軟骨基質(zhì)中含有透明質(zhì)酸， 其必須由健全的軟骨細(xì)胞維持恒定的結(jié)構(gòu)(質(zhì))與量，才可供維持正常的軟骨結(jié) 構(gòu)。但是這些細(xì)胞在人體生命周期的中期或更早，就逐漸衰老甚或凋亡，于是退形性病變就形成了。軟骨細(xì)胞功能衰退的原因十分復(fù)雜，u前學(xué)界所知不多， 但 -項公認(rèn)的重要因素，就是代謝過程(包括前述機械性磨耗和生體自然的生 物性運作等等)中產(chǎn)生的氧化性物質(zhì)，特別是像自由基等強氧化劑對它所造成 的傷害。
在化學(xué)反應(yīng)中，活性氧(reactive oxygen species, ROS)或稱為氧自由基(free radicals)會以不穩(wěn)定的情況存在，必須得到-一個電子來達到平衡，因此會以 氧化的方式，與其它原子或化合物競爭電子。據(jù)估計人體內(nèi)所有的自由基屮約 有95 7。以上屬于ROS，活性氧或其衍生物因相互競爭電子，會影響其它分子或化合物的狀態(tài)。細(xì)胞的構(gòu)造中多處皆可產(chǎn)生自由基如線粒體、溶酶體、細(xì)胞膜磷脂質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。自由基過多會對細(xì)胞組織造成傷害。當(dāng)體內(nèi)的氧化物過多時會導(dǎo)致體內(nèi)的平衡失調(diào)，而造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或是DNA損傷，進而造 諸如癌癥、帕金森氏癥、高血壓、動脈硬化癥、心肌梗塞、血栓形成、血小板 凝集等疾病產(chǎn)生。目前已知自由基會和細(xì)胞膜上脂質(zhì)的不飽和鍵結(jié)合，產(chǎn)生脂 質(zhì)過氧化反應(yīng)，而使細(xì)胞膜受損。自由基也會損害含硫蛋白及其它蛋白，造成 離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(ion transport systems)受損，導(dǎo)致細(xì)胞受到傷害或造成蛋白質(zhì) 分解、結(jié)構(gòu)改變或變性等。另外自由基會對脫氧核糖核酸的堿基造成傷害，使 DNA斷裂、突變、細(xì)胞周期改變、甚至具有致癌性。目前已知在關(guān)節(jié)炎中，活性氧(如02—'、 OH'、 H202、 HOC1等)會進行 去聚合化(depolarization)而破壞透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)，并降低透明質(zhì)酸的數(shù)量、降低 關(guān)節(jié)的粘稠度與潤滑度以及產(chǎn)生發(fā)炎現(xiàn)象(參見，例如Free Radic Biol Med. 2003,35:169-78;及Pathophysiology. 2003， 9:215-220) 。 &02和CuCl2的存在 會破壞高分子量(例如120萬道爾頓)透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)(參見Carbohydr Res. 1999, 321:228-34; Carbohydr Res. 2006， 341:639-44;及Pathophysiology. 2003, 9:215-220)。現(xiàn)有文獻還提及關(guān)節(jié)液中的透明質(zhì)酸易受H202或山H202衍生 的OH'破壞(Inflammation. 1993， 17:403-15)。因此，&02似乎為造成透明質(zhì) 酸結(jié)構(gòu)變化的主因。本發(fā)明利用不同分子量與制造來源的透明質(zhì)酸，在體外或活體試驗評估透明質(zhì)酸作為-j亢氧化(H202)，以及進而促進軟骨細(xì)胞增生的用途。并評估外加透明質(zhì)酸可以在人關(guān)節(jié)退化的過程中，提供某種程度的還原及 保護細(xì)胞的功用，或具有軟骨細(xì)胞增生的效應(yīng)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的及優(yōu)點將部分描述于下，或可由描述中顯而易見。本發(fā)明的目的在于提供透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)用于改善軟骨細(xì)胞因 活性氧所引起的氧化損害的用途。 本發(fā)明的另 一 目的在于提供透明質(zhì)酸用于促進軟骨細(xì)胞增生的用途。本發(fā)明的上述目的是這樣實現(xiàn)的 一種透明質(zhì)酸的促進軟骨細(xì)胞增生的用 途，是通過對軟骨細(xì)胞生長周期的調(diào)控而實現(xiàn)。本發(fā)明所述的用途，該生長周期的調(diào)控是增加生長周期調(diào)控因子Cydhi Bl在G2/M期的表現(xiàn)。本發(fā)明的又一 目的在于提供用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥品。本發(fā)明的上述目的是這樣實現(xiàn)的 一種用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥品，其特征在于包含分子量介于50-800萬道爾頓(Dalton)的透明質(zhì)酸。本發(fā)明所述的醫(yī)藥品，該透明質(zhì)酸用于改善關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的氧化損害。 本發(fā)明所述的醫(yī)藥品，該透明質(zhì)酸用于降低關(guān)節(jié)液內(nèi)的自由基活性。 本發(fā)明的再一 目的在于提供用于改善關(guān)節(jié)炎病癥的口服性食品。本發(fā)明的上述目的是這樣實現(xiàn)的 -種供改善關(guān)節(jié)炎病癥的口服性食品，其特征在于，包含分子量介于50-800萬道爾頓的透明質(zhì)酸。下面，結(jié)合具體實施例及其所示附圖，對本發(fā)明作進-歩詳細(xì)說明。

圖1表示各種不同分子量的透明質(zhì)酸(Hyaluronan)降低關(guān)節(jié)液中H202的產(chǎn)生。圖2表示在給予病人透明質(zhì)酸后，其關(guān)節(jié)液內(nèi)的02—'、 H202、及發(fā)炎l天l子 C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)與結(jié)合珠蛋白(haptoglobin)的量，相比于對照組的下降情形。圖3A表示在給予透明質(zhì)酸的環(huán)境下，自由基的表現(xiàn)受到抑制。 圖3B表示在有或無透明質(zhì)酸(20 pl)存在下，軟骨細(xì)胞隨著11202濃度增加的存活率。圖4表示在有或未給予透明質(zhì)酸的狀況下，老年人類軟骨細(xì)胞隨時間的生長情形。圖5表示利用流式細(xì)胞儀(flow cytometery)分析有或未經(jīng)透明質(zhì)酸(1 mg/ml)處理的老人軟骨細(xì)胞的細(xì)胞周期。圖6表示以蛋白質(zhì)印跡分析調(diào)控G0/G1期的蛋白質(zhì)細(xì)胞周期蛋白Dl、 cdk4與cdk6;以及調(diào)控G2/M的蛋白質(zhì)細(xì)胞周期蛋白B1，在有或未經(jīng)透明
質(zhì)酸(lmg/ml)處理的軟骨細(xì)胞中的表現(xiàn)變化情形。
具體實施方式
以下實施例為使用日本專利1284023與1353027的方式分離的透明質(zhì)酸 制品。其中包含600萬道爾頓透明質(zhì)酸(Synvisc,Biomatrix,USA)， 60-120萬 道爾頓透明質(zhì)酸(ARTZDispo, Seikagaku， Japan), 60-120萬道爾頓透明質(zhì)酸 (Hikamilon Dispo， Taisho Pharmaceutical Co., Ltd., Japan), 60-120萬道爾頓透明 質(zhì)酸(Lumisteron Dispo, Nissin, Japan), 60-120萬道爾頓透明質(zhì)酸(Unihylon Dispo, UJI, Japan), 50-73萬道爾頓透明質(zhì)酸(Hyalgan， Fidia， Italy), 50-73萬道 爾頓透明質(zhì)酸(Suplasyn， Bioniche， Ireland)。實施例1.透明質(zhì)酸降低關(guān)節(jié)液內(nèi)的11202與發(fā)炎物質(zhì)為了解在臨床上使用透明質(zhì)酸注入于病人關(guān)節(jié)內(nèi)，其對關(guān)節(jié)液內(nèi)自由基表 現(xiàn)的影響如何，首先取出受過透明質(zhì)酸治療的病人的關(guān)節(jié)液，檢測其內(nèi)所含的自由基量。將所收集的人類關(guān)節(jié)液置于冰上。取200 ^tl的關(guān)節(jié)液置于鐵盤內(nèi)，并放 入化學(xué)冷光檢測儀(CLA-FS1， Tohoku Electronic Ind. Co., Sendai，日本)的 檢測槽內(nèi)。啟動檢測儀，測一段50秒內(nèi)的背景值后，再加入500^1魯米諾(Luminol (5-amino-2,3隱dihydro-l,4-phthalazinedione) ， !)溝買于美國Sigma公 司，粉末溶于磷酸緩沖生理鹽水(PBS)配制成0.1 mM并于4"C保存)或光澤精(Lucigenin (Bis-N-Methylacridinium)，購買于美國Sigma公口:]，粉末溶于磷酸 緩沖生理鹽水(PBS)配制成0.1 mM并于4。C保存)進而檢測自由基的含量直到 300秒停止(每10秒可得一個累積計數(shù)值)。存儲文件并分析。計算時間-計數(shù) 50秒所得的積分平均值，再乘上30則可得300秒的背景積分值。將所有的吋 間-計數(shù)所構(gòu)成的面積積分值扣除300秒的背景積分值，再除上25則可得到檢 體每10秒的平均自由基計數(shù)。結(jié)果表示于圖l。由圖1顯小，50-800萬道爾 頓的透明質(zhì)酸具有降低關(guān)節(jié)液中H202的產(chǎn)生的作用。其中降低H202的表現(xiàn)能 力為60-120萬道爾頓的透明質(zhì)酸〉50-73萬道爾頓的透明質(zhì)酸〉600萬道爾頓 的透明質(zhì)酸。
圖1表示各種不同分子量的透明質(zhì)酸(Hyaluronan)降低關(guān)節(jié)液中&02的產(chǎn) 生。其中降低&02的表現(xiàn)能力為60-120萬道爾頓>50-73萬道爾頓>600萬道爾頓。以未接受過透明質(zhì)酸治療的病人的關(guān)節(jié)液為對照組，由實驗結(jié)果顯示，對 照組的關(guān)節(jié)液內(nèi)，含有大量的02"、 &02的自由基，然而在給予病人透明質(zhì)酸 后，其關(guān)節(jié)液內(nèi)的11202量比對照組明顯的下降(參見圖2)。實施例2.在體外試驗中(in vitro)，透明質(zhì)酸降低自由基產(chǎn)量并能減少軟骨 細(xì)胞的死亡率為了解在體外實驗中，透明質(zhì)酸是否能減低自由基活性，取200pl不同濃 度的&02 (0、 100、 200及400^iM)，利用化學(xué)冷光測定儀測量其自由基的 表現(xiàn)情形。并且另外于200 iliM的環(huán)境下給予20 iul的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid) 并測定自由基的表現(xiàn)量。結(jié)果如圖3A所示，自由基的表現(xiàn)量會隨著H202的 濃度增加而增加，但在H2O2 200 ^iM有加20iLil透明質(zhì)酸處理的環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)自由基的表現(xiàn)受到抑制，且?guī)缀鹾蜎]有加入H202時的表現(xiàn)-樣。由于從文獻得知，自由基的含量增加，會造成細(xì)胞的死亡。于是，為探討透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid)是否能減少因自由基造成的細(xì)胞死亡率，收集老年病人(大于 60歲)的軟骨組織，進而分離出初級的軟骨細(xì)胞進行培養(yǎng)。將裝有檢體的離心管秤重記錄，扣掉離心管的凈重量，記錄軟骨檢體的重 梟。加10ml磷酸緩沖生理鹽水(PBS)于離心管中，水平旋轉(zhuǎn)搖晃五下，再 將PBS吸千。重復(fù)清洗軟骨檢體一次。利用平口鑷子夾起軟骨檢體，轉(zhuǎn)移辛. 10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上。以10mlPBS將軟骨檢體再清洗 次。利用手術(shù)刀將軟 骨檢體做初步分離，將粘附于檢體的軟組織與硬骨組織分離；將分離出的純白 色的軟骨組織移到步驟八的無菌培養(yǎng)皿中。利用手術(shù)刀將軟骨組織細(xì)分切成小 碎片(體積不超過lmm3)。添加60pl第—:型纖維素分解酶(100mg/ml)。 將置有細(xì)分后軟骨組織的細(xì)胞培養(yǎng)皿移放置37°C、 5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中的 搖晃器，以50rpm搖晃四小時。吸取5ml細(xì)胞培養(yǎng)液回沖分解后的軟骨組織， 全部移至預(yù)備的無菌15 ml離心管中。再吸取5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液回沖其分解軟 骨的培養(yǎng)皿，以確保利用第二型纖維素分解酶分離出來的細(xì)胞全部皆收集到預(yù) 備的無菌15ml離心管中。于室溫下，離心1000rpm5分鐘。吸掉上清液，添 加10mlPBS打散細(xì)胞，再次離心1000rpm5分鐘。重復(fù)清洗軟骨細(xì)胞兩次。
添加10 ml細(xì)胞培養(yǎng)液均勻打散細(xì)胞，然后取其50pl細(xì)胞培養(yǎng)液移到1.5 ml 離心小管，加40 pi PBS與10^1的10x錐蟲藍(lán)染料(Trypan Blue),均勻混合后 取10^混合液緩慢放進血球計數(shù)器并在顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)的細(xì)胞密度九 格的計數(shù)數(shù)目x2xl04/9:細(xì)胞數(shù)目/ml。軟骨細(xì)胞以l x 104/ml細(xì)胞密度轉(zhuǎn) 植入錐形瓶，并置放于37。C、 5%032細(xì)胞培養(yǎng)箱。每三天利用拋棄式吸管吸 掉錐形瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加10mlPBS于錐形瓶裡面上緣(切勿直接沖擊細(xì) 胞)，水平緩和搖晃錐形瓶后，吸掉磷酸緩沖生理鹽水(phosphate buffer saline)， 再添加12ml細(xì)胞培養(yǎng)液于錐形瓶中，并將錐形瓶繼續(xù)放于37"C、 5%032細(xì) 胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。進行存活實驗時，于培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的11202 (0、 100、 200及400 ^M)，另外兩組是0及200pM的H2O2皆加入20(il透明質(zhì)酸，如此培養(yǎng)細(xì) 胞一天后，收集軟骨細(xì)胞并計算其存活率。從表示于圖3B的結(jié)果顯示，軟骨 細(xì)胞的存活率隨著^02的濃度增加而下降，但是在含有透明質(zhì)酸的環(huán)境下， 細(xì)胞的存活率反而增加。因此，證明透明質(zhì)酸確實具有降低自由基表現(xiàn)量，并 減少軟骨細(xì)胞的死亡率，進而促進軟骨細(xì)胞增生的功效。圖3B表示在有或無透明質(zhì)酸(20 pl)存在下，軟骨細(xì)胞隨著H202濃度 增加的存活率。結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞的存活率隨著&02的濃度增加而下降， 但是在有透明質(zhì)酸的環(huán)境下細(xì)胞的存活率反而增加。實施例3.透明質(zhì)酸促進對老年人軟骨細(xì)胞生^本實驗進一步測試在有或無透明質(zhì)酸存在下，對老人關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞生長 的影響，測量軟骨細(xì)胞的生長曲線。按照前述實施例2的步驟，培養(yǎng)老人軟骨 細(xì)胞，并于細(xì)胞長至約八成滿時將其分盤，每盤約8xl04個/60mmdish并培 養(yǎng)至隔夜。隔天，取出細(xì)胞培養(yǎng)盤，將細(xì)胞培養(yǎng)液置換成含有l(wèi)mg/ml透明質(zhì) 酸(hyaluronic add)的細(xì)胞培養(yǎng)液來培養(yǎng)細(xì)胞(HA組)，而對照組則更換 般的 培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間持續(xù)至12天為止，并于第5天更換-次培養(yǎng)液。從第0天 (DayO)起開始計算細(xì)胞總數(shù)，而后每兩天計算一次。此實驗重復(fù)二次。結(jié)果表 示于圖4。由所測得的生長曲線可知，老年人類軟骨細(xì)胞在有給予透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid)的狀況下，從第2到第4天可發(fā)現(xiàn)，HA組的細(xì)胞數(shù)明顯的大 于對照組1.7倍，而在第6天HA組比對照組達到大于兩倍的差異。第8辛:12 天HA組生長速度趨緩，但和對照組比起來，仍有1.4至1.6倍的差異。
實施例4.透明質(zhì)酸對老年人軟骨細(xì)胞生長促進是經(jīng)由生長周期的調(diào)控 為了解透明質(zhì)酸是否會調(diào)控老年人類軟骨細(xì)胞的細(xì)胞周期，按照前述實施例2的步驟，于八成滿時將其分盤，每盤約3x105/100 mm dish并于隔天將細(xì) 胞培養(yǎng)液置換成含有1 mg/ml透明質(zhì)酸的細(xì)胞培養(yǎng)液來培養(yǎng)細(xì)胞(HA組)，而 對照組則更換一般的培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間持續(xù)至8天為止。從第0天(DayO)起開 始收集細(xì)胞，而后每兩天收集一次。所收集的細(xì)胞，經(jīng)處理過后，利用流式細(xì) 胞儀(flow cytometery)分析其細(xì)胞周期。先制備單細(xì)胞懸浮液。經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞以PBS潤洗，再以胰蛋白質(zhì)酶處理， 待細(xì)胞變圓后，便以5 ml含胎牛血清(5。/。FCS)的培養(yǎng)液收取細(xì)胞，并均勻地 打散細(xì)胞懸浮液。加入5ml冰冷PBS來清洗細(xì)胞，低速離心5分鐘，之后小 心地去除上清液，可留約50pl溶液，避免碰及細(xì)胞。加入0.2mlPBS并均勻 地打散細(xì)胞。 一邊振蕩混合細(xì)胞懸浮液，同時一滴--滴地加入1 ml 70%酒精 以固定細(xì)胞，靜置在-2(TC冰箱中至少- 小時(酒精固定后樣品可靜置過夜)。 以低速(1200轉(zhuǎn)/分鐘)離心5分鐘，吸除上清液避免觸及細(xì)胞。將細(xì)胞團塊 均勻地打散，加入5mlPBS清洗細(xì)胞。靜置一分鐘后低速1200rpm離心5分 鐘，之后盡量吸除上清液。加入1 ml碘化丙啶PI/聚氧乙烯辛基苯基醚Triton X-100染色液，將細(xì)胞團塊均勻地打散，并輕搖混合，在室溫下暗室中作用 30分鐘(最終濃度為聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton X-100) 0.1%，核醣核酸酶 A(RNase A 0.2 mg/ml &碘化丙啶PI 20嗎/ml，避免重復(fù)使用回溫過的酶)。在 臨上機前混勻樣品，并以35卞m尼龍篩網(wǎng)過濾樣品。于樣本制備的兩小時內(nèi)， 利用流式細(xì)胞儀(flow cytometer) (FL2-A)檢測細(xì)胞熒光的表現(xiàn)，且可按照所得 的數(shù)據(jù)分析細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表示于圖5。于G0/G1期的測定結(jié)果(參見圖5A)，在第4天時對 照組的細(xì)胞數(shù)百分比HA組高，其余則無差異。而于S期的測定結(jié)果(參見圖 5B)，在實驗組與對照組兩組間，從第0至8天并沒有統(tǒng)計上的差異。另外， 在G2/M期的測定結(jié)果(參見圖5C)，發(fā)現(xiàn)第4天時HA組的細(xì)胞數(shù)百分比 較對照組高，但第6天以后則沒有差異。實施例5.透明質(zhì)酸可以增加生長周期調(diào)控因子細(xì)胞周期蛋白Bl (G2/M) 的表現(xiàn)為進一步了解透明質(zhì)酸如何改變細(xì)胞周期的進行，是否和細(xì)胞周期調(diào)控因 子有關(guān)，按照前述實施例2的步驟培養(yǎng)老人軟骨細(xì)胞，且于有或未給予1 mg/ml 透明質(zhì)酸的環(huán)境下，進行培養(yǎng)2、 4、 6及8天，并收集細(xì)胞的蛋白質(zhì)后，以蛋 白質(zhì)印跡法(Western blotting)分析其中各種不同細(xì)胞周期調(diào)控因于的表現(xiàn)情形。
用1倍PBS清洗三次細(xì)胞，并加入RIPA緩沖液(50mM Tris (pH7.5)， 150mMNaCl， 1%NP40， 0.1%十二烷基硫酸鈉SDS， 0.5y。脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholic acid),蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor))將細(xì)胞打破并溶出蛋白 質(zhì)。配合使用刮勺，將細(xì)胞從培養(yǎng)盤上刮下，收集至微量離心管。離心(12000 轉(zhuǎn)速，30min， 4°C)，取出上清液預(yù)備進行電泳分離。蛋白定量過后的檢體 取出20 pg，并依照樣本樣本緩沖液(含甘油)=1:4的比例混合，丄L在IO(TC 的水溫下加熱五分鐘，加樣至電泳槽。進行電泳的后，取出膠體并剪下大小適 合的尼龍紙，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液(100ml濃縮溶液(Tris30.28g及甘氨酸(glycine) 144.9g配置成一公升，pH8.2 8.4) + 700ml二次蒸餾水+ 200ml屮醇)中，將 紙覆蓋在膠體上， 一起放入轉(zhuǎn)移箱(transferchamber),接上電極調(diào)整電流而開。 始進行轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移(Tmnsfer)的條件為300 mA、 2.5 3 hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼 龍紙取出并置于5M脫脂牛奶溶于Tris緩沖液內(nèi)，于室溫下?lián)u一小時。用Tris 緩沖液將尼龍紙清洗干凈(清洗三次，每次五分鐘)，加入一級抗體于室溫下?lián)u --個小時或于4。C搖過夜。用Tris緩沖液清洗尼龍紙，清洗五次，每次五分鐘。 加入二級抗體并于室溫下?lián)u40分鐘。如前述用Tris緩沖液清洗尼龍紙，的后 加入化學(xué)發(fā)光測試組(ECLkit)(溶劑l:溶劑2=1:1)，溶液需完全覆蓋于尼龍紙， 在室溫下反應(yīng)一分鐘。至暗房顯影。
結(jié)果如圖6所示，調(diào)控G0/G1期的蛋白質(zhì)如細(xì)胞周期蛋白D1、 cdk4及 cdk6，在對照組及透明質(zhì)酸處理組(HA組)中皆沒有差異。但在處理過透明 質(zhì)酸(hyaluronic acid)的軟骨細(xì)胞中，于第4天時，調(diào)控G2/M期的蛋白質(zhì) 細(xì)胞周期蛋白Bl表現(xiàn)量略高于對照組。另外和細(xì)胞周期蛋白Bl相關(guān)的蛋白 質(zhì)cdc2則沒有改變。
綜上所述，本發(fā)明已利用不同濃度的過氧化氫(H202)加到軟骨細(xì)胞的 培養(yǎng)環(huán)境中，來模擬細(xì)胞遭受氧化物質(zhì)侵害的狀況。然后在這些系統(tǒng)中添加不 同分子量或來源的透明質(zhì)酸，觀察是否可以減低細(xì)胞發(fā)生的損傷。此項研究的 正面發(fā)現(xiàn)，可進一步說明在關(guān)節(jié)腔中注射透明質(zhì)酸的有效機轉(zhuǎn)，同時提供防治
關(guān)節(jié)炎的另 一種有效模式。此外本發(fā)明的抗-H202透明質(zhì)酸還適用于因鐵過度 累積的血色素沉著病、青銅色糖尿病與色素性肝硬變?；谝陨系膶嶒灲Y(jié)果， 本發(fā)明還提出含透明質(zhì)酸用于制造供改善關(guān)節(jié)炎病癥的口服性食品或飲料的 用途。
權(quán)利要求
1. 一種將透明質(zhì)酸用于改善軟骨細(xì)胞的氧化損害的用途，其中該氧化損害是由活性氧所引起。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該透明質(zhì)酸的分子量介于50-800萬 道爾頓。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中該透明質(zhì)酸的分子量介于60-120萬 道爾頓。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該活性氧選自02—'、OH'、H202及HOCl。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該改善軟骨細(xì)胞的氧化損害是通過減 低活性氧的自由基活性而實現(xiàn)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中透明質(zhì)酸能夠進一步減少軟骨細(xì)胞的 死亡率。
7. -種將透明質(zhì)酸用于促進軟骨細(xì)胞增生的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中透明質(zhì)酸促進軟骨細(xì)胞增生是通過對 軟骨細(xì)胞生長周期的調(diào)控而實現(xiàn)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中該生長周期的調(diào)控是增加生長周期調(diào) 控因子Cyclin B1在G2/M期的表現(xiàn)。
10. —種用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥品，其特征在于，包含分子量介于 50-800萬道爾頓的透明質(zhì)酸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的醫(yī)藥品，其中該透明質(zhì)酸的分子量介于60-120 萬道爾頓。
12. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的醫(yī)藥品，其中該透明質(zhì)酸用于改善關(guān)節(jié)軟骨細(xì) 胞的氧化損害。
13. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的醫(yī)藥品，其中該透明質(zhì)酸用于降低關(guān)節(jié)液內(nèi)的 自由基活性。
14. 一種供改善關(guān)節(jié)炎病癥的口服性食品，其特征在于，包含分子量介于 50-800萬道爾頓的透明質(zhì)酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的食品，其中該透明質(zhì)酸的分子量介于60-120 萬道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸(hyaluronic acid、又名玻璃質(zhì)酸)用于改善軟骨細(xì)胞的氧化損害，進而促進軟骨細(xì)胞增生的用途。更特別地，本發(fā)明涉及分子量介于60-120萬道爾頓(Dalton)的透明質(zhì)酸用以保護活性氧傷害軟骨細(xì)胞，及促進軟骨細(xì)胞增生的用途。本發(fā)明還涉及透明質(zhì)酸用于制造供治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎的醫(yī)藥品，及提供改善關(guān)節(jié)炎病癥的口服性食品或飲料的用途。
文檔編號A61K31/726GK101209259SQ20061017230
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日
發(fā)明者徐煥清, 江清泉, 鄭劍廷 申請人:江清泉;鄭劍廷;徐煥清