專利名稱：三肽和四肽硫醚的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三肽和四肽硫醚、包含它們的藥物組合物、它們的藥學(xué)應(yīng)用、以及它們的制備。
背景技術(shù)：
美國(guó)專利第5599903、5763570、5767086、5786336、和5955432號(hào)，歐洲專利公開(kāi)第0 645 397號(hào)，以及PCT國(guó)際公開(kāi)第WO95/08563和WO 96/40205號(hào)披露了作為還原的谷胱甘肽(L-γ-谷氨?；?L-半胱氨酰甘氨酸)的類似物的各種三肽和四肽化合物，包括下式的化合物[WO 95/08563] 以及它們的C1-10烷基或烯基或C7-12芳烷基酯、酰胺、以及混合的酯/酰胺，其中Z為S、O、或C；n為1到3；
當(dāng)Z為S或O以及n為1時(shí)，X為C1-20烴基，可選地包含1或2個(gè)非鄰位O、S、或N雜原子，未取代或被鹵、NO、-NO2、-NR2、-OR、或-SR單或二取代，其中R為H或C1-4烷基；當(dāng)Z為S以及n為2時(shí)，一個(gè)X如上定義，另一X為C1-4烷基；以及當(dāng)Z為C以及n為3時(shí)，一個(gè)X如上定義，另兩個(gè)X獨(dú)立地為H或C1-4烷基；YOO為γ-glu、β-asp、glu，asp、γ-glu-gly、β-asp-gly、glu-gly、asp-gly；以及AAc為通過(guò)肽鍵連接至該化合物的其余部分的氨基酸。
所述化合物被描述為具有各種用途，包括作為表征谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)同工酶中以及確定細(xì)胞和組織的GST補(bǔ)體中所用的試劑、作為層析法親和性配體、結(jié)合劑、以及酶抑制劑；以及治療性用于增強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒性、提高骨髓中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓細(xì)胞的分化、減輕化學(xué)治療劑對(duì)骨髓的破壞作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
TLK117，在那些專利和公開(kāi)物中鑒定為TER117，并具有各種名稱γ-Glu-Cys(Bz)-苯基Gly、γE-C(Bz)-G、γE-C(Bz)-PG、γE-C(苯甲基)-G，以及苯甲基PG，是這些化合物之一。TLK117是化學(xué)式如下的化合物
并且可以命名為L(zhǎng)-γ-谷氨?；?S-(苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。TLK117抑制GST P1-1，IC50為約400nM。TLK199，在那些專利和公開(kāi)物中鑒定為TER199，為TLK117的二乙基酯。
美國(guó)專利第6627732號(hào)和PCT國(guó)際公開(kāi)第WO 99/54346號(hào)披露了化學(xué)式如下的谷胱甘肽衍生物 其中，A為H或C1-20?；?；R1為C1-26烷基或C3-26烯基；以及R2為H、C1-26烷基、或C3-26烯基；不包括下述情況其中R1為C1-10烷基或C3-10烯基以及R2為H、C1-10烷基、或C3-10烯基。
美國(guó)公開(kāi)申請(qǐng)第2003/0100511號(hào)和PCT國(guó)際公開(kāi)第WO00/44366號(hào)披露了化學(xué)式如下的化合物的二酯的脂質(zhì)組成，包括脂質(zhì)體組成
其中每個(gè)酯為1-25C；YCO為γ-glu或β-asp；G*為苯基甘氨酸；Z為CH2、O、或S；以及X為6-8C烷基、苯甲基、或萘基，或其藥用鹽；或化學(xué)式如下的化合物 其中R1和R2獨(dú)立地選自直鏈或支鏈烷基基團(tuán)(1-25C)、環(huán)烷基基團(tuán)(6-25C)、取代的烷基基團(tuán)(2-25C)、雜環(huán)(6-20C)、醚或聚醚(3-25C)，或其中R1-R2(2-20C)一起形成具有該化學(xué)式的大環(huán)；以及R3為6-8C烷基、苯甲基、或萘基；或其藥用鹽。
許多疾病特征為骨髓減少，包括脊髓增生異常綜合征(MDS)，一種白血病前期的形式，其中骨髓產(chǎn)生的三種主要血液成分(白血細(xì)胞、紅血細(xì)胞以及血小板)的一種或多種水平不足。血細(xì)胞水平的下降和骨髓中新血細(xì)胞的產(chǎn)生，骨髓抑制，也是許多標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療藥的常見(jiàn)的毒性作用。
已經(jīng)顯示，TLK199在體外誘導(dǎo)HL-60前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的分化、在體外和體內(nèi)加強(qiáng)細(xì)胞毒性劑的活性、以及在正常人外周血中刺激造血祖細(xì)胞的所有三個(gè)譜系(lineage)的集落形成。在臨床前試驗(yàn)中，已經(jīng)顯示，TLK199在正常動(dòng)物以及其中白血細(xì)胞由于順鉑或氟尿嘧啶的治療而減少的動(dòng)物中提高白血細(xì)胞的產(chǎn)量。類似的作用可以提供治療MDS的新方法。TLK199目前在用于治療MDS的II期臨床實(shí)驗(yàn)中被評(píng)估。來(lái)自在2004和2005美國(guó)血液學(xué)團(tuán)體(American Society of Hematology)的會(huì)議上報(bào)道的這次實(shí)驗(yàn)的中間結(jié)果表明TLK199耐受良好，并且導(dǎo)致多譜系血液學(xué)改善。這些結(jié)果還表明TLK199在治療化學(xué)治療導(dǎo)致的血細(xì)胞減少方面的潛在作用。
希望能夠開(kāi)發(fā)有效的用于人類的GST P1-1抑制劑，以便加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明是化學(xué)式如下的化合物 其中n為0或1；W是L-γ-谷氨?；騆-γ-谷氨?；拾滨?；X是可選取代的C5-6環(huán)烷基、可選取代的C5-6雜環(huán)烷基、可選取代的苯基、或可選取代的C5-6雜芳基；Y是＝O、＝N-OH、或＝N-O(可選取代的C1-3烷基)；以及Z是可選取代的苯基或可選取代的C5-6雜芳基；以及它們的C1-10烷基、(苯基)-C1-3烷基、或(C5-6雜芳基)-C1-3烷基單酯和二酯；以及所述化合物的鹽和它們的單酯和二酯。
所述化合物(尤其為酸形式)在體外是GST P1-1的非常有效的抑制劑(通常為選擇性抑制劑)。在二酯形式中，已顯示它們?cè)隗w外對(duì)來(lái)自HL-60細(xì)胞的GSTπ的免疫沉淀作用也是有效的，并且在體外對(duì)HL-60細(xì)胞是細(xì)胞毒性的。從這點(diǎn)以及從與TLK117、TLK199、以及相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)類似性，可以預(yù)期所述化合物可以治療性用于加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
第二方面，本發(fā)明是包括本發(fā)明的第一方面的化合物和可選的一種或多種賦形劑的藥物組合物。
第三方面，本發(fā)明是下列一種或多種的治療方法(尤其在人類中)加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成，所述方法通過(guò)給予本發(fā)明第一方面的化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物來(lái)進(jìn)行，以及本發(fā)明第一方面的化合物在制造用于上述治療方法的一種或多種的藥物中的應(yīng)用。
在第四方面，本發(fā)明是化學(xué)式如下的化合物 其中W是N-α-R1-L-γ-谷氨?；騈-α-R1-L-γ-谷氨?；拾滨；?，其中R1是胺保護(hù)基團(tuán)；以及n、X、Y、以及Z如權(quán)利要求1所定義；
以及它們的C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或(C5-6雜芳基)-C1-3烷基單酯和二酯；以及所述化合物的鹽和它們的單酯和二酯。這些化合物在本發(fā)明第一方面的化合物的制備中用作中間體。
第五方面，本發(fā)明是本發(fā)明第一方面的化合物的合成方法。
本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的特征在于所提交的本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求2-21以及藥物組合物、方法和這些化合物的應(yīng)用的特征。
具體實(shí)施例方式
定義“烷基”指的是通過(guò)從碳原子去除一個(gè)氫原子而衍生自飽和或不飽和(但不是芳香族不飽和)烴(其可以是直鏈、支鏈、或環(huán)狀烴)的單價(jià)基團(tuán)，如甲基、乙基、丙基、1-丙烯基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯(cyclopenten)-1-基、環(huán)丙基甲基、環(huán)己基、以及環(huán)己基甲基。飽和烷基和C1-6烷基是示例性的。注意在本申請(qǐng)中“烷基”的定義比通常的定義廣泛，并且包括更通常稱為“環(huán)烷基”、“環(huán)烷基烷基”、“烯基”、以及“炔基”的基團(tuán)。
“取代的C1-3烷基”(在Y的定義中)指的是被一個(gè)或兩個(gè)、尤其是一個(gè)基團(tuán)取代的C1-3烷基，其中所述基團(tuán)選自鹵基、羥基、甲基、三氟甲基、甲氧基、以及氨基。
“取代的C5-6環(huán)烷基”指的是被一個(gè)或兩個(gè)、尤其是一個(gè)基團(tuán)取代的環(huán)戊基或環(huán)己基，其中所述基團(tuán)選自鹵基、羥基、甲基、三氟甲基、以及甲氧基，尤其是F、Cl、或甲基。
“C5-6雜環(huán)烷基”指的是其中環(huán)亞甲基基團(tuán)中的一個(gè)被O、S、SO2、NH、或N-甲基取代的環(huán)戊基或環(huán)己基；并且包括2-和3-四氫呋喃基、3-和4-四氫吡喃基、4-四氫硫代吡喃基(tetrahydrothiopyranyl)及其S，S-二氧化物、以及2-、3-、和4-哌啶基?！叭〈腃5-6雜環(huán)烷基”指的是以上述針對(duì)取代的C5-6環(huán)烷基相同的方式取代的C5-6雜環(huán)烷基。
“取代的苯基”指的是被多達(dá)3個(gè)取代基取代的苯基，所述取代基選自鹵基、-CN、-NO2、-OH、可選鹵基取代的C1-3烷基(如，乙基、三氟甲基)、可選鹵基取代的C1-3烷氧基、甲?；?formyl)、羧基、以及C1-3烷氧羰基。
“鹵素”或“鹵基”指的是F、Cl、或Br。
“C5-6雜芳基”指的是2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、或2-，3-，或4-吡啶基。“取代的C5-6雜芳基”指的是以上述針對(duì)取代的苯基所描述的方式取代的C5-6雜芳基。
在“本發(fā)明的化合物”部分對(duì)“鹽”進(jìn)行描述。
“胺保護(hù)基團(tuán)”是這樣的基團(tuán)，其能夠保護(hù)本發(fā)明的第一方面的化合物的谷氨?；?胺基團(tuán)或其中間體(在該化合物的合成期間)，并且隨后可去除而不影響本發(fā)明的第一方面的化合物的其余部分。通常這樣的基團(tuán)包括叔丁氧基羰基和芐氧基羰基，通過(guò)酸解可方便地去除。胺保護(hù)基團(tuán)在有機(jī)合成，特別是肽合成領(lǐng)域是熟知的。合適的這樣的基團(tuán)，以及用于它們的去除的條件，描述在書(shū)中，如Synthesis of Peptides and Peptidomimetics，Workbench edition，M.Goodman，ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，2004，以及Protective groups in organic synthesis，3 ed.，T.W.Greene andP.G.M.Wuts，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York，New York，U.S.A.，1999，并且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的。
“有效治療量”指的是這樣的量，當(dāng)其被施加給哺乳動(dòng)物，尤其是人類，用于影響通過(guò)治療方法的一種的治療時(shí)，足以影響對(duì)于作為治療性處理的目標(biāo)的疾病的治療。哺乳動(dòng)物中疾病的“治療”或“處理”包括以下一種或多種(1)抑制疾病的發(fā)展，如，阻止其發(fā)展，(2)減輕疾病，如，引起疾病的消退或治愈疾病，(3)防止疾病的復(fù)發(fā)，以及(4)減輕疾病的癥狀。
本發(fā)明的化合物及其制備本發(fā)明的第一方面的化合物是化學(xué)式如下的化合物 其中n為0或1；W是L-γ-谷氨?；騆-γ-谷氨?；拾滨?；
X是可選取代的C5-6環(huán)烷基、可選取代的C5-6雜環(huán)烷基、可選取代的苯基、或可選取代的C5-6雜芳基；Y是＝O、＝N-OH、或＝N-O(可選取代的C1-3烷基)；以及Z是可選取代的苯基或可選取代的C5-6雜芳基；以及它們的C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或(C5-6雜芳基)-C1-3烷基單酯和二酯；以及所述化合物的鹽和它們的單酯和二酯。
本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選化合物包括具有一種或多種以下特征的那些化合物1.W為L(zhǎng)-γ-谷氨酰基；2.X為環(huán)戊基、環(huán)己基、呋喃基、噻吩基、或吡啶基、或可選取代的苯基；尤其是環(huán)己基或3-噻吩基、或可選地被氟基、氯基、氰基、甲基、羥基、或甲氧基取代的苯基、尤其是其中苯基是未取代的或在4-位具有1個(gè)取代基；如苯基、4-氯苯基、和4-羥基苯基；3A.n為0；或3B.n為1，并且Y為＝O、＝N-OH、或＝N-OCH2CH2NH2；4.Z-C(＝Y(jié))n-取代基是在其被連接的苯基的2-或4-位；5.Z為吡啶基或可選取代的苯基；6A.該化合物是二酸；或6B.該化合物是二酯，尤其是C1-6烷基二酯，更加尤其為C1-3烷基二酯，尤其為二乙基酯。
通常，具有更多這些特征的化合物比具有較少的這些特征的化合物是優(yōu)選的；尤其是，將這些特征的一個(gè)加到具有少于所有這些特征的化合物中通常會(huì)導(dǎo)致比沒(méi)有該特征的化合物優(yōu)選的化合物。
本發(fā)明的化合物的合適的鹽(參見(jiàn)Berge et al.，J.Phaum.Sci.，661(1971)中不排他的列表)是那些當(dāng)無(wú)機(jī)堿(如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、和氫氧化鈣)或有機(jī)堿(如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、氨丁三醇、N-甲基葡萄糖胺)與本發(fā)明的化合物的羧基基團(tuán)反應(yīng)時(shí)形成的鹽，以及當(dāng)無(wú)機(jī)酸(如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、以及氯磺酸)或有機(jī)酸(如，乙酸、丙酸、草酸、蘋果酸、馬來(lái)酸、丙二酸、富馬酸、或酒石酸，和鏈烷磺酸或芳烴磺酸如，甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸，取代的苯磺酸如氯苯磺酸和甲苯磺酸、萘磺酸和取代的萘磺酸、萘二磺酸和取代的萘二磺酸、以及樟腦磺酸)與本發(fā)明的化合物的胺基團(tuán)反應(yīng)時(shí)形成的酸加成鹽。這樣的鹽優(yōu)選用藥用酸和堿來(lái)形成。用于所述化合物的合適的鹽是酸加成鹽，尤其是與無(wú)機(jī)酸，如鹽酸鹽。
通過(guò)本發(fā)明的方法制備本發(fā)明第一方面的化合物涉及步驟(a1)到(a4)之一(a1)烷基化化學(xué)式如下的三肽或四肽的半胱氨酸硫原子 或其單酯或二酯，通常具有受保護(hù)的谷氨?；坊鶊F(tuán)R1，該烷基化借助化學(xué)式如下的取代的芐基基團(tuán)
其中L為離去基團(tuán)，如氯、溴、或可選取代的C1-6鏈烷磺酸鹽或苯磺酸鹽如甲烷-、三氟甲烷-、苯-、4-甲苯-、4-硝基苯-、4-氯苯-、或4-溴苯磺酸鹽，尤其是溴；或(a2)將化學(xué)式如下的可選保護(hù)的二肽或三肽 其中如果n為1，則Y為＝O；或其在谷氨?；然锾幍膯熙?通常具有受保護(hù)的谷氨酰基胺基團(tuán)R1)與化學(xué)式如下的氨基酸或其單酯連接 或者
(a3)將化學(xué)式如下的二肽 其中如果n為1，則Y為＝O；或其單酯，與可選受保護(hù)的L-γ-谷氨酸或L-γ-谷氨酰基甘氨酸連接，可選地在谷氨酰基α-羧化物處進(jìn)行酯化；或者(a4)將化學(xué)式如下的三肽或四肽或其單酯或二酯 與Z-硼酸連接，以產(chǎn)生化學(xué)式如下的化合物 其中n為0，
或其單酯或二酯；可選地跟隨步驟(b)到(e)的一個(gè)或多個(gè)(b)如果在步驟(a)中制備的化合物中W是N-α-R1-L-γ-谷氨酰基或N-α-R1-L-γ-谷氨?；拾滨＃敲疵摫Ｗo(hù)本發(fā)明第四方面的化合物以產(chǎn)生本發(fā)明第一方面的化合物；(c)如果n為1，則將其中Y為＝O的化合物與羥基胺或O-(可選取代的C1-3烷基)羥基胺反應(yīng)，以形成其中＝N-OH或＝N-O(可選取代的C1-3烷基)的化合物；(d1)如果該化合物為二酸，則形成該化合物的單酯或二酯；或者(d2)如果該化合物為單酯或二酯，則使該化合物去酯化以制備該化合物的二酸；以及(e)形成在任何(a)到(e)的步驟中制備的化合物的鹽。
用于步驟(a1)的方法的起始物質(zhì)是三肽和四肽，可選地單酯化或二酯化，可選地在谷氨?；繁槐Ｗo(hù)，并且半胱氨酸硫脫保護(hù)。這些谷胱甘肽類似物通常通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的肽合成常用的方法加以制備。
該肽合成可以利用許多標(biāo)準(zhǔn)S-保護(hù)基團(tuán)之一來(lái)進(jìn)行，如三苯基甲基，并且隨后可將所得到的S-保護(hù)的肽例如通過(guò)酸解脫保護(hù)。通常，S-保護(hù)的肽可選地在清除劑的存在下溶解在酸中，該酸足以去除酸解可去除的硫保護(hù)基團(tuán)，但是不足以去除任何胺保護(hù)基團(tuán)。合適的這樣的酸包括三氟乙酸和其它強(qiáng)酸，如三氟甲磺酸，可選地在如二氯甲烷的共溶劑的存在下；合適的清除劑包括芳香族醚和硫化物如苯甲醚和苯硫基甲烷，酚類(如甲酚)，以及最有效的硅烷，其包括三烷基硅烷如三乙基硅烷和三異丙基硅烷和硅烷聚合物如聚(甲基氫化硅氧烷)；以及在聚(甲基氫化硅氧烷)存在下特別合適的脫保護(hù)劑是三氟乙酸。通過(guò)添加抗溶劑，例如非質(zhì)子非極性溶劑，如烴或醚，可以從反應(yīng)混合物中分離S-脫保護(hù)肽。
利用容易獲得的起始物質(zhì)N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酸α-芐基酯、S-三苯甲基-L-半胱氨酸、以及D-苯基甘氨酸，作為本發(fā)明的許多化合物的起始肽的N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨?；?L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸的方便的制備如下。通過(guò)在無(wú)水1，4-二氧雜環(huán)己烷中與N-羥基琥珀酰亞胺和雙環(huán)己基-碳二亞胺反應(yīng)，N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酸α-芐基酯被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯。N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酸α-芐基酯γ-N-羥基琥珀酰亞胺酯被溶解在無(wú)水四氫呋喃中，并且被加入到S-(三苯甲基)-L-半胱氨酸和三乙胺的水溶液中以產(chǎn)生O-α-芐基-N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨?；?S-(三苯甲基)-L-半胱氨酸。其被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯并且以γ-谷氨酰胺和半胱氨酸連接的相同的方式與D-苯基甘氨酸連接，以產(chǎn)生O-α-芐基-N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酰基-S-(三苯甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。
也可以使用利用不同活化基團(tuán)的類似方法或者活化用于連接的谷氨酸的γ-羧基基團(tuán)和/或半胱氨酸羧基基團(tuán)的方法；這樣的方法也可以使用，其中半胱氨酸-苯基甘氨酸連接被首先進(jìn)行，隨后連接得到的S-(三苯甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸與N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酸α-芐基酯。倘若α-羧基基團(tuán)最終可以脫保護(hù)，同時(shí)使N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酰基-S-(三苯甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸分子的殘余部分保持完整，那么也可以使用N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酸的α-羧基基團(tuán)的其它保護(hù)。O-α-芐基-N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酰基-S-(三苯甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸溶解在低級(jí)醇(如，甲醇)中，并且借助含水堿(如，1M NaOH)通過(guò)水解去除芐基酯，隨后酸化以便能夠分離作為酸加成鹽的N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨?；?S-(三苯甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。隨后在甲苯中通過(guò)與三氟乙酸和聚(甲基氫化硅氧烷)反應(yīng)，N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨?；?S-(三苯甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸的半胱氨酸硫被脫保護(hù)，并且可以用庚烷/甲基叔丁基醚沉淀N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。
從氨基酸開(kāi)始，或者如果可獲得從二肽開(kāi)始，可以通過(guò)類似的方法容易地制備其它肽?；瘜W(xué)式如下的許多氨基酸 如D-苯基甘氨酸、D-(4-氯苯基)甘氨酸、D-(4-羥苯基)甘氨酸、D-(3-噻吩基)甘氨酸、D-環(huán)己基甘氨酸可以以分離形式商購(gòu)獲得，并且在一些情況下為酯。其它可以以外消旋形式獲得，但是可以通過(guò)已知的用于分離氨基酸的任何方法來(lái)拆分(resolved)。
隨后，在步驟(a1)中，S-脫保護(hù)肽的硫醇陰離子被化學(xué)式如下的取代的芐基基團(tuán)烷基化 其中，L為離去基團(tuán)，如氯、溴、或可選取代的C1-6鏈烷磺酸鹽或苯磺酸鹽，如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、4-甲苯磺酸鹽、4-硝基苯磺酸鹽、4-氯苯磺酸鹽、或4-溴苯磺酸鹽，尤其是溴，以制備合適的S-烷基化肽。這通常在谷氨?；繁槐Ｗo(hù)時(shí)進(jìn)行，以最小化副反應(yīng)，但是甚至當(dāng)胺未被保護(hù)時(shí)，也可以進(jìn)行。
通常，S-脫保護(hù)的肽被溶解在合適溶劑中(如，C1-6烷醇、二醇如1，2-乙二醇或1，3-丙二醇、醚如2-甲氧基乙醇、1，2-二甲氧基乙烷、或四氫呋喃等)的強(qiáng)堿(如，堿金屬或堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、或醇鹽、或氫氧化銨；或有機(jī)胺堿，如四甲基胍、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一-7-烯(DBU)等)溶液中，以形成硫醇陰離子，加入取代的芐基基團(tuán)(通常過(guò)量加入)，反應(yīng)混合物保持在合適的溫度和時(shí)間下直到完成。合適的反應(yīng)條件是使用水中20％四氫呋喃和約十倍過(guò)量的碳酸氫鈉。
該肽可以制備為二酸(雖然這可能涉及谷氨?；?羧基以及胺的中間體保護(hù))或制備為單酯或二酯，其取決于起始氨基酸的狀態(tài)。如果該肽被制備為二酸，則它可以在半胱氨酸的硫原子烷基化前被單酯化或二酯化(通常同時(shí)胺保護(hù))，并且酯化條件通常與酯化本發(fā)明第一方面的化合物所用的那些條件類似。
在步驟(a2)和(a3)中，可選地胺保護(hù)的半胱氨酸的硫醇陰離子被化學(xué)式如下的取代的芐基基團(tuán)首先烷基化 以形成本發(fā)明第一方面的三肽或四肽的中心氨基酸；并且隨后通過(guò)傳統(tǒng)的肽合成方法對(duì)該肽進(jìn)行組裝。
可以通過(guò)與上述烷基化三肽或四肽所用的那些方法類似的方法進(jìn)行半胱氨酸的烷基化；也可以通過(guò)與上述方法類似的方法進(jìn)行各種氨基酸的連接，以產(chǎn)生作為本發(fā)明第一或第四方面的化合物的合成肽。
在步驟(a4)中，包含S-[(鹵代苯基)甲基]-半胱氨酸的三肽或四肽[其通過(guò)任何便利的方法合成，如，以步驟(a1)中所述的方式通過(guò)烷基化S-未保護(hù)的肽或者通過(guò)以步驟(a2)和(a3)中描述的方式烷基化半胱氨酸隨后連接以形成該肽]以Suzuki連接方式連接于分子式為Z-B(OH)2的硼酸。
在可選的步驟(b)中，可選地在二氯甲烷的存在下，通過(guò)適于去除胺保護(hù)基團(tuán)的任何方法(其也不影響該分子的殘余部分)，通常通過(guò)利用強(qiáng)酸(如三氟乙酸)的酸解，使本發(fā)明第四方面的化合物的R1保護(hù)的胺基團(tuán)脫保護(hù)，以制備本發(fā)明第一方面的化合物。
在可選的步驟(c)中，本發(fā)明的第一方面的化合物(其中n為1，以及Y為＝O)與羥基胺或O-(可選取代的C1-3烷基)-羥基胺反應(yīng)，以形成其中＝N-OH或＝N-O(可選取代的C1-3烷基)的化合物。該反應(yīng)通常通過(guò)在水溶液(可選地還包含水混溶性有機(jī)溶劑，如四氫呋喃)中，在堿的存在下，與羥基胺反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。
在可選的步驟(d1)和(d2)中，本發(fā)明第一方面的化合物被酯化(如果想得到酯)，或者脫酯化(如果想得到二酸)。這些酯化或脫酯化是常規(guī)的，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法進(jìn)行；尤其是，便利的酯化方法涉及本發(fā)明第一方面的二酸化合物與醇反應(yīng)，其產(chǎn)生想要的酯，該反應(yīng)利用上述醇作為溶劑，在鹵代硅烷如三甲基氯硅烷的存在下，在室溫和該醇的沸騰溫度之間的溫度下進(jìn)行。
在可選的步驟(e)中，形成本發(fā)明第一方面的化合物的鹽。其通常為酸加成鹽(參見(jiàn)上面“鹽”的定義)。便利地，這在形成本發(fā)明第一方面的化合物后立即進(jìn)行；并且可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)加入將成為該鹽的抗溶劑的溶劑，如非質(zhì)子溶劑，例如烴或鹵化烴如二氯甲烷，隨后加入所選的酸以形成該鹽，尤其以單獨(dú)的無(wú)水酸或以非質(zhì)子溶劑的形式，如氯化氫氣體。如果必要或需要，可以加入該鹽的另外的抗溶劑，例如醚，如二乙醚、甲基叔丁基醚、以及四氫呋喃，尤其是甲基叔丁基醚。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，考慮到該技術(shù)和披露的內(nèi)容(包括實(shí)施例)，在制備本發(fā)明的第四和第一方面的化合物方面將毫無(wú)困難。
所述化合物的應(yīng)用和方法本發(fā)明的第一方面的化合物(尤其是酸形式的化合物)是GSTP1-1的非常有效的抑制劑，通常是選擇性抑制劑。它們?cè)谔岣唧w外HL-60細(xì)胞的分化方面也具有活性，并且已經(jīng)顯示一種化合物在體外提高來(lái)自鼠骨髓細(xì)胞的粒細(xì)胞/單核細(xì)胞集落形成。因此預(yù)期所述化合物可以在人類中治療性地作用于加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用(因?yàn)镚ST、尤其GST P1-1，其在許多腫瘤組織中被提高，涉及腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑的抗藥性；因此GST抑制劑將降低腫瘤細(xì)胞清除化學(xué)治療劑的能力)、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒性(還是由于GST同工酶抑制)、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
本發(fā)明第四方面的化合物和本發(fā)明第五方面的方法可以用于制備本發(fā)明第一方面的化合物。
本發(fā)明第二方面是包括本發(fā)明第一方面的化合物的藥物組合物，可選地還包含賦形劑，如藥用賦形劑。
本發(fā)明第三方面是治療方法，這些方法涉及給予通常為有效治療量的本發(fā)明第一方面的化合物或本發(fā)明第二方面的藥物組合物，以及這些化合物在下述一種或多種中的應(yīng)用加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
所述化合物可以通過(guò)適于要治療的患者和該患者的疾病性質(zhì)的任何途徑給予。給與途徑包括但不限于，通過(guò)注射給予，包括靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、以及皮下注射，通過(guò)透粘膜或透皮遞送，通過(guò)局部應(yīng)用，鼻噴霧，栓劑等，或者可以經(jīng)口給予。包含這些化合物的藥物組合物可以可選地為脂質(zhì)體劑型、乳劑、設(shè)計(jì)為穿過(guò)粘膜給予藥物的劑型或透皮劑型?？梢栽诶纾琑emingtonThe Science and Practice of Pharmacy，20 ed.，A.Gennaro，ed.，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，Pennsylvania，U.S.A.，2003中找到這些給藥方法中的每個(gè)的合適的劑型。典型的組合物可以為口服或靜脈內(nèi)灌注溶液，并且可以包含所述化合物，還通常包含一種或多種藥用賦形劑。典型的劑型是片劑、用于靜脈內(nèi)灌注的溶液、作為用于靜脈內(nèi)灌注的溶液重建的凍干粉、以及用于靜脈內(nèi)給藥的脂質(zhì)體劑型和凍干脂質(zhì)體劑型。
本發(fā)明第一方面的化合物的有效治療量是約10-2000mg/m2體表面積，尤其是50-1000mg/m2?？梢砸?-35天的間隔給藥；例如，以1-5周間隔給藥約250-1000mg/m2，尤其是以1、2、3、或4周間隔，或更高頻率，包括頻率達(dá)每天一次達(dá)幾天(如5或7天)，每2、3、或4周重復(fù)給藥，或者恒量灌注6-72小時(shí)，并且還是每2、3、或4周重復(fù)給藥。典型的方案可以涉及每三周每天一次給藥達(dá)5天。
制備和實(shí)施例下面的實(shí)施例示出了有用中間體的制備和通過(guò)本發(fā)明的方法的本發(fā)明的化合物的合成，以及本發(fā)明第一方面的化合物作為治療劑的應(yīng)用。
制備1和2描述了用于半胱氨酸或所述三肽和四肽的半胱氨酸的S-烷基化的試劑的制備。為了方便，這些試劑命名為芐基溴(α-溴甲苯)的衍生物。
制備14-(2-吡啶基)芐基溴的制備將4-(2-吡啶基)甲苯(2mL(1.98g，11.7mmol))、N-溴琥珀酰亞胺(NBS)(2.5g(14.0mmol))、以及α，α′-偶氮二(異丁腈)(AIBN)(23mg(0.14mmol))懸浮在35mL四氯甲烷中，并且回流24小時(shí)。將產(chǎn)物過(guò)濾，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從濾液去除溶劑。加入等量氯仿和水，并萃取產(chǎn)物。分離并干燥氯仿層，然后去除溶劑。獲得作為粘稠黃色固體的4-(2-吡啶基)芐基溴(2g)。
通過(guò)這種方法，從4′-甲基-4-聯(lián)苯羧酸制備4′-(4-羧基苯基)芐基溴；從4′-甲基-4-聯(lián)苯羧酸甲酯(通過(guò)甲醇和三甲基氯硅烷的酯化從羧酸獲得)制備4′-(4-(甲氧基羰基)芐基溴；以及從4-甲基二苯甲酮制備4-(苯甲?；?芐基溴。
制備24-(2-甲氧基苯基)芐基溴的制備將4-溴甲苯(171mg(1mmol))，2-甲氧基苯基硼酸(152mg(1mmol))二乙酸鈀(1mg(4μmol))，N-丁基溴化銨(322mg(1mmol))，以及2M含水Na2CO3(1.9mL(3.8mmol))置于可微波加壓瓶中并加熱到150℃達(dá)5分鐘。冷卻到室溫后，產(chǎn)物被傾倒入分液漏斗中并加入分別為30mL的水和二乙基醚。萃取后，使層分離，并用另外的30mL二乙基醚沖洗水層。合并醚萃取物，在MgSO4上干燥，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在真空下去除溶劑。獲得作為固體產(chǎn)物的2-甲氧基-4′-甲基聯(lián)苯(160mg，產(chǎn)率為81％)，通過(guò)NMR測(cè)得純度為95％。
將2-甲氧基-4′-甲基聯(lián)苯(160mg，0.81mmol)，NBS(158mg，0.91mmol)，以及AIBN(1mg(0.006mmol)懸浮在7mL四氯甲烷中，并且回流24小時(shí)。將產(chǎn)物過(guò)濾，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從濾液去除溶劑。加入等量二乙醚和水，并萃取產(chǎn)物。分離醚層，在MgSO4上干燥，過(guò)濾，然后去除溶劑。獲得作為油的4-(2-甲氧基苯基)芐基溴(128mg)。
通過(guò)這種方法，從4-氰基苯基硼酸制備4′-(4-氰基苯基)芐基溴，并且從3-(三氟甲基)苯基硼酸制備4′-[3-(三氟甲基)苯基]芐基溴。
可以通過(guò)這些制備方法容易地制備被可選取代的苯基、可選取代的C5-6雜芳基、可選取代的苯甲酰基、或者(可選取代的C5-6雜芳基)羰基取代的其它芐基溴。
制備3描述了S-烷基化半胱氨酸的制備。
制備3N-α-(叔丁氧基羰基)-S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酸的制備。
將N-α-(叔丁氧基羰基)-L-半胱氨酸(1.0g，4.52mmol)溶解在9mL四氫呋喃和9mL 1M含水NaOH的混合物中(其已經(jīng)通過(guò)使通過(guò)它的氬起泡而脫氣)。加入在5mL四氫呋喃(THF)中的4-(溴甲基)聯(lián)苯(1.12g，4.53mmol)溶液，然后在室溫下，在氬冒泡的情況下，攪拌溶液8小時(shí)。在真空下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF，殘余物用水稀釋，并用二乙醚沖洗。用6M含水HCl酸化水相到pH3，并用乙酸乙酯萃取三次。用水、飽和含水NaHCO3、水、和鹽水沖洗合并的有機(jī)萃取物，隨后干燥并濃縮，以產(chǎn)生作為白色固體的1.44gN-α-(叔丁氧基羰基)-S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酸(產(chǎn)率為82％)。
可以通過(guò)這種制備方法容易地制備其它(可選地保護(hù)的)S-烷基化半胱氨酸。
合成實(shí)施例1L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸的合成[說(shuō)明步驟(a1)、(b)、和(e)]。
通過(guò)下述過(guò)程從330mg N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨?；?L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸制備作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸，1A將胺保護(hù)的肽溶解在乙腈/水中，加入約10倍多的碳酸氫鈉，并且加入輕微過(guò)量的4-(溴甲基)聯(lián)苯，隨后在氮?dú)夥障戮S持反應(yīng)直到完成。用水稀釋反應(yīng)混合物，用二乙醚沖洗，分離水相并用鹽酸酸化到pH2-3，隨后用乙酸乙酯萃取。在無(wú)水MgSO4上干燥有機(jī)相，過(guò)濾，減少容積以產(chǎn)生N-α-(芐氧基羰基)-L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。用1滴水將約300mg胺保護(hù)的硫化物溶解在2mL的95∶5的三氟乙酸(TFA)∶二氯甲烷中，并在45℃攪拌過(guò)夜，然后通過(guò)制備性HPLC加以純化，以產(chǎn)生L-γ-谷氨酰基-S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。分離作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸。
通過(guò)類似的方法制備化合物，如L-γ-谷氨酰基-S-{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸，化合物8A，以及L-γ-谷氨酰基-S-[(4-苯甲酰苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸，化合物9A。
本發(fā)明第一方面的其它三肽和四肽(包括作為單酯和二酯的化合物)可以通過(guò)類似的方法容易地加以制備。
合成實(shí)施例2L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯的合成[說(shuō)明步驟(d1)和(e)]。
通過(guò)用乙醇和三甲基氯硅烷進(jìn)行酯化，從L-γ-谷氨酰基-S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸制備作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯，1B，產(chǎn)生L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯，準(zhǔn)確質(zhì)量為605，MS(m/z)606(M+H)。分離作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯。
通過(guò)類似的方法制得化合物，如L-γ-谷氨酰基-S-{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯，化合物8B，以及L-γ-谷氨?；?S-[(4-苯甲酰苯基)甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯，化合物9B?？梢酝ㄟ^(guò)類似的方法容易地制備本發(fā)明第一方面的化合物的其它酯，尤其是二酯。
合成實(shí)施例3L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸的合成[說(shuō)明步驟(a3)、(b)、和(e)]。
通過(guò)下述過(guò)程從D-環(huán)己基甘氨酸(500mg，3.1mmol)制備D-環(huán)己基甘氨酸乙酯將該酸懸浮在15mL乙醇中，加入三甲基氯硅烷(2.02mL，5當(dāng)量)，并將混合物在50℃加熱18小時(shí)。在真空下去除揮發(fā)性成分，殘余物溶解在乙酸乙酯中，用含水NaHCO3沖洗，用鹽水沖洗兩遍，在MgSO4上干燥，過(guò)濾，蒸發(fā)，以產(chǎn)生401mg作為油性固體的D-環(huán)己基甘氨酸乙酯。
將N-α-(叔丁氧基羰基)-S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酸(588mg，1.9mmol)溶解在5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲陽(yáng)離子六氟磷酸酯(HBTU)(860mg，1.2當(dāng)量)，和二(異丙基)乙胺(990μL，3當(dāng)量)。3分鐘后，加入溶解在4mL DMF中的D-環(huán)己基甘氨酸乙酯(360mg，1當(dāng)量)，在室溫下攪拌混合物2小時(shí)，隨后分離粗制N-α-(叔丁氧基羰基)-S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸乙酯。將該二肽溶解在10mL20％的TFA/二氯甲烷中，在室溫下攪拌2小時(shí)，然后通過(guò)在真空下去除揮發(fā)物來(lái)分離該粗制產(chǎn)物。粗制S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸三氟乙酸酯可以直接用于下個(gè)步驟，或者可以進(jìn)一步加以處理。
將N-α-(叔丁氧基羰基)-O-α-叔丁基-L-γ-谷氨酰胺溶解在2mLDMF中，然后加入HBTU(174mg，1.2當(dāng)量)，以及二(異丙基)乙胺(330μL，5當(dāng)量)。5分鐘后，加入溶解在2mL DMF中的粗制S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸三氟乙酸酯(200mg，0.38mmol)，在室溫下攪拌混合物2小時(shí)。將混合物傾倒入0.1N含水檸檬酸中，并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用鹽水沖洗四次，在MgSO4上干燥，并蒸發(fā)揮發(fā)物以產(chǎn)生作為褐色油的N-α-(叔丁氧基羰基)-O-α-叔丁基-L-γ-谷氨?；?S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸。其被溶解在10mL 20％的TFA/-二氯甲烷中并在室溫下攪拌24小時(shí)。在真空下去除揮發(fā)物，通過(guò)反相HPLC純化產(chǎn)物，隨后分離作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸，化合物12A(47mg)。
通過(guò)類似的方法制得作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-(4-聯(lián)苯基甲基)-L-半胱氨酰-D-(4-氯苯基)甘氨酸，化合物11A。
合成實(shí)施例4L-γ-谷氨?；?S-({4-[(2-氨基乙氧基亞氨基)(苯基)甲基]苯基}甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸的合成[說(shuō)明步驟(c)]。
在pH4.5的5mL水、5mL THF、和10mL 0.5M磷酸鈉中通過(guò)用O-(2-氨基乙基)羥基胺二鹽酸鹽(26mg，0.18mmol)處理L-γ-谷氨?；?S-[(4-苯甲酰苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸(108mg，0.18mmol)制得L-γ-谷氨?；?S-({4-[(2-氨基乙氧基亞氨基)(苯基)甲基]苯基}甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸，化合物10A。在50℃加熱混合物過(guò)夜，通過(guò)HPLC并用鹽酸緩沖液純化產(chǎn)物，分離作為鹽酸鹽的L-γ-谷氨?；?S-({4-[(2-氨基乙氧基亞氨基)(苯基)甲基]苯基}甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸的兩種異構(gòu)體(在肟氮下)，每種約45mg。
通過(guò)同樣的方法并從L-γ-谷氨?；?S-[(4-苯甲酰苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯開(kāi)始，制得L-γ-谷氨?；?S-({4-[(2-氨基乙氧基亞氨基)(苯基)甲基]苯基}甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸二乙酯，化合物10B，也產(chǎn)生兩種異構(gòu)體。
本發(fā)明第一方面的代表性化合物如下表1所示表1.本發(fā)明第一方面的二酸化合物
#表示A與化合物的其余部分的半胱氨酸硫的連接點(diǎn)通過(guò)上述方法之一制得化合物1A到12A的二乙酯1B到12B，除了沒(méi)有制備化合物9B；通過(guò)質(zhì)譜法分析，每種化合物產(chǎn)生相應(yīng)于其質(zhì)量的質(zhì)量峰(M/z)，通常M+H伴隨(with)陽(yáng)離子化，或者M(jìn)-H伴隨陰離子化。
分離作為二鹽酸鹽的化合物10A及其二乙酯10B，并且在肟氮下作為兩種異構(gòu)體存在。該異構(gòu)體已經(jīng)被分離。
考慮到技術(shù)和本文披露的內(nèi)容，可以利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的方法類似地制備本發(fā)明的其它化合物。
體外測(cè)定實(shí)施例這些實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的化合物(以及一種或其他比較化合物TLK117和TLK199，和TLK137)在預(yù)先體外測(cè)定中的作用。
從EMD Biosciences，Inc.，San Diego，California，U.S.A.獲得重組人GST P1-1，A1-1，和M1-1同工酶，以及兔多克隆抗人GSTπ抗體。從Dakoctyomation，Inc.，Carpinteria，California，U.S.A.獲得鼠單克隆抗人GSTπ抗體。從Rockland Immunochemicals，Inc.，Gilbertsville，Pennsylvania，U.S.A.獲得IRDye800共軛的、親和力純化的羊抗兔IgG抗體。從National Cancer Institute，Bethesda，Maryland，U.S.A.獲得人類癌細(xì)胞系HL-60(前髓細(xì)胞樣(promyeloid)髓細(xì)胞白血病)。從Invitrogen，Inc.，Carlsbad，California，U.S.A.獲得RPMI 1640培養(yǎng)基和Iscove’s改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)。從Promega Corporation，Madison，Wisconsin，U.S.A.獲得CellTiter-GloTM測(cè)定試劑盒，并按照制造商的說(shuō)明使用。從BD Biosciences，Inc.，San Jose，California，U.S.A.獲得藻紅蛋白-共軛的抗CD11b抗體和藻紅蛋白-共軛的同種型對(duì)照抗體。從StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada獲得MethoCultTM M3234甲基纖維素培養(yǎng)基(IMDM中2.5％的甲基纖維素，補(bǔ)充有胎牛血清、牛血清白蛋白、rh胰島素、h轉(zhuǎn)鐵蛋白、2-巰基乙醇、以及L-谷氨酰胺)，并按照制造商的說(shuō)明稀釋(到1％甲基纖維素濃度)。
體外實(shí)施例1.谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶同工酶的抑制。這個(gè)實(shí)施例表明這種化合物在體外作為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶同工酶GST P1-1，A1-1，和M1-1的抑制劑的作用。GST P1-1的抑制被認(rèn)為是本發(fā)明第三方面的治療方法有效的預(yù)兆，因?yàn)門LK199(在這些測(cè)定中試驗(yàn)的TLK117的二乙酯)已經(jīng)在人類中表現(xiàn)出骨髓刺激活性并在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出化學(xué)增強(qiáng)活性。
在測(cè)定緩沖液中(100mM KH2PO4/K2HPO4，0.1mM EDTA，pH6.5，在水中)，重組人類GST P1-1，A1-1，和M1-1同工酶分別以終濃度0.02，0.011，和0.0083單位/mL加以使用[1單位是指在20℃和pH6.5，每分鐘，共軛連接1μmol的1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)以還原谷胱甘肽(GSH)的酶的量]。GSH被制備為在水中的100mM儲(chǔ)備溶液，而CDNB被制備為在乙醇中的100mM儲(chǔ)備溶液，并且用測(cè)定緩沖液稀釋兩者到合適的濃度(以獲得要評(píng)估的同工酶的2×Km的終濃度)。將試驗(yàn)化合物(二酸，化合物1A到12A和TLK117)溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，并用DMSO稀釋到適于測(cè)定的濃度(在濃度范圍內(nèi)有8個(gè)濃度，其中中點(diǎn)鄰近預(yù)期的IC50)。對(duì)于每個(gè)測(cè)定，試驗(yàn)化合物和GSH被加入到該同工酶中。在將CDNB溶液加入到同工酶/化合物/GSH溶液中后，馬上在SpectraMax平板閱讀器(Molecular Devices，Inc.，Sunnyvale，California，U.S.A.)上連續(xù)紀(jì)錄在340nm處的吸光度5分鐘。每種化合物的GST抑制活性是根據(jù)試驗(yàn)化合物的各種濃度的吸光度/時(shí)間曲線的斜度來(lái)計(jì)算。所有測(cè)定在雙孔中進(jìn)行，DMSO作為對(duì)照，最終DMSO濃度維持在2％。這些測(cè)定的結(jié)果在下面的表2中示出。
體外實(shí)施例2.HL60細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明了在體外本發(fā)明的化合物對(duì)HL-60人類白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
將對(duì)數(shù)期細(xì)胞以1500個(gè)細(xì)胞/孔接種在具有150μL RPMI 1640培養(yǎng)基的96孔板中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)和1％L-谷氨酰胺，并在37℃，空氣/5％CO2下孵育4-5小時(shí)。將試驗(yàn)化合物(二乙酯、化合物1B到12B和TLK199)溶解在DMSO中并持續(xù)稀釋(在濃度范圍內(nèi)有8個(gè)濃度，其中中點(diǎn)鄰近預(yù)期的IC50)。在補(bǔ)充的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)一步1∶50稀釋后，加入50μL稀釋的化合物以達(dá)到0.5％的DMSO終濃度。隨后將所述細(xì)胞孵育72小時(shí)(約3倍時(shí)間)。隨后通過(guò)離心分離收集細(xì)胞(1200rpm，5分鐘，20℃)，去除100μL培養(yǎng)上清液并用相同量的CellTiter-Glo試劑替換。在室溫下持續(xù)混合并孵育10分鐘后，用光度計(jì)讀取平板，存活細(xì)胞的數(shù)量與觀察到的光度值成比例。所有測(cè)定在三份孔中進(jìn)行，以DMSO溶劑作為對(duì)照。通過(guò)光度值/濃度曲線計(jì)算CC50(引起50％生長(zhǎng)抑制的濃度)。這種測(cè)定的結(jié)果在下面表2中示出。
體外實(shí)施例3.GSTπ免疫沉淀測(cè)定。這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明化合物在引起GSTπ免疫沉淀方面的有益作用。這些結(jié)果被認(rèn)為是本發(fā)明第三方面的治療性方法有效的預(yù)兆，因?yàn)門LK199(在這些測(cè)定中試驗(yàn)的TLK117的二乙酯)在人類中已經(jīng)顯示出骨髓刺激活性并在動(dòng)物模型中顯示出化學(xué)增強(qiáng)活性。
將HL60細(xì)胞以6×105個(gè)細(xì)胞/mL接種在T75瓶中的補(bǔ)充有10％胎牛血清、1mM谷氨酰胺和20μM慶大霉素的20mLRPMI-1640培養(yǎng)基中，并在37℃，5％CO2空氣中過(guò)夜培養(yǎng)。在包含0.1％DMSO的培養(yǎng)基中用0.1％DMSO或20μM試驗(yàn)化合物(二乙酯，化合物1B到12B和TLK199)處理細(xì)胞2小時(shí)。處理后，通過(guò)離心分離收集細(xì)胞并用磷酸緩沖鹽水沖洗兩次。將細(xì)胞沉淀物重新懸浮在1mL裂解緩沖液(50mM Tris，pH8.0，120mM NaCl，0.5％NP-40表面活性劑，100mM NaF；使用前向其中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana，U.S.A.))中，并在4℃，溫和攪拌并孵育30分鐘。通過(guò)以13000rpm將細(xì)胞裂解物離心10分鐘以清除細(xì)胞碎片。對(duì)于免疫沉淀反應(yīng)，將2.1μg鼠單克隆抗人GSTπ抗體加入到1mg/mL總蛋白的500μL細(xì)胞裂解物中。在4℃過(guò)夜孵育后，將30μL蛋白A/G瓊脂糖珠(Pierce，Rockford，IL)加入到該混合物中并在4℃孵育1小時(shí)。隨后通過(guò)離心分離收集所述珠，在裂解緩沖液中沖洗三次，并重新懸浮在10μL非還原性十二烷基硫酸鋰樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，California，U.S.A.)中。在95℃加熱懸浮的樣品5分鐘，并在4-12％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE，隨后利用兔多克隆抗人GSTπ抗體并接著利用IRDye 800共軛的、親合力純化的羊抗兔IgG抗體進(jìn)行Westernblot分析。使GSTπ蛋白帶顯現(xiàn)并在Odyssey紅外掃描儀(Li-Cor，Lincoln，Nebraska，U.S.A.)上量化帶強(qiáng)度。將來(lái)自化合物處理的帶強(qiáng)度與其相應(yīng)的DMSO對(duì)照比較，并表達(dá)為抑制百分比。結(jié)果列在下面的表2中。
表2.通過(guò)本發(fā)明的二酸化合物的GST同工酶抑制，以及本發(fā)明的二乙酯化合物的HL-60細(xì)胞毒性和GSTπ免疫沉淀(*對(duì)于化合物6，三乙酯，包括在聯(lián)苯基羧酸酯的酯化)。
NM-未測(cè)量的值；空白-未制備的化合物本發(fā)明的二酸化合物都是GST P1-1的非常有效的抑制劑(IC50＜20nM，其中幾個(gè)IC50＜10nM)，并且對(duì)于GST P1-1的選擇性大于GST A1-1和GST M1-1(兩種其它人類GST同工酶)。二乙酯在HL-60細(xì)胞中都表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒性，并且許多如免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中所測(cè)量的那樣表現(xiàn)出GSTπ的顯著抑制。
還測(cè)試了本發(fā)明的一些二乙酯化合物的提高HL-60細(xì)胞分化的能力。這說(shuō)明了本發(fā)明的化合物在體外刺激HL-60人類白血病細(xì)胞系的分化方面的有益作用。這些結(jié)果被認(rèn)為是在人類骨髓刺激中有效的預(yù)兆，因?yàn)門LK199，其在本測(cè)定中提高分化，在人類中顯示出骨髓刺激活性。在2mL體外實(shí)施例2中所用的補(bǔ)充的RPMI1640培養(yǎng)基和溶解在DMSO中的試驗(yàn)化合物中(DMSO的終濃度為0.1％)，在空氣/5％CO2下，在37℃，孵育對(duì)數(shù)期細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)24小時(shí)。通過(guò)離心分離(1250rpm，5min，20℃)收集細(xì)胞，并用2mL包含2％FBS的冰冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)沖洗，隨后用10μL藻紅蛋白-共軛的抗CD11b抗體或10μL藻紅蛋白-共軛的同種型對(duì)照抗體染色。在冰上放置30分鐘后，將細(xì)胞重新懸浮在包含2％FBS的2mL冰冷的PBS中。通過(guò)離心分離(1250rpm，5min，20℃)收集細(xì)胞，并將細(xì)胞重新懸浮在0.4mL包含2％FBS的PBS中。通過(guò)流式細(xì)胞儀并利用FACSCalibur分析儀(BDBiosciences)，檢測(cè)了CD11b(一種粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的標(biāo)記物)的特異性細(xì)胞表面表達(dá)。所有的測(cè)定以三份進(jìn)行，DMSO作為對(duì)照。分化程度表達(dá)為來(lái)自DMSO對(duì)照的信號(hào)倍數(shù)(a multiple of thesignal)。許多試驗(yàn)化合物提高了HL-60細(xì)胞的分化。
根據(jù)這些結(jié)果和這些化合物與TLK199的結(jié)構(gòu)類似性，所述化合物，尤其是作為二酯，預(yù)期治療性作用于加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
劑型實(shí)施例.本實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的化合物(尤其是二酯)的合適的劑型。
通過(guò)組合以下物質(zhì)制備用于口服的固體劑型化合物 25.0％w/w硬脂酸鎂0.5％w/w淀粉2.0％w/w羥丙基甲基纖維素1.0％w/w微晶纖維素 71.5％w/w并且壓制該混合物以形成片劑或填入包含例如250mg化合物的硬膠囊中。如果需要，可以通過(guò)下述過(guò)程來(lái)對(duì)片劑進(jìn)行包衣施加成膜劑(如，羥丙基甲基纖維素)、顏料(如，二氧化鈦)、以及增塑劑(如酞酸二乙酯)的懸浮液，然后通過(guò)蒸發(fā)溶劑來(lái)干燥膜。
用于IV施加的劑型是這樣制備將例如作為藥用鹽的化合物溶解在磷酸緩沖鹽水中，濃度為1％w/v；將該溶液滅菌，例如通過(guò)過(guò)濾除菌，并密封在包含例如250mg本發(fā)明的化合物的無(wú)菌容器中。
可替換地，可以這樣制備凍干劑型將例如作為藥用鹽的化合物溶解在合適的緩沖液中，如上述磷酸緩沖鹽水的磷酸鹽緩沖液；將該溶液滅菌并分裝在合適的無(wú)菌小瓶中；將該溶液凍干以除去水；以及密封小瓶。通過(guò)加入無(wú)菌水使凍干劑型成原狀，并且可以進(jìn)一步稀釋成原狀(reconstituted)溶液用于施加，如0.9％氯化鈉溶液靜脈內(nèi)灌注或5％右旋糖溶液靜脈內(nèi)灌注。
可替換地，通過(guò)US公開(kāi)申請(qǐng)第2003/0100511號(hào)的方法(如實(shí)施例4和5)，并利用本發(fā)明的化合物替代上述申請(qǐng)中的化合物9，可以制備脂質(zhì)體劑型，并且該劑型可以如上述申請(qǐng)中所述被凍干。
治療實(shí)施例.本實(shí)施說(shuō)明了用于本發(fā)明的化合物的合適的治療方法。
在上述劑型實(shí)施例中所述的靜脈內(nèi)劑型中的本發(fā)明的化合物以50mg/m2的首次劑量經(jīng)30分鐘靜脈內(nèi)施加給患有骨髓增生異常綜合癥的患者；并且這個(gè)劑量被提高到100mg/m2、200mg/m2、400mg/m2、和600mg/m2。每隔3周，給予該化合物每天一次，時(shí)間為5天。
雖然參照特定實(shí)施方式和實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是考慮到技術(shù)和本發(fā)明的披露內(nèi)容，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，所披露的特定材料和方法的等同替換可以應(yīng)用于本發(fā)明；并且這樣的等同替換包括在所附權(quán)利要求內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)式如下的化合物 其中n為0或1；W是L-γ-谷氨酰基或L-γ-谷氨?；拾滨＃籜是可選取代的C5-6環(huán)烷基、可選取代的C5-6雜環(huán)烷基、可選取代的苯基、或可選取代的C5-6雜芳基；Y是＝O、＝N-OH、或＝N-O(可選取代的C1-3烷基)；以及Z是可選取代的苯基或可選取代的C5-6雜芳基；或其C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或(C5-6雜芳基)-C1-3烷基單酯或二酯；或所述化合物的鹽或其單酯或二酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，n為0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，n為1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中，Y為＝O。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)所述的化合物，其中，W是L-γ-谷氨酰基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)所述的化合物，其中，X是環(huán)戊基、環(huán)己基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、或可選取代的苯基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中，X是環(huán)己基。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中，X是可選地被1或2個(gè)氟基、氯基、甲基、羥基、甲氧基、或三氟甲基基團(tuán)取代的苯基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中，所述苯基是未取代的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中，所述苯基是取代的并且取代基中的一個(gè)在4位。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中，只有一個(gè)取代基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任何一項(xiàng)所述的化合物，其中，所述-C(＝Y(jié))n-Z取代是在所述苯基基團(tuán)的2位或4位。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其中，所述-C(＝Y(jié))n-Z取代是在所述苯基基團(tuán)的2位。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其中，所述-C(＝Y(jié))n-Z取代是在所述苯基基團(tuán)的4位。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中，Z是可選地被氟基、氯基、氰基、甲基、羥基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任何一項(xiàng)所述的化合物，其是二酸或其鹽。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任何一項(xiàng)所述的化合物，其是二酯或其鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其是C1-6烷基或芐基二酯，或其鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的化合物，其是C1-3烷基二酯，或其鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其是二乙酯，或其鹽。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其選自L-γ-谷氨酰基-S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(2-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(2′-氰基-4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(2′-甲氧基-4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(3′-(三氟甲基)-4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨酰基-S-[(4′-羧基-4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(4′-氰基-4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(4-苯甲酰苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨酰基-S-({4-[(2-氨基乙氧基亞氨基)(苯基)甲基]苯基}甲基)-L-半胱氨酰-D-苯基甘氨酸、L-γ-谷氨?；?S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-(4-氯苯基)甘氨酸、以及L-γ-谷氨酰基-S-[(4-聯(lián)苯基)甲基]-L-半胱氨酰-D-環(huán)己基甘氨酸、以及它們的二乙酯，以及所述化合物的鹽和它們的二乙酯。
22.一種包括權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所述的化合物的藥物組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的藥物組合物，進(jìn)一步包括賦形劑。
24.權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所述的化合物在制造用于下述一種或多種的藥物中的應(yīng)用加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
25.用于下述一種或多種的方法加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成，該方法包括給予權(quán)利要求1到21中任何一項(xiàng)所述的化合物或權(quán)利要求22或23的任何一項(xiàng)所述的組合物。
26.一種化學(xué)式如下的化合物 其中W是N-α-R1-L-γ-谷氨?；騈-α-R1-L-γ-谷氨酰基甘氨?；?，其中R1是胺保護(hù)基團(tuán)；以及n、X、Y、以及Z如權(quán)利要求1中所定義；或者其C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或(C5-6雜芳基)-C1-3烷基單酯或二酯；或所述化合物的鹽或其單酯或二酯。
全文摘要
本發(fā)明披露了三肽和四肽硫醚、包含它們的藥物組合物、它們的藥學(xué)應(yīng)用、以及它們的制備。所述化合物用于加強(qiáng)化學(xué)治療劑在腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用、選擇性地在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞毒性、提高骨髓中GM祖細(xì)胞的產(chǎn)量、刺激骨髓的分化、減輕化學(xué)治療劑的骨髓抑制作用、以及調(diào)節(jié)骨髓中的血細(xì)胞生成。
文檔編號(hào)A61K38/06GK101090977SQ200680001494
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2006年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月6日
發(fā)明者納塔利婭·奧雷科埃切亞, 安德魯·B·凱爾松, 羅伯特·W·毛喬陶, 路易絲·魯濱遜, 安東尼·J·桑切斯, 尼古拉斯·M·圣地亞哥, 史蒂文·R·修, 雷納·J·西蒙 申請(qǐng)人:泰立克公司