專利名稱：：聯(lián)合使用telomelysin的抗癌藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于肺瘤的聯(lián)合療法的藥物組合物，該藥物組合物包括含多核普酸的重組病毒和具有抗肺瘤作用的物質(zhì)，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。
背景技術(shù)：
：在腫瘤細(xì)胞中選擇性增殖的重組病毒在肺瘤細(xì)胞中發(fā)生病毒的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此，僅該重組病毒即具有抗胂瘤效果。但是，通過與具有抗腫瘤效果的物質(zhì)聯(lián)合使用，可以抑制癌細(xì)胞的增殖、確保病毒在癌細(xì)胞內(nèi)有充裕的時(shí)間增殖。另外，在癌細(xì)胞內(nèi)增殖的病毒^皮抗癌藥破壞，促進(jìn)病毒的釋放，使病毒急劇向周邊癌細(xì)胞擴(kuò)散，有望獲得顯著的抗腫瘤效果。并且，病毒導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與以往的抗癌藥導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的作用基理不同，因此聯(lián)合使用時(shí)，每種的抗腫瘤效果受到抑制的可能性低。實(shí)際上已有報(bào)道指出，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性增殖的皰疹病毒與抗癌藥或放射療法等以往的抗癌治療聯(lián)合使用，在臨床之前或臨床上可見抗腫瘤效果的增強(qiáng)(PostDE,FulciG,ChioccaEA,VanMeirEG.Replicativeoncolyticherpessimplexvirusesincombinationcancertherapies.CurrGeneTher.2004Mar;4(1):41-51以及BennettJJ,AdusumilliP,Pe加wakyH,BurtBM,RobertsG,DelmanKA,ZagerJS,ChouTC,FongY.Up-regulationofGADD34mediatesthesynergisticanticanceractivityofmitomycinCandagamma134,5deletedoncolyticherpesvirus(G207).FASEBJ.2004Jun;18(9):1001-3)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供抗癌活性進(jìn)一步增強(qiáng)的藥物組合物。本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入的研究。發(fā)現(xiàn)通過將包括含多核苷酸的重組病毒與以往的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，抗肺瘤活性提高，從而完成了本發(fā)明。其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和EIB基因。即，本發(fā)明包含以下內(nèi)容。(1)用于腫瘤聯(lián)合療法的藥物組合物，該藥物組合物包括含多核香酸的病毒和具有抗肺瘤作用的物質(zhì)，其中所述多核苦酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。上述藥物組合物中，人端粒酶例如有hTERT。病毒可以例舉腺病毒。具有抗腫瘤作用的物質(zhì)除具有微管抑制活性的物質(zhì)、具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)之外，還可以是具有組蛋白去乙酰化酶抑制活性的物質(zhì)或具有INGN-201的物質(zhì)。并且，作為具有微管抑制活性的物質(zhì)，可以例舉多西他賽或長(zhǎng)春瑞濱或者它們的鹽，具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)可以例舉伊立替康或其鹽，具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘奈镔|(zhì)可以例舉FR901228。腫瘤并沒有特別限定，例如可以是肺癌、大腸癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、頭頸部癌、肝癌、胰臟癌、膽嚢膽管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、曱狀腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、間葉組織腫瘤等。(2)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其特征在于將含有多核苷酸的重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。(3)腫瘤的治療方法，其特征在于將含有多核苷酸的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。上述(2)和(3)中，人端粒酶例如有hTERT。病毒可以例舉腺病毒。具有抗腫瘤的物質(zhì)除具有微管抑制活性的物質(zhì)、具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)之外，還可以是具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘奈镔|(zhì)或具有INGN-201的物質(zhì)。并且，作為具有微管抑制活性的物質(zhì)，可以例舉多西他賽或長(zhǎng)春瑞濱或者它們的鹽，具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)可以例舉伊立替康或其鹽，具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘奈镔|(zhì)可以例舉FR901228。肺瘤并沒有特別限定，例如可以是肺癌、大腸癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、頭頸部癌、肝癌、胰臟癌、膽嚢.膽管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、間葉組織腫瘤等。附圖簡(jiǎn)述圖1表示本發(fā)明的重組腺病毒(telomelysin)的模式圖。圖2表示FR901228。圖3是表示CAR表達(dá)對(duì)腺病毒感染的影響的圖。圖4表示使用XTT檢測(cè)對(duì)telomelysin和微管抑制藥物的聯(lián)合用藥效果進(jìn)行分析的圖表。圖5表示使用telomelysin、微管抑制藥長(zhǎng)春瑞濱以及拓樸異構(gòu)酶I抑制劑SNJ8(CPT-11代謝產(chǎn)物)進(jìn)行XTG檢測(cè)的圖表。圖6表示抗癌藥對(duì)重組病毒的增殖的影響的分析圖表。圖7是表示telomelysin和微管抑制藥物對(duì)胂瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響的圖表。圖8表示telomelysin和微管抑制藥對(duì)H1299人肺癌肺瘤的體內(nèi)抗腫瘤效果。圖9是表示胂瘤內(nèi)給予telomelysin后腫瘤組織和肝臟的組織學(xué)變化(HE染色)的照片。圖0是表示HDAC抑制劑FR901228對(duì)腺病毒受體CAR表達(dá)的作用的圖表。圖11是表示HDAC抑制劑FR901228對(duì)腺病毒感染效率的作用的照片。圖12是表示HDAC抑制劑FR901228增強(qiáng)OBP-401感染效率的13是表示HDAC抑制劑FR901228增強(qiáng)telomelysin抗腫瘤效果的圖表。圖14是測(cè)定Advexm的抗腫瘤效果的圖表。圖15是測(cè)定同時(shí)給予telomdysin-Advexin時(shí)的抗腫瘤效果的圖表。圖16是測(cè)定間隔時(shí)間給予telomelysin-Advexin時(shí)的抗腫瘤效果的圖表。圖17是測(cè)定間隔時(shí)間給予telomelysin-Advexin時(shí)的抗腫瘤效果的圖表。圖18是測(cè)定間隔時(shí)間給予telomelysin-Advexin時(shí)的抗腫瘤效果的圖表。實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明是涉及用于腫瘤的聯(lián)合療法的藥物組合物，該藥物組合物包括含多核苷酸的重組病毒和具有抗肺瘤作用的物質(zhì)，其中所述多核普酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。本發(fā)明的藥物組合物比將上述重組病毒和抗腫瘤作用物質(zhì)單獨(dú)給予腫瘤細(xì)胞時(shí)得到的抗腫瘤效果可得到更優(yōu)異的效果，并且可以對(duì)在單獨(dú)使用這些物質(zhì)時(shí)無法發(fā)揮抗腫瘤作用的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效果。以下詳細(xì)說明本發(fā)明。1.本發(fā)明的重組病毒本發(fā)明的重組病毒是指依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的多核苷酸整合到基因組中的病毒。所使用的病毒沒有特別限定，從安全性等角度考慮，優(yōu)選腺病毒。從使用簡(jiǎn)便性等考慮，腺病毒中特別優(yōu)選5型腺病毒。本發(fā)明所使用的重組病毒通過人端粒酶的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)E1A基因、IRES序列和E1B基因。正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中的端粒酶的表達(dá)極高，因此含有端粒酶的腫瘤細(xì)胞中，端粒酶啟動(dòng)子表達(dá)，由此，本發(fā)明所含的重組病毒增殖。如上所述，本發(fā)明的藥物組合物所含的重組病毒在正常細(xì)胞中不增殖，只在胂瘤細(xì)胞中增殖，因此發(fā)生癌細(xì)胞特異性和端粒酶特異性增殖、復(fù)制。結(jié)果，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，由于病毒增殖引起細(xì)胞障礙，由此，本發(fā)明所使用的重組病毒可特異性殺死腫瘤細(xì)胞。"端粒酶的啟動(dòng)子，，是確定端粒酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并直接調(diào)節(jié)其頻率。端粒酶是拮抗真核生物染色體復(fù)制時(shí)的縮短，可維持端粒長(zhǎng)度的酶。上述端粒酶的啟動(dòng)子的種類只要是可與目標(biāo)基因表達(dá)中使用的病毒對(duì)應(yīng)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子即可，沒有特別限定，例如優(yōu)選人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的啟動(dòng)子。在hTERT的5，末端上游1.4kbp的區(qū)可見4艮多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，可認(rèn)為該區(qū)是hTERT的啟動(dòng)子，其中，翻譯起始位點(diǎn)的上游181bp的序列對(duì)于下游基因的表達(dá)來說是重要的核心區(qū)。本發(fā)明中，只要包含該核心區(qū)，則均可不限定地使用，優(yōu)選將完全包含了該核心區(qū)上游378bp左右的序列作為hTERT啟動(dòng)子4吏用。該378bp左右的序列與單獨(dú)的181bp的核心區(qū)相比，可以確認(rèn)其基因表達(dá)效率相同。將455bp長(zhǎng)度的hTERT啟動(dòng)子的堿基序列表示為SEQIDNo.l。hTERT啟動(dòng)子除SEQIDNo.l所示的堿基序列之外，也包含在嚴(yán)格條件下與具有同含SEQIDNo.l的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交、且具有hTERT啟動(dòng)子活性的核苷酸的堿基序列。上述核普酸可如下獲得以含有SEQIDNo.l所示堿基序列的多核苷酸或其片段作為探針，通過集落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得。cDNA文庫(kù)的制備方法可參照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.，，(ColdSpringHarborPress(1989))。另外，也可以使用市售的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)。上述雜交中，嚴(yán)格條件例如有l(wèi)xSSC-2xSSC、0.1%-0.5%SDS和42。C-68。C的條件，更具體地說，有在60-68。C下進(jìn)行30分鐘或以上的預(yù)雜交，然后在2xSSC、0.P/。SDS中、在室溫下進(jìn)行4-6次5-15分鐘的洗滌的條件。雜交方法的i羊纟田順序可參照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989);特別是Section9.47-9.58)等。也可以使用與SEQIDNo.l具有50%或以上、60%或以上、70%或以上、80%或以上、90%或以上、95%或以上、98%或以上或99%或以上的同源性、且具有hTERT啟動(dòng)子活性的核苷酸的堿基序列。本發(fā)明中，制成依次含有E1A基因、IRES序列和E1B基因，這是由于，將IRES序列插入到E1A基因和E1B基因之間使用，在使病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)增殖能力提高。E1A基因和E1B基因是E1基因所含的基因，該El基因可以是指病毒所具有的、與DNA復(fù)制相關(guān)的早期基因(early:E)和晚期基因(late:L)中早期基因的一個(gè)，編碼與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。由E1A基因編碼的E1A蛋白質(zhì)可活化可進(jìn)行感染的病毒的生成所必需的基因群(E1B、E2、E4等)的轉(zhuǎn)錄。由E1B基因編碼的E1B蛋白質(zhì)可幫助晚期基因(L基因)的mRNA在所感染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積蓄，通過抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)病毒的復(fù)制。E1A基因、E1B基因的堿基序列分別表示為SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。ElA和E1B除各SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的堿基序列之外，還包含在嚴(yán)才各條件下與具有同含SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交、且編碼具有各E1A和E1B的活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。上述堿基序列可如下獲得以分別含有SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示堿基序列的多核苷酸或其片段作為探針，通過集落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫(kù)說明書第6/26頁(yè)和基因組文庫(kù)獲得。cDNA文庫(kù)的制備方法可參照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.，，(ColdSpringHarborPress(1989))。另夕卜，也可以使用市售的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)。上述雜交中，嚴(yán)才各條件例如有l(wèi)xSSC-2xSSC、0.1%-0.5%SDS和42。C-68。C的條件，更具體地說，有在60-68t:下進(jìn)行30分鐘或以上的預(yù)雜交，然后在2xSSC、0.1%SDS中、在室溫下進(jìn)行4-6次5-15分鐘的洗滌的條件。雜交方法的詳細(xì)順序可參照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded"(ColdSpringHarborPress(1989);特別是Section9.47-9.58)等。也可以使用與SEQIDNo.2或3具有50%或以上、60%或以上、70%或以上、80%或以上、90%或以上、95%或以上、98%或以上或99%或以上的同源性、且具有E1A和E1B的活性的核普酸的堿基序列。IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))是小RNA病毒科特異性的蛋白質(zhì)合成起始信號(hào)，具有與18S核糖體RNA的3'末端互補(bǔ)的序列，因此可發(fā)揮核糖體結(jié)合位點(diǎn)的作用。來自小RNA病毒科的病毒的mRNA經(jīng)由該序列被翻譯。通過IRES序列進(jìn)行的翻譯效率高，即使從mRNA的中途也可以不依賴帽(cap)結(jié)構(gòu)地進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。因此，本病毒可以通過人端粒酶的啟動(dòng)子獨(dú)立地翻譯E1A基因和位于IRES序列下游的E1B基因兩者。使用IRES,則端粒酶的啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控獨(dú)立地與E1A基因、E1B基因相關(guān)，與通過端粒酶的啟動(dòng)子控制E1A基因或E1B基因其中一方的情況相比，可以將病毒的增殖更嚴(yán)格地限定在具有端粒酶活性的細(xì)胞中。IRES序列如SEQIDNo.4所示。IRES除SEQIDNo.4所示的堿基序列之外，還包含在嚴(yán)才各條件下與具有同含SEQIDNo.4的DNA互補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交、且編碼具有IRES活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。上述堿基序列可如下獲得以含有SEQIDNo.4所示堿基序列的多核苷酸或其片段作為探針，通過集落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡等公知的雜交方法，由cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得。cDNA文庫(kù)的制備方法可參照"MolecularCloning，ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989》。另夕卜，也可以使用市售的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)。上述雜交中，嚴(yán)才各條件例如有l(wèi)xSSC-2xSSC、0.1%-0.5%SDS和42。C-68。C的條件，更具體地說，有在60-68。C下進(jìn)行30分鐘或以上的預(yù)雜交，然后在2xSSC、0.1%SDS中、在室溫下進(jìn)行4-6次5-15分鐘的洗滌的條件。雜交方法的詳細(xì)順序9可參照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989);特別是Section9.47-9.58)等。也可以使用與SEQIDNo.4具有50%或以上、60%或以上、70%或以上、80%或以上、90%或以上、95%或以上、98%或以上或99%或以上的同源性、且具有IRES的活性的核苷酸的堿基序列。本發(fā)明中，人端粒酶的啟動(dòng)子位于El基因的上游。這樣可以促進(jìn)在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)增殖。本發(fā)明的重組病毒中所含的基因可通過常規(guī)基因工程的方法獲得。例如可采用核酸合成法，該方法使用基因工程方法中通常使用的DNA合成裝置進(jìn)行。還可以在分離或合成作為模板的基因序列后，設(shè)計(jì)各基因特異性的引物，采用使用PCR裝置擴(kuò)增基因序列的PCR法(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1987)Section6.1-6.4)、或使用克隆載體的基因擴(kuò)增法。上述方法可按照"MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded."(ColdSpringHarborPress(1989))等，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可容易地進(jìn)行。所得PCR產(chǎn)物的純化可采用公知方法。例如有使用溴化乙錠的方法、使用SYBRGreenl(Molecularprobes制備)的方法、使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAGEN(QIAGEN)等的瓊脂糖凝膠的方法、使用DEAE-纖維素濾紙的方法、冷凍和擠壓法、使用透析管的方法等。使用瓊脂糖凝膠時(shí)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切取、純化。還可根據(jù)需要通過常用的序列確定法確認(rèn)獲得了所需的基因。例如可通過雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等人.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463)等進(jìn)行。還可以利用適當(dāng)?shù)腄NA測(cè)序儀(例如ABIPIRSM(AppliedBiosystems制造))進(jìn)行序列分析。然后，將上述所得的各個(gè)基因按照規(guī)定順序連接。首先，將上述各基因用公知的限制酶等切斷，將切斷的該基因的DNA片段按照公知的方法插入到公知的載體中，進(jìn)行連接。公知的載體包括腦心肌炎病毒(ECMV)的IRES(mRNA內(nèi)部的核糖體結(jié)合位點(diǎn))，除由一種mRNA可以翻譯兩處開放閱讀框(ORF)的pIRES載體之外，還可以使用來自大腸桿菌的質(zhì)粒(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)、來自枯草桿菌的質(zhì)粒(pUB110、pTP5、pC194等)、來自酵母的質(zhì)粒(pSH19、pSH15等)、X噬菌體等噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等動(dòng)物病毒等，除此之外還可使用pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。本發(fā)明中，如果使用pIRES載體，則通過將所需基因依次插入到多克隆位點(diǎn)，可以制備依次含有"人端粒酶啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因"的重組基因，因此優(yōu)選。DNA的連接可以4吏用DNA連接酶。上述重組基因向病毒內(nèi)的整合例如可通過電穿孔法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)球法、乙酸鋰法等。本發(fā)明中，對(duì)于使用hTERT作為人端粒酶的情形進(jìn)行以下具體說明。使用E1A-S、E1A-AS、E1B-S、E1B-AS等引物，通過進(jìn)行RT-PCR和/或DNA-PCR,可以由293細(xì)胞等表達(dá)El基因的細(xì)胞中擴(kuò)增E1A基因和E1B基因，還可根據(jù)需要使用TA克隆等公知的方法確認(rèn)序列，然后用公知的限制酶切取E1A和E1B的DNA片段。接著，本發(fā)明中使用的含有hTERT-ElA-IRES-ElB的基因可如下制備按照"E1A-IRES-E1B"的順序，利用多克隆位點(diǎn)等，將各基因插入到公知的載體(例如pIRES等)中。接著，可以將用Mlul、BglIII等限制酶切取的hTERT啟動(dòng)子序列插入到E1A的上游。還可根據(jù)需要，通過MfeI、NheI等適當(dāng)?shù)南拗泼赋Shuttle等公知的載體中所含的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，向該位點(diǎn)插入用限制酶NheI和NotI從phTERT-ElA-IRES-ElB中切取的序列。如上所述，將整合了含有本發(fā)明所使用的hTERT-ElA-IRES-ElB的盒(圖l)的腺病毒被特別稱為"telomelysm"。在hTERT啟動(dòng)子的控制下，通過〗吏腺病毒增殖所必須的El基因表達(dá)，可以使病毒在癌細(xì)胞中特異性增殖。將重組病毒感染細(xì)胞時(shí)，例如可按照以下方法進(jìn)行感染。首先，將人大腸癌細(xì)胞SW620、人肺癌細(xì)胞A549、H1299等細(xì)胞接種在加入了適當(dāng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)板上，在二氧化碳存在下、在37。C進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液可采用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中通常使用的DMEM、MEM、RPMI-1640等，可根據(jù)需要添加血清、抗生素、維生素等。通過向培養(yǎng)的細(xì)胞中接種一定量的本病毒、例如0.1-10MOI,優(yōu)選0.1-1MOI(感染復(fù)數(shù))，使其感染。MOI是指使一定量的病毒顆粒感染一定量的培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，病毒量(感染單位)與細(xì)胞數(shù)的比，用作將病毒感染細(xì)胞時(shí)的指標(biāo)。為了確認(rèn)病毒增殖，回收病毒感染的細(xì)胞，提取DNA，使用以該病毒所具有的適當(dāng)?shù)幕蜃鳛榘械囊?，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,可進(jìn)行定量分析。2.具有抗腫瘤作用的物質(zhì)本發(fā)明的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)是指具有抑制腫瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)的發(fā)育或增殖的作用的物質(zhì)，也包含通過抑制癌細(xì)胞的核酸合成或者抑制代謝來阻止增殖的物質(zhì)。其中所述胂瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)是由于肌體調(diào)節(jié)功能紊亂、細(xì)胞分裂反復(fù)進(jìn)行、細(xì)胞過量增殖，導(dǎo)致形成腫瘤塊。具體來說，有向癌細(xì)胞的核酸蛋白質(zhì)中導(dǎo)入烷基，引起細(xì)胞障礙的具有烷基化活性的物質(zhì)；在代謝過程中拮抗酶、抑制細(xì)胞合成的具有代謝拮抗活性的物質(zhì)；具有抗癌作用的抗生素；作用于微管、顯示抗腫瘤效果的具有微管抑制活性的物質(zhì)；具有抑制拓樸異構(gòu)酶的拓樸異構(gòu)酶抑制活性的物質(zhì)等。拓樸異構(gòu)酶是指在DNA上臨時(shí)加入切口，催化改變DNA鏈的連接數(shù)目的反應(yīng)的酶。各物質(zhì)具體如以下所示。具有烷基化活性的物質(zhì)卡波醌、白消安(芥子藥)、尼莫司汀(亞硝基脲類)等具有代謝拮抗活性的物質(zhì)曱氨蝶呤(葉酸系)、巰嘌呤、(嘌呤系)、阿糖胞苷(嘧啶系)、氟尿嘧啶、替加氟、卡莫氟等抗生素放線菌素D、博來霉素、多柔比星、絲裂霉素C等具有微管抑制活性的物質(zhì)多西他賽、紫杉醇(紫杉烷)、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿(生物堿系)等具有拓樸異構(gòu)酶抑制活性的物質(zhì)伊立替康(拓樸異構(gòu)酶I抑制藥)、鬼臼毒素衍生物(拓樸異構(gòu)酶II抑制藥)本發(fā)明中，可以使用上述具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的鹽。適合本發(fā)明的"鹽"沒有特別限定，例如有鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、焦硫酸、偏磷酸、氬碘酸等各種無機(jī)酸加成鹽；乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸等各種有機(jī)酸加成鹽；天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽等各種氨基酸的鹽。上述物質(zhì)具有酚式羥基或羧基時(shí)，還可以以鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽的形式使用。本發(fā)明中，可以使用上述物質(zhì)的水合物或非水合物等。非水合物可以使用醇(例如曱醇、乙醇、正丙醇)、二甲基甲酰胺等。上述物質(zhì)可通過公知的化學(xué)合成或者以市售商品的形式獲得。特別是上述抗癌藥中，作為本發(fā)明的抗癌藥，優(yōu)選具有微管抑制活性的物質(zhì)一多西他賽和長(zhǎng)春瑞濱、以及具有拓樸異構(gòu)酶抑制活性的物質(zhì)一伊立替康，但并不限于此。多西他賽在上述微管抑制藥中被分為紫杉烷類，主要適用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌的治療。多西他賽可以從紅豆杉針葉提取物中以半合成品的形式獲得，促進(jìn)與微管蛋白的聚合，形成微管，同時(shí)抑制微管的脫聚，除此之外還具有使細(xì)胞有絲分裂停止的功能。長(zhǎng)春瑞濱在上述微管抑制藥中被分類為植物(長(zhǎng)春花)生物堿系，適用于非小細(xì)胞肺癌的治療，除此之外還作為注射藥治療乳腺癌。長(zhǎng)春瑞濱的神經(jīng)毒性低，選擇性作用于微管蛋白，抑制其聚合，除此之外，還具有通過妨礙細(xì)胞分裂來殺死細(xì)胞的功能。伊立替康被分類為具有上述拓樸異構(gòu)酶抑制活性的物質(zhì)，適用于大腸癌、幾種惡性淋巴瘤以及小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌(無法手術(shù)或復(fù)發(fā))、結(jié)腸直腸癌(無法手術(shù)或復(fù)發(fā))、乳腺癌(無法手術(shù)或復(fù)發(fā))、棘細(xì)胞癌、以及惡性淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)等癌癥的治療。伊立替康是從中國(guó)原產(chǎn)植物喜樹中提取的長(zhǎng)春花生物堿一喜樹堿，通過妨礙細(xì)胞分裂的必需元素的發(fā)育，具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功^匕f]匕。上述分類中未含有、但具有組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制活性的物質(zhì)也作為本發(fā)明的藥物組合物所含的物質(zhì)有效。具有HDAC抑制活性的物質(zhì)是發(fā)揮抑制組蛋白去乙?；饔玫奈镔|(zhì)。具有HDAC抑制活性的物質(zhì)通過增強(qiáng)腺病毒受體(CAR)的表達(dá)，可以在某種癌細(xì)胞中與tdomelysin發(fā)揮協(xié)同的抗肺瘤效果。HDAC是調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；拿傅囊环N，是發(fā)揮抑制組蛋白去乙?；淖饔玫拿?。組蛋白是形成核小體的核心的蛋白質(zhì)，通過催化組蛋白的去乙?；?，具有促進(jìn)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化、抑制基因表達(dá)的功能。已經(jīng)鑒定出抑制該HDAC的作用、在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮使組蛋白乙?；淖饔玫奈镔|(zhì)，作為HDAC抑制劑，目前正以美國(guó)NCI(美國(guó)國(guó)立癌癥研究所)為中心進(jìn)行臨床試驗(yàn)。具有HDAC抑制活性的物質(zhì)是誘導(dǎo)細(xì)胞腫瘤分化或細(xì)胞自身分化的物質(zhì)，因此，即使不采用強(qiáng)力的化學(xué)療法也可以使癌化細(xì)胞恢復(fù)為正常細(xì)胞。作為具有HDAC抑制活性的物質(zhì)的一個(gè)例子有^f皮稱為FR901228(FK128)的物質(zhì)(圖2)。FR901228在美國(guó)國(guó)立癌癥研究所以NSC編號(hào)630176登記，是來自Mapouriamandrarensis的環(huán)肽，分子式為C24H36N406S2,如圖2所示化學(xué)式表示。FR901228在造血性細(xì)胞中促進(jìn)柯薩奇病毒.腺病毒受體(CAR)水平或av整聯(lián)蛋白水平以及H3組蛋白的乙酰化，據(jù)^艮道，經(jīng)FR901228處理的造血細(xì)胞容易感染腺病毒(Blood,15March2002,vol.99,No.6,2248-2251頁(yè))。腺病毒經(jīng)由受體CAR感染并進(jìn)入細(xì)胞，在CAR為陰性的癌細(xì)胞中，病毒感染效率降低。因此在癌細(xì)胞中，如果CAR的表達(dá)增強(qiáng)，則腺病毒容易進(jìn)入癌細(xì)胞(圖3)。FR901228可以使癌細(xì)胞中CAR的表達(dá)增強(qiáng)，因此將FR901228與本發(fā)明的重組腺病毒聯(lián)合使用時(shí)，F(xiàn)R901228除本身的抗腫瘤作用之外，還具有提高聯(lián)合使用的重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞感染效率的作用，故而優(yōu)選。這里，F(xiàn)R901228是否增強(qiáng)在癌細(xì)胞中CAR的表達(dá)，這可以通過使用流式細(xì)胞儀的以下試-瞼進(jìn)行確認(rèn)。即，將各種腫瘤細(xì)胞在適當(dāng)條件下培養(yǎng)，然后添加適量FR901222,進(jìn)行處理，然后通過流式細(xì)胞儀分析CAR的表達(dá)?；蛑委熤惺褂玫奈镔|(zhì)也作為本發(fā)明的藥物組合物所含的物質(zhì)有效?；蛑委熓侵甘咕哂邪┮种浦委?、免疫增強(qiáng)活性或血管生成抑制作用的蛋白質(zhì)在體內(nèi)瞬時(shí)或持續(xù)性表達(dá)，治療腫瘤的方法。上述基因治療中使用的物質(zhì)具體有INGN-201(Advexin:IntrogenTherapeutics制備)，但并不限于此。INGN-201是將胂瘤抑制基因p53基因整合到腺病毒中的基因治療藥，是表達(dá)p53蛋白質(zhì)的不可復(fù)制的腺病毒。在一些腫瘤細(xì)胞中與telomelysm發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效果。INGN-201與telomelysin不同，通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡來發(fā)揮抗腫瘤效果。INGN-201和telomelysin同時(shí)感染癌細(xì)胞，則通過利用由telomelysin生成的El蛋白質(zhì)，不可復(fù)制的INGN-201也可以增殖。通過該INGN-201,可以大量生成p53蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，同時(shí)加強(qiáng)telomelysin導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，有望獲得非常強(qiáng)烈的殺死細(xì)胞的效果。本發(fā)明的藥物組合物發(fā)揮作用的腫瘤(癌)細(xì)胞種類沒有限定，可以使用所有種類的腫瘤細(xì)胞。例如對(duì)頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前列腺、胰臟、食道、膀胱、膽嚢.膽管、乳房、子宮、甲狀腺、卵巢等的實(shí)體癌，或者白血病、淋巴瘤、肉瘤、間葉組織腫瘤等有效。來自人組織的腫瘤細(xì)胞幾乎都顯示端粒酶活性升高，本發(fā)明的藥物組合物可以全面地作用于由于上述端粒酶活性使增殖活躍的腫瘤細(xì)胞。特別是對(duì)本發(fā)明使用的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)(抗癌藥)所發(fā)揮作用的大腸、肺、胃、食道、肝臟、前列腺、頭頸部、乳房等有效。如上所述，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞比較，端粒酶表達(dá)極高，因此本發(fā)明的藥物組合物所含的重組病毒在正常細(xì)胞中不增殖，只在腫瘤細(xì)胞中增殖，因此可以特異性地殺死腫瘤細(xì)胞。3.藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物的特征在于將含有多核苷酸的重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用。其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。這是由于telomelysin重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞殺死作用的機(jī)理與以往的抗癌藥的編程性細(xì)胞死亡的作用機(jī)理不同，并且telomelysin重組病毒是通過telomelysin的性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，即，即使在用具有抗腫瘤作用的物質(zhì)處理肺瘤細(xì)胞時(shí)也不會(huì)受其任何影響，可以在該細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖復(fù)制。本發(fā)明的藥物組合物可以直接應(yīng)用于患部，也可以通過所有公知的方法例如靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下等注射，或者鼻腔、口腔或肺吸入，口服、使用飼管等的血管內(nèi)給予等導(dǎo)入到生物體(作為對(duì)象的細(xì)胞或器官)中。并且還可以將本發(fā)明的藥物組合物所含的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)同時(shí)給予；也可以通過先給予一方，然后經(jīng)過一定時(shí)間后給予另一方的方法導(dǎo)入生物體。例如通過冷凍等方法使其變得容易處理，然后可以直接使用，或者與賦形劑、增量劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等公知的藥學(xué)可接受的載體，公知的添加劑(緩沖劑、等滲劑、螯合劑、著色劑、防腐劑、香精、風(fēng)味劑、甜味劑等)等混合。本發(fā)明的藥物組合物中含有的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)分別獨(dú)立給予時(shí)，也可以分別混合上述物質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)片劑、膠嚢劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、糖漿劑等口服劑，注射劑、外用劑、栓劑、滴眼劑等非口服劑等形式進(jìn)行口服給予或腸道外給予。優(yōu)選的例子有肌肉、腹腔等的局部注射、靜脈注射等。給予量可根據(jù)有效成分的種類、給予途徑、給予對(duì)象、患者的年齡、體重、性別、癥狀等其它條件適當(dāng)選擇。本發(fā)明所含的病毒的每天給予量可以是106-1011PFU(蝕斑形成單位)左右，優(yōu)選10M0"PFU左右，可以每天給予一次，也可以分多次給予。使用本發(fā)明的病毒時(shí)，通過使用公知的免疫抑制劑等，可以抑制機(jī)體免疫，使該病毒容易感染。并且，本發(fā)明的病毒可以與選自7>知的抗癌藥和》文射線的至少一種抗癌藥聯(lián):合使用?；谝韵碌睦碛桑景l(fā)明的藥物組合物產(chǎn)生副作用的可能性極低，可以說是非常安全的制劑。(1)正常的體細(xì)胞中幾乎沒有端粒酶活性，另外，在造血細(xì)胞等游走細(xì)胞中，本發(fā)明的病毒難以感染。(2)本發(fā)明的病毒具有增殖能力，因此可以以比在常規(guī)的基因治療中使用的非增殖性病毒更低的濃度使用。(3)即使過量給予本發(fā)明的病毒，也可由于機(jī)體的通常的免疫作用而發(fā)揮抗病毒作用。本發(fā)明中所含的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的給予量也根據(jù)有效成分的種類、給予途徑、給予對(duì)象、患者的年齡、體重、性別、癥狀等條件適當(dāng)選擇。例如為多西他賽時(shí)，通常為成人每天l次，用l小時(shí)或以上的時(shí)間靜脈輸注60mg/m、體表面積)，每隔3-4周間隔輸注一次。也可以根據(jù)癥狀適當(dāng)增減。但每次的最高用量為70mg/m2。為長(zhǎng)春瑞濱時(shí)，例如可以以一周的間隔每次以2.0-2.5mg/m2靜脈內(nèi)緩釋靜脈輸注。為伊立替康時(shí)，例如作為鹽酸伊立替康，通常是成人每天一次，以150mg/m2、兩周內(nèi)靜脈輸注3-4次，然后至少休藥三周。將其作為一個(gè)周期反復(fù)給予。為FR901228時(shí)，目前正在歐美進(jìn)行臨床試-瞼，尚未確定最佳容量或最佳給藥途徑。為INGN-201時(shí)，尚處于臨床試驗(yàn)階段，尚未確定最佳容量，在我國(guó)的臨床試驗(yàn)中最高給藥至IO"PFU(蝕斑形成單位)，在美國(guó)的臨床試驗(yàn)中給藥至3xl0^VP(病毒顆粒)，未見嚴(yán)重的副作用。給藥途徑優(yōu)選肺瘤內(nèi)給予，但并不限于此。本發(fā)明的藥物組合物的抗胂瘤作用通過如下的試驗(yàn)進(jìn)行研究。(1)重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的聯(lián)合用藥效果的研究本發(fā)明的藥物組合物中所含的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，則對(duì)在單獨(dú)使用它們時(shí)未見效果的肺瘤也可發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，通過使用本發(fā)明的藥物組合物，可以進(jìn)行更多種肺瘤的治療等。根據(jù)腫瘤種類的不同，如果以低濃度給予具有抗胂瘤作用的物質(zhì)，則可發(fā)揮本發(fā)明的藥物組合物的抗腫瘤效果，但是以高濃度給予具有抗腫瘤作用的物質(zhì)，則可能無法發(fā)揮本發(fā)明的藥物組合物的抗腫瘤效果。具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的服用大多伴隨有副作用，減少該給予量從提高患者QOL考慮優(yōu)選。為了分析本發(fā)明的藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞有多大程度的抗腫瘤效果，例如可進(jìn)行XTT檢測(cè)。XTT(2,3-雙[2-曱氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鏠-5-羧基苯胺內(nèi)鹽)檢測(cè)的基本原理是通過活細(xì)胞中的線粒體的脫氫酶測(cè)定存活細(xì)胞的活性，是適合體外監(jiān)控細(xì)胞毒性的方法。以下對(duì)XTT檢測(cè)進(jìn)行具體說明。XTT溶液在不含有酚紅時(shí)或者溶解于平ff鹽溶液中時(shí)顯示黃色。該XTT溶液與活細(xì)胞接觸，則活細(xì)胞的線粒體的脫氬酶切斷XTT的四唑錄環(huán)，生成可溶于水溶液的橙色的甲脂晶體。實(shí)際上XTT的生物學(xué)還原并不充分，因此大多將吩嗪硫酸甲酯(PMS)等電子共軛物質(zhì)作為還原促進(jìn)劑添加到反應(yīng)液中。根據(jù)細(xì)胞數(shù)的增減，利用生成的甲臘量的變化，通過比色法測(cè)定所得的橙色溶液，可以測(cè)定所需物質(zhì)的細(xì)胞毒性。對(duì)本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)行時(shí)，將本發(fā)明的重組病毒以適當(dāng)?shù)臐舛?MOI:感染復(fù)數(shù))感染在體外培養(yǎng)的各種癌細(xì)胞。將上述細(xì)胞在適當(dāng)條件下培養(yǎng)，然后將各種濃度的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)給予上述病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)液中。病毒感染后，培養(yǎng)適當(dāng)期間，然后進(jìn)行上述XTT檢測(cè)，可以分析抗腫瘤效果。(2)具有抗胂瘤作用的物質(zhì)對(duì)重組病毒的增殖的影響即使將本發(fā)明的藥物組合物中所含的重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的存在對(duì)重組病毒的增殖復(fù)制不會(huì)有任何影響。因此，本發(fā)明的藥物組合物中含有的上述病毒即使聯(lián)合使用，也不會(huì)抑制其單獨(dú)使用時(shí)可發(fā)揮的抗腫瘤效果。重組病毒在靶細(xì)胞內(nèi)的增殖到底有什么樣的影響，這例如可采用定量實(shí)時(shí)PCR如下測(cè)定。即，聯(lián)合使用具有抗肺瘤作用的物質(zhì)，將重組病毒培養(yǎng)適當(dāng)期間，然后回收病毒感染細(xì)胞，提取DNA，使用以該病毒所具有的適當(dāng)?shù)幕蜃鳛槟繕?biāo)的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,可以定量分析該病毒所具有的適當(dāng)?shù)幕颉４藭r(shí)，例如在本發(fā)明的重組病毒中摻入編碼熒光物質(zhì)的基因等，可見該病毒增殖的細(xì)胞通過照射激發(fā)光發(fā)出規(guī)定的熒光(例如為GFP時(shí)為綠色熒光)，因此可以使細(xì)胞內(nèi)的病毒增殖可一見化。例如在焚光顯微鏡下觀察病毒感染細(xì)胞，細(xì)胞中可見GFP熒光表達(dá)。還可使用CCD照相才幾在不同的時(shí)間》見察GFP熒光的表達(dá)，在不同時(shí)間〗現(xiàn)察病毒感染細(xì)胞，如果將上述重組病毒給予生物體內(nèi)，則可以在生物體內(nèi)實(shí)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的標(biāo)記和檢測(cè)。(3)具有抗腫瘤作用的物質(zhì)和重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響本發(fā)明的藥物組合物中聯(lián)合使用的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)和重組病毒對(duì)胂瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果是各自獨(dú)立的，并不互相影響。重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的抗腫瘤效果是完全不同的作用才幾理。因此，即4吏存在重組病毒，也不會(huì)喪失例如具有抗腫瘤作用的物質(zhì)抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的功能。本發(fā)明的藥物組合物中聯(lián)合使用的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)和重組病毒對(duì)于作為目標(biāo)的細(xì)胞周期有怎樣的影響，這例如可以使用流式細(xì)胞儀，通過對(duì)核染色的PI(碘化丙錠)來分析細(xì)胞周期。流式細(xì)胞儀是以高速使細(xì)胞懸浮液流動(dòng)，測(cè)定每一個(gè)顆粒發(fā)出的熒光，由此測(cè)定細(xì)胞集團(tuán)中各個(gè)細(xì)胞的大小、DNA含量等的方法。流式細(xì)胞數(shù)不僅可以分析每一個(gè)細(xì)胞的相對(duì)的大小或形狀、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同，通過進(jìn)一步進(jìn)行熒光標(biāo)記，還可以測(cè)定熒光強(qiáng)度或熒光的種類，可進(jìn)行細(xì)胞筌定或在短時(shí)間內(nèi)分析構(gòu)成細(xì)胞群的各種細(xì)胞的存在比。細(xì)胞膜由于細(xì)胞死亡而無法保持其狀態(tài)，核容易被上述PI等染色。因此，由該P(yáng)I的核染色結(jié)果可以判定DNA量和細(xì)胞周期。腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期的S期和G2/M期的比例越高則惡性程度越高。因此，如果得到可抑制G2/M期的比例的結(jié)果，則可以說判斷具有抗腫瘤效果。(4)具有抗腫瘤作用的物質(zhì)和重組病毒聯(lián)合使用時(shí)的體內(nèi)抗腫瘤效果作為本發(fā)明的藥物組合物的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)和重組病毒聯(lián)合使用時(shí)，與單獨(dú)給予重組病毒時(shí)或單獨(dú)給予具有抗胂瘤作用的物質(zhì)時(shí)相比，可得到極高的抗腫瘤效果。抗胂瘤效果例如可如下計(jì)測(cè)腫瘤直徑來進(jìn)行分析。在5周齡棵小鼠背部皮下接種適當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞例如H1299，在胂瘤生長(zhǎng)至5-10mm大時(shí)，以適當(dāng)?shù)拈g隔時(shí)間向腫瘤內(nèi)給予適量telomelysin，向腹腔內(nèi)給予適量多西他賽。此時(shí)，作為對(duì)照，可以只腫瘤內(nèi)給予、腹腔內(nèi)給予PBS。給予后，以適當(dāng)?shù)钠陂g計(jì)測(cè)腫瘤直徑，與對(duì)照相比，分析是否可見腫瘤大小的顯著差異。本發(fā)明的藥物組合物中，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)也可以具有使重組病毒的感染效率增強(qiáng)的作用。為了確認(rèn)具有上述作用，例如可以向腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加具有抗腫瘤作用的物質(zhì)，然后接種重組病毒，測(cè)定該病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞有多大程度的感染，與接種的病毒對(duì)未添加具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的感染狀態(tài)進(jìn)行比較，確認(rèn)。為了確認(rèn)該病毒以多大程度感染了腫瘤細(xì)胞，例如可以使用非增殖型LacZ基因表達(dá)腺病毒，該非增殖型LacZ基因表達(dá)腺病毒是向本發(fā)明的非增殖型重組病毒的載體中整合LacZ基因得到的。采用該方法，則該非增殖型LacZ基因表達(dá)腺病毒感染細(xì)胞并增殖，LacZ基因表達(dá)，顯色為藍(lán)色，因此容易確認(rèn)病毒感染。在其它方法中，可以使用在本發(fā)明的重組病毒基因組的適當(dāng)位點(diǎn)中整合標(biāo)記蛋白例如編碼GFP的基因得到的重組病毒。使用上述重組病毒，可以通過對(duì)GFP定量來確認(rèn)病毒的增殖，因此優(yōu)選。為了確認(rèn)本發(fā)明的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)與重組病毒的聯(lián)合使用效果，例如可以通過使用等效劑量分析的試驗(yàn)確認(rèn)。等效劑量分析是用于分析兩種物質(zhì)是否具有協(xié)同效果的系統(tǒng)。具體來說，是根據(jù)MTT檢測(cè)或攝入胸苷，調(diào)查腫瘤細(xì)胞的增殖是否發(fā)展，由此確認(rèn)某種藥物與另外一種藥物的協(xié)同效果。MTT檢測(cè)是藥物組合物的感受性測(cè)試，具體來說，將腫瘤細(xì)胞與各種抗癌藥一起以適當(dāng)?shù)钠陂g混合培養(yǎng)，通過判定線粒體的琥珀酸脫氬酶(SD)活性來判定培養(yǎng)結(jié)束時(shí)殘留的存活胂瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥的感受性。即，使腫瘤細(xì)胞與SD的底物一四唑総鹽(MTT)反應(yīng)，將析出的甲臘晶體用DMSO溶解，對(duì)紫色顯色通過微量板讀板儀測(cè)定吸光度(MTT的判定)。這樣，通過測(cè)定活細(xì)胞活性，通過比色即可以判定藥物的效果。例如，將本發(fā)明的具有抗腫瘤作用的物質(zhì)與重組病毒給予適當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞例如人肺癌細(xì)胞H1299,培養(yǎng)，然后使用上述方法進(jìn)行MTT檢測(cè)，可以測(cè)定對(duì)H1299的抗腫瘤活性。(5)腫瘤內(nèi)給予本發(fā)明的藥物組合物后腫瘤組織和肝臟的組織學(xué)變化(HE染色)本發(fā)明的藥物組合物即使服用也不會(huì)對(duì)肝臟造成影響，是安全性高的優(yōu)異的藥物組合物。藥物組合物給予體內(nèi)時(shí)，在肝臟、消化道粘膜、腎臟等處被分解、解毒(代謝)。此時(shí)，最大的代謝器官是肝臟。將本發(fā)明的藥物組合物給予生物體內(nèi)時(shí)，即4吏對(duì)作為耙的腫瘤組織有抗腫瘤效果，對(duì)于上述代謝器官肝臟有不會(huì)有任何影響。因此，本發(fā)明的藥物組合物可以說是安全性高的優(yōu)異的藥物組合物。關(guān)于上述藥物組合物的安全性評(píng)價(jià)，例如將本發(fā)明的藥物組合物給予肺瘤內(nèi)時(shí)，可以分析腫瘤組織和肝臟組織發(fā)生了怎樣的變化。例如，可使用蘇木精.曙紅(HE)染色等組織學(xué)染色方法確認(rèn)。HE染色是基本的組織染色方法，是利用組織內(nèi)電荷的不同而導(dǎo)致所染的染料的不同。例如，核染為藍(lán)紫色，其它細(xì)胞質(zhì)、纖維、紅細(xì)胞等分別根據(jù)其性質(zhì)染成濃淡不同的紅色。具體來說，將給予了本發(fā)明的藥物組合物的腫瘤組織等組織切片進(jìn)行脫蠟處理，然后用蘇木精液處理，用曙紅處理，可確認(rèn)腫瘤組織的組織學(xué)變化。例如肺瘤細(xì)胞中可見抗腫瘤效果時(shí)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生玻璃化改性。4.使用本發(fā)明的藥物組合物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的方法本發(fā)明是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其特征在于將上述telomelysin重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)組合使用。為了抑制胂瘤細(xì)胞的增殖，例如可以在給予telomelysin后再給予微管抑制藥物。由使用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的試驗(yàn)可以了解到通過該方法可以確認(rèn)顯著的聯(lián)合用藥效果。另外也可以腫瘤內(nèi)給予telomelysin,同時(shí)全身給予微管抑制藥物。動(dòng)物試驗(yàn)中，通過上述的同時(shí)給予，可以見到明確的聯(lián)合用藥效果。而采用HDAC抑制劑時(shí)，可以在使用telomelysin之前使用HDAC抑制劑，通過上述方法可得到進(jìn)一步增強(qiáng)的協(xié)同效果。將INGN-201與telomelysin聯(lián)合使用時(shí)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的種類，有的情況是給予telomelysm24小時(shí)后再給予INGN-201有效，有的情況是同時(shí)給予也可以得到同樣的效果。例如，在肺癌中，先行給予telomelysin較為有效，而在大腸癌中同時(shí)給予也可以得到同樣的效果。聯(lián)合給予INGN-201和telomelysin的并不限于上述細(xì)胞。以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。[實(shí)施例1]<重組腺病毒(telomelysm)的制備>使用由人胎兒腎臟細(xì)胞293細(xì)胞提取的RNA和以下特異性引物(E1A-S:SEQIDNO.5,E1A-AS:SEQIDNO.6),在下述條件下進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增897bp的EIA基因。E則；5'-ACACCGGGACTGMAATGAG'3'(SEQIDNO.5)EU'AS:5,-CACAGGTTTACACCTTATGGC.3'(SEQIDNO.6)PCR液組成lxPCR緩沖液0.2mM各dNtP5MmMgCl22.5UampliPaqGold0,2,uM各引物反應(yīng)條件95。C10分鐘(95。Cl分鐘、56。Cl分鐘、72。C1.5分鐘)x32個(gè)循環(huán)72°C7分鐘4°C5分鐘同樣，4吏用以下的引物(EIB-S:SEQIDNO.7,E1B-AS:SEQIDN0.8),從293細(xì)胞中提取DNA,進(jìn)行DNA-PCR，擴(kuò)增1822bp的ElB基因。PCR液的組成、反應(yīng)條件(循環(huán)、溫度)與E1A基因的情形相同。E1B'S:5'-CTGACCTCATGGAGGCTTGG-3'(SEQIDNO.7)E1B-AS:5'-GCCCACACATTTCAGTACCTC.3'(SEQIDNO.8)進(jìn)行各PCR產(chǎn)物的TA克隆(TA克隆試劑盒雙啟動(dòng)子；Invitrogen),確認(rèn)序列，然后通過限制酶EcoRI切取各911bp(ElA)、1836bp(ElB)的DNA片段。向pIRES載體(CLONTECH)的Mlul切斷位點(diǎn)按照順時(shí)針方向插入E1A，向SalI位點(diǎn)順時(shí)針方向插入ElB(ElA-IRES-ElB)。將用限制酶Mlul和BglII切取的455bp的hTERT啟動(dòng)子序列按照順時(shí)針方向插入到位于E1A-IRES-E1B的E1A上游的Xhol位點(diǎn)。(phTERT-E1A-IRES-E1B)將pShuttle載體中所含的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子用限制酶Mfel和Nhel處理除去，通過向該位點(diǎn)插入用限制酶Nhel和Notl從phTERT-ElA-IRES-ElB中切取的3828bp的序列(pSh'hAIB)。通過限制酶I-CeuI-和Pl-Scel,從pSh-hAIB中切取4381bp的序列，插入到腺病毒-X表達(dá)系統(tǒng)(CLONTECH)的Adeno-X病毒DNA中(AdenoX-hAIB)。用限制酶PacI處理，使AdenoX-hAIB形成線狀，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，制備具有感染性的重組腺病毒(telomelysm)。整合到telomelysm中的復(fù)制盒的模式圖如圖1所示。[實(shí)施例2]<telomelysin與孩t管抑制藥物聯(lián)合用藥效果的研究>將telomelysinfenbie分別以Mock、0.1MOI或1MOI(MOI:感染復(fù)數(shù))的濃度感染體外培養(yǎng)的以下各種癌細(xì)胞。即，所使用的細(xì)胞是人肺癌細(xì)胞(H1299、A549、H226Br)、人大腸癌細(xì)胞(SW620、DLD-1)、人肺癌細(xì)胞(MKN28)、人食道癌細(xì)胞(TE8、T.Tn)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人前列腺癌細(xì)胞(LNCaP)。具體來說，在96孔板上4妻種lxl()S個(gè)上述細(xì)胞，24小時(shí)后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，將0.1MOI或1MOI濃度的病毒添加到培養(yǎng)液中。第二天，將各種濃度(對(duì)照、0.1nM、1.0nM、10.0nM、100.0nM)的多西他賽給予上述病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)液。感染后第五天，使用試劑盒(RochDiagnostics制備)進(jìn)行XTT檢測(cè)。具體來說，由孔中除去培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)后將含有XTT試劑的反應(yīng)液添加并培養(yǎng)。約4小時(shí)后，通過微量滴定板(EUSA)讀板儀測(cè)定吸光度，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，確認(rèn)抗肺瘤效果。結(jié)果如圖4所示。圖4上段的癌細(xì)胞抹中可見0.1MOItdomelysin與低濃度的多西他賽之間的聯(lián)合用藥效果。其中，特別是對(duì)于H1299細(xì)胞，其聯(lián)合用藥效果顯著。另一方面，在如HepG2、LNCaP的對(duì)telomelysin的感受性高的細(xì)胞抹，或如H226Br、T.Tn的對(duì)多西他賽本身具有感受性的細(xì)胞抹中，未見明顯的聯(lián)合用藥效果?！磘elomelysin與其它抗癌藥的聯(lián)合用藥效果的研究〉作為聯(lián)合使用的抗癌藥，使用微管抑制劑長(zhǎng)春瑞濱和拓樸異構(gòu)酶I抑制劑SN-38(CPP-ll代謝產(chǎn)物)，按照與上述同樣的條件進(jìn)行XTT檢測(cè)。結(jié)果，長(zhǎng)春瑞濱顯示了與多西他賽大致同樣的聯(lián)合用藥效果。每種細(xì)胞抹均對(duì)SN-38具有感受性，SN-38為低濃度時(shí)可見聯(lián)合用藥效果(圖5)。<抗癌藥對(duì)重組病毒的增殖的影響>聯(lián)合使用微管作用型抗癌藥時(shí)，telomelysin對(duì)增殖會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響，這可使用定量性實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行分析。將O.lMOItelomelysin用2小時(shí)感染人肺癌細(xì)胞H1299和人大腸癌細(xì)胞SW620,再過2小時(shí)后給予多西他賽。感染后，在12、24、36、48和60小時(shí)后回收細(xì)胞，分別提取DNA內(nèi)以及上清中的DNA。使用以telomelysin所具有的E1A基因?yàn)榘械囊镞M(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,定量分析病毒增殖、復(fù)制。具體來說，向18pLPCR液中加入2iLiL的DNA提取液，使用E1A引物，在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。E1A引物序列(正向)5'-CCTGTGTCTAGAGAATGCAA'3'(SEQIDNO.9)(反向)5'.ACAGCTCAAGTCCAAAGGTT-3'(SEQIDNO.10)PCR液的組成1xLCFastStartDNAMasterSybRGreenl3MmMgCl20.5fiM各引物反應(yīng)條件95。C10分鐘(95。C10秒、6(TC15秒、72°C8秒)x40個(gè)循環(huán)70°C15秒40°C30秒結(jié)果如下所示(圖6)。a)細(xì)胞內(nèi)，telomelysin用12-24小時(shí)急劇增殖,即使進(jìn)行多西他賽處理也顯示同樣的增殖效率。b)擴(kuò)散在上清中的telomelysin其單獨(dú)和聯(lián)合使用均同等。將上清全部回收，提取DNA，因此可以認(rèn)為反映了細(xì)胞死亡而釋放到上清中的全部的病毒量。由以上可以認(rèn)為，抗癌藥的聯(lián)合使用對(duì)telomelysin的增殖復(fù)制沒有影響，不會(huì)抑制病毒的抗感應(yīng)效果(圖6)。<telomelysin和微管抑制藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響>使用流式細(xì)胞儀，通過PI(碘丙錠)分析細(xì)胞周期。結(jié)果，在治療后12、48小時(shí)時(shí)，以濃度O.lMOI單獨(dú)用telomelysin處理時(shí)，細(xì)胞周期未見變化。單獨(dú)給予多西他賽時(shí)以及將telomelysin/多西他賽聯(lián)合給予時(shí)，在給予12小時(shí)時(shí)可見G2/M與多西他賽相關(guān)性地停止，接著subG0/G1增加，可以見到被認(rèn)為是與多西他賽相關(guān)的編程性細(xì)胞死亡(DNA片段化)(圖7)。由以上可以認(rèn)為，telomelysin的抗胂瘤效果是與多西他賽的編程性細(xì)胞死亡不同的分子才幾理?！磘elomelysm和微管抑制劑對(duì)H1299肺癌腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤效果〉向5周齡的棵小鼠背部皮下接種H1299,在腫瘤生長(zhǎng)至5-10mm大時(shí)，將telomelysin以各lx107pfu/50,ul/每只腫瘤內(nèi)給予，以12.5mg/kg腹腔內(nèi)給予多西他賽，1、3、5天后共給予三次。作為對(duì)照，腫瘤內(nèi)給予、腹腔內(nèi)給予PBS。每隔3天計(jì)測(cè)肺瘤直徑。結(jié)果，即使是telomelysin單獨(dú)治療組，與對(duì)照相比也可見顯著的增殖抑制，在耳關(guān)合用藥組中，與對(duì)照組、單獨(dú)治療組相比更可見顯著的抗腫瘤效果(圖8)。<胂瘤內(nèi)給予telomelysin后肺瘤組織和肝臟的組織學(xué)變化(HE染色)>在5周齡棵小鼠背部皮下接種H1299,腫瘤生長(zhǎng)至5-10mm大時(shí)，將telomelysin給予上述細(xì)胞腫瘤內(nèi)，在最終給予6天后，按照以下方法對(duì)腫瘤組織和肝臟進(jìn)行組織HE染色。即，制備組織切片，進(jìn)行脫蠟處理，然后水洗，過蒸餾水。向其中添加蘇木精液，放置20分鐘，然后輕輕水洗。將其用1%鹽酸70%乙醇區(qū)分，顯色，水洗10分鐘，然后過80%乙醇，然后在曙紅溶液中浸泡IO分鐘。然后將組織輕輕水洗，脫水，透明，包埋，進(jìn)行HE染色。結(jié)果，在單獨(dú)和聯(lián)合給予telomelysin時(shí)，在廣范圍內(nèi)可見到腫瘤細(xì)胞的玻璃化改性(圖9的"telomelysm"和"聯(lián)合"的圖)。在肝組織中均未見毒性(圖9)。[實(shí)施例3]<HDAC抑制劑FR卯1228對(duì)腺病毒受體CAR的表達(dá)的增強(qiáng)作用〉以1ng/ml的濃度向各種人肺癌細(xì)胞(A549、H358、H460、H1299)的培養(yǎng)液中添加FR901228(藤澤藥品工業(yè))，處理48小時(shí)，然后通過流式細(xì)胞儀分析CAR表達(dá)。結(jié)果，在A549、H460細(xì)胞中，CAR表達(dá)增強(qiáng)，但在H358、H1299中未見變化(圖10)。<HDAC抑制劑FR901228對(duì)腺病毒感染效率的增強(qiáng)作用>使用A549肺癌細(xì)胞和非增殖型LacZ基因表達(dá)腺病毒，研究HDAC抑制劑FR901228是否增強(qiáng)了腺病毒的感染效率。以0.1ng/ml、1ng/ml的濃度向A549肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加FR901228,處理48小時(shí)后，以1MOI、IOMOI感染非增殖型LacZ基因表達(dá)腺病毒，觀察細(xì)胞的狀態(tài)。如果腺病毒感染了細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖，則LacZ基因表達(dá)，顯色為藍(lán)色，利用該顯色可以確認(rèn)FR901228處理對(duì)腺病毒的感染效率的作用。結(jié)果，通過FR901228處理，可見與濃度相關(guān)性的藍(lán)色斑點(diǎn)，從而顯示LacZ表達(dá)增強(qiáng)。因此，可以確認(rèn)腺病毒的感染效率是用量相關(guān)性地增強(qiáng)(圖11)。<HDAC抑制劑FR卯1228對(duì)telomelysin感染效率的增強(qiáng)作用〉下面，使用A549肺癌細(xì)胞和非增殖型LacZ基因表達(dá)腺病毒，研究HDAC抑制劑FR901228是否使本發(fā)明的telomelysin的感染效率增強(qiáng)。用于試驗(yàn)的telomelysin是使用在本發(fā)明的重組腺病毒基因組的E3區(qū)整合了編碼標(biāo)記蛋白GFP的基因和抑制該基因表達(dá)的啟動(dòng)子的重組病毒OBT-401。4吏用該OBT-401,以GFP表達(dá)作為指標(biāo)，確i^了FR901228對(duì)病毒增殖的增強(qiáng)作用。以0.5ng/ml、1ng/ml的濃度向A549肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加FR901228,處理48小時(shí)，然后用0.1MOI感染OBP-401。感染該OBT-401后第72小時(shí)，用流式細(xì)胞儀對(duì)GFP的表達(dá)進(jìn)行定量。結(jié)果，通過FR901228的處理，可見GFP表達(dá)用量相關(guān)性地增強(qiáng)，可以確認(rèn)FR901228使OBT-401的感染、增殖增強(qiáng)(圖12)。<HDAC抑制劑FR901228對(duì)telomelysin抗胂瘤效果的增強(qiáng)作用>為了確認(rèn)FR901228和telomelysin的聯(lián)合用藥效果，使用用于分析兩種物質(zhì)是否具有協(xié)同效果的等效劑量分析，對(duì)FR901228和telomelysin的協(xié)同效果進(jìn)行研究。試驗(yàn)中，使用整合了編碼標(biāo)記蛋白GFP的基因和控制該基因表達(dá)的啟動(dòng)子的重組病毒OBP-401作為telomelysin、以及使用FR901228。將telomelysin用0.]、0.5、1、2、5、10、100MOI感染在96孔板上培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞A549,同時(shí)以0.01、0.5、1、2、5ng/ml的濃度添加FR901228,通過MTT檢測(cè)來測(cè)定第4天的活細(xì)胞數(shù)。MTT測(cè)試是在除去各孔的培養(yǎng)液后用PBS洗滌，加入含有0.5mg/mlMTT(Sigma)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4小時(shí)。加入含有0.04N鹽酸的異丙醇，然后用微量板讀板儀測(cè)定吸光度，圖13的右上圖是將所有的測(cè)定值進(jìn)行標(biāo)樣的圖。右下圖中，縱軸表示活細(xì)胞率，橫軸標(biāo)記各濃度，可以確認(rèn)telomelysin和FR901228的容量相關(guān)性的抗胂瘤效果。將各測(cè)定值用Steel和Peckham的等#克劑量分4斤法(StedG.G.,PeckhamM.丄Exploitablemechanismsincombinedradiotherapychemotherapy:theconceptofadditivity.Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Physiol.,5:85-91,1979)進(jìn)行分析，制成左圖。模式1的藍(lán)線或以下的區(qū)域?yàn)閰f(xié)同效果區(qū)域，所有的測(cè)定值均在該區(qū)域內(nèi)標(biāo)樣，由此可知，F(xiàn)R901228和telomelysin在人肺癌H1299中發(fā)揮了協(xié)同作用(圖13)。[實(shí)施例4]<基因治療藥INGN-201(Advexin)的抗肺瘤效果測(cè)定>將INGN-201(以下也稱為Advexin,附圖中也同樣)分別以Mock、10MOI、50MOI、100MOI、500MOI或1000MOI的濃度感染體外培養(yǎng)的H1299細(xì)胞、SW620細(xì)胞和TE8細(xì)胞。具體來說，向96孔板上接種lxl(^個(gè)上述細(xì)胞，24小時(shí)后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，將上述濃度的Advexin添加到培養(yǎng)液中。感染后第5天，使用試劑盒(RochDiagnostics制備)進(jìn)行XTT才企測(cè)。具體來說，從孔中除去培養(yǎng)液，在調(diào)節(jié)后添加含有XTT試劑的反應(yīng)液并培養(yǎng)。約4小時(shí)后，用纟敖量滴定一反(ELISA)讀板儀測(cè)定吸光度，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，確定抗腫瘤效果。以未處置組為1.0,表示第5天活細(xì)胞數(shù)的比率。其結(jié)果如圖14所示。H1299細(xì)胞中以50MOI即可見顯著的抗胂瘤效果，但是在SW620細(xì)胞中，500MOI之后才可見抗腫瘤效果。另夕卜，在TE8細(xì)胞中，在50MOI可見輕度的增殖抑制，但是只有在達(dá)到500MOI之后才可觀察到明顯的抗腫瘤效果。因此，可認(rèn)為H1299是高感受性細(xì)胞林，SW620是低感受性細(xì)胞抹，TE8具有中等程度的感受性。<telomelysin-Advexin同時(shí)給予時(shí)的抗腫瘤效果的測(cè)定〉將0MOI、1MOI、5MOI或10MOI濃度的telomelysin和0MOI、10MOI、50MOI或100MOI濃度的Advexin分別組合，感染體外培養(yǎng)的H1299細(xì)胞和SW620細(xì)胞。具體來說，向96孔板上接種lxl03個(gè)的上述細(xì)胞，24小時(shí)后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，將上述濃度的telomelysin和Advexin添加到培養(yǎng)液中。感染后第5天，使用試劑盒(RochDiagnostics制備)進(jìn)行XTT檢測(cè)。具體來說，從孔中除去培養(yǎng)液，經(jīng)調(diào)節(jié)后添加含有XTT試劑的反應(yīng)液，進(jìn)行培養(yǎng)。約4小時(shí)后通過微量滴定板(ELISA)讀板儀測(cè)定吸光度，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，確認(rèn)抗腫瘤效果。該結(jié)果如圖15和圖16所示。H1299細(xì)胞中，通過將1MOItelomelysin和10MOIAdvexin聯(lián)合使用，活細(xì)胞數(shù)顯著減少，可見顯著的抗肺瘤效果(圖15)。H1299細(xì)胞中，單獨(dú)使用Advexin時(shí)的抗腫瘤效果是50MOI左右的濃度(圖14),與其相比較，在H1299細(xì)胞中，通過聯(lián)合使用telomelysin和Advexin,顯示可得到協(xié)同性的抗腫瘤效果。在SW620細(xì)胞中，通過聯(lián)合使用1MOItelomelysin和50MOIAdvexin,活細(xì)胞數(shù)顯著減少，可見顯著的抗腫瘤效果(圖16)。SW620細(xì)胞中，單獨(dú)使用Advexin時(shí)的抗腫瘤效果是500MOI左右的濃度(圖14),與此相比較，在SW620細(xì)胞中，通過聯(lián)合使用telomelysin和Advexin,顯示可得到協(xié)同性的抗腫瘤效果。<telomelysin.Advexin間隔時(shí)間給予的抗胂瘤效果測(cè)定>在96孔板上接種lx103個(gè)H1299細(xì)胞和SW620細(xì)胞，體外培養(yǎng)，24小時(shí)后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，(i)將telomelysin和Advexin同時(shí)給予培養(yǎng)液中，(ii)纟會(huì)予telomelysin24小時(shí)后纟合予Advexin(telomelysin先4亍纟合予)，(iii)給予Advexin24小時(shí)后給予telomelysin(Advexin先行給予)，進(jìn)行感染。比較是使用Mock。具體來說，組合使用的telomelysin和Advexin的濃度如下。H]299細(xì)胞1MOItelomelysin和5MOI或10MOIAdvexinSW620細(xì)胞1MOItelomelysin和10MOI、50MOI或100MOIAdvexin從最初感染后第5天，使用試劑盒(RochDiagnostics制備)進(jìn)行XTT檢測(cè)。具體來說，從孔中除去培養(yǎng)液，進(jìn)行調(diào)節(jié)后添加含有XTT試劑的反應(yīng)液進(jìn)行培養(yǎng)。約4小時(shí)后，通過微量滴定板(ELISA)讀板儀測(cè)定吸光度，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，確認(rèn)抗腫瘤效果。其結(jié)果如圖17和18所示。H1299細(xì)胞中，上述(i)-(iii)的任何情況與Mock相比都得到了顯著的抗腫瘤效果(圖17),其中先行給予telomelysin時(shí)的抗腫瘤效果最高。在SW620細(xì)胞中，上述(i)-(iii)的任何情況都顯示抗腫瘤效果，特別是(i)和(ii)的情況的抗腫瘤效果顯著。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可提供包括含多核苷酸的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)的用于腫瘤聯(lián)合療法的藥物組合物，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶啟動(dòng)子、EIA基因、IRES序列和E1B基因。本發(fā)明的藥物組合物可得到比分別單獨(dú)對(duì)腫瘤細(xì)胞給予上迷重組病毒和抗腫瘤作用物質(zhì)時(shí)得到的抗腫瘤效果更優(yōu)異的效果，由此可以降低所使用的藥物的用量，結(jié)果可以抑制抗癌藥服用導(dǎo)致的副作用。并且，本發(fā)明的藥物組合物對(duì)于在分別單獨(dú)使用上述重組病毒和抗腫瘤作用物質(zhì)時(shí)其并未發(fā)揮抗腫瘤效果的腫瘤細(xì)胞中也可發(fā)揮抗腫瘤效果，因此可對(duì)更多種的腫瘤進(jìn)行抗癌治療。序列表文本SEQIDNO.5引物SEQIDNO.6引物SEQIDNO.7引物SEQIDNO.8引物SEQIDN0.9引物SEQIDNO.10:引物權(quán)利要求1.用于腫瘤聯(lián)合療法的藥物組合物，該藥物組合物包括含多核苷酸的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。2.權(quán)利要求l的藥物組合物，其中，人端粒酶是hTERT。3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中，病毒是腺病毒。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)是具有微管抑制活性的物質(zhì)或具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)。5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)是具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘奈镔|(zhì)。6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)是INGN-201。7.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中，具有微管抑制活性的物質(zhì)是多西他賽或長(zhǎng)春瑞濱或它們的鹽。8.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中，具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)是伊立替康或其鹽。9.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中，具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘奈镔|(zhì)是FR901228。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中，腫瘤選自肺癌、大腸癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、頭頸部癌、肝癌、胰臟癌、膽嚢膽管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、曱狀腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和間葉組織肺瘤的至少一種。11.抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其特征在于將含有多核苷酸的重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。12.肺瘤的治療方法，其特征在于將含有多核苷酸的重組病毒與具有抗腫瘤作用的物質(zhì)聯(lián)合使用，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中，人端粒酶是hTERT。14.權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中，病毒是腺病毒。15.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)是具有微管抑制活性的物質(zhì)或具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)。16.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法，其中，具有抗肺瘤作用的物質(zhì)是具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘奈镔|(zhì)。17.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的方法，其中，具有抗腫瘤作用的物質(zhì)是INGN-201。18.權(quán)利要求15的方法，其中，具有微管抑制活性的物質(zhì)是多西他賽或長(zhǎng)春瑞濱或它們的鹽。19.權(quán)利要求15的方法，其中，具有拓樸異構(gòu)酶I抑制活性的物質(zhì)是伊立替康或其鹽。20.權(quán)利要求16的方法，其中，具有組蛋白去乙酰化酶抑制活性的物質(zhì)是FR901228。21.權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)的方法，其中，腫瘤選自肺癌、大腸癌、胃癌、乳腺癌、食道癌、頭頸部癌、肝癌、胰臟癌、膽嚢'膽管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、曱狀腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和間葉組織肺瘤的至少一種。全文摘要本發(fā)明涉及抗癌活性進(jìn)一步增強(qiáng)的藥物組合物的提供。具體來說，涉及用于腫瘤的聯(lián)合療法的藥物組合物，該藥物組合物包括含多核苷酸的重組病毒和具有抗腫瘤作用的物質(zhì)，其中所述多核苷酸依次含有人端粒酶的啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列和E1B基因。文檔編號(hào)A61K48/00GK101232894SQ20068001135公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2006年2月10日優(yōu)先權(quán)日2005年2月10日發(fā)明者哲京,田中紀(jì)章,藤原俊義申請(qǐng)人:癌康理生物制藥株式會(huì)社