專利名稱：用于治療高膽紅素血癥的膽紅素吸附材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物分離工程技術領域。涉及到合成了具有賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺吸附功能基的系列膽紅素吸附材料，并在病人血漿中進行了吸附實驗。
背景技術：
膽紅素是衰老紅細胞中血紅素的代謝產(chǎn)物，正常情況下在肝臟與葡萄糖醛酸結合后經(jīng)進一步代謝排出體外。如果肝臟對其代謝出現(xiàn)障礙，則血液中的膽紅素濃度會升高，當膽紅素濃度超過17μmol/L時就會產(chǎn)生黃疸，此時的膽紅素又成為一種內(nèi)源性毒素，極易透過生物膜，并透過血腦屏障與神經(jīng)核團結合，干擾腦細胞的正常代謝及功能，對大腦產(chǎn)生不可逆的毒副作用。膽紅素腦病易發(fā)生于新生兒，并往往導致死亡。膽道阻塞、急性及慢性黃疸性肝炎、中毒性肝炎、各種溶血性肝炎、新生兒黃疸癥等都會導致肝臟對膽紅素的代謝紊亂，從而導致病患者體內(nèi)膽紅素的積累，產(chǎn)生高膽紅素血癥，他們體內(nèi)的膽紅素濃度可高達近700μmol/L，致使患者生理失調(diào)。當前，急性肝功能衰竭導致的死亡率高達80％。如果能夠及時的除去血液中過量的膽紅素，將極大的緩解病情，給病人肝細胞進行自我修復和肝移植爭取時間，對挽救病人的生命具有重大意義。
大量研究表明，利用血液凈化吸附療法可以有效地治療高膽紅素血癥。此療法的關鍵是膽紅素吸附材料的性能。近20年來，膽紅素吸附材料的研究主要集中在載體和功能基團兩方面，依據(jù)載體的類型可分為合成樹脂類吸附劑和多糖類吸附劑，依據(jù)功能基團的類型可分為廣譜類吸附劑和親和吸附劑。
合成樹脂類吸附劑是網(wǎng)狀結構的高分子聚合物，可根據(jù)不同的需要進行人工合成，使其具備特定的吸附性能，是目前研究較多的吸附劑。樹脂類吸附劑可分為離子交換樹脂和吸附樹脂兩大類。a)應用離子交換樹脂型膽紅素吸附材料去除膽紅素的實例有以乙稀基苯共聚合體為骨架的BL-300陰離子交換樹脂型膽紅素吸附材料，此類吸附材料已商品化。在實際治療中，該類吸附材料對病人血漿中膽紅素的去除率可達到50~60％，但治療時間較長，一般需要4~6小時。另外，此類吸附材料的價格昂貴(6000~9000RMB)，很難被廣大高膽紅素血癥患者所接受。b)應用吸附樹脂型膽紅素吸附材料去除膽紅素的實例有高分子樹脂型膽紅素吸附劑(中國專利號ZL 200410016088.2)、吸附膽紅素的環(huán)糊精交聯(lián)聚合物微球(中國專利號ZL 03111583.7)等。高分子樹脂型膽紅素吸附劑(中國專利號ZL 200410016088.2)是以聚苯乙烯-二乙烯苯為載體，β環(huán)糊精為功能基吸附膽紅素。動物全血灌流實驗表明這種吸附材料對膽紅素的去除率可達61.2％，但沒有給出更為詳細的實驗結果。吸附膽紅素的環(huán)糊精交聯(lián)聚合物微球(中國專利號ZL 03111583.7)是以二異氰酸酯為交聯(lián)劑，與環(huán)糊精單體縮合而成。實驗結果表明該類吸附材料在不含牛血清白蛋白膽紅素溶液和含牛血清白蛋白膽紅素溶液中對膽紅素的去除率分別為87.5％和51.5％?？梢姲椎鞍追肿訉ξ叫Ч绊憞乐?，并且專利中并沒考察吸附材料在實際血漿中對膽紅素的吸附性能，而只有在實際血漿中對膽紅素具有良好吸附性能的吸附材料才具有臨床意義。
材料表面功能基與膽紅素具有親和作用的吸附劑被稱為親和吸附劑，以人血清白蛋白(中國專利號ZL 01128196.0)以及三嗪染料(Denizli A等，Journal of Chromatography BBiomedical Sciences and Applications，1998，707(1-2)25-31)為功能基的吸附劑均屬此類。用于治療高膽紅素血癥的免疫吸附材料(中國專利號ZL 01128196.0)是以瓊脂糖凝膠為載體，人血清白蛋白HSA為吸附膽紅素的功能分子。此類吸附材料雖然血液相容性良好，在血漿中對膽紅素的去除率達到57.3％。但末端偶聯(lián)人血清白蛋白HSA為配基吸附膽紅素，使得制備成本偏高，而且人血清白蛋白HSA的使用也使得吸附材料易被微生物所污染，不易保存。以三嗪染料為功能基的膽紅素吸附劑，以二甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸-2-羥基乙酯的共聚物為載體。此類吸附材料對膽紅素的吸附量可達24.2mg/g，但染料配基的脫落問題使得該類吸附材料很難應用于臨床。
目前，只有日本生產(chǎn)的乙稀基苯共聚合體陰離子樹脂在臨床上得到了應用，其它吸附劑離臨床應用還有很大的距離。研究新型的膽紅素吸附劑解決目前膽紅素吸附材料存在的(1)病人血漿體系中對膽紅素的吸附容量低；(2)血液相容性差、價格昂貴等缺陷，對挽救重癥肝炎病人的生命具有重要意義。
我們提出了以天然的多糖類材料為載體，通過篩選功能基團鏈以提高吸附材料對膽紅素的吸附容量，最終合成對血液中膽紅素去除率高、血液相容性好的吸附材料?？傮w構想是(1)選擇多糖類材料瓊脂糖凝膠為載體以增強血液相容性。(2)鑒于間隔臂和末端功能基對膽紅素的吸附都有貢獻，通過計算機軟件計算吸附材料的整個功能基團鏈與膽紅素分子的疏水性常數(shù)，根據(jù)“相似相溶”原理，推測與膽紅素分子疏水性常數(shù)最接近的吸附材料對膽紅素的吸附性能最優(yōu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于設計、合成一種無毒、無害、膽紅素吸附效果好、成本低的多糖型吸附材料，以克服現(xiàn)有技術中主要存在的吸附材料在實際病人血漿中對膽紅素吸附容量低、價格昂貴等缺陷。達到對膽紅素高選擇性的去除，并且具有良好的血液相容性的目的。
本發(fā)明的技術方案如下(1)選用血液相容性良好的瓊脂糖凝膠為載體，它是從天然植物中提取出來的多糖類物質(zhì)，含有大量的羥基。通常情況下，它是惰性的，不具有吸附性，所以血液相容性好。使用N，N’羰基二咪唑活化載體，以雙氨基試劑、雙醛基試劑作為間隔臂分子，根據(jù)吸附材料與膽紅素分子之間可能存在的氫鍵、疏水、離子鍵等作用機制，鍵合幾種不同的末端功能基(賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺)合成一系列膽紅素吸附材料。
(2)通過計算機軟件優(yōu)化吸附材料的最低能量構型，并計算此構型時整個功能基團鏈的疏水性常數(shù)，通過與膽紅素分子疏水性常數(shù)的比較來確定吸附性能最佳的吸附材料。一般認為，與膽紅素分子疏水性常數(shù)較接近的吸附材料具有較好的吸附性能，這是因為根據(jù)“相似相溶”原理，其與膽紅素分子的吸附作用力應該較強。
按照上述實驗構思，本發(fā)明提供出了用于治療高膽紅素血癥的膽紅素吸附材料，包括選用瓊脂糖凝膠為載體，采用N，N’羰基二咪唑活化載體，以雙氨基試劑、雙醛基試劑作為間隔臂分子，末端分別偶聯(lián)賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺的一系列對膽紅素具有較高吸附容量的多糖型吸附材料的合成過程，其特征在于1)利用N，N’羰基二咪唑活化瓊脂糖凝膠，其中N，N’羰基二咪唑的質(zhì)量濃度為60~220g/L，瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間1~2小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的活性基團密度為72~192mmol/Lgel；2)利用雙氨基試劑合成帶有氨基功能基團的瓊脂糖凝膠。其中雙氨基試劑在溶液中的體積百分比為2~20％，N，N’羰基二咪唑活化的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間2~4小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的氨基密度為50~107mmol/Lgel；3)利用雙醛基試劑合成帶有醛基功能基團的瓊脂糖凝膠。其中雙醛基試劑在溶液中的體積百分比為3~25％，帶有氨基功能基團的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間2~18小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的醛基密度為13~23mmol/Lgel；
4)分別利用賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺與帶有醛基功能基團的瓊脂糖凝膠反應，合成系列膽紅素吸附材料。其中，賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺在溶液中的摩爾濃度分別為0.2~1.0mol/L，帶有醛基功能基團的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間2~24小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的吸附功能基密度為13~23mmol/Lgel；5)以賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料，在膽紅素濃度為324mg/L的人血漿中的吸附容量分別為0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。密度為23mmol/Lgel的以正丁胺為末端功能基的吸附材料，對膽紅素濃度為474μmol/L的實際病人血漿中的膽紅素去除率達到55.2％。
本發(fā)明的效果和益處是選用多糖類材料瓊脂糖凝膠為載體，與其他吸附材料相比，具有血液相容性好、非特異性吸附小等優(yōu)點，增強了治療的安全性；采用賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺為末端功能基，取代人血清白蛋白HSA，保證治療效果，降低生產(chǎn)成本，使材料易于消毒、運輸和保存。如密度為23mmol/Lgel的以正丁胺為末端功能基的吸附材料，對膽紅素濃度為474μmol/L的實際病人血漿中的膽紅素去除率達到55.2％，0.5小時吸附基本達到平衡。膽紅素去除率接近進口吸附柱水平，但吸附效率遠高于進口吸附柱。


附圖是以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料在實際病人血漿中對膽紅素的去除率與時間的關系圖。
座標橫座標為吸附時間，單位為小時。縱座標為膽紅素的去除率，用百分率％表示。符號□代表總膽紅素符號○代表直接膽紅素，符號△代表間接膽紅素。
實驗條件密度為23mmol/Lgel的以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料吸附材料55ml(裝柱)，動態(tài)吸附時間2.5小時，含膽紅素病人血漿與吸附材料的體積比為10∶1，膽紅素初始濃度為474μmol/L。
具體實施例方式
以下結合技術方案和附圖，詳細敘述本發(fā)明的細節(jié)最佳實施例。
實施例1N，N’羰基二咪唑活化瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖凝膠0.43~1.0L，用去離子水經(jīng)過真空抽濾4-5次除去凝膠中的防腐劑，依次以30％、70％、100％的丙酮清洗凝膠，稱取60~220g的N，N’羰基二咪唑溶于1.0L丙酮中，然后把洗好的凝膠加到該溶液中，在溫度25~37℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應1~2小時。反應結束后，用6~10倍體積的丙酮反復清洗已活化的凝膠，真空抽濾，除去反應過程中產(chǎn)生的咪唑。此時瓊脂糖凝膠表面的活性基團密度為72~192mmol/Lgel。
實施例2雙氨基試劑偶聯(lián)瓊脂糖凝膠的制備在1.0L丙酮中加入0.021~0.25L的雙氨基試劑(如二氨基二丙基亞胺、己二胺、乙二胺等)后，再加入0.43~1.0L用N，N’羰基二咪唑活化好的瓊脂糖凝膠，在溫度25~37℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應2~4小時。反應結束后，用6~10倍體積的去離子水反復清洗反應后的凝膠，然后再用0.15mol/L、pH8.2的硼酸緩沖液清洗膠樣。此時瓊脂糖凝膠表面的氨基密度為50~107mmol/Lgel。
實施例3帶有醛基活性基團的瓊脂糖凝膠的制備把0.43~1.0L偶聯(lián)雙氨基試劑的瓊脂糖凝膠分散在1.0L含雙醛基試劑(如戊二醛、乙二醛等)體積百分比為3~25％的0.15mol/L、pH8.2的硼酸緩沖液中，在溫度25~37癈，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應2~18小時。反應結束后，依次用6~10倍體積的去離子水，6~10倍體積的2mol/L醋酸，6~10倍體積的0.15mol/L、pH8.2的硼酸緩沖液清洗膠樣，抽干。此時瓊脂糖凝膠表面的醛基密度為13~23mmol/Lgel。
實施例4通過疏水性常數(shù)的計算篩選功能基利用計算機軟件ChemOffice計算以賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺為末端功能基的吸附材料的疏水性常數(shù)分別為-0.8441，-0.8607，-1.1197和0.8978，膽紅素分子的疏水性常數(shù)為1.0413。理論上以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料的疏水性常數(shù)(0.8978)與膽紅素分子的疏水性常數(shù)(1.0413)最接近，根據(jù)“相似相溶”原理，推測其對膽紅素應具有較高的吸附容量，推測的準確性需要進一步通過吸附實驗驗證。
實施例5賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺為末端功能基的吸附材料的制備及評價分別將賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺溶于1.0L的0.15mol/L、pH8.2的硼酸緩沖液中，使其摩爾濃度為0.2~1.0mol/L，將0.43~1.0L帶有醛基活性基團的瓊脂糖凝膠分別加入其中，在溫度25~37癈，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應2~24小時。反應結束后，用6~10倍體積的去離子水清洗膠樣，用硼氫化鈉還原反應過程中生成的雙鍵。此時瓊脂糖凝膠表面的吸附功能基密度為13~23mmol/Lgel。
分別取含有不同功能基的膽紅素吸附材料0.5ml，加入5ml高膽紅素血癥病人血漿，膽紅素濃度為324mg/L，靜態(tài)吸附2.5小時，分析吸附前后血漿中膽紅素的變化量，計算膽紅素吸附量。實驗結果表明以賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺為末端功能基的吸附材料，對人血漿中膽紅素的吸附容量分別為0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。其中以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料的性能優(yōu)于其它吸附材料，這一結果在某種程度上與理論計算的結果吻合。
實施例6以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料的體外動態(tài)吸附實驗取以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料55ml裝入吸附柱中(內(nèi)徑4cm，高度6cm)，將550ml患有高膽紅素血癥病人的血漿過柱循環(huán)2.5小時，分析吸附前后血漿中膽紅素的變化量，計算膽紅素去除率。實驗結果表明以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料，對膽紅素濃度為474靘ol/L的實際病人血漿中的總膽紅素去除率達到55.2％，直接膽紅素的去除率達到57.1％，間接膽紅素的去除率達到52.2％，這一效果接近進口膽紅素吸附柱水平。從附圖1中還可以看出，吸附材料在0.5小時內(nèi)對膽紅素吸附基本平衡，由于進口膽紅素吸附柱4~6小時才能基本達到吸附平衡，這一結果可以說明以正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料對膽紅素的吸附速度遠高于進口膽紅素吸附柱。
權利要求
1.一種用于治療高膽紅素血癥的膽紅素吸附材料，包括選用瓊脂糖凝膠為載體，采用N，N’羰基二咪唑活化載體，以雙氨基試劑、雙醛基試劑作為間隔臂分子，末端分別偶聯(lián)賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺的一系列對膽紅素具有較高吸附容量的多糖型吸附材料的合成方法，其特征在于a)利用N，N’羰基二咪唑活化瓊脂糖凝膠，其中N，N’羰基二咪唑的質(zhì)量濃度為60~220g/L，瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間1~2小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的活性基團密度為72~192mmol/Lgel；b)利用雙氨基試劑合成帶有氨基功能基團的瓊脂糖凝膠，其中雙氨基試劑在溶液中的體積百分比為2~20％，N，N’羰基二咪唑活化的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間2~4小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的氨基密度為50~107mmol/Lgel；c)利用雙醛基試劑合成帶有醛基功能基團的瓊脂糖凝膠，其中雙醛基試劑在溶液中的體積百分比為3~25％，帶有氨基功能基團的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37℃，反應時間2~18小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的醛基密度為13~23mmol/Lgel；d)分別利用賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺與帶有醛基功能基團的瓊脂糖凝膠反應，合成系列膽紅素吸附材料，其中，賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺在溶液中的摩爾濃度分別為0.2~1.0mol/L，帶有醛基功能基團的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，反應溫度25~37？，反應時間2~24小時，反應后瓊脂糖凝膠表面的吸附功能基密度為13~23mmol/Lgel。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于治療高膽紅素血癥的膽紅素吸附材料，其特征還在于以賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺為末端功能基的膽紅素吸附材料，在膽紅素濃度為324mg/L的人血漿中的吸附容量分別為0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。密度為23mmol/Lgel的以正丁胺為末端功能基的吸附材料，對膽紅素濃度為474μmol/L的實際病人血漿中的膽紅素去除率達到55.2％。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分離工程技術領域，用于治療高膽紅素血癥的膽紅素吸附材料，采用瓊脂糖凝膠為載體，用N，N’ 羰基二咪唑活化載體，以雙氨基試劑、雙醛基試劑作為間隔臂分子，末端分別偶聯(lián)賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺，合成了系列膽紅素吸附材料。其特征為賴氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺膽紅素吸附材料在膽紅素濃度為324mg/L的人血漿中，吸附容量分別為0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。以正丁胺為末端功能基的吸附材料，對病人血漿中的膽紅素去除率達到50.0％以上。本發(fā)明的效果和益處是該材料具有價格低廉、可快速的從病人血漿中除去膽 紅素，吸附容量大，血液相容性好等優(yōu)點。
文檔編號A61M1/38GK1876226SQ20061020009
公開日2006年12月13日 申請日期2006年1月27日 優(yōu)先權日2006年1月27日
發(fā)明者賈凌云 申請人:大連理工大學