專利名稱：制備富含igf－1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，利用柞蠶絲腺作為生物反應器制備富含類胰島素生長因子-1(IGF-1)的柞蠶粉，作為一種提高動物生產(chǎn)性能的飼料添加劑。
背景技術：
胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是一種由70個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對分子量為7649道爾頓，等電點pH約8.2，其結(jié)構與胰島素原(proinsulin)相似，有3個二硫鍵，將肽鏈緊密的連接起來。幾乎所有動物類型組織中都含有IGF-1，但主要來源于肝臟循環(huán)過程中。IGF-1的生理功能一是提高組織攝取葡萄糖的能力，二是抑制肝糖原的分解并促進肝糖原及肌糖原的合成。IGF-1本身又是生長激素的介質(zhì)，具有促進生長的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)IGF-1具有自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)功能。許多肝外組織細胞能分泌IGF-1作用于自身或相鄰的組織細胞，促進DNA的合成和表達，促進細胞生長和分裂。
研究表明，經(jīng)口攝入的IGF-1在動物胃和十二指腸中穩(wěn)定。IGF-1可促進胃腸道發(fā)育，給未吮乳初生仔豬喂以牛奶為基礎的添加2靏/ml的重組人IGF-1的嬰兒配方乳24小時結(jié)果顯示，添加IGF-1的配方乳與不添加IGF-1的配方乳相比，可使胃、胰腺的DNA、RNA含量增加，胰腺重量以及小腸隱窩細胞增殖速率顯著增加，表明口服IGF-1刺激了小腸隱窩細胞的增殖。高劑量的IGF-1可使小腸的重量、蛋白質(zhì)和DNA濃度有較大幅度的提高，而正常濃度的IGF-1可顯著刺激仔豬回腸絨毛生長。IGF-1可刺激胃腸道功能的成熟，正常水平的IGF-1可提高乳糖酶和麥芽糖酶的比活性。目前的各種報道普遍認為，IGF-I能顯著刺激小腸前部刷狀緣酶的活性。IGF-1大部分是由肝臟合成，主要存在于血液中，而血清中的IGF-1含量極低，100L血漿IGF-1的含量不到1mg，6000kg血漿IGF-1的含量僅為38mg。且IGF-1蛋白極不穩(wěn)定，純化困難。正因為如此，我們采用生物工程的方法，來大量生產(chǎn)IGF-1。
IGF-1在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達易形成包涵體，且無翻譯后修飾；在酵母表達系統(tǒng)中表達也不穩(wěn)定，且只能進行簡單的后加工修飾；動物細胞、哺乳動物乳腺和植物表達系統(tǒng)等雖然克服了原核表達系統(tǒng)的缺陷，在產(chǎn)品的抗原性、免疫源性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，能夠進行糖基化等后加工的特點，但是還存在著表達水平較低等缺點。
昆蟲表達系統(tǒng)與其它表達系統(tǒng)相比，具有以下特點(1)轉(zhuǎn)基因昆蟲所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)能夠被糖基化；(2)有些藥物，如抗血栓形成藥物和血液稀釋劑用轉(zhuǎn)基因昆蟲來生產(chǎn)可能更好，因為沒有生物交叉反應；(3)由于昆蟲的特殊生物學特性(世代周期短，群體大，生產(chǎn)水平高和維持費用低)，利用昆蟲作為生物反應器生產(chǎn)藥物相對來講成本低廉。尤其是蠶類絲腺作為生物反應器生產(chǎn)目的蛋白，具有表達量高、分離純化工藝相對簡單等優(yōu)點。
柞蠶是完全變態(tài)的絹絲類昆蟲，生長至五齡后期合成并分泌一種絲素蛋白，約占蠶絲的80％。柞蠶絲素蛋白在結(jié)構上與家蠶不同，家蠶絲素蛋白是由兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成，而柞蠶絲素蛋白是由一條多肽鏈構成。根據(jù)柞蠶絲素蛋白這一特點，構建了柞蠶絲素基因轉(zhuǎn)移表達載體，利用同源重組生產(chǎn)外源蛋白產(chǎn)物。如上所述，因為IGF-1具有促生長的作用和柞蠶作為表達宿主的特點，我們利用柞蠶生產(chǎn)IGF-1，并將其加工，制成富含IGF-1的仔豬飼料添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用柞蠶作為生物反應器大量表達外源基因的方法，在柞蠶絲腺中表達IGF-1，并加工成柞蠶粉，作為仔豬的飼料添加劑應用于動物生產(chǎn)中，達到促進斷奶仔豬的腸道發(fā)育和促進仔豬生長的目的。
本發(fā)明的目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是克隆柞蠶染色體上絲素基因的5’端和3’端調(diào)控區(qū)DNA序列，以此DNA片段為同源序列，構建柞蠶絲素基因為靶點的轉(zhuǎn)移表達載體。將IGF-1基因插入到轉(zhuǎn)移表達載體上構建IGF-1轉(zhuǎn)化元件。將IGF-1轉(zhuǎn)化元件用脂質(zhì)體包埋，直接注射到柞蠶雌蛾的交配囊或雄蠶蛹的睪丸內(nèi)，交配產(chǎn)卵后外源基因通過同源重組整合到柞蠶染色體上。篩選含有外源基因的轉(zhuǎn)基因柞蠶，使其在體內(nèi)大量表達IGF-1。最后將表達IGF-1的柞蠶加工成柞蠶粉，制成飼料添加劑，用于仔豬生產(chǎn)。
本發(fā)明制備的IGF-1與天然產(chǎn)物相似，生產(chǎn)工藝簡單，具有較高的生物學活性，制成的飼料添加劑低劑量添加到仔豬日糧中，可顯著提高動物采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，增加生產(chǎn)性能，是一種高效的飼料添加劑。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果是1、柞蠶的世代周期短，易于繁殖。
2、柞蠶個體大、表達量高，可大量表達外源蛋白。
3、柞蠶絲腺作為生物反應器能夠?qū)λ磉_的蛋白質(zhì)進行糖基化、磷酸化等修飾作用，與IGF-1天然結(jié)構相似，具有高生物活性。


圖1是PCR擴增柞蠶絲素基因5’端調(diào)控區(qū)圖片，其中1蠶絲素基因5’端調(diào)控區(qū)DNA序列，
MDL-2000 Marker；圖2是PCR擴增柞蠶絲素基因3’端調(diào)控區(qū)圖片，其中1蠶絲素基因3’端調(diào)控區(qū)DNA序列，MDL-2000 Marker；圖3是Southern雜交結(jié)果圖片，其中1l-Hind III DNA Marker，2~5基因組DNA；圖4是Western雜交結(jié)果圖片，其中M蛋白Marker，1IGF-1蛋白；圖5、6是100x電鏡觀察小腸絨毛生長結(jié)果圖片，其中圖5為空白對照，圖6為柞蠶粉2；圖7是構建IGF-1轉(zhuǎn)化元件示意框圖。
圖8、9是250X電鏡觀察小腸絨毛生長結(jié)果圖片，圖8為空白對照，圖9為柞蠶粉2。
具體實施例方式實施例1IGF-1基因的獲得根據(jù)IGF-1基因序列，設計并合成IGF-1基因的引物IGF1-F5’-atg gga ccg gag acg ctc tgc ggg gct gag-3’；IGF1-R5’-tct aga tta cta agc tga ctt ggc agg ctt gag-3’；提取豬肝臟組織基因組DNA，用上述引物進行PCR擴增獲得IGF-1基因，PCR擴增條件為94℃預變性1min，94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，最后72℃延伸5min。
實施例2釣取柞蠶絲素基因5’端和3’端非編碼區(qū)序列(1)柞蠶DNA的提取取柞蠶蛹脂肪組織0.5g，液氮研磨成粉狀，加入提取緩沖液和5U/ml蛋白酶K，65℃水浴4h，分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，經(jīng)乙醇沉淀，干燥后溶于200μl緩沖液中，加5U/ml RNase，37℃保溫1h。用酚/氯仿抽提1次，上清用異丙醇沉淀，干燥后溶于400靗ddH2O中，備用。
(2)柞蠶絲素基因5’端DNA片段的克隆根據(jù)柞蠶絲素基因5’端DNA序列，設計并合成一對引物5’-gtc gtt gat ttt gtt gtaggc att-3’和5’-ggt tat gag agc tgg aac cga act g-3’。以柞蠶基因組DNA為模板，PCR擴增出柞蠶絲素基因5’端1.9kb長的DNA片段(圖1)。經(jīng)測序分析所釣取的DNA為柞蠶絲素基因5’端調(diào)控區(qū)序列。
(3)釣取柞蠶絲素基因的3’端DNA序列根據(jù)柞蠶絲素基因3’端DNA序列，設計并合成一對引物，5’-aat acg aat gtg att tccttt ata ttt gac cg-3’和5’-ctg aaa agg gaa aac cat gct tga-3’。以柞蠶基因組DNA為模板，PCR擴增出柞蠶絲素基因3’端1.5kb長的DNA片段(圖2)。經(jīng)測序分析所釣取的DNA為柞蠶絲素基因3’端調(diào)控區(qū)序列。
實施例3構建IGF-1轉(zhuǎn)化元件將實施例2中釣取的5’端和3’端PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)低熔點瓊脂糖凝膠電泳法回收、純化，采用PCR技術和連接酶連接的方法，把他們構建成如圖7所示轉(zhuǎn)化元件，轉(zhuǎn)化元件經(jīng)測序鑒定用于轉(zhuǎn)化。
實施例4外源基因?qū)胱跣Q卵柞蠶滯育蛹經(jīng)過體表消毒后解剖，找到雄蠶睪丸，將2靗經(jīng)過脂質(zhì)體處理的轉(zhuǎn)化元件(1靏DNA+30靗脂質(zhì)體，混勻后室溫放置30min)，注射到睪丸內(nèi)，涂上抗生素(抑菌)用蠟將體表傷口密封，使其正常發(fā)育，采用常規(guī)方法與雌蛾交配制種。產(chǎn)卵后孵化養(yǎng)蠶，檢測個體是否攜帶外源基因。
將轉(zhuǎn)化元件經(jīng)過脂質(zhì)體處理(1μgDNA+30脂質(zhì)體，混勻后室溫放置30min)，取2μl注射到處女蛾交配囊，再與雄蛾交配，使其產(chǎn)卵孵化。檢測其所產(chǎn)卵孵化而成的后代個體是否攜帶外源基因。
實施例5檢測攜帶外源基因的后代個體及表達產(chǎn)物取5齡期柞蠶，提取基因組DNA(參見實施例2)，用雙酶切，以IGF-1基因序列作為探針進行Southern雜交(圖3)，鑒定外源基因的整合。
取5齡期柞蠶絲腺在液氮中碾成粉末，提取蛋白質(zhì)，通過Western雜交對表達產(chǎn)物進行鑒定(圖4)。由以上結(jié)果可知，IGF-1基因已被重組到柞蠶的絲素基因中。
實施例6柞蠶粉飼料添加劑的制備將轉(zhuǎn)基因柞蠶進行脫水、風干處理，然后粉碎制成柞蠶粉，用作飼料添加劑。
柞蠶粉的要求如下感官指標色澤一致，無霉變、結(jié)塊和異味、異臭；水分不高于10％；有毒有害物質(zhì)鉛含量不高于40mg/kg，砷含量不高于10mg/kg(添加有機砷制劑不高于100mg/kg)，沙門氏菌不得檢出；衛(wèi)生指標產(chǎn)品和原料符合GB13078執(zhí)行。
實施例7仔豬飼養(yǎng)試驗選擇品種一致、胎次接近、窩仔數(shù)10-12頭的7d仔豬12窩，隨機分為4組，每組3窩，自仔豬7天起進行補飼。試驗采用完全隨機化設計進行，試驗處理見表1。
表1添加劑用量表

將表1中處理的添加物加入到基礎日糧(表2)中進行飼養(yǎng)試驗，試驗期為5周。
表2基礎日糧表


斷乳及其后2周仔豬體重及日增重見表3。
表3斷乳及其后2周仔豬體重及日增重

上述結(jié)果可知，在斷乳仔豬飼料中添加富含IGF-1的柞蠶粉，可顯著提高仔豬的體重和日增重，促進仔豬生長。
電鏡觀察柞蠶粉2與對照組小腸絨毛生長狀況可見，小腸絨毛數(shù)量和粗細度比對照組明顯，由表4可知，各試驗處理間21d仔豬小腸長度與體重差異顯著，柞蠶粉各添加組均高于空白對照組(p＜0.05)；厚度也以柞蠶粉2為最高。42d斷乳仔豬的各指標也具有類似趨勢(表5)表4柞蠶粉對斷乳前仔豬(21d)腸道發(fā)育的影響


表5柞蠶粉對斷乳后2周仔豬(42d)腸道發(fā)育的影響

權利要求
1.制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征在于以柞蠶染色體DNA絲素基因的5’端與3’端非翻譯區(qū)及部分結(jié)構基因作為同源序列，構建柞蠶絲素基因轉(zhuǎn)移表達載體的轉(zhuǎn)化元件，并導入柞蠶中，在柞蠶體絲腺中表達外源蛋白，并將其作為飼料添加劑應用于生產(chǎn)實踐。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征還在于利用柞蠶染色體DNA絲素基因的5’端與3’端非翻譯區(qū)及部分結(jié)構基因作為同源序列，線性DNA片段包括各種基因的5’端調(diào)控區(qū)域與3’端終止區(qū)域及部分結(jié)構基因；也包括與該基因相鄰的其它基因片段。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征在于轉(zhuǎn)化元件中的外源基因為IGF-1基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征還在于利用柞蠶染色體DNA絲素基因的5’端與3’端非翻譯區(qū)及部分結(jié)構基因作為同源序列。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征還在于利用柞蠶染色體DNA絲素基因的5’端與3’端非翻譯區(qū)及部分結(jié)構基因作為同源序列進行同源重組，將外源基因轉(zhuǎn)移到柞蠶染色體上。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征在于以下組建步驟a)構建含有外源基因的柞蠶絲素基因轉(zhuǎn)移表達載體轉(zhuǎn)化元件，該載體含有柞蠶絲素基因5’端與3’端非翻譯區(qū)及部分結(jié)構基因序列；b)將步驟a)中的轉(zhuǎn)移表達載體轉(zhuǎn)化元件脂質(zhì)體包埋后直接注射到柞蠶雌蛾的交配囊或雄蠶幼蟲的睪丸內(nèi)，交配后獲得蠶卵；c)通過正常的發(fā)育，孵化；d)對轉(zhuǎn)基因柞蠶進行鑒別，獲得表達IGF-1的轉(zhuǎn)基因柞蠶。e)將表達IGF-1的轉(zhuǎn)基因柞蠶或蛹制成粉狀添加劑用于飼料中。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種制備富含IGF-1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，其特征是將IGF-1基因?qū)胱跣Q個體獲得轉(zhuǎn)基因柞蠶品種及后代。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備富含IGF－1的柞蠶粉作為仔豬飼料添加劑，是將IGF－1基因構建成轉(zhuǎn)化元件重組到柞蠶的絲線基因中，使得外源基因得以表達，并將富含IGF－1的柞蠶制成柞蠶粉，用作仔豬飼料添加劑。本發(fā)明產(chǎn)品口感細膩，易于攝食，生物利用度高，將其添加到動物飼料中，可以提高動物采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，增加動物生產(chǎn)性能。
文檔編號A61K38/30GK101023778SQ200610200269
公開日2007年8月29日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權日2006年6月16日
發(fā)明者徐永平 申請人:大連理工大學