專利名稱：用基質(zhì)金屬蛋白酶拮抗劑抑制her2脫落的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)注使用基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)尤其是MMP-15的拮抗劑來(lái)抑 制HER2脫落。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶的HER家族是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介質(zhì)。該 受體家族包括四個(gè)截然不同的成員，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR、. ErbBl 或HER1 )、 HER2 (ErbB2或pi 85"e" )、 HER3 ( ErbB3 )和HER4 (ErbB4或 tyro2 )。
由eABl基因編碼的EGFR已經(jīng)在原因上與人惡性腫瘤聯(lián)系起來(lái)。具體 而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成"交質(zhì)細(xì)月包瘤中觀j 察到EGFR表達(dá)升高。EGFR受體表達(dá)升高常常與同 一腫瘤細(xì)胞的EGFR配 體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a(TGF-a)的產(chǎn)量升高有關(guān)，通過(guò)自分泌刺激途徑導(dǎo)致受體 活化。Baselga and Mendelsohn, P/zwtt^c. T7^k 64: 127-154 (1994)。針對(duì)EGFR 或其配體TGF-a和EGF的單克隆抗體已經(jīng)作為此類惡性腫瘤治療中的治療 劑進(jìn)4亍了^H古。參見(jiàn)例長(zhǎng)口 Baselga and Mendelsohn,見(jiàn)上文；Masui a/.， C""cwi e化"n^ 44: 1002-1007 (1984); Wu "a/,, / C7/w. /"vesf. 95: 1897-1905 (1995)。
HER家族的第二個(gè)成員pl85"e"最初鑒定為來(lái)自化學(xué)處理大鼠的成神經(jīng) 細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。恥"原癌基因的活化形式源自所編碼蛋白質(zhì)跨膜 區(qū)中的點(diǎn)突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中觀察到"ew的人 同系物的擴(kuò)增，而且這與不良預(yù)后有關(guān)(Slamon " a/., 5Wence 23 5: 177-182 (1987); Slamon " a/. 聰244: 707-712(1989);美國(guó)專利第4,968，603號(hào))。 迄今為止，對(duì)于人腫瘤尚無(wú)與wew原癌基因中類似的點(diǎn)突變的報(bào)道。在其它
癌中也已觀察到HER2的過(guò)表達(dá)(頻繁但不均一，原因在于基因擴(kuò)增)，包
括胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、曱狀腺、胰和膀胱的癌。參見(jiàn)
King " 5We臟229: 974 (1985); Yokota & "/.,丄騰& 1: 765-767 (1986); Fukushige"/., Mo/. Ce//萬(wàn)z'o/. 6: 955-958 (1986); Guerin e a/.， O cogewe 3: 21-31 (1988); Cohen d a/.， 4: 81-88 (1989); Yonemura ef
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Sadasivan^"/.， / f/ro/. 150: 126-31 (1993))。
針對(duì)大鼠pl85卿和人HER2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已有記載。 Drebin及其同事制備了針對(duì)大鼠mw基因產(chǎn)物pl85腦的抗體。參見(jiàn)例 ^口Drebin er a/.， Ce〃 41: 695-706 (1985); Myers " a/" Me仇198: 277-2卯(1991); WO 94/22478。 Drebin " a/" 2: 273-277 (1988)報(bào)道
了與pl85"e"的兩個(gè)不同區(qū)域有反應(yīng)性的抗體混合物對(duì)植入棵鼠的"ew轉(zhuǎn)化 的NIH-3T3細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。還可參見(jiàn)1998年10月20日公告的 美國(guó)專利第5，824,311號(hào)。
Hudziak"a/.,Mo/. CW/.所o/. 9(3): 1165-1172 (1989)描述了一組HER2抗 體的生成，并使用人乳腺腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3進(jìn)行了表征。將SK-BR-3細(xì) 胞暴露于抗體后72小時(shí)通過(guò)細(xì)胞單層的結(jié)晶紫染色測(cè)定了相對(duì)細(xì)胞增殖。 利用此測(cè)定法，用稱作4D5的抗體獲得了最大抑制，它抑制細(xì)胞增殖達(dá)56%。 該組其它抗體在此測(cè)定法中以較低程度降低細(xì)胞增殖。還發(fā)現(xiàn)抗體4D5使過(guò) 表達(dá)HER2的乳腺腫瘤細(xì)胞系對(duì)TNF-a的細(xì)胞毒性作用敏感化。還可參見(jiàn) 1997年10月14日公告的美國(guó)專利第5,677,171號(hào)。Hudziak等人的文章中 所討論的HER2抗體在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了進(jìn)一步表征Fendly " a/.， Owcer i 麼a廠c/2 50: 1550-1558 (1990); Kotts " a/，, /"版o 26(3): 59A (1990); Sarup " a/., G廠om^/z i egw/a"o" 1: 72-82 (1991); Shepard ef a/.,C7f". /mmwwo/. 11(3): 117-127 (1991); Kumar W a/., vWo/. CW/. S/o/. 11(2): 979-986 (1991); Lewis "
5
a/.， Cflwcw/附wwwo/. 7wmw"c^/2eK 37: 255-263 (1993); Pietras ef a/.， Owcoge"e 9: 1829-1838 (1994); Vitetta ef a/.， Ca"cer "e化^r/z 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski a/., 說(shuō)o/. C/zew. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott e/ a/., J ^/o/. C/^w. 266: 14300-5 (1991); D'souza a/.，iVaf/.爿cgc . 91: 7202-7206 (1994); Lewis " a/.， C麵er i e廳rc/z 56: 1457-1465 (1996); Schaefer e/a/.， Owcoge"e 15: 1385-1394 (1997)。
鼠HER2抗體4D5的重組人源化型式(huMAb4D5-8、 rhuMAb HER2、 Trastuzumab或HERCEPTIN ;美國(guó)專利第5,821,337號(hào))在臨床上對(duì)患有 HER2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌并已接受大量現(xiàn)有抗癌療法的患者起作用 (Baselga C7〖".14: 737-744 (1996) )。 Trastuzumab在1998年9
月25日得到了美國(guó)食品和藥品管理局的銷(xiāo)售許可，可用于治療其腫瘤過(guò)表 達(dá)HER2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。
下列文獻(xiàn)中記載了具有各種特性的其它HER2抗體Tagliabue w 乂 C騰w 47: 933-937 (1991); McKenzie d a/" O"cog認(rèn)4: 543-548 (1989); Maier d fl/" C"wcer51: 5361-5369 (1991); Bacus a/., Mo/ecw/ar C'"oge顧's 3: 350-362 (19%); Stancovski " "/.， 88: 8691-,5
(1991); Bacus a/.， Owcer i e艦rc/ 52: 2580-2589 (1992); Xu a/.，紋 / Ca匿r 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk " C離er i e織rc/z 52: 2771-2776 (1992); Hancock a/" C騰er M 51: 4575-4580 (1991); Shawver a/.， Cawcer 54: 1367-1373 (1994); Arteaga d a/" Cawcer 54: 3758-3765 (1994); Harwerth 腺.C/2流267: 15160-15167 (1992);美
國(guó)專利第5,783,186號(hào)；Klapper a/., O歸ge"e 14: 2099-2109 (1997)。
同源性篩選使得HER受體家族的兩個(gè)其它成員得以筌定HER3 (美國(guó) 專利第5,183,884和5,480,968號(hào)以及Kraus d "/., 7W^S (X/iX" 86: 9193-9197 (1989))和HER4(歐洲專利申請(qǐng)第599,274號(hào)；Plowman a/., iVoc.Jcad 5W. 90: 1746-1750 (1993); Plowman " a/" Atoww 366: 473-475 (1993))。 這兩種受體都在至少有些乳腺癌細(xì)胞系中展示出表達(dá)升高。
HER受體在細(xì)胞中通常以多種組合發(fā)現(xiàn)，而且認(rèn)為異二聚化增加了對(duì)各 種HER配體的細(xì)月包應(yīng)答的多樣性(Earp ^ a/.， Brea" Ca"cer i esearc/z 7>eWmem 35: 115-132 (1995))。 EGFR結(jié)合6種不同配體表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子oc(TGF-a)、雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF) 、 betacellulin和epiregulin ( Groenen ef a/., OowA Factor1 11: 235-257 (1994))。由單一基因的可變剪接產(chǎn)生的調(diào)蛋白蛋白質(zhì)家族是HER3 和HER4的配體。調(diào)蛋白家族包括a、 P和Y調(diào)蛋白(Holmes "a/., 5We"ce 256: 1205-1210(1992);美國(guó)專利第5,641,869號(hào);Schaefer ^a/., O腳g匿15: 1385-1394 (1"7)); neu分化因子(NDF);神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF);乙酰膽 堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA);及感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)。有關(guān)綜述 參見(jiàn)Groenen OowA Factora 11: 235-257 (1994); Lemke, G" Mo/ec. cfe
CW/. TVewmsc/. 7: 247-262 (1996); Lee da/.,i ev. 47: 51-85 (1995)。最近 鑒定了另外三種HER配體神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2),據(jù)報(bào)道它結(jié)合HER3 或HER4( Chang " 淑臟387: 509-512 (1997); Carraway ^ a/"淑wm 387: 512-516 (1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3，它結(jié)合HER4 ( Zhang " a/.，/W^SY"S力 94(18): 9562-7 (1997));和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4,它結(jié)合HER4 (Harari d a/., O coge"e 18: 2681-89 (1999))。 HB-EGF、 betacellulin和epiregulin也結(jié)合 HER4。
盡管EGF和TGFa不結(jié)合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成 異二聚體，它活化EGFR并導(dǎo)敢異二聚體中HER2的轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化作 用和/或轉(zhuǎn)磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。參見(jiàn)Earp"a/.，見(jiàn)上文。 同樣，當(dāng)HER3與HER2共表達(dá)時(shí)，形成有活性的信號(hào)復(fù)合物，而針對(duì)HER2 的抗體能夠破壞此復(fù)合物(Sliwkowski " "/., /歷o/. C/2e附.269(20): 14661-14665 (1994))。另外，在與HER2共表達(dá)時(shí)，HER3對(duì)調(diào)蛋白(HRG) 的親和力升高到更高的親和力狀態(tài)。關(guān)于HER2-HER3蛋白質(zhì)復(fù)合物還可參 見(jiàn)Levi d Jow/7 a/ o/A^wnwc/e"ce 15: 1329-1340 (1995); Morrissey ef a/" 尸rac. A^/.爿cad 5W. 92: 1431-1435 (1995》Lewis W a/" Owce廠A仏56: 1457-1465 (l996)。 HER4,與HER3類似，與HER2形成有活性的信號(hào)復(fù)合 物(Carraway and Cantley， Ce// 78: 5-8 (1994))。
圖4中描繪了 HER信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。
涉及HER抗體的專利出版物包括US 5,677,171; US 5,720,937; US 5,720,954; US 5,725,856; US 5,770,195; US 5,772,997; US 6,165,464; US 6，387，371; US 6,399,063; US 2002/0192211 Al; US 6,015,567; US 6，333，169; US 4,968,603; US 5,821,337; US 6,054,297; US 6,407,213; US 6,719,971; US 6,800,738; US 2004/0236078 Al; US 5，648，237; US 6,267,958; US6,685,940; US 6,821,515; WO 98/17797; US 6,127,526; US 6,333,398; US 6,797,814; US 6,339,142; US 6,417,335; US 6,489,447; WO 99/31140; US 2003/0147884 Al; US 2003/0170234 Al; US 2005/0002928 Al; US 6,573,043; US 2003/0152987 Al; WO 99/48527; US 2002/0141993 Al; WO 01/00245; US 2003/0086924; US 2004/0013667 Al; WO 00/69460; WO 01/00238; WO 01/15730; US 6,627,196 Bl; US 6,632,979 Bl; WO 01/00244; US 2002/0090662 Al; WO 01/89566; US 2002/0064785; US 2003/0134344; WO 04/24866; US 2004/0082047; US 2003/0175845 Al; WO 03/087131; US 2003/0228663; WO 2004/008099 A2; US 2004/0106161; WO 2004/048525; US 2004/0258685 Al; US 5,985,553; US 5,747,261; US 4,935,341; US 5,401,638; US 5,604,107; WO 87/07646; WO 89/10412; WO 91/05264; EP412，116B1; EP 494,135 Bl; US 5,824,311; EP 444,181 Bl; EP 1,006,194 A2; US 2002/0155527 Al; WO 91/02062; US 5,571,894; US 5,939,531; EP 502,812 Bl; WO 93/03741; EP 554,441 Bl; EP 656,367 Al; US 5,288,477; US 5,514,554; US 5,587,458; WO 93/12220; WO 93/16185; US 5，877，305; WO 93/21319; WO 93/21232; US 5,856,089; WO 94/22478; US 5,910,486; US 6,028,059; WO 96/07321; US5，804，396; US 5，846，749; EP 711,565; WO 96/16673; US 5,783,404; US 5,977,322; US 6,512,097; WO 97/00271; US 6,270,765; US 6,395,272; US 5,837,243; WO 96/40789; US 5,783,186; US 6,458,356; WO 97/20858; WO 97/38731; US 6,214,388; US 5,925,519; WO 98/02463; US 5,922,845; WO 98/18489; WO 98/33914; US 5,994,071; WO 98/45479; US 6，358，682 Bl; US 2003/0059790; WO 99/55367; WO 01/20033; US 2002/0076695 Al; WO (XV78347; WO 01/09187; WO 01/21192; WO 01/32155; WO 01/53354; WO 01/56604; WO 01/76630; WO02/05791; WO 02/11677; US 6,582,919; US 2002/0192652 Al; US 2003/0211530 Al; WO 02/44413; US 2002/0142328; US 6,602,670 B2; WO 02/45653; WO 02/055106; US 2003/0152572; US 2003/0165840; WO 02/087619; WO 03/006509; WO03/012072; WO 03/028638; US 2003/0068318; WO 03/041736; EP 1,357,132; US 2003/0202973; US 2004/0138160; US 5,705,157; US 6，123，939; EP 616,812 Bl; US 2003/0103973; US 2003/0108545; US 6,403,630 Bl; WO 00/61145; WO 00/61185; US 6,333,348 Bl; WO 01/05425; WO 01/64246; US 2003/0022918;US 2002/0051785 Al; US 6,767,541; WO 01/76586; US 2003/0144252; WO 01/87336; US 2002/0031515 Al; WO 01/87334; WO02/05791; WO 02/09754; US 2003/0157097; US 2002/0076408; WO 02/055106; WO 02/070008; WO 02/089842;和WO 03/86467。
HER2胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)通過(guò)蛋白水解從培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞脫落(Petch a/., Mo/. Ce〃.傷o/. 10: 2973-2982 (1990); Scott d a/., JWb/. Ce〃. B/o/, 13: 2247-2257 (1993); Lee and Maihle， Owcogewe 16: 3243-3252(1998)),而且在有 些癌癥患者的血清中有找到(Leitzel & a/., / C7/w. <9腳/. 10: 1436-1443
(1992) )。 HER2 ECD可能是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的血清標(biāo)志物(Leitzel d C7Z". Owco/. 10: 1436-1443 (1992))，而且可能使得過(guò)表達(dá)HER2的腫瘤逃脫免疫學(xué) 控制(Baselga a/" C//". 14: 737-744 (1997》Brodowicz d a/.， /"f. 乂 C朋cw 73: 875-879 (1997))。脫落HER2 ECD血清水平代表患有過(guò)表達(dá)HER2 的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中不良臨床結(jié)果的獨(dú)立標(biāo)志物(Ali&fl/.，C7/". C/zem. 48: 1314-1320 (2002); Molina efa/" C7Z". Qmceri &s. 8: 347-353 (2002))。
截短的HER2胞外結(jié)構(gòu)域還是通過(guò)使用內(nèi)含子內(nèi)的聚腺苷酸化信號(hào)產(chǎn)生 的2.3kb可變轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)物(Scott d a/., M /. CW/.脂.13: 2247-2257
(1993) )。可變轉(zhuǎn)錄物首先在胃癌細(xì)胞系MKN7中得到鑒定(Yamamoto a/., A^ww 319: 230-234 (1986); Scott "/.， Mo/. Ce〃. B/o/. 13: 2247-2257 (1993)),截短的受體位于核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而非由這些胂瘤細(xì)胞分泌(Scott" a/" Mo/. Ce〃.腺.13: 2247-2257 (1993))。
還鑒定到了 HER2的另一種可變剪接產(chǎn)物，稱為"herstatin" ( Doherty ^ a/., Prac.淑/.爿cad Sc/. 96: 10869-10874 (1999); Azios d a/" O"cog麼20: 5199-5209 (2001); Justman and Clinton, 所o/. C/2e肌277: 20618-20624 (2002))。該蛋白質(zhì)的組成是來(lái)自胞外結(jié)構(gòu)域的亞結(jié)構(gòu)域I和II，隨后是由內(nèi) 含子8編碼的獨(dú)特C-末端序列。
下面的觀察結(jié)果提出了可能解釋過(guò)表達(dá)HER2的肺瘤中的不良臨床結(jié)果 的另一種機(jī)制，即在有些過(guò)表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞中，受體受到未知金屬蛋 白酶加工以產(chǎn)生截短的膜相關(guān)受體(有時(shí)稱為"stub",也稱為p95)、和可 溶性胞外結(jié)構(gòu)域(也稱為ECD、 ECD105或p105 )。
與其它HER受體一樣，胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的喪失使得HER2胞內(nèi)膜 相關(guān)結(jié)構(gòu)域成為組成性活性酪氨酸激酶。因此推定HER2 ECD的加工產(chǎn)生可
將生長(zhǎng)和存活信號(hào)直接投遞至癌細(xì)胞的組成性活性受體。參見(jiàn)美國(guó)專利第
6,541,214號(hào)(Clinton)和美國(guó)專利申請(qǐng)第2004/0247602A1號(hào)(Friedman et al.)。 Saez ef a/.， C//". Owcer 12(2): 424-431 (January, 2006)報(bào)道了其肺瘤 表達(dá)高水平p95的患者具有比沒(méi)有此類腫瘤的患者顯著更差的結(jié)果。p95水 平現(xiàn)在只能通過(guò)Western印跡來(lái)測(cè)定。
發(fā)明概述
第一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注用于抑制HER2脫落的方法，包括用有效抑制 HER2脫落的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑處理表達(dá)HER2的細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物中降低HER2胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)血 清水平的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用在哺乳動(dòng)物中有效降低HER2 ECD血清 水平的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
還有一個(gè)方面，提供了用于在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的方法，包括對(duì)哺乳 動(dòng)物施用有效治療癌癥的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
同樣，本發(fā)明關(guān)注用于在哺乳動(dòng)物中治療HER抑制劑抗性癌癥的方法， 包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效治療癌癥的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
還有一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于降低細(xì)胞中p95HER2水平的方法，包 括將細(xì)胞暴露于有效降低p95 HER2水平的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗 劑。
本發(fā)明還關(guān)注診斷(或預(yù)后)方法，包括評(píng)估來(lái)自癌癥患者的樣品中的 MMP-15 (MT7-MMP),其中升高的MMP-15水平或活性表明該患者具有升 高的p95 HER2和/或脫落HER2血清水平，和/或?qū)⒕哂胁涣寂R床結(jié)果。優(yōu) 選的是，在該方法中評(píng)估MMP-15水平(蛋白質(zhì)或核酸)并用于鑒定具有較 差預(yù)后的患者或?qū)⒕哂休^差臨床結(jié)果的患者。任選的是，患者的癌癥進(jìn)一步 展示出HER表達(dá)、擴(kuò)增或活化，最優(yōu)選HER2過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增。
附圖簡(jiǎn)迷


圖1提供了全長(zhǎng)HER2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖及其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域 I-IV (分別是SEQIDNO. 1-4)的氨基酸序列。
圖2A和2B分別顯示了 trastuzumab輕鏈(圖2A; SEQ ID No. 5 )和重 鏈(圖2B; SEQ ID No. 6 )的氨基酸序列。
圖3A和3B顯示了 pertuzumab輕鏈(圖3A; SEQ ID NO. 7 )和重鏈(圖 3B; SEQ ID NO. 8 )的氨基酸序列。CDR以粗體顯示。輕鏈和重鏈的計(jì)算的 分子量是23,526.22 Da和49,216.56 Da (半胱氨酸為還原形式)。碳水化合物 模塊(moiety)附著于重鏈的Asn 299。
圖4描繪了 HER信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。
圖5圖示了與非過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)相比，trastuzumab對(duì)來(lái) 自過(guò)表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞系(SKBR3, MT474)的HER2 ECD脫落的抑制。
圖6圖示了 MMTVHER2轉(zhuǎn)基因肺瘤(f2:1282腫瘤，trastuzumab敏感 的；和Fo5肺瘤，trastuzumab抵抗的)中p95 HER2和脫落的HER2 ECD水 平的差異。
圖7描繪了用于鑒定HER2脫落酶的策略。
圖8圖示了證實(shí)脫落酶具有金屬蛋白酶特性的實(shí)驗(yàn)。
圖9顯示了 MMTV-HER2腫瘤和細(xì)胞系中的MMP表達(dá)。MMP-15是用 于解釋trastuzumab敏感的G:1282肺瘤和trastuzumab抵抗的Fo5腫瘤之間 的差異的候選物。
圖10反映了 flag-HER2與MMP-15之間的相互作用。
圖ll顯示了 flagHER2-f2:1282和flagHER2-Fo5與MMP-15之間的相互 作用。f2:1282與Fo5之間的差異不能由MMP-15突變體的差異結(jié)合來(lái)解釋。
圖12圖示了在MMTVHER2轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變。所示序 列是脫落酶位點(diǎn)(SEQ ID NO. 23)、野生型(WT) (SEQ ID NO. 24)、剪接(SEQ ID NO. 25)、 Fo5 (SEQ ID NO. 26)和￡2:3078.10 (SEQ ID NO. 27)。
圖13描繪了體外脫落酶測(cè)定法的結(jié)果。gDHER29(DIV)-IgG是MMP-15 、 MMP-16、 MMP-19和MMP-25的催化結(jié)構(gòu)域的底物。蛋白酶消化的序列是 MMP-15 (SEQ ID NO. 28)、 MMP-16 (SEQ ID NO. 29)、 MMP-19 (SEQ ID NO. 30)、MMP-25 (SEQ ID NO. 31)、所有其它(SEQ ID NO. 32);及用于HER2 ECD C-末端位點(diǎn)的(SEQ ID NO. 33)。
圖14圖示了證實(shí)MMP-15不修剪其它HER受體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。證實(shí)跨膜
結(jié)構(gòu)域附近的序列變異的序列是HER2 (SEQ ID NO. 34)、EGFR (SEQ ID NO.
35)、 HER3 (SEQ ID NO. 36)、 HER4 (Jma) (SEQ ID NO. 37)和HER4 (Jmb)
(SEQ ID NO. 38)。
圖15顯示了 MMP-15 "全長(zhǎng)"修剪HER2(+)-IgG。
圖16展示了表明p95HER2組成性磷酸化但必須與HER3異二聚化以活 化Akt的實(shí)驗(yàn)。
圖17顯示了 MMP-15 RNA抑制劑(RNAi)在SKBR3和BT474細(xì)胞中降 低HER2 ECD脫落和p95 HER2水平。
圖18圖示了 SKBR3細(xì)胞中trastuzumab介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制如何獨(dú)立于對(duì) HER2脫落的抑制。
圖19展示了 Fo5異種移植腫瘤中對(duì)金屬蛋白酶活性的抑制降低HER2 脫落和抑制p95 HER2水平。
圖20描繪了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的成員。MMP家族成員依照結(jié) 構(gòu)域結(jié)構(gòu)分組。此圖中所使用的縮寫(xiě)是PRE,前結(jié)構(gòu)域(pre-domain); PRO， 原結(jié)構(gòu)域(pro-domain); CAT,催化結(jié)構(gòu)域；H，鉸鏈；HEM，血紅素結(jié)合蛋 白結(jié)構(gòu)域；F,弗林蛋白酶(ftirin)切割共有結(jié)構(gòu)域；FN，纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域； GPI,糖磷脂酰肌醇錨；TM,跨膜結(jié)構(gòu)域；Ig,免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域；CA， 半胱氨酸隊(duì)列(array); CL,膠原樣結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
I.定義
術(shù)語(yǔ)"基質(zhì)金屬蛋白酶"或"MMP"在本文中指作為基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)超家族成員的蛋白質(zhì)，其活性依賴Zn或Ca。 MMP在本文中包括前 蛋白原、成熟蛋白質(zhì)及其變異形式。具有各種結(jié)構(gòu)域的MMP的例子參見(jiàn)例 如本文中的圖20。 MMP的綜述有Wagenaar-Miller Ca"cer Metotos^ Aev/謹(jǐn)23: 119-135 (2004)。
"膜束綽的MMP(membrane-tethered MMP)"或"MT-MMP，，在本文中 指如上定義的MMP,其中所述MMP能夠經(jīng)跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域或糖磷脂酰肌 醇(GPI)錨附著于細(xì)胞膜?？缒そY(jié)構(gòu)域錨定的MT-MMP的例子在本文中包括 MT1-MMP (MMP-14)、 MT2畫(huà)MMP (MMP-15)、 MT3-MMP (MMP-16)、 MT5-MMP (MMP-24)。通過(guò)GPI錨錨定的MT-MMP的例子包括MT4-MMP (MMP-17)和MT6-MMP (MMP-25)。 MMP-15是本文中優(yōu)選的MT陽(yáng)MMP。
"MT2-MMP，，和"MMP-15"在本文中同義，描述NCB1數(shù)據(jù)庫(kù)中的 前蛋白原NP_002415、包含其第132-699位氨基酸的成熟蛋白質(zhì)、及其變 異形式。MMP-15的已知底物包括膠原、纖連蛋白、CD44和補(bǔ)體。MMP-15 在有些癌中上調(diào)，此蛋白酶的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)肺瘤^f曼入和肺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
"MMP拮抗劑"指一定程度上結(jié)合和/或干擾至少一種MMP的蛋白水 解活性的藥劑。優(yōu)選的是，MMP拮抗劑選擇性結(jié)合或抑制MMP但不顯著 結(jié)合或抑制其它蛋白酶，諸如ADAM (解聯(lián)蛋白(disintegrin)和金屬蛋白酶) 家族的蛋白酶。MMP拮抗劑的例子在本文中包括結(jié)合MMP的抗體、小分 子抑制劑、^i擬MMP底物的假肽、結(jié)合MMP的催化性鋅的非肽分子、分 離的MMP的天然組織抑制劑(TIMP)、核酸抑制劑諸如RNA或反義抑制劑、 等。
"MT-MMP拮抗劑"指一定程度上結(jié)合和/或干擾至少一種MT-MMP的 蛋白水解活性的藥劑。優(yōu)選的是，MT-MMP拮抗劑選擇性結(jié)合或抑制 MT-MMP但不顯著結(jié)合或抑制其它蛋白酶(包括不是膜束縛的其它MMP)。 MT-MMP拮抗劑的例子包括結(jié)合MT-MMP的抗體、小分子抑制劑、模擬 MT-MMP底物的假肽、結(jié)合MT-MMP的催化性鋅的非肽分子、MT-MMP 的分離的天然組織抑制劑、MT-MMP核酸抑制劑諸如RNA或反義抑制劑、 等。
"MMP-15"拮抗劑"指一定程度上結(jié)合和/或干擾MMP-15的蛋白水解. 活性的藥劑。優(yōu)選的是，MMP-15拮抗劑選擇性結(jié)合或抑制MMP-15但不顯 著結(jié)合或抑制其它蛋白酶(包括MMP-15以外的MMP )。 MMP-15拮抗劑的 例子包括結(jié)合MMP-15的抗體、小分子抑制劑、模擬MMP-15底物的假肽、 結(jié)合MMP-15的催化性鋅的非肽分子、MMP-15的分離的天然組織抑制劑、 MMP-15核酸抑制劑諸如RNA或反義抑制劑、等。
"MMP水平升高"指生物學(xué)樣品諸如腫瘤樣品中MMP的量超過(guò)MMP 的正常量，例如同一組織類型的正?；蚍悄[瘤樣品中的量。此類MMP(例 如MMP-15 )的正常量包括沒(méi)有或檢測(cè)不到的MMP-15的量。MMP水平升 高可以多種方式測(cè)定，包括那些測(cè)量MMP蛋白質(zhì)或MMP核酸的方式。
"HER受體，，是屬于HER受體家族的受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，包括 EGFR、 HER2、 HER3和HER4受體。HER受體包括天然序列HER受體及 其變體。優(yōu)選的是，HER受體是天然序列人HER受體。
"全長(zhǎng)"HER受體包含胞外結(jié)構(gòu)域，它可結(jié)合HER配體和/或與另一 HER受體分子二聚化；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和羧基 末端信號(hào)結(jié)構(gòu)域，它包含可磷酸化的幾個(gè)酪氨酸殘基。
術(shù)語(yǔ)"ErbBl"、 "HER1"、"表皮生長(zhǎng)因子受體"和"EGFR"在本文中 可互換使用，指例如Carpenter " a/.，爿朋.i ev.所oc/zem. 56: 881-914 (1987)中 公開(kāi)的EGFR，包括其變異形式(例如如Humphrey & 尸A^S (T7&i) 87: 4207-4211 (1990)中的刪除突變體EGFR )。
表述"ErbB2，，和"HER2"在本文中可互換使用，指例如Semba " a/.,尸A^S (X/Si) 82: 6497-6501 (1985)和Yamamoto " a/" 319: 230-234 (1986)中
記載的人HER2蛋白(Genebank編號(hào)X03363 )及其變異形式，諸如可變剪 接形式(Siegel"a/,，五MB(9J: 18(8): 2149-2164 (1990))。
在本文中，"HER2胞外結(jié)構(gòu)域，，或"HER2ECD"指HER2在細(xì)胞外的 結(jié)構(gòu)域，或是錨定在細(xì)胞膜上，或是在循環(huán)中，包括其片段。在一個(gè)實(shí)施方 案中，HER2的胞外結(jié)構(gòu)域可包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域"結(jié)構(gòu)域I"(大約第1-195位 氨基酸殘基；SEQIDNO: 1)、"結(jié)構(gòu)域II"(大約第196-319位氨基酸殘基； SEQ ID NO: 2 )、"結(jié)構(gòu)域III"(大約第320-488位氨基酸殘基；SEQ ID NO: 3 )和"結(jié)構(gòu)域IV"(大約第489-630位氨基酸殘基；SEQ ID NO: 4 )(殘基 編號(hào)不包括信號(hào)肽)。參見(jiàn)Garrett a a/" M /. CW/. 11: 495-505 (2003); Cho " a/" TVa嫌421: 756-760 (2003); Franklin " "/., C彥w CW/ 5: 317-328 (2004); Plowman d "/.,A^/. ^c"d 90: 1746-1750 (1993)，以及本文中的圖 1。
在本文中，"HER2脫落"指從表達(dá)HER2的細(xì)胞的細(xì)胞表面釋放HER2 的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)片段。此類脫落可能是由細(xì)胞表面HER2的蛋白 水解切割引起的，導(dǎo)致ECD片段從細(xì)胞表面釋放，或者可溶性ECD或其片 —段可以由不同轉(zhuǎn)錄物編碼。
"脫落HER2血清水平，，指哺乳動(dòng)物的血清或循環(huán)中存在的HER2 ECD 的量。此類水平可通過(guò)多種技術(shù)評(píng)估，包括下列文獻(xiàn)中所記載的Alida/., C/,w. C/zem. 48: 1314-1320 (2002); Molina a/., C/z'w. Ca臟r版8: 347-353 (2002); 1990年6月12日授權(quán)的美國(guó)專利第4,933,294號(hào)；1991年4月18曰 公開(kāi)的WO 91/05264; 1995年3月28日授權(quán)的美國(guó)專利第5,401，638號(hào)；Sias W/,簡(jiǎn)畫(huà)/. M函oA 132: 73-80 (1990)。
在本文中，"脫落HER2血清水平升高，，指哺乳動(dòng)物(例如人)血清中 脫落HER2或HER2 ECD的量超過(guò)正常哺乳動(dòng)物(例如人)血清中存在的量。 HER2 ECD血清水平升高可能與晚期乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌療法和化療的預(yù)
后不良和響應(yīng)降低有關(guān)。
表述"p95 HER2"在本文中指NH2末端截短的HER2蛋白質(zhì)。通常， p95是膜結(jié)合的殘留(stub)片段，可能是由蛋白酶或脫落酶切割全長(zhǎng)HER2產(chǎn) 生的(Yuan ef a/., /Vo "'" Expmw/ow aw<i尸z^訴ca/7'ow 29: 217-222 (2003) )。 p95 可具有約95,000的分子量且可磷酸化(Molina a a/.， / e化mr;z 4744—4749 (2001))。 p95已經(jīng)在有些乳腺癌樣品中找到(Christianson a/., Ca"cerW& . 15: 5123-5129(1998))。
"p95水平升高"指癌細(xì)胞中的p95水平超過(guò)正常水平，例如與該癌細(xì) 胞同一組織類型的正?；蚍前┘?xì)胞中的水平。此類p95水平升高可能導(dǎo)致組 成性"[言號(hào)(constitutive signaling)和結(jié)節(jié)性轉(zhuǎn)移(nodal metastasis) ( Molina a/.， C7/". Ga"cer i^searc/z 8: 347-353 (2002》Christianson "/., C""cer Way. 15: 5123-5129(1998))。
"評(píng)估"標(biāo)志物，諸如MMP-15,指其診斷性和/或預(yù)后性分析，包括分 析標(biāo)志物的存在與否、測(cè)量其量、和/或分析其活性(例如活性升高)。
具有"不良臨床結(jié)果"的癌癥患者指具有不良預(yù)后的癌癥患者，他不大 可能響應(yīng)癌癥療法，諸如化療或使用HER2抗體諸如trastuzumab的療法?！?臨床結(jié)果可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)手段測(cè)量，諸如存活，包括沒(méi)有疾病的存活等。
"ErbB3"和"HER3"指例如美國(guó)專利第5,183,884和5,480,968號(hào)以及 Kraus "a/., /WAS W&i) 86: 9193-9197 (1989)中公開(kāi)的受體多肽，包括其變 異形式。
術(shù)語(yǔ)"ErbB4"和"HER4"在本文中指例如歐洲專利申請(qǐng)第599,274號(hào)； Plowman d a/"A^/. ^cad 90: 1746-1750 (1993); Plowman "
a/.， Atoww 366: 473-475 (1993)中公開(kāi)的受體多肽，包括其變異形式，諸如 1999年4月22日出版的WO 99/19488中公開(kāi)的同種型(isoform)。
"HER配體"指結(jié)合和/或活化HER受體的多肽。本文中特別感興趣的 HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)( Savage 傷o/. C/ze附.247: 7612-7621 (1972));轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子cx (TGF-a)( Marquardt "a/" 5Wewce 223: 1079-1082(1984));雙調(diào)蛋白，又稱為施旺細(xì)胞瘤(schwannoma) 或角質(zhì)形成細(xì)胞自分泌生長(zhǎng)因子(Shoyab &&聽(tīng)243: 1074-1076
(1989); Kimura " a/.,淑臟348: 257-260 (1990); Cook ef 組Ce〃.所o/. 11: 2547-2557 (1991) ); betacellulin( Shing "cr/., Sc/ewce 259: 1604-1607 (1993);Sasada "a/.， Sz'oc/zew. B/0p/7;AS. Commzm. 190: 1173 (1993));肝素纟吉合表 皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF) (Higashiyama a/.， 6We"ce 251: 936-939 (1991)); epiregulin ( Toyoda d a/., J!腸/. CTzem. 270: 7495-7500 (1995); Komurasaki d a/.， (9wcoge"e 15: 2841-2848 (1997)); a調(diào)蛋白(見(jiàn)下文)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2 (NRG-2) (Carmway " a/.， A^ww 387: 512-516 (1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3 (NRG-3) ( Zhang "a/.,尸roc. 94: 9562-9567 (1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)
蛋白-4 (NRG-4) ( Harari " a/,， O"coge"e 18: 2681-89 (1999));和cripto (CR-1)
(Kannan 祝o/. C&w. 272(6): 3330-3335 (1997))。結(jié)合EGFR的HER
配體包括EGF、 TGF-a、雙調(diào)蛋白、betacellulin、 HB-EGF和epiregulin。結(jié) 合HER3的HER配體包括調(diào)蛋白。能夠結(jié)合HER4的HER配體包括 betacellulin、 epiregulin、 HB匿EGF、 NRG隱2、 NRG-3 、 NRG-4禾口調(diào)蛋白。
"調(diào)蛋白"(HRG)在用于本文時(shí)指由調(diào)蛋白基因編碼的多肽，如美國(guó)專 利第5,641,869號(hào)或Marchionni ^a/.,淑,362: 312-318 (1993)中所公開(kāi)的。 調(diào)蛋白的例子包括調(diào)蛋白-oc 、調(diào)蛋白-P 1、調(diào)蛋白-P 2和調(diào)蛋白-13 3( Holmes d a/.， 5We"ce 256: 1205-1210 (1992);美國(guó)專利第5,641,869號(hào))；wew分化因 子(NDF)( Peles " a/., CW/ 69: 205，216 (1992));乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)
(Falls &a/.， Ce// 72: 801-815 (1993));神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF) ( Marchionni a/"淑,362: 312-318 (1993));感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF) (Ho a/., /編.C/zem. 270: 14523-14532 (1995)); y-調(diào)蛋白(Schaefer " a/.， Owcoge"e 15: 1385-1394(1997))。
"HER 二聚體"在本文中指包含至少兩個(gè)HER受體的非共價(jià)結(jié)合二聚 體。在表達(dá)兩種或多種HER受體的細(xì)胞暴露于HER配體時(shí)可形成此類復(fù)合 物，可通過(guò)免疫沉淀分離并通過(guò)SDS-PAGE，如例如Sliwkowski d a/.， 《/ 5/o/. Ozem. 269(20): 14661-14665 (1994)中所述的進(jìn)行分析。此類HER二聚體的例 子包括EGFR-HER2、 HER2-HER3和HER3-HER4異二聚體。此外，HER 二聚體可包含與不同HER受體諸如HER3、 HER4或EGFR結(jié)合的兩個(gè)或多 個(gè)HER2受體。其它蛋白質(zhì)，諸如細(xì)胞因子受體亞基(例如gpl30)可與二 聚體結(jié)合。
"展示出HER表達(dá)、擴(kuò)增或活化"的細(xì)胞、癌或生物學(xué)樣品是在診斷 測(cè)試中表達(dá)(包括過(guò)表達(dá))HER,具有擴(kuò)增的HER基因，和/或以其它方式 展現(xiàn)出HER受體活化或磷酸化的細(xì)胞、癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過(guò)測(cè)量HER磷酸化)或間接(例如通過(guò)基因表達(dá)制譜或通過(guò)檢測(cè) HER異二聚體)測(cè)定。
"正R2受體過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增"的癌或腫瘤細(xì)胞是與同一組織類型的非癌 細(xì)胞相比，具有顯著更高水平的HER2蛋白質(zhì)或基因的癌癥。這樣的過(guò)表達(dá) 可以是由基因擴(kuò)增或者轉(zhuǎn)錄或翻譯增加引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測(cè)定法中通 過(guò)評(píng)估細(xì)胞表面上存在的HER2蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過(guò)免疫組化測(cè)定 法；IHC)來(lái)確定HER2的過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增?；蛘?另外，可測(cè)量細(xì)胞中的HER2 核酸水平，例如通過(guò)焚光原位雜交(FISH;參見(jiàn)1998年10月公開(kāi)的WO 98/45479)、 Southern印跡或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)4支術(shù)，諸如定量實(shí)時(shí)PCR (qRT-PCR)。還可通過(guò)測(cè)量生物學(xué)流體諸如血清中的脫落HER2來(lái)研究HER2 過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增(參見(jiàn)例如1990年6月12日公告的美國(guó)專利第4,933,294號(hào); 1991年4月18日公開(kāi)的WO 91/05264; 1995年3月28日公告的美國(guó)專利第 5,401,638號(hào)；Sias " 。/.， J！ /國(guó),/. MeAoA 132: 73-80 (1990))。除了上述測(cè) 定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用多種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者體內(nèi)細(xì) 胞暴露于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估抗 體與患者體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)合，例如通過(guò)放射活性外部掃描或通過(guò)分析取自事先
已暴露于所述抗體的患者的活檢。
相反，"HER受體不過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增"的癌或腫瘤細(xì)胞是與同一組織類型 的非癌細(xì)胞相比，沒(méi)有高于正常水平的HER受體蛋白質(zhì)或基因的癌癥。抑 制HER二聚化的抗體，諸如pertuzumab，可用于治療HER2受體不過(guò)表達(dá) 或擴(kuò)增的癌。
"HER抑制劑"指干擾HER活化或功能的藥劑。HER抑制劑的例子包 括HER抗體(例如EGFR、 HER2、 HER3或HER4抗體)；HER 二聚化抑 制劑；EGFR靶向藥物；小分子HER拮抗劑；HER酪氨酸激酶抑制劑；HER2 和EGFR雙重酪氨酸激酶抑制劑，諸如lapatinib/GW572016;反義分子(參 見(jiàn)例如WO 2004/87207 );和/或結(jié)合下游信號(hào)分子諸如MAPK或Akt或干擾 其功能的藥劑。優(yōu)選的是，HER抑制劑是結(jié)合HER受體的抗體或小分子。 HER抑制齊'J的具體例子包才舌trastuzumab、 pertuzumab 、 cetuximab、 ABX-EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC-11F8 和TAK165。
"HER二聚化抑制劑"指抑制HER二聚體形成的藥劑。優(yōu)選的是，
HER 二聚化抑制劑是抗體，例如在HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合HER2 的抗體。本文中最優(yōu)選的二聚化抑制劑是Pertuzumab或單克隆抗體2C4 (MAb 2C4)。 HER 二聚化抑制劑的其它例子包括結(jié)合EGFR并抑制其與一種 或多種其它HER受體二聚化的抗體(例如EGFR單克隆抗體806, MAb 806, 它結(jié)合活化的或"未束縛的(untethered)，，EGFR;參見(jiàn)Johns e^/.,J所o/. C/zem. 279(29): 30375-30384 (2004));結(jié)合HER3并抑制其與一種或多種其它HER 受體二聚化的抗體；結(jié)合HER4并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚 化的抗體；肽二聚化抑制劑(美國(guó)專利第6,417,168號(hào));反義二聚化抑制劑； 等。
"HER抗體"指結(jié)合HER受體的抗體。任選的是，HER抗體還干擾 HER活化或功能。優(yōu)選的是，HER抗體結(jié)合HER2受體。本文中特別感興 趣的HER2 4元體是trastuzumab和pertuzumab。 EGFR抗體的例子包招: cetuximab、 ABX0303、 EMD7200和IMC-11F5。
"HER活化"指任何一種或多種HER受體的活化或磷酸化。通常，HER 活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由HER受體胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起的，磷酸化HER 受體或底物多肽中的酪氨酸殘基—)。HER活化可由結(jié)合包含.目的HER受體的 HER 二聚體的HER配體介導(dǎo)。結(jié)合HER 二聚體的HER配體可活化二聚體 中 一種或多種HER受體的激酶結(jié)構(gòu)域，由此導(dǎo)致一種或多種HER受體中酪 氨酸殘基的磷酸化和/或其它底物多肽，諸如Akt或MAPK胞內(nèi)激酶中酪氨 酸殘基的磷酸化。
"磷酸化"指向蛋白質(zhì)，諸如HER受體或其底物添加一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)。
"抑制HER二聚化"的抗體指抑制或干擾HER二聚體形成的抗體。優(yōu) 選的是，這樣的抗體在HER的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合HER2。本文中最優(yōu)選 的二聚化抑制性抗體是pertuzumab或MAb 2C4。抑制HER 二聚化的抗體的 其它例子包括結(jié)合EGFR并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗 體(例如EGFR單克隆抗體806, MAb 806,它結(jié)合活化的或"未束縛的 (untethered)" EGFR;參見(jiàn)Johns " 《/所o/. CTzem. 279(29): 30375-30384 (2004));結(jié)合HER3并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體； 及結(jié)合HER4并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體。
HER2上的"異二聚體結(jié)合位點(diǎn)"指形成二聚體時(shí)，與EGFR、 HER3
或HER4胞外結(jié)構(gòu)域中某區(qū)域接觸或形成介面的HER2胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū) 域。已發(fā)現(xiàn)所述區(qū)域在HER2的結(jié)構(gòu)域II中。Franklin & "/., Owe" CW/ 5: 317-328 (2004)。
HER2抗體可以是像trastuzumab那樣"抑制HER2胞外域切割，，的抗體 (Molina d， C"聰r紐61: 4744-4749(2001)),或者可以是像pertuzumab 那樣不顯著抑制HER2胞外域切割(ectodomain)的抗體。
"結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)的"HER2抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘
III中的殘基)，且至少在一定程度上可在空間上阻礙HER2-EGFR、 HER2-HER3或HER2畫(huà)HER4異二聚體的形成。Franklin " a/., C""cer Ce〃 5: 317-328 (2004)表征了存放在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(ID Code IS78 )的 HER2-Pertuzumab晶體結(jié)構(gòu)，舉例說(shuō)明了結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)的 例示性抗體。
"結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域II的"抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基和任選HER2 的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基。優(yōu)選的是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域II的 抗體結(jié)合HER2的—結(jié)構(gòu)域I、 II和III之間的連接處。
"天然序列，，多肽指與衍生自自然界的多肽(例如HER受體或HER配 體)具有相同氨基S^f列的多肽。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或 者可通過(guò)重組或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、 鼠多肽、或來(lái)自任何其它哺乳類物種的多肽的氨基酉M列。
術(shù)語(yǔ)"抗體，，在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整的單克隆抗體、多 克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、 及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。
術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗 體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的 過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，而此類變體通常以極小量存在。此類單克隆 抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中結(jié)合靶物的多肽序列 是通過(guò)包括從多種多肽序列中選擇結(jié)合靶物的單一多肽在內(nèi)的過(guò)程得到的。 例如，選擇過(guò)程可以是從多種克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA 克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，選擇的結(jié)合靶物的序列可進(jìn)一步改 變，例如提高對(duì)靶物的親和力、將結(jié)合靶物的序列人源化、提高其在細(xì)胞培
養(yǎng)物中產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改 變后的結(jié)合靶物的序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對(duì) 不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備 物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆 抗體制備物的優(yōu)勢(shì)在于它們未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)"單克隆" 指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定 方法來(lái)生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)多種技術(shù)來(lái)
生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler e/a/.， A^we 256: 495 (1975); Harlow " d/"爿77幼o(hù)Wes, j丄a60rato7 Ma"wa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling ^ a/.， in: Mowoc/ora/ Jw幼Wey PCW/外6r/(icway, 563-681, Elsevier, N.Y" 1981 )、重組DNA法(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第4,816,567 號(hào))、噬菌體展示技術(shù)(參見(jiàn)例如Clackson & a/.， A^ww 352: 624-628 (1991); Marks " a/., J Mo/. 5/o/. 222: 581-597 (1991); Sidhu d a/., J! Mo/. 5/o/. 338(2): 299-310 (2004); Lee " a/.， Mo/. Sfo/. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, 戶rac. Ato, Jc^/. 6W. "5^ 101(34): 12467-12472 (2004); Lee /附mimo/. MeAoA 284(1-2): 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白 基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成人或人樣抗體的技術(shù) (參見(jiàn)例如WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits a/.，A^/.力cao . 5W. 90: 2551 (1993);
Jakobovits d a/" 362: 255-258 (1993); Bruggemann a/.，腸r
/mww"o. 7: 33 (1993);美國(guó)專利第5,545,806號(hào)；第5，569,825號(hào)；第5,591,669 號(hào)(都授予GenPharm );美國(guó)專利第5,545,807號(hào)；WO 1997/17852;美國(guó)專 利第5,545,807號(hào)；第5,545,806號(hào)；第5,569,825號(hào)；第5,625,126號(hào)；第 5,633,425號(hào)；第5，661,016號(hào)；Marks 腸/7fecW， 10: 779-783 (1992); Lonberg " 淑廳368: 856-859 (1994); Morrison,淑匿368: 812-813 (1994); Fishwild d a/.，淑匿5/o欣/7"o/ogy 14: 845-851 (1996); Neuberger， A^a wre 5/ofec/z"o/ogy 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, /wferw. Z ev. /附wmwo/. 13: 65-93 (1995))。
單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部 分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同 或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗
體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望生
物學(xué)活性(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Morrison a "/.，A^/. ^c^/. 5W. 81: 6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類 (例如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人 恒定區(qū)序列的"靈長(zhǎng)類化"抗體。
"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片 段的例子包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體 分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
"完整抗體"在本文中指包含兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的 是，完整抗體具有一項(xiàng)或多項(xiàng)效應(yīng)器功能。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，完整抗體可歸入不同的"類"。完整抗 體有五種主要的類IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM,其中有些可進(jìn)一步分為 "亞類"(同種型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2。將與抗 體的不同類對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作a、 5、 s、 y和P。不同類的免疫球蛋 白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。
抗體"效應(yīng)器功能"—指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸 序列變體Fc區(qū))的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合； 補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)下調(diào)；等。
"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，，和"ADCC"指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)， 其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞和巨喧細(xì)胞)識(shí)別輩巴細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后？ 1起靶細(xì)胞溶解。 介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、 FcyRII和FcyRin。 Ravetch and Kinet, 觸/麵畫(huà)/. 9: 457-92 (1991)第 464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性， 可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利第5,500,362或5,821,337號(hào)中所記 載的。可用于此類測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然 殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在 動(dòng)物模型中,諸如Clynes " < 95: 652-656 (1998)中所披露的。
"人效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu) 選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcYRIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的 人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核 細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì) 胞可以從其天然來(lái)源分離，例如血液或PBMC ，如本文中所描述的。
術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR 是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(y受體)，包 括FcyRI、 FcyRII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變 剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")， 它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體FqRUA 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體 FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參 見(jiàn)綜述Dagron, Wev. /w附w"o/. 15: 203-234 (1997))。 FcR的綜述參見(jiàn)
Ravetch and Kinet， i ev. /mwww/. 9: 457-492 (1991); Capel ^ a/.，
Imm畫(huà)methods 4: 25-34 (1994); de Haas " a/" ￡4 C7/w. Med 126: 330-41 (1995)。術(shù)語(yǔ)"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。該 術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn,它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer"a/., /mm朋o/, 117: 587 (1976)和Kim " a/., J /附m柳o/. 24: 249 (1994))及調(diào)控免 疫球蛋白的動(dòng)態(tài)平衡。
"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"指在存在補(bǔ)體時(shí)分子溶解靶物的能 力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第 一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子 (例如抗體)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如 Gazzano-Santoro a/.,/mmww /. Afe決o^s 202: 163 (1996)中所i己載的。
"天然抗體，，指通常由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的 約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈 連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈 和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有可變區(qū)(vh)，接 著是多個(gè)恒定區(qū)(Ch)。每條輕鏈在一端具有可變區(qū)(VO，而另一端是恒定區(qū) (C0。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重 鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形 成界面。
術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每 種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的事實(shí)。然而，變異性并非均勻分
布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū) 段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變
區(qū)各自包含四個(gè)FR,它們大多采取(3-折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在 有些情況中形成|3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū) 通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另 一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗 原結(jié)合4立點(diǎn)的形成(參見(jiàn)Kabat等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD， 1991)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功 能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。
術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高 變區(qū)通常包含來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變 區(qū)中的殘基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及重鏈可變區(qū)中的殘基31-35 (Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)和/或那些來(lái)自"高變環(huán)"的殘基(例如輕鏈 可變區(qū)中的殘基26-32 (Ll)、 50-52 (L2)和91-96 (L3)及重鏈可定區(qū)中的殘基 26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk, Mo/.脂.196: 901-917 (1987))。"框架區(qū)"或"FR"殘基指可變區(qū)中除本文中所定義的高 變區(qū)殘基外的那些殘基。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片 段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余"Fc"片段，其名稱反映了它 易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合 位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。
"Fv"是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊 密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在 這種構(gòu)造中，各可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在V『VL二聚體表面上確定 了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而， 即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有 識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。 Fab'片段與 Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括
來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定區(qū)半 胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是 作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片 段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
根據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列，來(lái)自任何脊推動(dòng)物物種的抗體"輕鏈"可歸 入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡巾自(k)和拉姆達(dá)(X)。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片^a包含抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域，其中這 些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間 還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜 述參見(jiàn)Pltickthun， 在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第 113巻，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag， New York,第269-315頁(yè)， 1994。 HER2抗體scFv片段記載于W093/16185;美國(guó)專利第5,571,894號(hào)； 和美國(guó)專利第5,587,458號(hào)。
術(shù)語(yǔ)"雙抗體"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同
一條多肽鏈(VH-VJ中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。通過(guò)
使用過(guò)短的接頭使得同 一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使結(jié)構(gòu)域與 另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載 于例如EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger " a/"尸腦.廳.^cW, 脂 卯6444-6448 (1993)。
非人(例如嚙齒類)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人 免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白 (受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種 (供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球 蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基 替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有找到的殘基。 進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。 一般而言，人源化抗體將包含 至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變區(qū)，其中整個(gè)或基本上整個(gè)高變環(huán) 對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個(gè)或基本上整個(gè)FR是人免疫球蛋白 序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常 是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones W fl/.， A/flfwe 321: 522-525 (1986); Riechmanna/"淑,332: 323-329 (1988); Presta, C臟Op.
腸/. 2: 593-596(1992)。
人源化HER2抗體包括huMAb4D5-l、 huMAb4D5-2、 huMAb4D5-3、 huMAb4D5陽(yáng)4、 huMAb4D5匿5、 huMAb4D5-6、 huMAb4D5-7和huMAb4D5-8 或Trastuzumab (HERCEPTIN ),如美國(guó)專利第5,821,337號(hào)表3中所述， 明確收入本文作為參考；人源化520C9( WO 93/21319 );及人源化2C4抗體， il"^口 pertuzumab， ^口4^i^戶斤ii。
為了本發(fā)明的目的，"trastuzumab，'、 "HERCEPTIN "和"huMAb4D5-8" 指包含分別在SEQ ID No. 5和6中的輕鏈和重鏈氨基S臾序列的抗體。
在本文中，"pertuzumab"和"OMNITARGTM，，指包含分別在SEQ ID No. 7和8中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。
"棵抗體，，指未偶聯(lián)異源分子，諸如細(xì)胞毒性模塊(moiety)或放射性標(biāo) i己對(duì)勿的4;H。
"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回 收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物 質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%， 最優(yōu)選重量超過(guò)99%,(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的 N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的 還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至 少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而， 分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
"親和力成熟的"抗體指在其一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中具有導(dǎo)致抗體對(duì)抗原 的親和力與沒(méi)有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的一處或多處改變的抗
體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對(duì)靶抗原的 親和力。親和力成熟的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知流程生成。Marks d a/., 所o/rec/wo/ogy 10: 779-783 (1992)記載了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力 成熟。下列文獻(xiàn)記載了 CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas " a/.,戶rac. Ato. Jcadt/5^ 91: 3809-3813 (1994); Schier " a/" 169: 147-155
(1995); Yelton " a/.， J /顯,/. 155: 1994-2004 (1995); Jackson d /mwww /. 154(7): 3310-9 (1995); Hawkins e a/., / Mo/. Ao/. 226: 889-896 (1992)。術(shù)語(yǔ)"主要種類抗體，，在本文中指組合物中作為數(shù)量上主要抗體分子的 抗體結(jié)構(gòu)。
"氨基酸序列變體"抗體在本文中指具有與主要種類抗體不同的氨基酸 序列的抗體。通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70%的同 源性，而且優(yōu)選的是，它們將是與主要種類抗體至少約80%，更優(yōu)選至少約 90%同源。氨基酸序列變體在主要種類抗體氨基酸序列內(nèi)部或鄰近的某些位 置具有替代、刪除和/或添加。
"糖基化變體，，抗體在本文中指附著有一種或多種碳水化合物模塊且所 述碳水化合物與附著于主要種類抗體的 一種或多種碳水化合物模塊不同的 抗體。
"脫酰胺"抗體指其中一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基衍生成例如天冬氨酸、 琥珀酰亞胺或異天冬氨酸的抗體。
術(shù)語(yǔ)"癌癥'，和"癌性，，指的是或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng) 不受調(diào)節(jié)的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤(包 括髓母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤)、
神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 (包括類癌胂瘤(carcinoid tumor)、胃泌素瘤和胰島細(xì)胞癌)、 間皮瘤、施旺細(xì)胞瘤(包括聽(tīng)神經(jīng)瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、及白血病 或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀 細(xì)胞癌)、肺癌包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌 和肺的鱗癌、腹膜癌癥、肝細(xì)胞癌癥、胃癌癥包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì) 細(xì)月包瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳 腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子 宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、 肛門(mén)癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤、以及頭和頸癌。
具有"HER抑制劑抗性癌癥"的哺乳動(dòng)物指在接受基于HER抑制劑的 療法時(shí)病情仍有發(fā)展的哺乳動(dòng)物(即患者"對(duì)HER抑制劑有抗性")，或是 在基于HER抑制劑的治療方案完成后12個(gè)月內(nèi)(例如6個(gè)月內(nèi))病情有發(fā) 展的哺乳動(dòng)物。基于HER抑制劑的療法包括使用棵露的(naked)或偶聯(lián)的 HER抑制劑的療法，其中作為單一藥劑或與其它抗腫瘤藥聯(lián)合施用HER抑 制劑。HERj卬制劑可以是trastuzumab、 pertuzumab、 cetuximab、 ABX-EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC-11F8
或TAK165, 優(yōu)選trastuzumab 。
為了治療的目的，"哺乳動(dòng)物"指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人，家 畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的是， 哺乳動(dòng)物指人。
"腫瘤樣品"在本文中指衍生自患者腫瘤或包含來(lái)自患者腫瘤的腫瘤細(xì) 胞的樣品。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限于腫瘤活;險(xiǎn)、循環(huán)中的腫瘤 細(xì)胞、循環(huán)中的血漿蛋白質(zhì)、腹水、衍生自腫瘤或展現(xiàn)出腫瘤樣特性的原代 細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定的、石蠟包 埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。
"固定的"腫瘤樣品指已經(jīng)使用固定劑以組織學(xué)方法保存的樣品。 "福爾馬林固定的，，腫瘤樣品指使用曱醛作為固定劑保存的樣品。 "包埋的"腫瘤樣品指用堅(jiān)固的且通常是硬的介質(zhì)諸如石蠟、蠟、火棉 或樹(shù)脂包圍的樣品。包埋使得有可能切出薄片供顯微鏡檢查或生成組織微陣 列(TMA)。
"石蠟包埋的"腫瘤樣品指用衍生自石油的固體碳?xì)浠衔锏募兓旌?br> 物包圍的樣 品o 一
在本文中，"冷凍的，，腫瘤樣品指正在或曾經(jīng)冷凍的腫瘤樣品。 "生長(zhǎng)抑制劑"在用于本文時(shí)指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是表達(dá)
HER的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。如此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處 于S期的表達(dá)HER的細(xì)胞百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞 周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的 藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春堿類(vincas)(長(zhǎng)春新石威(vincristine)和長(zhǎng) 春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比 星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊香 (et叩oside)和博來(lái)霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯， 例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴 口秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤 (methotrexate)、 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見(jiàn)《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs ，， ， Murakami 等人,WB Saunders, Philadelphia, 1995，尤其是第13頁(yè)。
細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性HER2抗體在約0.5-30嗎/ml的抗體濃 度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中SK-BR-3乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制大于20%，優(yōu)選大于50% (例如約50%至約100% )，其中生長(zhǎng)抑制是在SK-BR-3細(xì)胞暴露于抗體后6 天測(cè)定的(參見(jiàn)1997年10月14日公告的美國(guó)專利第5，677，171號(hào))。該專 利及下文中更詳細(xì)的描述了 SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制 性抗體是鼠單克隆抗體4D5的人源化變體，例如trastuzumab。
"誘導(dǎo)凋亡"的抗體指根據(jù)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂、和/或膜嚢(稱作凋亡小體)形成的測(cè)定，誘導(dǎo)程序 性細(xì)胞死亡的抗體。所述細(xì)胞通常是過(guò)表達(dá)HER2受體的細(xì)胞。優(yōu)選的是， 所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、 結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱細(xì)胞。在體外，所述細(xì)胞可以是SK-BR-3、 BT474、 Calu3纟田月包、MDA-MB-453、 MDA-MB-361或SKOV3纟田月包。有多種方法可 用于評(píng)估與凋亡有關(guān)的細(xì)胞事件。例如，可通過(guò)膜聯(lián)蛋白結(jié)合來(lái)測(cè)量磷脂酰
絲氨酸(PS)易位；可通過(guò)DNA梯化(laddering)來(lái)評(píng)估DNA斷裂；可通過(guò)亞 二倍體細(xì)胞的任何增加來(lái)評(píng)估伴隨著DNA斷裂的核/染色質(zhì)濃縮。優(yōu)選的是， 誘導(dǎo)凋亡的抗體是在使用BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合測(cè)定法(見(jiàn)下文)中， 相對(duì)于未處理細(xì)胞，導(dǎo)致約2至50倍，優(yōu)選約5至50倍，最優(yōu)選約10至 50倍的誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體。誘導(dǎo)凋亡的HER2抗體的例子有7C2和 7F3。
"表位2C4"指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中抗體2C4所結(jié)合的區(qū)域。為了篩 選結(jié)合2C4表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)定法，諸如《Antibodies, A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane, 1988中所記載的。優(yōu)選的是，所述抗體將2C4對(duì)HER2的結(jié)合阻斷 約50°/?；蚋?。或者，可進(jìn)行表位作圖以評(píng)估抗體是否結(jié)合HER2的2C4 表位。表位2C4包含來(lái)自HER2胞外結(jié)構(gòu)域中結(jié)構(gòu)域II的殘基。2C4和 Pertuzumab在結(jié)構(gòu)域I、 II和III的連接處結(jié)合HER2的胞外結(jié)構(gòu)域。Franklin d a/" Ca廳r Ce〃 5: 317-328 (2004)。
"表位4D5"指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中抗體4D5 ( ATCC CRL 10463 ) 和Trastuzumab所結(jié)合的區(qū)域。此表位接近HER2的跨膜結(jié)構(gòu)域，且在HER2 的結(jié)構(gòu)域IV內(nèi)。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)
定法,諸如《Antibodies, A Laboratory Manual》,Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane， 1988中所記載的。或者，可進(jìn)行表位作圖以評(píng)估 抗體是否結(jié)合HER2的4D5表位(例如HER2 ECD的大約第529位(含該位 點(diǎn))殘基至大約第625位(含該位點(diǎn))殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，該殘 基編號(hào)包括信號(hào)肽)。
"表位7C2/7F3"指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I內(nèi)N末端處7C2和 /或7F3抗體(各自保藏于ATCC,見(jiàn)下文)所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合 7C2〃F3表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)定法，諸如《Antibodies, A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane， 1988中所記載的?；蛘?，可進(jìn)行表位作圖以確定抗體是否結(jié)合HER2上的 7C2/7F3表位(例如HER2 ECD的大約第22位殘基至大約第53位殘基區(qū)域 內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，殘基編號(hào)包括信號(hào)肽)。
"處理"和"治療"(treatment)指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要 治療的受試者包括那些早就患有疾病的以及要預(yù)防疾病的。因此，本文中待 治療的患者可能已經(jīng)診斷為患有疾病或者可能有患上疾病的傾向性或易感 性。 .
術(shù)語(yǔ)"有效量"指在患者中有效治療癌癥的藥物量。有效量的藥物可減 少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小腫瘤的大??；抑制(即一定程度的減緩和優(yōu)選阻止) 癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周?chē)鞴僦?；抑?即一定程度的減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移； 一定程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度的減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥 狀。藥物可一定程度上阻止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞，它可以是 抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的(細(xì)胞毒性的)藥物。有效量可延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展存活 (progression free survival),導(dǎo)致客觀響應(yīng)(包括部分響應(yīng)，PR或完全響應(yīng)， CR)，增加總體存活時(shí)間，和/或改善癌癥的一種或多種癥狀。
"完全響應(yīng)(complete response)"或"完全消退"指癌癥的所有癥狀響應(yīng) 治療而消失。這并不總是意味著癌癥得到治愈。
"部分響應(yīng)"指一處或多處腫瘤或損傷的大小或癌癥在身體中的范圍響 應(yīng)治療而縮小。
術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒劑"在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞 破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素(例如At211、 I131、 I125、 Y9G、 Re186、 Re'88、 Sm153、 Bi212、 P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸
如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和 /或變體。
"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷化劑
類(alkylating agents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide);石黃酸》克基酯類(alkyl sulfonates), i者如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)牙口派泊舒凡(piposulfan); 氮丙p定類(aziridines)，諸i口苯 佐替y泉(benzodepa)、 卡〉皮酉昆(carboquone)、 美妥替》泉(meturedepa)和烏瑞替》泉 (uredepa); 乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines)， 包 括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克i^石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine); TLK 286 ( TELCYTA );番荔枝內(nèi)酯 類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)); 四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol), MARINOL ); (3-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸 (betulinic acid);喜初于石咸(camptothecin)(包4舌合成類似物4乇泊替康(topotecan) (HYCAMTIN )、 CPT-11 (伊立替康(irinotecan), CAMPTOSAR )、乙酰 喜樹(shù)堿、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹(shù)堿)；苔蘚抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和 比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸 (podophyllinic acid);替尼泊苦(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(對(duì)爭(zhēng)另'J是 隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成類似 物，KW-2189和CB1-TM1 ); 艾榴塞洛素(eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin;》每纟帛承卩素(spongistatin);氮芥類(nitrogen mustards), i者長(zhǎng)口苯丁&臾 氮芥(chlorambucil)、茶氮齊(chlornaphazine)、月旦石粦醜胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺 (mechlorethamine)、 鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法 侖(mdphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司 汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧卩定氮芥(uracil mustard); 亞硝 脲類(nitrosoureas), i者如卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、福 莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀 (ranimustine); 二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate); 抗 生素類，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(例如加利車(chē)霉素(calicheamicin)， 尤其是加利車(chē)霉素yll和加利車(chē)霉素coll (參見(jiàn)例如Agnew, C/2em.
33: 183-186 (1994))和蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)諸如annamycin、 AD 32 、 alcarubicin 、 柔紅霉素(daunorubicin)、 右雷佐生(dexrazoxane)、 DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、 GPX-100、伊達(dá)比星(idarubicin)、 KRN5500、 美諾立爾(menogaril)、 dynemicin包括dynemicin A、埃斯波霉素(esperamicin)、 新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán)、阿克 拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、 氛茴霉素(anthramycin)、 偶 氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、 carabicin 、 洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、 色霉素 (chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮 -5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔 比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體和脫氧多 柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西羅霉素(marcellomydn)、絲裂霉素類 (mitomycins)諸如絲裂霉素C、 霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素 (nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、 potfiromycin、 噤呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈 黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美 司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);葉酸類似物，諸 如二曱葉酸(denopterin)、蟲(chóng)萊酰三谷氨酸(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate); 嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、 6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、石克咪 。票呤(thiamiprine)和硫鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物，諸如安西他濱 (ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6_氮尿苷、卡莫氟(carmofUr)、阿糖胞苷 (cytarabine)、 雙脫氧尿芬(dideoxyuridine)、去氧氟尿香(doxifluridine)、依i若 他濱(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine); 雄激素類，諸如卡魯睪酉同 (calusterone)、 丙酉吏屈 <也i#酉同(dromostanolone propionate)、 表石危力#酉享 (epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，諸 如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);葉 酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酉l(folinic acid)(leucovorin);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);抗 葉酸(鹽/酯)抗瘤劑，諸如ALIMTA⑧、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、 二氫葉酸還原酶抑制劑諸如曱氨喋呤(methotrexate)、抗代謝物類，諸如5-
氟尿嘧啶OFU)及其前藥諸如UFT、 S-l和卡培他濱(capecitabine),及胸苦酸 合酶抑制劑和甘氨酰胺核糖核苷酸曱?；D(zhuǎn)移酶抑制劑諸如雷替曲塞 (raltitrexed) ( TOMUDEX , TDX); 二氫嘧咬脫氫酶抑制劑諸如恩尿嘧咬 (eniluracil); 醛磷酰胺糖芬(aldophosphamide glycoside); 氨基乙敞丙酸 (aminolevulinic acid); 安口丫咬(amsacrine); bestrabucil; 比生群(bisantrene); 依達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖 酉昆(diaziquone) ; elfornithine ; 依利醋4妄(elliptinium acetate); ^矣》皮審素 (epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖 (lentinan); 氯尼達(dá)明(lonidamine); 美登木素生物石威類(maytansinoids), i者^(guò)口 美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin); 米4乇胍月宗(mitoguazone); 米4乇 蒽酉昆(mitoxantrone);莫口底達(dá)醇(mopidamol); 二胺硝吖口定(nitracrine);噴司他 丁 (pentostatin); 蛋氨氮芥(phenamet); 吡柔比星(pirarubicin); 洛索蒽醌 (losoxantrone); 2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine); PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素 (rhizoxin); 西索菲蘭(sizofiran); 螺旋鍺(spirogermanium);纟田交鏈孑包菌S同酸 (tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone); 2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin) A、桿孢菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine)( ELDISINE , FILDESIN );達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol); 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol); 旅泊溴烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside) ( "Ara陽(yáng)C，，)；環(huán)石舞酰胺(cyclophosphamide); 塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)和紫杉烷類(taxanes)，例如TAXOL 紫杉醇(paclitaxel) ( Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、 ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉 醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois )和TAXOTERE 多西他塞(docetaxel) ( Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony， France); 苯丁酸氮芥 (chlorambucil);抗代謝物化療劑，諸如吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR ); 5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine) (XELODATM)、 6-巰基嘌呤、曱 氨喋呤(methotrexate)、 6J危鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷 ^齊曲塞(raltitrexed)、 阿4唐月包芬(arabinosylcytosine ARA-C cytarabine) (CYTOSAR-U )、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine) ( DTIC-DOME )、 azocytosine、
deoxycytosine、 pyridmidene、 氟達(dá)拉濱(fludarabine) ( FLUDARA )、克拉屈 濱(cladrabine)、和2-脫氧-D-葡萄糖；6-硫鳥(niǎo)。票呤(thioguanine);巰基噪呤 (mercaptopurine); 基于4白的化療劑，t者如卡柏(carboplatin)、順柏(cisplatin) 或奧沙利鈕(oxaliplatin); 長(zhǎng)春堿(vinblastine) ( VELBAN );依托泊苷 (etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng) 春新i威(vincristine) ( ONCOVIN );長(zhǎng)春花生物石威類(vinca alkaloid);長(zhǎng)春瑞 濱(vinorelbine) (NAVELBINE );能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate); 道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希羅達(dá)(xeloda);伊本膦酸 鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000; 二氟曱基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);類 維A酸(retinoids),諸如視黃酸(retinoic acid);任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、 酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多 柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫(xiě))和FOLFOX (奧沙利鉑
(ELOXATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫(xiě))。
該定義還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑，諸如抗雌 激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)
(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、—雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、 4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、 LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抑 制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪 唑、氨魯米特(aminoglutethimide) 、 MEGASE 醋酸曱地孕酮(megestrol acetate) 、 AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔峻 (fadrozole) 、 RIVISOR 伏羅唑(vorozole) 、 FEMARA 來(lái)曲唑(letrozole)和 ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、 尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞4木(leuprolide)和戈舍 瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine) ( 1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似 物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及粘著細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基 因表達(dá)的，諸如例如PKC-a、 Raf、 H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R);疫 苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和 VAXID⑧疫苗；PROLEUKIN rIL-2; LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶1抑制劑； ABARELIX⑧rmRH;及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。
"抗血管發(fā)生劑，，指阻斷或一定程度的干擾血管發(fā)育的化合物?？寡?br> 小分子或抗體。在本文中優(yōu)選的抗血管發(fā)生因子是結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子
(VEGF)的抗體，諸如bevacizumab ( AVASTIN )。
術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì) 胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多 肽激素。細(xì)胞因子中包括生長(zhǎng)激素，諸如人生長(zhǎng)激素、N-曱硫氨酰人生長(zhǎng)激 素和牛生長(zhǎng)激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松 馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃 體激素(LH);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤(pán)催乳激素； 肺瘤壞死因子-a和-P;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān) 肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO); 神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-(3;血小板衍生生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)， 諸如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);骨 誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor);干擾素，諸如干擾素-a、 -|3和-y;集落刺激 因子(CSF),諸如巨噬細(xì)胞CSF (M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF (GM-CSF) 和粒細(xì)胞CSF(G-CSF);"白介素(IL)，諸如IL-1、 IL-la、 IL-2、 IL-3、 IL陽(yáng)4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12;腫瘤壞死因子，諸如 TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文 時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然 序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。
在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"EGFR靶向藥物"指結(jié)合EGFR并任選抑制EGFR 活化的治療劑。此類藥劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合EGFR 的抗體的例子包括MAb 579 ( ATCCCRLHB 8506)、 MAb 455 ( ATCC CRL HB 8507 )、 MAb 225 ( ATCC CRL 8508 )、 MAb 528 ( ATCC CRL 8509 )(參 見(jiàn)美國(guó)專利第4,943,533號(hào)，Mendelsohn等人)及其變體，諸如嵌合化225 (C225或Cetuximab; ERBUTIX )和重構(gòu)人225( H225 X參見(jiàn)WO 96/40210， Imclone Systems Inc.); IMC-11F8,完全人的EGFR靶向抗體(Imclone );結(jié) 合II型突變體EGFR的抗體(美國(guó)專利第5，212,2卯號(hào))；結(jié)合EGFR的人源 化和嵌合抗體，如美國(guó)專利第5,891,996號(hào)中所述；及結(jié)合EGFR的人抗體， 諸如ABX-EGF (參見(jiàn)WO 98/50433， Abgenix ); EMD 55900 ( Stragliotto a/., ￡紅 / Qz"cer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 ( matuzumab ),針對(duì)EGFR、
與EGF和TGF-a都竟?fàn)嶦GFR結(jié)合的人源化EGFR抗體；及mAb 806或人 源化mAb 806 ( Johns d a/., 所o/. Ozew. 279(29): 30375-30384 (2004))?？?EGFR抗體可偶聯(lián)細(xì)胞毒劑，如此產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(參見(jiàn)例如EP 659,439 A2， Merck Patent GmbH )。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib (IRESSATM; Astra Zeneca ); CP-358774或Erlotinib ( TARCEVA ; Genentech/OSI);和AG1478、 AG1571 ( SU 5271; Sugen ); EMD-7200。
"酪氨酸激酶抑制劑"指抑制酪氨酸激酶諸如HER受體的酪氨酸激酶 活性的分子。此類抑制劑的例子包括上一段中提到的EGFR靶向藥物；小分 子HER2酪氨酸激酶抑制劑，諸如可從Takeda購(gòu)買(mǎi)的TAK165; CP-724，714, ErbB2受體酪氨酸激酶的口服選擇性抑制劑(Pfizer and OSI);優(yōu)先結(jié)合 EGFR但抑制HER2和EGFR 二者過(guò)表達(dá)細(xì)胞的雙重HER抑制劑，諸如 EKB-569(可從Wyeth購(gòu)買(mǎi))；GW572016(可從Glaxo購(gòu)買(mǎi))， 一種口服HER2 和EGFR酪氨酸激酶抑制劑；PKI-166(可從Novartis購(gòu)買(mǎi))；泛HER (pan-HER) 抑制劑,諸如canertinib ( CI-1033; Pharmacia); Raf畫(huà)l抑制劑，諸如可從ISIS Pharmaceuticals購(gòu)買(mǎi)、抑制Raf-1信號(hào)傳導(dǎo)的反義劑ISIS-5132;非HER靶 向TK抑制劑，i者如可乂人Glaxo購(gòu)買(mǎi)的Imatinib mesylate ( GLEEVACTM ); MAPK胞外調(diào)控激酶I抑制劑CI-1040 (可從Pharmacia購(gòu)買(mǎi))；喹唑啉類， 諸如PD 153035, 4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡咬并嘧咬類；嘧咬并嘧咬類；吡 咯并嘧啶類，諸如CGP 59326、 CGP 60261和CGP 62706;吡唑并嘧"定類， 4-(苯氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶；姜黃素(二阿魏酰曱烷，4,5-雙(4-氟苯胺基)-狀亞胺)；含硝基p塞吩模塊的tyrphostines; PD-0183805 ( Warner-Lambert); 反義分子(例如那些結(jié)合HER編碼核酸的)；喹喔啉類(美國(guó)專利第5，804，396 號(hào))；tryphostins(美國(guó)專利第5,804,396號(hào))；ZD6474( Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG );泛HER抑制劑，諸如CI-1033 ( Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); Imatinib mesylate ( Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth ); Semaxinib ( Sugen ); ZD6474 ( AstraZeneca ); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone);或如任何下列專利出版物 中所記載的美國(guó)專利第5,804,396號(hào)；WO 99/09016 ( American Cyanimid ); WO 98/43960 ( American Cyanamid ); WO 97/38983 ( Warner Lambert); WO 99/06378 ( Warner Lambert); WO 99/06396 ( Warner Lambert ); WO 96/30347
(Pfizer， Inc.); WO 96/33978 ( Zeneca); WO 96/3397 ( Zeneca); WO 96/33980 (Zeneca )。
II.抑制HER2脫落
本申請(qǐng)關(guān)注用于抑制HER2脫落的方法，包括用有效抑制HER2脫落的 量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑處理表達(dá)HER2的細(xì)胞或?qū)⒈磉_(dá)HER2的 細(xì)胞暴露于有效抑制HER2脫落的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。優(yōu)選 的是，所述MMP拮抗劑是膜束縛MMP(MT-MMP)拮抗劑，諸如MTl-MMP (MMP-14) 、 MT2-MMP (MMP-15) 、 MT3-MMP (MMP-16) 、 MT5-MMP (MMP-24)、 MT4-MMP(MMP-17)或MT6-MMP(MMP-25)。最優(yōu)選的是，所 述MT-MMP是MMP-15,而且希望，所述拮抗劑選擇性或優(yōu)先結(jié)合MMP-15 但不顯著結(jié)合其它蛋白酶或MMP-15以外的MMP,和/或所述拮抗劑干擾 MMP-15蛋白水解功能但不顯著干擾其它蛋白酶或MMP-15以外的MMP的 功能。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所處理的細(xì)胞展示出HER和/或MMP表達(dá)、擴(kuò) 增或活化。例如，所述細(xì)胞展示出HER2和/或MMP-15過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增。
MMP拮抗劑的活性可通過(guò)將其與其它抗腫瘤藥物、HER抑制劑或HER2 抗體(諸如trastuzumab或pertuzumab )聯(lián)合而增強(qiáng)?？梢耘cMMP拮抗劑l關(guān) 合的HERJ中制劑的例子包才舌trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX畫(huà)EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC-11F8 和TAK165。
本發(fā)明還關(guān)注用于在哺乳動(dòng)物中降低HER2胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)血清水平 的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用在哺乳動(dòng)物中有效降低HER2 ECD血清水平的 量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。所述哺乳動(dòng)物任選具有升高的MMP水平。
本發(fā)明還提供了用于在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施 用有效治療癌癥的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。所述癌可展示出HER 和/或MMP表達(dá)、擴(kuò)增或活化。例如，所述癌可展示出HER2或MMP-15 過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，所治療的哺乳動(dòng)物具有升高的脫落HER2 血清水平或升高的p95 HER2水平。
本發(fā)明還涉及用于在哺乳動(dòng)物中治療HER抑制劑抗性癌癥的方法，包
括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效治療癌癥的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。例
如，所述哺乳動(dòng)物可對(duì)HER2抗體，諸如trastuzumab有抗性。
還提供了用于降低細(xì)胞中p95 HER2水平的方法，包括將細(xì)胞暴露于有
效降低p95 HER2水平的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
可使用多種MMP拮抗劑，優(yōu)選的是，所述MMP拮抗劑是小分子抑制
劑或抗體。下文描述了用于生成抗體的方法。
III.抗體的生產(chǎn)
下文描述了用于生成依照本發(fā)明使用的抗體的例示性技術(shù)。用于生成抗 體的抗原可以是例如可溶形式的抗原或其包含期望表位的部分?；蛘撸谄?細(xì)胞表面表達(dá)抗原的細(xì)胞(例如經(jīng)轉(zhuǎn)化而過(guò)表達(dá)HER2的NIH-3T3細(xì)胞；或 癌細(xì)胞系，諸如SK-BR-3細(xì)胞，參見(jiàn)Stancovski d a/., /WJS (^/5*^) 88: 8691-8695 (1991))可用于生成抗體?？捎糜谏煽贵w的其它形式抗原對(duì)于本 領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原 和佐劑來(lái)生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來(lái)酰亞胺苯曱?；腔?酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、 戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R^N^ONR,其中R和W是不同的烴基，將 相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙 孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過(guò)將例如IOO嗎或5嗎蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍 體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，將動(dòng)物針對(duì)抗 原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。 一個(gè)月后，通過(guò)多個(gè)部位的皮下注 射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。 7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫， 直到滴度達(dá)到穩(wěn)定(plateau)。優(yōu)選的是，將動(dòng)物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì) 和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。偶聯(lián)物還可在重組細(xì) 胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來(lái)制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來(lái)增強(qiáng) 免疫應(yīng)答。
本領(lǐng)域有多種方法可用于制備本文中的單克隆抗體。例如，單克隆抗體
可使用最初由Kohler Wa/., A^fww 256: 495 (1975)描述的雜交瘤方法、通過(guò)重 組DNA方法(美國(guó)專利第4,816,567號(hào))來(lái)制備。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，諸如倉(cāng)鼠， 以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免 疫的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸 如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding， 《Monoclonal Antibodies: Principles and Practice》,第59-103頁(yè),Academic Press, 1986)。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu) 選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如， 若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃噤呤鳥(niǎo)噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或 HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃噪呤、氨基喋呤和胸苷 (HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水 平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選 的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA)獲4尋的 MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤及可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA)獲得的 SP-2或 X63-Ag8-653細(xì)胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系用于生成人 單克隆抗體也已有記載(Kozbor，J /mmw"o/. 133: 3001 (1984); Brodeur等人， 《Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications》,第51-63頁(yè), Marcel Dekker, Inc. ， New York, 1987 )。
可對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)抗原的單克隆抗體的 生成。優(yōu)選的是，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射性免疫測(cè) 定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆 抗體的結(jié)合特異性。
單克隆4元體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如Munson e/ "/.，107: 220 (1980)的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。
在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞
后，所述克隆可通過(guò)有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)
(Goding,《Monoclonal Antibodies: Principles and Practice》，第59-103頁(yè), Academic Press, 1986 )。適于這 一 目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或 RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。 可通過(guò)常規(guī)抗體純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、 凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或 血清適當(dāng)分開(kāi)。
編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測(cè)序(例如通過(guò)使用 能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤 細(xì)胞作為此類DNA的優(yōu)選來(lái)源。 一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中， 然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外生成抗體蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿 菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組 宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組 表達(dá)的綜述'〖生"i倉(cāng)文包^舌Skerra a/., Cw/r. C^/mbw z'w /mmwwo/. 5: 256-262 (1993)及Pliickthun,/mw朋o/.130: 151-188(1992)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCafferty a/., A^ww 348: 552-554 (1990)所述技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)中分離單克隆抗體或抗體片段。 Clackson a/.，淑歸352: 624-628 (1991)及Marks " a/" 乂 Mo/.編.222: 581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載 了通過(guò)鏈改組(Marks d a/.，所o/rec/z"o/ogy 10: 779-783 (1992))，以及組合感 染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的喧菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse d a/.， M/c. ^c/A i 仏21: 2265-2266 (1993))，生成高親和力(nM范圍)的人抗體。如 此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替 代方法。
還可以-修飾DNA，例如通過(guò)替代即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列 代替同源鼠序列(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Morrison " 尸rac. A^/. ^cad
t/SJ 81: 6851 (1984))，或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序 列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)接合。
典型的，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)，或者用它們替代 抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，它包含對(duì)一種抗 原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原
結(jié)合位點(diǎn)。
"W 乂源^戎傳
體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常 稱作"輸入"殘基，它們典型的取自"輸入，，可變區(qū)。人源化可基本上遵循
Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones 7Va^w 321: 522-525 (1986);
Riechmann a "/., 7V虛re 332: 323-327 (1988); Verhoeyen w a/" /Sc/ewce 239: 1534-1536 (1988))，通過(guò)用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類 "人源化"抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利第4,816,567號(hào))，其中本質(zhì)上少于整 個(gè)人可變區(qū)用來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體典型的 是其中 一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來(lái)自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn) 的殘基替代的人抗體。
用于構(gòu)建人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對(duì)于降 低抗原性非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可 變區(qū)序列對(duì)已知的人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最 接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR) ( Sims W a/., 乂 /mwwwo/. 151: 2296 (1993); Chothia d J Mo/. Ao/. 196: 901 (1987))。另 一種方法4吏用由 特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架 可用于凄t種不同的人源化抗體(Carter " a/.,尸rac. Mrf/. ^cad t7X4 89: 4285 (1992); Presta " a/.,/麵畫(huà)/. 151: 2623 (1993))。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高親和力及其它有利的生 物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，通過(guò)使用親本和人源 化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來(lái)制備人 源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員 所熟悉?？色@得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的 計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功 能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這 樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得期望抗體特 征，諸如對(duì)把抗原的親和力提高。 一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉 及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
(7v,人發(fā)#
作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏 內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時(shí)生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接 區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠 中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊時(shí)生成人抗體。參見(jiàn)例
如JakobovitsA^/.90: 2551 (1993); Jakobovits ^a/.: 淑匿362: 255-258 (1993); Bruggermann d a/" F麼/顯畫(huà).7: 33 (1993); 及美國(guó)專利第5,591,669號(hào)、第5,589,369號(hào)和第5,545,807號(hào)。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty d 。/.，胸置348: 552-553 (1990)) 可用于在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)基因全集生成人抗 體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克 隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體 顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組 的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那 些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體 展示可以多種形式進(jìn)行；有關(guān)綜述參見(jiàn)例如Johnson, Kevin S. and Chiswell， David J., C醉ewf (9—'ow 1w"畫(huà)/編ogy 3: 564-571 (1993)。 V基因區(qū)段 的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson " a/., A^/wre 352: 624-628 (1991)從 衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)中分離得到大量不同的抗o 惡哇酮抗體?？杀举|(zhì)上遵循Marks d a/" / Mo/.編.222: 581-597 (1991)或 Griffith " a/., 12: 725-734 (1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V
基因全集和分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見(jiàn)美國(guó)
專利第5,565,332號(hào)和第5,573,905號(hào)。
如上所述，還可通過(guò)體外激活B細(xì)胞來(lái)生成人抗體(參見(jiàn)美國(guó)專利第 5,567,610號(hào)和第5,229,275號(hào))。
1998年6月30日公告的美國(guó)專利第5,772,997號(hào)和1997年1月3日公 開(kāi)的WO97/00271中記載了人HER2抗體。
(V」在沐^^
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于生成包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段的多種技 術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見(jiàn)例如Morimoto ef a/.， Jowma/ 。/ S/oc/ze附/ca/ 5—/z戸'ca/ 7Wef/zc^ 24: 107-117 (1992);
Brennan"fl/.,Sc/ewce229: 81 (1985))。然而，現(xiàn)在可直4妄由重組宿主細(xì)胞生 成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫(kù)中分離抗體片段?；蛘?， 可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter & a/.,說(shuō)o/7k;/^o/ogy 10: 163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主 細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)熟練從業(yè)人員 將是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參 見(jiàn)WO 93/16185;美國(guó)專利第5，571,894號(hào)；美國(guó)專利第5，587，458號(hào)。抗體 片段還可以是"線性抗體"，例如如美國(guó)專利第5，641，870號(hào)中所述。此類線 性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
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雙特異性抗體指具有對(duì)至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。例示性 的雙特異性抗體可結(jié)合HER2蛋白質(zhì)的兩種不同表位。其它此類抗體可將 HER2結(jié)合位點(diǎn)與EGFR、 HER3和/或HER4的結(jié)合位點(diǎn)組合在一起?；蛘撸?可將HER2臂與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或 CD3 )或IgG的Fc受體(FcyR)，諸如FcyRI (CD64)、 FcyRII (CD32)和FcyRin (CD16)的臂組合在一起，使得細(xì)胞防御機(jī)制聚焦于HER2表達(dá)細(xì)胞。雙特異 性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)HER2的細(xì)胞。這些抗體擁有HER2 結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-cu長(zhǎng)春花生物堿類、 蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗 體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
WO 96/16673記載了一種雙特異性HER2/FcyRI11抗體，美國(guó)專利第 5,837,234號(hào)公開(kāi)了一種雙特異性HER2/FcyRI抗體IDM1 (Osidem)。 WO 98/02463顯示了一種雙特異性HER2/Fca抗體。美國(guó)專利第5,821,337號(hào)教 導(dǎo)了 一種雙特異性HER2/CD3抗體。MDX-210是一種雙特異性HER2-FcyRIH 抗體。
用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域知道的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳 統(tǒng)生成基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特 異性(Millstein "a/., Atowe 305: 537-539 (1983))。由于免疫J求蛋白重鏈和輕 鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分 子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層 析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。WO 93/08829及
Traunecker^a/.，五M5(97: 10: 3655-3659 (1991)中公開(kāi)了類似的流程。
依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)) 的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸 鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合 物中，第一重鏈恒定區(qū)(CH1)包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋 白重鏈融合物和，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開(kāi)的表達(dá)載體， 并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供 最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈 活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比率沒(méi) 有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個(gè)表達(dá) 載體。
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié) 合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另 一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕 鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性 分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望 的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開(kāi)。該方法公開(kāi)于WO 94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見(jiàn)例如Suresh ef 她f/ioiis //i ￡"^ymo/ogy 121: 210 (1986)。
依照美國(guó)專利第5,731,168號(hào)中記載的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分 子之間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu) 選的界面包含至少部分抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分 子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。 通過(guò)將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第 二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對(duì)大側(cè)鏈的相同或相似大小的補(bǔ)償性"空腔"。 這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一 種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用 于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利第4,676,980號(hào))，及用于治 療HIV感染(WO 91/00360、 WO 92/200373和EP 03089 )?？墒褂萌魏伪憷?的交聯(lián)方法來(lái)制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且 連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開(kāi)于美國(guó)專利第4,676,980號(hào)。
文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化
學(xué)連接來(lái)制備雙特異性抗體。Brennan " a/.， 5Wewce 229: 81 (1985)記載了通 過(guò)蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的流程。將這些片段在存在二硫 醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵 的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸綍跛狨?TNB)衍生物。然 后將Fab'-TNB衍生物之一通過(guò)巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與 等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙 特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué) 偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby e/a/.， J 175: 217-225 (1992)記
載了生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子。每個(gè)Fab'片段由大腸桿菌 分開(kāi)分泌，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙 特異性抗體能夠結(jié)合過(guò)表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人 細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。
還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種 技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny " a/.,/www"o/. 148(5): 1547-1553 (1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融 合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而形成單 體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚 體。由Hollinger " a/., Prac. iVw/. Jcad t/5L4 90: 6444-6448 (1993)描述的 "雙抗體"技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過(guò)
接頭相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(vo，所述接頭太短使得同一條鏈
上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的Vh和Vl結(jié)枸域與 另一個(gè)片段上的互補(bǔ)Vl和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還
報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv (sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另 一種策略。 參見(jiàn)Gruber ef a/" /mmw"o/. 152: 5368 (1994)。
設(shè)想了具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt " a/., 乂/mw畫(huà)/. 147:60(1991)。
"^它^差凝#/{/發(fā)謬
設(shè)想了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié) 合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過(guò)將適宜的核苷酸改變引入抗體核酸或者
通過(guò)肽合成來(lái)制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體氨基si/f
列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有期望特性，可 進(jìn)行刪除、插入和替代的任意組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可改 變抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的 一種方法稱
作"丙氨酸掃描誘變"，如Cunningham and Wells, Sc/e"ce 244: 1081-1085 (1989) 所述。這里，鑒定了一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨 酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸 (最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后 通過(guò)在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲那些對(duì)替代展現(xiàn)出功能敏感 性的氨基酸位置。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但 是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在給定位點(diǎn)處的突變的 后果，在耙密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)的抗體變 體篩選期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基至 包含上百個(gè)或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。 末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融 合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶(例 如用于ADEPT )或」提高抗體血清半衰期的多肽。
另 一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少 一個(gè)氨基 酸殘基用不同殘基替換。最感興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也設(shè) 想了 FR改變。
任何不涉及保持抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨 酸，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱 氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是抗體片段諸如Fv片段時(shí))。
特別優(yōu)選的一類替代變體涉及替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的 一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生 它們的親本抗體將具有改進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方 法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如 6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此產(chǎn)生的抗 體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13
基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開(kāi)的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生 物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn) 行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另
外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和人HER2之間的接觸
點(diǎn)可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代 的候選位點(diǎn)。 一旦產(chǎn)生此類變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選擇 在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。
抗體的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化模式。改變意味著刪 除在抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一 個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
抗體的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合 物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰 胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶 促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存 在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。0-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸i最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可 使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)
上述三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通 過(guò)向原始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行 (用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。
若抗體包含F(xiàn)c區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國(guó)專利 申請(qǐng)US 2003/0157108 Al (Presta,L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合 物結(jié)構(gòu)附著于抗體Fc區(qū)的抗體。還可參見(jiàn)US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co" Ltd.)。 WO 03/011878 (Jean德iret等人)和美國(guó)專利第 6,602,684號(hào)(Umana等人)中提到了在附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中有等 分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO 97/30087 (Patel等人)中報(bào)告了在附著 于抗體Fc區(qū)的寡糖中有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有更改碳水化合 物附著于其Fc區(qū)的抗體還可參見(jiàn)WO 98/58964 (Raju,S.)和WO "/22764 (Raju,S.)。
可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如增強(qiáng)抗體的抗體依
賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通 過(guò)在抗體Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者/另外，可在Fc
區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容許在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同 二聚體抗體可具有改進(jìn)的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗
體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron d "/.， 7!176: 1191-1195 (1992)和Shopes,B., / /附mw"o/. 148: 2918-2922 (1992)。具有增強(qiáng)的 抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可4吏用如Wolff " a/., Ca"cer We"arc/2 53: 2560-2565 (1993)中記載的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備?；蛘?，抗體可改造成具有 雙重Fc區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見(jiàn)Stevenson "a/., 顛-Ca"m"DragZ)鄉(xiāng)"3: 219-230 (1989)。
WO 00/42072 (Presta，L.)記載了在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)具有改進(jìn)的ADCC 功能的抗體，其中所述抗體在其Fc區(qū)中包含氨基酸替代。優(yōu)選的是，具有 改進(jìn)的ADCC的抗體在Fc區(qū)的位置298、 333和/或334包含替代。優(yōu)選的 是，改變的Fc區(qū)是在這些位置中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)處包含替代或由其組 成的人IgGl Fc區(qū)。
WO 99/51642、美國(guó)專利第6,194,551 Bl號(hào)、美國(guó)專利第6,242,195 Bl 號(hào)、美國(guó)專利第6,528,624 Bl號(hào)和美國(guó)專利第6,538,124號(hào)(Idusogie等人)中 記載了具有改變的Clq結(jié)合和/和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的抗體。所述抗 體在其Fc區(qū)的氨基酸位置270、 322、 326、 327、 329、 313、 333和/或334 (如Kabat中那樣使用Fc區(qū)殘基的Eu編號(hào))中的一個(gè)或多個(gè)處包含氨基酸 替代。
為了延長(zhǎng)抗體的血清半衰期，可如例如美國(guó)專利第5,739,277號(hào)中所述 將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"補(bǔ) 救受體結(jié)合表位'，指IgG分子(例如IgG,、 IgG2、 IgG4lgG4)的Fc區(qū)中 負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。
WO 00/42072 (Presta， L.)和US 2005/0014934 Al (Hinton et al.)中記載了 具有改進(jìn)的對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合和延長(zhǎng)的半衰期的抗體。這些抗 體包含其中具有一處或多處改進(jìn)Fc區(qū)對(duì)FcRn結(jié)合的替代的Fc區(qū)。例如， Fc區(qū)可在其一個(gè)或多個(gè)下列位置具有替代238、 250、 256、 265、 272、 286、 303、 305、 307、 311、 312、 314、 317、 340、 356、 360、 362、 376、 378、 380、 382、 413、 424、 428或434 (如Kabat中那樣使用Fc區(qū)殘基的Eu編號(hào))。優(yōu)選的具有改進(jìn)的FcRn結(jié)合的含F(xiàn)c區(qū)抗體變體在其Fc區(qū)的位置307、 380和434中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)處包含氨基酸替代。
還設(shè)想了具有三個(gè)或更多(優(yōu)選四個(gè))功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程改造 抗體(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朥S 2002/0004587 Al ， Miller等人)。
編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過(guò)本領(lǐng)域知道的多種方法制 備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然存在氨基酸序列變體的 情況中)，或者通過(guò)對(duì)早期制備的變體或非變體型式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介 導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。
一名瘦偶炎參
本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑 諸如化療劑、毒素(例如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶 活毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑。本文還設(shè)想了抗 體與一種或多種小分子毒素的偶聯(lián)物，諸如加利車(chē)霉素、美登素(美國(guó)專利 第5,208,020號(hào))、單端孢菌毒素和CC1065。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將抗體與一個(gè)或多個(gè)美登素分子偶聯(lián) (例如每個(gè)抗體分子偶聯(lián)約1個(gè)至約IO個(gè)美登素分子)。例如，可將美登素 轉(zhuǎn)變?yōu)镸ay-SS-Me,后者可還原為May-SH3并與經(jīng)^修飾抗體反應(yīng)(Chari " 。/., Owcer i a^arc/7 52: 127-131 (1992))以生成美登木素生物石成-抗體免疫偶 聯(lián)物。
另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)加利車(chē)霉素分子的 抗體。加利車(chē)霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？?使用的加利車(chē)霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于Yi1、 a2l、 (X31、 N畫(huà)乙?；?Y,1、 PSAG和9'i( Hinman " a/" C朋cer 7 e化a,c/2 53: 3336-3342 (1993)和Lode " a/.: Owcer^^arc/z 58: 2925-2928 (1998))。還可參見(jiàn)美國(guó)專利第5,714,586號(hào)； 第5,712,374號(hào)；第5,264,586號(hào)和第5,773,001號(hào)，明確收入本文作為參考。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性 片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孑包菌(i^ewcfoww w aerag/"osa))、蓖麻毒 蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin) A鏈、a-帚曲毒素 (sarcin)、油桐(J/ewn'fes /oratt)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸 CP to/aca ylmen'ca憩)毒蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S )、苦瓜(momordica
charantia)抑制物、麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)、 巴豆毒蛋白(crotin)、肥急草 (sapaonaria officinalis)抑制物、白樹(shù)毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局 卩艮曲菌素(restrictocin)、 酴霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)矛口單端孑包 菌毒素(tricothecenes)。參見(jiàn)例如1993年10月28日公開(kāi)的WO 93/21232。
本發(fā)明還設(shè)想了抗體與具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或 DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。
有多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)的HER2抗體。例子包括 At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 P"和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如 N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬 來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己胺-l-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己 二酰亞胺二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊 二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸 如雙(對(duì)重氮苯曱?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、 和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如， 可如Vitetta " Sc/ewce 238: 1098 (1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用 于將放射性核素與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見(jiàn)WO 94/11026。接頭可以 是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn) 定接頭、肽酶每文感接頭、二曱基接頭或含二硫化物接頭(Chari"a/.，Owcer to,A52: 127-131 (1992))。
或者，可例如通過(guò)重組技術(shù)或肽合成來(lái)制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合 蛋白。
本文還設(shè)想了其它免疫偶聯(lián)物。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚 合物中的一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚 丙二醇的共聚物。還可將抗體包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備 的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯) 微膠嚢)、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、 納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)/>開(kāi)于《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版,Osol,A.編，1980。
本文公開(kāi)的抗體還可配制成免疫脂質(zhì)體。可通過(guò)本領(lǐng)域知道的方法來(lái)制
備包含抗體的脂質(zhì)體，諸如Epstein " 戶rac. Waf/. Jcad C/SJ 82: 3688 (1985); Hwang d a/.，尸rac.淑/,5W.園77: 4030 (1980);美國(guó)專利第 4，485,045號(hào)和第4,544,545號(hào)；1997年10月23日公開(kāi)的WO 97/38731中所 記載的。美國(guó)專利第5,013,556號(hào)中公開(kāi)了循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體可用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰 乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠過(guò)具有限定 孔徑的濾器，以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin "fl/.,/.歷o/. C/zem. 257: 286-288 (1982)中所記載的，將本發(fā)明抗體的Fab，片段經(jīng)二硫化物交換 反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見(jiàn)Gabizon a/., / iVa"w a/Owcer81(19): 1484(1989)。
IV.藥用配制劑
通過(guò)將具有期望純度的MMP拮抗劑與任選的藥學(xué)可接受的載體、賦形 劑或穩(wěn)定齊'J (《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編， 1980)混合，以凍干劑型或水溶液的形式，制備依照本發(fā)明使用的MMP拮 抗劑的治療用配制劑供貯存?？山邮艿牟皿w、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑 量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有 機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二 曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對(duì) 羥基苯曱酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚； 環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)， 諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮； 氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單 糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如 鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如 TWEENtm、 PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。 WO97/04801中記載了凍千抗 體配制劑，在此明確收入作為參考。
本文中的配制劑還可含有超過(guò)一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化 合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒(méi)有不利影響的。下文治療方法部分中描述 了可與MMP拮抗劑聯(lián)合的各種藥物。合適的是，所述分子以對(duì)于預(yù)定目的
有效的量組合。
活性成分還可包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢 中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(甲基丙烯酸曱酉旨)微膠嚢)、 在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和
納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開(kāi)于例如《Remington's Pharmaceutical Sciences》,第16版，Osol,A.編,1980。
可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏 水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持 續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚 (乙烯S享))、聚交酯(美國(guó)專利第3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯 的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物 諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注 射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò) 濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。
V.治療
上文定義部分列出了可用MMP拮抗劑治療的各種癌癥的例子。MMP 拮抗劑的施用將導(dǎo)致癌癥的體征或癥狀的改善。
依照已知方法對(duì)人類患者施用MMP拮抗劑，諸如靜脈內(nèi)施用，例如推 注(bolus)或一段時(shí)間的連續(xù)輸注，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、 關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入路徑。
對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，MMP拮抗劑的劑量將取決于如上定義的待治 療癌癥的類型、癌癥的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、施用抗體是為了預(yù)防還是治療目的、 先前的療法、患者的臨床史和對(duì)抗體的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的判斷。
雖然MMP拮抗劑可以是施用的唯一抗腫瘤藥物，但是任選用MMP拮 抗劑與 一種或多種其它抗腫瘤劑的組合來(lái)治療患者。
聯(lián)合施用包括使用分開(kāi)的配制劑(separate formulations)或單一的藥用配 制劑(single pharmaceutical formulation)的共施用(coadministration)或同時(shí)施用 (concurrent administration),以及任一次序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選有一,殳時(shí)間 所有兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。如此，可在施用MMP
拮抗劑之前或之后施用其它抗鐘瘤劑。在此實(shí)施方案中，至少一次MMP拮 抗劑的施用和至少一次其它抗肺瘤劑的施用之間的計(jì)時(shí)優(yōu)選為約l個(gè)月或更 短，最優(yōu)選約2周或更短?；蛘?，以單一的配制劑或分開(kāi)的配制劑同時(shí)對(duì)患
者施用MMP拮抗劑和其它抗腫瘤劑。MMP拮抗劑和其它抗腫瘤劑的聯(lián)合 治療可對(duì)患者產(chǎn)生協(xié)同的、或者大于累加的治療效益。
可與MMP拮抗劑聯(lián)合的第二抗腫瘤劑的例子包括 一種或多種化療劑； HER抑制劑(例如trastuzumab 、 pertuzumab 、 cetuximab 、 ABX-EGF 、 EMD7200 、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC畫(huà)11F8、 TAK165 等)；Raf和/或ras抑制劑(參見(jiàn)例如WO 2003/86467 );生長(zhǎng)抑制性HER2 抗體，諸如trastuzumab; HER二聚化抑制劑，諸如Pertuzumab; i秀導(dǎo)過(guò)表 達(dá)HER2的細(xì)胞凋亡的HER2抗體，諸如7C2、 7F3、或其人源化變體；針 對(duì)腫瘤相關(guān)抗原諸如EGFR、 HER3、 HER4的抗體；抗激素化合物，例如抗 雌激素化合物諸如他莫昔芬，或芳香酶抑制劑；心臟保護(hù)劑(以預(yù)防或減輕 與治療有關(guān)的任何心肌功能障礙)；細(xì)胞因子；EGFR靶向藥物(諸如 TARCEVA 、 IRESSA⑧或Cetuximab);抗血管發(fā)生劑(尤其是Genentech 以商標(biāo)AVASTINTM銷(xiāo)售的bevacizumab );酪氨酸激酶抑制劑；COX抑制劑
(例如COX-l或COX-2抑制劑)；非類固醇抗炎藥，Celecoxib (CELEBREX );法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如可,人Johnson and Johnson購(gòu)買(mǎi) 的Tipifamib/ZARNESTRA Rl 15777或可從Schering-Plough購(gòu)買(mǎi)的 Lonafarnib SCH66336);結(jié)合癌胚蛋白CA 125的抗體，諸如Oregovomab
(MoAb B43.13 ); HER2疫苗(諸如Pharmexia的HER2 Auto Vac疫苗，或 Dendreon的APC8024蛋白質(zhì)疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；鹽酸 多柔比星脂質(zhì)體注射液(DOXIL⑧)；拓樸異構(gòu)酶I抑制劑，諸如托泊替康； 紫杉烷；HER2和EGFR雙重酪氨酸激酶抑制劑，諸如lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA ) ; EMD-7200 ; 降體溫藥物，諸如醋氨酚 (acetaminophen)、 苯海拉明(diphenhydramine)或麥口定(meperidine); 造血生長(zhǎng)
因子；等。
任何上述共施用藥劑的合適劑量就是那些目前所使用的劑量，而且可由
于該藥劑與MMP拮抗劑的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而降低。
在上述治療方案之外，還可對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)去除癌細(xì)胞和/或放療。
在對(duì)患者施用蛋白質(zhì)MMP拮抗劑之外，本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想了通過(guò)基因療法來(lái)
施用MMP拮抗劑。參見(jiàn)例如1996年3月14日公布的WO 96/07321，它關(guān) 注使用基因療法來(lái)生成胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者的細(xì)胞，即體內(nèi) 和回體(ex v/vo)。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要抗體的部位將核酸直接注射到 患者體內(nèi)。對(duì)于回體治療，采集患者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞， 并將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內(nèi)并植入患 者體內(nèi)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第4,892,538號(hào)和第5,283,187號(hào))。有多種技術(shù) 可用于將核酸導(dǎo)入可存活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)細(xì)胞 還是目的宿主的體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖 苷、磷酸鈣沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純 皰瘆病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的 脂質(zhì)有例如DOTMA、 DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，希 望與耙向輩巴細(xì)胞的試劑一起提供核酸源，諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特 異的抗體、耙細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，與胞吞作用相關(guān)細(xì)胞 表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具 有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、和靶向 細(xì)胞內(nèi)定位和增加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如Wu AW. C7^w. 262:
4429-4432 (1987); Wagner d a/"尸rac. ^cad 5W. "5^4 87: 3410-3414
(1990)中記載了受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療 方案的綜述參見(jiàn)Anderson " a/.， Sc/e"ce 256: 808-813 (1992)。還可參見(jiàn)WO 93/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。
VI.材料保藏
以下雜交瘤細(xì)胞系已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type
Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA) (ATCC):
抗體名稱ATCC編號(hào) 保藏日期
7C2 ATCCHB-12215 1996年10月17日
7F3ATCCHB-12216 1996年10月17日
4D5 ATCC CRL 104631990年5月24日
2C4 ATCCHB-12697 1999年4月8日
下文非限制性實(shí)施例例示了本發(fā)明的進(jìn)一步詳情。在此明確收入說(shuō)明書(shū) 中所有,引文的公開(kāi)內(nèi)容作為參考。
實(shí)施例
下文實(shí)施例研究了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在HER2脫落中的作用。
材料和方法
勿/《眷#和脊糴
此項(xiàng)研究中所使用的所有細(xì)胞系來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC， Manassas, VA)。 BT 474、 MCF-7和SKBR-3細(xì)胞在補(bǔ)充有10%熱滅活FBS 和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM:Ham氏F12 (50:50)中維持。Cos-7細(xì) 胞在補(bǔ)充有10%熱滅活FBS和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM中維持。 細(xì)胞系在供應(yīng)有5% C02的增濕培養(yǎng)箱中于37。C維持。BT 474和SKBR-3 細(xì)胞使用試劑盒V依照制造商的說(shuō)明書(shū)(AMAXATM)所述電穿孔法所述瞬時(shí) 轉(zhuǎn)染。Cos-7細(xì)胞使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen)依照制造商的建 議如所述轉(zhuǎn)染。
尸o5 *y2,"<§2 v、l^^^^^^產(chǎn)y^秀
Fo5和f2:1282系先前已有i己載(Finkle ef a/., C//w. Ca"cer 10: 2499-2511 (2004))。這些系衍生自來(lái)自MMTV HER2轉(zhuǎn)基因小鼠的原發(fā)性 腫瘤并在FVB小鼠的乳房脂肪墊中傳代。
將Fo5肺瘤移植到FVB小鼠中并在啟動(dòng)研究前讓其生長(zhǎng)至平均大小 400-600 mm3。 GM6001 ( 3-[N-羥基羰酰基]-[2R]-異丁基丙?；?L-色氨酸曱 酰 胺 , 3-[N-hydroxycarbomyl]-[2R]隱isobutylpropionyl-L-tryptophan methylamide)來(lái)自Calbiochem，在4%羧曱基纖維素/0.9% PBS的漿液中重 建，并以100mg/kg體重通過(guò)腹膜內(nèi)注射每天施用一次，持續(xù)3天。第三天 的注射后24小時(shí)，將動(dòng)物處死并通過(guò)心臟穿刺收集血清。在第0天和第4 天測(cè)量腫瘤大小。取出腫瘤并瞬間凍結(jié)，供進(jìn)一步分析。
謝務(wù);^/lFFZMEmxrM萍/！/
使用RNAEASYTM試劑盒(Qiagen, Chatsworth， CA)從瞬間凍結(jié)的腫瘤樣 品分離總RNA。通過(guò)DNA酶I處理(Roche Molecular Biochemicals)除去殘余 的基因組DNA。如先前所述(Jin， H " C7rcw/a"ow 103: 736-742 (2001)) 進(jìn)行和分析微陣列實(shí)驗(yàn)。將樣品與AFFYMETRIXTM小鼠基因組單一陣列 (MOE430P)和已知基因陣歹'J(MOE430A) (AFFYMETRIXTM, Inc., Santa Clara, CA)雜交。對(duì)于三份Fo5和三份f2:1282腫瘤樣品，進(jìn)行一式三份的實(shí)驗(yàn)。 進(jìn)行Mann-Whitney成對(duì)比較，認(rèn)為那些一致性超過(guò)80%的表達(dá)具有2倍增 量的基因是顯著的。使用GeneLogic Bioexpress數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneLogic, Gaithersburg, MD)，即來(lái)自細(xì)胞系和組織的AFFYMETRIXTM微陣列分析的基 因表達(dá)數(shù)據(jù)集合，檢查蛋白酶的表達(dá)，所述蛋白酶是從Fo5-f2:1282腫瘤差 異篩選SKBR-3和BT474細(xì)胞系中的表達(dá)鑒定的。
//腦五CD虹/5^
通過(guò)心臟穿刺收集來(lái)自攜帶Fo5或f2:1282異種移植腫瘤的小鼠的血清， 并使用先前記載的HER2 ELISA( Finkle Wa/.， C7/". Ca"cerA^. 10: 2499-2511 (2004))檢測(cè)HER2 ECD水平。將血清用測(cè)定緩沖液(PBS/0.5% BSA, 0.05% TWEEN 20/10ppm PROCLIN 300/0.2% BGG/0,25% CHAPS/0.15M NaCl/5mM EDTA (pH 7.4)) 1:50稀釋，接著進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋。遵循先前記 載的流程(Sias "a/,, J /纖畫(huà)/. Me仇109: 219-27 (1990))，用山羊抗HER2 多克隆抗體(Genentech)將脫落的HER2捕捉到NUNC Maxisorp板上，并用 偶聯(lián)有生物素的兔抗HER2多克隆抗體(Genentech)及后續(xù)AMDEXTM-鏈霉親 合素-辣根過(guò)氧化物酶抗體(Amersham Pharmacia Biotech)才企觀'J。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)，如所述處理細(xì)胞，收集條件培養(yǎng)液，并用測(cè)定緩沖液l:2連續(xù)稀釋。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線的四參數(shù)擬合測(cè)定血清或條件培養(yǎng)液中脫落的HER2的濃度，其 中使用純化的重組HER2 ECD蛋白質(zhì)(Genentech)作為標(biāo)準(zhǔn)品。
DA^種建參和f ^者鍵/A
使用origen克隆作為模板，通過(guò)PCR將人MMP-15克隆到pRK5中。 使用如下引物通過(guò)PCR產(chǎn)生C-末端V5His標(biāo)記的全長(zhǎng)型式 5'-GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3， (SEQ ID NO. 9)和
(SEQ ID NO. 10),
并克隆到pcDNA3.1V5His中。
使用如下引物通過(guò)PCR產(chǎn)生缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性型式MMP-15: 5，-GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3， (SEQ ID NO. ll)和
5，-GCTGTCTAGAGACCCACTCCTGCAGCGAGCG-3， (SEQ ID NO. 12)。 通過(guò)定點(diǎn)誘變用丙氨酸殘基替代成熟蛋白質(zhì)第260位氨基酸處的谷氨酰
胺，產(chǎn)生MMP-15的無(wú)催化活性突變體(catalytically dead mutant)。
使用如下引物通過(guò)PCR產(chǎn)生pRK5.gDHER2-Fc (pRK5.gDHER2-IgG):
5，-CGAGTCGACCTCGAGGCCAGCCCTCTGACGTCC-3'
(SEQ ID NO. 13)和
5,-GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG陽(yáng)3， (SEQ ID NO. 14), 并克隆到經(jīng)過(guò)XhoI-Mlu消化的pRK5.gDHER2-Fc中(Fitzpatrick " a/.， F五55S
431(1): 102-6(1998))。這導(dǎo)入了 HER2的推定切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)是從分 離自SKBR-3條件培養(yǎng)液的純化的HER2 ECD鑒定的(Yuan " "/.，尸rafe/" 五x/7mw/o" "W(i./^訴c加'o" 29: 217-222 (2003))。
還使用如下PCR產(chǎn)生只包含HER2的結(jié)構(gòu)域IV的截短型式 gDHER2-Fc:
5'-GGCCTCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAG-3， (SEQ ID NO. 15)和 5，-GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG-3， (SEQ ID NO. 16)。
pRK5.HER3-Fc和pRK5.HER4誦Fc先前已有記載(Fitzpatrick a a/.， 431(1): 102-6 (1998))。 將 FLAG 表位 (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; (SEQ ID NO. 17))導(dǎo)入pRK5的N-末 端。如先前所述將HER-Fc融合蛋白轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中并從無(wú)血清的條件培 養(yǎng)液純化(Fitzpatrick " a/" /^S^S431(1): 102-6 (1998))?？扇苄?MMP-15V5His和sMMP-15V5His(E260A)蛋白質(zhì)由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞條件 培養(yǎng)液產(chǎn)生，并使用Ni-NTA瓊脂糖依照制造商(Qiagen)的建議純化。
評(píng)估幾種不同shRNA在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)降低MMP-15蛋白質(zhì)水平的能力。 發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人 MMP-15最有效的shRNA 識(shí)別 bp 5，-CCACCATCTGACCTTTAGCTT-3， (SEQ ID NO. 18),對(duì)應(yīng)于nt 1396-1414
(GENBANKTM編號(hào)NM—002428)。作為包含形成shRNA的內(nèi)部發(fā)夾的如下 寡聚物，將針對(duì)MMP-15的RNAi導(dǎo)入pSIREN載體(BD Biosciences)的 BamHI-EcoRI位點(diǎn)
TGGTGGTTTTTTGCTAGCG-3， (SEQ ID NO. 19)和 TAAAGGTCAGATGGTGGCG-3， (SEQ ID NO. 20)。
針對(duì)MMP-25的shRNA購(gòu)自O(shè)PENBIOSYSTEMSTM。使用AMAXATM試劑 盒V遵循制造商的建議，單獨(dú)將pSIREN shRNA構(gòu)建物或載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到 SKBR-3和BT 474細(xì)胞中。48小時(shí)后，收集條件培養(yǎng)液并通過(guò)HER2 ELISA 測(cè)定脫落HER2，使用2x樣品緩沖液在板上直接裂解細(xì)胞。使用兔多克隆抗 MMP-15抗體(Labvision目錄號(hào)RB-1546-P)或小鼠單克隆抗HER2抗體Ab-15 (Labvision目錄號(hào)MS-599-P0)通過(guò)Western印跡4企測(cè)MMP-15、全長(zhǎng)HER2 和p95 HER2蛋白質(zhì)。
勿W縱
使用純化的gDHER2-Fc融合蛋白作為底物，在體外測(cè)定候選蛋白酶切 割HER2 ECD的能力。MT1隱MMP (MMP-14)、 MT2-MMP (MMP-15)、 MT3-MMP (MMP-16)、 MT4-MMP (MMP畫(huà)19)和MT5畫(huà)MMP (MMP-25)的純化 的催化結(jié)構(gòu)域購(gòu)自R&D systems。將純化的MMP蛋白質(zhì)與gDHER2-Fc或所 述其它HER-Fc蛋白質(zhì)在測(cè)定緩沖液(100mM Tris (pH=7.4), lOOmM NaCl， 2.5pM ZnCl2， 10mM CaCl2， 0.001% Brij35 )中以1:100的酶:底物比例混合， 并于37。C溫育20分鐘。加入等體積的2x樣品緩沖液(Invitrogen)終止反應(yīng)， 并在加載到4-20。/。Tris-甘氨酸梯度凝膠(Invitrogen)上之前煮沸5分鐘。使用 GEL CODE BLUEtm染色劑(Pierce目錄號(hào)24592)遵循制造商的建議通過(guò)染色 顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。使用自動(dòng)化蛋白質(zhì)測(cè)序儀通過(guò)自動(dòng)化Edman降解法(Kishiyama, A.,爿wa/. C77ew. 72(21): 5431-6 (2000)),通過(guò)N-末端蛋白質(zhì)測(cè)序測(cè)定MMP 切割位點(diǎn)。
A^沉/定^W;t法f口 ff^ fem伊遂
使用LIPOFECTAMINE 2000，將Cos-7細(xì)胞用pRK5.Flag-HER2和 pcDNA3.MMP-15構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染，或者單獨(dú)用pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染。讓細(xì)胞 恢復(fù)48小時(shí)。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用PBS漂洗，并在裂解緩沖液(1 % TRITON X-100TM
50mM Tris (pH=7.4)， 150mMNaCl， ImMPMSF, 10(ig/ml亮抑酶肽(leupeptin) 10U/ml抑酶肽(aprotinin)， 2mM Na2V04)中裂解。通過(guò)離心除去裂解物中的 不溶性物質(zhì)，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce目錄號(hào)23229)測(cè)定總蛋白 質(zhì)水平。將200嗎總細(xì)胞蛋白質(zhì)加到裂解緩沖液中至終體積lml，使用抗Flag M2-瓊脂糖(Sigma)或與蛋白A/G瓊脂糖復(fù)合的多克隆抗MMP-15抗體免疫 沉淀Flag-HER2。將免疫復(fù)合物用裂解緩沖液清洗2次，并重懸于SDS樣品 緩沖液中煮沸。將樣品在4-12% Tris-甘氨酸梯度凝膠(Invitrogen)上分開(kāi)并轉(zhuǎn) 移至硝酸纖維素膜。如所述將印跡在5% BSA/TBST中封閉，并用針對(duì) MMP-15或HER2的抗體及后續(xù)的偶聯(lián)有過(guò)氧化物酶的抗小鼠或兔二抗探 查。通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL, Amersham Pharmacia Biotech)使印跡顯影。
將Fo5和f2:1282腫瘤重懸于含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，并使用 POLYTRON TISSUEMIZERtm (PT2100)在冰上勻漿。通過(guò)離心除去腫瘤裂解 物中的不溶性物質(zhì)，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)水平。使用 與蛋白A/G sepharaose復(fù)合的小鼠單克隆抗體Ab-15 (Labvision目錄號(hào) MS-599-P0)，從來(lái)自至少三份獨(dú)立肺瘤裂解物的lmg總蛋白質(zhì)于4。C免疫 沉淀HER2過(guò)夜。通過(guò)離心使復(fù)合物成團(tuán)，用裂解緩沖液清洗兩次，重懸于 SDS樣品緩沖液并煮沸。將樣品在4-12。/。Tris-甘氨酸凝膠上分開(kāi)并轉(zhuǎn)移至硝 酸纖維素膜。用檢測(cè)磷酸化HER2的小鼠單克隆抗體Ab-18 (Labvision目錄 號(hào)MS-1072-P)或Ab-15 (Labvsion目錄號(hào)MS-599-P0)探查印跡。使用才企測(cè) MMP-14的兔多克隆Ab-1 (Labvision目錄號(hào)RB-1544-P)、檢測(cè)MMP-15的 兔多克隆Ab-1 (Labvision目錄號(hào)RB-1546-P)或檢測(cè)MMP-25的兔多克隆 Ab-1 (Oncogene Research Products目錄號(hào)PC499)，通過(guò)來(lái)自50ug腫瘤裂解 物或者來(lái)自50ug BT474或MCF-7或SKBR-3細(xì)胞裂解物的Western印跡， 評(píng)估MMP-14、 MMP-15和MMP-25的表達(dá)。
通過(guò)50嗎細(xì)胞裂解物的Western印跡測(cè)定活化的MAPK (Cell Signaling Technology目錄號(hào)9101)、 PhosphoAkt Ser473 (Cell Signaling Technology目錄 號(hào)9271)、總Akt (Cell Signaling Technology目錄號(hào)9272)、總Erk (Cell Signaling Technology目錄號(hào)9102)或phosphoHER3 (Cell Signaling Technology 目錄號(hào)4791)。
將細(xì)胞以104細(xì)胞/孔的密度一式四份接種到96孔板(Nunc)中并讓其貼
壁過(guò)夜。如所示處理細(xì)胞，或者如所示轉(zhuǎn)染。溫育3天后，向每個(gè)孔中加入
25^ Alamar blue試劑(Trek Diagnostic Systems,目錄號(hào)00-100),繼續(xù)溫育3 小時(shí)。在熒光計(jì)中依照制造商的建議對(duì)板讀數(shù)，激發(fā)波長(zhǎng)530nm，發(fā)射波長(zhǎng) 590nm。如先前所述測(cè)定相對(duì)于未刺激或?qū)φ辙D(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖(Lewis da/., O 膨rL 56(6): 1457-65 (1996))。
結(jié)果
HER2的ECD通過(guò)蛋白水解從培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞上脫落，并在轉(zhuǎn)移性乳 腺癌患者的血清中檢測(cè)到，在這種情況中它與不良臨床預(yù)后有關(guān)(Molina^ a/" Omcw/ " 61: 4744-4749(2001))。然而，HER2脫落的生物學(xué)作用尚不 清楚。本文中的實(shí)驗(yàn)是為了鑒定HER2脫落酶(sheddase)而進(jìn)行的。
HER2脫落酶的鑒定可能也是重要的，因?yàn)橄惹白C實(shí)trastuzumab在乳腺 癌細(xì)胞系中抑制脫落(Molina d a/., 61: 4744-4749 (2001))。與先
前報(bào)道的結(jié)果一致，trastuzumab在10 (ig/ml的濃度在乳腺癌細(xì)胞系BT 474 和SKBR-3細(xì)胞中將脫落降低超過(guò)60% (圖5，左圖)，并且在這些細(xì)胞系中 將細(xì)胞增殖降低50% (圖5，右圖)。
使用衍生自MMTVHER2轉(zhuǎn)基因小鼠(Finkle " a/.， C/z'". Ca"cer i 仏10: 2499-2511 (2004))的乳腺腫瘤的動(dòng)物4莫型系統(tǒng)來(lái)鑒定HER2脫落酶。此動(dòng)物 模型系統(tǒng)可重現(xiàn)地將不同水平的HER2脫落到血清中，并且對(duì)trastuzumab 展現(xiàn)出不同的敏感性(圖6，右圖)。血清HER2水平的這種差異還與從三份 獨(dú)立Fo5腫瘤細(xì)胞裂解物免疫沉淀的蛋白質(zhì)片段的存在很有關(guān)聯(lián)，該蛋白質(zhì) 片段表觀分子量為95 kD,與p95 HER2的大d、一致(圖6，左下圖)。此片 段在Fo5腫瘤細(xì)胞裂解物中組成性磷酸化，表明此片段在這些腫瘤中可能具 有生物學(xué)活性。HER2脫落酶水平的升高可能有助于此系的trastuzumab抗性， 因?yàn)閠rastuzumab的表位將通過(guò)蛋白水解切割而喪失(Cho or/., A^ww 421: 756-760 (2003))。
因?yàn)镕o5腫瘤系脫落更高水平的HER2且具有高水平的p95 HER2片段， 所以通過(guò)差異表達(dá)分析這種方法來(lái)鑒定在Fo5肺瘤中相對(duì)于f2:1282腫瘤上 調(diào)的轉(zhuǎn)錄物。從來(lái)自平均腫瘤大小300-600 mm3的Fo5腫瘤或f2:1282腫瘤 的3份個(gè)別肺瘤樣品制備RNA。將來(lái)自每份獨(dú)立腫瘤樣品的RNA —式三份 與AFFYMETRIXtm小鼠基因組單一陣列芯片(MOE430P)和已知基因陣列
(MOE430A)雜交。進(jìn)行Mann-Whitney成對(duì)比較，在Fo5肺瘤樣品中鑒定出 638種上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物。因?yàn)锽T 474和SKBR-3細(xì)胞系也將HER2 ECD脫落 到條件培養(yǎng)液中(圖5,左圖)，所以還使用Genelogic Bioexpress數(shù)據(jù)庫(kù)將 此表與在兩種細(xì)胞系中都表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行比較。圖7圖示了用于鑒定 HER2脫落酶的方法。
為了減少候選基因的數(shù)目，使用通用金屬蛋白酶抑制劑GM6001來(lái)評(píng)估 MMP活性是否在調(diào)控HER2脫落中發(fā)揮作用。根據(jù)HER2 ECD ELISA的測(cè) 定(圖8，左圖)，GM6001確實(shí)在SKBR-3細(xì)胞中劑量依賴性地抑制HER2 脫落，其立體異構(gòu)體則不然。此結(jié)果與先前發(fā)表的報(bào)告一致，即通用金屬蛋 白酶抑制劑BB-94在乳腺癌細(xì)胞系中抑制HER2 ECD脫落(Codony-Servat W a/" C露erL 59: 1196-1201 (1999))。 Timp-l、 Timp-2和Timp-3是調(diào)控金 屬蛋白酶活'f生的天然存在的肽(Overall and Lopez-Otin， iVamw及ev/ews C朋cw 2: 657-672 (2002))。以1嗎/ml的濃度向SKBR-3細(xì)胞的條件培養(yǎng)液 中添加純化的Timp-l、 Timp-2或Timp-3降低了 HER2 ECD的水平(圖8， 右圖)。然而，Timp-2降低HER2 ECD脫落最有效(圖8,右圖)。已知Timp-2 有效抑制金屬蛋白酶的MT-MMP亞家族(Overall and Lopez-Otin， Atowe Z eWe鄉(xiāng)Owcer 2: 657-672 (2002))。這些資料說(shuō)明在SKBR-3和BT 474細(xì)胞 中導(dǎo)致HER2脫落的蛋白酶是金屬蛋白酶，顯著減少了從生物信息學(xué)篩選鑒 定的候選物的數(shù)目。
根據(jù)GENELOGICTM數(shù)據(jù)庫(kù)，MT-MMP家族的幾個(gè)成員在SKBR-3和 BT 474細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)AFFYMETRIXTM微陣列數(shù)據(jù)，MT1-MMP和 MT2-MMP也都在Fo5腫瘤中表達(dá)。為了確定這些轉(zhuǎn)錄物是否表達(dá)，將Fo5 和f2:1282腫瘤及乳腺癌細(xì)胞系裂解物用針對(duì)這些MT-MMP的多克隆抗體進(jìn) 行免疫印跡，所述抗體識(shí)別人和小鼠二者的蛋白質(zhì)(圖9)。所有細(xì)胞系都表 達(dá)MMP-14、 MMP-15和MMP-25，但7jc平不同。雖然MMP-14在f2:1282 和Fo5腫瘤細(xì)胞裂解物中都表達(dá)，但是MMP-15在Fo5腫瘤裂解物中大量 表達(dá)。此結(jié)果與表明Fo5腫瘤中MMP-15的mRNA表達(dá)水平高2倍的 Mann-Whitney比較一致。為了驗(yàn)證MMP-15在腫瘤的上皮細(xì)胞而非周?chē)?基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，將Fo5和G:1282腫瘤進(jìn)行切片并用抗HER2抗體(Dako) 或抗MMP-15抗體(Ab-l)染色。f2:1282和Fo5腫瘤都表達(dá)人HER2，但是 MMP-15在Fo5腫瘤中的表達(dá)比G:1282腫瘤的量更大。
傳統(tǒng)上認(rèn)為MT-MMP成員的底物是胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。建立了生化測(cè)定
法以對(duì)從微陣列數(shù)據(jù)鑒定的候選物測(cè)試其體外切割全長(zhǎng)HER2。此測(cè)定法使 用純化的重組融合蛋白作為候選蛋白酶的底物，所述融合蛋白由N-末端gD 表位標(biāo)記的HER2 ECD與人IgG的重鏈Fc以符合讀碼框的方式組成。這些 研究中使用了幾種不同的蛋白質(zhì)。gDHER2(+)-IgG包含HER2 ECD的氨基 酸第2-656位(GenBank編號(hào)AAA75493)， gDHER2(-)-IgG包含HER2 ECD 的氨基酸第2-626位。gDHER2(+)-IgG重組蛋白包含先前已知證明包含推定 HER2脫落酶位點(diǎn)(PA/EQR/ASP; SEQ ID NO. 23)的近膜序列，而 gDHER2(-)-IgG蛋白缺少此序歹'J (Yuan ef 尸rafe/"五xpmwz'o" 尸w訴c加'o" 29: 217-222 (2003))。此測(cè)定法中還使用了截短型式的 gDHER2(+)-IgG，即gDHER2(DIV)-IgG，它只有以符合讀碼框的方式融合的 HER2的結(jié)構(gòu)域IV(DIV)和人Fc。將MMP-14、 MMP-15、 MMP-16、 MMP-19 和MMP-25的純化的催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domains)與gDHER2(DIV)-IgG于 37。C溫育20分鐘。除MMP-14以外的所有MT-MMP有效切割 gDHER2(DIV)-IgG底物(圖13,左圖)。切下切割后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，進(jìn)行 N-端測(cè)序以鑒定切割位點(diǎn)。所有四種MT-MMP都在已發(fā)表的序列位點(diǎn)附近 士刀害寸 HER2 (Yuan ef a/"尸ro/ez力五xj: ra^/ow 尸wny ca"ow 29: 217-222 (2003))(圖13,右圖)。
具有序列PINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPASPLTSIV (SEQ ID NO. 21)的HER2-Fc融合蛋白是這四種MMP在體外的底物(圖14 )。此資料說(shuō)明 HER2是MMP-15的底物。
MT-MMP底物識(shí)別可能受到血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域(hem叩exin domain) 的影響(Overall and Lopez-Otin， A^fwre i evz'ews Owcer 2: 657-672 (2002))。 在293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)具有C-末端V5 His表位的可溶性形式的MMP-15, 并通過(guò)親和層析從293條件培養(yǎng)液純化。如圖15所示，此可溶性形式的 MMP-15在體外脫落酶測(cè)定法中也能切割gDHER2(+)-IgG。
為了確定MMP-15和HER2是否能在膜中結(jié)合，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Cos-7 細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀測(cè)定法。將pRK5.FlagHER2與載體、 pcDNA3.MMP-15V5His 、 pcDNA3.sMMP-15V5His 或
pcDNA3.MMP-15(E260A)共轉(zhuǎn)染。用抗FLAG樹(shù)脂免疫沉淀FlagHER2。圖 10顯示了可溶性MMP-15和無(wú)催化活性(E260A)突變體都能與Flag-HER2結(jié)
合。這與MMP-15可切割膜中的HER2的想法一致，因?yàn)橐吧托褪降牡鞍?酶，pcDNA3.MMP-15V5His，將切除FlagHER2 ECD, HER2-MMP-15復(fù)合 物將不會(huì)免疫共沉淀。
從來(lái)自MMTVHER2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺腫瘤中已經(jīng)鑒定出了體細(xì)胞點(diǎn) 突變和刪除及剪接變體(Siegel 18: 2149-2164 (1999); Finkle "
a/., C7/". Qwceri &y. 10: 2499-2511 (2004))。這些突變最頻繁的存在于HER2 跨膜結(jié)構(gòu)域附近的胞外結(jié)構(gòu)域。Fo5胂瘤系有與HER2切割位點(diǎn)鄰近的五個(gè) 氨基酸刪除，DLDDK(SEQIDNO. 22)， f2:1282肺瘤系有單一點(diǎn)突變，R變 成C(CforR)(圖12)。這些突變不影響MMP-15結(jié)合(圖11)。然而，有 可能的是DLDDK (SEQ ID NO. 22)刪除臨近HER2 MMP切割位點(diǎn)可能影響 該蛋白酶的酶活性。
RNA抑制(RNAi)是一種能下調(diào)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平的方法。為了 檢驗(yàn)MMP-15在SKBR-3和BT 474細(xì)胞中的生物學(xué)作用，使用抗MMP-15 RNAi構(gòu)建物。在導(dǎo)入SKBR-3或BT 474細(xì)胞時(shí)，此shRNAi表達(dá)質(zhì)粒在兩 種細(xì)胞類型中都降低MMP-15的內(nèi)源蛋白質(zhì)水平(圖17,左上圖)。此shRNA 的轉(zhuǎn)染還在兩種細(xì)胞類型中都降低p95 HER2的量(圖17,左下圖)。這些 細(xì)胞中MMP-15蛋白質(zhì)的丟失在兩種系中都顯著降低HER2 ECD脫落(圖 17，右圖)。然而，在將針對(duì)MMP-25的shRNAi導(dǎo)入任一細(xì)胞系時(shí)，沒(méi)有 觀察到HER2 ECD脫落的顯著降低(圖17，右圖)。這些實(shí)驗(yàn)強(qiáng)烈說(shuō)明 MMP-15的丟失顯著影響HER2 ECD脫落。
通過(guò)RNAi降低MMP-15蛋白質(zhì)水平還對(duì)SKBR-3和BT 474細(xì)胞的生 長(zhǎng)速率有影響(圖18,左圖)。針對(duì)MMP-25的shRNAi也再現(xiàn)這種效果。 這說(shuō)明在BT 474和SKBR-3細(xì)胞中降低HER2 ECD脫落還下調(diào)p95 HER2 的量，由此降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率。在將gD標(biāo)記的p95 HER2構(gòu)建物導(dǎo)入這些 細(xì)胞系時(shí)，在兩種細(xì)胞系中都檢測(cè)到相對(duì)于對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)速率的 升高(圖18，左圖)。在以獨(dú)立于配體的方式導(dǎo)入Cos-7細(xì)胞時(shí)，此構(gòu)建物 -陂組成性磷酸化并活化MAPK (圖16)。然而，此構(gòu)建物必須仍與HER3或 EGFR異二聚化以活化Akt信號(hào)途徑，與先前發(fā)表的研究一致(Xia ef a/., CV coge"e 23: 646-653 (2004) )。 gDp95HER2在SKBR-3細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)不顯 著抑制這些細(xì)胞中trastuzumab介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制(圖18,右圖)。
使用藥理學(xué)方法來(lái)確定在Fo5腫瘤中MMP活性是否在調(diào)控HER2脫落
和p95 HER2水平中發(fā)揮作用。每天一次給攜帶平均大小400-600 mm3的Fo5 肺瘤的FVB小鼠腹膜內(nèi)注射GM6001或?qū)φ彰浇槲?control vehicle),持續(xù)3 天。第4天，收集血清并通過(guò)ELISA測(cè)定HER2 ECD,收集腫瘤并稱重。 從腫瘤細(xì)胞裂解物免疫沉淀HER2并通過(guò)Western印跡測(cè)定p95 HER2水平。 用GM6001處理的動(dòng)物顯示出與對(duì)照動(dòng)物相比p95 HER2量的顯著降4氐(圖 19，右圖)。在用々某介和GM6001處理的動(dòng)物中血清HER2ECD水平都降低 (圖19,左圖)，然而，在用GM6001處理的動(dòng)物中觀察到更大降低。
總結(jié)
以上實(shí)驗(yàn)證明基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-15在體外在與來(lái)自SKBR3細(xì)胞的 純化的脫落ECD—致的位點(diǎn)切割HER2，并且與全長(zhǎng)HER2相互作用。降低 此MMP的水平與HER2受體脫落的降低極好關(guān)聯(lián)，并且在SKBR3和BT474 細(xì)胞系中降低基礎(chǔ)增殖水平。trastuzumab似乎通過(guò)間接調(diào)控MMP-15活性 而抑制HER2受體脫落，但不與MMP-15竟?fàn)幍孜锝Y(jié)合和切割。用MMP拮 抗劑，諸如MMP-15拮抗劑，降低HER2脫落代表了用于治療癌癥的治療方 法，包凌舌trastuzumab 4元性癌癥。
權(quán)利要求
1.用于抑制HER2脫落的方法，包括用有效抑制HER2脫落的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑處理表達(dá)HER2的細(xì)胞。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述MMP拮抗劑是膜束縛MMP (MT-MMP)拮抗劑。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述MT-MMP選自MMP-15 (MT2-MMP)、 MMP-16 (MT3-MMP)、 MMP-24 (MT5-MMP)、 MMP-17 (MT4-MMP)和 MMP-25 (MT6-MMP)。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述MT-MMP是MMP-15。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞展示出HER2過(guò)表達(dá)、擴(kuò)增或活化。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞展示出HER2過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增。
7. 權(quán)利要求l的方法，還包括用HER抑制劑處理所述細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述HER抑制劑是HER2抗體。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述HER2抗體是trastuzumab或pertuzumab。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述HER抑制劑選自tmstuzumab、pertuzumab、 cetuximab、 ABX-EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC畫(huà)11F8和TAK165。
11. 用于在哺乳動(dòng)物中降低HER2胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)血清水平的方法，包括 對(duì)哺乳動(dòng)物施用在哺乳動(dòng)物中有效降低HER2 ECD血清水平的量的基 質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有升高的MMP水平。
13. 用于在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效治療癌癥 的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述癌展示出HER表達(dá)、擴(kuò)增或活化。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述癌展示出HER2過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增。
16. 權(quán)利要求13的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有升高的脫落HER2血清水 平或升高的p95 HER2水平。
17. 用于在哺乳動(dòng)物中治療HER抑制劑抗性癌癥的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物 施用有效治療癌癥的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述HER抑制劑是trastuzumab。
19. 用于降低細(xì)胞中p95 HER2水平的方法，包括將細(xì)胞暴露于有效降低p95 HER2水平的量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)拮抗劑。
20. 診斷方法，包括評(píng)估來(lái)自癌癥患者的樣品中的MMP-15 (MT7-MMP), 其中升高的MMP-15水平或活性表明該患者具有升高的p95 HER2或脫 落HER2血清水平，或者將具有不良臨床結(jié)果。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中升高的MMP-15水平表明該患者將具有不良 臨床結(jié)果。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了使用基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)尤其是MMP-15的拮抗劑來(lái)抑制HER2脫落。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101115836SQ200680004472
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月9日
發(fā)明者拉爾夫·H·施瓦爾, 肯德?tīng)枴·凱里, 馬克·X·斯利科夫斯基 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司