專利名稱：用于局部施用和經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的組合物和方法
本申請(qǐng)要求于2005年3月3日申請(qǐng)的美國(guó)暫時(shí)專利申請(qǐng)案No.60/658,434的優(yōu)先權(quán)。美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/658,434在這里通過(guò)全文引入作為參考。
背景技術(shù)：
皮膚保護(hù)身體的器官免受外界環(huán)境威脅并用作維持體溫的恒溫器。它由幾個(gè)不同的層組成，每一層具有專門的功能。主要的層包括表皮層、真皮層和皮下組織。表皮層是在真皮層上的分層的上皮細(xì)胞，真皮層由結(jié)締組織組成。表皮層和真皮層都進(jìn)一步由內(nèi)層脂肪組織的皮下組織支持。
表皮層(皮膚的最上層)只有0.1-1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NYPeople′s Medical Society，1-7(1998))。它由角質(zhì)形成細(xì)胞組成并基于它們的分化狀態(tài)分為若干層。表皮層可進(jìn)一步分為角質(zhì)層和有活力的表皮，表皮由顆粒狀melphigian和基底細(xì)胞組成。角質(zhì)層是吸濕性的并且需要至少10％重量的水分來(lái)維持它的彈性和軟度。吸濕性可部分地歸因于角蛋白的持水能力。當(dāng)角質(zhì)層喪失它的軟度和彈性時(shí)，它變得粗糙和易裂，導(dǎo)致干性皮膚。
緊接在表皮層下面的真皮層為1.5-4毫米厚。它是皮膚的三層中最厚的層。另外，真皮層還是大部分皮膚結(jié)構(gòu)的所在地，包括汗腺和脂腺(其通過(guò)皮膚中稱為毛孔或粉刺的開口分泌物質(zhì))、毛囊、神經(jīng)末梢，以及血液和淋巴管(Inlander，Skin，New York，NYPeople′sMedical Society，1-7(1998))。但是，真皮層的主要成分是膠原蛋白和彈性蛋白。
皮下組織是皮膚的最深層。它擔(dān)當(dāng)用于身體熱量保存的隔熱體并擔(dān)當(dāng)用于器官保護(hù)的減震器(Inlander，Skin，New York，NYPeople’s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下組織還存儲(chǔ)脂肪用于能量?jī)?chǔ)備。皮膚的pH通常在5和6之間。該酸度是由于存在兩性氨基酸、乳酸，以及皮脂腺分泌的脂肪酸。術(shù)語(yǔ)“酸性外膜(acid mantle)”指在皮膚的大部分區(qū)域上水溶性物質(zhì)的存在。皮膚的緩沖能力部分歸因于皮膚角質(zhì)層中儲(chǔ)藏的這些分泌物。
皮膚的其中一項(xiàng)主要功能是為可能對(duì)正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有害的水和物質(zhì)的運(yùn)輸提供一個(gè)屏障。如果沒(méi)有堅(jiān)韌的、半滲透性的皮膚，身體將會(huì)迅速脫水。皮膚有助于防止有害物質(zhì)進(jìn)入身體。
皺紋是衰老的一個(gè)指示跡象，可通過(guò)從環(huán)境損害積累的生物化學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)變化引起(Benedetto，International Journal ofDermatology，38641-655(1999))。另外，存在能引起面部皺紋的特征性褶、溝和皺褶的其它次要因素(Stegman等，The Skin of theAging Face Cosmetic Dermatological Surgery，2nded.，St.Louis，MOMosby Year Book5-15(1990))。這些次要因素包括皮膚受到重力的持續(xù)拉力、頻繁且持續(xù)的位置壓力(即在睡覺(jué)過(guò)程中)，以及由面部肌肉收縮引起的重復(fù)的面部運(yùn)動(dòng)(Stegman等，The Skin of theAging Face Cosmetic Dermatological Surgery，2nded.，St.Louis，MOMosby Year Book5-15(1990))。
已經(jīng)采用不同的技術(shù)以可能減輕一些衰老跡象。這些技術(shù)從含有α羥酸和維生素A的面部增濕劑到手術(shù)操作以及注射神經(jīng)毒素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers(由眼整形外科醫(yī)師和皮膚科醫(yī)師組成的夫妻團(tuán)隊(duì))開始發(fā)展A型肉毒桿菌毒素的美容用途，用于處理眉間區(qū)域中與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的皺紋(Schantz and Scott，In LewisGE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，New YorkAcademicPress，143-150(1981))。Carruthers將A型肉毒桿菌用于處理皺紋的使用導(dǎo)致他們?cè)?992年開創(chuàng)性地發(fā)表了該方法(Schantz andScott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，NewYorkAcademic Press，143-150(1981))。到1994年，該小組報(bào)道了對(duì)面部上其它運(yùn)動(dòng)-相關(guān)皺紋的體驗(yàn)(Scott，Ophthalmol，871044-1049(1980))。這接下來(lái)導(dǎo)致美容性A型肉毒桿菌處理時(shí)代的誕生。
除了A型肉毒桿菌(botulinum)，存在血清學(xué)相關(guān)但不同的7種其它的肉毒桿菌毒素?？偟膩?lái)說(shuō)，肉毒桿菌毒素(也稱為肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌神經(jīng)毒素)是通過(guò)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌肉毒桿菌(clostridium botulinum)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素。它們通過(guò)阻止突觸傳遞或釋放乙酰膽堿跨越神經(jīng)肌接點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生肌肉麻痹，并認(rèn)為也可以以其它的方式起作用。它們的作用基本上阻斷了通常會(huì)引起肌肉痙攣或收縮的信號(hào)，導(dǎo)致麻痹。
在這8種血清學(xué)相關(guān)的肉毒桿菌毒素中，有7種能引起麻痹，即肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。這7種的每種通過(guò)類型特異性抗體的中和作用區(qū)分。但是，對(duì)于所有7種這些活性肉毒桿菌毒素血清型，肉毒桿菌毒素蛋白質(zhì)分子的分子量都是約150kD。正如通過(guò)細(xì)菌釋放的，肉毒桿菌毒素是含有所討論的150kD肉毒桿菌毒素蛋白質(zhì)分子連同相關(guān)非毒素蛋白質(zhì)的復(fù)合體。A型肉毒桿菌毒素復(fù)合體可由梭菌屬細(xì)菌以900kD、500kD和300kD的形式產(chǎn)生。B和C型肉毒桿菌毒素顯然只作為700kD或500kD的復(fù)合體產(chǎn)生。D型肉毒桿菌毒素作為300kD和500kD的復(fù)合體產(chǎn)生。E和F型肉毒桿菌毒素只作為約300kD的復(fù)合體產(chǎn)生。據(jù)認(rèn)為所述復(fù)合體(即分子量大于約150kD)含有非毒素血凝素蛋白質(zhì)以及非毒素且無(wú)毒的非血凝素蛋白質(zhì)。在攝入毒素時(shí)，這兩種非毒素蛋白質(zhì)(其連同肉毒桿菌毒素分子一起構(gòu)成了相關(guān)的神經(jīng)毒素復(fù)合體)可用于提供對(duì)抗肉毒桿菌毒素分子變性的穩(wěn)定性和當(dāng)其被消化時(shí)保護(hù)其對(duì)抗消化性酸。另外，有可能較大的(大于約150kD分子量)肉毒桿菌毒素復(fù)合體可導(dǎo)致肉毒桿菌毒素以較慢的擴(kuò)散速率離開肉毒桿菌毒素復(fù)合體的肌內(nèi)注射位點(diǎn)。
不同血清型的肉毒桿菌毒素在它們感染的動(dòng)物種以及它們引起的麻痹的嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間上不同。例如，如通過(guò)在大鼠中測(cè)量產(chǎn)生的麻痹速率，已經(jīng)確定A型肉毒桿菌毒素比B型肉毒桿菌毒素有效500倍。另外，已經(jīng)確定B型肉毒桿菌毒素在劑量為480U/kg(約為A型肉毒桿菌毒素的靈長(zhǎng)類LD50的12倍)時(shí)在靈長(zhǎng)類中是無(wú)毒的。由于肉毒桿菌毒素的分子大小和分子結(jié)構(gòu)，它不能夠通過(guò)角質(zhì)層和下面的皮膚結(jié)構(gòu)的多個(gè)層。
全身性肉毒桿菌毒素曝露引起的中毒癥狀(稱為肉毒中毒)自古代以來(lái)就在歐洲存在。在1895年，Emile P.van Ermengem首次從生的咸豬肉分離出厭氧性產(chǎn)芽孢桿菌，所述的豬肉從在比利時(shí)死于肉毒中毒的豬的死后組織獲得。Van Ermengem發(fā)現(xiàn)該疾病是由他所命名的肉毒芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素引起(Van Ermengem，Z HyygInfektionskr，261-56；Rev Infect(1897))。該名稱在1992年更改成肉毒桿菌。名稱梭狀芽孢桿菌用于反映這種微生物的厭氧特性以及它的形態(tài)特征(Carruthers和Carruthers，Can J Ophthalmol，31389-400(1996))。在20世紀(jì)20年代，在多次爆發(fā)食物中毒后粗產(chǎn)物形式的A型肉毒桿菌毒素得以分離。舊金山加利福尼亞大學(xué)的Herman Sommer博士第一次嘗試純化該神經(jīng)毒素(Borodic等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，754-60(1991))。在1964年，Edward J.Schantz博士和他的同事分離出結(jié)晶體形式的上述神經(jīng)毒素(Schantz等，InJankovi J，Hallet M(Eds)Therapy withBotulinum Toxin，New York，NYMarcel Dekker，41-49(1994))。到1949年，Burgen和他的同事能夠證明肉毒桿菌毒素阻斷了跨越神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的神經(jīng)沖動(dòng)(Burgen等，J Physiol，10910-24(1949))。1973年，Allan B.Scott首次在猴中使用肉毒桿菌毒素A(BTX-A)。Scott證明了持續(xù)3個(gè)月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna，Science，130763-772(1959))。不久之后，報(bào)道了BTX-A是一種對(duì)人的斜視、臉痙攣和痙攣性斜頸的成功的療法(Baron等，InBaron EJ，PetersonLR，F(xiàn)inegold SM(Eds)，Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology，St.Louis，MOMosby Year Book，504-523(1994)；Carruthers和Carruthers，Adv Dermatol，12325-348(1997)；Markowitz，InStrickland GT(Eds)Hunters Tropical Medicine，7th ed.PhiladelphiaW.B.Saunders，441-444(1991))。A型肉毒桿菌毒素?fù)?jù)說(shuō)是人類已知的最致命性的天然生物制劑。肉毒桿菌的孢子在土壤中發(fā)現(xiàn)并能夠在不正確消毒的且密封的食物容器中生長(zhǎng)。該細(xì)菌的攝入可導(dǎo)致肉毒中毒，這可能是致命的。
同時(shí)，肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應(yīng)已經(jīng)用于治療目的。肉毒桿菌毒素的受控施用已經(jīng)用于提供肌肉麻痹來(lái)治療病癥，例如表征為機(jī)能亢進(jìn)的骨骼肌的神經(jīng)肌肉障礙。已經(jīng)用肉毒桿菌毒素治療的病癥包括半側(cè)面痙攣、成年型痙攣性斜頸、肛裂、臉痙攣、腦性麻痹、宮口梗阻性難產(chǎn)、偏頭痛、斜視、顳側(cè)下頜關(guān)節(jié)障礙(temperomandibularjoint disorder)，以及多種類型的肌肉痛性痙攣和痙攣。更近一些時(shí)候，已經(jīng)利用肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應(yīng)用于治療性和美容性面部施用例如處理皺紋、皺眉引起的皺紋，以及面部肌肉痙攣或收縮的其它結(jié)果。
考慮到肉毒桿菌毒素的毒性以及它的治療用途潛力，開發(fā)用于安全施用該毒素的組合物和方法將是所期望的。肉毒桿菌毒素的局部施用因?yàn)橄铝性蚨鴮?huì)提供更安全且更理想的治療備選方案施用的無(wú)痛性質(zhì)、可覆蓋的更大治療表面積、制備具有更高比活性的純毒素的能力、應(yīng)用肉毒桿菌治療所需訓(xùn)練的減少、產(chǎn)生理想效果所需的量更少，以及不需要大量毒素來(lái)達(dá)到治療性的臨床效果。用于經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的有效手段，以及用于施用肉毒桿菌毒素治療或預(yù)防不需要注射的許多病癥的有效手段因而是非常理想的。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及含有肉毒桿菌毒素的新的組合物，更特別涉及這樣的組合物，其能夠通過(guò)皮膚或上皮組織輸送或遞送(也稱為“經(jīng)皮膚遞送”)肉毒桿菌毒素，并因此可局部施用來(lái)提供肉毒桿菌毒素給受試者，用于如在此描述的多種治療、美容和/或美學(xué)目的。
本發(fā)明的一方面是提供含有肉毒桿菌毒素和載體的組合物。該載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈。載體和肉毒桿菌毒素之間的連接是非共價(jià)的。
本發(fā)明還提供了施用肉毒桿菌毒素給受試者的方法，該方法包括局部施用給受試者的皮膚或上皮組織與有效量載體結(jié)合的肉毒桿菌毒素。該載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈，并且與肉毒桿菌毒素非共價(jià)結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供制劑，所述的制劑含有肉毒桿菌毒素、帶正電荷的主鏈，以及至少一種選自分配劑(partitioning agent)、寡聚-橋(oligo-bridge)和聚陰離子橋(polyanion bridge)的成員，這樣肉毒桿菌毒素與帶正電荷的主鏈非共價(jià)地復(fù)合。該制劑可用于通過(guò)施用制劑至皮膚區(qū)域來(lái)處理皺紋。如果需要，可在施用該制劑后施用遮蔽劑(occlusion agent)。
本發(fā)明的制劑還可用于治療多汗癥。本發(fā)明考慮的治療方法包括施用給皮膚區(qū)域本發(fā)明制劑以及隨后任選施用遮蔽劑。
本發(fā)明的另一方面是提供用于施用肉毒桿菌毒素給受試者的試劑盒。該試劑盒包含以用于其經(jīng)皮膚遞送的有效量存在的肉毒桿菌毒素，以及載體，所述載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈。載體和肉毒桿菌毒素之間的結(jié)合是非共價(jià)的。
然而，本發(fā)明的另一方面是提供用于施用肉毒桿菌毒素給受試者的試劑盒。該試劑盒包含用于遞送肉毒桿菌毒素至皮膚的裝置和含有載體的組合物，所述載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈，所述的分支基團(tuán)選自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT及其片段，以及Antennapedia PTD，其中下標(biāo)n1是0至約20的整數(shù)，并且下標(biāo)n2獨(dú)立地是從約5至約25的奇整數(shù)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有肉毒桿菌毒素(如在此定義的)和載體的組合物，所述載體包含具有帶正電荷的分支或效應(yīng)基團(tuán)的帶正電荷的“主鏈”，如在此描述的。最優(yōu)選地，帶正電荷的載體是長(zhǎng)鏈帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽基聚合物，例如聚亞烷基亞胺。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于通過(guò)局部施用有效量的這種組合物優(yōu)選至需要這種治療的受試者或患者的皮膚而產(chǎn)生生物效應(yīng)的方法，所述的生物效應(yīng)例如是肌肉麻痹、減少分泌過(guò)多或出汗、治療神經(jīng)性疼痛或偏頭痛、減少肌肉痙攣、預(yù)防或減少粉刺，或者減少或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生美容或美學(xué)效果的方法，例如通過(guò)局部施用肉毒桿菌毒素至面部而不是通過(guò)注射進(jìn)面部肌肉。
本發(fā)明還提供了用于制備或配制組合物的試劑盒，所述的組合物包含載體和肉毒桿菌毒素，以及產(chǎn)生可使用的制劑或可依次用于產(chǎn)生這種制劑的預(yù)混合物所需的另外的物質(zhì)。備選地，該試劑盒包括用于分別施用，但是協(xié)同作用，施用肉毒桿菌毒素和載體給受試者的手段。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)證明了用含有肽主鏈的本發(fā)明組合物經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的效力。
圖2是描述小鼠的后肢狀態(tài)的照片，其中一個(gè)后肢區(qū)域用本發(fā)明的組合物處理，而另一后肢區(qū)域用不含根據(jù)本發(fā)明的載體的另一種含有肉毒桿菌毒素的組合物處理。
圖3是描述在用Revance’s肉毒桿菌制劑局部處理之前和之后受試者前額上的皺紋的照片。
圖4顯示了(A)在用Revance’s肉毒桿菌制劑局部處理皺紋之后以及(b)在處理之前前額的Mikrosil印跡(cast)。這些Mikrosil印跡清楚地顯示未處理的一側(cè)具有更深的皺紋，所述的Mikrosil印跡是有用的，因?yàn)樗鼈兪箍赡軄?lái)自給真實(shí)受試者照相的人為因素最小化。
圖5圖5顯示描述在處理之前于受試者前額上進(jìn)行的Minor’s淀粉/碘試驗(yàn)的照片。
圖6圖6a顯示描述在施用Revance’s肉毒桿菌制劑(A)和對(duì)照制劑(B)5天后Minor’s淀粉/碘試驗(yàn)的照片。對(duì)照制劑含有分子量約21,000并具有TAT分支基團(tuán)的帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈。這些照片在施用2分鐘后獲得。圖6b與圖6a相同，除了它們?cè)诮?jīng)過(guò)4分鐘后獲得以外。
圖7顯示在腋下多汗癥試驗(yàn)中使用的給藥區(qū)域。注意到，該給藥區(qū)域的范圍超過(guò)了腋毛覆蓋的皮膚區(qū)域1厘米。
圖8圖8a顯示了一個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，該試驗(yàn)證明了肉毒桿菌毒素治療人受試者的腋下多汗癥的效力，所述的肉毒桿菌毒素作為使用短的肽基載體的局部用藥劑治療性地遞送穿過(guò)完整的皮膚。該圖描述了在用Botox加上短的肽基載體或單獨(dú)用載體處理4周后按重量分析測(cè)量到的汗量(mg/5分鐘)的顯著減少。結(jié)果是作為與相同組基準(zhǔn)值的比率的4周的值，顯著性通過(guò)Wilcoxon分析(P＜0.05、N＝10個(gè)患者)測(cè)定。圖8b顯示了一個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，該試驗(yàn)證明肉毒桿菌毒素治療人受試者的腋下多汗癥的效力，所述的肉毒桿菌毒素使用短的肽基載體作為局部用藥劑治療性地遞送經(jīng)過(guò)完整的皮膚。該圖描述了在用Botox加上短的肽基載體或單獨(dú)用載體處理4周后按重量分析測(cè)量到的汗量(mg/5分鐘)的顯著減少。結(jié)果是作為對(duì)兩者時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照值的比率的治療值，其顯著性通過(guò)Wilcoxon分析(P＜0.05、N＝10個(gè)患者)測(cè)定。
圖9顯示了描述Minor’s淀粉/碘試驗(yàn)的照片，所述試驗(yàn)在用Revance’s肉毒桿菌制劑局部處理來(lái)治療腋下多汗癥之前和之后進(jìn)行。顯示了基線和2周時(shí)的淀粉碘試驗(yàn)，其中受試者#12的右側(cè)腋窩用Revance’s肉毒桿菌制劑處理(a和c)而左側(cè)腋窩施用對(duì)照(b和d)。這些照片說(shuō)明了在碘淀粉試驗(yàn)中用載體+botox處理后觀察到的典型的效果。雖然在對(duì)照一側(cè)上觀察到一些交叉(與重量分析數(shù)據(jù)減少25％一致)，但是處理引起顯著減少(與經(jīng)處理的一側(cè)的重量分析數(shù)據(jù)減少65％一致)。
圖10在兩個(gè)不同動(dòng)物中局部施用無(wú)載體的肉毒桿菌毒素(a和c)或有KNR的肉毒桿菌毒素(b和d)7天后，通過(guò)碘-淀粉染色法(深藍(lán)色的為陽(yáng)性)顯示的小鼠足部汗的產(chǎn)生。
圖11圖11(a)顯示了在施用對(duì)照制劑給雄性CD1小鼠后的肌力(muscle force)產(chǎn)生。圖11(b)顯示了在施用局部用“RevanceBotox溶液”后的肌力產(chǎn)生。
圖12改良的Franz Chamber。(a)儀器裝置，包括貯器、循環(huán)式水浴鍋、在線蠕動(dòng)泵、在線Franz chamber和級(jí)分收集器。(b)單個(gè)的Franz chamber的橫截面，顯示了輸入管和輸出管、皮膚膜，以及供體化合物的放置。
圖13K30 T相對(duì)于對(duì)照樣品的增加的流通量。(a)K30 T對(duì)多聚賴氨酸(b)K30 T對(duì)無(wú)載體。
圖14在豬皮膚模型中Revance載體遞送A型肉毒桿菌毒素穿過(guò)皮膚屏障的效力用改良的Franz chamber評(píng)估。顯示了局部施用后增加的毒素流通量(圖13a-f)。每個(gè)圖描述了以不同載體毒素質(zhì)量比遞送穿過(guò)豬的皮膚的局部用毒素的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差百分比。
圖15描述鏈霉抗生物素蛋白染色(藍(lán)色為陽(yáng)性)的代表性顯微照片，所述的鏈霉抗生物素蛋白染色是在局部施用無(wú)載體的生物素化肉毒桿菌毒素(對(duì)照組，a-c)，或具有K30 T載體的生物素化肉毒桿菌毒素(處理組，d-f)后進(jìn)行。
圖16該圖顯示了對(duì)于含有K15T2的NNX(處理組)、無(wú)載體的NNX(對(duì)照組)以及NNX注射肌力減少的百分比。
圖17該圖顯示了在局部施用A型肉毒桿菌毒素后減少了前額的皺紋。人受試者1在預(yù)行并且受試者2在底端行。該圖舉例說(shuō)明了處理前(基線)和處理后的狀況。
圖18比較了根據(jù)本發(fā)明的制劑和對(duì)照制劑的人的腋下多汗癥試驗(yàn)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了用于通過(guò)局部施用合適的制劑遞送、尤其經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的組合物和方法。
根據(jù)本發(fā)明，具有效應(yīng)基團(tuán)的帶正電荷的載體分子，如在此描述的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)適合作為肉毒桿菌毒素的運(yùn)輸系統(tǒng)，使得毒素能夠經(jīng)皮膚施用至肌肉和/或其它皮膚相關(guān)組織。運(yùn)輸發(fā)生，而無(wú)需共價(jià)修飾肉毒桿菌毒素。
“帶正電荷的”表示載體在至少一些液相條件下，更優(yōu)選在至少一些生理學(xué)兼容的條件下帶有正電荷。更優(yōu)選地，如在此使用的，“帶正電荷的”表示所考慮的基團(tuán)含有在所有pH條件下帶電荷的官能團(tuán)，例如季胺，或者含有在某些液相條件下，例如在伯胺的情形中pH變化的條件下，可獲得正電荷的官能團(tuán)。更優(yōu)選的，如在此使用的，“帶正電荷的”指具有在生理學(xué)兼容條件下與陰離子締合的行為的那些基團(tuán)。具有多個(gè)帶正電荷的部分的聚合物不必是均聚物，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。帶正電荷的部分的其它實(shí)例是現(xiàn)有技術(shù)所熟知的并可容易地采用，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
一般而言，帶正電荷的載體(也稱為“帶正電荷的主鏈”)通常是原子組成的直鏈，其鏈中的基團(tuán)在生理pH下帶正電荷，或帶正電荷的基團(tuán)連接至從主鏈延伸的側(cè)鏈上。優(yōu)選地，帶正電荷的主鏈自身將不具有確定的酶促活性或治療性生物學(xué)活性。線性主鏈?zhǔn)菬N主鏈，在一些實(shí)施方案中，其由選自氮、氧、硫、硅和磷的雜原子間插。大多數(shù)主鏈的原子通常是碳。另外，主鏈將通常是重復(fù)單位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基)、聚(丙烯胺)、聚亞烷基亞胺等)的聚合物但可以是雜聚物。在一組實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)瞧渲性S多胺氮原子作為攜帶正電荷的銨基(四-取代的)存在的聚丙烯胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)欠请幕酆衔?，其可以是雜聚物或均聚物例如聚亞烷基亞胺，如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，分子量約10,000-2,500,000、優(yōu)選約100,000-1,800,000，并且最優(yōu)選約500,000-1,400,000。在另一組實(shí)施方案中，主鏈已經(jīng)連接有多個(gè)包含帶正電荷的基團(tuán)(例如銨基、吡啶_、磷_、锍、胍基團(tuán)(guanidinium)或amidinium基團(tuán))的側(cè)鏈部分。該組實(shí)施方案中的側(cè)鏈部分可沿主鏈間隔放置，間隔是一致的或可變的。另外，側(cè)鏈的長(zhǎng)度可以相似或不同。例如，在一組實(shí)施方案中，側(cè)鏈可以是具有1-20個(gè)碳原子并在遠(yuǎn)端(遠(yuǎn)離主鏈)以上述帶正電荷的基團(tuán)之一結(jié)尾的直或分支的烴鏈。在本發(fā)明的所有方面，載體與生物活性制劑之間的結(jié)合是通過(guò)非共價(jià)相互作用，其非限制性實(shí)例包括離子相互作用、氫鍵結(jié)合、范德華力或其組合。
在一組實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂卸鄠€(gè)帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)(例如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優(yōu)選地，該多肽的分子量為約10,000-1,500,000，更優(yōu)選約25,000-1,200,000，最優(yōu)選約100,000-1,000,000。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，當(dāng)氨基酸用于本發(fā)明的這個(gè)部分時(shí)，在連接的中心，側(cè)鏈可具有D-或L-型(R或S構(gòu)型)。備選地，主鏈可以是多肽的類似物例如類肽(peptoid)。參見，例如Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32543(1993)；Zuckermann等，Chemtracts-Macromol.Chem.480(1992)；以及Simon等，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 899367(1992))。簡(jiǎn)而言之，類肽是其中側(cè)鏈連接至主鏈氮原子而不是α-碳原子的多聚甘氨酸。同上，一部分側(cè)鏈通常將會(huì)以帶正電荷的基團(tuán)結(jié)尾以提供帶正電荷的主鏈成分。類肽的合成在例如美國(guó)專利No.5,877,278中描述，其在這里通過(guò)全文引入作為參考。如在此使用的術(shù)語(yǔ)，具有類肽主鏈結(jié)構(gòu)的帶正電荷的主鏈認(rèn)為是“非肽”的，因?yàn)樗鼈儾皇怯稍讦?碳位置具有天然存在的側(cè)鏈的氨基酸組成。
可使用多種其它主鏈，例如采用其中肽的酰胺鍵用代用品例如酯鍵、硫代酰胺(-CSNH-)、反向的硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亞甲基(-NHCH2-)或反向的亞甲基氨基(-CH2NH-)基團(tuán)、酮-亞甲基(-COCH2-)基團(tuán)、次膦酸酯(-PO2RCH2-)、膦酰胺(phosphonamidate)和膦酰胺酯(phosphonamidate ester)(-PO2RNH-)、反向的肽(-NHCO-)、反式-烯基(-CR＝CH-)、氟代烯(-CF＝CH-)、二亞甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羥基亞乙基(-CH(OH)CH2-)、亞甲基氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、磺酰氨基(-SO2NH-)、亞甲基磺酰氨基(-CHRSO2NH-)、反向的磺酰胺基(-NHSO2-)替換的多肽的空間或電子模擬物，以及具有丙二酸酯和/或偕-二氨基-烷基亞單位的主鏈，例如，通過(guò)Fletcher等人綜述的((1998)Chem.Rev.98763)以及通過(guò)其中引用的參考文獻(xiàn)詳細(xì)描述的。許多前述的取代產(chǎn)生相對(duì)于由α-氨基酸形成的主鏈近似等排的聚合物主鏈。
在上面提供的每個(gè)主鏈中，可以添加攜帶帶正電荷的基團(tuán)的側(cè)鏈基團(tuán)。例如，磺酰胺-連接的主鏈(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有連接至氮原子的側(cè)鏈基團(tuán)。類似地，羥基乙烯基(-CH(OH)CH2-)鍵可具有連接至羥基取代基的側(cè)鏈基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地修改其它鍵化學(xué)來(lái)用標(biāo)準(zhǔn)合成方法提供帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂蟹种Щ鶊F(tuán)(也稱為效應(yīng)基團(tuán))的多肽。如在此使用的，效應(yīng)基團(tuán)或分支基團(tuán)是具有促進(jìn)帶正電荷主鏈運(yùn)送通過(guò)組織或細(xì)胞膜的效果的任何物質(zhì)。所述分支或效應(yīng)基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段，或Antennapedia的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或其片段，其中下標(biāo)n1是0-20，更優(yōu)選0-8，依然更優(yōu)選2-5的整數(shù)，并且下標(biāo)n2獨(dú)立地是約5-25，更優(yōu)選約7-17，最優(yōu)選約7-13的奇整數(shù)。更進(jìn)一步優(yōu)選的是其中HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的那些實(shí)施方案，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是從0-20的整數(shù)并且所述片段經(jīng)由該片段的C-端或N-端連接至主鏈。優(yōu)選的HIV-TAT片段是其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是0-8，更優(yōu)選2-5的整數(shù)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的側(cè)鏈或分支基團(tuán)是Antennapedia(Antp)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)，或其保留活性的片段。優(yōu)選地，帶正電荷的載體包含側(cè)鏈帶正電荷的分支基團(tuán)，所述分支基團(tuán)的量為總載體重量的至少約0.05％，優(yōu)選約0.05-45％重量，并且最優(yōu)選約0.1-30％重量。對(duì)于具有式(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團(tuán)，最優(yōu)選的量是約0.1-25％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，主鏈部分是多聚賴氨酸并且?guī)д姾傻姆种Щ鶊F(tuán)連接至賴氨酸側(cè)鏈的氨基酸。多聚賴氨酸可具有的分子量為約10,000-1,500,000，優(yōu)選約25,000-1,200,000，并且最優(yōu)選約100,000-1,000,000。其可以是任何可商業(yè)獲得的(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，Missouri，USA)多聚賴氨酸，例如MW＞70,000的多聚賴氨酸、MW為70,000-150,000的多聚賴氨酸、MW為150,000-300,000的多聚賴氨酸以及MW＞300,000的多聚賴氨酸。合適的多聚賴氨酸的選擇將取決于組合物的剩余部分，并將足以總體提供凈正電荷給組合物并提供優(yōu)選為帶負(fù)電荷成分的組合長(zhǎng)度的1-4倍的長(zhǎng)度。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)包括，例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)情L(zhǎng)鏈的聚亞烷基亞胺例如聚乙烯亞胺，如分子量為約1,000,000的聚乙烯亞胺。
包含多肽或聚亞烷基亞胺的帶正電荷的主鏈或載體分子是新的化合物并形成本發(fā)明的一個(gè)方面，所述的主鏈或載體分子具有上述分支基團(tuán)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，僅具有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的載體是經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素所需的。在特定的實(shí)施方案中，帶正電荷的載體是具有多個(gè)帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)的多肽(如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)，如上描述的。優(yōu)選地，所述多肽分子量至少為約10,000。在另一個(gè)實(shí)施方案中，帶正電荷的載體是非肽基聚合物例如分子量至少約100,000的、具有多個(gè)帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)的聚亞烷基亞胺。這種聚亞烷基亞胺包括聚乙烯-和聚丙烯亞胺。在任一情況中，為了用作經(jīng)皮膚遞送唯一需要的制劑，帶正電荷的載體分子包含帶正電荷的分支或效應(yīng)基團(tuán)，包括-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段，或者Antennapedia PTD或其片段，其中下標(biāo)n1是0-20，更優(yōu)選0-8，更優(yōu)選2-5的整數(shù)，并且下標(biāo)n2獨(dú)立地是約5-25，更優(yōu)選約7-17，并且最優(yōu)選約7-13的奇整數(shù)。優(yōu)選地，所述側(cè)鏈或分支基團(tuán)具有如上描述的通式-(gly)n1-(arg)n2。其它優(yōu)選的實(shí)施方案是其中分支或效應(yīng)基團(tuán)是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)pYGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段的那些，其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立的是0-20的整數(shù)并且所述片段通過(guò)該片段的C-端或N-端連接至載體分子。在連接中心，側(cè)鏈的分支基團(tuán)可具有D-或L-型(R或S構(gòu)型)。優(yōu)選的HIV-TAT片段是其中下標(biāo)p和q各自獨(dú)立地是0-8，更優(yōu)選2-5的整數(shù)的那些。其它優(yōu)選的實(shí)施方案是其中分支基團(tuán)是Antennapedia PTD基團(tuán)或其保持該基團(tuán)活性的片段的那些。這些在本領(lǐng)域例如從Console等，J.Biol.Chem.27835109(2003)得知。優(yōu)選地，帶正電荷的載體包含側(cè)鏈帶正電荷的分支基團(tuán)，所述分支基團(tuán)的量是總載體重量的至少約0.05％，優(yōu)選約0.05-45％重量，并且最優(yōu)選約0.1-30％重量。對(duì)于具有式-(gly)n1-(arg)n2的帶正電荷的分支基團(tuán)，最優(yōu)選的量是約0.1-25％。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是具有帶正電荷的分支基團(tuán)的多聚賴氨酸，所述的分支基團(tuán)連接至賴氨酸側(cè)鏈氨基上。在該特定實(shí)施方案中使用的多聚賴氨酸可以是任何可商業(yè)獲得的(例如Sigma ChemicalCompany，St.Louis，Missouri，USA)多聚賴氨酸，例如MW＞70,000的多聚賴氨酸、MW為70,000-150,000的多聚賴氨酸、MW為150,000-300,000的多聚賴氨酸以及MW＞300,000的多聚賴氨酸。然而，優(yōu)選多聚賴氨酸具有至少約10,000的MW。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)包括例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT或其片段，以及Antennapedia PTD或其片段。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是相對(duì)短的多聚賴氨酸或聚乙烯亞胺(PEI)主鏈(其可以是直鏈的或分支的)并且其具有帶正電荷的分支基團(tuán)。這些載體可用于使治療組合物中主鏈和肉毒桿菌毒素不受控制的集聚最小化，該集聚導(dǎo)致運(yùn)輸效率急劇降低。當(dāng)載體是相對(duì)短的直鏈多聚賴氨酸或PEI主鏈時(shí)，該主鏈將具有低于75,000，更優(yōu)選低于30,000，并且最優(yōu)選低于25,000的分子量。然而，當(dāng)載體是相對(duì)短的分支的多聚賴氨酸或PEI主鏈時(shí)，主鏈將具有低于60,000，更優(yōu)選低于55,000，并且最優(yōu)選低于50,000的分子量。但是，如果如在此描述的分配劑包含于組合物中，則所述分支的多聚賴氨酸和PEI主鏈的分子量可達(dá)到75,000，而直鏈多聚賴氨酸和PEI主鏈的分子量可達(dá)到150,000。
如在此描述的，術(shù)語(yǔ)“肉毒桿菌毒素”意指通過(guò)細(xì)菌或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的任何已知類型的肉毒桿菌毒素，以及可隨后發(fā)現(xiàn)的任何類型包括基因工程變體或融合蛋白。如上面提及的，目前，已經(jīng)鑒定了7種免疫學(xué)上不同的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，即肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，它們的每種通過(guò)用類型-特異性抗體中和來(lái)區(qū)分。肉毒桿菌毒素血清型可從Sigma-Aldrich和Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)以及從其它來(lái)源商業(yè)獲得。不同血清型的肉毒桿菌毒素在它們影響的動(dòng)物種以及它們引發(fā)的麻痹的嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間方面不同。至少兩種類型的肉毒桿菌毒素(A型和B型)可商業(yè)獲得用于治療某些病癥的制劑。例如，A型包含于商標(biāo)為BOTOX_的Allergan制劑和商標(biāo)為DYSPORT_的Ipsen制劑中，而B型包含于商標(biāo)為MYOBLOC_的Elan制劑中。
本發(fā)明組合物中使用的肉毒桿菌毒素可備選地是肉毒桿菌毒素衍生物，即，具有肉毒桿菌毒素活性但相對(duì)于天然存在的或重組天然肉毒桿菌毒素在任意部分或任意鏈上含有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)或官能改變的化合物。例如，肉毒桿菌毒素可以是經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素(例如，與天然的或重組產(chǎn)生的神經(jīng)毒素或其片段或衍生物比較，具有至少一個(gè)它的氨基酸缺失、修飾或取代的神經(jīng)毒素)。例如，肉毒桿菌毒素可以是已經(jīng)以例如增強(qiáng)它的特性或減少不期望的副作用，但仍然保留期望的肉毒桿菌毒素活性的方式修飾了的肉毒桿菌毒素。肉毒桿菌毒素可以是由細(xì)菌產(chǎn)生的任何肉毒桿菌毒素復(fù)合體，如上面描述的。備選地，肉毒桿菌毒素可以是用重組或合成化學(xué)技術(shù)制備的毒素(例如，從不同肉毒桿菌毒素血清型的亞基或結(jié)構(gòu)域制備的重組肽、融合蛋白或雜合神經(jīng)毒素(例如，參見美國(guó)專利6,444,209))。肉毒桿菌毒素還可以是已經(jīng)顯示具有必需的肉毒桿菌毒素活性的整個(gè)分子的一部分，并且在這種情形中可以本身或作為組合物或綴合分子(例如融合蛋白)的部分使用。另外，肉毒桿菌毒素可以是肉毒桿菌毒素前體的形式，其自身可以是無(wú)毒的，例如無(wú)毒鋅蛋白酶，其在溶蛋白性裂解后變成有毒。
本發(fā)明還考慮肉毒桿菌毒素的組合物和混合物的一般使用，雖然由于它們不同的本質(zhì)和特性，肉毒桿菌毒素血清型的混合物通常不會(huì)在醫(yī)療保健或化妝品工業(yè)中同時(shí)施用。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選是施用至受試者或患者(即需要該特定治療的人或其它哺乳動(dòng)物)的皮膚或上皮組織的產(chǎn)品形式。術(shù)語(yǔ)“需要”表示包括藥學(xué)或健康相關(guān)的需要，例如治療涉及不期望的面肌痙攣的病癥，以及美容和主觀需要，例如改變或改善面部組織的外觀。通常，組合物通過(guò)將肉毒桿菌毒素與載體，并通常與一種或多種另外的可藥用載體或賦形劑混合制備。在它們的最簡(jiǎn)單形式中，它們可包含簡(jiǎn)單的含水可藥用載體或稀釋劑，例如緩沖鹽水。然而，組合物可包含局部用藥物組合物或化妝品組合物中典型的其它成分，包括皮膚學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體、賦形物或介質(zhì)(即與它們將施用的組織相兼容的載體、賦形物或介質(zhì))。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“皮膚學(xué)或藥學(xué)上可接受的”表示所描述的組合物或其成分適合用于與這些組織接觸或適合用于患者，通常沒(méi)有過(guò)度毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、變應(yīng)性應(yīng)答等。如果合適，本發(fā)明的組合物可包含在所考慮領(lǐng)域中，并且尤其在美容學(xué)和皮膚病學(xué)中常規(guī)使用的任何成分。組合物還可以包含一些小的陰離子，優(yōu)選多價(jià)陰離子，例如磷酸鹽、天冬氨酸鹽或檸檬酸鹽。
關(guān)于它們的形式，本發(fā)明組合物可包括用于施用至皮膚和可使用該組合物的其它組織的溶液劑、乳劑(包括微乳劑)、混懸劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、粉劑或其它典型的固體或液體組合物。除肉毒桿菌毒素和載體外，這些組合物還可包含通常用于這種產(chǎn)品的其它成分，例如抗微生物劑、增濕劑和水合劑(hydration agents)、穿透劑、防腐劑、乳化劑、天然或合成油脂、溶劑、表面活性劑、去污劑、潤(rùn)膚劑、抗氧化劑、芳香劑、充填劑、增稠劑、蠟、氣味吸收劑、染料、著色劑、粉劑，并任選包括麻醉劑、止癢添加劑、植物提取物、調(diào)節(jié)劑、遮光或發(fā)光劑、閃光劑、保濕劑、云母(mica)、礦物質(zhì)、多酚類、硅酮或其衍生物、防曬霜、維生素，以及植物藥物。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含凝膠劑和/或粘度修飾劑。通常加入這些制劑來(lái)增加組合物的粘度，以便使得組合物的施用更容易且更精確。另外，這些制劑有助于防止含水的肉毒桿菌毒素/載體溶液劑干燥，干燥將會(huì)導(dǎo)致肉毒桿菌毒素的活性降低。特別優(yōu)選的制劑是不帶電的且不會(huì)干擾肉毒桿菌毒素活性或毒素-載體復(fù)合物在跨越皮膚中的效力的那些制劑。凝膠劑可以是某些基于纖維素的凝膠劑，例如羥丙基纖維素(HPC)。在一些實(shí)施方案中，肉毒桿菌毒素/載體復(fù)合物配制成具有2-4％HPC的組合物。備選地，含有肉毒桿菌毒素/載體復(fù)合物的溶液劑的粘度可以通過(guò)加入聚乙二醇(PEG)改變。在其它實(shí)施方案中，肉毒桿菌毒素/載體溶液劑與預(yù)混合的粘稠劑例如Cetaphil_增濕劑組合。
本發(fā)明的組合物可任選包含分配劑。如在此使用的，“分配劑”是具有防止或最小化肉毒桿菌毒素與本發(fā)明載體的不期望或不受控制的集聚的任何物質(zhì)或添加劑。分配劑可例如在由于體積限制而必須采用濃縮的肉毒桿菌毒素溶液劑時(shí)是有用的。在這些情形中，分配劑使肉毒桿菌毒素保持分散，從而防止該毒素聚集，否則在沒(méi)有分配劑時(shí)將會(huì)發(fā)生聚集。通常，分配劑是(1)無(wú)刺激性的、(2)不會(huì)破壞肉毒桿菌毒素、(3)不會(huì)使?jié)B透性有任何增加、(4)提供可靠且穩(wěn)定的粒度、(5)是不帶電的，以及(6)不會(huì)干擾毒素和經(jīng)皮膚載體的復(fù)合物。合適的分配劑的實(shí)例是乙醇(EtOH)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EtOH少于組合物的20％，并且最優(yōu)選少于組合物的5％。
作為實(shí)例，如果體積限制要求重構(gòu)100U肉毒桿菌毒素于0.5ml，而不是2.5ml溶液中，通常觀察到肉毒桿菌毒素將會(huì)顯示出不期望的集聚，并因此降低了活性。然而，通過(guò)加入1％的EtOH作為分散劑，甚至在該濃度下24小時(shí)后仍保持完全的活性。作為另一個(gè)實(shí)例，Botox_以1.0ml 0.9％NaCl重構(gòu)具有完全活性，而以0.5ml在1％和5％EtOH加上0.9％NaCl中重構(gòu)產(chǎn)生具有完全活性的溶液劑。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將寡聚-或聚陰離子橋加入至肉毒桿菌毒素組合物中以提高毒素與帶正電荷的主鏈載體的復(fù)合。正如本領(lǐng)域所熟知的，肉毒桿菌毒素實(shí)際上是不同蛋白質(zhì)的復(fù)合物，這些蛋白質(zhì)的一些是帶正電荷的，而一些是帶負(fù)電荷的。因?yàn)槎舅爻煞值拇_切比例取決于毒素來(lái)源而不同，所以有可能來(lái)自某些來(lái)源的肉毒桿菌毒素具有較低的與在此描述的帶正電荷的主鏈復(fù)合的傾向。然而，本發(fā)明的一方面是發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加入寡聚-或聚陰離子橋至這類肉毒桿菌毒素，局部施用的功率和效力顯著增加。這種寡聚-/聚陰離子橋的合適的實(shí)例包括磷酸鈉(5％)、PBS或5％聚-L-天冬氨酸(例如MW為3000)。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是控制釋放或持續(xù)釋放組合物的形式，其中肉毒桿菌毒素和載體包封于或以別的方式包含于一種物質(zhì)中，這樣它們以控制的方式在一段時(shí)間內(nèi)釋放至皮膚上。肉毒桿菌毒素和載體可以包含于基質(zhì)、脂質(zhì)體、小囊泡、微膠囊、微球等中，或包含于固體顆粒材料中，選擇和/或構(gòu)建所有上述物質(zhì)用以使得肉毒桿菌毒素隨時(shí)間過(guò)去釋放。肉毒桿菌毒素和載體可以在一起封裝(例如，在相同膠囊中)或分開封裝(在單獨(dú)的膠囊中)于膠囊中。
使用在此描述的組合物，肉毒桿菌毒素可以以有效量遞送至皮膚下面的肌肉，或遞送至皮膚內(nèi)部的腺結(jié)構(gòu)來(lái)產(chǎn)生麻痹、產(chǎn)生松弛、減少收縮、防止或減輕痙攣、減少腺的排出量或產(chǎn)生其它期望效果。相對(duì)于可注射或可植入材料，以這種方式局部遞送肉毒桿菌毒素能使劑量減少、減小毒性并使得能進(jìn)行更精確的劑量?jī)?yōu)化來(lái)獲得理想的效果。
施用本發(fā)明的組合物以便施用有效量的肉毒桿菌毒素。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”表示如上定義的肉毒桿菌毒素的量，該量足以產(chǎn)生期望的肌肉麻痹或其它生物學(xué)或美學(xué)效果，但是隱含它是安全劑量，即足夠低而能避免嚴(yán)重副作用的量。期望的效果包括松弛某些肌肉，為了例如減少特別是臉上的細(xì)紋和/或皺紋的出現(xiàn)，或以其它方式例如使眼睛變寬、提升嘴角、或使從上唇散開的皺紋平滑，或一般性解除肌緊張來(lái)調(diào)整外觀。最后提及的效果(一般性解除肌緊張)可在面部或其它部位實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明組合物可包含合適的有效量的肉毒桿菌毒素用于作為單劑量處理施用，或者可以是更加濃縮的，用于在施用處稀釋或用于多次施用。通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的帶正電荷的載體，肉毒桿菌毒素可以經(jīng)皮膚施用給受試者用于治療病癥例如不期望的面肌或其它肌肉痙攣、多汗癥、痤瘡或其中肌肉疼痛或痙攣的緩解是所期望的身體其它部位的病癥。肉毒桿菌毒素經(jīng)局部施用來(lái)經(jīng)皮膚遞送至肌肉或其它皮膚-相關(guān)結(jié)構(gòu)。施用可在例如腿、肩、背(包括下背)、腋窩、掌、足、頸、腹股溝、手背或腳背、肘、上臂、膝、大腿、臀、軀干、骨盆或期望施用肉毒桿菌毒素的身體的任何其它部位進(jìn)行。
還可以施用根據(jù)本發(fā)明的肉毒桿菌毒素制劑用于治療其它病癥，包括治療神經(jīng)疼痛、預(yù)防或減少偏頭痛或其它頭痛、預(yù)防或減少痤瘡、預(yù)防或減少?gòu)埩φ系K或張力障礙性收縮(主觀的或臨床的)、預(yù)防或減少與主觀性或臨床多汗癥相關(guān)的癥狀、減少分泌過(guò)多或出汗、降低或增強(qiáng)免疫應(yīng)答、或治療已經(jīng)建議或?qū)嵤┩ㄟ^(guò)注射施用肉毒桿菌毒素的其它病癥。
還可施用在此描述的肉毒桿菌毒素或其它治療性蛋白質(zhì)用于免疫-相關(guān)目的。令人驚訝的是，可以施用在此描述的肉毒桿菌毒素用于減少免疫應(yīng)答。更具體地說(shuō)，本發(fā)明使得肉毒桿菌毒素能通過(guò)改變的施用途徑遞送，從而改變制劑的復(fù)合抗原的呈遞。以這種方式，本發(fā)明可用于減少對(duì)肉毒桿菌毒素抗原的免疫應(yīng)答，并便于重復(fù)施用而沒(méi)有免疫-相關(guān)的活性減少。備選地，可制備并局部施用復(fù)合物來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，例如提供關(guān)于多種蛋白質(zhì)的免疫，例如，用于兒童免疫而無(wú)需注射。對(duì)于與免疫-相關(guān)活性相關(guān)的使用，“有效量”指足以使受試者在施用或一系列施用肉毒桿菌毒素后產(chǎn)生對(duì)它的免疫應(yīng)答的肉毒桿菌毒素的量。
最優(yōu)選地，組合物由或在醫(yī)師或其它保健專家的指導(dǎo)下施用。它們可以以單次處理或在一段時(shí)間內(nèi)以一系列周期性處理施用。為了經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素用于上述目的，將如上描述的組合物局部施用至期望產(chǎn)生效果的一個(gè)位置或多個(gè)位置的皮膚上。在將含水的肉毒桿菌毒素/載體溶液劑直接施用至皮膚的實(shí)施方案中，優(yōu)選覆蓋接受治療的區(qū)域(例如用Cetaphil_增濕劑)或用屏蔽物(例如Telfa)遮蔽受治療的區(qū)域，以便防止溶液干燥，溶液干燥將會(huì)導(dǎo)致毒素活性減少。由于它們的性質(zhì)，最優(yōu)選地，施用的肉毒桿菌毒素的量應(yīng)該小心應(yīng)用，以將產(chǎn)生期望效果而不會(huì)產(chǎn)生任何不利或不期望結(jié)果的施用比率和施用頻率施用。因此，例如，本發(fā)明的局部用組合物應(yīng)該以每cm2皮膚面積約1U-20,000U，優(yōu)選約1U-10,000U肉毒桿菌毒素的比率施用。這些范圍內(nèi)的較高劑量可優(yōu)選與控制釋放材料一起使用，例如，或者使在去除前在皮膚上停留時(shí)間更短。
在施用肉毒桿菌毒素/載體組合物之前適當(dāng)處理皮膚表面對(duì)于保持該溶液劑的效力是重要的。例如，在皮膚表面引入表面活性劑以在施用前除去皮膚上的表面油脂令人驚訝地是起反作用的，因?yàn)楸砻婊钚詣┧坪跗茐牧巳舛緱U菌毒素活性。即使隨后在施用肉毒桿菌毒素/載體溶液劑前用水多次洗滌皮膚，這也會(huì)發(fā)生。甚至極其溫和的表面活性劑，例如在嬰兒擦劑中的那些，看起來(lái)也引起了這種現(xiàn)象。因此，在施用本發(fā)明組合物的優(yōu)選方法中，皮膚僅用清水預(yù)先清洗。僅用水清洗看來(lái)還適度地提高了肉毒桿菌毒素的經(jīng)皮膚運(yùn)輸。
另外，可在施用肉毒桿菌毒素/載體復(fù)合物之前剝離皮膚以減少角質(zhì)層。原則上，剝離皮膚的過(guò)程應(yīng)該導(dǎo)致經(jīng)皮膚運(yùn)輸肉毒桿菌毒素的效力增強(qiáng)。然而，用于剝離皮膚的方法是重要的。例如，丙酮-介導(dǎo)的人或動(dòng)物中角質(zhì)層的減少看起來(lái)減少了隨后施用的肉毒桿菌毒素的活性。比較而言，膠帶剝脫(即將膠帶粘在皮膚表面并隨后移除膠帶)看起來(lái)使得肉毒桿菌毒素在小鼠模型和人中都能更深滲透并使劑量減少。據(jù)推測(cè)皮膚表面的磨損(例如通過(guò)使用磨擦墊(abrasive pads))將會(huì)引起與膠帶剝脫類似的效果。
本發(fā)明還包括用于經(jīng)皮膚遞送含有肉毒桿菌毒素和載體的組合物的裝置，所述載體具有如在此定義的連接有分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈。這種裝置在結(jié)構(gòu)上可與皮膚貼劑一樣簡(jiǎn)單，或者可以是更復(fù)雜的裝置，包括用于投放和監(jiān)控組合物投放的手段，以及任選用于監(jiān)控受試者狀態(tài)(例如，監(jiān)控受試者對(duì)投放的物質(zhì)的反應(yīng))的手段。
應(yīng)該注意的是，用于構(gòu)建該裝置的材料的選擇是重要的。用于構(gòu)建遞送裝置的優(yōu)選材料是不會(huì)通過(guò)降解或裝置表面對(duì)肉毒桿菌毒素不期望的吸收而導(dǎo)致肉毒桿菌毒素/載體溶液劑活性喪失的那些材料。這種不期望的行為已經(jīng)在例如當(dāng)含水溶液劑中的肉毒桿菌毒素/載體接觸聚丙烯表面時(shí)觀察到，但是在肉毒桿菌毒素/載體接觸聚氯乙烯(PVC)表面時(shí)未觀察到。
一般而言，組合物可以預(yù)先配制和/或預(yù)先安裝于裝置中或者可以稍后制備，例如使用試劑盒，該試劑盒保存有分開的兩種成分(肉毒桿菌毒素和載體)但提供了用于在施用時(shí)或施用前將它們混合的手段。載體分子的量或它與肉毒桿菌毒素的比率將取決于選擇哪種載體用于所考慮的組合物。在給出的情況中，合適的載體分子的量或比率可容易地確定，例如通過(guò)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)，例如在下面描述的那些試驗(yàn)確定。
一般而言，本發(fā)明還包括用于施用肉毒桿菌毒素至需要它的受試者或患者的方法。該方法包括局部施用與載體一起的有效量的肉毒桿菌毒素，所述載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，如在此描述的?！昂?..一起”表示兩種成分(肉毒桿菌毒素和載體)在組合程序中施用，其可包括將它們組合為一種隨后施用給受試者的組合物，或者將它們分開施用，但是以它們共同起作用以提供所需要的有效量的治療性蛋白質(zhì)的遞送的方式施用。例如，可首先施用含有載體的組合物至受試者的皮膚，之后應(yīng)用含有肉毒桿菌毒素的皮膚貼劑或其它設(shè)備。肉毒桿菌毒素可以以干燥形式整合進(jìn)皮膚貼劑或其它投藥裝置中，同時(shí)帶正電荷的載體可以在施用貼劑之前施用至皮膚表面以便兩者共同起作用，產(chǎn)生期望的經(jīng)皮膚遞送。因此，這兩種物質(zhì)(載體和肉毒桿菌毒素)聯(lián)合作用或者可能相互作用而在原位形成組合物或復(fù)合物。因此，本發(fā)明也包括一種試劑盒，該試劑盒包括用于經(jīng)由皮膚分配肉毒桿菌毒素的裝置以及含有載體或主鏈的液體、凝膠劑、乳劑等，并且該試劑盒適合應(yīng)用于受試者的皮膚或上皮組織。用于在保健專家指導(dǎo)下或者通過(guò)患者或受試者施用本發(fā)明組合物的試劑盒還可以包括適合該目的的定制的涂藥器(applicator)。
本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法使得能遞送具有更高比活性的純的肉毒桿菌毒素并潛在地改善了藥物動(dòng)力學(xué)。另外，載體可用作減少對(duì)外來(lái)輔助蛋白(例如，400-600mg的人血清白蛋白或250-500mg的重組血清白蛋白)和/或多糖穩(wěn)定劑的需要的穩(wěn)定劑，并可有利地減少了對(duì)肉毒桿菌毒素的免疫應(yīng)答。另外，組合物適合在pH約4.5至約6.3的生理環(huán)境中使用，并因此可具有該pH值。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在室溫下或在冷藏條件下存儲(chǔ)。
下面是本發(fā)明的代表性實(shí)施例。它們展示了功能性肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物跨越皮膚的遞送，而不需要共價(jià)修飾要遞送的神經(jīng)毒素。
實(shí)施例 實(shí)施例1 用Revance肽基載體體內(nèi)運(yùn)輸肉毒桿菌毒素。
該試驗(yàn)展示了相對(duì)于對(duì)照，在單次施用后，使用肽基載體轉(zhuǎn)運(yùn)含有完整的標(biāo)記蛋白質(zhì)肉毒桿菌毒素的大復(fù)合物穿過(guò)完整的皮膚。
主鏈選擇 帶正電荷的主鏈通過(guò)綴合-Gly3Arg7至多聚賴氨酸(MW 112,000)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)與-Gly3Arg7綴合)裝配，該綴合是通過(guò)末端甘氨酸與賴氨酸側(cè)鏈的游離胺結(jié)合。所述經(jīng)修飾的主鏈稱為“KNR”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小且來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治療劑 選擇Botox_商標(biāo)的A型肉毒桿菌毒素(Allergan)用于該試驗(yàn)。它具有約150,000的分子量。
樣品的制備 根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書重構(gòu)肉毒桿菌毒素。將一等分試樣的蛋白質(zhì)用經(jīng)計(jì)算的12-倍摩爾過(guò)量的硫-NHS-LC生物素(Pierce Chemical)進(jìn)行生物素化。標(biāo)記產(chǎn)物稱為“Btox-b”。
在所有情形中，過(guò)量的聚陽(yáng)離子用來(lái)裝配最終的復(fù)合物，所述最終復(fù)合物如在遞送高負(fù)電性的大的核苷酸復(fù)合物時(shí)具有過(guò)量的正電荷。凈中性或凈正電荷防止蛋白質(zhì)復(fù)合物受到高度負(fù)電性細(xì)胞表面蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)的排斥。對(duì)于所有組將Btox-b劑量標(biāo)準(zhǔn)化，同樣對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH值標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品 “JMW-7”組將每等分試樣2.0單位的Btox-b(即總量為20U)和肽基載體KNR以計(jì)算的MW比例4∶1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋成200微升。將得到的組合物與1.8ml Cetaphil_乳劑混合至均勻并等分成200微升的等份。
“JMW-8”組將每等分試樣2.0單位的Btox-b(即總量為20U)和K以計(jì)算的MW比例4∶1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至200微升。將得到的組合物與1.8ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。
用于在用肽基載體和標(biāo)記Btox單次處理后測(cè)定經(jīng)皮膚遞送效率的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 在實(shí)施處理過(guò)程中，將動(dòng)物通過(guò)吸入異氟烷麻醉。在麻醉后，讓C57 black 6小鼠(每組n＝4)接受局部施用定量的200微升劑量的合適治療物，所述治療物施用至頭顱部分的背后面皮膚(選擇此處是因?yàn)樾∈蟛荒苡米旎蛩闹|及該區(qū)域)。動(dòng)物不進(jìn)行脫毛。在初次處理30分鐘后，將小鼠通過(guò)吸入CO2安樂(lè)死，并由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的觀察者獲取完整厚度的受處理的皮膚部分。將受處理部分分成三等份；將頭顱部分固定在10％中性緩沖的福爾馬林中12-16小時(shí)，隨后存儲(chǔ)于70％乙醇中直到進(jìn)行石蠟包埋。將中間部分快速冷凍，將其直接用于由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的觀測(cè)者按下面概述的進(jìn)行生物素顯影。將受處理的近尾部分速凍用于溶解研究。
生物素顯影如下進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將每個(gè)切片浸入NeutrAvidin_緩沖液中1小時(shí)。為了顯影堿性磷酸酶活性，將橫切片在鹽水中洗滌4次，隨后將其浸入NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小時(shí)。隨后將切片在鹽水中沖洗并在具有平面-高度消色透鏡的Nikon E600顯微鏡下對(duì)整體拍照。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 總的陽(yáng)性染色由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的觀測(cè)者采用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)進(jìn)行分批圖像分析測(cè)定，并將其對(duì)總的橫斷面積標(biāo)準(zhǔn)化以測(cè)定每個(gè)切片的百分比陽(yáng)性染色。隨后確定每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中分析95％置信度時(shí)的顯著性。
結(jié)果 在單次局部施用含有KNR的Btox-b(“EB-Btox”)或含有K的Btox-b(“n1”)后，生物素化肉毒桿菌毒素陽(yáng)性的平均橫斷面積報(bào)告為總面積的百分比。結(jié)果在下面的表1中給出并在圖1中說(shuō)明。在圖1中，在用含有Btox-b和肽基載體KNR的“EB-Btox”以及含有Btox-b和聚陽(yáng)離子K的“n1”(作為對(duì)照)每天處理一次處理三天后，確定對(duì)標(biāo)記呈陽(yáng)性的區(qū)域?qū)偯娣e的百分比。描述了每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
表1在單次局部施用含有KNR(JMW-7)或K(JMW-8)的Btox-b 30分鐘后，作為總橫切面的百分比的標(biāo)記肉毒桿菌毒素區(qū)域的平均值和 標(biāo)準(zhǔn)誤差。
P＝0.0001(99％時(shí)的顯著性) 實(shí)施例2 具有肽基載體的局部用肉毒桿菌毒素制劑的治療效果。
實(shí)施例1表明肽基經(jīng)皮膚載體在局部施用于鼠模型的完整皮膚后使得能有效轉(zhuǎn)移肉毒桿菌毒素。然而，該試驗(yàn)未指出復(fù)合蛋白質(zhì)肉毒桿菌毒素在轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)皮膚后是否以功能形式釋放。因此建立下面的實(shí)驗(yàn)用以評(píng)估肉毒桿菌毒素是否可用這種肽基載體(同樣，沒(méi)有共價(jià)修飾該蛋白質(zhì))作為局部用藥劑治療性遞送穿過(guò)完整的皮膚。
帶正電荷的主鏈同樣通過(guò)以18％的飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有18個(gè)與-Gly3Arg7結(jié)合)將-Gly3Arg7綴合至多聚賴氨酸(MW112,000)來(lái)裝配，所述的綴合是通過(guò)末端甘氨酸的羧基與賴氨酸側(cè)鏈的游離胺結(jié)合。所述經(jīng)修飾的主鏈稱為“KNR”。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小且來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。使用與實(shí)施例1中相同的肉毒桿菌毒素治療劑，并以相同的方式制備。樣品如下制備 “JMW-9”組將每等分試樣2.0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為60U)和肽基載體KNR以計(jì)算的MW比例4∶1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至600微升。將得到的組合物與5.4ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。
“JMW-10”組將每等分試樣2.0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為60U)和K以MW比例4∶1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至600微升。將得到的組合物與5.4ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。
“JMW-11”組將無(wú)聚陽(yáng)離子的、每等分試樣2.0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為60U)用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋至600微升。將得到的組合物與5.4ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。
在用肽基載體和肉毒桿菌毒素單次處理后確定治療效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 在實(shí)施處理過(guò)程中，將動(dòng)物通過(guò)吸入異氟烷麻醉。麻醉后，給C57black 6小鼠(每組n＝4)局部施用定量的400微升劑量的適當(dāng)處理物，所述處理物均勻地從腳趾施用至大腿中部。二肢都接受處理，并且處理隨機(jī)地發(fā)生在任一側(cè)。動(dòng)物不用脫毛。初次處理后30分鐘，根據(jù)公開的關(guān)于在施用肉毒桿菌毒素后足的靈活性的足趾外展(digitalabduction)能力打分來(lái)評(píng)估小鼠的足趾外展能力[Aoki，KR.Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20]。也可以主觀地評(píng)價(jià)小鼠的靈活性。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 足趾外展打分由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的兩名觀測(cè)者獨(dú)立地列表顯示。隨后確定每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中分析95％置信度時(shí)的顯著性。
結(jié)果 單次局部施用含有KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”)或無(wú)聚陽(yáng)離子的稀釋劑(“JMW-11”)的肉毒桿菌毒素后的平均足趾外展打分在表2中顯示，并且在下面圖2的代表性顯微照片中舉例說(shuō)明。相對(duì)于兩個(gè)對(duì)照，肽基載體KNR提供了統(tǒng)計(jì)上顯著的對(duì)肉毒桿菌毒素的功能性跨越皮膚遞送，這些試驗(yàn)是彼此可比較的。另外獨(dú)立重復(fù)本試驗(yàn)(全部的三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)都有一致的結(jié)論統(tǒng)計(jì)上顯著的麻痹作用來(lái)自含有KNR的局部用肉毒桿菌毒素而不是對(duì)照)證實(shí)了當(dāng)前的發(fā)現(xiàn)，并顯示在含有或不含K的局部用肉毒桿菌毒素(即兩種對(duì)照)之間無(wú)顯著差別。有趣地是，小鼠一致地移向麻痹的肢體(這在100％受處理的動(dòng)物發(fā)生而0％的來(lái)自任一對(duì)照組的對(duì)照中發(fā)生)。如在圖2中顯示的，用肉毒桿菌毒素加上對(duì)照聚陽(yáng)離子多聚賴氨酸或用無(wú)聚陽(yáng)離子的肉毒桿菌毒素(“僅毒素”)處理的肢可移動(dòng)足趾(作為提起時(shí)的防御機(jī)制)，但是用肉毒桿菌毒素加上肽基載體KNR(“Revance’s肉毒桿菌制劑”)處理的肢不能移動(dòng)。
表2在單次局部施用具有肽基載體KNR的肉毒桿菌毒素(“JMW-9”)、具有對(duì)照聚陽(yáng)離子K的肉毒桿菌毒素(“JMW-10”)或單獨(dú)的肉毒桿 菌毒素后30分鐘的足趾外展打分。
P＝0.0351(95％的顯著性) 結(jié)論 該試驗(yàn)證明了肽基經(jīng)皮膚載體可以跨越皮膚運(yùn)輸治療有效量的肉毒桿菌治療劑而無(wú)需共價(jià)修飾該治療劑。該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了肉毒桿菌毒素在對(duì)照組中局部施用時(shí)不起作用。
實(shí)施例3 具有非肽基載體的局部用肉毒桿菌毒素制劑的治療效果。
該試驗(yàn)證明了本發(fā)明中的非肽基載體的作用。
方法 主鏈選擇 帶正電荷的主鏈通過(guò)以30％飽和度(即每100個(gè)賴氨酸殘基中有30個(gè)與-Gly3Arg7綴合)將-Gly3Arg7綴合至MW 1,000,000的聚乙烯亞胺(PEI)來(lái)裝配，該綴合是通過(guò)末端甘氨酸的羧基與PEI側(cè)鏈的游離胺結(jié)合。所述經(jīng)修飾的主鏈稱為“PEIR”用以表示大的非肽基載體。對(duì)照聚陽(yáng)離子是相同大小且來(lái)自相同批次的未經(jīng)修飾的PEI(稱為“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。使用與實(shí)施例1中相同的肉毒桿菌毒素治療劑。
肉毒桿菌毒素根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書從Botox產(chǎn)品重構(gòu)。在所有情形中，過(guò)量的聚陽(yáng)離子用來(lái)裝配最終的復(fù)合物，所述最終復(fù)合物如在遞送高負(fù)電性的大的核苷酸復(fù)合物時(shí)具有過(guò)量的正電荷。凈中性或凈正電荷防止蛋白質(zhì)復(fù)合物受到高度負(fù)電性細(xì)胞表面蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)的排斥。對(duì)于所有組將肉毒桿菌毒素劑量標(biāo)準(zhǔn)化，同樣對(duì)要局部施用的組合物的總體積和終pH值標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品 “AZ”組將每等分試樣2.0單位的肉毒桿菌毒素(即總共為60U)和超純形式的非肽基載體PEIR以計(jì)算的MW比例5∶1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至600微升。將得到的組合物與5.4mlCetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。
“BA”組將每等分試樣2.0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為60U)和PEI以5∶1配比混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至600微升。將得到的組合物與5.4ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。
確定單次處理后的治療效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 在實(shí)施治療過(guò)程中，將動(dòng)物通過(guò)吸入異氟烷麻醉。麻醉后，給C57black 6小鼠(每組n＝3)局部施用定量的400微升劑量的適當(dāng)處理物，所述處理物均勻地從腳趾施用至大腿中部。二肢都接受處理，并且處理隨機(jī)地發(fā)生在任一側(cè)。動(dòng)物不用脫毛。初次處理后30分鐘，根據(jù)公開的用于在施用肉毒桿菌毒素后足的運(yùn)動(dòng)能力的足趾外展能力打分來(lái)評(píng)估小鼠的足趾外展能力[Aoki，KR.A comparison of the safetymargins of botulinum neurotoxin serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001 Dec；39(12)1815-20]。也可以主觀地評(píng)價(jià)小鼠的靈活性。
數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 足趾外展打分由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的兩名觀測(cè)者獨(dú)立地列表顯示。隨后確定每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Statview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在單向ANOVA重復(fù)測(cè)量中分析95％置信度時(shí)的顯著性。
結(jié)果 在單次局部施用具有超純PEIR的肉毒桿菌毒素(“AZ”)或含有對(duì)照聚陽(yáng)離子PEI的肉毒桿菌毒素(“BA”)后的平均足趾外展打分在表3中顯示，并且重復(fù)試驗(yàn)如表4顯示(對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行單次獨(dú)立的重復(fù))。相對(duì)于對(duì)照，非肽基載體PEIR提供了統(tǒng)計(jì)上顯著的對(duì)肉毒桿菌毒素的功能性跨皮膚遞送。與前面一樣，觀察到動(dòng)物偏向于麻痹的足繞圈行走。
表3在單次局部施用具有超純PEIR的Botox(“AZ”)或含有對(duì)照聚陽(yáng)離子PEI的Botox(“BA”)后30分鐘的足趾外展打分。顯示了平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
P＝0.0002(99％的顯著性) 表4在單次局部施用含有超純PEIR的Botox(“AZ1”)或含有對(duì)照聚陽(yáng)離子PEI的Botox(“BA1”)后40分鐘的足趾外展打分。顯示了平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
P＝0.0001(99％的顯著性) 結(jié)論 該試驗(yàn)證明了非肽基經(jīng)皮膚載體能夠跨越皮膚輸送治療劑量的肉毒桿菌毒素而不需要預(yù)先共價(jià)修飾肉毒桿菌毒素。這些發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了有關(guān)肽基轉(zhuǎn)移劑的那些發(fā)現(xiàn)。對(duì)使用非肽基或肽基載體來(lái)達(dá)到治療效果的選擇將使得能適應(yīng)特定情況、環(huán)境，以及施用方法并增加了本發(fā)明經(jīng)皮膚遞送平臺(tái)的寬度。
實(shí)施例4 具有肽基載體的局部用肉毒桿菌毒素制劑對(duì)前額多汗癥和皺紋的治療 效果 該試驗(yàn)證明可用這種肽基載體將肉毒桿菌毒素作為局部用藥劑治療性遞送穿過(guò)完整皮膚，用于治療人受試者的前額多汗癥和皺紋。
前額多汗癥和皺紋研究的實(shí)驗(yàn)過(guò)程 受試者前額的基線和治療后的照片用具有Nikon TTLMacrospeedlight SB29s閃光燈的Nikon D70照相機(jī)(Nikon，Inc.USA)以藍(lán)色背景拍攝。
受試者前額的基線和治療后的錄像用Sony Digital Handycam可攜式攝影機(jī)以藍(lán)色背景攝像。
用10％局部用聚乙烯吡咯烷酮碘溶液(Walgreen Co.，Deerfield，Illinois)和Kingsford’s 100％玉米淀粉(ACH Food Companies，Inc.，Memphis，Tennessee)進(jìn)行Minor’s淀粉/碘試驗(yàn)用以顯影汗的產(chǎn)生。將受試者前額用無(wú)菌棉球涂上碘溶液(Johnson & Johnson ConsumerProduct Company，Skiilman，New Jersey)，并隨后讓其完全干燥。用無(wú)菌棉球?qū)⒌矸圯p輕地涂于該區(qū)域。在環(huán)境室溫下通過(guò)體力活動(dòng)引起出汗。當(dāng)汗溶解了碘并與淀粉反應(yīng)后深藍(lán)-黑斑出現(xiàn)。碘-淀粉試驗(yàn)的基線和治療后的照片用具有Nikon TTL Macro-speedlight SB29s閃光燈的Nikon D70照相機(jī)以藍(lán)色背景拍攝。將受試者前額用70％EtOH并隨后用去離子水清潔。
受試者前額上的預(yù)定治療區(qū)域在處理進(jìn)行前通過(guò)用于角質(zhì)層的非損傷性膠帶剝離方法處理。將預(yù)切割的膠帶用強(qiáng)的壓力施加于治療區(qū)域數(shù)秒鐘。通過(guò)拉扯膠帶的一角迅速除去膠帶。在除去第一張膠帶后立即小心地將第二張膠帶施加在相同區(qū)域。重復(fù)膠帶-剝離3-5次。
治療準(zhǔn)備 制備無(wú)菌0.9％氯化鈉(Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois)加上5％EtOH加上5％標(biāo)為A-3C的短鏈聚天冬氨酸溶液(Donlar BioPolymer，Inc.Bedford Park，Illinois)的Botox重構(gòu)溶液(即，對(duì)于每1.0毫升溶液，有900微升無(wú)菌0.9％氯化鈉加上50微升100％EtOH加上50微升短鏈聚天冬氨酸溶液)。用0.9％氯化鈉加上5％EtOH制備1毫克/毫升濃度的Kn21T(即，將500微升的Kn21T等分并加上25微升的100％EtOH)。如在此使用的，Kn21T指分子量為21,000并具有TAT分支基團(tuán)的帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈。采用無(wú)菌3ml具有18G11/2的無(wú)乳膠注射器(Becton Dickinson& Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)，用1.0毫升重構(gòu)溶液重構(gòu)100單位的Botox(Allergan，Irvine，CA)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)8次仔細(xì)混合該重構(gòu)的Botox。將200單位的Botox用于每個(gè)受試者。Revance’s肉毒桿菌制劑用200單位的Botox和Kn21T加上5％EtOH制備(即將2.0毫升的Botox加入至500微升Kn21T加25微升100％EtOH中)，并置于室溫下5分鐘用于使復(fù)合物形成。
對(duì)照溶液用重構(gòu)溶液和Kn21T加上5％EtOH制備(即將2.0毫升重構(gòu)溶液加入至500微升Kn21T加25微升100％EtOH中)，并保持在室溫下。
處理施用 受試者斜躺在臺(tái)子上，用防護(hù)罩遮蓋眼、面和上身。將治療劑用吸管均勻地施用至受試者前額，并用戴有無(wú)粉丁腈手套的手指進(jìn)行圓周運(yùn)動(dòng)將其按摩進(jìn)皮膚。將治療區(qū)域用一薄層Cetaphil_保濕霜(Galderma，F(xiàn)ort Worth，TX)覆蓋并孵育60分鐘。孵育60分鐘后，用無(wú)菌網(wǎng)墊除去治療劑。將網(wǎng)墊和手套棄于生物危害品袋中。
結(jié)果 圖3描述了在用肽基載體和肉毒桿菌組合物局部處理后皺紋長(zhǎng)度深度以及寬度顯著減小。該試驗(yàn)證實(shí)了局部施用肉毒桿菌毒素(當(dāng)與經(jīng)皮膚載體組合時(shí))能產(chǎn)生顯著的肌肉麻痹而產(chǎn)生美容效果。圖4是受處理皮膚(A)對(duì)未受處理的皮膚(B)的Mikrosil印跡。在未受處理皮膚的模型上皺紋是明顯的。
圖5和6顯示了Minor’s淀粉/碘試驗(yàn)的結(jié)果。圖5顯示了在施用后2分鐘拍攝的照片，圖(A)對(duì)應(yīng)用Revance’s肉毒桿菌制劑處理的一側(cè)，而圖(B)對(duì)應(yīng)用只含有Kn21T載體的對(duì)照制劑處理的一側(cè)。圖6與圖5一樣，除了它是在4分鐘時(shí)拍攝之外。注意到在對(duì)照制劑的一側(cè)面上更顯著的著色，表明這一側(cè)面的皮膚分泌更多的汗。還注意到在未受處理的一側(cè)出汗開始更早。
結(jié)論 該實(shí)施例證明了局部施用肉毒桿菌毒素的復(fù)合物能在減少細(xì)微的和粗的皺紋方面產(chǎn)生顯著的美容效果。這種跨上皮作用進(jìn)一步證實(shí)肌肉麻痹可在局部施用肉毒桿菌毒素復(fù)合物(例如在這里公開的那些)后用合適的載體完成。該實(shí)施例因而表明，局部施用肉毒桿菌毒素可導(dǎo)致減輕肌肉痙攣例如臉痙攣或斜頸，以及減輕肌肉痙攣相關(guān)的疼痛例如背下部疼痛。
實(shí)施例5 含有肽基載體的局部用肉毒桿菌毒素制劑對(duì)腋下多汗癥的治療效果 該試驗(yàn)證明是否可以用這種肽基載體將肉毒桿菌毒素作為局部用藥劑治療性遞送穿過(guò)完整皮膚，用于治療人受試者的腋下多汗癥(每組n＝10個(gè)腋窩，每個(gè)患者有一個(gè)腋窩經(jīng)處理而一個(gè)作為對(duì)照，以隨機(jī)雙盲的方式進(jìn)行)。
腋下多汗癥研究的選擇標(biāo)準(zhǔn) ●年齡18歲或更大 ●健康自愿受試者 ●給于知情同意書并由自愿者簽名 ●受試者愿意遵循指導(dǎo)并返回進(jìn)行隨訪。
●受試者表現(xiàn)先前存在的、主觀性多汗癥 ●受試者不是懷孕的或不打算在接下來(lái)的3個(gè)月懷孕。
●受試者在舊金山或在研究地區(qū)附近生活和/或工作。
●受試者在過(guò)去6個(gè)月內(nèi)未曾治療腋下出汗。
●受試者在接下來(lái)的3個(gè)月內(nèi)不打算治療腋下出汗。
重量測(cè)量步驟 作為重量測(cè)量步驟的一部分，首先讓受試者適應(yīng)試驗(yàn)地區(qū)。具體而言，每個(gè)受試者在72-77_的室溫下以休息體位坐15分鐘。
腋窩準(zhǔn)備(對(duì)于接下來(lái)的步驟，戴上無(wú)粉丁腈手套)將受試者換穿上一次性使用的披肩和乳罩(如果是女人)或脫掉所有上身衣服(如果是男人)以便充分暴露兩腋。用藥區(qū)域預(yù)先確定為每側(cè)腋窩上由帶有毛發(fā)的皮膚覆蓋的區(qū)域，加上該含有毛發(fā)的皮膚向外擴(kuò)展1cm的區(qū)域。將用藥區(qū)域用取自50ml錐形管的預(yù)先弄濕的無(wú)菌網(wǎng)墊清潔，所述的清潔通過(guò)用該紗網(wǎng)的一側(cè)以相同方向從頂端到底端進(jìn)行5次長(zhǎng)的擦拭。用潔凈的預(yù)先弄濕的網(wǎng)墊再重復(fù)該步驟三次，同時(shí)每一次都小心不刺激或擦破皮膚。將網(wǎng)墊棄于垃圾中。對(duì)于其它腋窩，重復(fù)相同的清洗步驟。通過(guò)從腋窩頂部至底部使用用力的擠拍動(dòng)作用干的無(wú)菌紗布干燥腋窩，同時(shí)小心不刺激或擦破皮膚。然后，通過(guò)將濾紙置于腋窩折縫下并讓該濾紙?zhí)幱谠囼?yàn)點(diǎn)5分鐘來(lái)進(jìn)一步干燥腋窩，之后進(jìn)行重量評(píng)估步驟。讓患者坐著，他們的手臂以休息體位緊靠著他的/她的軀體。將濾紙棄于垃圾中。讓受試者休息1分鐘，在第一次重量評(píng)估之前不進(jìn)行腋窩操作。
出汗量測(cè)量(重量測(cè)量)(在這些測(cè)量之前戴上一對(duì)新的無(wú)粉丁腈手套)。受試者舉起他的或她的雙手合于腦后以便完全暴露腋窩，同時(shí)部分傾斜(約45度)。從錐形存儲(chǔ)管中取出一張預(yù)先稱重的濾紙并放置于受試者的腋下，使濾紙的頂端與腋窩折痕線中心對(duì)齊。用手指將濾紙保持在原處，同時(shí)受試者放松手臂至身體一側(cè)。受試者坐著，讓雙臂緊緊地貼著他的/她的軀干5分鐘。當(dāng)濾紙牢固地處于兩側(cè)腋下時(shí)開始計(jì)時(shí)。同時(shí)測(cè)量?jī)蓚?cè)腋窩。5分鐘后，將濾紙從腋窩移出并放回原來(lái)各自的錐形管中。首先移出最先放置的濾紙。擰緊錐形管的蓋以防止汗從管中蒸發(fā)。以1分鐘時(shí)間間隔再重復(fù)兩次獲得汗液。
Minor’s淀粉/碘試驗(yàn) 受試者舉起他的/她的雙手合于腦后以便完全暴露腋窩。將碘溶液如先前描述的用無(wú)菌紗墊涂于預(yù)先確定的腋窩區(qū)域并讓其自然干燥。當(dāng)?shù)馔耆稍飼r(shí)，將很薄一層淀粉用棉球涂在碘覆蓋的區(qū)域上。在施用淀粉前讓碘風(fēng)干以便減少假陽(yáng)性和背景。受試者隨后坐著，雙臂緊緊地貼著他的/她的軀干。5分鐘后，受試者舉起他的/她的雙臂并將雙手合于腦后以便充分暴露腋窩。獲得每側(cè)腋窩的照片，照片上明確標(biāo)出左腋和右腋以及日期。將腋窩用70％EtOH并隨后用無(wú)菌去離子水清洗。
處理劑準(zhǔn)備 用鹽水加上5％EtOH制備1毫克/毫升濃度的Kn21pr(即，將500微升的Kn21pr加上25微升100％EtOH)。如在此使用的，Kn21pr指分子量為21,000并具有分支基團(tuán)(包含受保護(hù)的寡聚精氨酸)的帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈。使用無(wú)菌的具有18G11/2的3ml無(wú)乳膠注射器(Becton Dickinson and Company，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)，用0.75毫升0.9％氯化鈉(Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois)重構(gòu)100單位的Botox_(Allergan，Irvine，CA)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)8次仔細(xì)混合該重構(gòu)的Botox_。將200單位的Botox_用于每位受試者。處理溶液用200單位的Botox_和Kn21pr加上5％EtOH制備(即將1.5毫升的Botox_加入至500微升Kn21pr加上25微升100％EtOH)并在室溫下保持5分鐘以使復(fù)合物形成。在5分鐘孵育期后，加入約1.0毫升4％的HPC(羥丙基纖維素)(含有1％EtOH)并用小金屬調(diào)藥刀輕輕地徹底混合。將均質(zhì)的治療劑溶液轉(zhuǎn)移至3ml注射器中并蓋上注射器頂端蓋。(Becton Dickinson and Company，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)。
對(duì)照溶液用0.9％氯化鈉和Kn21pr加上5％EtOH制備(即將1.5毫升0.9％氯化鈉加入至500微升Kn21pr加上25微升100％的EtOH中)并置于室溫下5分鐘。孵育后，加入約1.0毫升4％的HPC(含有1％EtOH)并用小型金屬調(diào)藥刀將其輕輕地徹底混合。將均質(zhì)的對(duì)照溶液轉(zhuǎn)移至3ml注射器并蓋上注射器頂端蓋。
處理溶液施用(戴上無(wú)粉丁腈手套) 受試者合上他的/她的雙手手指互扣并置于腦后以便充分暴露受試者的腋窩。然后，受試者以約45度的角度斜躺在椅子上。如圖7中顯示的，直觀地標(biāo)出了用藥區(qū)域(即超出含有毛發(fā)的皮膚1cm)用于施用。檢查用藥區(qū)域的干燥性。將注射器頂端蓋從貼有標(biāo)簽的注射器(“L”表示左側(cè)，“R”表示右側(cè))移除，并準(zhǔn)備用于施用至患者的腋窩上。將處理溶液用注射器均勻地分散在用藥區(qū)域并將其用手指將其按摩進(jìn)皮膚1分鐘。然后，受試者將他的/她的雙臂沿著身體一側(cè)放下并孵育60分鐘。孵育60分鐘后，用無(wú)菌網(wǎng)墊除去處理物。將網(wǎng)墊和手套棄于生物危害品袋中。允許受試者離開。
結(jié)果 Revance’s局部用肉毒桿菌制劑減少了65％的出汗(P＝0.0137)。圖8a顯示在單獨(dú)用Kn21pr主鏈(對(duì)照)或用Kn21pr主鏈加上200UBotox處理4周后(隨機(jī)選擇邊)的汗量的比較(與基線的比率)。統(tǒng)計(jì)分析用NPSS(P是如標(biāo)明的，以及P＜0.05時(shí)的顯著性)通過(guò)魏克森訊號(hào)等級(jí)檢定(wilcoxon signed ranks)完成。[n＝10個(gè)受試者]。
第二次比較圖8b顯示了在基線和在4周時(shí)比較的治療劑與對(duì)照的比。該圖顯示在單獨(dú)用kn21pr主鏈(對(duì)照)或用kn21pr主鏈加上200 U Botox處理腋窩(隨機(jī)選擇邊)4周后的出汗量(mg/5分鐘)(處理與對(duì)照的比率)。統(tǒng)計(jì)分析用NPSS(P是如標(biāo)明的，以及P＜0.05時(shí)的顯著性)通過(guò)魏克森訊號(hào)等級(jí)檢定完成。(P＝0.0195)(Pr Tp＝0.0217)[n＝10]。
圖9顯示了描述用Revance’s肉毒桿菌制劑局部處理來(lái)治療腋下多汗癥之前和之后的Minor’s淀粉/碘試驗(yàn)的照片。顯示了在基線和2周時(shí)的淀粉/碘試驗(yàn)，其中對(duì)于受試者#12，右側(cè)腋窩用Revance’s肉毒桿菌制劑處理(a和c)而左側(cè)腋窩用對(duì)照處理(b和d)。這些照片說(shuō)明了在淀粉碘試驗(yàn)中用載體+botox處理后觀察到的典型的好處。盡管在對(duì)照側(cè)觀察到一些交叉(與重量測(cè)量數(shù)據(jù)25％的減少一致)，但是處理引起了顯著減少(與受處理一側(cè)重量測(cè)量數(shù)據(jù)65％的減少一致)。
結(jié)論 該實(shí)施例證實(shí)了局部施用根據(jù)在此公開的本發(fā)明而形成的肉毒桿菌復(fù)合物在減少一群患有多汗癥(主觀的或定量的)的患者出汗方面容易產(chǎn)生治療效果。當(dāng)與手套組合以限制制劑在停留期間擴(kuò)展時(shí)，這種減少出汗方面的效果也已經(jīng)在上面介紹的前額案例中以及在手掌/足底應(yīng)用中獲得。這種經(jīng)上皮遞送肉毒桿菌毒素復(fù)合物來(lái)獲得治療效果進(jìn)一步證實(shí)了該方法可以延伸到其中NSAP功能或乙酰膽堿信號(hào)至關(guān)重要的其它病例，例如膀胱功能障礙或痙攣、胃腸應(yīng)用，或者用于皮脂腺分泌來(lái)減少臭味或痤瘡的預(yù)防/治療。
實(shí)施例6 Wipe-on Revance’s肉毒桿菌制劑的預(yù)試驗(yàn) 目的 在鼠模型中測(cè)定wipe-on Dysport的運(yùn)輸效力和肽基經(jīng)皮膚載體(主鏈)的性能。
方法 試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用重19-20g的C57BL/6雌性小鼠(Charles River，Wilmington，MA)。將動(dòng)物用異氟烷麻醉并在小鼠的后肢上局部施用“Revance Dysport溶液劑”(表5)。恢復(fù)后，用足趾外展打分(DAS)值給后肢肌弱化打分。
表5.試驗(yàn)化合物和肽基經(jīng)皮膚載體(主鏈)的描述。
試驗(yàn)化合物制備制備無(wú)菌0.9％氯化鈉的Dysport重構(gòu)溶液(Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois)。主鏈用0.9％氯化鈉以1毫克/毫升的濃度制備。使用無(wú)菌的具有18G11/2的3m1無(wú)乳膠注射器(Becton Dickinson & Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，NewJersey)，用2.5毫升重構(gòu)溶液重構(gòu)500單位的Dysport(Ipsen)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)8次仔細(xì)混合該重構(gòu)的Dysport。Revance’s肉毒桿菌制劑用30單位的Dysport和主鏈(即將150微升的Dysport加入至75微升的Revance載體中)在微量離心管中制備，并置于室溫下5分鐘用于使復(fù)合物形成。
局部施用將動(dòng)物用混合有氧的1.5％異氟烷麻醉并隨后腹膜內(nèi)注射0.05ml的嚙齒動(dòng)物麻醉混合物(3.75ml 100mg/ml氯胺酮、3.00ml 20mg/ml賽拉嗪以及23.25ml鹽水)。麻醉后，將C57BL/6雌性小鼠(每組n＝3)隨機(jī)分組并準(zhǔn)備接受治療。讓動(dòng)物接受三次丙酮-膠帶剝離處理。用吸管將“Revance Dysport溶液劑”施用于后肢上并戴上丁腈手套將其按摩進(jìn)皮膚中。讓動(dòng)物在控制溫度的環(huán)境下恢復(fù)以防止體溫過(guò)低。記錄基線和治療后的照片、動(dòng)物恢復(fù)的錄像以及足趾外展打分(DAS)值。
統(tǒng)計(jì)分析 隨后用Statview_軟件(Abacus Concepts，Berkeley，CA)測(cè)定每組的統(tǒng)計(jì)分析并表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。所有比較的統(tǒng)計(jì)顯著性以采用單因子ANOVA重復(fù)測(cè)量和Fisher PLSD post-hoc檢驗(yàn)在95％的置信度下測(cè)定。
結(jié)果 足靈活性打分用DAS值列表顯示，其中打分為0表示正常的足趾外展(沒(méi)有肌減弱)而打分為4表示足趾外展的最大減少(最大的肌弱化)[Aoki，K.R.A Comparison of the Safety Margins of BotulinumNeurotoxin Serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001；391815-1820]。
統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)三次不同的比較測(cè)定并且結(jié)果在表6-8中顯示。平均DAS值顯示在單次局部施用“Revance Dys port溶液劑”后治療組和對(duì)照之間統(tǒng)計(jì)上顯著的肌弱化/麻痹。表6顯示相對(duì)于對(duì)照每組由局部用Dysport產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)上顯著的麻痹(P＝0.0001)，而表7詳細(xì)描述了相對(duì)于對(duì)照所有處理組在統(tǒng)計(jì)上顯著的麻痹(P＝0.0013)。表8詳細(xì)描述了在組之間以及相對(duì)于對(duì)照，用制劑1或2處理的組在統(tǒng)計(jì)上顯著的麻痹(P＝0.0024)。
在恢復(fù)后，觀察到動(dòng)物偏向于麻痹的肢繞圈行走。
表6.足的靈活性打分-DAS值。列出了在處理后30分鐘每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
P＝0.0001(95％的顯著性) 表7.足的靈活性打分-DAS值。列出了對(duì)照和所有治療組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
P＝0.0013(95％的顯著性) 表8.足的靈活性打分-DAS值。列出了相對(duì)于對(duì)照施用制劑1或2的處理組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
P＝0.0024(95％的顯著性) 結(jié)論 該試驗(yàn)用于證明肽基經(jīng)皮膚載體可以跨越皮膚運(yùn)輸治療有效量的Dysport肉毒桿菌治療劑而無(wú)需共價(jià)修飾該治療劑。
實(shí)施例7 在小鼠后足模型中通過(guò)局部用肉毒桿菌毒素對(duì)出汗的抑制 目的 在鼠模型中確定通過(guò)局部施用含有肽基載體的肉毒桿菌毒素(Revance’s肉毒桿菌制劑)對(duì)出汗的抑制。
方法 試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用重19-21g的雌性C57BL/6小鼠(Charles River，Wilmington，MA)。將動(dòng)物用混合有氧的1.5％異氟烷麻醉并在該試驗(yàn)期間保持麻醉。將Botox以每條小鼠足2單位的劑量局部施用(表9)。通過(guò)膽堿能藥物毛果蕓香堿誘導(dǎo)出汗。[Kaszynski，E和FrischSB.Mouse Foot Screen for the Inhibition of Sweating byAnticholinergic Drugs.(1974)Journal of InvestigativeDermatology，62510-513]。用Minor’s淀粉-碘試驗(yàn)使汗顯影。
表9試驗(yàn)化合物和肽基經(jīng)皮膚載體(主鏈)的描述。
試驗(yàn)化合物制備毛果蕓香堿溶液劑(Sigma Aldrich，Cat No.P0472)在注射前24小時(shí)制備。毛果蕓香堿溶液劑用0.9％氯化鈉以1毫克/毫升的濃度制備并通過(guò)渦旋2分鐘充分混合。將該毛果蕓香堿溶液劑采用PURADISC 25 TF一次性過(guò)濾裝置(Whatman，25mm Dia.Catalog No.6784-2504)過(guò)濾滅菌，并用一大注射器注射進(jìn)無(wú)菌小瓶中。然后，將該溶液用箔封蓋。制備在70％乙醇中的2％碘溶液(SigmaAldrich，Cat No.266426)并通過(guò)渦旋充分混合。隨后將該碘溶液超聲處理15分鐘然后再次渦旋攪拌。主鏈用去離子水以1毫克/毫升的濃度制備。采用無(wú)菌的具有18G11/2的3ml無(wú)乳膠注射器(BectonDickinson & Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)，用1.0毫升0.9％的氯化鈉重構(gòu)100單位的Botox(Allergan，Irvine，CA)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)8次仔細(xì)混合該重構(gòu)的Botox。治療劑溶液用7單位的Botox和主鏈(即將70微升的Botox加入至35微升的KNR或KNT中并用35微升的PBS稀釋)在微型離心管中制備，并將其置于室溫下5分鐘用于使復(fù)合物形成。對(duì)照溶液用Botox和PBS制備(即將70微升的Botox加入至70微升的PBS中)。
局部施用將動(dòng)物用混合有氧的1.5％異氟烷麻醉并隨后腹膜內(nèi)注射0.07ml嚙齒動(dòng)物麻醉混合物(3.75ml 100mg/ml氯胺酮、3.00ml 20mg/ml賽拉嗪以及23.25ml的鹽水)，并且根據(jù)需要補(bǔ)充異氟烷。在麻醉后，將C57BL/6雌性小鼠(每組n＝6)隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組。將20微升的處理溶液或?qū)φ杖芤菏┯弥林付ǖ暮笞?。將足底部用該溶液完全且充足地涂布。吸管尖用于施用試?yàn)溶液的薄的均勻涂層至足部。讓動(dòng)物在控制溫度的環(huán)境下恢復(fù)以防止體溫過(guò)低。將溶液用熱燈完全干燥2分鐘，然后風(fēng)干5分鐘。隨后將后足用約50微升的Cetaphil乳劑涂布。
淀粉-碘試驗(yàn)進(jìn)行Minors淀粉碘試驗(yàn)以便使在基線時(shí)和在處理后1周時(shí)的出汗分布顯影。在通過(guò)將后肢浸入2％碘溶液中來(lái)施用碘溶液之前，動(dòng)物保持完全麻醉(具有穩(wěn)定的生命體征)10分鐘。將碘溶液用熱燈完全干燥3分鐘，然后風(fēng)干5分鐘。隨后用戴有無(wú)粉手套的手指將淀粉粉末用力擦入施用。用小的漆刷除去過(guò)量的淀粉粉末，并然后用致密絲絨墊松散地涂敷淀粉粉末以增強(qiáng)均勻度。在毛果蕓香堿注射后10、20和60分鐘記錄基線和處理后的照片。
結(jié)果 動(dòng)物的足部汗液通過(guò)Minor′s淀粉碘試驗(yàn)顯影。汗通過(guò)藍(lán)-黑色著色指示。[Kuttner，C等，Treatment of Gus tatory Sweating withBotulinum toxin A.(2001)Tnt Poster J Dent Oral Med.3；3poster82]。
藍(lán)-黑色陽(yáng)性斑點(diǎn)通常在毛果蕓香堿注射后50-60分鐘最好觀察。淀粉-碘試驗(yàn)顯示如在圖10a-d中的代表性照片中顯示的，治療組具有比對(duì)照明顯少的藍(lán)-黑色陽(yáng)性斑點(diǎn)。
實(shí)施例8 在局部施用Revance’s肉毒桿菌制劑后對(duì)肌力產(chǎn)生的評(píng)估 目的 通過(guò)鼠模型中肌收縮力產(chǎn)生來(lái)評(píng)估局部施用B型肉毒桿菌毒素后的神經(jīng)肌肉阻滯效果。
方法 試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用重27-33g的雄性CD1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)。將小鼠按5只每組分組圈養(yǎng)并在處理之前允許隨意攝取食物和水。將動(dòng)物用混合有氧的1.5％異氟烷麻醉并在該試驗(yàn)期間保持麻醉。將每只小鼠后肢的用藥位置用Andis Edjer II無(wú)線可再充電的修剪器(Andis，Sturtevant，WI)仔細(xì)刮干凈。將Dysport以每只小鼠肢25個(gè)單位的劑量局部施用。將未處理的正常小鼠，以及用基礎(chǔ)制劑(無(wú)毒素)以等效量局部施用處理的那些小鼠作為對(duì)照。肌收縮力在局部施用后2-3.5小時(shí)測(cè)量。
試驗(yàn)化合物的制備制備含有5％EtOH和5％聚天冬氨酸溶液的無(wú)菌0.9％氯化鈉的Dysport重構(gòu)溶液劑(Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois)。主鏈用0.9％氯化鈉以1毫克/毫升的濃度制備。采用無(wú)菌的具有18G11/2的3ml無(wú)乳膠注射器(BectonDickinson & Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)，用2.5毫升重構(gòu)溶液重構(gòu)500單位的Dysport(Ipsen)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)8次仔細(xì)混合該重構(gòu)的Dysport。Revance’s肉毒桿菌制劑用25單位的Dysport和主鏈在微量離心管中制備(即將125微升的Dysport加入至62.5微升基于上面先前試驗(yàn)的短的肽基主鏈中)，并置于室溫下5分鐘用于使復(fù)合物形成(n＝2只動(dòng)物存活)。對(duì)照只使用鹽水作為活性劑(n＝4只動(dòng)物)。
局部施用用吸管將對(duì)照或Revance’s肉毒桿菌制劑施用于后肢上并戴上丁腈手套將其按摩進(jìn)皮膚中。將Dysport和主鏈在4℃下存儲(chǔ)。在控制溫度的環(huán)境下培養(yǎng)動(dòng)物以防止體溫過(guò)低。肌收縮力在局部施用后2-3.5小時(shí)測(cè)量。
肌收縮力的產(chǎn)生將肢通過(guò)用基爾希納鋼絲(K-wires)穿過(guò)股骨和脛骨將其綁在木桌上以防止運(yùn)動(dòng)而固定。腓腸肌保持在原位。在跟骨腱的遠(yuǎn)端周圍綁上一金屬縫線。隨后將該腱在縫線遠(yuǎn)側(cè)橫切，并且將縫線連接至力傳感器(model FTO3，Grass，West Warwick，RI)，傳感器隨后連接至力傳感器放大器(model 13-G4615-50，Gould，Cleveland，OH)。將來(lái)自用Dysport處理的一側(cè)的坐骨神經(jīng)用遞增的電壓直接刺激(SD9刺激器，Grass，West Warwick，RI)直到獲得最大的等大單收縮力。隨后增加刺激頻率直到產(chǎn)生最大的強(qiáng)直性張力。顫搐通過(guò)刺激一個(gè)運(yùn)動(dòng)單位產(chǎn)生，而肌強(qiáng)直通過(guò)超高級(jí)刺激所有運(yùn)動(dòng)單位的積累產(chǎn)生。在對(duì)照肢上重復(fù)相同的步驟。用連接至力傳感器的標(biāo)刻度的記錄振動(dòng)器(RS 3800，Gould，Cleveland，OH)記錄反應(yīng)。[Ma J、Elsaidi GA、Smith TL等，Time course of recovery of juvenileskeletal muscle after botulinum toxin A injection.Am.J.Phys.Med.Rehabil.2004；83(10)774-780]。
結(jié)果 在先前的注射A型肉毒桿菌毒素的試驗(yàn)中，C57BL/6小鼠產(chǎn)生的肌力正常值具有60±15克的平均單收縮力和240±30克的平均肌強(qiáng)直力。在該先導(dǎo)性臨床前試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)?4±2克的平均單收縮力和241±20克的平均肌強(qiáng)直力。
當(dāng)評(píng)估含有Kn21Pr的局部用Dysport產(chǎn)生的肌力時(shí)，單次施用具有Kn21Pr的局部用Revance’s肉毒桿菌毒素制劑處理的動(dòng)物相對(duì)于用對(duì)照處理的動(dòng)物在記錄上顯示沒(méi)有反應(yīng)，該反應(yīng)導(dǎo)致單次收縮和強(qiáng)直反應(yīng)約100％的降低，而在單次施用具有KnT的局部用Revance’s肉毒桿菌毒素制劑處理的動(dòng)物相對(duì)于用對(duì)照處理的動(dòng)物，肌肉力產(chǎn)生顯示下限單次收縮降低約58％而強(qiáng)直力降低約61％。表10和11分別顯示了關(guān)于單收縮試驗(yàn)和肌強(qiáng)直試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
表10.肌力產(chǎn)生-單收縮試驗(yàn)。列出了處理組和對(duì)照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
*下限 表11.肌力產(chǎn)生-肌強(qiáng)直試驗(yàn)。列出了處理組和對(duì)照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
*下限 結(jié)論 該研究用于證明以每小鼠肢25個(gè)單位局部施用Dysport可有效降低運(yùn)動(dòng)力的產(chǎn)生并顯示了對(duì)治療效果的證明。
實(shí)施例9 在局部施用Revance’s肉毒桿菌制劑后對(duì)肌力產(chǎn)生的評(píng)估 目的 通過(guò)鼠模型中肌收縮力產(chǎn)生來(lái)評(píng)估局部施用A型肉毒桿菌毒素后的神經(jīng)肌肉阻滯效果。
方法 試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用重27-33g的雄性CD1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)。將小鼠按5只每組分組圈養(yǎng)并在處理之前允許隨意攝取食物和水。將動(dòng)物用混合有氧的1.5％異氟烷麻醉并在該試驗(yàn)期間內(nèi)保持麻醉。將每只小鼠后肢的用藥位置用Andis Edjer II無(wú)線可再充電的修剪器(Andis，Sturtevant，WI)仔細(xì)刮干凈。將Botox以每小鼠肢10個(gè)單位的劑量局部施用。將未處理的正常小鼠，以及用基礎(chǔ)制劑(無(wú)毒素)以等效量局部施用處理的那些小鼠作為對(duì)照。肌收縮力在局部施用后2-3.5小時(shí)測(cè)量。
試驗(yàn)化合物制備制備含有5％EtOH和5％聚天冬氨酸溶液的無(wú)菌0.9％氯化鈉的Botox重構(gòu)溶液(Abbott Laboratories，NorthChicago，Illinois)。主鏈用0.9％氯化鈉以1毫克/毫升的濃度制備。采用無(wú)菌的具有18G11/2的3ml無(wú)乳膠注射器(Becton Dickinson& Co.，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey)，用1.0毫升重構(gòu)溶液重構(gòu)100單位的Botox(Allergan，Irvine，CA)。通過(guò)倒轉(zhuǎn)8次仔細(xì)混合該重構(gòu)的Botox?！癛evance Botox溶液劑”用10單位的Botox和主鏈在微量離心管中制備(即將100微升的Botox加入至50微升基于上面先前試驗(yàn)的短的肽基主鏈中)，并置于室溫下5分鐘用于使復(fù)合物形成(n＝2只動(dòng)物存活)。對(duì)照只使用鹽水作為活性劑(n＝4只動(dòng)物)。
步驟用吸管將對(duì)照或“Revance Botox溶液劑”施用于后肢上并戴上丁腈手套將其按摩進(jìn)皮膚中。將Botox和主鏈在4℃下存儲(chǔ)。在控制溫度的環(huán)境下培養(yǎng)動(dòng)物以防止體溫過(guò)低。肌收縮力在局部施用后2-3.5小時(shí)測(cè)量。
肌收縮力產(chǎn)生將肢通過(guò)用基爾希納鋼絲穿過(guò)股骨和脛骨將其綁在木桌上以防止運(yùn)動(dòng)而固定。腓腸肌保持在原位。在跟骨腱的遠(yuǎn)端周圍綁上一金屬縫線。隨后將該腱在縫線遠(yuǎn)側(cè)橫切，并且將縫線連接至力傳感器(model FTO3，Grass，West Warwick，RI)，傳感器隨后連接至力傳感器放大器(model 13-G4615-50，Gould，Cleveland，OH)。將來(lái)自用Botox處理的一側(cè)的坐骨神經(jīng)用遞增的電壓直接刺激(SD9刺激器，Grass，West Warwick，RI)直到獲得最大的等大單收縮力。隨后增加刺激頻率直到產(chǎn)生最大的強(qiáng)直性張力。顫搐通過(guò)刺激一個(gè)運(yùn)動(dòng)單位產(chǎn)生，而肌強(qiáng)直通過(guò)超高級(jí)刺激所有運(yùn)動(dòng)單位的積累產(chǎn)生。在對(duì)照肢上重復(fù)相同的步驟。用連接至力傳感器的標(biāo)刻度的記錄振動(dòng)器(RS 3800，Gould，Clevel and，OH)記錄反應(yīng)。[Ma J，ElsaidiGA，Smith TL等，Time course of recovery of juvenile skeletalmuscle after botulinum toxin A injection.Am.J.Phys.Med.Rehabil.2004；83(10)774-780]。
結(jié)果 如在此進(jìn)行的，C57BL/6小鼠產(chǎn)生的肌力正常值是60±15克的平均單收縮力和240±30克的平均肌強(qiáng)直力。在該探索性臨床前試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)?4±2克的平均單收縮力和241±20克的平均肌強(qiáng)直力。
當(dāng)評(píng)估含有Kn21Pr的局部用Botox產(chǎn)生的肌力時(shí)，單次施用具有Kn21Pr的局部用“Revance Botox溶液劑”處理的動(dòng)物相對(duì)于用對(duì)照處理的動(dòng)物在記錄上(圖11)顯示沒(méi)有反應(yīng)，該反應(yīng)導(dǎo)致單次收縮和強(qiáng)直反應(yīng)約100％的降低，而在單次施用具有KNP的局部用“RevanceBotox溶液劑”處理的動(dòng)物相對(duì)于用對(duì)照處理的動(dòng)物，肌力產(chǎn)生顯示下限單次收縮降低約90％而強(qiáng)直力降低約100％(無(wú)反應(yīng))。表12分別顯示了關(guān)于單收縮試驗(yàn)和肌強(qiáng)直試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。表13顯示了平均的肌力產(chǎn)生和單收縮力及肌強(qiáng)直力降低的百分比的總結(jié)。
表12肌力產(chǎn)生-肌強(qiáng)直試驗(yàn)。列出了處理組和對(duì)照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
*下限 表13對(duì)實(shí)施例8和9的肌力產(chǎn)生試驗(yàn)的總結(jié)。列出了處理組和對(duì)照的平均值和％降低。
*下限 結(jié)論 該試驗(yàn)用以證明以每小鼠肢25個(gè)單位局部施用Dysport以及以每小鼠肢10個(gè)單位局部施用Botox都可有效地減少運(yùn)動(dòng)力產(chǎn)生，并顯示了對(duì)治療效果的證明。
實(shí)施例10 體外載體-介導(dǎo)的A型肉毒桿菌毒素穿越豬皮膚的經(jīng)皮膚遞送-Pt.1流通分析 目的 評(píng)估我們的載體在遞送A型肉毒桿菌毒素(BoNTA)跨越皮膚屏障中的效力。
方法 生物素化毒素將10微克A型肉毒桿菌毒素(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)再懸浮于100微升pH 7.4的PBS。加入20倍摩爾過(guò)量的硫-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)，并使反應(yīng)體積達(dá)到1毫升。將反應(yīng)物在室溫下孵育1小時(shí)，并用10 KMWCO Slide-A-Lyzer Dialysis Casette(Pierce，Campbell，CA)對(duì)PBS透析過(guò)夜。
獲得皮膚完整的皮膚從雄性和雌性豬腹部獲得(Lychron LLC，Mountain View，CA)。在運(yùn)輸過(guò)程中，將皮膚浸入含有PBS、10單位/毫升青霉素和10微克/毫升鏈霉素的冰浴中。用設(shè)定0.8mm厚度的皮刀(Padgett Instruments，Plainsboro，NJ)分離表皮和真皮。將皮膚在液氮中迅速冷凍并在-80℃下儲(chǔ)存直到使用。
試驗(yàn)一式三份試驗(yàn)所有試驗(yàn)條件。對(duì)于每種樣品，加入適量的載體和毒素(表14)并用PBS使體積達(dá)到200微升。
表14試驗(yàn)樣品組成的描述 將皮膚于使用前在37℃的水浴中立即解凍，切成1.5cm×1.5cm的正方形，并且將其固定在改良的Franz Chamber裝置(PermeGear，Bethlehem，PA)中。將Haake DC10循環(huán)式水浴鍋(Thermo Electron，Karlsruhe，德國(guó))設(shè)定為37℃。用IPC Ismatec蠕動(dòng)泵(Idex，Wertheim-Mondfeld，德國(guó))將樣品施加至皮膚表面，并且流通速率設(shè)為8.02微升/分鐘。用Retriever IV級(jí)分收集器(Teledyne Isco，Lincoln，NE)收集流過(guò)級(jí)分，用ATM10 Indexing Controller(Permegear，Bethlehem，PA)在0-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12和12-20小時(shí)合并級(jí)分。對(duì)于儀器結(jié)構(gòu)見圖12。
樣品分析系列稀釋的生物素化毒素溶液用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將一平板涂上200微升的流通樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品并在室溫下孵育2小時(shí)。隨后用PBS中的0.1％吐溫20(PBST)洗滌該平板3次。然后將每孔加入200微升的封閉緩沖液(PBST中20％的FBS)并在室溫下孵育2小時(shí)。除去封閉緩沖液。將以1∶1000存在于PBST中的2％FBS中的100微升鏈霉抗生物素-HRP加入至每孔，并將其在室溫下孵育1小時(shí)。隨后用PBST洗滌平板5次。加入100微升的OptEIA底物(BDBiosciences)至每孔并在室溫下孵育10分鐘來(lái)顯影。加入50微升1N H2SO4淬滅該反應(yīng)，并且在450nm下測(cè)量吸收。
結(jié)果 Revance載體顯示出毒素遞送的增強(qiáng)(見圖13)。優(yōu)化毒素濃度和載體毒素質(zhì)量比使毒素遞送相對(duì)于對(duì)照在統(tǒng)計(jì)上顯著增加(P＜0.05)。
實(shí)施例11 體外載體-介導(dǎo)的經(jīng)皮膚遞送A型肉毒桿菌毒素穿越豬皮膚-Pt.2流通分析 目的 使用改良的Franz chamber在豬皮模型中評(píng)估Revance載體遞送A型肉毒桿菌毒素和牛小腸磷酸酶(CIP)穿越皮膚屏障的效力。
方法 生物素化毒素將10微克A型肉毒桿菌毒素(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA和Sigma-Aldrich)再懸浮于100微升pH 7.4的PBS中。加入20倍摩爾過(guò)量的硫酸-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)，并用PBS使反應(yīng)體積達(dá)到1毫升。檢查pH以確保7-9的pH范圍用于結(jié)合。將反應(yīng)物在室溫下孵育1小時(shí)，并用10 K MWCOSlide-A-Lyzer Dialysis Casette(Pierce，Campbell，CA)相對(duì)PBS透析過(guò)夜。
獲取皮膚完整的皮膚從雄性和雌性豬的腹部和肩部獲得(Lychron LLC，Mountain View，CA)。在運(yùn)輸過(guò)程中，將皮膚浸入含有PBS、10單位/毫升青霉素和10微克/毫升鏈霉素的冰浴中。用設(shè)定0.8mm厚的皮刀(Padgett Instruments，Plainsboro，NJ)分離皮膚植皮(包括表皮和真皮的完整厚度)。將皮膚植皮在液氮中迅速冰凍并在-80℃下儲(chǔ)存直到使用。
試驗(yàn)一式三份試驗(yàn)所有試驗(yàn)條件。存在3種有效負(fù)載組(payloadgroup)和6種不同的載體。對(duì)于每種樣品，加入適量的載體和毒素(表15)。有效負(fù)載和載體以下面的濃度制備Kn8載體(Kn8、Kn8R和Kn8T)以10毫克/毫升制備；Kn21T載體以1毫克/毫升制備；K30T和Kn21pR以及A型肉毒桿菌毒素(List Labs和Sigma toxins)以0.1毫克/毫升制備；CIP以100單位/毫升制備。
表15試驗(yàn)樣品組合物的描述 將皮膚于使用前在37℃的水浴中立即解凍，切成1.5cm×1.5cm的正方形，并且將其在改良的Franz Chamber裝置(PermeGear，Bethlehem，PA)中固定。將Haake DC10循環(huán)式水浴鍋(ThermoElectron，Karlsruhe，德國(guó))設(shè)置為37℃。用IPC Ismatec蠕動(dòng)泵(Idex，Wertheim-Mondfeld，德國(guó))將樣品施加至皮膚表面，并且流通速率設(shè)為8.02微升/分鐘。用Retriever IV級(jí)分收集器(TeledyneIsco，Lincoln，NE)收集流通級(jí)分，用ATM10 Indexing Controller(Permegear，Bethlehem，PA)在0-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12和12-20小時(shí)合并級(jí)分。
樣品分析系列稀釋的生物素化毒素溶液用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將平板用200微升的流通樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品包被并在室溫下孵育2小時(shí)。隨后用PBS中0.1％的吐溫20(PBST)洗滌該平板3次。然后在每孔加入200微升的封閉緩沖液(PBST中20％的FBS)并在室溫下孵育2小時(shí)。除去封閉緩沖液。將以1∶1000存在于PBST中的2％FBS中的100微升鏈霉抗生物素-HRP加入至每孔，并將其在室溫下孵育1小時(shí)。然后用PBST洗滌平板5次。加入100微升的OptEIA底物(BD生物科學(xué))至每孔并在室溫下孵育10分鐘以便顯影。加入50微升1NH2SO4淬滅該反應(yīng)，并且在450nm下測(cè)量吸收。
CIP對(duì)CIP使用相似的步驟。選擇CIP作為一種備選，因?yàn)樗c肉毒桿菌毒素非常相似。它是具有相似分子量160KD的球狀蛋白質(zhì)。它便宜很多并且CIP具有高的特異活性。
結(jié)果 表16效力的總結(jié)平均效力和標(biāo)準(zhǔn)誤差用百分比顯示。
如表16中顯示的，不同載體影響不同復(fù)合物的深度和向性。越短的主鏈(Kn8系列)停留在越表面從而越不容易流通。在給定主鏈長(zhǎng)度下，TAT比寡聚精氨酸穿透更深。帶較少電荷的種類如CIP不形成如此有效的粒子因此不會(huì)如此深的穿透。復(fù)合物成分如乳糖可改變載體的偏好(或者需要策略來(lái)形成穩(wěn)定的顆粒)。
實(shí)施例12 體外載體-介導(dǎo)的經(jīng)皮膚遞送A型肉毒桿菌毒素穿越豬皮膚-Pt.3流通分析 目的 用改良的Franz chamber在豬皮模型中評(píng)估Revance載體遞送A型肉毒桿菌毒素穿過(guò)皮膚屏障的效力。
方法 獲得皮膚完整的皮膚從雌性豬的肩部和腹部獲得(Lychron LLC，Mountain View，CA)。在運(yùn)輸過(guò)程中，將皮膚浸入含有10單位/毫升青霉素和10mg/ml鏈霉素的PBS中并將其保持在冰上。用設(shè)定0.8mm厚的皮刀(Padgett Instruments，Plainsboro，NJ)分離皮膚植皮(包括表皮和真皮的完整厚度)，并且將其在液氮中速凍并在-80下儲(chǔ)存直至使用。
生物素化毒素將10ug A型肉毒桿菌毒素(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)再懸浮于100ul pH 7.4的PBS中。加入100倍摩爾過(guò)剩的硫-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)，并用PBS使反應(yīng)體積達(dá)到1ml。檢查pH以確保7-9的pH范圍用于結(jié)合。將反應(yīng)物在室溫下孵育2小時(shí)，并用10 K MWCO Slide-A-LyzerDialysis Casette(Pierce，Campbell，CA)相對(duì)PBS透析過(guò)夜。第二天，將生物素化毒素等分(100ul/試管)并在4℃下存儲(chǔ)。
用于Franz Chamber的皮膚的準(zhǔn)備將皮膚于使用前在37℃的水浴中立即解凍，切成1.5cm×1.5cm的正方形，并且將其在改良的Franz Chamber裝置(PermeGear，Bethlehem，PA)中固定。將HaakeDC10循環(huán)式水浴鍋(Thermo Electron，Karlsruhe，德國(guó))設(shè)置為37℃。用IPC Ismatec蠕動(dòng)泵(Idex，Wertheim-Mondfeld，德國(guó))將樣品施加至皮膚表面，并且流通速率設(shè)為8.02微升/分鐘。用Retriever IV級(jí)分收集器(Teledyne Isco，Lincoln，NE)收集流通級(jí)分，并用ATM10 Indexing Controller(Permegear，Bethlehem，PA)在0-1、1-2、2-3、3-4小時(shí)合并級(jí)分。
制劑對(duì)于每種樣品，加入適量的載體和毒素。一式三份試驗(yàn)所有試驗(yàn)條件。處理組是含有Revance載體的生物素化毒素，而對(duì)照組是單獨(dú)的生物素化毒素。將載體和A型肉毒桿菌毒素以不同的質(zhì)量比制備以便優(yōu)化毒素濃度以及毒素載體質(zhì)量比。
ELISA(蛋白質(zhì)定量測(cè)定法)系列稀釋(1∶3和1∶2)的生物素化毒素用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將平板用200微升的流通樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品包被并在室溫下孵育2小時(shí)。2小時(shí)后，棄去樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品，在室溫下每孔用300μl super block封閉緩沖液封閉平板1分鐘，并重復(fù)兩次。除去封閉緩沖液，并將以1∶1000于含有2％FBS的PBST中的100μl鏈霉抗生物素-HRP加入至每孔，并將其在室溫下孵育1小時(shí)。隨后將平板在室溫下用300μl(每孔)PBST(含有0.1％吐溫20的PBS)洗滌5分鐘，并重復(fù)2次。洗滌后，加入100ul Opt EIA底物(BDBiosciences)至每孔并在室溫下孵育10分鐘以便顯影。然后加入50μl1 N H2SO4淬滅該反應(yīng)，并且在450nm下測(cè)量吸收。
結(jié)果 與對(duì)照比較，Revance載體顯示出毒素遞送的增加(見圖14a-f)。
實(shí)施例13 體外載體-介導(dǎo)的經(jīng)皮膚遞送A型肉毒桿菌毒素穿越豬皮膚-皮膚分析 目的 用改良的Franz chamber在豬皮膚模型中評(píng)估Revance載體遞送A型肉毒桿菌毒素穿過(guò)皮膚屏障的效力。
方法 生物素化毒素將10微克A型肉毒桿菌毒素(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)再懸浮于100微升pH 7.4的PBS。加入20倍摩爾過(guò)量的硫-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)，并用PBS使反應(yīng)體積達(dá)到1毫升。檢查pH以確保7-9的pH范圍用于結(jié)合。將反應(yīng)物在室溫下孵育1小時(shí)，并用10 K MWCO Slide-A-LyzerDialysis Casette(Pierce，Campbell，CA)相對(duì)PBS透析過(guò)夜。
獲得皮膚完整的皮膚從雌性豬的肩部獲得(Lychr on LLC，Mountain View，CA)。在運(yùn)輸過(guò)程中，將皮膚浸入含有PBS、10單位/毫升青霉素和10微克/毫升鏈霉素的冰浴中。用設(shè)定0.8mm厚的皮刀(Padgett Instruments，Plains boro，NJ)分離皮膚植片(包括表皮和真皮的完整厚度)。將皮膚植片在液氮中速凍并在-80℃下儲(chǔ)存直至使用。
試驗(yàn)一式三份試驗(yàn)所有試驗(yàn)條件。存在兩個(gè)試驗(yàn)組。處理組是含有Revance K 30T載體的生物素化毒素，而對(duì)照組為單獨(dú)的生物素化毒素。對(duì)于每種樣品，加入適量的載體和毒素(表17)。將載體和A型肉毒桿菌毒素以0.1毫克/毫升的濃度制備。
表17試驗(yàn)樣品組合物的描述 將皮膚于使用前在37℃的水浴中立即解凍，切成1.5cm×1.5cm的正方形，并且將其在改良的Franz Chamber裝置(PermeGear，Bethlehem，PA)中固定。將Haake DC10循環(huán)式水浴鍋(ThermoElectron，Karlsruhe，德國(guó))設(shè)置為37℃。用IPC Ismatec蠕動(dòng)泵(Idex，Wertheim-Mondfeld，德國(guó))將樣品施加至皮膚表面，并且流通速率設(shè)為8.02微升/分鐘。用Retriever IV級(jí)分收集器(TeledyneIsco，Lincoln，NE)收集流通級(jí)分，用ATM10 Indexing Controller(Permegear，Bethlehem，PA)在0-1、1-2、2-3、3-4、4-6、6-8、8-12和12-20小時(shí)合并級(jí)分。
鏈霉抗生物素染色法將速凍的皮膚切片并用PBS中的0.1％吐溫20(PBST)水合。在室溫下將切片用Blotto封閉緩沖液封閉2小時(shí)并隨后用PBST以5分鐘間隔沖洗3次。加入2％FBS中(PBST中)1∶1000的鏈霉抗生物素-HRP，并且將切片在室溫下孵育30分鐘并隨后用PBST以5分鐘間隔沖洗3次。加入OptEIA底物(BD Biosciences)并在室溫下孵育切片3分鐘以便顯影。將切片用PBST洗滌并蓋上蓋玻片。
結(jié)果 照片在具有4x放大的平面-復(fù)消色差物鏡的Nikon E600顯微鏡上，用Retina 1300B照相機(jī)(Imaging，Burnaby，BC，Canada)為染色的切片拍照(圖15)。
實(shí)施例14 A型肉毒桿菌毒素在引起肌肉麻痹方面的效果 目標(biāo) 通過(guò)肌力產(chǎn)生試驗(yàn)研究在局部施用Revance’s肉毒桿菌制劑中的毒素后，A型肉毒桿菌毒素在引起小鼠肌肉麻痹方面的效果。
材料和方法 肉毒桿菌毒素 Neuronox(Medy-Tox，Inc.，Korea)批次NNX0502，100U/小瓶；0.9％NaCl(無(wú)防腐劑，Abbott Laboratories，North Chicago，IL) 多聚賴氨酸肽(載體) K15T2 試驗(yàn)組-10U毒素/小鼠，n＝4 多聚賴氨酸肽/毒素復(fù)合物的制備 目標(biāo)載體白蛋白/毒素質(zhì)量比＝1.1∶1 Neuronox制劑(0.5mg白蛋白/100U毒素) 微量離心管中用0.9％NaCl制備K15T2載體的1.1mg/ml儲(chǔ)液并通過(guò)渦旋混合。用0.5ml 0.9％的NaCl，通過(guò)將0.9％的NaCl緩慢注射進(jìn)小瓶的側(cè)壁來(lái)重構(gòu)100U(1小瓶)的NNX，并通過(guò)輕輕倒轉(zhuǎn)混合。(濃度是100U毒素/0.5ml)。將0.5ml載體儲(chǔ)液緩慢注射進(jìn)0.5ml重構(gòu)的毒素中并輕輕倒轉(zhuǎn)該載體/毒素小瓶10次，將其在室溫下放置5分鐘(小瓶垂直放置)并隨后在給藥前將其再次輕輕倒轉(zhuǎn)。(濃度是100U毒素/1.0ml)。用1ml注射器和針頭取出100μl該混合物。在施用前除去針頭。(終濃度是10U毒素/100μl)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)將重22-26g的雄性CD1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)用于接受處理并且將28-31g的雄性CD1小鼠用作對(duì)照。將小鼠按5只每組分組圈養(yǎng)并在處理之前允許隨意攝取食物和水。將動(dòng)物用混合有氧的1.5％異氟烷麻醉并在該試驗(yàn)期間內(nèi)保持麻醉，保持時(shí)間為30分鐘。將每只小鼠后肢的用藥位置用Andis EdjerII無(wú)線可再充電的修剪器(Andis，Sturtevant，WI)仔細(xì)刮干凈。將NNX以每小鼠肢10個(gè)單位的劑量局部施用。將以等體積局部施用的無(wú)肽基載體的毒素用作對(duì)照。肌收縮力在局部處理后4天測(cè)量。
局部施用 將動(dòng)物用混合有氧的異氟烷麻醉。100μl(10個(gè)單位)載體/毒素混合物通過(guò)用1ml無(wú)注射針頭的注射器施用涂于隨機(jī)選擇的小鼠后足(剃了毛的)。另一后足用對(duì)照混合物處理。戴上丁腈手套將混合物按摩進(jìn)后足中，在小鼠處于麻醉下孵育30分鐘，然后用水沖洗用藥位置并用紙巾擦干以清除用藥位置的殘留毒素。在局部施用和清洗后，將小鼠放回它的籠子圈養(yǎng)并在控制溫度的環(huán)境下讓其從麻醉狀態(tài)中恢復(fù)。每天觀察動(dòng)物的全身毒性的行為跡象例如呼吸頻率減少、用力呼吸、下垂和瞳孔放大或肌肉麻痹。在處理后4天測(cè)量肌收縮力產(chǎn)生。
肌收縮力產(chǎn)生 將肢通過(guò)用基爾希納鋼絲穿過(guò)股骨和脛骨將其綁在木桌上以防止運(yùn)動(dòng)而固定。腓腸肌保持在原位。在跟骨腱的遠(yuǎn)端周圍綁上一金屬縫線。隨后將該腱在縫線遠(yuǎn)側(cè)橫切，并且將縫線連接至力傳感器(modelFTO3，Grass，West Warwick，RI)，傳感器隨后連接至力傳感器放大器(model 13-G4615-50，Gould，Cleveland，OH)。直接刺激經(jīng)NNX處理的一側(cè)的坐骨神經(jīng)(SD9刺激器，Grass，West Warwick，RI)。增加刺激頻率直到產(chǎn)生最大的強(qiáng)直性張力。肌強(qiáng)直通過(guò)超高級(jí)刺激所有運(yùn)動(dòng)單位的積累產(chǎn)生。在對(duì)照肢上重復(fù)相同的步驟。用連接至力傳感器的標(biāo)刻度的記錄振動(dòng)器(RS 3800，Gould，Cleveland，OH)記錄反應(yīng)。[Ma J、Elsaidi GA、Smith TL等，Time course of recoveryof juvenile skeletal muscle after botulinum toxin A injection.Am.J.Phys.Med.Rehabil.2004；83(10)774-780]。
結(jié)果 當(dāng)評(píng)估含有肽基載體系統(tǒng)的局部用NNX的肌力產(chǎn)生時(shí)，顯示了肌力的減小，導(dǎo)致經(jīng)單次局部施用處理的動(dòng)物中降低約55％肌強(qiáng)直反應(yīng)，肌強(qiáng)直反應(yīng)對(duì)于用含有K15T2的NNX處理的動(dòng)物(處理組)具有128±11克的平均值而對(duì)于用無(wú)載體的NNX處理的動(dòng)物(對(duì)照組)為286±16克(表18)。刺激頻率的總結(jié)(包括對(duì)于每個(gè)刺激頻率肌力產(chǎn)生的平均百分比、平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差)在表19中給出。圖16顯示了關(guān)于含有K15T2的NNX(治療組)、無(wú)載體的NNX(對(duì)照組)以及NNX注射的肌力減少的百分比。
表18肌力產(chǎn)生-肌強(qiáng)直試驗(yàn)。列出了處理組和對(duì)照的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
表19刺激頻率的總結(jié) 列出了肌力的減少百分比、平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
結(jié)論 該試驗(yàn)證明了在載體系統(tǒng)中Revance’s肉毒桿菌制劑中的A型肉毒桿菌毒素在單次局部施用后引起小鼠肌肉麻痹方面是有效的。
實(shí)施例15 人體探索性研究減少前額皺紋而對(duì)表情無(wú)功能損害的局部用A型肉毒桿菌毒素。
局部用肉毒桿菌毒素的制備和施用 受試者1首次處理-將4μg K15T2 Revance載體溶解于2.0ml15％的泊洛沙姆(在0.9％氯化鈉中并且無(wú)EtOH)中并通過(guò)倒轉(zhuǎn)混合。
在系列步驟中將1.0ml泊洛沙姆-載體混合物用于重構(gòu)400 U Botox(Allergan，Irvine，CA)并通過(guò)倒轉(zhuǎn)混合。載體與毒素的終濃度比率是0.5mg載體/100 U毒素。將局部用毒素溶液劑置于室溫下5分鐘。將總體積為1.0ml的毒素溶液劑用注射器涂至前額。在孵育30分鐘后，將受處理的前額區(qū)域用5張濕潤(rùn)紙巾清洗，其中每張紙巾僅用于以一個(gè)方向擦洗前額一次。記錄處理前(基線)和處理后的照片。
受試者2首次處理-將10μg A型肉毒桿菌毒素(List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，CA，product #130A)在1.0ml 0.9％的氯化鈉中重構(gòu)并進(jìn)一步稀釋成5ng/100μl的終濃度。通過(guò)倒轉(zhuǎn)混合重構(gòu)的毒素。將Revance載體以1ng/20μl的濃度制備。將1ng載體混合進(jìn)0.9％NaCl中的900μl 15％的泊洛沙姆中(無(wú)EtOH)。然后，加入100ml毒素至920μl的泊洛沙姆中以達(dá)到1∶10的毒素∶稀釋液比例。將總體積為1.02ml的毒素溶液劑用注射器涂至前額。在孵育30分鐘后，將受處理的前額區(qū)域用5張濕潤(rùn)紙巾以與受試者1相同的方式清洗。記錄在處理前(基線)和處理后的照片。
結(jié)果 圖17顯示了在處理前和后拍攝的照片。照片顯示在局部施用A型肉毒桿菌毒素后前額皺紋減少。人受試者1(頂行)和受試者2(底端行)的處理前(基線)和處理后的照片。
實(shí)施例16 多汗癥試驗(yàn)-治療人受試者出汗過(guò)多的Revance局部用肉毒桿菌制劑 目的 確定通過(guò)局部施用Revance’s肉毒桿菌制劑抑制出汗的可行性。
制劑在單獨(dú)的試管中的去離子水中制備1mg/ml的每種KNR和P6R-B主鏈，渦旋至充分混合。將BOTOX_-100單位(Allergan，Irvine，CA)用1.0ml去離子水(受試者1)或0.5ml 0.9％的NaCl(受試者2 & 3)重構(gòu)并通過(guò)倒轉(zhuǎn)混合。處理劑的儲(chǔ)液通過(guò)加入在下表中顯示的成分至1.7ml微量離心管中得以制備，將其渦旋90秒鐘，并在室溫下孵育5分鐘用于使復(fù)合物形成。標(biāo)記錐形管，R表示用于右邊而L表示用于左邊。將1.0ml儲(chǔ)液轉(zhuǎn)移至給定的錐形管中，1∶5稀釋液通過(guò)加入4.0ml Cetaphil(Galderma，F(xiàn)ort Worth，TX)并用金屬調(diào)藥刀充分混合而制備。
重量評(píng)估該方法的每一步驟須戴上丁腈(或無(wú)粉)手套操作。準(zhǔn)備三層濾紙并用鑷子將其置于錐形管中，確保濾紙接近螺旋蓋。濾紙通過(guò)將蓋上其螺旋蓋的錐形管置于天平盤中間來(lái)在錐形管中預(yù)稱重。每位受試者預(yù)稱重三組濾紙。將濾紙同時(shí)置于每側(cè)腋窩上。讓受試者靜坐，他們的手臂靠著他們的兩側(cè)并且雙手在身體前交叉。在收集階段，受試者在暖房中保持不動(dòng)。在每10分鐘的汗液收集階段后，將濾紙移出并放回它們的試管中。用鑷子將濾紙置于它們的初始位置，展開并接近螺旋蓋，注意別撕裂濾紙?；€汗液測(cè)量以10分鐘時(shí)間間隔收集3次。濾紙通過(guò)將蓋有其螺旋蓋的試管置于天平盤中間來(lái)再次稱重并記錄重量。
藥物施用步驟戴上丁腈手套，將5.0ml(受試者1)和1.5ml(受試者2)檢品或?qū)φ沼媒饘僬{(diào)藥刀(用于受試者1)或滾動(dòng)涂藥器(用于受試者2，以上下運(yùn)動(dòng)，然后圓周運(yùn)動(dòng))局部施用至腋窩。在受試者2的情況中，將每側(cè)腋窩用小的調(diào)藥刀涂上約4ml的Cetaphil，并在室溫(72-77_)下孵育1小時(shí)以使處理溶液得以吸收。將腋窩用清潔布(Johnson & Johnson)擦去并清潔。
觀察腋窩上的毛發(fā)是完整的。在處理溶液施用前不進(jìn)行上蠟。受試者聲稱沒(méi)有疼痛或不適。腋窩的兩側(cè)都具有麻刺感。沒(méi)有刺激癥狀并且皮膚色素?zé)o變化。
結(jié)果 重量分析(人受試者1)在可行性試驗(yàn)中，對(duì)于人受試者#1，每側(cè)腋窩在局部施用含有或不含Revance肽基載體的20U肉毒桿菌毒素(Botox)后最初7天。在標(biāo)準(zhǔn)條件下每10分鐘產(chǎn)生的汗(mg)(p＝0.0043) 重量分析(人受試者2)在可行性試驗(yàn)中，對(duì)于人受試者#2，每側(cè)腋窩在局部施用含有或不含Revance肽基載體的50U肉毒桿菌毒素(Botox)后最初7天。在標(biāo)準(zhǔn)條件下每10分鐘產(chǎn)生的汗(mg)(p＝0.0117)。圖18顯示了受試者2在一側(cè)腋窩施用根據(jù)本發(fā)明的肉毒桿菌毒素制劑，并且在另一側(cè)施用對(duì)照制劑后的照片。

權(quán)利要求
1.一種制劑，所述的制劑包含
肉毒桿菌毒素，
帶正電荷的主鏈，以及
至少一種選自分配劑、寡聚-橋以及聚陰離子橋的成分，
其中所述肉毒桿菌毒素與所述帶正電荷的主鏈非共價(jià)復(fù)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中所述帶正電荷的主鏈進(jìn)一步包含分支基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制劑，其中所述帶正電荷的主鏈具有低于21,000的分子量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的制劑，其中所述帶正電荷的主鏈?zhǔn)嵌嗑圪嚢彼峄騊EI。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的制劑，其中所述分支基團(tuán)是經(jīng)保護(hù)的寡聚精氨酸或TAT結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，所述的制劑進(jìn)一步包含粘度修飾劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制劑，其中所述粘度修飾劑是羥丙基纖維素或Cetaphil。
8.用于經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的試劑盒，所述的試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1的制劑。
7.一種處理皺紋的方法，所述的方法包括
施用根據(jù)權(quán)利要求1的制劑至患者的皮膚區(qū)域，并隨后任選施用遮蔽劑。
8.一種治療多汗癥的方法，所述的方法包括
施用根據(jù)權(quán)利要求1的制劑至患者的皮膚區(qū)域，并隨后任選施用遮蔽劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述皮膚區(qū)域選自面部、前額、頸、手和足。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述皮膚區(qū)域選自腋窩、前額、背部、胸、掌、手背、腳背或足底。
全文摘要
公開了用于經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的改良制劑。該制劑包含，例如，與帶正電荷的主鏈非-共價(jià)連接的肉毒桿菌毒素，所述的主鏈具有分支或效應(yīng)基團(tuán)。制劑還包含分配劑、寡聚-橋或多聚陰離子橋，并可任選包含粘度改良劑。該制劑設(shè)計(jì)用于局部施用于患者的皮膚上并可用于處理皺紋、多汗癥和其它與健康相關(guān)的問(wèn)題。用于施用的試劑盒也得以描述。
文檔編號(hào)A61K31/74GK101171018SQ200680014839
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日
發(fā)明者M·D·戴克, J·M·沃 申請(qǐng)人:雷文斯治療公司