專利名稱：：具有降脂性能的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用改性電子轉(zhuǎn)移劑降低LDL膽固醇、甘油三酯和總膽固醇等一種或多種血液脂質(zhì)水平的治療方法。
背景技術(shù)：
：本說明書在提及或討論某篇科技文獻、某種科學(xué)理論或某個知識點時，并不代表承認該科技文獻、科學(xué)理論或知識點或其任意組合在優(yōu)先權(quán)日已公開、為公眾所知、屬于公知常識，或者與試圖解決本說明書所涉及技術(shù)問題的過程相關(guān)。雖然以下內(nèi)容涉及心血管疾病，但應(yīng)當(dāng)理解，這些內(nèi)容僅作說明之用，本發(fā)明除涉及心血管疾病外，還同樣涉及與脂質(zhì)水平升高有關(guān)的任何病癥。心血管疾病(CVD)包括心臟病和中風(fēng)，它是導(dǎo)致西方國家人口死亡的大敵。一般認為存在很多致病因素，包括血管平滑肌細胞(SMC)過度增殖、總膽固醇增加和低密度脂蛋白(LDL)膽固醇減少。雖然干預(yù)治療時，一般會最先建議患者改變生活方式，如調(diào)整飲食、加強鍛煉，但大多時候藥物治療仍然必不可少，而且也有一定保障。人們常認為心臟病和心血管疾病是同一種疾病，其實不然，它們涉及身體不同部位。心臟病僅指心臟和心臟內(nèi)血管系統(tǒng)疾病，心血管疾病則指心臟和人全身(如腦、腿和肺)血管系統(tǒng)(動脈、毛細管、靜脈)疾病。這里"心"是指心臟，"血管"是指血管系統(tǒng)。心臟比拳頭稍大一點，是一個強力肌肉泵。它向外持續(xù)泵血，通過循環(huán)系統(tǒng)的彈性管網(wǎng)絡(luò)，使血液流經(jīng)全身。循環(huán)系統(tǒng)包括兩個主要器官心臟和肺以及血管(動脈、毛細管和靜脈)。動脈和毛細管將富含氧和營養(yǎng)物質(zhì)的血液，從心肺運送到身體各部位，靜脈又將氧和營養(yǎng)物質(zhì)耗盡的血液送回到心臟和肺。心臟和血管問題不是短時間內(nèi)產(chǎn)生的，而是隨時間推移，細胞、脂肪和膽固醇(斑塊)不斷增加，逐漸將負責(zé)向心臟和大腦運送血液的動脈阻塞。由于動脈阻塞，流向心臟的血流越來越少，最后導(dǎo)致心臟病發(fā)作。而中風(fēng)則由于血栓引起大腦缺血或者血管破裂引起腦出血所致。心臟病和心血管疾病有很多種，以下兒種最普遍冠狀心臟疾病(冠狀動脈疾病)；心絞痛；中風(fēng)；高血壓；心力衰竭。很多因素易導(dǎo)致人患心臟病和心血管疾病，往往危險因素(或增加危險的因素)越多，患心臟病和心血管疾病的機率就越大。危險因素包括年齡；吸煙(主動或被動吸煙)；高血壓；高血脂；超重；糖尿病。有些因素不能人為控制，如年齡、家族病史和種族，但吸煙、高血壓和高血脂這三大危險因素是有可能控制的。培養(yǎng)良好的生活習(xí)慣，如攝取低飽和脂肪和低膽固醇食物，定期體育鍛煉，會降低血壓，使血糖和血脂保持正常水平。膽固醇是脂類物質(zhì)，由肝產(chǎn)生，遍布全身各個部位，用來形成細胞膜、激素、維生素D和幫助脂肪消化的膽汁酸。血液中只需少量膽固醇即可滿足身體需要，而且身體所需的所有膽固醇均由肝提供。血液中也會積累膽固醇。從肉類、全脂奶制品、蛋黃、家禽和魚肉等動物食品中攝取過多膽固醇能升高膽固醇水平，而膳食中飽和脂肪是導(dǎo)致膽固醇水平升高的主要元兇。膽固醇包在脂蛋白中，隨血液流動。脂蛋白包含兩類低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)，由于LDL會不斷積聚，阻塞動脈，所以常被稱為"壞"膽固醇，而HDL會幫助清除血液中膽固醇，防止膽固醇堆積、阻塞動脈，所以被稱為"好"膽固醇。通常在改變生活方式時，會根據(jù)需要同時服用降膽固醇藥物。降膽固醇治療主要是降低LDL水平，減小心臟病或心力衰竭的發(fā)病率。降膽固醇藥物包括他汀類、膽酸螯合劑、煙酸和苯氧酸等藥，它們各有優(yōu)點、副作用和注意事項。藥物種類通用名和商標(biāo)名功效副作用和注意事項<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*所有降膽固醇類藥物(膽固醇吸收抑制劑可能除外)都可能導(dǎo)致肝功能異常。雖然這些降膽固醇藥物在降低心臟病危險中發(fā)揮重要作用，但都有其局限性，因為膽固醇達到所需水平后，仍要不定期服藥以維持該水平。所以就需要有一種降脂藥物，不僅副作用要小于現(xiàn)有藥物，而且不會產(chǎn)生藥物依賴性。生育酚a-生育酚(維生素E)水平偏低與冠狀心臟病發(fā)病率增加有關(guān)。相反，增加(x-生育酚攝入量能預(yù)防心臟病。一般認為，維生素E是一種抗氧化劑，它能阻止LDL氧化，防止動脈粥樣硬化形成。研究還發(fā)現(xiàn)，維生素E之所以能預(yù)防動脈粥樣硬化斑塊，可能還存在非抗氧化機理，包括抑制平滑肌細胞增殖、抑制單核細胞一內(nèi)皮黏附、抑制單核細胞釋放活性氧和細胞因子，以及抑制血小板粘附和聚集。但使用維生素E治療動脈粥樣硬化的臨床試驗結(jié)果尚不明朗。所以，目前動脈粥樣硬化臨床治療中并未使用維生素E添加劑。國際專利申請W003/026673中記載，增加體內(nèi)生育酚磷酸酯等維生素含量，有可能緩解或治療冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化和糖尿病等炎癥，但文中沒有提到降低血液中膽固醇等脂質(zhì)水平。發(fā)炎過程包括一整套復(fù)雜反應(yīng)，但并不包括脂肪代謝、膽固醇攝入等反應(yīng)過程。國際專利申請W02004/064831中也記載了生育酚磷酸酯，文中提到生育酚磷酸酯能抑制單核細胞/巨噬細胞增殖、平滑肌細胞增殖、CD36受體表達和氧化型LDL攝入，但沒有提到降低血液中膽固醇等脂質(zhì)水平。大量研究顯示，CD36在阿爾茨海默氏病中會促使積聚蛋白應(yīng)答反應(yīng)改變，并促使動脈粥樣硬化形成。這些過程均與脂代謝無關(guān)，例如，瘧疾和阿爾茨海默氏病治療藥物均針對CD36表達起作用，但并不改變脂質(zhì)狀況。
發(fā)明內(nèi)容目前的研究意外發(fā)現(xiàn)，電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物降低下述一種或多種血脂水平的效果優(yōu)于非磷酸化電子轉(zhuǎn)移劑LDL膽固醇甘油三酯，以及總膽固醇。本發(fā)明的一個方面是提供一種降低血液脂質(zhì)水平的治療方法，所述脂肪選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該治療方法包括投用有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的治療方法將應(yīng)用于一種或多種血液脂質(zhì)(LDL膽固醇、甘油三酯和總膽固醇)水平升高相關(guān)性疾病的治療。這類疾病例如包括但不限于心血管疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎病、原發(fā)性和繼發(fā)性高脂血癥和血脂異常、視網(wǎng)膜病、肝脾腫大和黃色瘤。所以，本發(fā)明包括一種緩解疾病癥狀、治療或預(yù)防疾病的方法，所述疾病選自心血管疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎病、原發(fā)性和繼發(fā)性高脂血癥和血脂異常、視網(wǎng)膜病、肝脾腫大、黃色瘤和其組合，該方法包括向上述疾病患者或有患上述疾病危險的對象投用有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，用于降低血液脂質(zhì)水平，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該組合物包括有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物。再一方面，本發(fā)明提供有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物和適合的載體或稀釋劑在制造降低血液脂質(zhì)水平藥物中的應(yīng)用，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物。又一方面，本發(fā)明提供一種降低血液脂質(zhì)水平的治療方法，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該方法包括使有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物釋放的步驟。這方面的一個實施例中，所述有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物以前藥形式釋放。所述對象是動物較佳，所述動物是人尤佳。本文中"有效量"是指所使用的量足以降低一種或多種血液脂質(zhì)(LDL膽固醇、甘油三酯和總膽固醇)水平。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，該使用量依不同患者而定，通常根據(jù)具體患者的臨床用藥經(jīng)驗確定。本文中"電子轉(zhuǎn)移劑"是指一類可被磷酸化，非磷酸化形式下能接受一個電子形成較穩(wěn)定分子基團，或者接受兩個電子以參與可逆氧化還原系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)。可被磷酸化的電子轉(zhuǎn)移劑類化合物例如包括羥基苯并二氫吡喃，其包含a、(3、y、5-母育酚對映體和外消旋體；對苯二酚(維生素Kl和輔酶Q的還原形式)；羥基類胡蘿卜素，其包含維生素A;維生素D2和維生素C。電子轉(zhuǎn)移劑選自生育酚和其他母育酚、維生素A、維生素K1及其混合物較為理想。電子轉(zhuǎn)移劑選自母育酚及其混合物更佳。母育酚包括6-羥基-2-甲基苯并二氫吡喃衍生物的所有異構(gòu)體(見下式)，其中K、R2和R3可以是h或甲基，即a-5，7，8-三甲基、卩-5,8-二甲基、y-7，8-二甲基和5-8-甲基衍生物。生育酚中R4被4-8-12-三甲基十三烷基取代，包括各種立體異構(gòu)體和光學(xué)異構(gòu)體(手性中心用*標(biāo)出)。在生育三烯酚中，&被4-8-12-三甲基十三烷基-3-7-ll三烯取代，第2位可以具有R或S立體異構(gòu)體的立體活性。電子轉(zhuǎn)移劑選自a-生育酚、S-生育酚、y-生育酚、a-生育三烯酚、5-生育三烯酚、Y-生育三烯酚及其混合物最為理想。本文使用的術(shù)語"磷酸酯衍生物"是指其中氧原子與磷酸基團中磷原子共價結(jié)合形成c-o-p鍵的化合物，這里的氧原子通常來自電子轉(zhuǎn)移劑中的羥基氧原子。該術(shù)語包括酸式磷酸化電子轉(zhuǎn)移劑、磷酸酯鹽(包含鈉、鎂、鉀和鈣等金屬鹽)，以及磷酸質(zhì)子被乙基、甲基或磷脂酰等其他基團所取代的任何磷酸酯衍生物。該術(shù)語包括磷酸酯衍生物混合物，尤其是指通過磷酸化反應(yīng)得到的磷酸酯衍生物混合物，以及各磷酸酯衍生物本身。例如，該術(shù)語既可以包括單生育酚磷酸酯(TP)和二生育酚磷酸酯(T2P)混合物，也可以只包括TP或T2P。國際專利申請PCT/AU01/01475中記載了可適用的混合物。比較理想的是，一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物選自單生育酚磷酸酯、二生育酚磷酸酯、單生育三烯酚磷酸酯、二生育三烯酚磷酸酯及其混合物。一優(yōu)選實施例中，一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物是一種或多種單生育酚磷酸酯、二生育酚磷酸酯、單生育三烯酚磷酸酯和二生育三烯酚磷酸酯的混合物。如果要側(cè)重考慮提高水溶性等其他特性時，可能就要使用磷脂等磷酸酯衍生物。磷脂酰衍生物是有機的氨基烷基磷酸酯衍生物。用分子式為R^N(CH^0H的胺可制得這些衍生物，其中n是整數(shù)1-6，R^PR2可以是H或不多于3個碳原子的短鏈垸基。K和R2可以相同或不同。磷脂酰衍生物按以下方法制備用磷酸本體取代電子轉(zhuǎn)移劑的羥基質(zhì)子，然后與乙醇胺或N，N'-二甲基乙醇胺等反應(yīng)生成電子轉(zhuǎn)移劑磷脂酰衍生物。磷脂酰衍生物的一種治療制劑的制備方法是使用吡啶或三乙胺等堿性溶劑與三氯氧磷反應(yīng)得到中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物再與胺的羥基反應(yīng)，得到相應(yīng)的磷脂酰衍生物，例如磷脂酰膽堿(PcholylP)生育酚磷酸二氫酯。如果要側(cè)重考慮改善穩(wěn)定性或釋放性等其他特性時，還可以使用電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物配合物。所謂"磷酸酯衍生物配合物"是指電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物與一種或多種選自兩性表面活性劑、陽離子表面活性劑、具有氮官能團的氨基酸和富含這些氨基酸的蛋白質(zhì)(國際專利申請PCT/AU01/01476中有記載，全文通過引用并入本文)的配合劑的反應(yīng)產(chǎn)物。所述蛋白質(zhì)中精氨酸、組氨酸或賴氨酸數(shù)量例如分別占整個蛋白質(zhì)的至少1/62、1/83或1/65，各類酪蛋白就屬于這類蛋白質(zhì)。其他蛋白質(zhì)例如包括胰島素、甲狀旁腺激素(PTH)、胰高血糖素、降鈣素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、催乳素、干擾素-oc、干擾素-p、干擾素i、促黃體生成激素(LH)(又稱促性腺激素釋放激素)、卵泡刺激素(FSH)和集落刺激因子(CSF)。下表中列出了上述大部分蛋白質(zhì)中氨基酸的位置。蛋白質(zhì)中氨基酸氨基酸占總氨基酸比例胰島素110arg51:22his21:55lys21:55PTH84arg51:17his00lys51:17胰高血糖素180arg161:11his41:45lys101:18降轉(zhuǎn)素93arg61:16his31:31lys51:19ACTH41arg31:14his11:41lys1:10催乳素arghislys22012911181311干擾素-a、干擾素-phislys133727198319干擾素，axghislys166822121838arghislys92527184613FSHEirghislys129529266514CSFEirghislys144636244824GH域AOD960416arg21:8優(yōu)選配合劑選自精氨酸、賴氨酸和三取代胺，分子式例如為她Y其中，R1選自直鏈或支鏈C6-C22混合垸基及其羰基衍生物，R2和W各選自H、CH2C00X、CH2CH0HCH2S03X、CH2CH0HCH20P03X、CH2CH2C00X、CH2C00X、CH2CH2CHOHCH2S03X或CH2CH2CH0HCH20P03X，如果R2和W不是H，則X是H、Na、K或鏈烷醇胺；以及W是RC0時，則W可以是CH3，R3可以是(CH2CH2)N(C孔0H)-H2CH0P03，或者R2和R3都可以是N(CH2)2N(C2H40H)CH2C00—。優(yōu)選配合劑包括精氨酸、賴氨酸或亞氨基二丙酸月桂酯，其中堿性氮中心和磷酸酯配合形成穩(wěn)定的配合物。給人或動物投用的電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物可以是各種劑型，如補充劑、腸道喂養(yǎng)、非經(jīng)腸道劑、栓劑、口服劑、肺鼻內(nèi)釋藥劑、貼劑和乳膏等皮膚釋藥劑。例如，電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物可以是口腔、非經(jīng)腸道給藥劑型，這些劑型包括片劑、粉劑、咀嚼片、膠囊劑、口服混懸劑、混懸劑、乳化劑或液體劑、兒童制劑、腸內(nèi)喂養(yǎng)、保健品和功能性食PI該劑型可進一步包括制劑中常用的任何添加劑，如淀粉或高分子粘結(jié)劑、甜味劑、著色劑、乳化劑、包衣劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其他合適添加劑亦可。在一實施例中，所述劑型包有一層如國際專利申請PCT/AU02/01003(全文通過引用并入本文)所述的腸衣。在另一實施例中，所述劑型是一種如國際專利申請PCT/AU02/01003(全文通過引用并入本文)所述的局部制劑。所述劑型可以含有其他藥物化合物，只要該化合物不抑制本發(fā)明電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物活性即可。所述其他藥物化合物可以在本發(fā)明的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物之前、同時或之后投用，其他藥物化合物最好是治療心臟疾病和心血管疾病的藥物，以及治療高脂血癥或血脂異?；衔铩Ｈ暨x自膽固醇吸收抑制劑，如依澤替米貝；膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑，如torcetrapib;其他增加HDL類藥物、他汀類藥物、他汀類磷酸酯衍生物及其混合物則更佳。比較適合的他汀類藥物包括普伐他汀、洛伐他汀和阿托伐他汀及其磷酸酯。投用對象最好是動物，若是哺乳動物更佳，是人則最佳。現(xiàn)根據(jù)以下附圖對本發(fā)明各實施例/方面進行說明。圖l:本發(fā)明實施例1在2周后的結(jié)果；圖2:本發(fā)明實施例l在4周后的結(jié)果；圖3:本發(fā)明實施例2的結(jié)果。具體實施方式現(xiàn)根據(jù)以下非限制性實施例對本發(fā)明各實施例/方面進行說明。實施例l本實施例用來評價現(xiàn)有CVD載脂蛋白E(AP0E)小鼠模型中生育酚磷酸酯混合物的抗CVD作用。本例中通過是否將升高的血漿膽固醇、甘油三酯和LDL水平降低來確定抗CVD作用。心血管研究中廣泛使用APOE敲除小鼠模型，該模型能模擬人部分疾病的許多臨床特性。AP0E敲除小鼠在大約6個月鼠齡時循環(huán)血脂水平開始升高。給小鼠喂高脂肪、高膽固醇食物(即21%脂肪、0.15%膽固醇)，使CVD急劇升高，以便盡快觀察相關(guān)癥狀。方法動物從澳大利亞佩思動物資源中心獲得雄性APOE敲除小鼠(15-20g)，提供不含維生素E，含脂肪21%和膽固醇0.15%的粒狀鼠禾良(GlenForrestStockfeeders，W.A.,Australia生產(chǎn))，關(guān)在標(biāo)準(zhǔn)實驗室籠中，自然光線，實驗前先讓它們適應(yīng)至少7天。本研究中，按高脂肪、高膽固醇飲食給AP0E小鼠連續(xù)喂養(yǎng)8周，之后每天經(jīng)口灌服載體(1%CMC)、生育酚乙酸酯(TA)100mg/kg，或者TP混合物(TPm)33.25、66,5或133mg/kg，持續(xù)治療4周。治療期間，定期采血，測定小鼠CDV改善狀況，以測定脂質(zhì)水平，并通過主動脈弓切片檢測療程結(jié)束時是否形成斑塊。試劑生育酚乙酸酯(M)(Sigma目錄號T-3001)生育酚磷酸酯混合物(77^)，含單生育酚磷酸酯和二生育酚磷酸酯，比例為2:1(自己生產(chǎn)，批號SGNaTPm/21-10-04)羧甲基纖維素(Sigma目錄號C-5678)Milli-Q水(自己提供)制備用1%羧甲基纖維素(CMC)按以下濃度制備TPm和TA溶液TA，15mg/ml;TPm，4.99、9.98和19.95mg/ml，TA按100mg/kg，TPm按33.25、66.5和133mg/kg的劑量給小鼠投用。制備這些溶液時，取適量各化合物加到P/。CMC中，然后放到裝有溫水(約5(TC)的水浴型超聲波破碎儀中運行15分鐘。133mg/kgTPm與100mg/kgTA的劑量大致相當(dāng)，所以66.5和33.25mg/kg分別相當(dāng)于TA100mg/kg劑量的50%和25%。用藥小鼠每周稱重，各化合物劑量根據(jù)投用當(dāng)周的小鼠重量計算，每天早上7:30am-11:00am用無菌口飼鋼針灌服。采血將小鼠固定住，從尾部采集大約50pl血，裝在C即ijectTM管中，然后8，000xg離心，收集血漿，進行脂質(zhì)分析(交由GribblesPathology公司測定總膽固醇、甘油三酯、HDL和LDL)。實驗開始前，先分別在單獨飲食第4周結(jié)束時(化合物治療開始前)、治療期第2周結(jié)束時給小鼠抽血(先期抽血)。治療期結(jié)束后，用C02將小鼠窒息而死，然后直接從心臟取血。經(jīng)高脂肪和高膽固醇飲食喂養(yǎng)的APOE小鼠在飲食期間，其血漿膽固醇、LDL和甘油三酯水平升高2-3倍，這一水平應(yīng)該非常高，因為在沒有給這些小鼠喂致動脈粥樣硬化食物時，其空腹脂質(zhì)就已達到很高水平。這個水平應(yīng)該算是一個好起點，有助于評價TPm對高脂質(zhì)水平的降低效果。血漿甘油三酯分析使用甘油三酯測定試劑盒(TriglycerideDeterminationKit)(Sigma，目錄號TR0100)檢測血漿甘油三酯。測定過程包括用甘油三酯脂酶水解得到甘油和游離脂肪酸，然后利用以下酶聯(lián)反應(yīng)測定水解產(chǎn)生的甘油。脂蛋白脂酶甘油三酯------------------〉甘油+脂肪酸甘油激酶甘油+ATP---------------->甘油-1-磷酸酯+ADP甘油磷酸酯氧化甘油-卜磷酸酯--------_>磷酸二羥基丙酮+H202酶過氧化物酶H202+4-氨基安替比林+SodiumN-乙基-N-(3-磺丙基)間位氨基苯甲醚--------------->醌亞胺染料+h20試劑盒中的試劑根據(jù)產(chǎn)品使用說明配制。將游離甘油對照試劑和樣品置于室溫。準(zhǔn)備一套試管，分別裝空白、對照和樣品。向各管中加入O.8ml游離甘油試劑，然后分別加10(il水、甘油對照或血漿。上下倒轉(zhuǎn)，使樣品混勻，在37。C放5分鐘。測定540nm吸光度，作為起始值(IA)。之后向各管內(nèi)加入0.2ml甘油試劑，再上下倒轉(zhuǎn)混勻，然后再37。C、5分鐘。最后測定540nm吸光度終值(FA)。血漿中總甘油三酯濃度計算如下tt廿油一而匕一^a樣品.fa空白^對照濃度總甘油二酉日一(fa對照-fa空白)血漿膽固醇分析使用工nfinityTM膽固醇試劑盒(ThermoElectronCorp.生產(chǎn)，目錄號TR13521)測定血漿膽固醇。反應(yīng)過程如下膽固醇酯酶膽固醇酯---------------------->膽固醇+脂肪酸膽固醇氧化酶膽固醇+o2------------------------〉4一膽甾烯酮+H202過氧化物酶2H202+羥基苯甲酸+4-氨基安替比林-----------〉醌亞胺染料+4H20(1)膽固醇酯在膽固醇酯酶作用下水解為膽固醇和游離脂肪酸。(2)游離膽固醇(包括原先存在的膽固醇)在膽固醇氧化酶作用下氧化為4-膽甾烯酮和過氧化氫。(3)過氧化氫與HBA和4-氨基安替比林結(jié)合形成發(fā)色團(醌亞胺染料)，可在500-550nm下測定。用CholesterolReagentTM試劑處理血漿(1:100)。例如，將3|^1樣品和300plCholesterolReagentTM試劑加到微孔板中，37°C、5分鐘。用試劑盒中的標(biāo)定試劑(calibrator)操作?？偰懝檀加嬎愎饺缦屡e例說明校驗儀吸光度二0.35未知吸光度二0.25校驗儀數(shù)值二7.0mmol/L膽固醇=0.25/0.35X7.0=5.0讓ol/L血漿HDL分析使用InfinityTMHDL膽固醇試劑盒(ThermoElectronCorp.生產(chǎn)，目錄號TR39601)測定HDL。將血漿(4^1)加到微孔板中，與300^il試劑l在37。C溫育5分鐘，然后加入100(al試劑2，再溫育3分鐘。之后在600nm下測定吸光度，最后仍使用膽固醇試劑盒中提供的標(biāo)定儀進行計算。血漿LDL分析使用InfinityTMLDL膽固醇附加試劑盒(CholesterolPlusReagentKit)(ThermoElectronCorp.生目錄號3365-030)測定LDL。將血漿(4^1)加到微孔板中，與300nl試劑l在37i:溫育5分鐘，然后加入100pl試劑2，再溫育5分鐘。之后在600nm下測定吸光度，最后仍使用膽固醇試劑盒中提供的標(biāo)定儀進行計算。統(tǒng)計分析結(jié)果用平均值±SD表示。采用Studentt-檢驗法確定經(jīng)TA或TPm治療的小鼠與未治療或載體對照組之間是否存在顯著性差異。本試驗中，P<0.05(*)視為有顯著性。結(jié)果與討論圖1:治療2周后結(jié)果。圖2:治療4周后結(jié)果。按33。25mg/kg劑量給小鼠投用TPm2周，該治療小鼠血漿中總膽固醇和LDL濃度與未治療或單使用載體治療的小鼠相比，顯著減小。治療4周后，治療小鼠血漿中甘油三酯水平與未治療或單使用載體治療的小鼠相比仍顯著降低。這些結(jié)果暗示，TPm(33.25膽固醇=標(biāo)定試劑濃度mg/kg)有可能將血液中升高的膽固醇、甘油三酯和LDL降低。實施例2本實施例用來評價生育酚磷酸酯混合物(TPm)(單生育酚磷酸酯和雙生育酚磷酸酯)對雄性AP0E缺陷小鼠中動脈粥樣硬化病灶進展的影響方法將28只小鼠分成4組2個對照組、1個生育酚乙酸酯(TA)組(按150mgTA/kg喂養(yǎng))和1個TPm組(按200mgTPm/kg喂養(yǎng)，含7%脂肪)飲食"誘導(dǎo)期"——誘導(dǎo)期包括治療期的前16周。這一期間，給小鼠喂低維生素E粒狀鼠糧(每克食物中維生素E少于20mg，含總脂肪7%)、加以改進的標(biāo)準(zhǔn)A頂93G嚙齒動物食物(SF05-040，Specialtyfeeds,GlenForrest,WAAustralia)。對照組動物僅喂上述食物，而TA組另外再按150mg/kg劑量喂給TA，TPm組按200mg/kg劑量喂給TPm。TA和TPm分別按平均21mg/kg'體重和26mg/kg'體重的劑量釋放。26mg/kgTPm相當(dāng)于TA中的生育酚劑量。"激發(fā)期"——這一時期包括治療期的后8周。該期間給小鼠喂低維生素E、高脂肪(21%)、高膽固醇(0.15%)的嚙齒動物專用粒狀食物(HFHC;SF04-055鼠糧在標(biāo)準(zhǔn)SF00-219鼠糧基礎(chǔ)上作了改動，每克食物中維生素E少于20mg;Specialtyfeeds,GlenForrest,WA:Australia)。4組動物的飲食方案治療組0-16周飲食16-24周飲食對照(C24)SF05-040SF05-040對照(C16/8)SF05-040SF04-055TASF05-040+TA(150mgTA/kg)SF04-055+TA(150mgTA/kg)TPmSF05-040+TPm(200mgTPm/kg)SF04-055+TPm(200mgTPm/kg)兩個對照動物組在為期24周的整個治療期間，只有1組提供SF04-055、HfflC飲食，而另1組仍提供SF05-040粒狀鼠茅良(僅7%脂肪)，目的是確定HFHC飲食對所測定的各種動脈粥樣硬化參數(shù)的作用，以及評估各種化合物治療是否對正常飲食動物有益處。TA治療動物按150mg/kg劑量喂給TA，給TPm治療動物按200mg/kg劑量喂給TPm。TA和TPm分別按平均21mg/kg'體重和26mg/kg'體重的劑量釋放。26mg/kgTPm相當(dāng)于TA中的生育酚劑量。誘導(dǎo)期期間，對照組大鼠得輕微高膽固醇血癥，出現(xiàn)動脈粥樣硬化病灶。用TPm治療16周后，與對照組相比，治療組小鼠的總膽固醇降低34%(11.44+/-1.37:17.38+/-1.47咖ol/L)、甘油三酯降低51%(0.99+/-0.14:2.00+/-0.58腿ol/L)和LDL-C降低44%(4.67+/-0.70:8.38+/-0.76mmol/L)，與對照組動物存在顯著性差異，遠大于用TA治療所得結(jié)果。激發(fā)期之后，對照組小鼠患有嚴(yán)重的高膽固醇血癥和晚期動脈粥樣硬化病灶。TA治療小鼠的血漿脂質(zhì)水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著降低或病灶退化跡象，雖然病灶區(qū)平均縮小12%(沒有顯著性)。但是，TPm治療組的總膽固醇降低15%(43.8+/-4.38:37.08+/-5.15咖ol/L)、甘油三酯降低28%(1.63+/-0.22:2.27+/-0.20咖ol/L)和LDL-C降低16%(15.02+/-2.61:17.95+/—1.51腿ol/L)，以及主動脈病灶形成區(qū)顯著縮小(58%)。表l:誘導(dǎo)期和激發(fā)期期間小鼠總膽固醇水平比較(平均值±SD;mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>#表示仍按HFHC飲食喂養(yǎng)(治療期的后8周)的對照組小鼠中血漿膽固醇水平要顯著高于正常飲食的對照組小鼠(P<0.05)。*表示與對照組動物相比有顯著性(P<0.05)表2:本試驗中小鼠在誘導(dǎo)期和激發(fā)期期間的甘油三酯水平比較(平均值±SD;腿ol/L)試驗組(n)基準(zhǔn)誘導(dǎo)期激發(fā)期周01624對照組SF05-040飲食(n=8-12)1.73±0.13(n=12)1.10±0.25(n=12)1.45±0.21(n=8)對照(n=8)1.18±0.282.00±0.582.27±0.20#TA(n=8)1.75±0.251.30±0.22*2.23±0.29TP(n=8)1.54±0.380.99±0.14*1.63±0.22*#表示仍按HFHC飲食喂養(yǎng)(治療期的后8周)的對照組小鼠中血漿膽固醇水平要顯著高于正常飲食的對照組小鼠(P〈0.05)。*表示與對照組動物相比有顯著性(P〈0.Q5)表3:本試驗中小鼠在誘導(dǎo)期和激發(fā)期期間的甘油三酯水平比較(平均值±SD;mmol/L)試驗組(n)基準(zhǔn)誘導(dǎo)期激發(fā)期周01624對照組SF05-040飲食(n=8-12)6.83±0.54(n=12)7.65士0.54(n二12)5.20±0.96(n=8)對照組(n=8)8.08±1.208,38±0.7617.95±1.51ttTA(n=8)8.85±1.666.51±0.7118.98±2.29TP(n=8)7.84±1.514.67±0.70*15.02±2.61#表示仍按HFHC飲食喂養(yǎng)(治療期的后8周)的對照組小鼠中血漿膽固醇水平要顯著高于正常飲食的對照組小鼠(P〈0.05)。*表示與對照組動物相比有顯著性(P〈0.05)表4:治療期結(jié)束時動脈粥樣病灶區(qū)(平均值士SD，％病灶覆蓋面)試驗組(n)%病灶覆蓋面對照組SF05-040飲食(n=8)8.9±1.7對照C16/8(n=8)10.7±1.3TA(n=8)9.4±1.1TPm(n=8)4.5±1.3**表示與對照組動物相比有顯著性(P<0.05)圖3顯示用油紅0染色(Oilred0staining)法確定的主動脈病灶形成情況。用油紅0對主動脈根部、胸部和腹部主動脈染色(脂肪染成紅色)，結(jié)果顯示，血管動脈粥樣硬化病灶中有大量脂肪沉積。表4顯示了各治療組在24周治療期結(jié)束時的病灶大小。誘導(dǎo)期結(jié)束時(第16周)各小鼠的動脈粥樣病灶覆蓋面平均約占主動脈區(qū)的5%(未列出數(shù)據(jù))。仍采用誘導(dǎo)飲食(僅有7%脂肪)的小鼠在第24周結(jié)束時，病灶區(qū)增加8.9%。在最后8周采用致動脈粥樣飲食的小鼠的動脈粥樣病灶覆蓋面平均約占主動脈區(qū)的10.7%，而TA治療組相應(yīng)數(shù)據(jù)為9.4%，TPm治療組為4.5%?？梢钥吹?，與仍采用同樣飲食喂養(yǎng)的對照組相比，TA治療可減小動脈粥樣硬化病灶達12%(沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性)，而TPm治療可顯著減小病灶形成達58%。結(jié)論試驗結(jié)果顯示，經(jīng)TPm治療的動物體內(nèi)脂質(zhì)水平(LDL、總膽固醇和甘油三酯)顯著降低，這表明TPm治療可治療高血脂異常病及相關(guān)疾病。另外，結(jié)果還顯示，經(jīng)TPm治療的APOE缺陷小鼠體內(nèi)動脈粥樣病灶尺寸顯著減小，表明TPm可治療或減慢這類鼠的動脈粥樣硬化病灶的進展。本說明書和權(quán)利要求書所用的"包括"一詞和其形式并不限制本發(fā)明以排除任何變更或補充。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，對本發(fā)明作出修改和改進是很顯而易見的。所以這些修改和改進仍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種降低血液脂質(zhì)水平的治療方法，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該治療方法包括投用有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物；其中該電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物不是抗壞血酸-生育酚磷酸酯。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療方法，其中，所述電子轉(zhuǎn)移劑選自母育酚、維生素A、維生素K1及其混合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療方法，其中，所述電子轉(zhuǎn)移劑選自母育酚和其混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療方法，其中，所述電子轉(zhuǎn)移劑選自cx-生育酚、5-生育酚、y-生育酚、oc-生育三烯酚、S-生育三烯酚、Y-生育三烯酚及其混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的治療方法，其中，所述電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物選自單生育酚磷酸酯、二生育酚磷酸酯、單生育三烯酚磷酸酯、二生育三烯酚磷酸酯及其混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療方法，其中，所述電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物是單生育酚磷酸酯和二生育酚磷酸酯的混和物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療方法，其進一步包括投用一種或多種不會抑制本發(fā)明電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物活性的其他藥物化合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的治療方法，其中，其他藥物化合物選自膽固醇吸收抑制劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑、增加HDL藥物化合物和他汀類藥物及其磷酸酯衍生物和其混合物。9.一種降低血液脂質(zhì)水平的治療方法，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該治療方法包括投用有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物前藥；其中該電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物不是抗壞血酸-生育酚磷酸酯。10.—種緩解疾病癥狀、治療或預(yù)防疾病的方法，所述疾病選自心血管疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎病、原發(fā)性和繼發(fā)性高脂血癥和血脂異常、視網(wǎng)膜病、肝脾腫大、黃色瘤和其組合，該方法包括向上述疾病患者或有患上述疾病危險的對象投用有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物。11.有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物和適合的載體或稀釋劑在制造降低血液脂質(zhì)水平藥物中的應(yīng)用，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，其中該電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物不是抗壞血酸-生育酚磷酸酯。12.—種用于降低血液脂質(zhì)水平的藥物組合物，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該組合物包括有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物，其中該電子轉(zhuǎn)移劑磷酸酯衍生物不是抗壞血酸-生育酚磷酸酯。全文摘要本發(fā)明提供一種降低血液脂質(zhì)水平的治療方法，所述脂質(zhì)選自LDL膽固醇、甘油三酯、總膽固醇及其混合物，該治療方法包括投用有效量的一種或多種電子轉(zhuǎn)移劑的一種或多種磷酸酯衍生物。文檔編號A61K31/07GK101132789SQ200680006932公開日2008年2月27日申請日期2006年3月3日優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日發(fā)明者E·奧古,R·利比來凱,S·M·韋斯特申請人:生命健康科學(xué)有限公司