專利名稱：：抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒的中和單克隆抗體的制作方法抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒的中和單克隆抗體相關(guān)申請(qǐng)的交叉參者本申請(qǐng)要求2005年2月8日提交的美國(guó)系列申請(qǐng)No.60/651，046的優(yōu)先權(quán)，并且是2005年5月31日提交的美國(guó)系列申請(qǐng)No.11/141，925的部分繼續(xù)申請(qǐng)，該申請(qǐng)要求2004年6月2日提交的美國(guó)系列申請(qǐng)No.60/576，118的優(yōu)先權(quán)。在整個(gè)申請(qǐng)中引用了各種出版物。這樣，這些參考文獻(xiàn)及其相應(yīng)的公開內(nèi)容全部引入本申請(qǐng)作為參考，從而更為全面地闡述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展水平。
背景技術(shù)：
：嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)是近來(lái)被認(rèn)識(shí)的發(fā)熱性嚴(yán)重下呼吸道疾病，它是由于感染一種新的冠狀病毒(SARS-CoV)而導(dǎo)致的(1-5)。全球性的SARS爆發(fā)雖然得到了控制，但是對(duì)其未來(lái)再出現(xiàn)的可能性的關(guān)注卻仍然存在，尤其是近期關(guān)于實(shí)驗(yàn)室獲得的感染的報(bào)導(dǎo)(6)。無(wú)論如何，目前尚未獲得能夠有效地治療或預(yù)防該致命性病毒感染的方法(7,8)。類似于其他冠狀病毒，SARS-CoV是一種包膜病毒，含有一個(gè)大的、正鏈RNA基因組，該基因組編碼病毒的復(fù)制酶蛋白以及包括剌突(S)蛋白、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白、核衣殼(N)蛋白在內(nèi)的結(jié)構(gòu)性蛋白和若干尚未表征的蛋白(4,5，9)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，SARS-CoV不同于冠狀病毒的三個(gè)已知抗原組。因此，SARS-CoV的后基因組特征對(duì)于開發(fā)抗SARS療法和疫苗是重要的(10,11)。冠狀病毒感染起始于S蛋白附著到特異性的宿主受體，從而觸發(fā)S蛋白內(nèi)的構(gòu)象改變。SARS-CoV的S蛋白為預(yù)測(cè)長(zhǎng)度為1,255個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白，其氨基酸序列包括前導(dǎo)區(qū)(殘基1-14)、胞外域(殘基15-11卯)、跨膜結(jié)構(gòu)域(殘基1191-1227)以及短的細(xì)胞內(nèi)尾部(殘基1227-1255)(5)。與許多其他的冠狀病毒例如小鼠肝炎病毒(MHV)(12,13)不同，在所述其他冠狀病毒中，S蛋白被后期翻譯性切割為S1和S2亞單位，而在SARS-CoV的S蛋白中并沒(méi)有典型的切割基序被確定(5)。其S1和S2結(jié)構(gòu)域則可通過(guò)與其它冠狀病毒S蛋白的序列對(duì)齊而被預(yù)測(cè)(5,14)。該SARS-CoVS蛋白的S2結(jié)構(gòu)域(殘基681-1255)包含一種推定的融合肽和兩個(gè)介導(dǎo)病毒和靶細(xì)胞膜之間的融合的七殘基重復(fù)序列(HR1和HR2)區(qū)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HR1和HR2區(qū)域可以結(jié)合形成一種六螺旋束結(jié)構(gòu)(15-18),類似于艾滋病病毒fflVgp41(19)和MHVS蛋白(20,21)的融合活性核心結(jié)構(gòu)。該SARS-CoV的S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)病毒與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的結(jié)合，ACE2是SARS-CoV在易感性細(xì)胞上的功能性受體(22-25)。近來(lái)，一個(gè)在S1結(jié)構(gòu)域之中的193個(gè)氨基酸的小片段(殘基318-5IO)被確定為一種足以與ACE2結(jié)合的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)(26-28)。冠狀病毒S蛋白是主要的誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原決定嚴(yán)(29，30)。因此，邏輯上可以使用S蛋白作為疫苗開發(fā)的抗原(30)。近來(lái)已經(jīng)證明SARS-CoV的S蛋白是一種在結(jié)構(gòu)蛋白中的保護(hù)性免疫的主要誘導(dǎo)物(31)。Yang等人(32)報(bào)導(dǎo)了一種編碼S蛋白的DNA疫苗能在小鼠中誘導(dǎo)SARS-CoV的中和(中和抗體效價(jià)范圍為1:25至1:150)以及保護(hù)性免疫，并且已證實(shí)該保護(hù)作用是由中和抗體而不是由T細(xì)胞依賴性機(jī)制所介導(dǎo)的。Bisht等人(33)證實(shí)，通過(guò)減毒的痘苗病毒(MVA)表達(dá)的SARS-CoV的S蛋白能夠引起SARS-CoV-中和抗體效價(jià)為l:284的S-特異性抗體，并且保護(hù)免疫小鼠不被SARS-CoV感染。經(jīng)過(guò)攻擊感染后的小鼠呼吸道中SARS-CoV的滴度明顯降低。Bukreyev等人(34)報(bào)導(dǎo)，將非洲綠猴通過(guò)表達(dá)該SARS-CoVS蛋白的減毒的副流感病毒(BHPIV3)進(jìn)行粘膜免疫，誘導(dǎo)了中和效價(jià)為1:8到1:16的中和抗體，并且保護(hù)動(dòng)物免受攻擊性感染。這些數(shù)據(jù)顯示，SARS-CoV的S蛋白是一種保護(hù)性抗原，該抗原能夠誘導(dǎo)中和抗體，雖然其抗原決定簇仍然需要進(jìn)一步確定。我們近來(lái)已經(jīng)證實(shí)，SARS-CoV的S蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)是在SARS-CoV感染的患者體內(nèi)和經(jīng)滅活病毒或S蛋白(35,36)免疫的動(dòng)物中誘導(dǎo)的中和抗體的主要耙點(diǎn)。因此，我們使用SARS-CoV的S蛋白的重組體RBD作為誘導(dǎo)中和單克隆抗體(mAb)的免疫原。發(fā)明筒述本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體，該單克隆抗體能夠與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)結(jié)合，從而竟?fàn)幮缘匾种芐ARS-CoV與宿主細(xì)胞結(jié)合。另外，本發(fā)明提供一種包括如上所述單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域的物質(zhì)，該物質(zhì)能夠與如上所述5單克隆抗體相同的表位結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述物質(zhì)是抗體。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是中和的。本發(fā)明還提供單鏈抗體或抗體融合構(gòu)建體；一種人源化抗體；和一種如上所述的嵌合抗體。本申請(qǐng)意圖包括使用本發(fā)明抗體創(chuàng)建的不同的嵌合構(gòu)建體。本發(fā)明也包括該抗體的所有人源化構(gòu)建體。在一種實(shí)施方案中，上述分離抗體直接或間接地偶聯(lián)到細(xì)胞毒素試劑。本發(fā)明還提供包括所述抗體的細(xì)胞。本發(fā)明另外提供一種編碼上述抗體的核酸分子。本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種能夠特異性雜交如上所述的分子的核酸分子。所述核酸分子包括，但不限于，合成DNA或RNA、基因組DNA、cDNA和RNA。本發(fā)明還提供一種包括上述核酸分子或其一部分的載體。在一種實(shí)施方案中，所述載體是表達(dá)載體，由此可以表達(dá)上述核酸分子編碼的蛋白。本發(fā)明更進(jìn)一步包括一種包含上述核酸分子的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以用于表達(dá)。本發(fā)明提供一種制備抗體的方法，該抗體能夠與SARS-CoV刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)結(jié)合，從而竟?fàn)幮缘匾种芐ARS-CoV結(jié)合到宿主細(xì)胞，該方法包括可操作地連接如上所述的核酸分子到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件，從而表達(dá)所述抗體；將所述連接的核酸分子置于允許所述抗體表達(dá)的適宜條件下；回收所述表達(dá)的抗體，從而制得所述抗體。本發(fā)明還提供一種通過(guò)上述方法制備的抗體。本發(fā)明提供一種包括有效量的上述單克隆抗體和適宜載體的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種包括有效量的上述單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供一種使用上述藥物組合物來(lái)治療SARS-CoV感染的方法。本發(fā)明更進(jìn)一步提供一種使用上述藥物組合物來(lái)預(yù)防SARS-CoV感染的方法。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)SARS-CoV(或SARS-CoV感染細(xì)胞)的方法，該方法包括接觸能夠結(jié)合所述病毒刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的抗體或其衍生物，接觸的條件是允許所述抗體或其衍生物與SARS-CoV的S蛋白的RBD形成復(fù)合物；檢測(cè)形成的復(fù)合物。最后，本發(fā)明提供一種用于篩選能夠通過(guò)阻斷所述病毒與宿主細(xì)胞上受體的結(jié)合，從而抑制嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)感染的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)建立一種用于使所述抗體結(jié)合到SARS-CoV刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的體系；和(b)將待測(cè)所述化合物加入上述(a)的體系中，由此如果上述抗體與SARS-CoV的S蛋白的RBD結(jié)合降低，表明該化合物能夠干擾抗體與RBD的結(jié)合，從而抑制SARS-CoV的S蛋白的RBD的感染。本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選得到的化合物。然后可將該化合物用于治療或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)。本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包括含有能夠識(shí)別SARS病毒的抗體的隔室。本發(fā)明證實(shí)，所述RBD包含多個(gè)構(gòu)象依賴性的中和表位，所述表位誘導(dǎo)一組有效的中和單克隆抗體(mAb),該抗體可用于治療、診斷和預(yù)防SARS。附圖簡(jiǎn)述圖1.通逸霞蓋S蛋白R(shí)BD的重疊肽確定的mAb4D5和17H9的表位圖譜。每一肽段的包被濃度5jag/ml，mAb的檢測(cè)濃度10jag/ml。圖2.通過(guò)mAb抑制RBD-Fc與ACE2的結(jié)合。上圖表示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的、對(duì)RBD-Fc與在293T/ACE2細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞相關(guān)性ACE2的結(jié)合的抑制作用；下圖表示通過(guò)ELISA測(cè)定的對(duì)RBD-Fc與可溶性ACE2結(jié)合的抑制作用。RBD-Fc的用量為liag/m1,而mAb的用量為50yg/ml。計(jì)算出每一種mAb的抑制百分率.，圖3.以mAb中和SARS假病毒。本圖顯示出了每組中的代表性mAb對(duì)293T/ACE2細(xì)胞中的SARS假病毒感染的抑制作用。在2倍系列稀釋液中檢測(cè)每一種mAb，并且計(jì)算中和百分率。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體，該抗體能夠與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)結(jié)合，從而竟?fàn)幮缘匾种芐ARS-CoV與宿主細(xì)胞結(jié)合。本發(fā)明還提供一種包括上述單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域的物質(zhì)，該物質(zhì)能夠與如上所述單克隆抗體相同的表位結(jié)合。該物質(zhì)包括，但不限于，多肽、小分子、抗體或抗體片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體是中和的。在另外實(shí)施方案中，該抗體可以是單鏈抗體或抗體融合構(gòu)建體；人源化抗體；或如上所述的嵌合抗體。本申請(qǐng)意圖包括使用本發(fā)明抗體創(chuàng)建的不同的嵌合構(gòu)建體。本發(fā)明也包括該抗體的所有人源化構(gòu)建體。生產(chǎn)嵌合抗體或人源化抗體的技術(shù)是眾所周知的。參見(jiàn)嵌合抗體的例子(37,38)和人源化抗體的例所述的〗奮飾可以包括，在;述片段中增加、減少或突變某些氨基酸序列。制備抗體的一般方法在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。參見(jiàn)，例如Ed.Harlow的"使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)便攜式方案l(UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNo.1)，，(1998)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述的分離抗體直接或間接地與一種或多種細(xì)胞毒素試劑偶聯(lián)。所述的細(xì)胞毒素試劑包括，但不限于，放射性核苷酸或其它毒素。本發(fā)明還提供包括所述抗體的細(xì)胞。本發(fā)明另外提供一種編碼上述抗體的核酸分子。一旦所述抗體被分離，編碼所述抗體的基因即可被分離，并且該核酸序列將被確定。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種能夠特異性雜交如上所述分子的核酸分子。所述核酸分子包括，但不限于，合成DNA或RNA、基因組DNA、cDNA和RNA。本發(fā)明還纟是供一種包括上述核酸分子或其一部分的載體。該部分可以是執(zhí)行某種功能的功能性部分。片段或部分序列能夠編碼一種功能性的蛋白的功能性結(jié)構(gòu)域。在一種實(shí)施方案中，所述載體是表達(dá)載體，由此，可以表達(dá)核酸分子編碼的蛋白。本發(fā)明更進(jìn)一步包括一種包含上述核酸分子的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以用于表達(dá)。載體是本領(lǐng)域中眾所周知的。參見(jiàn)例如，Graupner，美國(guó)專利No.6，337，208,"CloningVector",2001年1月8日授權(quán)。也可參見(jiàn)，Schumacher等人,美國(guó)專利No.6，l卯，906,"ExpressionVectorfortheRegulatableExpressionofForeignGenesinProkaryotes",2001年2月20日授4又。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是質(zhì)粒。本發(fā)明提供一種制備抗體的方法，該抗體能夠與SARS-CoV刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)結(jié)合，從而竟?fàn)幮缘匾种芐ARS-CoV結(jié)合到宿主細(xì)胞，所述方法包括可#:作地連接如上所述的核酸分子到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件，從而表達(dá)所述抗體；將所述連接的核酸分子置于允許所述抗體表達(dá)的適宜條件下；和回收所述表達(dá)的抗體，由此制得所述抗體。本發(fā)明還提供了一種通過(guò)上述方法制備的抗體。雜交瘤細(xì)胞系32H5(Conf1)、31H12(Conf11)、18D9(ConfIII)、30F9(ConfIV)、33G4(ConfV)和19B2(ConfVI)于2005年1月13日保存入美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110,美國(guó)。該中心是根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定的用于專利程序中的國(guó)際上認(rèn)可的微生物保藏機(jī)構(gòu)。細(xì)胞系32H5(Conf1)、31H12(Conf11)、18D9(ConfIII)、30F9(ConfIV)、33G4(ConfV)和19B2(ConfVI)分別獲得ATCC保藏號(hào)PTA-6525、PTA-6524、PTA-6521、PTA-6523、PTA-6526和PTA-6522。本發(fā)明也提供通過(guò)上述單克隆抗體識(shí)別的表位。在序列上或構(gòu)象上，所述表位對(duì)診斷或治療的用途很重要。本發(fā)明提供一種包括有效量的上述單克隆抗體和適宜載體的組合物。該有效量可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。本發(fā)明另外提供一種包括有效量的上述單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。用于此處的藥學(xué)上可接受的載體是指任何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體。適宜載體的例子是本領(lǐng)域眾所周知的，其可以包括，但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，例如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液，包含Polysorb80的磷酸鹽緩沖液，水，乳劑例如油/水乳劑，以及各種潤(rùn)濕劑。其它的載體還可以包括無(wú)菌溶液、片劑、包衣片劑和膠嚢。典型地，這樣的載體包含賦形劑，例如淀粉、乳、糖、特定類型的粘土、凝膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸朽、滑石粉、植物脂或油、樹膠、二醇或其它已知的賦形劑。所述載體還可包括風(fēng)"^未和顏色添加劑或其它成分。根據(jù)眾所周知的常規(guī)方法配制包含所述載體的組合物。本發(fā)明還提供一種使用上述藥物組合物治療SARS-CoV感染的方法。本發(fā)明另外提供一種使用上述藥物組合物預(yù)防SARS-CoV感染的方法。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)SARS-CoV(或SARS-CoV感染細(xì)胞)的方法，該方法包括，在允許能夠結(jié)合所述病毒刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的抗體或其衍生物，與SARS-CoV的S蛋白的RBD之間形成復(fù)合物的條件下，接觸所述抗體或其衍生物；并且檢測(cè)形成的復(fù)合物。最后，本發(fā)明提供一種用于篩選能夠通過(guò)阻斷所述病毒與宿主細(xì)胞上受體的結(jié)合，從而抑制SARS-CoV感染的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)建立一種用于使所述抗體結(jié)合到SARS-CoV及刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的體系；和(b)使所述化合物上述(a)的體系接觸，由此，上述抗體與SARS-CoV的S蛋白的RBD結(jié)合的降低表明所述化合物能夠干擾所述的結(jié)合，由此抑制SARS-CoV的S蛋白的RBD的感染。本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選得到的化合物，該化合物可用于治療或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)。本發(fā)明提供一種包括隔室的試劑盒，所述隔室含有能夠識(shí)別SARS病毒的抗體和/或一種能夠竟?fàn)幮缘匾种扑隹贵w的結(jié)合的物質(zhì)。本發(fā)明證實(shí)，所述受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)包含多個(gè)構(gòu)象依賴性的中和表位，所述表位誘導(dǎo)一組有效的中和單克隆抗體(mAb),該抗體可用于治療、診斷和預(yù)防SARS。參考隨后的實(shí)驗(yàn)描述，能夠更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地明白，這些具體實(shí)驗(yàn)的描述僅僅是說(shuō)明性的，并不意味著限制在此描述的本發(fā)明，本發(fā)明將通過(guò)隨后的權(quán)利要求被定義。實(shí)驗(yàn)詳述通過(guò)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與Balb/c小鼠脾細(xì)胞的融合而制備27個(gè)雜交瘤克隆，該Balb/c小鼠脾細(xì)胞通過(guò)一種包含連接到人IgGlFc片段的SARS-CoV刺突(S)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的融合蛋白(命名為RBD-Fc)來(lái)免疫。在這27個(gè)由所述雜交瘤克隆產(chǎn)生的單克隆抗體(mAb)中，除了與相鄰的線性表位結(jié)合的2個(gè)mAb外，全部其它mAb均識(shí)別構(gòu)象依賴性表位?；诮Y(jié)合竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)的結(jié)果，這25個(gè)構(gòu)象特異性的mAb可以被分成6組，定義為Confl-VI。ConfIV和ConfV的mAb能夠顯著性地阻斷RBD-Fc與ACE2的結(jié)合，該ACE2為SARS-CoV的受體，揭示它們的表位與S蛋白中的受體結(jié)合位點(diǎn)相重疊。大多數(shù)識(shí)別該構(gòu)象性表位的mAb(23/25)具有有效的抗SARS假病毒的中和活性，其50。/o中和劑量(ND5o)范圍為0.005到6.569jug/ml。這些SARS-CoV中和mAb可用于l)作為用于SARS-CoV感染早期治療的免疫治療劑；2)作為用于診斷SARS-CoV感染的生物試劑；和3)作為用于研究SARS-C:oV的S蛋白的免疫原性、抗原性、結(jié)構(gòu)與功能的探針。此外，這些鼠mAb可以被人源化而用于治療和預(yù)防SARS-CoV感染。材料和方法V、扃Wi瘦^m^W,4:在MLP+TDM佐劑系統(tǒng)(Sigma,SaintLouis,MI)存在下用20|ig如前所述(35)制備的蛋白A瓊脂糖凝膠純化的RBD-Fc皮下免疫五只Balb/c小鼠(4周齡)，然后每隔3周使用10jLig同樣的抗原加MLP+TDM佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。收集小鼠的抗血清以檢測(cè)抗RBD抗體和SARS-CoV中和抗體。用于制備抗RBD的mAb的雜交瘤用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)生產(chǎn)。筒而言之，獲取來(lái)自于所述免疫小鼠的脾細(xì)胞，并將其與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。使用如前所述制備的SK9(3$)作為包被抗原，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)篩選來(lái)10自于包含雜交瘤克隆的孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。擴(kuò)增并再檢測(cè)來(lái)自陽(yáng)性孔的細(xì)胞。亞克隆所述保持陽(yáng)性的培養(yǎng)物，以產(chǎn)生穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系。所有的mAb是通過(guò)蛋白A瓊脂糖凝膠4速流儀(ProteinASepharose4FastFlow)(AmershamBiosciences)從培養(yǎng)物上清液中純化的。通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠血清或mAb與各種抗原的反應(yīng)性。簡(jiǎn)而言之，在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH值9.6)中分別使用1Mg/ml的重組蛋白(RBD-Fc或Sl-C9)或純化的人IgG(Zymed，SouthSanFrancisco,CA)包被96孔微量滴定板(CorningCostar,Acton，MA),于4。C過(guò)夜。在使用2%的脫脂乳阻斷后，加入系列稀釋的小鼠血清或mAb,并在37。C孵化1小時(shí)，接著用含0.1。/。吐溫20的PBS液洗滌四次。通過(guò)HRP-聯(lián)結(jié)的山羊抗小鼠lgG(Zymed)于37。C下檢測(cè)結(jié)合的抗體1小時(shí)，然后洗滌。加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)基質(zhì)來(lái)顯示反應(yīng)，并使用酶標(biāo)平板閱讀儀(ELISAplatereader)(TecanUS,ResearchTrianglePark,NC))測(cè)定450納米下的吸光度。為了檢測(cè)RBD中二硫鍵還原對(duì)結(jié)合RBD特異性mAb的影響，用重組RBD-Fc或Sl-C9在llig/ml濃度下包^ELISA平板，然后以10mM濃度的二硫蘇糖醇(DTT)在37。C下處理1小時(shí)，然后洗滌。接著在37。C下用50mM碘乙酰胺處理所述的孔l小時(shí)。洗滌后，如上所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA^r測(cè)。用竟?fàn)幮缘腅LISA來(lái)測(cè)定RBD特異性mAb對(duì)生物素標(biāo)記的mAb與RBD-Fc結(jié)合的抑制活性。簡(jiǎn)而言之，該ELISA平板孔用如上所述的1jig/ml的RBD-Fc包被。加入一種包含50)ig/ml的未標(biāo)記mAb和l|ig/ml生物素標(biāo)記的mAb的混合物，然后在37。C下孵化1小時(shí)。依次加入HRP結(jié)合的鏈酶親和素(Zymed)和TMB后，檢測(cè)所述生物素標(biāo)記的mAb的結(jié)合。根據(jù)廠家的方案，使用EZ-linkNHS-PEO固相生物素標(biāo)記試劑盒(Pierce，Rockford,IL)進(jìn)行mAb的生物標(biāo)記。SJiS痕病善^襲的^和使用活的SARS-CoV的常規(guī)中和試驗(yàn)較為繁瑣并且必須在BSL-3設(shè)備中進(jìn)行。我們?yōu)榇嗽诒緦?shí)驗(yàn)室中建立了一種SARS-CoV假病毒體系(27，32,42,43)。該試驗(yàn)敏感而且定量，并且可以在BSL-2設(shè)備中進(jìn)行。如前所述，制備帶有SARS-CoV的S蛋白和一種表達(dá)熒光素酶作為報(bào)道基因的缺陷型HIV-1基因組的SARS假病毒(27,42,43)。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)編碼密碼子最佳化的SARS-CoV的S蛋白的質(zhì)粒和一種編碼Env-缺失的、熒光素酶-表達(dá)性HIV-1基因組(pNL4-3.1uc.RE)以Fugene6試劑(BoehringerMannheim)共同轉(zhuǎn)染"3T細(xì)胞。收獲48小時(shí)后轉(zhuǎn)染的包含SARS假病毒的上清液，并將其用于ACE2轉(zhuǎn)染的293T(293T/ACE2)細(xì)胞的單循環(huán)感染。簡(jiǎn)而言之，在96孔組織培養(yǎng)板中以10"細(xì)胞/孔濃度培養(yǎng)293T/ACE2細(xì)胞，并且生長(zhǎng)過(guò)夜。在加入細(xì)胞前，將包含假病毒的上清液用2倍系列稀釋的小鼠血清或mAb于37。C下預(yù)孵化1小時(shí)。隨后以新鮮培養(yǎng)基再次喂飼所述培養(yǎng)物24小時(shí)，并且再孵化48小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞并使用溶解試劑將其溶解，所述溶解試劑包含在一種熒光素酶試劑盒(Promega,Madison,WI)中。細(xì)胞溶解產(chǎn)物的等分試樣被轉(zhuǎn)移到可在發(fā)光計(jì)中檢測(cè)的96孔平底板(CorningCostar,Coming,NY)中，接著加入熒光素酶基質(zhì)(Promega)。立即在Ultra384發(fā)光計(jì)(TecanUS)中測(cè)定相對(duì)光照單位(RLU)。m」6對(duì)i^Z)-Fc々愛(ài)傳^潛合通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)^r測(cè)mAb對(duì)RBD-Fc與ACE2-表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抑制。簡(jiǎn)而言之，分離并收集到1(^的293T/ACE2細(xì)胞，并且用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)(Sigma,St,Louis,MO)洗滌。在存在或不存在50|ag/ml的mAb的情形下，將RBD-Fc加入所述細(xì)胞至終濃度為ljiig/ml，接著在室溫下孵化30分鐘。用HBSS洗滌細(xì)胞，并且以抗人IgG-FITC軛合物(Zymed)于l:50稀釋度在室溫下再孵化30分鐘。洗滌后，用含有1。/。曱醛的PBS固定細(xì)胞，然后使用CellQuest軟件在BectonFACSCalibur流式細(xì)胞儀(MountainView,CA)中分析。通過(guò)ELISA檢測(cè)mAb對(duì)RBD-Fc與可溶性ACE2結(jié)合的抑制。簡(jiǎn)而言之，在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中，將2jig/ml重組的可溶性ACE2(R&Dsystems,Inc.,Minneapolis,MN)包被至96孔ELISA板(ComingCostar)，4。C過(guò)夜。以2%脫脂牛奶封閉后，在存在或不存在50iag/ml小鼠mAb的情形下，將liig/mlRBD-Fc加入到所述孔內(nèi)，并且在37。C下孵化1小時(shí)。洗滌后，加入HRP-結(jié)合的山羊抗人IgG(Zymed)，且再孵化l小時(shí)。洗滌后，使用基質(zhì)TMB來(lái)檢測(cè)。結(jié)果7^Z)#;^/i^^6W為、岸及初始或在在293T細(xì)胞中短暫表達(dá)，并以蛋白A純化得到均一的RBD-Fc融合蛋白。在Ribi佐劑存在下，以RBD-Fc免疫五只小鼠(A到E)4次。初次加強(qiáng)免疫化后，所有動(dòng)物均顯示出可被觀察到的抗RBD-Fc的抗體反應(yīng)，并且其抗體效價(jià)隨著之后的免疫而增加。第三次加強(qiáng)免疫后，收集4天的抗血清，顯示出高度有效的抗SARS-CoV和帶有SARS-CoVS蛋白的假病毒的中和活性。通過(guò)RBD-Fc免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合制備一組27個(gè)RBD特異性mAb,并且隨后以Sl-C9作為抗原篩選雜交瘤。該mAb的表位特異性通過(guò)ELISA而最初確定，該ELISA使用RBD-Fc、DTT-還原的RBD-Fc、Sl-C9、DTT-還原的Sl-C9以及純化的人IgG作為包被抗原(表I)。大部分的mAb(25/27)與天然的RBD-Fc和Sl-C9呈反應(yīng)性，但是與DTT還原的RBD-Fc和Sl-C9不反應(yīng)。這表明它們是針對(duì)S蛋白R(shí)BD上表達(dá)的二硫鍵依賴性的構(gòu)象性表位。其它兩個(gè)mAb(4D5和17H9)則既識(shí)別天然的又識(shí)別還原的RBD-Fc和S1-C9,這表明它們是針對(duì)RBD上存在的線型表位。Sl-C9篩選到與人IgG不反應(yīng)的mAb,而來(lái)自于RBD-Fc免疫小鼠的對(duì)照抗血清則可與人IgG起反應(yīng)(表1)。由于mAb4D5和17H9可以與所述還原的RBD-Fc和Sl-C9起反應(yīng)，它們的表位可以用合成肽來(lái)定位。通過(guò)ELISA,用一組27個(gè)覆蓋S蛋白R(shí)BD的重疊肽來(lái)定位4D5和17H9的表位。如圖1所示，4D5與肽435-45l(NYNYKYRYLRHGKLRPF)起反應(yīng)，而17H9與兩個(gè)重疊肽442-458(YLRHGKLRPFERDISNV)和449-465(RPFERDISNVPFSPDGK)起反應(yīng)。17H9的表位被清楚地定位于肽442-458和449-465的重疊序列(RPFERDISNV)上，而4D5的表位需要肽435-451的大部分序列，其與肽442-458和449-465的部分序列重疊。因此，這兩種mAb識(shí)別RBD內(nèi)的鄰近線型表位。構(gòu)象依賴性mAb與任何被測(cè)試的肽段都不反應(yīng)(未顯示數(shù)據(jù))。遞過(guò)潛合《爭(zhēng)試發(fā)源;Ci5D##遂^或在掙并^為了確定構(gòu)象依賴性表位的特性，通過(guò)結(jié)合竟?fàn)幵囼?yàn)將所述RBD特異性mAb分組(表11)。首先用生物素標(biāo)記其中一個(gè)mAb(10E7),且測(cè)定27個(gè)mAb對(duì)10E7與RBD-Fc結(jié)合的抑制活性。mAb4D5和17H9識(shí)別通過(guò)上述肽定位的線型表位，在竟?fàn)幵囼?yàn)中作為對(duì)照。約一半的構(gòu)象依賴性rnAb(13/25)與生物素標(biāo)記的10E7竟?fàn)?，而其它的mAb并不阻斷10E7與RBD-Fc的結(jié)合。隨后用生物素標(biāo)記另外四個(gè)非竟?fàn)幮詍Ab(l1E12、33G4、45B5和17H9)，并且通過(guò)結(jié)合竟?fàn)幵囼?yàn)進(jìn)行類似的檢測(cè)。與生物素標(biāo)記的10E7竟?fàn)幍?3個(gè)mAb中的5個(gè)，也阻斷生物素標(biāo)記的45B5與RBD-Fc的結(jié)合，并且被定義為一個(gè)單獨(dú)的組。由此，將25個(gè)構(gòu)象特異性的mAb分為六個(gè)不同的竟?fàn)幗M(定義為ConI-VI)。兩個(gè)線型表位特異性的mAb(4D5和17H9)不與任何構(gòu)象特異性mAb竟?fàn)?。這些結(jié)果表明，S蛋白的RBD包含多個(gè)抗原結(jié)構(gòu)，這些抗原結(jié)構(gòu)在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性的抗體反應(yīng)。然而，RBD中的優(yōu)勢(shì)免疫表位是構(gòu)象依賴性的。逸錄f糸潛合W^46W《在RBD-Fc能夠有效地結(jié)合至表達(dá)在293T/ACE2細(xì)胞上的ACE2以及可溶性的ACE2，這可以分別通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)(未顯示數(shù)據(jù))。我們檢測(cè)了RBD特異性的mAb是否抑制RBD-Fc與細(xì)胞相關(guān)性的或可溶性的ACE2的結(jié)合。如圖2所示，以一種高度一致的方式，全部的來(lái)自于ConfIV(28D6、30F9和35B5)和ConfV(24F4、33G4和38D4)的mAb均能完全阻斷RBD-Fc與細(xì)胞相關(guān)性的和可溶性的ACE2的結(jié)合。全部的兩種ConfIII制RBD-Fc與表達(dá)在293T/AEC2細(xì)胞上的ACE2和可溶性的ACE2的結(jié)合。所有其他的mAbs，包括兩個(gè)抗線性序列的mAb在內(nèi)，對(duì)于受體的結(jié)合沒(méi)有顯著抑制作用。這些結(jié)果顯示，ConfIV和ConfVmAb識(shí)別的表位可能與S蛋白內(nèi)的構(gòu)象性受體結(jié)合位點(diǎn)相重疊。雖然在結(jié)合竟?fàn)幵囼?yàn)中，這些mAb并不彼此相互竟?fàn)帉?duì)抗。ConfIIImAb和兩種ConfVImAb(19B2和45F6)也可與所述參與受體結(jié)合的構(gòu)象性表位結(jié)合。全部的ConfI和ConfIImAb均不阻斷受體的結(jié)合，這表明它們識(shí)別的構(gòu)象性表位與RBD中的所述受體結(jié)合位點(diǎn)重疊。這些結(jié)果揭示了RBD特異性mAb的表位異質(zhì)性，并且進(jìn)一步表明了S蛋白的RBD中包含多個(gè)抗原性構(gòu)象。朋D掙并控附屈J^"才放的尹和法絲檢測(cè)每個(gè)RBD特異性mAb的抗SARS假病毒的中和活性。值得注意的是，絕大多數(shù)的構(gòu)象依賴性mAb(23/25)具有有效的中和活性,其50%中和劑量(NDso)范圍為0.005至6.569(ig/ml(表ni),而兩個(gè)直接抗線型表位(4D5和17H9)的mAb和一個(gè)來(lái)自于ConfVI的mAb(44B5)在濃度高達(dá)100"g/ml下不中和SARS假病毒感染。阻斷該受體結(jié)合的來(lái)自ConfV的mAb33G4和14來(lái)自ConfIV的30F9具有最高的抗假病毒中和活性。有趣的是，甚至具有相對(duì)較低,￡病毒中和活性的來(lái)自ConfVI的45F6能部分地阻斷RBD-Fc與ACE2的結(jié)合。每組中若干具代表性的mAb的劑量依賴性的中和活性列于圖3。這些結(jié)果表明，S蛋白的RBD主要誘導(dǎo)針對(duì)構(gòu)象性表位的中和抗體。扭#論新近的研究顯示，SARS-CoV的S蛋白是在感染期間引起免疫反應(yīng)的主要抗原之一(44-46)。這表明S蛋白可以作為誘導(dǎo)中和mAb的免疫原。在該研究中，我們使用一種重組融合蛋白R(shí)BD-Fc作為免疫原來(lái)免疫小鼠，并且產(chǎn)生用于制備27種mAb的雜交瘤克隆。這些mAb中的大部分(25/27)識(shí)別構(gòu)象性表位，其中23個(gè)mAb具有有效的中和活性。發(fā)現(xiàn)僅有兩種mAb通過(guò)重疊肽映射到相鄰的線型表位上，其不能中和SARS假病毒的感染。有趣的是，基于結(jié)合竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)，所述構(gòu)象依賴性mAb可以被分成6個(gè)不同的組(即，ConfI-VI)，這揭示在可以引起中和抗體的RBD上，有若干種不同的構(gòu)象性表位。用(ACE2為SARS-CoV的功能性受體)。然而，我們發(fā)現(xiàn)只有識(shí)別ConfIV和V的mAb能夠有效地阻斷RBD與ACE2的結(jié)合。一些與ConfIII和VI反應(yīng)的mAb部分地抑制RBD與ACE2之間的相互作用，這表明其表位可能與RBD上的受體結(jié)合位點(diǎn)相重疊，或者這些mAb與RBD的結(jié)合可能導(dǎo)致該受體結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象改變，引起對(duì)RBD與ACE2的結(jié)合的抑制。識(shí)別ConfI和II的mAb對(duì)RBD與ACE2的結(jié)合沒(méi)有顯著性的影響，而且具有有效的中和活性，表明這些mAb抑制SARS-CoV感染而不干擾RBD-ACE2相互作用。這些mAb的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索。這些數(shù)據(jù)表明，RBD誘導(dǎo)的中和抗體不僅對(duì)所述受體結(jié)合位點(diǎn)是特異的，而且對(duì)其它獨(dú)特結(jié)構(gòu)構(gòu)象也是特異的，這闡明了其抗原異質(zhì)性，并且揭示了SARS-CoV的S蛋白的RBD包含多個(gè)負(fù)責(zé)誘導(dǎo)有效的中和抗體反應(yīng)的構(gòu)象性表位。這里描述的SARS-CoV中和mAb的構(gòu)象敏感性，與其它包膜病毒誘生的中和mAb的性能是一致的，而所述的其它包膜病毒一般要求更加天然的用于結(jié)合的構(gòu)象(47，48)。盡管SARS-CoVS蛋白的RBD是一種193個(gè)氨基酸的小片段，但其包含七個(gè)半胱氨酸，并且其中五個(gè)對(duì)ACE2結(jié)合是必需的。這些半胱氨酸之間的二硫鍵可形成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以構(gòu)建出多種抗原性構(gòu)象。然而，選自非免疫性人抗體文庫(kù)的中和人mAb能夠與DDT-還原的S蛋白反應(yīng)并且阻斷受體的結(jié)合(49)。因此，需要進(jìn)一步的特征來(lái)定義SARS-CoVS蛋白的RBD上的中和決定簇，并且這可提供用于開發(fā)抗SARS治療劑和疫苗的關(guān)鍵信息。據(jù)報(bào)導(dǎo)，小鼠免疫血清的被動(dòng)轉(zhuǎn)輸可減少SARS-CoV接種小鼠的肺病毒的復(fù)制(33，50)，中和mAb的預(yù)防性給藥可在小鼠或雪貂(51,52)體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)作用，這揭示了抗SARS抗體的被動(dòng)免疫是一種控制SARS的可行策略。因此，具有高SARS-CoV中和活性的mAb可用于SARS-CoV感染的早期治療。然而，由于人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)(53-55)的存在，人體內(nèi)的鼠mAb的應(yīng)用將會(huì)受到限制。如果僅僅小劑量的鼠mAb被短期(一個(gè)到兩個(gè)星期)用于早期的SARS-CoV感染中，可能不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的HAMA,而這緊急的治療可能挽救SARS患者的生命。我們已經(jīng)在Hantaan病毒(HTNV)感染的早期治療中采取了相似的策略，即使用鼠抗HTNV的mAb(56)。此外，可以將所述的鼠中和mAb人源化作為治療劑或免疫預(yù)防劑，為處于危險(xiǎn)中的人群提供抗SARS-CoV感染的立即保護(hù)。本研究的重要意義有三層第一、生產(chǎn)了許多高效的RBD特異性中和mAb，其可開發(fā)為用于SARS緊急治療的免疫治療劑。第二、這些mAb可開發(fā)為用于檢測(cè)SARS-CoV感染的診斷試劑。第三、這些mAb可用作研究SARS-CoVS蛋白的免疫原性、抗原性、結(jié)構(gòu)和功能的探針。這些mAb可被進(jìn)一步人源化而用于治療和預(yù)防SARS。16表I、RBD特異性mAb抗不同抗原的反應(yīng)性a<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>.使用的抗原為ljig/ml，被測(cè)mAb為10jag/邁l，且血清于l:IOO稀釋度下檢測(cè)。陽(yáng)性反應(yīng)以黑體字突出顯示。表II、RBD特異性mAb對(duì)生物素化mAb與RBD-Fca的結(jié)合的抑制。/。a組竟?fàn)幮詍Ab生物素化的mAb10E711E1233G445B517H9Confl9F784.5".7-13.322.316.410E791.05.6-12.921,09.912B11肪,819.3-0.219.821,018C284.919.34.918.119.424H893.724.07.025.622.126E1站.110.537.430.425.029G296.620.41.611.423.532H598.918.54.49,120.3Confll20E797.238.55.973,024.626A496.333.1-0.560.019.027C197,236.714.673.720.931H1297.518,77.158.419.730E1098.319.312.968.924.6Conflll11E1212.692.00.3"3.720.218D9-16.298.38-323.617.1ConflV28D639.799,613.867.426.630F928.7100.08.7沐032.435B534.999.910.064.733.6ConfV24F411.5-1.0訴.52.524.933G49.53.799.526.429.138D48.1-14-482.0-5.115.8ConfVI13B623.310.74.972.512.619B22.9-26.418.050.016.144B525.3-20.610.095.619.445F625.7-10.410.894.823.5線型4D513.010.6-11.11.0-10.517H917.833.3-5.825.097.8a于100jjg/ml下，通過(guò)ELISA檢測(cè)竟?fàn)幮詍Ab的阻斷該生物素化mAb與RBD-Fc結(jié)合的能力。大于4(W抑制率被認(rèn)為是陽(yáng)性竟?fàn)幍?數(shù)值見(jiàn)表)。負(fù)數(shù)表示增加生物素化試劑的結(jié)合。表III、抗SARS假病毒的RBD特異性mAb的—中和活性—<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>參考文獻(xiàn)1.Drosten，C,S.Gunther，W.Preiser,W.S.VanDer,H.R.Brodt，S.Becker,H.Rabenau，M.Panning,LKolesnikova，R.A.Fouchier,A.Berger，A.M.Burguiere，J.Cinatl,M.Eickmann,N.Escriou,K.Grywna，S.Kramme，J.C.Manuguerra，S.Muller,V.Rickerts，M.Sturmer,S.Vieth，H.D.Klenk，A.D.Osterhaus,H.Schmitz,andH.W.Doerr.2003.Identificationofanovelcoronavirusinpatientswithsevereacuterespiratorysyndrome.N.EnglJ.Med.348:1967-1976.2.Ksiazek，T.G.，D.Erdman，CS.Goldsmith,S.R.Zaki，T.Peret,S.Emery,S.Tong,C.Urbani,J.A.Comer,W.Lim,P.E.Rollin，S.F.Dowell,A.E.Ling,CD.Humphrey,WJ.Shieh,J.Guarner，CD.Paddock,P.Rota,B.Fields,J.DeRisi，J.Y.Yang,N.Cox，J.M.Hughes,J.W.LeDuc，WJ.Bellini,andLJ.Anderson.2003.Anovelcoronavirusassociatedwithsevereacuterespiratorysyndrome.N.Engl.J.Med.348:1953-1966.3.Peiris,J.S.，S.T.Lai，L丄Poon，Y.Guan,L.Y.Yam，W.Lim,J.Nicholls，W.K.Yee，W.W.Yan,M.T.Cheung,V.CCheng,K.H.Chan，D.N.Tsang，R.W.Yung,T.K.Ng，andK.Y.Yuen.2003.Coronavirusasapossiblecauseofsevereacuterespiratorysyndrome.Lancet361:1319-1325.4.Marra，M.A.,SJ.M.Jones，CR.Astell，R丄Holt，A.Brooks-Wilson,Y.S.N.Butterfield，J.Khattra，J.K.Asano,S.A.Barber,S.Y.Chan,A.Cloutier，S.M.Coughlin,D.Freeman,N.Girn，0.L.Griffith,S.R.Leach，M.Mayo,H.McDonald,S.B.Montgomery,P.K.Pandoh，A.S.Petrescu,A.G.Robertson,J.E.Schein,A.Siddiqui,D.E.Smailus,J.M.Stott，G.S.Yang,F.Plummer,A.Andonov,H.Artsob，N.Bastien,LBernard,T.F.Booth,D.Bowness,M.Czub，M.Drebot，L.Fernando,R.Flick,M.Garbutt,M.Gray,A.Grolla,S.Jones,H.Feldmann，A.Meyers:A.Kabani,Y，Li，S.Normand,U.Stroher,G.A.Tipples,S.Tyler,R.Vogrig,D.Ward,B.Watson,R.C.Brunham，M.Krajden,M.Petric，D.M.Skowronski,CUpton,andR丄Roper.2003.ThegenomesequenceoftheSARS-associatedcoronavirus.Science300:1399-1404.5.Rota,P.A.,M.S.0berste，S.S.Monroe,W.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roandinvivoprotectiveactivityofmonoclonalantibodiesdirectedagainstHantaanvirus:potentialapplicationforimmunotherapyandpassiveimmunization.Biochem.Biophys.Res.Commun.298:552-558.2權(quán)利要求1、一種分離抗體，該抗體能夠與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或一種抗體，該抗體能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)與宿主細(xì)胞上的受體或無(wú)細(xì)胞受體結(jié)合。2、一種包括權(quán)利要求l的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)的物質(zhì)，其能夠結(jié)合至與權(quán)利要求1的抗體相同的表位，或能夠竟?fàn)幮缘匾种扑霰砦坏慕Y(jié)合。3、權(quán)利要求2的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)是抗體。4、權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是中和的。5、一種通過(guò)ATCC保藏號(hào)為PTA-6521的雜交瘤18D9制備的抗體。6、權(quán)利要求5的抗體識(shí)別的表位。7、一種通過(guò)ATCC保藏號(hào)為PTA-6522的雜交瘤19B2制備的抗體。8、權(quán)利要求7的抗體識(shí)別的表位。9、一種通過(guò)ATCC保藏號(hào)為PTA-6523的雜交瘤30F9制備的抗體。10、權(quán)利要求9的抗體識(shí)別的表位。11、一種通過(guò)ATCC保藏號(hào)為PTA-6524的雜交瘤31H12制備的抗體。12、權(quán)利要求ll的抗體識(shí)別的表位。13、一種通過(guò)ATCC保藏號(hào)為PTA-6525的雜交瘤32H5制備的抗體。14、權(quán)利要求13的抗體識(shí)別的表位。15、一種通過(guò)ATCC保藏號(hào)為PTA-6526的雜交瘤33G4制備的抗體。16、權(quán)利要求15的抗體識(shí)別的表位。17、權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體或抗體融合構(gòu)建體。18、權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。19、權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。20、權(quán)利要求l的分離抗體，其中所述抗體直接或間接地偶聯(lián)于細(xì)胞毒素試劑。21、一種包含權(quán)利要求l的抗體的細(xì)胞。22、一種編碼權(quán)利要求l的抗體的核酸分子。23、一種能夠特異性雜交權(quán)利要求22的分子的核酸分子。24、權(quán)利要求22的核酸分子，其中它是合成DNA、基因組DM、cDNA或RNA。25、一種包含權(quán)利要求24的核酸分子或其一部分的載體。26、一種包含權(quán)利要求24的核酸分子的細(xì)胞。27、一種用于制備能夠與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或能夠竟?fàn)幮缘匾种茋?yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)與宿主細(xì)胞結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括可操作地連接權(quán)利要求22的核酸分子到適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件，從而表達(dá)所述抗體；將所述連接的核酸分子置于允許所述抗體表達(dá)的適宜條件下；和回收所述表達(dá)的抗體，由此制得所述抗體。28、通過(guò)權(quán)利要求27的方法制備的抗體。29、一種包括有效量的權(quán)利要求l的抗體和適宜載體的組合物。30、一種包括有效量的權(quán)利要求1的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。31、一種用于治療嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)感染的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求30的藥物組合物。32、一種用于預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)感染的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求30的藥物組合物。33、一種用于檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)或SARS-CoV感染細(xì)胞的方法，所述方法包括，在允許能夠與所述病毒刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或其衍生物與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間形成復(fù)合物的條件下，接觸所述抗體或其衍生物；并且檢測(cè)形成的復(fù)合物。34、一種用于篩選能夠通過(guò)阻斷嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒與宿主細(xì)胞上受體的結(jié)合，從而抑制所述病毒感染的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a)建立一種用于使權(quán)利要求l的抗體結(jié)合到嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的體系；和(b)使所述化合物與上述(a)的體系接觸，權(quán)利要求1的抗體與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的降低表明，所述化合物能夠干擾所述的結(jié)合并且抑制嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的感染。35、由權(quán)利要求34的方法得到的化合物。36、一種包括含有權(quán)利要求l的抗體的隔室的試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供一種分離的抗體，該抗體能夠與嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制SARS-CoV與宿主細(xì)胞的結(jié)合。這些mAb或物質(zhì)可用于1)作為預(yù)防SARS-CoV感染的被動(dòng)免疫性試劑；2)作為診斷SARS-CoV感染的生物學(xué)試劑；3)作為SARS-CoV感染早期治療的免疫治療劑；以及4)作為研究SARS-CoVS蛋白的免疫原性、抗原性、結(jié)構(gòu)及其功能的探針。文檔編號(hào)A61K39/00GK101522208SQ200680004376公開日2009年9月2日申請(qǐng)日期2006年2月8日優(yōu)先權(quán)日2005年2月8日發(fā)明者何玉先,姜世勃申請(qǐng)人:紐約血庫(kù)公司