專利名稱：：用于免疫調(diào)節(jié)的HIV-1gp41融合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的肽在預(yù)防或治療自身免疫疾病和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法中的新用途，所述方法包括給受治療者施用有效量的fflVgp41融合肽或其片段、同系物和衍生物。如此，要求保護(hù)可用于本發(fā)明方法的HlVgp41融合肽的某些新型片段。
背景技術(shù)：
：人類免疫缺陷病毒(HIV)感染擾亂免疫應(yīng)答。未治療的HIV感染通常導(dǎo)致總體的免疫抑制狀態(tài)、荻得性免疫缺陷綜合征(AIDS),并易患其他方面的無害機(jī)會(huì)性感染。然而，為建立成功的感染和復(fù)制，所述病毒必須逃避免疫控制一-HIV通過使用廣泛機(jī)制完成的任務(wù)，所述機(jī)制近期得到綜述(Johnson和Descrosiers,2002)。特別引人注目的是針對(duì)HIV自身的CD4+T細(xì)胞活化的抑制(Rosenberg等，1997;Norris和Rosenberg,2001);抗HIVCD4+T細(xì)胞是建立能夠控制所述病毒的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)所需要的(Altfeld和Rosenberg,2000)。靶細(xì)胞的HIV感染需要病毒膜與細(xì)胞膜的融合；該過程由env基因產(chǎn)物一包裝糖蛋白gpl60所催化。成熟的gpl60由兩個(gè)非共價(jià)連接的亞基一gpl20和gp41構(gòu)成(Wyatt和Sodroski，1998)。隨著gpl20與靶細(xì)胞上的膜受體相互作用，gp41亞基在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用。之前已經(jīng)鑒定了gp41的幾個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(圖1)。認(rèn)為N末端疏水融合結(jié)構(gòu)域一融合肽(FP)在膜融合中起重妻作用(圖1)。實(shí)際上，具有單個(gè)氨基酸(aa)取代的變異體FP,即V2E,顯示了比野生型FP小的融合活性(Kliger等，1997)。FP的前16個(gè)氨基酸插入靶細(xì)胞膜，且C20區(qū)插入病毒膜(Peisajovich和Shai,2003;Suarez等，2000)。N36和C34肽含有形成六螺旋束連接子(six-helixbundlelinker)(Chan等，1997)的七肽重復(fù)區(qū)，所述連接子使病毒膜和靶細(xì)胞膜緊密靠近。融合受相應(yīng)于C末端七肽重復(fù)區(qū)的肽DP178(HIV-l^gp41蛋白的氨基酸638-673)的抑制；該肽是HIV感染的強(qiáng)有力抑制劑，并已經(jīng)在近期被批準(zhǔn)用于人類應(yīng)用(Lawless等，1996)。用于抑制病毒感染的HIVgp"衍生肽公開于，例如，美國專利第5,464,933、6,133,418、6,093,794號(hào)(涉及DP178和DP107—相應(yīng)于HIVLAIgp41的氨基酸558-595的肽，及其類似物)和第5,840,843號(hào)(涉及相應(yīng)于氨基酸殘基600-862,或其包含相應(yīng)于HIV-11IIB包裝糖蛋白的氨基酸殘基637-666的序列的部分)。關(guān)于FP與T細(xì)胞膜的相互作用，Cladera等才艮道編碼FP的16個(gè)N末端氨基酸的合成肽顯示了在JurkatT細(xì)胞系的膜上的異質(zhì)分布(Cladera等，20(U)。反應(yīng)性T細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)域中突出的是免疫突觸。免疫突觸是跨膜分子簇，其確保了抗原特異性T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞之間的特異性相互作用。免疫突觸包括TCR和CD4分子以及T細(xì)胞活化中涉及的其他關(guān)鍵分子(Davis和Dustin,2004;Huppa等，2003)。免疫突觸的功能是完整的T細(xì)胞活化所需要的(H叩pa等，2003)。然而，現(xiàn)有技術(shù)無一公開或表明HIV-1gp41的FP結(jié)構(gòu)域可以區(qū)域化于免疫突觸并調(diào)控T細(xì)胞活化。雖然正常的免疫系統(tǒng)受到近似調(diào)控，但免疫反應(yīng)的異常并非是罕見的。在一些情況中，免疫系統(tǒng)功能不適當(dāng)?shù)仄鹱饔茫瑢?duì)宿主組分發(fā)生反應(yīng)，如同所述組分實(shí)際上是外源的。這種反應(yīng)導(dǎo)致了自身免疫疾病，其中宿主的免疫系統(tǒng)攻擊宿主自身組織。作為免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)子，T細(xì)胞直接或間接地影響這類自身免疫疾病。T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病指任何其中不適當(dāng)T細(xì)胞反應(yīng)是所述疾病組成的病癥。這既包括由T細(xì)胞直接介導(dǎo)的疾病，也包括其中不適當(dāng)T細(xì)胞反應(yīng)促進(jìn)異?？贵w生成的疾病。多種疾病被認(rèn)為起因于自身免疫機(jī)制。這些疾病中突出的是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、重癥肌無力、尋常型天皰滲。自身免疫疾病影響全世界數(shù)百萬人，以實(shí)際治療支出和損失的生產(chǎn)力方式計(jì)算，這些疾病的費(fèi)用每年為數(shù)十億美元。T細(xì)胞在器官移植的排斥或經(jīng)由骨髓(造血干細(xì)胞)移植的移植物抗宿主疾病中也起主要作用。因此，這種免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)是治療上所希望的。用以嘗試調(diào)節(jié)患者免疫反應(yīng)的傳統(tǒng)試劑和方法還導(dǎo)致不希望的副作用，且療效有限。例如，用于治療自身免疫疾病患者的免疫抑制劑(如，環(huán)孢素A、硫唑噤呤和潑尼松)還抑制所述患者的全部免疫反應(yīng)，從而增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)，并可以導(dǎo)致對(duì)非淋巴樣組織的毒副作用。由于免疫調(diào)節(jié)的醫(yī)療重要性和現(xiàn)有免疫藥理學(xué)試劑的不足，用以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)特定部分的試劑和方法已是多年來研究的主題。在一些自身免疫疾病中，有關(guān)的自身抗原是已知的并因此能夠用于特異療法。例如，除了許多其他專利公開文獻(xiàn)外，用于誘導(dǎo)對(duì)特定自身抗原的免疫耐受和/或保護(hù)性免疫的方法已由例如WO01/12222、WO97/02016和WO01/30378所7>開。免疫反應(yīng)的其他組分，如細(xì)胞因子和粘附分子也已成為開發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑的靶點(diǎn)，如除了許多其他公開外,由例如WO01/57056、US6,316，420、WO04/002500和WO00/63251所公開的?；赥CR衍生序列的肽也已經(jīng)被公開(WO96/22306,WO97/47644),推測其通過干擾組裝而用于破壞TCR功能。然而，證明這些肽在比本發(fā)明肽高約100倍的濃度下是有效的，因此具有顯著較高的潛在毒性和副作用。US5,230，887公開了通過施用亞免疫量的抗原來治療或抑制自身免疫疾病癥狀的方法，所述抗原與同種異體免疫免疫原吸收的(AIA)血清比與同物種的非免疫血清更具免疫反應(yīng)性。根據(jù)一種推定抗原與MHC-II類抗原的推定的血清學(xué)交叉反應(yīng)性，表明該推定抗原是HIV的完整gp41。所推斷的交叉反應(yīng)性存在于C末端肽(Golding等，1989)。WO89/09785涉及能夠抑制HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞融合或細(xì)胞病變合胞體形成的肽序列，其相應(yīng)于位于HIV-1gp41的氨基末端和HIV-2gp40的氨基末端的疏水結(jié)構(gòu)域。該公開內(nèi)容明確了這些肽可以在所述肽的氨基末端和/或所述肽的前兩個(gè)氨基酸處具有D-異構(gòu)體而非L-異構(gòu)體，但沒有公開任何包含D-氨基酸的肽的具體實(shí)施方案。WO89/09785的公開內(nèi)容揭示了使用一族相關(guān)肽抑制HIV誘導(dǎo)的融合和合胞體形成，所述肽都包含BH10株的gp41的至少前三個(gè)氨基酸；具體肽相應(yīng)于氨基酸殘基1-3,相應(yīng)于氨基酸殘基1-6的肽和相應(yīng)于改變順序的氨基酸殘基1-6的肽。在本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)日后公布的、為本發(fā)明的一些發(fā)明人的WO2005/060350公開了膜結(jié)合的非對(duì)映異構(gòu)體肽，其包含相應(yīng)于跨膜蛋白的片段的氨基酸序列，其中所述非對(duì)映異構(gòu)體肽的至少兩個(gè)氨基酸殘基為D-異構(gòu)體構(gòu)型，可用于抑制融合膜蛋白事件，所述融合膜蛋白事件具體包括病毒復(fù)制和傳^番。此外，WO2005/060350的公開內(nèi)容揭示了相應(yīng)于HIV-lLAVlgp41的氨基酸512至544的非對(duì)映異構(gòu)體肽在抑制膜融合過程中的應(yīng)用。存在對(duì)治愈或改善T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病或自身免疫疾病以及改善T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的更有效方法的長期渴望的需求。因此，希望開發(fā)能夠選擇性抑制T淋巴細(xì)胞活化且具有最小副作用的新免疫抑制劑。發(fā)明概述本發(fā)明首次公開了來源于HIV的gp41融合肽結(jié)構(gòu)域(FP)的肽或其片段、同系物和衍生物在有效預(yù)防或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中的新用途，所述疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫和移植物排斥。如此，要求保護(hù)特別用于這些方法的fflV的gp41融合肽結(jié)構(gòu)域(FP)的某些新型的活性片段。本發(fā)明部分地基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即HIV-lgp41分子的分離的融FP與其他gp41結(jié)構(gòu)域一起行使功能，以介導(dǎo)病毒體與宿主細(xì)胞的融合?，F(xiàn)在首次公開了FP與TCR和CD4分子在T細(xì)胞膜中共區(qū)域化，并表明其在體外和體內(nèi)抑制T細(xì)胞活化。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)FP(SEQIDNO:l)特別抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，而沒有影響經(jīng)由非特異性活化劑例如促有絲分裂的抗體(mitogenicantibodie)的T細(xì)胞活化。值得注意的是，F(xiàn)P在體內(nèi)抑制了這些疾病的動(dòng)物模型中的致關(guān)節(jié)炎的T細(xì)胞的活化和佐劑關(guān)節(jié)炎。另外，發(fā)現(xiàn)FP在體內(nèi)是非免疫原性的，以與其抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合的能力無關(guān)的序列和結(jié)構(gòu)依賴性方式起作用。這些意想不到的發(fā)現(xiàn)顯示了gp41融合肽結(jié)構(gòu)域的新功能具有治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的新用途。意想不到的是，本文公開了相應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸殘基5-13(SEQIDNO:407)的FP片段比相應(yīng)于氨基酸殘基l-8(SEQIDNO:406)的FP片段更大程度地保留了FP抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力。本發(fā)明進(jìn)一步基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即相應(yīng)于FP的非對(duì)映異構(gòu)體肽或其部分序列抑制了炎癥，不管所述肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。因此，本發(fā)明提供了來源于HIVgp41的分離的融合肽及其片段、類似物、突變體、變異體、共輒物、衍生物和鹽在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫中的新用途。因此，本發(fā)明涉及已知的肽和之前本領(lǐng)域中未描述的肽的用途，已知的肽例如全長FP(SEQIDNO:l)、非對(duì)映異構(gòu)體書f生物IFFA(SEQIDNO:6)和FP變異體V2E(SEQIDNO:2)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了如下具體描述的新型的FP的片段、類似物和變異體。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的分離的肽或其片段、類似物、突變體、變異體、共軛物、衍生物和鹽用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的用途，所述疾病包括但不限于炎性疾病、自身免疫疾病和移植物排斥。根據(jù)某些特定實(shí)施方案，所述疾病為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，包括但不限于多發(fā)性硬化癥、自身免疫神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病、I型糖尿病(IDDM)、舍格倫氏病、曱狀腺疾病、重癥肌無力、肉樣瘤病、自身免疫性眼色素層炎、炎性腸病(克隆氏結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)、自身免疫性肝炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。下文通過佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)的動(dòng)物疾病模型作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠砭唧w舉例說明本發(fā)明，所述佐劑關(guān)節(jié)炎是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性自身免疫疾病。該模型意于為非限制性實(shí)施例，用于本發(fā)明原理的說明性目的。在另一特定實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病選自同種異體移植物排斥和移植物抗宿主疾病。根據(jù)特定實(shí)施方案，所述肽是來源于HIV-1gp41蛋白的融合肽結(jié)構(gòu)域的片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽具有如SEQIDNO:l所列的氨基酸序列(見表1)。根據(jù)可供選擇的實(shí)施方案，所述肽為V2E變異體(SEQIDNO:2;見表1)。根據(jù)某些優(yōu)選實(shí)施方案，所述肽是根據(jù)表2的HIV-1gp41融合肽變異體，具有如SEQIDNO:7-198中任一者所列的氨基酸序列。根據(jù)其他優(yōu)選實(shí)施方案，融合肽是根據(jù)表2的HIV-1gp41融合肽片段，具有如SEQIDNO:199-405中任一者所列的氨基酸序列。在另一特定實(shí)施方案中，所述肽是相應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸1-8的HIV-1gp41融合肽片段，在本文命名為FPm(SEQIDNO:406;見表1)。在另一特定實(shí)施方案中，所述肽是相應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸5-13的fflV-1gp41融合肽片段，在本文命名為FP5.13(SEQIDNO:407;見表1)。在另一特定實(shí)施方案中，所述融合肽是FPw3的變異體，具有如SEQIDNO:409-414中任一者所列的氨基酸序列(見表2)。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:7-407和SEQIDNO:409-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述肽是相應(yīng)于全長FP的非對(duì)映異構(gòu)體肽，在本文命名為IFFA(見表1)，具有如SEQIDNO:6所列的氨基酸序列。在另一特定實(shí)施方案中，所述肽是相應(yīng)于？？5.13的非對(duì)映異構(gòu)體肽，在本文命名為FP5.13A6(見表l)，具有如SEQIDNO:408所列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述肽包括能夠抑制T細(xì)胞活化的FP5-i3的類似物、變異體、衍生物和共軛物，F(xiàn)P^3如這里式(I)所描述的Xr-AArAA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-X2(I)其中Xj代表N末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸序列的肽，或者可以不存在；AA,、AA2、AA6和AA9各自獨(dú)立代表丙氨酸或甘氨酸氨基酸殘基；AA3代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸氨基酸殘基；AA4、AA5、AA和AAs各自獨(dú)立代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸或絲氨酸氨基酸殘基，其中除了AA4、AA5、AA7和AAs中任意三個(gè)可以是亮氨酸氨基酸殘基之外，AA4、AA5、AA7和AAs中不超過兩個(gè)氨基酸殘基是相同的；X2代表C末端保護(hù)基，為長度達(dá)20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有纈氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸序列的肽，或者可以不存在；其中每個(gè)氨基酸可以是L或D型，且所述肽長度不超過30個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽不包含超過一個(gè)絲氨酸殘基。另一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防與不適當(dāng)或有害T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的疾病或病癥的癥狀的方法，包括給具有相應(yīng)需要的個(gè)體施用治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含作為活性成分的來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的分離的肽或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。另一實(shí)施方案中，所述肽具有如SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDNO:6-414或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。在另一實(shí)施方案中，所述肽是能夠抑制T細(xì)胞活化的如上詳述的式(I)所列的肽。本發(fā)明的另一方面是一種抑制T細(xì)胞活化的方法，其中所述方法包括給具有相應(yīng)需要的個(gè)體施用治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含作為活性成分的來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的分離的肽或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-l。另一實(shí)施方案中，所述肽具有如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和SEQIDNO:6-414或其片段、類似物、變異體、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。在另一實(shí)施方案中，所述肽是能夠抑制T細(xì)胞活化的如上詳述的式(I)所列的肽。本發(fā)明的其他方面涉及來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的新型肽以及包含所述新型肽的藥物組合物。因此，在另一方面，提供了一種能夠抑制T細(xì)胞活化的肽，其具有式(I):X廣AA廣AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-AA7-AA8-AArX2(I)其中Xi代表N末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸序列的肽，或者可以不存在；AApAA2、AA6和AA9各自獨(dú)立代表丙氨酸或甘氨酸氨基酸殘基；AA3代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸氨基酸殘基；AA4、AA5、AA7和AAs各自獨(dú)立代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸或絲氨酸氨基酸殘基，其中除了AA4、AA5、AA7和AAs中任意三個(gè)可以是亮氨酸氨基酸殘基之外，AA4、AA5、AA7和AAg中不超過兩個(gè)氨基酸殘基是相同的；X2代表C末端保護(hù)基，為長度達(dá)20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有纈氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸序列的肽，或者可以不存在；其中每個(gè)氨基酸可以是L或D型，且所述肽長度不超過30個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽不包含超過一個(gè)絲氨酸殘基。在另一實(shí)施方案中，所述肽是FP^3,具有如SEQIDNO:407中所列的氨基酸序列。另一實(shí)施方案中，所述肽具有如SEQIDNO:409-414中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含L和D氨基酸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述肽是FPw3A6，具有如SEQIDNO:408所列的氨基酸序歹'j。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含作為活性成分的式(I)的肽及其鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。結(jié)合附圖、說明書和隨后的權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案將變得顯而易見。附圖簡述圖1描述了HIV-1gp41外功能區(qū)的功能結(jié)構(gòu)域。gp41在gpl20結(jié)合至表面受體后變得具有活性；FP插入靶細(xì)胞的膜；C20插入病毒體的膜；N36和C34形成六螺旋束"彈簧"，其使所述膜形成并置(apposition);且ISU具有免疫抑制性。圖2說明了FP與CD4和TCR分子在T細(xì)胞免疫突觸中的共區(qū)域化。FP、V2E或AMP肽共軛至玫瑰紅(Rho)，并結(jié)合抗CD4或TCR的FITC標(biāo)記抗體用以研究結(jié)合至活化的T細(xì)胞膜的肽。(a)Rho標(biāo)記的FP或AMP在活化的T細(xì)胞中的分布。(b)FP-Rho與CD4和TCR分子的共區(qū)域化。(c)V2E-Rho與TCR的共區(qū)域化。(d)FP-Rho或V2E-Rho與針對(duì)TCR的FITC標(biāo)記的抗體之間的FRET。圖3表示在FP(黑色)、V2E(灰色)或p277(白色)存在下使用Mtl76-90肽(a、c和e)或PPD(b、d和f)在體外激活了針對(duì)Mt免疫鼠的Mt.LNC的T細(xì)胞反應(yīng)的FP抑制，并測定了增殖反應(yīng)(a和b)、IFNy分泌(c、d)和IL-10分泌(e、f)。在至少三次附加實(shí)驗(yàn)中獲得了相似的結(jié)果。圖4包含的圖顯示了FP作用于T細(xì)胞而不作用于免疫突觸中的APC。A2bT細(xì)胞或APC分別用FP(黑色)、V2E(灰色)或p277(白色)預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)，并洗滌。經(jīng)處理的T細(xì)胞與未經(jīng)處理的APC混合，且經(jīng)處理的APC與未經(jīng)處理的A2b混合，并測定A2bT細(xì)胞在用Mtl76-卯刺激后的增殖。圖5說明了FP不抑制由PMA/伊屋諾霉素或抗CD3抗體所誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化。在FP(黑色)或p277(白色)存在下用PMA/伊屋諾霉素(a)或抗CD3抗體(b)刺激A2bT細(xì)胞，并研究T細(xì)胞的增殖。圖6描述了FP對(duì)AA的抑制。通過對(duì)混合有FP(菱形)、V2E(三角形)、p277(空心方形)或PBS(實(shí)心方形)的油中的Mt免疫而誘導(dǎo)AA。從第10天開始每兩或三天對(duì)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)分(a);第26天檢測腿肺脹(b);第16天檢測針對(duì)PPD的DTH反應(yīng)(c);第26天在用HSP71或Mtl76-90刺激LNC后檢測IFNY分泌U)。圖7提供了對(duì)于HIV感染和免疫療法中FP的工作假設(shè)的圖示。圖8說明了在體內(nèi)對(duì)于FP的T細(xì)胞免疫的FP抑制。來自對(duì)混合有FP(三角形)、V2E(十字交叉)、IFFA(方形)或PBS(菱形)的油中的Mt免疫的大鼠的LNC在體外分別用FP、V2E、IFFA或PBS進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測IFNy分泌。在至少三次附加實(shí)驗(yàn)中得到相似的結(jié)果。圖9說明了FP衍生片段和非對(duì)映異構(gòu)體肽抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖。A-C為在FP5.13(A)、FPl8(B)或FP5.13A6(C)存在或不存在下，用MOG35.55肽體外活化的來自Mt免疫鼠的LNC的增殖反應(yīng)。D為在IFFA存在或不存在下用PPD體外活化的來自Mt免疫鼠的LNC的增殖反應(yīng)。圖IO說明了IFFA對(duì)大鼠的佐劑關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)抑制。通過對(duì)混合有IFFA肽(圓形)或PBS(菱形)的油中的Mt免疫而誘導(dǎo)AA。從第10天起每兩或三天對(duì)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行評(píng)分；標(biāo)準(zhǔn)誤低于10%。圖11說明了通過使用FP和IFFA經(jīng)皮治療的DTH的體內(nèi)抑制。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于控制T細(xì)胞活性的新方法。現(xiàn)在首次表明包含HIVgp41融合肽(FP)的組合物是用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的有效治療劑。具體地，本發(fā)明涉及使用人類病毒的分離的融合肽來抑制T細(xì)胞活化。優(yōu)選地，所述病毒是人類免疫缺陷病毒。更優(yōu)選地，所述病毒是HIV-1。所述分離的融合肽用于預(yù)防或改善T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，如自身免疫性疾病、炎性疾病、移;f直物排斥和變態(tài)反應(yīng)。本發(fā)明部分基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即HIV-1gp41融合肽結(jié)構(gòu)域(FP)能夠抑制抗原特異性T細(xì)胞活化，其將在本文更詳細(xì)地描述。不希望受特定作用機(jī)理的束縛，假定本發(fā)明的肽區(qū)域化于免疫突觸，從而抑制T細(xì)胞活化。圖7提供了假定的FP功能的圖示，藉此FP在HIV感染中行使兩種功能并提供用于免疫療法的新工具。HIV感染圖示描述了FP對(duì)HIV感染的兩種作用。FP插入T細(xì)胞免疫突觸促進(jìn)了融合和感染，同時(shí)其下調(diào)了對(duì)HIV表位的特異性T細(xì)胞免疫。在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)為有害的情況下，例如針對(duì)自身抗原的反應(yīng)或移植物排斥，免疫療法將所述經(jīng)由FP的下調(diào)擴(kuò)展至T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，F(xiàn)P自身或其活性片段可以作為新型免疫治療劑。T細(xì)胞活化T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是免疫反應(yīng)中涉及的多種不同細(xì)胞類型的一種。T細(xì)胞的活化受主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子中遞呈給T細(xì)胞的抗原所調(diào)節(jié)。然后，T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合至MHC-抗原復(fù)合物。一旦抗原復(fù)合至MHC，則MHC-抗原復(fù)合物被T細(xì)胞上的特異性TCR所結(jié)合，從而改變?cè)揟細(xì)胞的活性。經(jīng)由抗原遞呈細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的適當(dāng)活化不僅需要TCR的刺激，而且需要其輔助受體的共同和協(xié)調(diào)性參與。大多數(shù)TCR輔助受體結(jié)合細(xì)胞表面配基，并集中于細(xì)胞-細(xì)胞接觸，形成所稱的免疫突觸。突觸形成與抗原特異性T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子生成和裂解性顆粒釋放相關(guān)聯(lián)，并確定其功能是完整的T細(xì)胞活化所必需的(Davis和Dustin，2004;Huppa等,2003)。T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法。術(shù)語"T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病"指其中不適當(dāng)或有害的T細(xì)胞反應(yīng)是疾病或疾患的病因或病理的組成的任何病癥。該術(shù)語意于不僅包括由T細(xì)胞直4妄介導(dǎo)的疾病，還包括其中不適當(dāng)或有害的T細(xì)胞反應(yīng)促進(jìn)異?？贵w生成的疾病，以及移植物排斥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，包括但不限于多發(fā)性硬化癥、自身免疫性神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病、I型糖尿病(IDDM)、舍格倫氏病、曱狀腺疾病、重癥肌無力、肉樣瘤病、自身免疫眼色素層炎、炎性腸病(克隆氏結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)或自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在其他實(shí)施方案中，所述組合物可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病，包括但不限于炎性疾病或變態(tài)反應(yīng)疾病，如哞喘、過敏性肺病、過敏性肺炎、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、間質(zhì)性肺病(ILD)(例如，特發(fā)性肺纖維變性，或與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其他炎性疾病相關(guān)的ILD);硬皮病；銀屑病(包括T細(xì)胞介導(dǎo)的銀屑病)；皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕滲性皮炎)，虹膜炎，結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎，皮膚紅斑狼裔，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥物性皮滲，變應(yīng)性腦脊髓炎，急性出血性壞死腦病，自發(fā)性兩側(cè)遞增性感覺神經(jīng)性聽力喪失，再生障礙性貧血，單純紅細(xì)胞性貧血，自發(fā)性血小板減少，多軟骨炎，Graves眼病和原發(fā)性膽汁性肝硬變。在其他實(shí)施方案中，所述組合物可用于治療移植物排斥，包括同種異體移植物排斥或移植物抗宿主疾病。肽和基于肽的藥物組合物本發(fā)明部分基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即HIV融合肽(FP)及其片段和衍生物抑制T細(xì)胞活化。意想不到的是，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于FP的氨基酸殘基5-13的分離的FP片段及其非對(duì)映異構(gòu)體衍生物，和相應(yīng)于FP的氨基酸殘基1-8的分離的片段(較小程度上)，保留了FP抑制T細(xì)胞抗原依賴性增殖的能力。因此，第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽XrAArAA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA"AA8-AA9OC2其中Xj代表N末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸序列的肽，或者可以不存在；AA,、AA2、AA6和AA9各自獨(dú)立代表丙氨酸或甘氨酸氨基酸殘基；AA3代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸氨基酸殘基。AA4、AA5、AA7和AAs各自獨(dú)立代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸或絲氨酸氨基酸殘基，其中除了AA4、AA5、AA7和AAs中任意三個(gè)可以是亮氨酸氨基酸殘基之外，AA4、AA5、AA7和AA8中不超過兩個(gè)氨基酸殘基是相同的；X2代表C末端保護(hù)基，為長度達(dá)20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有纈氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸序列的肽，或者可以不存在；其中每個(gè)氨基酸可以是L或D型，且所述肽長度不超過30個(gè)氨基酸殘基。疏水性一般根據(jù)氨基酸在非極性溶劑和水之間的分配所定義。疏水性氨基酸是那些顯示偏好非極性溶劑的氨基酸。氨基酸的相對(duì)疏水性可以以疏水性標(biāo)度來表示，其中甘氨酸的疏水性標(biāo)度值為0.5。在這種標(biāo)度上，偏好水的氨基酸的值低于0.5,而那些偏好非極性溶劑的氨基酸值高于0.5。如本文使用的，術(shù)語"疏水性氨基酸"指疏水性標(biāo)度值大于或等于0.5的氨基酸，換言之，其分配入非極性溶劑的傾向至少等于甘氨酸。天然存在的疏水性氨基酸的例子是脂肪族氨基酸丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸和纈氨酸，和芳香族氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。當(dāng)作為殘基出現(xiàn)在蛋白質(zhì)中時(shí)，這些氨基酸賦予的疏水性是脂肪族側(cè)鏈長度和芳香族側(cè)鏈大小的函數(shù)。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽不包含超過一個(gè)絲氨酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是FPw3，具有如SEQIDNO:407中所列的氨基酸序列(GALFLGFLG)。通式結(jié)構(gòu)(I)的其他典型實(shí)施方案是選自下述序列的分離的肽GAVFLGFLG(SEQIDNO:409)、GAMFLGFLG(SEQIDNO:410)、GAVLLGFLG(SEQIDNO:411)、GAFFLGFLG(SEQIDNO:412)、GAMIFGFLG(SEQIDNO:413)和GALLFGFLG(SEQIDNO:414)。在另一實(shí)施方案中，所述肽是非對(duì)映異構(gòu)體肽，即同時(shí)包含L和D氨基酸的肽。所述非對(duì)映異構(gòu)體肽可以優(yōu)于具有同樣氨基酸序列的全部L氨基酸肽或全部D氨基酸肽，因?yàn)槠漭^高的水溶性和較低的對(duì)蛋白質(zhì)水解的敏感性。這些特征賦予了非對(duì)映異構(gòu)體肽比那些包含同樣氨基酸序列的全部L氨基酸肽或全部D氨基酸肽更高的效力和更高的生物利用度。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述肽是FPw3A6，具有如SEQIDNO:408中所列的氨基S臾序列(G^LFLGFLG，D氨基酸為黑體并加下劃線)。式(I)的肽優(yōu)選長度少于30個(gè)氨基酸。應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明，例如長度達(dá)50個(gè)氨基酸的較長的肽也可以用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，較短的肽是優(yōu)選的，因?yàn)楸容^容易制備。在另一目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽長度不超過20個(gè)氨基酸。在另一目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽長度不超過10個(gè)氨基酸。因此，在某些實(shí)施方案中，任選的N和C末端，即X!和X2，長度達(dá)20個(gè)氨基酸、優(yōu)選達(dá)10個(gè)氨基酸和更優(yōu)選達(dá)5個(gè)氨基酸，或在其他實(shí)施方案中長度達(dá)3個(gè)氨基酸或可以不存在。Xj和X2的氨基酸序列可以包含相應(yīng)于FP側(cè)翼區(qū)的序列，只要該肽不是之前本領(lǐng)域中描述過的肽。注意，預(yù)期式(I)提供的肽不包括已知的肽，如全長FP(SEQIDNO:1),和相應(yīng)于所述全長序列的非對(duì)映異構(gòu)體衍生物，如IFFA(SEQIDNO:6),和相應(yīng)于WO2005/060350中公開的全長序列的其他非對(duì)映異構(gòu)體衍生物，已知的Kliger等(1997V^開的V2E變異體(SEQIDNO:2),Martin等(1992)公開的具有如SEQIDNO:225所列的氨基酸序列的相應(yīng)于SEQIDNO:l的氨基酸1-16的肽，和WO89/09785公開的包含SEQIDNO:1的氨基酸1-3的肽。在替代實(shí)施方案中，X,和X2可以包含非來源于FP的序列，只要其保留了所需水平的疏水性。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含來源于HIVgp41的分離的融合肽及其類似物、突變體、變異體，共軛物和衍生物。根據(jù)特定實(shí)施方案，所述融合肽來源于HIV-1的gp41蛋白。根據(jù)可供選擇的實(shí)施方案，所述融合肽是V2E變異體。根據(jù)某些優(yōu)選的實(shí)施方案，所述融合肽具有如SEQIDNO:l中所列的氨基Si序列。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:2中所列的氨基酸序列。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合肽是根據(jù)表2的HIV-1gp41融合肽變異體，其具有如SEQIDNO:7-198中任一者所列的氨基酸序列。各種HIV4朱和變異體的數(shù)據(jù)庫是可獲得的(參見，例如，http:〃www.hiv.lanl.gov/content/index)。才艮據(jù)其4也優(yōu)選的實(shí)施方案，所述融合肽是根據(jù)表2的HIV-1gp41融合肽片段，其具有如SEQIDNO:199-405中任一者所列的氨基酸序列。根據(jù)其他優(yōu)選的實(shí)施方案，所述融合肽是根據(jù)表2的HIV-1gp41融合肽片^殳，其具有如SEQIDNO:406-407和409-414中任一者所列的氨基酸序列。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含L和D氨基酸殘基。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:6和408中任一者所列的氨基酸序列。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的融合肽片段優(yōu)選長度為5-50氨基酸，更優(yōu)選長度為10-36氨基酸。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含如上詳述的式(I)的肽?？梢允褂脤?shí)施例中所詳細(xì)描述的程序合成本發(fā)明的肽。然而，其他本領(lǐng)域已知的方法，包括^f旦不限于固相(例如Boc或f-Moc化學(xué))和液相合成方法，可以用于合成本發(fā)明的肽。本文描述的氨基酸殘基優(yōu)選為"L"異構(gòu)型。然而，"D"異構(gòu)型的殘基可以被取代為任何L氨基酸殘基，只要所述肽保留所需的功能性質(zhì)。應(yīng)該理解，融合蛋白不需要與本發(fā)明的肽的氨基酸序列相同，只要其包含所需序列并能夠如本文所述行使如本發(fā)明的肽的功能。本發(fā)明包括任何包含本發(fā)明的FP的類似物、衍生物和共軛物，只要所述肽能夠抑制T細(xì)胞活化。因此，本發(fā)明包括包含非天然氨基酸衍生物或非蛋白質(zhì)側(cè)鏈的肽。術(shù)語"類似物"包括任何具有與本文所具體描述的序列之一基本相同的氨基酸序列的肽，其中一個(gè)或多個(gè)殘基被功能相似的殘基所保守取代，并表現(xiàn)出如本文所述的能力。保守取代的例子包括一個(gè)非極性(疏水的)殘基取代另一個(gè)非極性(疏水的)殘基，如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；一個(gè)極性(親水的)殘基取代另一個(gè)極性(親水的)殘基，如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間；一個(gè)堿性殘基取代另一個(gè)堿性殘基，如賴氨酸、精氨酸或組氨酸；或一個(gè)酸性殘基取代另一個(gè)酸性殘基，如門冬氨酸或谷氨酸。術(shù)語"保守取代"還包括使用化學(xué)衍生殘基取代非衍生殘基，條件是這種肽表現(xiàn)出如本文所描述的必要的對(duì)T細(xì)胞的抑制性功能。術(shù)語"衍生物，，包括本發(fā)明的肽的任何化學(xué)衍生物，其具有由側(cè)鏈或功能基團(tuán)反應(yīng)而化學(xué)衍生的一個(gè)或更多殘基。這種衍生分子包括例如那些其中自由氨基已被衍生生成胺類氫氯化物、對(duì)曱苯磺酰基、節(jié)酯基、叔丁氧羰基、氯乙?；驎貂；姆肿?。自由羧基可以被衍生生成鹽、甲基酯和乙基酯或其他類型的酯或酰肼。自由羥基可以被衍生生成O-酰基或O-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以被衍生生成N-im-千基組氨酸(N-im-benzylhistidine)。化學(xué)衍生物還包括那些含有一種或多種20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸可以取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸；以及鳥氨酸可以取代賴氨酸。修飾包括但不限于末端-NH2?；?、乙酰化或巰基乙酸酰胺化，和通過末端羧基酰胺化，例如使用銨、曱胺等。肽可以是線性、環(huán)狀或分支的等，這些構(gòu)型可以通過使用本領(lǐng)域公知的方法獲得。因此，例如，式(I)中由X,和X2表示的"保護(hù)基"是常規(guī)用于肽化學(xué)領(lǐng)域中的化學(xué)基團(tuán)，賦予化學(xué)穩(wěn)定性和對(duì)肽鏈端解酶消化的抵抗力。例如，適當(dāng)?shù)腘末端保護(hù)基團(tuán)包括d.5鏈烷?；缫阴；?；其他典型保護(hù)基包括但不限于叔丁氧羰基、甲基、琥珀酰基、曱氧琥珀酰基、環(huán)庚基、己二?；?、壬二?；?azelayl)、丹酰基、千氧羰基、芴曱氧羰基、甲氧壬二?；?methoxyaselayl)、甲氧己二?；⒓籽醐h(huán)庚基和2,3-二硝基苯基。還適合作為N末端保護(hù)基團(tuán)的是缺乏氨基功能的氨基酸類似物。適當(dāng)?shù)腃末端保護(hù)基團(tuán)包括在C末端羧基的碳原子上形成酮或酰胺的基團(tuán)，或者在所述羧基的氧原子上形成酯的基團(tuán)。形成酮和酯的基團(tuán)包括烷基，特別是分支或未分支的d.5烷基，例如甲基、乙基和丙基，而形成酰胺的基團(tuán)包括氨基官能團(tuán)，如伯胺或烷氨基官能團(tuán)，例如單-Cw烷氨基和二-Cw烷氨基，如曱氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、曱基乙氨基等。其他典型的保護(hù)基可以包括但不限于C3，8環(huán)烷基，如環(huán)戊基、環(huán)己基；C6—12芳基，如苯基和a-萘基；苯基-d.2烷基，如千基、苯乙基或Cw4芳烷基；Cw烷基，如a-萘?xí)趸?；另外還有特戊酰氧甲基，其一般作為口服可生物利用的酯使用。氨基酸類似物也適合用于保護(hù)本發(fā)明化合物的C末端，所述化合物如去羧基化的氨基酸類似物，如緋精胺。本發(fā)明的肽還包括相對(duì)于本發(fā)明的融合肽序列具有一個(gè)或多個(gè)殘基的添加和/或缺失的任何肽，只要保持必要的抑制活性。氨基酸殘基的添加可以在本發(fā)明肽的任一末端進(jìn)行，目的是提供本發(fā)明肽可以藉此方便地連接至載體的"連接子"。這種連接子通常至少為一個(gè)氨基酸殘基，并可以為40或更多個(gè)殘基，更常見為1至10個(gè)殘基。用于連接的典型氨基酸殘基是酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。本發(fā)明的肽可以與另一蛋白或多肽偶聯(lián)或共軛生成共軛物。這種共軛合具有超過單獨(dú)使用的肽的優(yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明的肽可以共軛至T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中涉及的抗原。不希望受任何理論或作用機(jī)理的束縛，用這種共軛物接種可以導(dǎo)致針對(duì)共軛抗原的T細(xì)胞活化降低，并從而誘導(dǎo)對(duì)所述疾病靶抗原的致耐受的免疫反應(yīng)。所述肽可以通過酰胺鍵直接共軛，被合成為二元配基肽，或通過本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的連接子基團(tuán)的方式連接。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的分離的融合肽和藥學(xué)上可接受的載體。用于實(shí)施本發(fā)明的藥物組合物通常包含本發(fā)明的肽，所述肽被配制成作為中和的藥學(xué)上可接受的鹽形式的所述藥物組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與多肽的游離氨基形成)，其使用無機(jī)酸形成，例如鹽酸或磷酸，或者使用有機(jī)酸形成，例如乙酸、草酸、酒石酸等。能夠與本發(fā)明肽形成鹽的適當(dāng)?shù)膲A包括但不限于無機(jī)堿，如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀等；和有機(jī)堿，如單烷基胺、二烷基胺和三烷基胺和芳基胺(例如，三乙胺、二異丙胺、甲胺、二曱胺等)，以及任選取代的乙醇胺類(例如乙醇胺、二乙醇胺等)。含有作為活性成分的肽或多肽的藥物組合物的制劑是本領(lǐng)域公知的。通常，這種組合物被制備成適用的液體溶液或懸浮液，但是，也可以被制備成固體形式，其可以在注射前被懸浮或溶解。所述制劑還可以被乳化。所述活性治療成分與無機(jī)和/或有機(jī)載體混合，所述載體是藥學(xué)上可接受的并可與所述活性成分相容。載體是藥學(xué)上可接受的賦形劑(運(yùn)載體)，含有或多或少的惰性物質(zhì)，在被添加至藥物組合物時(shí)賦予適當(dāng)?shù)囊恢滦曰虺尚蜑樗鼋M合物。適當(dāng)?shù)妮d體是例如水、鹽水、右旋糖、丙三醇、乙醇等或其組合形式。另外，如果需要，所述組合物可以含有小量輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑和pH緩沖劑，其提高所述活性成分的有效性。治療用途一方面，本發(fā)明提供了包含gp41融合肽結(jié)構(gòu)域(FP)的藥物組合物在有效預(yù)防或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中的用途。本發(fā)明的一個(gè)方面是一種治療自身免疫疾病的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含本發(fā)明的分離的融合肽或其活性片段的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是fflV-l。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共輒物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種治療自身免疫疾病的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽或其鹽的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種預(yù)防自身免疫疾病癥狀的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含本發(fā)明的分離的融合肽的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種預(yù)防自身免疫疾病癥狀的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽或其鹽的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。本發(fā)明的一個(gè)方面是一種治療T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含本發(fā)明的分離的融合肽的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片#殳、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種治療T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽或其鹽的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病癥狀的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含本發(fā)明的分離的融合肽的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDN0:1、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共輒物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病癥狀的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽或其鹽的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。本發(fā)明的一個(gè)方面是一種治療或預(yù)防移植物排斥或移植物抗宿主疾病的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含本發(fā)明的分離的融合肽的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種治療或預(yù)防移植物排斥或移植物抗宿主疾病的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽或其鹽的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。本發(fā)明的一個(gè)方面是一種抑制T細(xì)胞活化的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含本發(fā)明的分離的融合肽的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種抑制T細(xì)胞活化的方法，其中所述方法包括給需要所述治療的個(gè)體施用治療有效量的包含能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽或其鹽的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的融合肽在制備用于治療或預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述HIV是HIV-1。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。要注意，來源于表示為SEQIDNO:1、2和6-414的肽的較短的活性片段以及包含這些序列的較長的肽都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在另一方面，本發(fā)明涉及能夠抑制T細(xì)胞活化的式(I)的肽在制備用于治療或預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。在另一方面，所述藥物組合物可以通過多種方式遞送，所述方式包括靜脈、肌內(nèi)、輸注、口服、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、直腸、局部，或進(jìn)入其他部位，如進(jìn)入滑膜液。然而，還考慮到經(jīng)皮遞送所述組合物，如經(jīng)由透貼劑的擴(kuò)散。對(duì)于口服攝入，如本領(lǐng)域已知的，制備具有改善的口服生物利用度和提高的對(duì)降解的抵抗力的肽類似物或特定肽的制劑是可能的。以與所述劑量制劑相容的方式并以治療有效量施用所述組合物。施用的量取決于受治療的患者、所述患者血液止血系統(tǒng)利用所述活性成分的能力以及所需的對(duì)T細(xì)胞活化或T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的抑制程度。所需施用的活性成分的準(zhǔn)確量根據(jù)從業(yè)醫(yī)生的判斷并對(duì)每一個(gè)體是特有的。本發(fā)明的肽的治療有效量為當(dāng)被施用于患者時(shí)能夠抑制T細(xì)胞活化原特異性增殖的抑制，對(duì)細(xì)胞因子如IFN-y和IL-10的T細(xì)胞抗原特異性分泌的抑制，和對(duì)體內(nèi)疾病模型的抑制，所述疾病模型包括但不限于如實(shí)施例中所描述的佐劑關(guān)節(jié)炎和DTH。然而，用于檢測抗原特異性T細(xì)胞活化的其他方法是本領(lǐng)域公知的，并可以用于評(píng)定本發(fā)明的肽的活性。當(dāng)在體外測定或體內(nèi)測定中檢測時(shí)，優(yōu)選地，本發(fā)明的肽的治療有效量是減少(抑制)T細(xì)胞活化至少10%、更優(yōu)選至少50%、最優(yōu)選至少90%的量。優(yōu)選地，如本文進(jìn)一步描述的，藥物組合物可用于抑制患者的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。在該實(shí)施方案中，治療有效量是當(dāng)施用于患者時(shí)足以抑制、優(yōu)選根除T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的量。優(yōu)選的單劑量融合肽為每kg體重約5嗎至約50mg，優(yōu)選每kg體重約50嗎至約5mg，以及更優(yōu)選每kg體重約0.125mg至約2mg。通常，醫(yī)師將確定最適合個(gè)體患者的實(shí)際劑量，且所述劑量隨特定患者的年齡、體重和反應(yīng)而不同。當(dāng)然，可以有需要較高或較低劑量范圍的個(gè)別情況，且這種劑量在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的融合肽可每日或每周給予如上所述的單劑量來施用。根據(jù)本發(fā)明的治療疾病的方法可以包括施用作為單一活性劑的本發(fā)明的藥物組合物，或者與其他治療方法聯(lián)合施用。本發(fā)明的治療方法可以在其他治療方法的同時(shí)、之前或之后。提供下述實(shí)施例以更加全面地描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案。然而，這些實(shí)施方案絕非解釋為限制本發(fā)明的寬范圍。實(shí)施例肽的合成.如之前所述(Kliger等，1997，Merrifield等，1982),使用固相方法合成了用于本工作的肽(如下表1所示)。使用于0.05%TFA中的線性梯度的20-60%乙腈，通過反相HPLC純化所述合成肽60分鐘(>98%同質(zhì)性)。所述肽接受氨基酸分析和質(zhì)譜分析，以確定其組成。除非另有說明，濃縮肽的原溶液保存在DMSO中，以避免所述肽在^f吏用前聚集。各實(shí)驗(yàn)中DMSO的終濃度(5。/。v/v)對(duì)所考察的系統(tǒng)沒有影響。表l.肽的命名和序列<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>根據(jù)HIV-1HXB2菌抹gpl60序列指定起始和終止位置。以黑色字體表示FP的位置2上的纈氨酸至谷氨酸突變。以黑色字體和下劃線表示D氨基酸。gp41，HIV-1糖蛋白gp41。AMP，合成的兩親肽(Papo等，2002)。HSP60，人類60kDa熱激蛋白。HSP65,結(jié)核分支桿菌(Mfw6wcw/o^)65kDa熱激蛋白。Syn.,合成序列。肽的熒光標(biāo)記.分別使用4-氯-7-硝基苯-2-氧雜-l，3-二唑氟化物(NBD-F)或5-羧基四甲基玫瑰紅琥珀酰亞胺酯(5-TAMRA、SE(玫瑰紅-SE))處理樹脂結(jié)合的肽。NBD-F和玫瑰紅-SE焚光探針購自MolecularProbes(City,State,Country)。如之前所述的(Gerber和Shai,2000)，與NBD-F的反應(yīng)發(fā)生于DMF中，而與玫瑰紅的反應(yīng)發(fā)生于含有2%二異丙基乙胺的DMF中。以超過2當(dāng)量使用所述熒光探針，導(dǎo)致生成樹脂結(jié)合的N末端NBD或玫瑰紅肽。lh后，所述樹脂用DMF并然后用二氯甲烷充分洗滌。所述樹脂在氮流下干燥并然后用TFA(95%)、H20(2.5%)和三乙基硅烷(2.5%)裂解。使用梯度的20%-60%的乙腈/水(均含有0.05%的TFA),在C4Bio-Rad半制備柱(250x10mm,300A孔徑，5卞m顆粒大小)通過RP-HPLC(反相高效液相色譜)純化所述熒光標(biāo)記的肽60分鐘。分析型RP-HPLC表明所述純化的肽是同質(zhì)的(>98%)。細(xì)胞系、抗原和佐劑.CD4+T細(xì)胞克隆A2b21與結(jié)核分支桿菌(Mt)65kDa熱激蛋白的180-188表位反應(yīng)，所述表位包含在本文使用的肽Mtl76-卯中(vanEden等，1988)。Mt抹H37Ra和不完全弗式佐劑(IFA)購自Difco(Detroit,MI,USA)。結(jié)核菌素純4匕蛋白書亍生物(PPD)由StatensSeruminstitute(Copenhagen,Denmark)提供。純化的重組71kDa熱激蛋白(HSP71)由RuurdvanderZee教授(InstituteofInfectiousDiseasesandImmunology,FacultyofVeterinaryMedicine,Utrecht,TheNetherlands)慷慨提供。PMA、伊屋諾霉素、卵清蛋白(OVA)和刀豆球蛋白A(ConA)購自Sigma(Rehovot,Israel)。肽與膜分子的共區(qū)域化。A2b細(xì)胞用4%對(duì)曱醛在水上固定15分鐘，用PBS洗滌。然后在室溫下用溶于PBS的2%BSA處理所述細(xì)胞，以阻斷非特異性結(jié)合。30分鐘后，將所述細(xì)胞分成每lOOpl含有50,000細(xì)胞的部分，并添加aTCR-FITC或aCD4-FITC(l:100)2小時(shí)。在最后5分鐘的溫育過程中添加玫瑰紅標(biāo)記的FP或V2E肽，終濃度為0.5-1pM。然后所述細(xì)胞用PBS洗滌并置于載玻片上。熒光共焦顯微鏡下觀察所述標(biāo)記的細(xì)胞樣本。FITC激發(fā)光設(shè)為488nm,且激光設(shè)為20%功率，以最小化熒光基團(tuán)的漂白。記錄505-525nm的熒光。玫瑰紅激發(fā)光設(shè)為543nm,且激光設(shè)為5%功率。收集560nm及以上的熒光數(shù)據(jù)。通過玫瑰紅探針被漂白的斑點(diǎn)中FITC熒光的增加檢測了FITC(供體標(biāo)記)和玫瑰紅(受體標(biāo)記)之間的熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)。通過在543nm點(diǎn)激發(fā)光6秒鐘(激光設(shè)為100%)實(shí)現(xiàn)漂白。為證實(shí)FITC熒光的增加不是由于自發(fā)熒光，首先使用488nm激光并然后僅在543nm進(jìn)行漂白。在505-525nm或高于560nm都沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)，排除了自發(fā)熒光的可能性。T細(xì)胞增殖.使用淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)或A2bT細(xì)胞系進(jìn)行T細(xì)胞增殖測定，所述細(xì)胞系與Mtl76-90肽反應(yīng)。在注射于不完全弗式佐劑(IFA)中的Mt26天后，當(dāng)可檢測到針對(duì)PPD和Mtl76-90的強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，移出胭和腹股溝LNC(Quintana等，2002)。以2x105細(xì)胞/孔的濃度培養(yǎng)LNC;存在有如之前描述制備的經(jīng)輻射的5x1C)S胸腺抗原遞呈細(xì)胞(APC)/孔的情況下，刺激5x104A2bT細(xì)胞(vanEden等，1985)。所述細(xì)胞分四組置于200pl圓底微量滴定孔(CostarCorp.,Cambridge,USA),使用或不使用抗原，存在有各種濃度的所研究的肽。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)，如所述的(Wang等，2002),用固定的抗CD3抗體或PMA/伊屋諾霉素活化所述細(xì)胞。培養(yǎng)物在增濕的7.5%C02氣氛中37。C培養(yǎng)72hr。通過在最后18hr的培養(yǎng)過程中添加的[甲基-3H]-胸腺嘧啶(Amersham,Buckinghamshire,UK;1pCi/孔)的摻入檢測了T細(xì)胞反應(yīng)。T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示為在不存在HIV或?qū)φ针牡那闆r下由所述抗原引發(fā)的T細(xì)胞增殖的抑制％。細(xì)胞因子測定.如所述的，刺激72小時(shí)后收集上清液，使用Pharmingen的OPTEIA試劑盒(Pharmingen，SanDiego,USA)通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)對(duì)大鼠IL-10和IFNy進(jìn)行定量(Quintana等，2002)。當(dāng)子的抑制百分?jǐn)?shù)?；蛘?，所述細(xì)胞因子表示為pg/ml。對(duì)于IL-10和IFNY,本文所描述的實(shí)驗(yàn)的較低檢測限是15pg/ml。根據(jù)使用重組細(xì)胞因子作為標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線計(jì)算了細(xì)胞因子的量。動(dòng)物.在我們實(shí)驗(yàn)中使用了三個(gè)月大的雌性Lewis大鼠，所述大鼠于AnimalBreedingCenteroftheWeizmannInstituteofScience在無病原體條件下飼養(yǎng)并維護(hù)。所述實(shí)驗(yàn)在AnimalWelfareCommittee的監(jiān)督和指導(dǎo)下進(jìn)行。佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)的誘導(dǎo)和評(píng)價(jià).為測試FP對(duì)體內(nèi)T細(xì)胞活化的作用，使用AA作為模型系統(tǒng)。通過在尾的基部注射50^懸浮于IFA的Mt(0.5mg/ml)誘導(dǎo)AA。在AA誘導(dǎo)的時(shí)候，每只大鼠還接受溶解于50piIFA并與用以誘導(dǎo)AA的Mt/IFA混合的100略FP或?qū)φ针幕騊BS。AA誘導(dǎo)的當(dāng)天被指定為第0天。通過直接觀察每只動(dòng)物的所有4肢評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重度?；陉P(guān)節(jié)炎癥、發(fā)紅和畸形，為每肢分配0和4之間的相對(duì)分?jǐn)?shù)；因此，各只動(dòng)物的最大可能分?jǐn)?shù)是16(Quintana等，2002)。顯示了每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均AA分?jǐn)?shù)(士SEM)。還通過使用測徑儀測定后肢直徑對(duì)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行定量。在誘導(dǎo)AA的當(dāng)天和之后的26天后(處于AA的高峰)進(jìn)行測定；結(jié)果表示為每組中所有動(dòng)物的兩個(gè)值之間差異的平均值±SEM。為所述疾病評(píng)分的人不知道所述組的身份。遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH).在AA誘導(dǎo)后第16天，將20|il的PPD(0.5mg/ml,于PBS中)皮內(nèi)注射入右耳的耳廓；將20pl無菌PBS注射入左耳作為對(duì)照。48小時(shí)后使用游標(biāo)卡尺測定所述耳朵的厚度，并表示為所述右耳和所述左耳之間的差異。實(shí)施例1:FP與CD4和TCR在IS中共區(qū)域化使用與玫瑰紅(FP-Rho)或NBD(FP-NBD)共軛的FP研究了FP在活化的T細(xì)胞膜上的分布。FP-Rho(圖2A)和FP-NBD都自我插入特定的膜結(jié)構(gòu)域，而非均勻標(biāo)記所述T細(xì)胞膜。這一集中分布不同于在細(xì)胞膜上表現(xiàn)均勻分布的對(duì)照膜活性兩親肽(AMP-Rho)(圖2A)。在CD4+T細(xì)胞膜上，除了其他組分外，IS結(jié)構(gòu)域標(biāo)志為TCR、CD3和CD4分子(Huppa和Davis,2003)。圖2B顯示了CD4和TCR分子在IS膜結(jié)構(gòu)域上的區(qū)域化。注意與CD4和TCR分子共區(qū)域化的FP共軛物(圖2B)。FP-Rho(圖2B)和FP-NBD都顯示了相同的共區(qū)域化；因此，至IS的分布不限于特定的熒光團(tuán)。另外，玫瑰紅標(biāo)記的FP突變體，即V2E(V2E-Rho),顯示了相似的與CD4和TCR的共區(qū)域化(圖2C)。通過熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)確認(rèn)了FP及其V2E突變體與TCR和CD4受體的共區(qū)域化(圖2D)。使用543nm激光，漂白所述細(xì)胞膜上的斑點(diǎn)，從而減少了FP-Rho或V2E-Rho共扼物在特定斑點(diǎn)的焚光。由于標(biāo)記的、漂白的FP(受體)和TCR特異性的FITC共軛的抗體(供體)之間的FRET,觀察到標(biāo)記的TCR的熒光的顯著增加。FITC/Rho對(duì)的平均Ro低于50A(Heidecker等，1995)，因此，F(xiàn)RET(圖2D)的檢測表明所述供體和受體分子在所述膜中的距離必須小于50A。這些結(jié)果表明，F(xiàn)P結(jié)合至T細(xì)胞膜，并優(yōu)選與IS處的CD4和TCR分子緊密地共區(qū)域化。實(shí)施例2:FP體外干擾T細(xì)胞活化為確定FP插入IS是否干擾T細(xì)胞活化，研究了Mt固定化大鼠的LNC對(duì)Mt抗原PPD或?qū)tl76-卯肽的T細(xì)胞反應(yīng)；這些抗原已知在AA大鼠的引流LNC中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)和自T細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放(Quintana等，2003;Quintana等，2002)。圖3A和3B顯示，F(xiàn)P和V2E突變肽以劑量依賴性方式抑制了針對(duì)PPD和針對(duì)Mtl76-卯的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。另夕卜，V2E的抑制作用低于FP的抑制作用，表明所述抑制是序列特異性的且關(guān)鍵的分子相互作用被V2E中V至E的取代所擾亂(見表1)。FP肽和V2E(較小程度上)還以劑量依賴性方式抑制了IFNy和IL-10的分泌，所述分泌由j吏用PPD或Mtl76-90肽的刺激所引發(fā)(圖3C-F)。FP和V2E肽對(duì)抗原引發(fā)的增殖和細(xì)胞因子釋放的抑制作用不歸因于細(xì)胞死亡，因?yàn)橛肍P、V2E或?qū)φ针膒277培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出同樣的存活率。實(shí)施例3:FP作用于T細(xì)胞而非APC使用大鼠CD4+T細(xì)胞克隆A2b進(jìn)一步研究了FP對(duì)T細(xì)胞活化的抑制作用，A2b在經(jīng)Mtl76-90肽刺激后增殖并分泌IFN^Quintana等，2003;Quintana等，2002)。經(jīng)由Mtl76-90的A2b的活化在存在有FP時(shí)，導(dǎo)致減少的細(xì)胞增殖(圖4)和較少的IFNy幹放。為確定FP在抑制T細(xì)胞活化中所靶向的細(xì)胞，在所述細(xì)胞與Mtl76-90肽混合之前將A2bT細(xì)胞或APC分別用FP預(yù)培養(yǎng)。APC的預(yù)培養(yǎng)對(duì)A2b增殖沒有作用(圖4)。然而，A2bT細(xì)胞與FP而非與對(duì)照肽p277的預(yù)培養(yǎng)導(dǎo)致了T細(xì)胞增殖的顯著抑制(圖4)。因此，F(xiàn)P通過直接作用于T細(xì)胞而非作用于APC來抑制T細(xì)胞活化。實(shí)施例4:FP不抑制由PMA/伊屋諾霉素或抗CD3抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞活也為了解FP是否也能抑制與特定抗原的APC遞呈誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化不同的T細(xì)胞活化，測試了FP對(duì)PMA/伊屋諾霉素(其中白色直方圖表示接受0.5mg/ml伊屋諾霉素的細(xì)胞，黑色直方圖表示接受1mg/ml伊屋諾霉素的細(xì)胞)或促有絲分裂的抗CD3單克隆抗體所誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化的作用。FP沒有抑制由PMA/伊屋諾霉素(圖5A)或促有絲分裂的抗CD3(圖5B)所誘導(dǎo)的A2bT細(xì)胞活化。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)P特異性干擾由APC所遞呈的MHC-肽復(fù)合物的識(shí)別所誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化。實(shí)施例5:FP體內(nèi)抑制T細(xì)胞免疫性作為FP對(duì)體內(nèi)特異性T細(xì)胞活化的作用的測試，研究了FP對(duì)AA的作用。使用油中的Mt免疫Lewis大鼠引發(fā)了AA—由Mt特異性T細(xì)胞與自身抗原的交叉反應(yīng)所驅(qū)使的實(shí)驗(yàn)性自身免疫疾病(Holoshitz等，1984;Holoshitz等，1983)。Mtl76-90特異性T細(xì)胞在AA誘導(dǎo)后是可4全測的(Anderton等，1994);實(shí)際上，A2bT細(xì)胞克隆與軟骨交叉反應(yīng)并介導(dǎo)了AA(vanEden等，1985)。由于FP抑制了已接觸抗原的LNC和克隆A2b對(duì)PPD和Mtl76-90的體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)(圖3和4)，考察了FP對(duì)驅(qū)使AA的T細(xì)胞體內(nèi)活化的作用。在AA"^秀導(dǎo)時(shí)與所述抗原一起施用的FP導(dǎo)致同時(shí)在臨床評(píng)分(圖6A)和踝腫脹(圖6B)方面明顯較輕的關(guān)節(jié)炎。對(duì)照肽p277或V2E沒有抑制AA。對(duì)照治療大鼠的平均最高分為13.7±0.3，與之相比，F(xiàn)P治療大鼠的平均最高分為7.3士0.7(與對(duì)照組相比較，兩測試組均為p<0.05)。也可通過研究針對(duì)PPD的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)來體內(nèi)檢測介導(dǎo)AA的T細(xì)胞的活性(vanEden等，1985)。研究了使用肽FP、V2E或p277治療的大鼠中AA誘導(dǎo)之后16天針對(duì)PPD的DTH反應(yīng)。圖6C顯示，F(xiàn)P的施用導(dǎo)致針對(duì)PPD的DTH反應(yīng)下降35%,而用V2E或p277肽治療所引起的抑制分別為25%和10%。驅(qū)使AA的T細(xì)胞顯示為Thl表型；其在用Mt抗原活化后分泌相對(duì)大量的IFNy，所述抗原例如HSP71或Mtl76-90(Quintana等，2003;Quintana等，2002)。相比之下，各種治療對(duì)AA的控制通常伴隨降低的Thl反應(yīng)(Quintana等，2003;Quintana等，2002，Tanaka等，1999)。注意，來自FP治療大鼠(黑色直方圖)的LNC在用分支桿菌抗原HSP71或Mtl76-90(也稱為Mtl80)刺激后顯示了降低的IFNy分泌，而用V2E(灰色直方圖)或p277(白色直方圖)的治療僅輕微影響了IFNy分泌(圖6D)。綜上所述，這些結(jié)果表明，F(xiàn)P能夠體內(nèi)干擾由特異性抗原誘導(dǎo)的t細(xì)胞活化。這種干擾導(dǎo)致在針對(duì)Mt抗原的反應(yīng)中輕度的AA(圖6A和6B)、降低的DTH反應(yīng)性(圖6C)和較低的IFNy分泌(圉6D)。實(shí)施例6:FP體內(nèi)4中制T細(xì)月包對(duì)FP的免疫性在存在有Mt和IFA的情況下，用FP、對(duì)照肽(V2E或IFFA)或PBS注射大鼠。26天后，收集LNC并分別用FP、V2E、IFFA或PBS體外培養(yǎng)，并檢測其IFN-y分泌水平。如圖8中所能看到的，來自FP注射大鼠的LNC不能在體外由FP活化，因?yàn)槠銲FN-y分泌水平與非活化的LNC(用PBS培養(yǎng))的IFN-y分泌水平是相當(dāng)?shù)?。這些結(jié)果表明了FP的低免疫原性。然而，來自V2E注射大鼠的LNC表現(xiàn)出由V2E的中度體外活化(比FP的活化高約五倍)，來自IFFA肽注射大鼠的LNC在體外對(duì)IFFA是高度反應(yīng)性的(比FP高約10倍)，所述IFFA肽是FP的非對(duì)映體衍生物，其中摻入了四個(gè)D氨基酸殘基(SEQIDN0:6)。因此，F(xiàn)P的免疫抑制作用是序列和結(jié)構(gòu)特異性的。當(dāng)使用相應(yīng)于FP、V2E和IFFA的16個(gè)N末端氨基酸的肽重復(fù)該實(shí)驗(yàn)時(shí)，得到了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。IFFA肽中D氨基酸的摻入，在本文顯示出充分降低其免疫原性，不影響其抑制gp41介導(dǎo)的膜融合的能力(Gerber等,2004)。因此，本文首次公開的FP的免疫抑制作用不僅僅是其已知的融合能力的反映，而更是該肽具有的新發(fā)現(xiàn)的功能。實(shí)施例7:FP衍生片段和非對(duì)映異構(gòu)體肽體外干擾T細(xì)胞活化檢驗(yàn)了FP衍生肽FP5-13、FPm、FP5-13八6和IFFA(見表1)對(duì)抗原特異性T細(xì)胞增殖的作用。如上所述，使用胭和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)進(jìn)行T細(xì)胞增殖測定，LNC在不完全弗式佐劑(IFA)中Mt的注射后26天移出。在一些實(shí)驗(yàn)中，在各種濃度的所研究的肽存在的情況下，使用或不使用MOG35-55肽抗原(0.5嗎/ml,圖8A;0.25嗎/ml,圖8B-C)培養(yǎng)小鼠LNC。在其他實(shí)驗(yàn)中，在各種濃度的所研究的肽存在的情況下，使用或不使用PPD抗原(25嗎/m1,圖8D)培養(yǎng)大鼠LNC。T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表示為在缺乏HIV或?qū)φ针牡南掠伤隹乖l(fā)的T細(xì)胞增殖的抑制％。如圖8中能看到的，所有檢測肽以劑量依賴性方式抑制了T細(xì)胞增殖，其中相應(yīng)于FP的氨基酸5-13的片段及其非對(duì)映異構(gòu)體肽比相應(yīng)于FP的氨基酸1-8的片段更大程度地抑制了T細(xì)胞增殖。實(shí)施例8:FP衍生的非對(duì)映異構(gòu)體肽體內(nèi)抑制T細(xì)胞免疫性為進(jìn)一步考察FP衍生的非對(duì)映異構(gòu)體肽對(duì)體內(nèi)T細(xì)胞活化的作用，使用了AA和DTH才莫型。如上所述在大鼠中誘導(dǎo)了AA;在AA誘導(dǎo)時(shí)，每只大鼠還接受了溶解于50plIFA并與用以誘導(dǎo)AA的Mt/IFA混合的100嗎IFFA或PBS。疾病嚴(yán)重度如上所述進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖IO中可看到的，IFFA的施用導(dǎo)致了通過AA臨床評(píng)分所確定的較輕的關(guān)節(jié)炎。在其他實(shí)驗(yàn)中，檢測了在FP和IFFA存在的情況下針對(duì)噁唑酮的DTH反應(yīng)。局部應(yīng)用100微升溶解于丙酮/橄欖油(4:1體積/體積)的2%噁唑酮對(duì)雌性Balb/c小鼠(每組5只小鼠)刮毛的腹部皮膚致敏，5天后用20微升溶解于丙酮/橄欖油的0.5%噁唑酮攻擊，每側(cè)耳朵施用IO微升。刺激后1小時(shí)，每側(cè)耳朵施用FP、IFFA(100(ig于40(xlDMSO中)或DMSO。在攻擊前和攻擊后24h立即檢測耳朵的恒定部位(constantarea)。如圖11中可看到的，F(xiàn)P和IFFA都抑制了DTH反應(yīng)。上述對(duì)具體實(shí)施方案的描述將如此全面地揭示本發(fā)明的總體特征，以致于其他人可以通過應(yīng)用現(xiàn)有知識(shí)在不應(yīng)用不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)且不脫離本發(fā)明的一般概念的情況下容易地對(duì)這些具體實(shí)施方案的各種應(yīng)用進(jìn)行修改和/或改變，因此，這樣的改變或》務(wù)改應(yīng)該并意于包括在所7>開的實(shí)施方案的等同替代的意義和范圍內(nèi)。盡管結(jié)合其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但顯然，許多替代、修改和改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，意于包括所有這些落入所附權(quán)利要求書的精神和寬范圍內(nèi)的替代、》務(wù)改和改變。參考文獻(xiàn)1.Johnson,W.E.&Desrosiers,R.C.^"ww.iev.53,499-518(2002)。2.Rosenberg,E.S.等.5W露e278,1447-1450(1997)。3.Norris，PJ.&Rosenberg,E.S.顛s15Suppl2,16-21(2001)。4.Altfeld,M.&Rosenberg,E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其中所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述肽不包含超過一個(gè)絲氨酸殘基。19.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述T細(xì)胞疾病是自身免疫疾病。20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述自身免疫疾病選自多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性神經(jīng)炎、系統(tǒng)性紅斑狼癡、銀屑病、I型糖尿病、舍格倫氏疾病、曱狀腺疾病、重癥肌無力、肉樣瘤病、自身免疫眼色素層炎、炎性腸病(克隆氏結(jié)腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)和自身免疫性肝炎。21.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述T細(xì)胞疾病是炎性疾病。22.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述T細(xì)胞疾病選自移植物排斥和移纟直物抗宿主疾病。23.—種抑制T細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給具有相應(yīng)需要的個(gè)體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的分離的肽或其片段、類似物、變異體、共輒物、書t生物和鹽。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述HIV是HIV-1。25.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述融合肽具有如SEQIDNO:l、2和6-414或其片段、類似物、變異體、共軛物、衍生物和鹽中任一者所列的氨基酸序列。26.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。27.—種抑制T細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給具有相應(yīng)需要的個(gè)體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的能夠抑制T細(xì)胞活化的具有式(I)的肽或其鹽X「AAi畫AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8誦AA9畫X2(I)其中Xj代表N末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸序列的肽，或者可以不存在；AA!、AA2、AAe和AA9各自獨(dú)立代表丙氨酸或甘氨酸氨基酸殘基；AA3代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸氨基酸殘基；AA4、AA5、AA和AAs各自獨(dú)立代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸或絲氨酸氨基酸殘基，其中除了AA4、AA5、AA7和AAs中任意三個(gè)可以是亮氨酸氨基酸殘基之外，AA4、AA5、AA7和AAg中不超過兩個(gè)氨基酸殘基是相同的；X2代表C末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有纈氡酸-谷氨酰胺-丙氨酸序列的肽，或者可以不存在；且其中每個(gè)氨基酸可以是L或D型，且所述肽長度不超過30個(gè)氨基酸殘基。28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述融合肽同時(shí)包含D和L氨基酸。29.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述肽不包含超過一個(gè)絲氨酸殘基。30.—種能夠抑制T細(xì)胞活化的具有式(I)的肽X廣AA廣AA2-六A3-AA4-AA5國AA6-AA7畫AA8-AA9-X2(I)其中X,代表N末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸序列的肽，或者可以不存在；AApAA2、AA6和AA9各自獨(dú)立代表丙氨酸或甘氨酸氨基酸殘基；AA3代表苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸氨基酸殘基；AA4、AA5、AA7和AAs各自獨(dú)立代表笨丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸或絲氨酸氨基酸殘基，其中除了AA4、AA5、AA7和AAs中任意三個(gè)可以是亮氨酸氨基酸殘基之外，AA4、AA5、AA7和AA8中不超過兩個(gè)氨基酸殘基是相同的；乂2代表C末端保護(hù)基，為長度達(dá)約20個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，其中至少50%氨基酸殘基是疏水性的，且其中所述序列不包括具有纈氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸序列的肽，或者可以不存在；且其中每個(gè)氨基酸可以是L或D型，且所述肽長度不超過30個(gè)氨基酸殘基。31.權(quán)利要求30所述的肽，其中所述肽不包含超過一個(gè)絲氨酸殘基。32.權(quán)利要求30所述的肽，所述肽具有氨基酸序列GALFLGFLG(SEQIDNO:407)。33.權(quán)利要求30所述的肽，其中所述肽選自GAVFLGFLG(SEQIDNO:409)、GAMFLGFLG(SEQIDNO:410)、GAVLLGFLG(SEQIDNO:411)、GAFFLGFLG(SEQIDNO:412)、GAMIFGFLG(SEQIDNO:413)和GALLFGFLG(SEQIDNO:414)。34.權(quán)利要求30所述的肽，其中所述肽同時(shí)包含D和L氨基酸。35.權(quán)利要求34所述的肽，所述肽具有氨基酸序列G^LFLGFLG,其中在位置2加下劃線的氨基酸殘基是"D"異構(gòu)體構(gòu)型(SEQIDNO:408)。36.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求30所述的肽和藥學(xué)上可接受的栽體或稀釋劑。全文摘要本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療自身免疫疾病和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病和病癥的藥物組合物和方法，其包括有效量的作為活性成分的來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的肽或其片段、類似物、同系物和衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的來源于HIVgp41融合肽結(jié)構(gòu)域的新型肽。文檔編號(hào)A61K38/00GK101115498SQ200680002209公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年1月24日優(yōu)先權(quán)日2005年1月24日發(fā)明者伊潤·R·科恩,多倫·格柏,弗朗西斯科·J·昆塔納,耶切爾·沙伊申請(qǐng)人:耶達(dá)研究與發(fā)展有限公司