專利名稱：被覆微粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以下(1)～(27)。
(1)一種用被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的制備方法，其特征在于，包含如下工序，即 使含有可溶解被覆層成分的極性有機(jī)溶劑的液體，以芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度含有該極性有機(jī)溶劑，使該液體中分散該芯微粒及該被覆層成分的工序(工序A)，及 用該被覆層成分被覆該芯微粒的工序(工序B)。
(2)如上述(1)所述的制備方法，其特征在于，工序B是將工序A所得液體靜置或混合充分時(shí)間，使該被覆層成分被覆該芯微粒。
(3)如上述(1)或(2)所述的制備方法，其特征在于，工序A包含如下工序，即 配制含有溶解了該被覆層成分的極性有機(jī)溶劑的液體(液體A)的工序， 配制可與液體A混合、且該芯微粒分散、不含該極性有機(jī)溶劑或以比液體A低的比例含有該極性有機(jī)溶劑的液體(液體B)的工序，及 混合液體A和液體B，配制液體C的工序。
(4)如上述(1)或(2)所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包含 配制分散有該被覆層成分的液體(液體D)的工序， 配制可以與液體D混合、且分散有該芯微粒的液體(液體E)的工序、 及混合液體D和液體E，配制液體F的工序， 液體D及液體E中的至少一方為含有極性有機(jī)溶劑的液體。
(5)如上述(1)或(2)所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包含 配制分散了該被覆層成分的含有極性有機(jī)溶劑的液體(液體G)的工序，及 在液體G中分散該芯微粒的工序。
(6)如上述(1)或(2)所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包含 配制分散有該被覆層成分及該芯微粒的液體(液體H)的工序及 將可與液體H混合且含有極性有機(jī)溶劑的液體與液體H混合，配制液體I的工序。
(7)如上述(1)～(6)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述極性有機(jī)溶劑為選自醇、二醇及聚亞烷基二醇中的一種以上有機(jī)溶劑。
(8)如上述(1)～(7)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，在工序B中，含有極性有機(jī)溶劑的液體中的極性有機(jī)溶劑的濃度為1～80vol％。
(9)如上述(1)～(8)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述被覆層成分含有選自使被覆層為脂質(zhì)膜的脂質(zhì)及表面活性劑中的一種以上物質(zhì)。
(10)如上述(1)～(8)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述被覆層成分含有選自使被覆層為脂質(zhì)膜的脂質(zhì)及表面活性劑中的一種以上物質(zhì)，及選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑。
(11)如上述(1)～(10)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒含有選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑。
(12)如上述(10)或(11)所述的制備方法，其中，所述選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑選自聚乙二醇化脂質(zhì)、聚甘油化脂質(zhì)、聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇及甘油脂肪酸酯中的一種以上。
(13)如上述(1)～(12)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，在工序B之后，包含從含有極性有機(jī)溶劑的液體中除去極性有機(jī)溶劑或降低極性有機(jī)溶劑濃度的工序。
(14)如上述(1)～(13)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，芯微粒是以選自藥物、脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒(emulsionparticle)、高分子、金屬膠體及微粒制劑中的一種以上物質(zhì)作為構(gòu)成成分的微粒。
(15)如上述(1)～(13)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，芯微粒為以藥物為構(gòu)成成分的微粒。
(16)如上述(1)～(13)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，芯微粒是以藥物和選自脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑中的一種以上物質(zhì)的復(fù)合體作為構(gòu)成成分的微粒。
(17)如上述(16)所述的制備方法，其中，脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑是帶有與藥物相反的靜電電荷的物質(zhì)。
(18)如上述(1)～(13)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，芯微粒是以陰離子性藥物和含有陽(yáng)離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒。
(19)如上述(1)～(13)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，芯微粒是以陽(yáng)離子性藥物和含有陰離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒。
(20)如上述(17)～(19)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，芯微粒是還含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑(adhesion competitive agent)的微粒。
(21)如上述(14)～(20)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，藥物選自肽、蛋白質(zhì)、核酸、低分子化合物、糖類及高分子化合物中的一種以上。
(22)如上述(14)～(20)中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，藥物選自基因、DNA、RNA、寡核苷酸、質(zhì)粒及siRNA中的一種以上。
(23)一種試劑盒，該試劑盒用于通過(guò)上述(1)～(22)中任一項(xiàng)所述的制備方法制備被覆微粒，至少由芯微粒、被覆層成分及含有極性有機(jī)溶劑的液體構(gòu)成。
(24)一種被覆微粒，所述被覆微?？梢允褂蒙鲜?1)～(22)中任一項(xiàng)所述的制備方法進(jìn)行制備。
(25)一種腫瘤治療劑，含有可以使用上述(15)～(22)中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的被覆微粒，其中，藥物為抗腫瘤藥。
(26)一種炎癥治療劑，含有可以使用上述(15)～(22)中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的被覆微粒，其中，藥物為抗炎癥藥。
(27)一種向腫瘤或炎癥部位運(yùn)載藥物的含藥物載體，所述載體由可以使用上述(15)～(22)中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的被覆微粒構(gòu)成。
本發(fā)明提供用被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的簡(jiǎn)便的制備方法等。另外，本發(fā)明還提供高效地及/或堅(jiān)固地含有藥物的被覆微粒的制備方法等。



[圖1]表示將實(shí)施例4及比較例2所得各制劑給與大鼠后的血中動(dòng)態(tài)變化?！癖硎緦?shí)施例4、○表示比較例2所得制劑的給藥組。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的被覆微粒是至少由芯微粒和被覆層構(gòu)成的微粒，是構(gòu)成被覆層的被覆層成分被覆芯微粒的外側(cè)而形成的微粒。
本發(fā)明的芯微粒是以例如藥物、脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體、微粒制劑等為構(gòu)成成分的微粒，優(yōu)選舉出至少以藥物為構(gòu)成成分的微粒。另外，本發(fā)明的芯微粒可以以組合藥物、脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體、微粒制劑等中的2種以上得到的復(fù)合體作為構(gòu)成成分，也可以以藥物、脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體、微粒制劑等與其他化合物(例如糖、脂質(zhì)、無(wú)機(jī)化合物等)組合形成的復(fù)合體作為構(gòu)成成分，優(yōu)選以藥物和選自脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體、微粒制劑中的一種以上物質(zhì)形成的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒，更優(yōu)選以藥物和脂質(zhì)體的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒。
藥物包括在含有極性有機(jī)溶劑的液體中的溶劑中處于微粒形態(tài)的藥物、與構(gòu)成芯微粒的其他構(gòu)成成分形成復(fù)合體并在該溶劑中處于微粒形態(tài)的藥物等，例如可以舉出蛋白質(zhì)、肽、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物、脂質(zhì)性化合物、金屬化合物等中具有藥理學(xué)活性的物質(zhì)，優(yōu)選舉出核酸，更優(yōu)選舉出選自基因、DNA、RNA、寡核苷酸(ODN)、質(zhì)粒及siRNA中的一種以上物質(zhì)。
作為蛋白質(zhì)或肽，例如可以舉出緩激肽、血管緊張素、催產(chǎn)素、加壓素、促腎上腺皮質(zhì)激素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、縮膽囊素、β-內(nèi)啡肽、黑素細(xì)胞抑制因子、促黑素細(xì)胞激素、促胃液激素拮抗劑、神經(jīng)降壓素、促生長(zhǎng)素抑制素、二甲氧基馬錢子堿、環(huán)孢菌素、腦啡肽、運(yùn)鐵蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽、甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素、促性腺激素、黃體生成素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸酶、羧肽酶、谷氨酰胺酶、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、白細(xì)胞介素、干擾素、胞壁酰二肽、胸腺生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、胰蛋白酶抑制劑、溶菌酶、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胸腺素、特異抗體(例如，可以舉出抗EGF受體抗體等)等。
作為核酸，例如可以舉出反義寡核苷酸、有義寡核苷酸等ODN、基因、DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA等，該核酸包括核酸結(jié)構(gòu)中的磷酸部、酯部等含有的氧原子等被取代成例如硫原子等其他原子的衍生物。需要說(shuō)明的是，siRNA是短的雙鏈RNA。
作為低分子化合物，例如可以舉出ε-氨基己酸、鹽酸精氨酸、L-天冬氨酸鉀、凝血酸、硫酸博萊霉素、硫酸長(zhǎng)春新堿、頭孢唑啉鈉、頭孢噻吩鈉、胞二磷膽堿、阿糖胞苷、硫酸慶大霉素、鹽酸萬(wàn)古霉素、硫酸卡那霉素、硫酸阿米卡星等。
作為糖類，例如可以舉出硫酸軟骨素鈉、肝素鈉、葡聚糖熒光素等。
作為高分子化合物，例如可以舉出聚亞乙基磺酸鈉、二乙烯基醚-馬來(lái)酸酐共聚物(DIVEMA)、苯乙烯馬來(lái)酸酐共聚物-新制癌菌素交聯(lián)物(SMANCS)等。
作為脂質(zhì)性化合物，例如可以舉出維生素D、維生素E等。
作為金屬化合物，例如可以舉出順鉑等。
脂質(zhì)集合體或脂質(zhì)體例如可以由脂質(zhì)及/或表面活性劑等構(gòu)成，作為脂質(zhì)，可以為單純脂質(zhì)、復(fù)合脂質(zhì)或衍生脂質(zhì)中的任一種，例如可以舉出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘氨醇?jí)A(sphingoid)、固醇、陽(yáng)離子性脂質(zhì)等，優(yōu)選舉出磷脂、陽(yáng)離子性脂質(zhì)等。另外，作為脂質(zhì)，例如也可以舉出表面活性劑(與下述的表面活性劑的定義相同)、高分子(與下述的高分子的定義相同，具體而言為葡聚糖等)、聚氧乙烯衍生物(具體而言為聚乙二醇等)等脂質(zhì)衍生物，優(yōu)選舉出聚乙二醇化磷脂。作為表面活性劑，例如可以舉出非離子性表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑等。
作為磷脂，例如可以舉出卵磷脂(具體而言可以舉出大豆卵磷脂、卵黃卵磷脂(EPC)、二硬脂酰卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二油酰卵磷脂等)、磷脂酰乙醇胺(具體而言可以舉出二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等)、甘油磷脂(具體而言可以舉出磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂等)、鞘磷脂(sphingophospholipid)(具體而言可以舉出鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸乙醇胺神經(jīng)酰胺、磷酸甘油神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺磷酸甘油磷酸等)、甘油膦脂(glycerophosphono lipid)、鞘膦脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具體而言可以舉出卵黃卵磷脂、大豆卵磷脂等)、氫化磷脂(具體而言可以舉出氫化大豆卵磷脂等)等天然或合成的磷脂。
作為甘油糖脂，例如可以舉出磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosylglyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯等。
作為鞘糖脂，例如可以舉出半乳糖基腦苷脂、乳糖基腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂等。
作為鞘氨醇?jí)A，例如可以舉出sphingan、icosasphingan、鞘氨醇、上述物質(zhì)的衍生物等。作為衍生物，例如可以舉出sphingan、icosasphingan、鞘氨醇等的-NH2變?yōu)?NHCO(CH2)XCH3(式中、x表示0～18的整數(shù)，其中優(yōu)選6、12或18)的衍生物等。
作為固醇，例如可以舉出膽固醇、二氫膽固醇、羊毛固醇、β-谷固醇、菜油甾醇(campesterol)、豆固醇、菜子甾醇、麥角鈣化甾醇(ergocasterol)、巖藻甾醇、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)等。
作為陽(yáng)離子性脂質(zhì)等，例如可以舉出N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油酰丙基)]-N，N-二甲基胺(DODAP)、N-[1-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、三氟乙酸2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙胺鎓鹽(DOSPA，2，3-dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxyamido)ethyl]-N，N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoroacetate)、N-[1-(2，3-雙十四烷基氧基丙基)]-N，N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油基氧基丙基)]-N，N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(DORIE)等。
作為非離子表面活性劑，例如可以舉出聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(具體而言有聚山梨酸酯80等)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(具體而言有普魯洛尼克(Pluronic)F68等)、脫水山梨糖醇脂肪酸(具體而言有脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具體而言有聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇等)、甘油脂肪酸酯等。
作為陰離子表面活性劑，例如可以舉出酰肌氨酸、烷基硫酸鈉、烷基苯磺酸鹽、碳原子數(shù)為7～22的脂肪酸鈉等。具體而言可以舉出十二烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c等。
作為陽(yáng)離子表面活性劑，例如可以舉出烷基胺鹽、酰基胺鹽、季銨鹽、胺衍生物等。具體而言可以舉出苯扎氯銨、?；被一一符}、N-烷基聚烷基聚胺鹽、脂肪酸聚乙烯聚酰胺、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、烷基聚氧乙烯胺、N-烷基氨基丙基胺、脂肪酸三乙醇胺酯等。
作為兩性離子表面活性劑，例如可以舉出3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸等。
在脂質(zhì)體中，上述脂質(zhì)及表面活性劑可以單獨(dú)使用或組合使用，優(yōu)選組合使用。作為組合使用時(shí)的組合，例如可以舉出選自氫化大豆卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及膽固醇中的2種成分以上的組合，選自二硬脂酰卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及膽固醇中的2種成分以上的組合，EPC和DOTAP的組合，EPC、DOTAP及聚乙二醇化磷脂的組合，EPC、DOTAP、膽固醇及聚乙二醇化磷脂的組合等。
另外，脂質(zhì)體可以根據(jù)需要含有例如膽固醇等固醇等膜穩(wěn)定化劑，例如生育酚等抗氧化劑等。
作為脂質(zhì)集合體，例如可以舉出球狀膠束、球狀逆膠束、臘腸狀膠束、臘腸狀逆膠束、板狀膠束、板狀逆膠束、六角相I、六角相II及由2分子以上脂質(zhì)構(gòu)成的締合體等。
作為乳液微粒，例如可以舉出脂肪乳劑、由非離子性表面活性劑和大豆油構(gòu)成的乳劑、脂質(zhì)乳劑(lipid emulsion)、脂質(zhì)納米球(lipidnanosphere)等水包油型(O/W)乳液微?；蛩桶?W/O/W)乳液微粒等。
作為高分子，可以舉出例如白蛋白、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、硫酸葡聚糖、DNA等天然高分子，例如聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙基丙烯酰胺-丙烯酸吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修飾的樹(shù)枝狀高分子(dendrimer)、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、聚乙二醇化聚乳酸等合成高分子，及上述物質(zhì)的鹽等。
此處，高分子的鹽包含例如金屬鹽、銨鹽、酸加成鹽、有機(jī)胺加成鹽、氨基酸加成鹽等。作為金屬鹽，例如可以舉出鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽、鎂鹽、鈣鹽等堿土金屬鹽、鋁鹽、鋅鹽等；作為銨鹽例如可以舉出銨、四甲基銨等的鹽；作為酸加成鹽，例如可以舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無(wú)機(jī)酸鹽，及乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽等有機(jī)酸鹽；作為有機(jī)胺加成鹽，例如可以舉出嗎啉、哌啶等的加成鹽；作為氨基酸加成鹽，例如可以舉出甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸等的加成鹽。
作為金屬膠體，例如可以舉出含有金、銀、鉑、銅、銠、二氧化硅、鈣、鋁、鐵、銦、鎘、鋇、鉛等的金屬膠體。
作為微粒制劑，例如可以舉出微球(micro-sphere)、微囊、納米晶體(Nano-Crystal)、納米顆粒(Nano-partical)、高分子膠束等。
另外，本發(fā)明的芯微粒優(yōu)選含有選自例如糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑等。選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑可以作為芯微粒的構(gòu)成成分使用，也可以將其加入到芯微粒的構(gòu)成成分中進(jìn)行使用。
作為選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑，優(yōu)選舉出糖脂質(zhì)、或水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，較優(yōu)選舉出水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物。選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑優(yōu)選為具有2面性的物質(zhì)，即分子的一部分具有通過(guò)例如疏水性親和力、靜電相互作用等與芯微粒的其他構(gòu)成成分鍵合的性質(zhì)，其他部分具有通過(guò)例如親水性親和力、靜電相互作用等與制備芯微粒時(shí)的溶劑鍵合的性質(zhì)。
作為糖、肽或核酸的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，可以舉出例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等糖，例如來(lái)自酪蛋白的肽、來(lái)自蛋白的肽、來(lái)自大豆的肽、谷胱甘肽等肽，或者例如DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA、ODN等核酸，與例如上述芯微粒定義中舉出的脂質(zhì)、例如硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸鍵合得到的物質(zhì)等，更具體而言，作為糖的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出上述芯微粒的定義中舉出的甘油糖脂、鞘糖脂等糖脂等。
作為水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纖維素、葡聚糖、硫酸軟骨素、聚甘油、脫乙酰殼多糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚天冬氨酸酰胺(polyaspartate amide)、聚-L-賴氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖(pullulan)、甘油低聚物(oligoglycerol)等或上述物質(zhì)的衍生物，與例如上述芯微粒的定義中舉出的脂質(zhì)或例如硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸鍵合得到的衍生物等，較優(yōu)選舉出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，更優(yōu)選舉出聚乙二醇衍生物的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物。
作為聚乙二醇衍生物的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出聚乙二醇化脂質(zhì)(具體而言有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(更具體而言有1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG-DSPE)等)、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯氫化蓖麻油(CREMOPHOR EL)等)、聚乙二醇脫水山梨糖醇脂肪酸酯(具體而言有聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯等)、聚乙二醇脂肪酸酯等，更優(yōu)選聚乙二醇化脂質(zhì)。
作為聚甘油衍生物的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以舉出聚甘油化脂質(zhì)(具體而言，有聚甘油-磷脂酰乙醇胺等)、聚甘油脂肪酸酯類等，更優(yōu)選舉出聚甘油化脂質(zhì)。
作為表面活性劑，例如可以舉出上述芯微粒的定義中舉出的表面活性劑、聚乙二醇烷基醚等，優(yōu)選舉出聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚等。
芯微粒以藥物和選自脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑中的一種以上物質(zhì)的復(fù)合體為構(gòu)成成分時(shí)，該脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑較優(yōu)選帶有與藥物相反的靜電電荷的物質(zhì)。此處，所謂與藥物相反的靜電電荷包括與藥物分子內(nèi)的電荷、分子內(nèi)極化等產(chǎn)生靜電引力的電荷、表面極化等。為了使脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑帶有與藥物相反的靜電電荷，優(yōu)選使脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑含有帶有與藥物相反的靜電電荷的帶電物質(zhì)，較優(yōu)選使脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑含有帶有與藥物相反的靜電電荷的脂質(zhì)(上述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)或下述的陰離子性脂質(zhì))。
帶有與藥物相反的靜電電荷的脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體或微粒制劑中含有的帶電物質(zhì)分為呈陽(yáng)離子性的陽(yáng)離子性物質(zhì)和呈陰離子性的陰離子性物質(zhì)，也可以為同時(shí)帶有陽(yáng)離子性基團(tuán)和陰離子性基團(tuán)的兩性物質(zhì)，由于通過(guò)pH或與其他物質(zhì)鍵合等導(dǎo)致相對(duì)電負(fù)性發(fā)生變化，所以，根據(jù)情況不同可以分類成陽(yáng)離子性物質(zhì)或陰離子性物質(zhì)。上述的帶電物質(zhì)可以作為芯微粒的構(gòu)成成分進(jìn)行使用，也可以添加在芯微粒的構(gòu)成成分中進(jìn)行使用。
作為陽(yáng)離子性物質(zhì)，例如可以舉出芯微粒的定義中舉出的物質(zhì)中的陽(yáng)離子性物質(zhì)[具體而言，有陽(yáng)離子性脂質(zhì)(與上述定義相同)、陽(yáng)離子性固醇、陽(yáng)離子性表面活性劑(與上述定義相同)、陽(yáng)離子性高分子等]、能夠在等電點(diǎn)以下的pH值下形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或肽等。
作為陽(yáng)離子性固醇，例如可以舉出DC-Chol等。
作為陽(yáng)離子性高分子，例如可以舉出聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、Polyfect、脫乙酰殼多糖等。
作為能夠在等電點(diǎn)以下的pH值下形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或肽，只要是能夠在該物質(zhì)的等電點(diǎn)以下的pH值下形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或肽即可，沒(méi)有特殊的限制。例如可以舉出白蛋白、血清類粘蛋白、球蛋白、血纖維蛋白原、胃蛋白酶、核糖核酸酶T1等。
作為陰離子性物質(zhì)，例如可以舉出上述芯微粒的定義中舉出的物質(zhì)中的陰離子性物質(zhì)[具體而言，有陰離子性脂質(zhì)、陰離子性表面活性劑(與上述定義相同)、陰離子性高分子等]、能夠在等電點(diǎn)以上的pH值下形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或肽、核酸等。
作為陰離子性脂質(zhì)，例如可以舉出磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
作為陰離子性高分子，例如可以舉出聚天冬氨酸、苯乙烯馬來(lái)酸共聚物、異丙基丙烯酰胺-丙烯?；量┩橥簿畚铩⒕垡叶夹揎椀臉?shù)枝狀高分子、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸鈉、硫酸軟骨素、軟骨素硫酸鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素、葡聚糖熒光素陰離子等。
作為能夠在等電點(diǎn)以上的pH值下形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或肽，只要是能夠在該物質(zhì)的等電點(diǎn)以上的pH值下形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)或肽即可，沒(méi)有特殊的限制。例如，可以舉出白蛋白、血清類粘蛋白、球蛋白、血纖維蛋白原、組蛋白、魚(yú)精蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等。
作為陰離子性物質(zhì)的核酸，例如可以舉出DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA、ODN等，只要為無(wú)生理活性的物質(zhì)即可，可以為任意長(zhǎng)度、任意序列。
芯微粒以藥物和選自脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑中的一種以上物質(zhì)的復(fù)合體為構(gòu)成成分，并且脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑帶有與藥物相反的靜電電荷時(shí)，更優(yōu)選芯微粒含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑。
作為附著競(jìng)爭(zhēng)劑，例如可以舉出帶有與藥物相同的靜電電荷的物質(zhì)等，包括通過(guò)由分子內(nèi)的電荷、分子內(nèi)極化等產(chǎn)生的對(duì)陽(yáng)離子或陰離子的靜電引力，靜電地附著在作為芯微粒的構(gòu)成成分的脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑上的物質(zhì)，例如可以舉出脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽、高分子等。作為脂質(zhì)、表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽、高分子，例如可以舉出上述帶電物質(zhì)的定義中舉出的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、陰離子性脂質(zhì)、陽(yáng)離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、核酸、蛋白質(zhì)、肽、陽(yáng)離子性高分子、陰離子性高分子等，優(yōu)選舉出上述帶電物質(zhì)的定義中舉出的陽(yáng)離子性高分子、陰離子性高分子等，較優(yōu)選舉出選自硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸鈉、硫酸軟骨素、軟骨素硫酸鈉、透明質(zhì)酸、軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角質(zhì)素、葡聚糖熒光素陰離子(dexstrane fluorescein anionic)、聚-L-賴氨酸、聚乙烯亞胺、Polyfect、脫乙酰殼多糖等中的1種以上物質(zhì)。附著競(jìng)爭(zhēng)劑優(yōu)選靜電地附著在作為芯微粒的構(gòu)成成分的脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑上，優(yōu)選具有一定尺寸的物質(zhì)，該物質(zhì)即使附著在作為芯微粒的構(gòu)成成分的脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑上也不形成使作為芯微粒的構(gòu)成成分的脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑凝集的交聯(lián)，或者優(yōu)選分子內(nèi)具有以下部分的物質(zhì)，即與脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑附著的部分、和排斥附著、抑制該脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑凝集的部分。
本發(fā)明的芯微?？梢圆捎霉闹苽浞椒ɑ蛞云錇榛鶞?zhǔn)進(jìn)行制備，可以是使用任意制備方法制備得到的芯微粒。例如，芯微粒之一的以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的芯微粒的制備可以采用公知的脂質(zhì)體的制備方法。作為公知的脂質(zhì)體的制備方法，例如可以舉出Bangham等的脂質(zhì)體制備方法[參見(jiàn)“分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)”，1965年，第13卷，p.238-252]、乙醇注入法[參見(jiàn)“細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.CellBiol.)”，1975年，第66卷，p.621-634]、法式壓濾(french press)法[參見(jiàn)″FEBS Lett.”，1979年，第99卷，p.210-214]、冷凍融解法[參見(jiàn)“生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Arch.Biochem.Biophys.)”，1981年，第212卷，p.186-194]、逆相蒸發(fā)法[參見(jiàn)“美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”，1978年，第75卷，p.4194-4198]，pH梯度法(參見(jiàn)例如專利第2572554號(hào)公報(bào)，專利第2659136號(hào)公報(bào)等)等。作為制備脂質(zhì)體時(shí)使脂質(zhì)體分散的溶液，例如可以使用水、酸、堿、各種緩沖液、生理食鹽液、氨基酸輸液等。另外，制備脂質(zhì)體時(shí)，也可以添加例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧化劑，例如甘油、葡萄糖、氯化鈉等等滲化劑等。另外，也可以通過(guò)下述方法制備脂質(zhì)體，即，將脂質(zhì)等溶解于例如乙醇等有機(jī)溶劑中，蒸餾除去溶劑后，添加生理鹽水等，振動(dòng)攪拌，形成脂質(zhì)體。
另外，也可以任意地通過(guò)例如非離子表面活性劑(與上述定義相同)、陽(yáng)離子表面活性劑(與上述定義相同)、陰離子表面活性劑(與上述定義相同)、高分子、聚氧乙烯衍生物等進(jìn)行脂質(zhì)體表面改質(zhì)，上述表面改質(zhì)脂質(zhì)體也可以用作本發(fā)明的芯微粒的構(gòu)成成分[參見(jiàn)D.D.Lasic、F.Martin編，″Stealth Liposomes”(美國(guó))，CRC Press Inc，1995年，p.93-102]。作為高分子，例如可以舉出葡聚糖、茁霉多糖、甘露聚糖、支鏈淀粉(amylopectin)、羥乙基淀粉等。作為聚氧乙烯衍生物，例如可以舉出聚山梨酸酯80、普魯洛尼克F68、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇、PEG-DSPE等。脂質(zhì)體表面改質(zhì)也可以用作使芯微粒含有選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑的一種方法。
脂質(zhì)體的平均粒徑可以根據(jù)需要自由地選擇。作為調(diào)節(jié)平均粒徑的方法，例如可以舉出擠壓延伸(extrusion)法、機(jī)械式粉碎(具體而言，使用蒙頓膠體磨、超微粒分散乳化機(jī)等)較大的多層脂質(zhì)體(MLV)的方法[參見(jiàn)R.H.Muller、S.Benita、B.Behm編著，“Emulsioinand Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs”，德國(guó)斯圖加特，Scientific Publishers，1998年，p.267-294]等。
另外，將選自構(gòu)成芯微粒的例如藥物、脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體、微粒制劑等中的2種以上物質(zhì)組合得到的復(fù)合體(具體而言，例如可以舉出含有陽(yáng)離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體或脂質(zhì)集合體和核酸的復(fù)合體、含有聚-L-賴氨酸等陽(yáng)離子性高分子的高分子和核酸的復(fù)合體、含有磷脂酸等陰離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體或脂質(zhì)集合體和蛋白質(zhì)的復(fù)合體、含有苯乙烯馬來(lái)酸等陰離子性高分子的高分子和蛋白質(zhì)的復(fù)合體、含有陽(yáng)離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體或脂質(zhì)集合體和蛋白質(zhì)的復(fù)合體、含有聚-L-賴氨酸等陽(yáng)離子性高分子的高分子和蛋白質(zhì)的復(fù)合體等)的制備方法，例如也可以只是在水中混合藥物和脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、高分子等的制備方法，此時(shí)，根據(jù)需要也可以進(jìn)一步加入整粒工序或無(wú)菌化工序等。另外，也可以在例如丙酮、乙醚等各種溶劑中進(jìn)行復(fù)合體的形成。例如，也可以在乙醇等有機(jī)溶劑中溶解核酸和脂質(zhì)，蒸餾除去溶劑后，加入生理鹽水等，振動(dòng)攪拌，形成核酸復(fù)合體。
本發(fā)明的芯微粒的大小優(yōu)選平均粒徑為數(shù)nm～數(shù)百μm，較優(yōu)選為10nm～5μm，更優(yōu)選為30nm～300nm，最優(yōu)選為50nm～200nm。
本發(fā)明的被覆層成分可以通過(guò)調(diào)整本發(fā)明中使用的極性有機(jī)溶劑的濃度而分散在含有該有機(jī)溶劑的液體中，作為該被覆層成分，例如可以舉出上述芯微粒的定義中舉出的脂質(zhì)、表面活性劑、高分子等，優(yōu)選舉出選自上述芯微粒的定義中舉出的脂質(zhì)及表面活性劑中的一種以上物質(zhì)，較優(yōu)選舉出選自使被覆層為脂質(zhì)膜的脂質(zhì)及表面活性劑中的一種以上物質(zhì)，更優(yōu)選舉出脂質(zhì)、表面活性劑中的中性脂質(zhì)。此處，所謂中性脂質(zhì)是指上述芯微粒的定義中舉出的脂質(zhì)及表面活性劑中的上述陽(yáng)離子性脂質(zhì)、陽(yáng)離子性表面活性劑、陰離子性脂質(zhì)及陰離子性表面活性劑以外的物質(zhì)，作為中性脂質(zhì)，優(yōu)選磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂等，更優(yōu)選磷脂，最優(yōu)選EPC。
本發(fā)明的芯微粒和被覆層成分的組合沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選芯微粒是以藥物和脂質(zhì)體的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒，被覆層成分為脂質(zhì)及/或表面活性劑的組合。芯微粒是以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒、被覆層成分為脂質(zhì)及/或表面活性劑、被覆層為脂質(zhì)膜的被覆微粒，從其構(gòu)成來(lái)看分類為狹義的脂質(zhì)體，微粒是以脂質(zhì)體為構(gòu)成成分的微粒之外的微粒、被覆層成分為脂質(zhì)及/或表面活性劑、被覆層為脂質(zhì)膜的被覆微粒，屬于廣義的脂質(zhì)體。本發(fā)明中較優(yōu)選芯微粒的構(gòu)成成分和被覆微粒都為脂質(zhì)體。
另外，該被覆層成分優(yōu)選在分子內(nèi)具有與本發(fā)明中使用的極性有機(jī)溶劑具有親和性的疏水性部分，通過(guò)此疏水性部分可以溶于該極性有機(jī)溶劑中，更優(yōu)選分子內(nèi)也具有親水性部分。另外，在工序A中優(yōu)選被覆層成分形成凝集體或膠束形態(tài)，大小優(yōu)選為0.1～1000nm、較優(yōu)選為0.3～500nm。該凝集體或膠束形態(tài)的大小可以通過(guò)是否能通過(guò)具有所期望大小的孔的膜濾器進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明中，所謂被覆層成分相對(duì)于極性有機(jī)溶劑可溶，包括如下幾種情況，即，被覆層成分具有溶解于極性有機(jī)溶劑的性質(zhì)的情況，通過(guò)使用可溶化劑等使被覆層成分具有溶解于極性有機(jī)溶劑中的性質(zhì)的情況，被覆層成分具有能夠在極性有機(jī)溶劑中形成凝集體或膠束等而乳濁或乳劑化的性質(zhì)的情況等，優(yōu)選被覆層成分具有溶解于極性有機(jī)溶劑中的性質(zhì)的情況。
另外，作為被覆層為脂質(zhì)膜時(shí)使用的脂質(zhì)，例如也可以舉出合成脂質(zhì)等。作為合成脂質(zhì)，例如可以舉出氟化卵磷脂、氟化表面活性劑、溴化二烷基銨等，上述物質(zhì)可以單獨(dú)使用，也可以與其他脂質(zhì)等組合使用。另外，被覆層為脂質(zhì)膜時(shí)，被覆層成分優(yōu)選含有水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪族烴衍生物、或者選自上述的糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物或表面活性劑，較優(yōu)選含有上述水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，更優(yōu)選含有上述聚乙二醇化磷脂，最優(yōu)選含有聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺。
作為本發(fā)明中的水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪族烴衍生物，例如可以舉出選自上述糖、蛋白質(zhì)及肽、核酸及水溶性高分子中的1種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，或者選自糖、蛋白質(zhì)及肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂肪族烴衍生物，優(yōu)選舉出糖脂質(zhì)、或水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物，較優(yōu)選舉出水溶性高分子的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物。
作為水溶性物質(zhì)的脂肪族烴衍生物，可以舉出水溶性物質(zhì)與例如長(zhǎng)鏈脂肪族醇、聚氧丙烯烷烴、甘油脂肪酸酯的醇性殘基等鍵合形成的衍生物。
作為糖、肽或核酸的脂肪族烴衍生物，可以舉出例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等糖，例如來(lái)自酪蛋白的肽、來(lái)自蛋白的肽、來(lái)自大豆的肽、谷胱甘肽等肽，或者例如DNA、RNA、質(zhì)粒、siRNA、ODN等核酸的脂肪族烴衍生物。
作為水溶性高分子的脂肪族烴衍生物，例如可以舉出聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纖維素、葡聚糖、硫酸軟骨素、聚甘油、脫乙酰殼多糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚天冬氨酸酰胺、聚-L-賴氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、甘油低聚物等或上述物質(zhì)的衍生物的脂肪族烴衍生物，較優(yōu)選聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂肪族烴衍生物，更優(yōu)選聚乙二醇衍生物的脂肪族烴衍生物。
本發(fā)明的被覆微?？梢圆捎孟率鲋苽浞椒ǖ冗M(jìn)行制備，例如特征在于包含下述工序的制備方法，即、使含有被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑的液體，以芯微粒不溶解、被覆層成分可以分散狀態(tài)存在的濃度含有該極性有機(jī)溶劑，使該芯微粒及該被覆層成分分散在該液體中的工序(工序A)，及用該被覆層成分被覆該芯微粒的工序(工序B)；或包含下述工序的制備方法，即、降低含有例如芯微粒分散且被覆層成分溶解的極性有機(jī)溶劑的液體中極性有機(jī)溶劑的濃度，至被覆層成分析出、分散，使芯微粒和被覆層成分分散在含有極性有機(jī)溶劑的液體中的工序，將所得芯微粒及被覆層成分的分散液靜置或混合充分的時(shí)間使被覆層成分被覆芯微粒的工序；通過(guò)上述制備方法，以分散液狀態(tài)得到被覆微粒。本發(fā)明的制備方法的特征在于，在工序A所得芯微粒及被覆層成分的分散液中含有被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑，該工序所得液體中的極性有機(jī)溶劑的濃度為能使芯微粒不溶解、被覆層成分的至少一部分不溶解而以分散狀態(tài)存在的濃度，在此濃度下該被覆層成分被覆芯微粒，工序B在工序A之后進(jìn)行或者將工序B包含在工序A之中。所謂芯微粒分散，是指芯微粒懸濁、乳濁或乳劑化的狀態(tài)，優(yōu)選懸濁的狀態(tài)，也包含芯微粒的大部分分散、剩余部分溶解的狀態(tài)或一部分沉淀的狀態(tài)，優(yōu)選芯微粒盡可能全部分散。另外，所謂被覆層成分分散是指被覆層成分形成凝集體或膠束等而懸濁、乳濁或乳劑化的狀態(tài)，優(yōu)選乳濁或乳劑化的狀態(tài)，包括被覆層成分的大部分形成凝集體或膠束等而乳濁或乳劑化，剩余部分溶解的狀態(tài)；被覆層成分的大部分形成凝集體或膠束等而懸濁、乳濁或乳劑化，優(yōu)選乳濁或乳劑化，剩余部分沉淀的狀態(tài)等。極性有機(jī)溶劑為所用被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑，工序A所得的分散液中該極性有機(jī)溶劑的濃度只要為可使芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度即可，分散液的配制方法可以采取任意方案。例如可以舉出下述配制方法，即、降低含有芯微粒分散、被覆層成分溶解的極性有機(jī)溶劑的液體中極性有機(jī)溶劑的濃度，至被覆層成分析出分散，使芯微粒和被覆層成分分散在含有極性有機(jī)溶劑的液體中時(shí)，將被覆層成分溶解于含有極性有機(jī)溶劑的液體中，另一方面，使芯微粒分散在不含極性有機(jī)溶劑或以芯微粒不溶解的濃度含有極性有機(jī)溶劑的液體中，將兩液體混合，配制含有芯微粒分散且被覆層成分溶解的極性有機(jī)溶劑的液體，降低該液體中極性有機(jī)溶劑的濃度至被覆層成分析出、分散，使芯微粒和被覆層成分分散在含有極性有機(jī)溶劑的液體中的配制方法等。
另外，工序B優(yōu)選為將工序A所得液體靜置或混合充分的時(shí)間，使該被覆層成分被覆該芯微粒的工序，靜置或混合的時(shí)間只要在使芯微粒及被覆層成分分散在含有極性有機(jī)溶劑的液體中之后不立即終止即可，沒(méi)有限制，可以根據(jù)被覆層成分或含有極性有機(jī)溶劑的液體的種類任意地設(shè)定，優(yōu)選設(shè)定的時(shí)間為所得被覆微粒的收率為一定值的時(shí)間，例如3秒～30分鐘。
另外，工序A可以包含配制含有溶解了被覆層成分的極性有機(jī)溶劑的液體(液體A)的工序、配制可與液體A混合且芯微粒分散、不含極性有機(jī)溶劑或以比液體A低的比例含有極性有機(jī)溶劑的液體(液體B)的工序、及將液體A和液體B混合配制液體C的工序。只要混合后的液體C中的極性有機(jī)溶劑的濃度為能夠使芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度即可，液體A及液體B的供給方法可以采取任意方案，優(yōu)選包含將液體A及液體B靜置或混合充分時(shí)間至被覆層成分被覆芯微粒的工序，靜置或混合的時(shí)間與上述相同。
另外，工序A可以包含配制分散了被覆層成分的液體(液體D)的工序、配制可與液體D混合且芯微粒分散的液體(液體E)的工序，及混合液體D和液體E配制液體F的工序。只要液體D及液體E中的至少一方是含有極性有機(jī)溶劑的液體，極性有機(jī)溶劑是被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑，液體F中的極性有機(jī)溶劑的濃度是可使芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度即可，液體D及液體E的供給方法可以采用任意方案，優(yōu)選包含靜置或混合充分時(shí)間至被覆層被覆芯微粒的工序，靜置或混合的時(shí)間與上述相同。
另外，工序A也可以包括配制含有被覆層成分分散的極性有機(jī)溶劑的液體(液體G)的工序及使芯微粒分散于液體G的工序。只要液體G是含有極性有機(jī)溶劑的液體，極性有機(jī)溶劑是被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑，液體G中的極性有機(jī)溶劑的濃度可使芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度即可，其供給方法可以采用任意方案，優(yōu)選包含靜置或混合充分時(shí)間至被覆層被覆芯微粒的工序，靜置或混合的時(shí)間與上述相同。
另外，工序A包括配制被覆層成分及芯微粒分散的液體(液體H)的工序、將可與液體H混合且含有極性有機(jī)溶劑的液體與液體H混合配制液體I的工序。液體H可以為使芯微粒及被覆層成分分別分散于極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中，將兩分散液混合而得到的液體，也可以是使芯微?；虮桓矊映煞种械娜我粋€(gè)分散在極性有機(jī)溶劑之外的溶劑中，向此分散液中加入固體狀態(tài)的芯微?；虮桓矊映煞种械牧硪怀煞郑蛊浞稚⒍玫降囊后w。需要說(shuō)明的是，極性有機(jī)溶劑是被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑，液體I中的極性有機(jī)溶劑的濃度只要是可使芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度即可，其供給方法可以采用任意方案，優(yōu)選包含靜置或混合充分時(shí)間至被覆層被覆芯微粒的工序，靜置或混合的時(shí)間與上述相同。
作為本發(fā)明中使用的極性有機(jī)溶劑，例如可以舉出甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇等醇，甘油、乙二醇、丙二醇等二醇，聚乙二醇、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯或醚等聚亞烷基二醇等，優(yōu)選乙醇。作為極性有機(jī)溶劑之外的溶劑，例如可以舉出水、液體二氧化碳、液體烴、鹵化碳、鹵化烴等，優(yōu)選水。需要說(shuō)明的是，工序A所得液體可以含有緩沖成分等。
極性有機(jī)溶劑和極性有機(jī)溶劑之外的溶劑的組合，優(yōu)選可以相互混合的組合，根據(jù)相對(duì)于各工序中含有極性有機(jī)溶劑的液體中的溶劑，上述芯微粒的溶解度、上述被覆層成分的溶解度等進(jìn)行選擇。另一方面，對(duì)于芯微粒，優(yōu)選相對(duì)于各工序中含有極性有機(jī)溶劑的液體中的任意溶劑，溶解度均低，另外優(yōu)選相對(duì)于所用極性有機(jī)溶劑及所用極性有機(jī)溶劑之外的溶劑，溶解度也低，對(duì)于被覆層成分，優(yōu)選相對(duì)于所用極性有機(jī)溶劑的溶解度高，優(yōu)選相對(duì)于所用極性有機(jī)溶劑之外的溶劑的溶解度低。
另外，芯微粒溶解于所用極性有機(jī)溶劑時(shí)，優(yōu)選其溶解度比被覆層成分的溶解度低。此處，所謂芯微粒的溶解度低，是指芯微粒的各構(gòu)成成分在溶劑中的溶出性小，即使各構(gòu)成成分各自的溶解度高，只要通過(guò)各構(gòu)成成分間的鍵合等使得各構(gòu)成成分的溶出性變小即可。
工序A所得液體的極性有機(jī)溶劑的比例只要滿足本發(fā)明的芯微粒和被覆層成分都分散的條件即可，沒(méi)有特殊的限定，根據(jù)所用溶劑或芯微粒、被覆層成分的種類等的不同而不同，工序A所得液體中的極性有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為1～80vol％，較優(yōu)選為10～60vol％，更優(yōu)選為20～50vol％，最優(yōu)選為30～40vol％。
另外，在工序A所得的液體中，優(yōu)選于分散液的溶劑中被覆層成分和芯微粒表面之間產(chǎn)生親水性相互作用的引力，所以，優(yōu)選芯微粒表面和被覆層成分具有親水性部分。
作為各工序中的混合或分散的方法，沒(méi)有特殊的限定，例如可以舉出通過(guò)連續(xù)式反應(yīng)器(in-line mixer)、靜態(tài)混合器、螺旋槳混合器、轉(zhuǎn)子/定子混合器、渦輪混合器、鋸齒刀、膠體磨、高壓均化器等混合或分散，優(yōu)選通過(guò)連續(xù)式反應(yīng)器(in-line mixer)、靜態(tài)混合器、螺旋槳混合器、轉(zhuǎn)子/定子混合器或渦輪混合器混合或分散。
作為被覆層為脂質(zhì)膜的本發(fā)明的被覆微粒的優(yōu)選制備方法，例如可以舉出以下方法。
(工序1)在含有極性有機(jī)溶劑的水溶液或極性有機(jī)溶劑中溶解或分散構(gòu)成脂質(zhì)膜的脂質(zhì)及/或表面活性劑(構(gòu)成脂質(zhì)膜的成分)。此時(shí)，還可以加入選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑(例如，聚乙二醇修飾的脂質(zhì)衍生物等)，此處添加的選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑的量沒(méi)有特殊的限制。
(工序2)使芯微粒分散(懸濁)在水溶液中。
(工序3)混合工序1所得液體和工序2所得液體。
不論所用的芯微粒的種類或所用被覆層成分的種類，基本上都可以采用與上述相同的方法制備本發(fā)明的被覆微粒。
在本發(fā)明的被覆微粒的制備方法中，工序A所得液體中的芯微粒的濃度只要能夠用被覆層成分被覆芯微粒即可，沒(méi)有特別的限制，優(yōu)選為1μg/mL～1g/mL，較優(yōu)選為0.1～500mg/mL。另外，工序A所得液體中的被覆層成分(例如脂質(zhì)等)的濃度，只要能夠被覆芯微粒即可，沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選為1μg/mL～1g/mL，較優(yōu)選為0.1～400mg/mL。在通過(guò)本發(fā)明的被覆微粒的制備方法所得的被覆微粒中，相對(duì)于芯微粒的被覆層成分的比例，以重量比計(jì)，優(yōu)選為1∶0.1～1∶1000，較優(yōu)選為1∶1～1∶10。
另外，通過(guò)本發(fā)明的被覆微粒的制備方法所得的被覆微粒的大小，優(yōu)選平均粒徑為300nm以下，較優(yōu)選為200nm以下，更優(yōu)選為130nm以下，最優(yōu)選為115nm以下，例如優(yōu)選為能夠注射的大小。為了增加所得被覆微粒的大小，可以增大被覆的芯微粒的大小，相反為了減小所得被覆微粒的大小，可以減小被覆的芯微粒的大小。
并且，對(duì)上述所得的被覆微粒也可以通過(guò)抗體等蛋白質(zhì)、糖類、糖脂質(zhì)、氨基酸、核酸、各種低分子化合物、高分子化合物等物質(zhì)進(jìn)行修飾，本發(fā)明的被覆微粒也包括上述所得的被覆微粒。另外，例如為了用于靶向，也可以對(duì)上述所得的被覆微粒通過(guò)抗體等蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸類等進(jìn)行脂質(zhì)膜表面修飾[參見(jiàn)D.D.Lasic、F.Martin編，“Stealth Liposomes”(美國(guó))，CRC Press Inc，1995年，p.93-102.]，另外，也可以與作為微粒構(gòu)成成分的脂質(zhì)體相同地通過(guò)例如非離子表面活性劑(與上述定義相同)、陽(yáng)離子表面活性劑(與上述定義相同)、陰離子表面活性劑(與上述定義相同)、高分子(與上述定義相同)、聚氧乙烯衍生物(與上述定義相同)等任意地進(jìn)行表面改質(zhì)，本發(fā)明的被覆微粒包括上述脂質(zhì)膜表面修飾或表面改質(zhì)的微粒。另外，也可以相同地通過(guò)例如水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪族烴衍生物、或選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑等進(jìn)行表面改質(zhì)，上述表面改質(zhì)所用的水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪族烴衍生物、或選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑與上述作為脂質(zhì)膜構(gòu)成成分的水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪族烴衍生物的定義相同，或者與上述芯微粒的定義中的用于使芯微粒的一部分或全部含有親水性部分的選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑的定義相同，包括在脂質(zhì)膜的構(gòu)成成分中。
使用本發(fā)明的制備方法制備的被覆微粒，可以作為制劑使用，用于例如血液成分等生物體成分(例如血液、消化液等)中藥物的穩(wěn)定化、降低副作用、增大藥物向腫瘤等靶臟器的集聚性，改善經(jīng)口或經(jīng)粘膜的藥物吸收等。
芯微粒的構(gòu)成成分的至少一個(gè)是例如抗腫瘤藥、抗炎藥等藥物時(shí)，使用本發(fā)明的制備方法制備的被覆微粒可用作向腫瘤或炎癥部位運(yùn)送該藥物的含藥載體，通過(guò)給與該被覆微粒，可以向腫瘤或炎癥部位輸送該藥物，該藥物為抗腫瘤藥時(shí)，例如通過(guò)給與該被覆微粒作為腫瘤治療劑，可以進(jìn)行腫瘤治療，另外該藥物為抗炎藥時(shí)，例如可以通過(guò)給與該被覆微粒作為炎癥治療劑，進(jìn)行炎癥的治療。另外，血管新生亢進(jìn)的組織或臟器是使用本發(fā)明的制備方法制備的被覆微?？梢粤己盟瓦_(dá)的部位之一，該修飾微粒的構(gòu)成成分中的至少一個(gè)是該組織或臟器的疾病的治療劑時(shí)，通過(guò)給與該微粒作為該疾病的治療藥，可以進(jìn)行該疾病的治療。
本發(fā)明的被覆微粒作為制劑使用時(shí)，通過(guò)上述方法配制的被覆微粒的分散液也可以直接用作例如注射劑等，也可以通過(guò)加入下述溶劑，該溶劑含有可與該分散液中含有的極性有機(jī)溶劑混合的極性有機(jī)溶劑之外的溶劑，及/或通過(guò)蒸餾除去、半透膜分離、分餾等，選擇性地除去該極性有機(jī)溶劑，使極性有機(jī)溶劑的比例減少后進(jìn)行使用。另外，可以通過(guò)例如過(guò)濾、離心等從分散液或降低了極性有機(jī)溶劑的比例的分散液中除去溶劑，進(jìn)行使用，也可以將該分散液或加入了例如甘露醇、乳糖、海藻糖、麥芽糖、甘氨酸等賦形劑的該分散液凍結(jié)干燥，進(jìn)行使用。
為注射劑時(shí)，優(yōu)選在上述被覆微粒的分散液或減少了極性有機(jī)溶劑比例的分散液、或除去或凍結(jié)干燥上述溶劑得到的被覆微粒中，混合例如水、酸、堿、各種緩沖液、生理鹽水、氨基酸輸液等，配制注射劑。另外，也可以加入例如檸檬酸、抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA等抗氧化劑、甘油、葡萄糖、氯化鈉等等滲劑等，配制注射劑。另外，也可以加入例如甘油等凍結(jié)保存劑進(jìn)行凍結(jié)保存。
另外，也可以將本發(fā)明的被覆微粒與適當(dāng)?shù)馁x形劑等共同地造粒、干燥等，加工成例如膠囊劑、片劑、顆粒劑等口服用制劑。
本發(fā)明的制備方法中也可以使用試劑盒。作為試劑盒的組成，例如可以舉出用于通過(guò)本發(fā)明的制備方法配制被覆微粒的、至少由芯微粒、被覆層成分及含有極性有機(jī)溶劑的液體構(gòu)成的組成等。例如，在小容量的容器中分別填充用于通過(guò)本發(fā)明的制備方法制備被覆微粒的、芯微粒、被覆層成分及含有極性有機(jī)溶劑的液體等，可以根據(jù)本發(fā)明的制備方法通過(guò)混合制備被覆微粒，在混合中，不存在例如必須緩緩地混合等制約，因此，具有作為試劑盒的簡(jiǎn)便性高的優(yōu)點(diǎn)。
接下來(lái)，通過(guò)實(shí)施例，具體地說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1 被覆層成分的溶解液(液體A)；將60mg EPC(日本油脂制、以下相同)及1 2.5mg PEG-DSPE(日本油脂制、以下相同)溶解于2mL乙醇/水混合液(8∶5)中(A1液)。
芯微粒的分散液(液體B)；將10mg葡聚糖熒光素陰離子(FD、Molecular Probes社制、以下相同)、60mg DOTAP(Avanti polar lipids公司制、以下相同)及24mg PEG-DSPE分散于2mL水中。所得分散液通過(guò)孔徑為0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜(Whatman制，以下相同)31次(B1液)。
向A1液中滴入0.5mL B1液(乙醇濃度約為50vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得分散液和22.5mL水混合，通過(guò)超離心(1小時(shí)、110,000×g、25℃)除去上清液，得到制劑。
實(shí)施例2 被覆層成分的分散液(液體D)；使60mg EPC及12.5mg PEG-DSPE分散于1.6mL乙醇/水混合液(1∶1)中(D2液)。
芯微粒的分散液(液體E)；使10mgFD、60mg DOTAP及24mg PEG-DSPE分散于1mL水中。所得分散液通過(guò)孔徑為0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜31次，得到芯微粒分散液。向0.25mL此液體中加入0.25mL乙醇，使乙醇濃度約為50vol％。(E2液)。
將D2液和E2液混合(乙醇濃度約為50vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和水23mL混合，與實(shí)施例1相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例3 被覆層成分及芯微粒的分散液(液體H)；使10mg FD、60mgDOTAP及24mg PEG-DSPE分散于1mL水中。將所得分散液通過(guò)孔徑為0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜31次。另外，使120mg EPC及25mg PEG-DSPE分散于2mL水中。將所得分散液通過(guò)孔徑為0.4μm的聚碳酸酯微孔濾膜(Whatman制，以下相同)11次，通過(guò)孔徑為0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜21次。將所得FD、DOTAP及PEG-DSPE的分散液和所得EPC及PEG-DSPE的分散液混合(H3液)。
向H3液中加入1.25mL乙醇(乙醇濃度約為50vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和22.5mL水混合，與實(shí)施例1相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
比較例1 被覆層成分的溶解液(液體A)，將60mg EPC及12.5mgPEG-DSPE溶解于1mL乙醇中(a1液)。
芯微粒的分散液(液體B)；使30mg FD、180mgDOTAP及72mg PEG-DSPE分散于9mL水中。將所得分散液通過(guò)孔徑為0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜31次(b1液)。
將0.25mL a1液和0.75mL b1液混合(乙醇濃度約為62.5vol％，在此濃度下被覆層成分溶解，芯微粒分散)，進(jìn)而邊攪拌，邊以1mL/分鐘的速度加入23mL蒸餾水，得到被覆微粒的分散液。
對(duì)所得分散液與實(shí)施例1相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
試驗(yàn)例1 按照以下方法，對(duì)實(shí)施例1～3及比較例1所得各制劑的平均粒徑、FD及EPC的回收率、及胎牛血清(FBS)中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果如表1所示。
平均粒子徑 采用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)(使用機(jī)器A model ELS-800、大電子、以下相同)，測(cè)定被覆微粒在磷酸緩沖生理鹽水(PBS)中的平均粒徑。
FD及EPC的回收率 用PBS稀釋各制劑，使總脂質(zhì)濃度為30mg/mL。再用PBS稀釋1000倍，向稀釋后的各50μL制劑中，分別加入50μL 10w/v％曲拉通X-100(TritonX-100、和光純藥制、以下相同)及400μL PBS，用渦流混合器(vortex mixer)攪拌。另外，用PBS將各實(shí)施例及比較例中得到的超離心上清液稀釋10倍，向稀釋后的各50μL上清液中，分別加入50μL 10w/v％TritonX-100及400μL PBS，用渦流混合器攪拌。分別取100μL置于96孔微孔板中，使用熒光分析儀(ARVOsx-4、Wallac社制、以下相同)，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm及熒光波長(zhǎng)530nm處的熒光強(qiáng)度。另一方面，測(cè)定1、0.5及0.25μg/mL的各FD-PBS的熒光強(qiáng)度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各制劑中的FD濃度。另一方面，通過(guò)使用磷脂C-Test Wako(和光純藥制、以下相同)測(cè)定，求得各制劑中EPC的濃度。
按照下式(1)及(2)計(jì)算各制劑的FD回收率及EPC回收率。
FD的回收率(％)＝A1/(A1+B1)×100 (1) A1被覆微粒中的FD含量(μg) ＝被覆微粒部分中的FD濃度(μg/mL)×被覆微粒的體積(mL) B1上清液中的FD含量(μg) ＝上清液中的FD濃度(μg/mL)×上清液的體積(mL) EPC的回收率(％)＝A2/(A2+B2)×100(2) A2被覆微粒中的EPC含量(μg) ＝被覆微粒部分中的EPC濃度(μg/mL)×被覆微粒的體積(mL) B2上清液中的EPC含量(μg) ＝上清液中的EPC濃度(μg/mL)×上清液的體積(mL) FBS中的穩(wěn)定性 用PBS稀釋各制劑，使總脂質(zhì)濃度為30mg/mL。向稀釋后的30μL制劑中，加入2970μL FBS，混合。
在混合剛剛結(jié)束后及37℃下靜置3小時(shí)后各取500μL，進(jìn)行凝膠滲透色譜法(Gel Permeation Chromatography(GPC))，回收其餾分(100滴，10瓶)。用渦流混合器振動(dòng)攪拌各餾分，制備樣品，為了定量FD，向各50μL中分別加入50μL 10w/V％TritonX-100及400μL PBS，用渦流混合器攪拌。取其中的100μL置于96孔微孔板中，使用ARVOsx-4，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm及熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度，按照下式(3)計(jì)算0小時(shí)后及3小時(shí)后微粒中的藥物殘存率。
0小時(shí)后FD的殘存率(％)＝A3/B3×100 (3) 3小時(shí)后FD的殘存率(％)＝C3/D3×100 A3＝∑{(各餾分熒光強(qiáng)度)被覆微粒部分(0小時(shí)后)×(各餾分體積)被覆微粒部分(0小時(shí)后)}。
B3＝∑{(各餾分熒光強(qiáng)度)所有部分(0小時(shí)后)×(各餾分體積)所有部分(0小時(shí)后)} C3＝∑{(各餾分熒光強(qiáng)度)被覆微粒部分(3小時(shí)后)×(各餾分體積)被覆微粒部分(3小時(shí)后)} D3＝∑{(各餾分熒光強(qiáng)度)所有部分(3小時(shí)后)×(各餾分體積)所有部分(3小時(shí)后)} [表1] 從表1可知，實(shí)施例1～3所得制劑與比較例1所得制劑相比，被覆微粒有程度相同的小粒徑(但是，實(shí)施例1及3所得制劑粒徑較小，分別為130nm以下及115nm以下)、且能相同程度地高效率堅(jiān)固地包封藥物。本發(fā)明的被覆微粒的制備方法盡管與現(xiàn)有方法相比是沒(méi)有例如必須緩緩地混合等制約的較簡(jiǎn)便的制備方法，但通過(guò)該方法，仍可以得到與現(xiàn)有方法程度相同的優(yōu)異的被覆微粒。
實(shí)施例4 向?qū)嵤├?所得的制劑中加入PBS，將EPC濃度調(diào)至24mg/mL，將0.5mL此液體、和將2.5mg PEG-DSPE溶解于0.02mL乙醇所得的液體混合后，在70℃下加熱2分鐘，得到用PEG進(jìn)行了表面修飾的制劑。
比較例2 向比較例1所得的制劑中加入PBS，將EPC濃度調(diào)至24mg/mL，將0.5mL此液體、和將2.5mg PEG-DSPE溶解于0.02mL乙醇所得的液體混合后，在70℃下加熱2分鐘，得到用PEG進(jìn)行了表面修飾的制劑。
試驗(yàn)例2 根據(jù)下述方法，研究實(shí)施例4及比較例2所得各制劑的血中動(dòng)態(tài)。各結(jié)果如表2及圖1所示。
血中動(dòng)態(tài) 用PBS稀釋各制劑，使總脂質(zhì)濃度為5mg/mL，對(duì)大鼠給藥，以脂質(zhì)量/大鼠體重比計(jì)，給藥量為10mg/kg。在給藥后1分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)及24小時(shí)進(jìn)行采血，經(jīng)離心得到血漿。為了定量血漿中的FD，在各50μL血-漿中分別加入50μL 10w/v％TritonX-100及400μL PBS，用渦流混合器攪拌。取其中100μL置于96孔微孔板中，使用ARVOsx-4，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm及熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度。另一方面，測(cè)定1、0.5、0.25μg/mL的各FD-PBS的熒光強(qiáng)度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各血漿中的FD濃度。按每100g大鼠體重的血漿量為7.8mL計(jì)算相對(duì)于給藥量的血中殘存率(％)，同時(shí)，采用梯形法計(jì)算AUC0.24h(μg·min/dose)。
[表2] 從表2可知，實(shí)施例4所得制劑與比較例2所得制劑相比，在生物體內(nèi)顯示同等程度的優(yōu)異的血中滯留性。本發(fā)明的被覆微粒的制備方法盡管是較簡(jiǎn)便的制備方法，但通過(guò)該方法，仍可以得到與現(xiàn)有方法同等優(yōu)異的被覆微粒。
實(shí)施例5 被覆層成分的溶解液(液體A)；將15mg EPC及3.125mg PEG-DSPE溶于1mL乙醇/水混合液(8∶5)中(A5液)。
芯微粒的分散液(液體B)；使90mg DOTAP及36mg PEG-DSPE分散于2mL水中。使所得分散液通過(guò)孔徑為0.4μm的聚碳酸酯微孔濾膜11次、孔徑為0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜11次、孔徑為0.05μm的聚碳酸酯微孔濾膜(Whatman制，以下相同)25次。在0.167mL所得分散液中，加入將1.87mg ODN(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的硫代磷酸化修飾型寡脫氧核苷酸(序列(5’)CCT CTT ACC TCA G(3’)、堿基數(shù)13、分子量4573.57、XAI MEDIA公司制、以下相同)溶解于0.083mL水所得的液體(B5液)。
將A5液和B5液混合(乙醇濃度約為50vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和11.25mL水混合，通過(guò)超離心(1小時(shí)、110,000×g、25℃)，除去上清液，得到制劑。
實(shí)施例6 被覆層成分的溶解液(液體A)；將與實(shí)施例5的A1液相同量的EPC及PEG-DSPE溶解于0.9mL乙醇/水混合液(8∶5)中(A6液)。
芯微粒的分散液(液體B)；向?qū)嵤├?的B5液中加入0.1mL蒸餾水(B6液)。
將A6液和B6液混合(乙醇濃度約為45vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和10mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例7 被覆層成分的溶解液(液體A)；將與實(shí)施例5的A5液相同量的EPC及PEG-DSPE溶解于0.8mL乙醇/水混合液(8∶5)中(A7液)。
芯微粒的分散液(液體B)；向?qū)嵤├?的B5液中加入0.2mL的水(B7液)。
混合A7液和B7液(乙醇濃度約為40vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和8.75mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例8 被覆層成分的溶解液(液體A)；將與實(shí)施例5的A5液相同量的EPC及PEG-DSPE溶解于0.71mL乙醇/水混合液(8∶5)中(A8液)。
芯微粒的分散液(液體B)；向?qū)嵤├?的B5液中加入0.3mL蒸餾水(B8液)。
混合A8液和B8液(乙醇濃度約為35vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和7.5mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例9 被覆層成分的溶解液(液體A)；將與實(shí)施例5的A5液相同量的EPC及PEG-DSPE溶解于0.5mL乙醇/水混合液(8∶5)中(A9液)。
芯微粒的分散液(液體B)；在實(shí)施例5的B5液中加入0.5mL蒸餾水(B9液)。
混合A9液和B9液(乙醇濃度約為25vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和5mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
比較例3 被覆層成分的溶解液(液體A)；將30mg EPC及6.25mg PEG-DSPE溶于1mL乙醇中(a3液)。
芯微粒的分散液(液體B)；使60mg DOTAP及24mg PEG-DSPE分散于2mL水中。將所得分散液通過(guò)孔徑0.4μm的聚碳酸酯微孔濾膜11次，孔徑0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜11次、孔徑0.05μm的聚碳酸酯微孔濾膜21次。向0.5mL所得分散液中加入將3.75mg ODN溶于0.25mL水所得的液體(b3液)。
混合0.25mL a3液和b3液(乙醇濃度約為62.5vol％，在此濃度下被覆層成分溶解，芯微粒分散)，進(jìn)而邊攪拌，邊以1mL/min的速度加入23mL水，得到被覆微粒約分散液。
對(duì)所得被覆微粒的分散液與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
試驗(yàn)例3 根據(jù)下述方法，對(duì)實(shí)施例5～9及比較例3所得各制劑的平均粒徑、ODN及EPC的回收率、及其FBS中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果如表3所示。平均粒子徑 用DLS測(cè)定被覆微粒在PBS中的平均粒徑。
ODN及EPC的回收率 用PBS稀釋各制劑，使總脂質(zhì)濃度為30mg/mL。再用PBS稀釋1000倍，向稀釋后的各50μL液體中，分別加入50μL 10w/v％TritonX-100及400μL PBS，用渦流混合器攪拌。另外，用PBS將各實(shí)施例及比較例中所得超離心上清液稀釋10倍，向稀釋后的各50μL液體中，分別加入50μL 10w/v％TritonX-100及400μL PBS，用渦流混合器攪拌。分別取100μL置于96孔微孔板中，使用ARVOsx-4，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm及熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度。另一方面，測(cè)定1.5、1.5/4、1.5/42、1.5/43、1.5/44及1.5/45μg/mL的各ODN-PBS的熒光強(qiáng)度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各制劑中的ODN濃度。另一方面，通過(guò)使用磷脂C-Test wako進(jìn)行測(cè)定，求出各制劑中的EPC濃度。
按照下式(4)及(5)計(jì)算各制劑的ODN回收率及EPC回收率。
ODN的回收率(％)＝A4/(A4+B4)×100(4) A4被覆微粒中的ODN含量(μg) ＝被覆微粒部分中的ODN濃度(μg/mL)×被覆微粒的體積(mL) B4上清液中的ODN含量(μg) ＝上清液中的ODN濃度(μg/mL)×上清液的體積(mL) EPC的回收率(％)＝A5/(A5+B5)×100(5) A5被覆微粒中的EPC含量(μg) ＝被覆微粒部分中的EPC濃度(μg/mL)×被覆微粒的體積(mL) B5上清液中的EPC含量(μg) ＝上清液中的EPC濃度(μg/mL)×上清液的體積(mL) FBS中的穩(wěn)定性 用PBS稀釋各制劑，使總脂質(zhì)濃度為30mg/mL。向稀釋后的30μL制劑中，加入60μL的50mg/mL葡聚糖硫酸鈉及2910μL的FBS，混合。
在混合剛剛結(jié)束后及37下靜置3小時(shí)后分別取500μL，進(jìn)行GPC，回收其餾分(100滴，10瓶)。用渦流混合器振動(dòng)攪拌各餾分，制備樣品，為了定量ODN，向各50μL中分別加入50μL 10w/v％TritonX-100及400μLPBS，用渦流混合器攪拌。取其中的100μL置于96孔微孔板中，使用ARVOsx-4，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)485nm及熒光波長(zhǎng)530nm下的熒光強(qiáng)度，采用下式(6)計(jì)算0小時(shí)后及3小時(shí)后藥物的回收率。
0小時(shí)后ODN的回收率(％)＝A6/B6×100 (6) 3小時(shí)后ODN的回收率(％)＝C6/D6×100 A6＝□{(各餾分熒光強(qiáng)度)被覆微粒部分(0小時(shí)后)×(各餾分體積)被覆微粒部分(0小時(shí)后)}。
B6＝□{(各餾分熒光強(qiáng)度)所有部分(0小時(shí)后)×(各餾分體積)所有部分(0小時(shí)后)} C6＝□{(各餾分熒光強(qiáng)度)被覆微粒部分(3小時(shí)后)×(各餾分體積)被覆微粒部分(3小時(shí)后)} D6＝□{(各餾分熒光強(qiáng)度)所有部分(3小時(shí)后)×(各餾分體積)所有部分(3小時(shí)后)} [表3] 從表3可知，實(shí)施例5～9所得制劑與比較例3所得制劑相比，被覆微粒具有相同程度的小粒徑(但是，實(shí)施例5～8及9所得制劑分別是130nm以下及115nm以下)、且能相同程度地高效率地包封藥物，還可以堅(jiān)固地包封藥物。實(shí)施例5～9涉及用被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的制備方法，所述制備方法包括如下工序，即，配制含有溶解了被覆層成分的極性有機(jī)溶劑的液體(液體A)的工序，配制可與液體A混合、且芯微粒分散、不含極性有機(jī)溶劑或以與液體A相比較低的比例含有極性有機(jī)溶劑的液體(液體B)的工序，及混合液體A和液體B配制液C的工序。盡管該方法與現(xiàn)有方法相比是沒(méi)有例如必須緩緩地混合等制約的較簡(jiǎn)便的制備方法，但通過(guò)該方法，即使在使用含有較大藥物ODN的芯微粒時(shí)，仍可以得到與現(xiàn)有方法同等優(yōu)異的被覆微粒。
實(shí)施例10 被覆層成分及芯微粒的分散液(液體H)；使30mgEPC及6.25mgPEG-DSPE分散于0.75mL水中。將所得分散液通過(guò)孔徑0.4μm的聚碳酸酯微孔濾膜11次，孔徑0.1μm的聚碳酸酯微孔濾膜25次，得到脂質(zhì)分散液。將0.375mL所得脂質(zhì)分散液和實(shí)施例5的B5液混合(H10液)。
向H10液中加入0.625mL乙醇(乙醇濃度約為50vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，攪拌30分鐘，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和11.25mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例11 被覆層成分及芯微粒的分散液(液H)；在實(shí)施例10的H10液配制中，水量設(shè)定為1mL，在0.5mL所得脂質(zhì)分散液中混合實(shí)施例5的B5液(H11液)。
向H11液中加入0.5mL乙醇(乙醇濃度約為40vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，攪拌30分鐘，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和8.75mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例12 被覆層成分及芯微粒的分散液(液體H)；在實(shí)施例10的H10液配制中，水量設(shè)定為1.125mL，在0.563mL所得脂質(zhì)分散液中混合實(shí)施例5的B5液(H12液)。
向H12液中加入0.438mL乙醇(乙醇濃度約為35vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，攪拌30分鐘，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和7.5mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
實(shí)施例13 被覆層成分及芯微粒的分散液(液體H)；在實(shí)施例10的H10液配制中，水量設(shè)定為1.375mL，在0.688mL所得脂質(zhì)分散液中混合實(shí)施例5的B5液(H13液)。
向H13液中加入0.313mL乙醇(乙醇濃度約為25vol％，在此濃度下被覆層成分及芯微粒分散)，攪拌30分鐘，得到被覆微粒的分散液。
將所得被覆微粒的分散液和5mL水混合，與實(shí)施例5相同地進(jìn)行超離心操作，得到制劑。
試驗(yàn)例4 根據(jù)與試驗(yàn)例3相同的方法，對(duì)實(shí)施例10～13所得各制劑的平均粒徑、ODN及EPC的回收率、及在FBS中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果如表4所示。
[表4] 從表4可知，實(shí)施例10～13所得制劑與比較例3所得制劑相比，具有相同程度的小粒徑(但是，實(shí)施例10及11～13分別為115nm以下及100nm以下)、被覆微粒相同程度地高效率地包封藥物，還可堅(jiān)固地包封藥物。實(shí)施例10～13涉及用被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的制備方法，所述制備方法包括如下工序，即，配制被覆層成分及芯微粒分散的液體(液體H)的工序，將可與液體H混合、且含極性有機(jī)溶劑的液體和液體H混合配制液體I的工序。盡管該方法與現(xiàn)有方法相比是沒(méi)有例如必須緩緩地混合等制約的較簡(jiǎn)便的制備方法，但通過(guò)該方法，即使在使用含有較大藥物ODN的芯微粒時(shí)，仍可以得到與現(xiàn)有方法同等優(yōu)異的被覆微粒。
需要說(shuō)明的是，由表3及表4可知，實(shí)施例9及13所得的制劑盡管極性有機(jī)溶劑的濃度僅約為25％，但仍可得到被覆微粒，且所述被覆微粒具有與現(xiàn)有方法程度相同的較小的粒徑，可與現(xiàn)有方法同樣高效地制備，還可堅(jiān)固地包封藥物。由此可知，本發(fā)明的被覆微粒的制備方法與現(xiàn)有方法相比具有可減少所用極性有機(jī)溶劑的量的優(yōu)點(diǎn)。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性 本發(fā)明提供一種用被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的簡(jiǎn)便的制備方法等。另外，本發(fā)明提供可高效及/或堅(jiān)固地含有藥物的被覆微粒的制備方法等。
權(quán)利要求
1.芯微粒被被覆層成分被覆的被覆微粒制備方法，其特征在于，包括以下工序
工序A在含有可溶解被覆層成分的極性有機(jī)溶劑的液體中，以芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度含有該極性有機(jī)溶劑，使該芯微粒及該被覆層成分分散在該液體中的工序；
工序B用該被覆層成分被覆該芯微粒的工序。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述工序B是將工序A所得液體靜置或混合充分時(shí)間，使芯微粒被被覆層成分被覆的工序。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包括以下工序
配制含有溶解了該被覆層成分的極性有機(jī)溶劑的液體A的工序；
配制可與液體A混合、且該芯微粒分散、不含該極性有機(jī)溶劑或以比液體A低的比例含有該極性有機(jī)溶劑的液體B的工序；
混合液體A和液體B配制液體C的工序。
4.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包括
配制分散有該被覆層成分的液體D的工序，
配制可以與液體D混合且分散有該芯微粒的液體E的工序，
混合液體D和液體E配制液體F的工序；
液體D及液體E中的至少一方為含有極性有機(jī)溶劑的液體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包括
配制分散了該被覆層成分的含有極性有機(jī)溶劑的液體G的工序及，
使該芯微粒分散在液體G中的工序。
6.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述工序A包括
配制分散有該被覆層成分及該芯微粒的液體H的工序；及
將可與液體H混合且含有極性有機(jī)溶劑的液體與液體H混合，配制液體I的工序。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述極性有機(jī)溶劑是選自醇、二醇及聚亞烷基二醇中的一種以上。
8.如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，在工序B中，含有極性有機(jī)溶劑的液體中的極性有機(jī)溶劑的濃度為1～80vol％。
9.如權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述被覆層成分是選自用于形成脂質(zhì)膜被覆層的脂質(zhì)及表面活性劑中的一種以上物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述被覆層成分是選自用于形成脂質(zhì)膜被覆層的脂質(zhì)及表面活性劑中的一種以上物質(zhì)，及選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑。
11.如權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒含有選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑。
12.如權(quán)利要求10或11所述的制備方法，其中，所述選自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一種以上物質(zhì)的脂質(zhì)衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性劑為選自聚乙二醇化脂質(zhì)、聚甘油化脂質(zhì)、聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇及甘油脂肪酸酯中的一種以上物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中還包括在所述工序B之后從含有極性有機(jī)溶劑的液體中除去極性有機(jī)溶劑或降低極性有機(jī)溶劑濃度的工序。
14.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒是以選自藥物、脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑中一種以上作為構(gòu)成成分的微粒。
15.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒為以藥物為構(gòu)成成分的微粒。
16.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒是以藥物和選自脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體及微粒制劑中的一種以上物質(zhì)的復(fù)合體作為構(gòu)成成分的微粒。
17.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其中，脂質(zhì)集合體、脂質(zhì)體、乳液微粒、高分子、金屬膠體或微粒制劑是帶有與藥物相反的靜電電荷的物質(zhì)。
18.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒是以陰離子性藥物和含有陽(yáng)離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒。
19.如權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒是以陽(yáng)離子性藥物和含有陰離子性脂質(zhì)的脂質(zhì)體的復(fù)合體為構(gòu)成成分的微粒。
20.如權(quán)利要求17～19中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述芯微粒是還含有附著競(jìng)爭(zhēng)劑的微粒。
21.如權(quán)利要求14～20中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述藥物是選自肽、蛋白質(zhì)、核酸、低分子化合物、糖類及高分子化合物中的一種以上。
22.如權(quán)利要求14～20中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述藥物是選自基因、DNA、RNA、寡核苷酸、質(zhì)粒及siRNA中的一種以上。
23.一種試劑盒，是用于通過(guò)權(quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的制備方法制備被覆微粒的試劑盒，至少由芯微粒、被覆層成分及含有極性有機(jī)溶劑的液體構(gòu)成。
24.一種被覆微粒，所述被覆微?？梢杂蓹?quán)利要求1～22中任一項(xiàng)所述的制備方法進(jìn)行制備。
25.一種腫瘤治療劑，含有可以由權(quán)利要求15～22中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的被覆微粒，其中藥物為抗腫瘤藥。
26.一種炎癥治療劑，含有可以由權(quán)利要求15～22中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的被覆微粒，其中藥物為抗炎癥藥。
27.一種向腫瘤或炎癥部位運(yùn)送藥物的含藥物載體，所述載體由可以利用權(quán)利要求15～22中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的被覆微粒構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)較簡(jiǎn)便的方法用被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的制備方法等，本發(fā)明提供用該被覆層成分被覆芯微粒的被覆微粒的制備方法等，其特征在于，包括如下工序在含有被覆層成分可溶的極性有機(jī)溶劑的液體中，以芯微粒不溶解、被覆層成分以分散狀態(tài)存在的濃度含有該極性有機(jī)溶劑，使該芯微粒及該被覆層成分分散在該液體中的工序，及用該被覆層成分被覆該芯微粒的工序。
文檔編號(hào)A61K9/127GK101111307SQ200680003348
公開(kāi)日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2006年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者八木信宏, 德田拓彌, 中倉(cāng)政司, 加藤泰己 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社