專利名稱：：具有磷脂酰絲氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的制作方法具有磷脂,氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白關(guān)于，贊助SW^f發(fā)的聲明。[oooi壞適用。發(fā)明背景在多種情況下，止血(弓IElfiL液凝結(jié)以停止出血的過(guò)程)可能會(huì)異常而可會(huì)脆及生命，然而仍需要在特定條件下誘導(dǎo)止血的改良方法。止血由血小板引發(fā)，血小板是引ML管創(chuàng)口卩腺的血細(xì)胞。在Jtbl程中，血小板被"激活"。^活的一方面表現(xiàn)在，脂,氨,)^^膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移勤卜側(cè)。一旦該過(guò)程發(fā)生，某些血液凝結(jié)蛋白就結(jié)合到血小板表面，并在該過(guò)程中相互作用，該過(guò)程稱為"血液凝結(jié)"。該過(guò)程的最終結(jié)果是形成WL歐也稱為Da因子)。凝血酶有多種重要作用。首先，它將血蛋白TF維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。每個(gè)纖維蛋白結(jié)合多個(gè)其它纖維蛋白分子，形成纖維蛋白凝塊，所述凝塊支撐血小板，用于卩M:出血。其次，敝酶也撒活血小板，增加參與她過(guò)程的血小板數(shù)量。再次，凝血酶以加Ml液凝結(jié)生化過(guò)程的方式影響其它血漿蛋白，例如XI因子。ffll小樹或其它PS夕卜露的細(xì)胞)表面相互作用的第一個(gè)蛋白是組織因T(tf)，^^活形式的vn因T(稱為vna因子)，和x因子。MifiL酶的產(chǎn)生，是由血,氨酸蛋白酶Vila因子與其蛋白輔因子TF相互作用而引發(fā)。TF是膜結(jié)合蛋白，雜與血流,的細(xì)面并不彭去，直至它們被撒活。在^ii后，tf結(jié)合vn因刊促使皿活為vna因子)或vna因子，提高微X因子轉(zhuǎn)化為Xa因子的催化效率。TF鵬卜結(jié)構(gòu)織全蛋白1-219或3-219氨基酸,部分)在;W桿菌中的皿，產(chǎn)生保留結(jié)合VHa因子并變構(gòu)撒活該因子能力的約26kDa多肽。該f^TF淋為可溶性TF或sTF)不結(jié)合細(xì)M，因ifcbffl常在皿vn因子自激活或vna因子介導(dǎo)的x因子撒活中，效率比天然TF低得多。sTF編碼cDNA的工程化使M哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面以糖磷月旨Wl醇錨定蛋白形式,，這導(dǎo)致與天然TF有相同特異性促凝活性的蛋白，這表明該蛋白膜結(jié)合相當(dāng)重要。很久已經(jīng)意i贈(zèng)lj，先天Vffl因預(yù)乏，tt液凝結(jié)由^^度TF引發(fā)的情況下，以WL酶產(chǎn)生方面的異常為特征。最近認(rèn)識(shí)到，血小板功能紊亂也與WL酶產(chǎn)量M^相關(guān)。維他命K-fM1tt液凝結(jié)蛋白，其是WL酶產(chǎn)4^需，其艦結(jié)合陰離子磷脂、特別是PS，聚集于激活血小板、內(nèi)皮細(xì)胞禾n/或?qū)ゼ?xì)胞表面。WL酶，強(qiáng)大的血小板激動(dòng)劑，其可放大血小板激活，戶腿激活由接觸內(nèi)皮下的膠原暴翻而引發(fā)。因此，鵬的凝血酶產(chǎn)生，可能是出血傾向的基礎(chǔ)或可放大出血傾向，其中戶，出血傾向伴隨著血漿凝結(jié)因T^舌L或血小板紊亂。其它文獻(xiàn)報(bào)道，給動(dòng)##脈目做酶原激斷膜結(jié)合的TF)產(chǎn)生Mlfil的普遍激活，該結(jié)果與同時(shí)湖sTF和Vna因子相同，在實(shí)麵物出血中可產(chǎn)生有益效果，這表明sTF可作為設(shè)計(jì)的減少出血治療的基礎(chǔ)。期望在有需要的個(gè)體中有效增弓IihlfiL和凝血的治療蛋白。附圖簡(jiǎn)述圖1.重組蛋白的蛋白純化和western印記。上圖，SDS-PAGE和考馬斯離她。中圖，小鼠單抗與人TF的western印記。下圖，小鼠單抗與His6的western印記。M，^f量^H己；第1-5道，在A，B，C電泳圖中相同第l道，sTF-膜聯(lián)蛋白V(sTF-annV);第2道，sTFAA-膜麟白V(sTFAA-annV);第3道,膜聯(lián)蛋白V;第4道，sIP;第5邋重組TF。第6邋電泳圖A:牛血清白蛋白；電泳圖B:重組TF(Innovin⑧,DadeBehrin&New昧DE)。圖2.重組蛋白對(duì)血漿凝結(jié)的影響。A機(jī)maAlfe槳隨不同濃度天然TF—)，sTF(T)或sTF-annV("的凝結(jié)時(shí)間。加至每樣品的PC/PS總量為10mM(PC:PS摩爾比,4:l)。顯示的是平均值±SEM。B，用^#偏促艦酶原激酶時(shí)間方敦adilutepartialthromboplastintimaprotocol)ii量的sTF(T),膜聯(lián)蛋白V(▲)，sTT+膜聯(lián)蛋白V(),或sTF-annV("血漿凝結(jié)時(shí)間，戶腿實(shí)驗(yàn)方餘實(shí)驗(yàn)驟中描述。C，在所加磷脂缺乏情況下，不同濃度sTF(T)，膜聯(lián)蛋白V(A)，sTP-annV—)，或sTFAA-annV(o)的血漿凝結(jié)時(shí)間。顯示的是平均值土SEM。圖3.sTF-araiV和sTFAA-annV的磷脂結(jié)合。M^測(cè)每蛋白從磷脂懸浮液取代FITC-膜聯(lián)蛋白V的能力(該實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)驗(yàn)步驟中描述)，將sTF-annV(*)和sTFAA-annV(o)結(jié)合PC/PS顆粒能力與膜聯(lián)蛋白V(A)的能力進(jìn)行比較。曲線用非線性回歸和單位點(diǎn)配體結(jié)合方程式(aonesiteligamlbindlrvg叫uaton)計(jì)i^幾模擬。EDTA-皿熒光百分?jǐn)?shù)表禍平均值±SEM)。圖4.天然TF,sTF-annV或sTF存在情況下的VHa因子自動(dòng)、^r活。在PC/PS(810mHPC:PS摩爾比=4:1)和CaCl2存在情況下，將VII因T(80nM)加入至等摩爾濃度的天然TF(一,sTF(V)，或sTF-annV—)中。在指定時(shí)間，移出^j，，M31,于含EDTA的溶液中而終止反應(yīng)。在所力口sTF和CaCl2存在情況下，M:測(cè)量Chromozymt-PA水解率，確定每樣品的VHa因T^。顯示的是平均值±SEM。圖5.在重組蛋白存在情況下，VHa因子介導(dǎo)的Xa因子產(chǎn)生。A在5pM天然TF(■)，sTF(，),sTF頓V()，或sTFAA彌V(。)#&情況下，將不同濃度的X因子，加入至1nMVHa因子，5mMPC/PS(摩爾比,4:1)，5mMCaCl2和ChromozymX底物。按實(shí)驗(yàn)步驟"/BB載方法，測(cè)物水^^加^1率，該水解速率擬合Mchaelis-Menten方程。B，在含28nMX因子，5mMCaCl2，1nMVila因子，0.347mMPC/PS和不同濃度的sTF("或sTF-annV("的溶液中，測(cè)量Xa因子的產(chǎn)生的初^^率。圖6.sTF-annV或VHa因子對(duì)肝素-處理的血漿aPTT的$娘。A,含肝素鈉(l單你mL)血漿的aPTT分析，在不同濃度Vila因刊"或sTF-annV(■)存在瞎況下進(jìn)行。B，含依諾肝素鈉(enoxaparins。diumXl單^/mL)的血漿aPTT，在不同濃度Vila因T("或sTF-annV一)存在情況下測(cè)量。虛線顯示在缺乏肝素或依諾肝素瞎況下，aFTT分析的平均凝結(jié)時(shí)間。顯示的是平均值±SEM沃多數(shù)體敏小而不可見(jiàn))。圖7.sTF-annV對(duì)尾出血時(shí)間的效應(yīng)。圖A:將小鼠(n=13>好皮下aft依諾肝素嵌20m&1<g)，2小時(shí)后將其麻醉，按實(shí)驗(yàn)步驟中戶形己載的方法測(cè)SM出血時(shí)間。出血一停止，立即給動(dòng)tl^脈ait位于TBS中的sTF-annV(90mcg^g)。五，后，再次測(cè)量出血時(shí)間。差異有顯著性，p=0.01(自雙尾t-test)。圖B:按，方法，測(cè)量尾出血時(shí)間。給予SQ依諾肝素(^fe7jC)2小時(shí)后，將動(dòng)物靜詠MtsTF-annV(90mcg/kg)或，摩爾量的sTF，膜聯(lián)蛋白V或sTF+膜聯(lián)蛋白V。10min后測(cè)量尾出血時(shí)間。sTF-amV縮短了未會(huì)好依諾肝素小鼠(p>0.2)和纟舒依諾肝素小鼠(p<0.0001，Welch's校正、TO非自t-test)的出血時(shí)間。在未給予依諾肝素組的每組中，研究?jī)芍粍?dòng)物，在依諾肝素處理組的每組中，研究四只動(dòng)物。發(fā)明詳述本發(fā)明構(gòu)思,嵌合蛋白至血管損傷部位，其中所述嵌合蛋白包含可激注組織因T(sTF)或具有足以增強(qiáng)VEa因子胺M活性至少10倍的活性的其有效部分，在所述血管損傷部位其用作止血?jiǎng)?，使誘導(dǎo)分散的血管內(nèi)凝結(jié)(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)的機(jī)會(huì)降至最低。雖然可以使用激活的血小板、內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞的特異性抗體進(jìn)行耙向，但是優(yōu)選能結(jié)合所有三種細(xì)胞類型的靶向部分，至此，因?yàn)樗鼘?duì)任意給定個(gè)體中可能存在的,胞數(shù)量改變更不敏感。因?yàn)槊糠N感興趣細(xì)胞類型在激活時(shí)IKE表面,磷脂酰絲氨酸(PS)，所以本發(fā)明構(gòu)思用sTF嵌合蛋白(例如，sTF-annV)^sTF靶向至含PS膜上，其中將sTF與PS結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如膜聯(lián)蛋白V(AnnV)偶聯(lián)，膜聯(lián)蛋白V為人PS結(jié)合蛋白，其顯示可結(jié)合激活的血小板、內(nèi)皮細(xì)麟口戦細(xì)胞。對(duì)膜聯(lián)蛋白V以該方刻頓的爭(zhēng)論在于它魏凝蛋白，因?yàn)樗芘c維他命K-繊性蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)MPS的膜。在本發(fā)明雌的實(shí)施方案中，sTF包含與AnnVMS^^接的人TF的217個(gè)MS酸(SEQIDNO:2)(它也可以連接在羧基，，也可以通M^接子序列連接在M^ra，基彩掃)。如前皿，TF常規(guī)結(jié)^T細(xì)M,因?yàn)樗心?nèi)錨定區(qū)，然而，sTF缺乏錨定區(qū)且10年前已克隆皿，其比天然蛋白(TF)活性低約1000倍。sTF例如由包含SEQIDNO:l的cDNA編碼。本文構(gòu)思的可溶性組織因刊sTF)包括SEQIDNO:2，或其207位有半胱氨艦保留了足以增強(qiáng)Vila因子胺,活性(抓)至少10倍的任意子序列(subsequence)。因此，本文所用的構(gòu)思的sTF包括，包^MS酸1-207，5-207，10-207，15-207，20-207，25-207，3曙7，35-207,格207，45-207，50-207,55-207，60^207，65-207，70~207，75-207，80^207,85-207,90~207，95-207，100"207，或105-207的sTFi^豆部分，以及包含在1-207至105-207之間的所有序列，例如包括2-207和104"207。本發(fā)明進(jìn)一步包,碼SEQIDNO:2或如上其功肯旨活性截短部分的任意備選cDNA，例如,SEQIDNO:2的備選cDNA，可包括與SEQIDNO:l相似但其具有保守取代密碼子的cDNA(即，具有不同核苷,列，但編碼相同M^酸的密碼)。本發(fā)明進(jìn)一步包括如上戶皿的任意sTF序列，,列，其中所述序列在SEQBDNO:2N-糊，進(jìn)一步包括嫩卜的ser-gly序列或僅gly難，由7此分別產(chǎn)生了219，或218個(gè)m^酸的序列，而且其中在SEQIDNO:2的207位的半胱氨酸殘基由此分別^M209位或208位。sTF-ArmV嵌合蛋白的第二結(jié)構(gòu)域，包含全長(zhǎng)人蛋白膜聯(lián)蛋白V(SEQIDNO:4)^^有效PS結(jié)合片段。AnnV是35kDa蛋白，例如由SEQIDNO:3編碼，其可產(chǎn)生于多種細(xì)胞，其可結(jié)合某彌脂，特另提如上戶脫的磷脂ifeM氨酸。PS常見(jiàn)于細(xì)M內(nèi)側(cè)(所有細(xì)胸。存在能轉(zhuǎn)移PS至細(xì)M^卜側(cè)的相關(guān)酶機(jī)制，其中在銬存在清況下，PS能被AnnV結(jié)合。連接子區(qū)(例如，但不限于SEQIDNO:6，其由具有SEQIDNO:5的cDNA編碼)任艦在嵌合蛋白sTF域與AnnV^間出現(xiàn)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明嵌合蛋白也可在羧基和/或魏糊或者內(nèi)部，含有一呦能fei己(tag)序列，其主要包括例如6^組氨酸SEQIDNO:8，其由具有SEQIDNO:7的cDNA編碼)，其用于輔助嵌合蛋白純化，而且其,在嵌合蛋白治療給藥應(yīng)用之前，從嵌合蛋白切除。在備選的實(shí)施方式中，將突式sTF用于嵌合蛋白。在一實(shí)施方式中，sTF突變體在163和164位具有丙氨^^，而不是天然sTF該位置所見(jiàn)的賴氨酸歹纖例如或者在219M^酸sTF的165位和166位)。該備選實(shí)施方案本文稱為"sTFAA-AnnV"(SEQIDNO:10，例如其由SEQE)NO:9cDNA編碼)。在另兩個(gè)實(shí)施方案中，sTTF突變條163和164位有谷氨^^或谷氨酰胺^代，本文稱為"sTFEE"(SEQIDNO:12，例如其由SEQEDNO:llcDNA編碼)和"sTFQQ"(SEQIDNO:14，例如其由SEQIDNO:13cDNAl^馬)。這些突變體^i^始sTF中的\可以包括(但不限于M壬意^^f有下列取代在13，131，163，164或183位丙氮酸取代，在42或138位天冬M取代在48位色氨酸取代,在52位絲氨酸取代，在128位天冬氨酸取代，在163或164位谷氨酸取代，或在129，163或164位谷氨,取代。事實(shí)上，本發(fā)明構(gòu)思在這些位點(diǎn)中的任意位點(diǎn)上，非極性氨基酸可被極性氨基酸或其它非極性氨基鵬取代，極性氨基酸可被繊性錢酸或其它極性氨基^ff取代，正電荷氨基酸可被負(fù)電荷、極性或一敞性氨基酸或者其它正電荷,^M取代，以及負(fù)電#酸可被正電荷、極性或非極性,酸或者其它負(fù)電^^取代。因此，本發(fā)明的嵌合蛋白sTF-annVtt^包括，例如含SEQIDNO:2的蛋白鵬有效部分，其與含SEQE)NO:4的蛋白鵬有效部^^接。sTF-annV蛋白可進(jìn)一步包M^接子，包括但不限于，位于sTF和annV序列間的具有SEQIDNO:6的連接子。含或不含連接子序歹啲sTF-annV蛋白，可以包含內(nèi)部嫩卜部^H3序列，例如SEQIDNO:8，用于輔助sTF-annV蛋白純化。flBf可其它有效的連接子序列和/或純化^iB^列，自用于替代SEQBDNO:6和/或SEQIDNO:8。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，可能期望嵌合蛋白具有縮短的血清半衰期使血清滯留時(shí)間最短，以限制嵌合蛋白引起所不期望的血栓形成潛能，或者使得嵌合蛋白在特定量的凝血酶形成之后被清除。在本發(fā)明這些實(shí)施方式中，將裂解位點(diǎn)例如血纖蛋白溶酶(plasmin)裂解位點(diǎn)或者凝血酶(thrombin)裂解位點(diǎn)，置于本文戶腿任一嵌合蛋白的sT7與araiV序列之間。例如，具有SEQIDNO:16(例如其由SEQIDNO:15cDNA編碼)的血纖蛋白溶H^f位點(diǎn)，或例如SEQIDNO:18(例如其由SEQIDNO:17cDNA編碼)WLill^位點(diǎn)，可被插入至sTF與annV序歹,的OT(含或不含^^子序列和/或純化^i游列)。為延長(zhǎng)血清半衰期以增加其活性，本發(fā)明也構(gòu)思含多個(gè)與膜聯(lián)蛋白V織繊基^^接的sTF域的嵌合蛋白(例如具有SEQIDNO:19的蛋白，其例如由SEQIDNO:20cDNAi^馬)。本發(fā)明也構(gòu)思包含sTF或多個(gè)sTF織或本文記載的其衍生物)和蛋白的其它非AnnVPS結(jié)合域的嵌合蛋白，所述蛋白例如為突觸結(jié)合蛋白I(synpatotagminl),赫本領(lǐng)嫩術(shù)人員已知的其它蛋白，其用于錨定sTF賠含PS的膜。用于取代AnnV的其它PS結(jié)合蛋白的實(shí)例，包括《旦不限于，膜聯(lián)蛋白家族成員，學(xué)L麟素(lactadherin)，已知結(jié)合PS的蛋白中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，戶艦蛋白例如V/Va因子，X/Xa因子，MIa因子,VH/VIIa因子，K/IXa因子，Vffl/Vma因子，血影蛋白，B類I型清道夫受體，蛋白激酶C,以及含蛋白激酶C的C2結(jié)構(gòu)域的蛋白(其包括鄉(xiāng)結(jié)合蛋白))，Rab親和蛋白(Rabphilin)家驗(yàn)員，PS受體,內(nèi)皮麟素樣OxLDL受體l(LOX-l)，PS抗體，磷脂,氨鵬羧酶，MARCKS(肉豆蔻?；?、富丙氨酸蛋白激酶C底物)，PS-p68，IW蛋白，紅細(xì)胞蛋白4.1，血紅蛋白，鈣調(diào)蛋白家員，S100入S100B，鈣周期素結(jié)合蛋白家族成員，孚LM糖蛋白，MFG-E8(糊旨漆EGF因子8),以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它PS亍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在舒sTF-annV(赫文構(gòu)思的ftf可其它嵌合蛋白)之前，將劇中瘤個(gè)體首先會(huì)好化療鄉(xiāng)，戶脫化療引趔中瘤劍中瘤血管變化，導(dǎo)致sTF-annV結(jié)合增加，例如M御中瘤或血管細(xì)IW面增強(qiáng)PS,而導(dǎo)致sTF-annV結(jié)合增加。然后纟^sTF-annV，所述sTF-araiV將會(huì)以增加量結(jié)合腫瘤和腫瘤血管。化療定義為致癌細(xì)胞死亡的倒可治療(即藥物，化學(xué)試劑，激素，維他命，等等，其是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。另一方法^^合予區(qū)域放療(對(duì)蟲或結(jié)合藥物治m，以增強(qiáng)sTF-annV安te禾P/或其結(jié)合。癌細(xì)胞接受來(lái)自環(huán)境的信號(hào)，其允許它們生長(zhǎng)、遷移和侵入正常組織。癌細(xì)胞不同于正常細(xì)臟處在于它們?cè)S多在其表面，有增加數(shù)量的某些"受體"分子，可幫助細(xì)胞存活。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明構(gòu)思將新蛋白設(shè)計(jì)為阻斷腫瘤細(xì)胞表面受體，包撤且織因子和尿激酶受體，由此改刻幗細(xì)胞行為。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明構(gòu)思將嵌合蛋白設(shè)計(jì)為抑制通過(guò)細(xì)胞受體的信號(hào)傳執(zhí)signaling)，其中戶艦受體對(duì)癌細(xì)胞，也可會(huì)樹正常的炎癥細(xì)胞比較重要。特別地，本發(fā)明構(gòu)敏l)新蛋白，其與尿激酶受體結(jié)合，從而Kih正常經(jīng)該受體產(chǎn)生信號(hào)的兩蛋白(尿激酶和血纖蛋白溶酶原激活劑抑制劑-l，也稱PAI-1)的結(jié)合，和(2)新蛋白，其與細(xì)胞表面結(jié)合，且包含細(xì)面蛋白ia織因子的鵬卜結(jié)構(gòu)域，戶;Mla織因子用作血漿蛋白^爾為VIIa因子的受體。因?yàn)榘?天然)組織因子和Vila因子的復(fù)糊，育^生以組織因子ifeM尾^^式影響癌細(xì)胞行為的信號(hào)，所以本文構(gòu)思的含sTF嵌合蛋白，可作為VHa因子接收池(sink)，從癌細(xì)胞表面的組織因子轉(zhuǎn)移VHa因子。本發(fā)明也構(gòu)思同時(shí)結(jié)合尿激酶受體和Vila因子的新蛋白，以阻止癌細(xì)胞從其自身細(xì)!W面組織因子和尿激酶受體^f受益。本發(fā)明也構(gòu)思組織因子結(jié)構(gòu):^B/^M激酶受體結(jié)構(gòu)域的突變體，以增強(qiáng)每種這些結(jié)構(gòu),其配體的親和力。尿激酶受體和組織因子也見(jiàn)于，稱為慢性炎癥細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。本文記載的嵌合蛋白也可用于治療人類或動(dòng)物疾病，在該疾病中，持續(xù)的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥在該持久疾病或不適中起作用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括與ATF連接的sTF(sTF-ATF)，該嵌合蛋白可同時(shí)阻斷細(xì)胞的TF和尿激,體。ATF■激酶的MrSS白片段(尿激酶A鏈1-135,酸，因此稱為ATF)。ATF(SEQIDNO:22，例如其由具10有SEQDDNO:21的cDNA編碼)結(jié)合尿^ll受體，但與^:尿激酶不同，其不被內(nèi)化?？山Y(jié)合腫瘤脈管并可包括本發(fā)明蛋白的其它肽，包括但不限于HWGF(SEQIDNO:23)^基序肽(基質(zhì)金屬蛋白膝2和基質(zhì)金屬蛋白膝9，也稱為明膠酶A和明膠酶B，的選擇性抑制齊IJ)，例如合劍太CTTHWGFTLC(SEQIDNO:24)靶向血管生成性血管，抑制人內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)Bte移，也在動(dòng)物模型中PMJ中瘤生長(zhǎng)和侵入，提高負(fù)荷人對(duì)中瘤的小鼠的存活。如上戶脫，本文構(gòu)思的任一腫瘤治療方法，可包括以膜麟白V(非sTF-膜,白V)進(jìn)，査的初始步驟，以確^t治療預(yù)期有正常^i^，答的個(gè)體。優(yōu)選的個(gè)體為顯示膜聯(lián)蛋白V腫瘤吸收而非腫瘤區(qū)^1量吸收的個(gè)體。這>1##是更有效的治療，因?yàn)槟承撛趥€(gè)皿無(wú)先行藥物治療和/^m治療的情況下，可能有增強(qiáng)的吸收(由此其不一定受益于這些伴隨著副作用的輔助治m，而其它個(gè)體可能沒(méi)有。后者將更可會(huì)縱首次化療皿療中^，從而允許在sTP-AnnV和治療之間產(chǎn)生協(xié)同作用。在膜聯(lián)蛋白V篩査中(在sTF-AnnV給藥之前進(jìn)行)，膜聯(lián)蛋白V結(jié)合于血液凝±夫中捕獲的激活血小板。因此，膜聯(lián)蛋白V篩查可確定有sTF-AnnV結(jié)合的提高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)俠subjects)，所述個(gè),非腫瘤血管床中可能發(fā)生病理WL銜即，中風(fēng)，心臟病發(fā)作，深靜脈血栓，等等。Mit行膜聯(lián)蛋白V先期篩査，避頓該并發(fā)歸更高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，^f頓者安全瞎況可得到提高。膜聯(lián)蛋白V篩查可用多種成像技術(shù)進(jìn)行(特別是磁共振成像禾啦醫(yī)療學(xué)成像)，該技術(shù)允許開，的成像化合物。備皿，在鄉(xiāng)好sTF-AnnV之前(有或沒(méi)有化療種或放m，給個(gè)體靜脈^#膜聯(lián)蛋白V，以預(yù)防所不期望發(fā)tt栓的血管與sTF-膜聯(lián)蛋白結(jié)合。^i^驟網(wǎng)材料如所述制備重鄉(xiāng)fl^-錨定TF，重組sTF(TF2-加)，以及VH和TF的單克隆抗體。與重組蛋白的Hi*標(biāo)記反應(yīng)的單克隆抗體，來(lái)自CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。Chromozymt-PA(N-甲基磺鵬-D"苯丙酰甘氨酰-L-精氨酸4硝基苯胺^&)和ChromozymX(N-甲縫鶴-D^正亮氨酰-甘氨酰-L-精氨酸"4"苯基重氮酸醋^ik)來(lái)自RocheDiagnosticsCoip(Indianapolis,IN)。純化的人X,Xa^VII，和Vila因子來(lái)自EnzymeResearchLaboratories(SouthBen4IN)。除非另有說(shuō)明，否則，所有其它試劑均來(lái)自SigmaChemicalCo.。磷脂以氯仿lt存液形式，獲自AvantiPolarLipid(Alabaster,AL)，其用于制備單層磷臘泡囊。將等^f以摩爾比磷脂翻旦fii(PCyPS4:1混合，氬氣下蒸發(fā)去除氯仿。自脂重懸于0.1MNaCl，0.05MTris-HCl,pH7.5,超聲，懸液AM明，產(chǎn)生PC/PS泡囊。磷月^^M磷酸分析確定。[(X)40]TF至磷脂泡囊的再脂化，用辛基-(3~1>葡糖吡喃法進(jìn)行，通常TF/磷脂摩爾比1:8700。有效TF濃度M在含Chromozymt-PA的溶液中，用逐步增加濃度的Vila因子滴定，并將所得胺,活性，與已知濃度sTF與Vila因子溫育所得胺l^^性(amiddyticactivity)進(jìn)行比較，而測(cè)量。TF制備物磷脂濃度用磷酸分析測(cè)量，以使TF與sTF-annV直接比較時(shí)，PS存在量相當(dāng)。熒光素^I氰酸,ITC》膜聯(lián)蛋白V，M將FITC與膜聯(lián)蛋白V以2:1摩爾比，在0.5M碳麟緩沖瓶pH9.5室溫暗室下溫育1小時(shí)而帶恪。未結(jié)合FITC通過(guò)150mMNaCl,0.01MTris-HCl,pH8.2^ii濾，接著用相同緩沖液透析另外的48小時(shí)而去除。魏載鵬建膜聯(lián)蛋白VcDNA(于pET-22b(+)載體中)由AntonyRosen博士惠贈(zèng)。sTF-annV構(gòu)建體，M將TF2-219^S酸編碼cDNA與膜聯(lián)蛋白VcDNA5',接而產(chǎn)生。sTFcDNA用正向引物5'-CATGCCATGGCAGGCGCTTCAGGCACTACAAATA03'(SEQIDNO:25),和反向引物5'-CCCMGTCTTGGGTTCTCTGMTTCCCCTTTCTC"3'(SEQIDNO鄰進(jìn)行PCR克隆。用下列引物5_GGGGMTTCAGAGAAGGTGGCGGTTCAGGCGGTGGAGGTTCAGGAGGTGGCGGATCAATGGCACAGGTTCTC"3'(SEQIDNO:27).4柳QuikChangeMuttiSite"DirectedMutagenesisKit(Stratagene，LaJoIIa^CA)，將編碼(GGGGS)3的連接子序列插入至sTF和膜聯(lián)蛋白VcDNA之間。將sTF-araiV基因克隆至pET-22b(+)載體iVcoI和報(bào)ndn位點(diǎn)。該載體編碼在,^有Hi"標(biāo)己的蛋白。由突，式的sTF與膜聯(lián)蛋白V連接組成的嵌合俠sTFAA-amV)，iM:定點(diǎn)突變產(chǎn)生。用QuikChangeMuitiate^DirectedMutagen^isWt(Stratagene,LaJ0n4CA)和下列引物5'-CTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAGCCGCAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTG陽(yáng)3'(SEQ、DND:28).將sTF的164和165位BS(即219M^^:度的sTF的165和166^S)進(jìn)行賴氨酸至丙氨酸的突變。將sTFAA-annV基因克隆至pET-22b(+)載體的M，ol和77^/01位點(diǎn)。DNA測(cè)序證實(shí)了所有三種構(gòu)建體的組成。sTF-annV，sTFAA-annV和膜聯(lián)蛋白V的,和純化將含sTHF-amV,sTFAA-annV或annV基因的pET-22b(+)載體，插入至鄉(xiāng)桿難株BL-21脂,ovag叫Madison^Wl)。該載^^了指導(dǎo)重組蛋白i4A周質(zhì)空間的信號(hào)肽。當(dāng)細(xì)菌懸液A6oo達(dá)到0.8時(shí)，在25r添加0,3mM異丙基-P"Ml!代半乳B比喃;^(IPTG)15小時(shí)誘導(dǎo)鋭。收獲細(xì)胞，進(jìn)斤滲透沖擊(5mMMgS04)，蝶周質(zhì)組分。用0.3MNaCl,0.05MNaH2P04,pH8.0平衡His-Select柱(Sigma^St.Louis，MO)ffl31固定金屬親和層析，將重組蛋白純化。在10和20mM咪唑存在瞎況下用相同溶液將柱洗滌，然后用250mM咪唑洗脫。^B兌、細(xì)0.1MNaCl,50mMTris-HClpH7.4透析。重組蛋白的純度和身份，用SDS-PAGE和Western印i己檢測(cè)。[薩〗磷脂結(jié)合分析嵌合體對(duì)含PS磷脂泡囊的親和性，通過(guò)使用商購(gòu)aPTT凝結(jié)劑(DadeActinFSLDadeBehring,NewarkDE)作PS源的6fca公JR^方ii4行測(cè)量。按照制造商4頓說(shuō)明重構(gòu)試劑，并以1:10繊于補(bǔ)加2.5mMCa卩的140mMNaCl，0.01MHEPES，pH7.5(HBS)溶液中(HBS"Ca，。將^#磷月騰液(10mL)在包被微離心管(Slickseal，NationalScientific,Claremon^CA)的HBS-Ca吣溶液中，與50nMFTTC-膜聯(lián)蛋白V(使微中PS飽和的濃度，可實(shí)驗(yàn)測(cè)定)M育。37tl溫育15min后，將混合物16,000xg離心20min。將團(tuán)塊在HBS^Ca^溶液13中洗滌，然后重懸T^不同量各未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性蛋白(膜聯(lián)蛋白V，sTF-annV或sTFAA-annV)的HBS《aW溶液中。再次37'C溫育12hr后，將混合物離心，將團(tuán)塊在HBS-Ca^溶液中洗滌。然后將團(tuán)±爐懸于補(bǔ)加10mMEDTA的HBS中，室溫溫育16hr，以洗脫結(jié)合的FITC-膜聯(lián)蛋白V。將管離心，移出上清液。通過(guò)熒光微板讀數(shù)儀(Victor2,Wallac，PeikinElmer，Boston^MA)測(cè)定熒光(激發(fā)波長(zhǎng)485nm;^!t波長(zhǎng)535nm)，確定上清液中FITC-膜聯(lián)蛋白量。VII因子自激活分析嵌合蛋白鵬W因子自激活的能九fflil在含5mMCaCl2的0.1MNaCl,50mMTris-HCl,0.1%牛血清白蛋白，pH7.4(TBS)(TOS/Ca2,溶液中，將各嵌合蛋白(終濃度，80nM)添加至VII因子(終濃度，80nM)進(jìn)行測(cè)量。在<頓sTF-annV或sTF的實(shí)驗(yàn)中，將PC/PS泡囊以與天然TF制備物相同鄉(xiāng)鵬n濃度，添加至溫育混^tK總磷脂濃度，810mHPC:PS摩爾比=4:1)。錢定時(shí)間間隔，從各溫育混^t/移取10mL等5^樣，轉(zhuǎn)移至含40mLTBS+5mMEDTA的聚苯乙烯管中，終止反應(yīng)。所產(chǎn)生VTIa因子的量，M添加150mLTBS/Ca2+,過(guò)量sTF，和Chromozymt-PA(終濃度分別為5mH124nM和5mM)，并檢測(cè)Aws的變化而測(cè)量。VIIa因子結(jié)合分析sTWTF誘導(dǎo)的Vila因子胺,活性增加用于對(duì)這些蛋白與Vila因子的結(jié)^i4行定量。將逐步增加濃度的sTF-annV，sTFAA-annV或sTF，在96孔分析板中的TBS/Ca^溶液中與VHa因子(5nM)溫育。室溫10min后，將Chromozymt-PA加入(終濃度1mM)，用微板讀數(shù)儀(MolecularDevices,MenloParl^CA)在405nm處，測(cè)量底物水解的初速率。從測(cè)量值減去不存在sTF，sTF-annV或sTFAA-annV時(shí)的Vila因子背景活性。動(dòng)力學(xué)參數(shù)用Prism4(GraphPadSoftware5SanDiego，CA)計(jì)算oX因子撒活sTF,sTT-annV,sTFAA崔V或天然再脂化(relipidated)TF雜情況下Vila因子介導(dǎo)的X因子激活，M^—期分抓onestageassay)進(jìn)行。將sTF,sTF-araiV，sTFAA-annV或天然TF加入TBS/Ca2+溶液中的1nMVila因子，X因子，PC/PS(摩爾比，4:1)和0.5mMChromozymX中。20min后檢測(cè)生艦物水解(A405變化)，參照純化人Xa因子制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將離化為Xa因子濃度。取所《尋拋物線導(dǎo)數(shù)扭riv81^ofresultingparabolicprogresscurve(SoflmaxPro,MolecularDevices,MenloPari^CA)，確定Xa因子產(chǎn)^3I率，用Prism4(GraphPadSoftware,SanDiego，CA)計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。血漿凝結(jié)分析凝結(jié)時(shí)間不同濃度重組蛋白和PC/PS(摩爾t匕4:l)存在情況下及添加CaCl2后的正常人檸檬酸鹽化血漿的凝結(jié)時(shí)間，'用機(jī)械凝結(jié)測(cè)量?jī)x(ST4，DiagnosticaStago,Parsipanny,NJ)測(cè)量，^i!j量上限為999s。,撒活的^(paitialK^ijflL酶原激酶時(shí)間將商業(yè)獲得aPTT試齊lJ(Dade0Actin⑧，DadeBehring)以1:50,于TBS，在各祌濃度sTF，膜聯(lián)蛋白V或sTF-annV存在情況下，用TiS行111t酸鹽化AJL漿凝結(jié)時(shí)間測(cè)量。將血槳與糖aPTT試劑和重組蛋白37。C溫育3min，然后添加25mMCaCl2。形成凝辦萬(wàn)需時(shí)間用|凝結(jié)測(cè)量?jī)x測(cè)量。激活的偏促凝血酶原激酶時(shí)間(Ac^atec/partfe/ffvom6pptes脅(frne，aPTI^根據(jù)制造商使用說(shuō)明，將含1單位/mL肝素鈉(AmericanPharmaceuticalPartners,Inc.LosAngeles,CA)或依諾肝素lft(Lovenox⑧,AventisPharmaceuticals,Bridgewater,NJ)與不同、濃度的sTF-annV或Vila因子的血漿的aPTT，用商業(yè)獲得aPTT試劑(Actin⑧FSL;DadeBehring，New昧DE)進(jìn)行測(cè)量。小鼠尾出血時(shí)間將小鼠按俄克拉荷馬大學(xué)|科學(xué)中心機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)(theUniversityofOklahomaHealthSciencesCenterInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)認(rèn)可的方案，進(jìn)行圈養(yǎng)和研究。將小鼠皮下皿依諾肝素鈉，兩小時(shí)后用戊巴比勢(shì)60mg/kg，i.p.給予)，。將尾在37。C常MS水中預(yù)暖，用解剖刀在直徑2mm處橫切，然后將尾置于37"恒溫常MibJC管中。記錄出血停止所需時(shí)間。在初步劑量探尋實(shí)驗(yàn)中，逐步增加給予依諾肝素鈉的劑量。一旦誠(chéng)劑量確定(20mg/kg)，首次實(shí)驗(yàn)5min后進(jìn)行第二次出血時(shí)間測(cè)量。卜的出血時(shí)間，艦在鄰近首次橫切的5mm處，橫切尾而進(jìn)行。與第一次相比，第二次出血時(shí)間不具有顯著性差異(p=03，雙尾成對(duì)t-teAPrism4,GraphpadSoftware)。未處理小鼠然后用類似方式處理，但是在首次出血時(shí)間確定后，立即靜脈SMsTF-annV(90mcg/kg)。注射5min后進(jìn)行第二次出血時(shí)間測(cè)量。雙尾自t-test，用于比較兩次出血時(shí)間。然后研究其它組動(dòng)物。SQ皿鹽7M依諾肝素(20mg/kg)兩小時(shí)后，給小鼠IV,sTF-annV(90mcg/kg),鹽水sTF，膜聯(lián)蛋白V,或者sTF+膜聯(lián)蛋白V的組合。所有蛋白以sTF-annV的等摩爾量注射。10，后測(cè)量出血時(shí)間。結(jié)果膜,白V和膜聯(lián)蛋白V嵌合體的,和純化將編碼三種蛋白的cDNA構(gòu)建體(膜聯(lián)蛋白V，sTF-annV和sTFAA-annV)，在^W桿菌(E.coli)周質(zhì)空間表達(dá)，將蛋白用固定金屬親和層析純化(參見(jiàn)圖1，純化蛋白用SDS-PAGE和western印記分析)。在初始研究中，比較了在相同濃度添加的磷脂和CaCl2存在的情況下，sTF，天然TF,和sTF-annV加皿漿凝結(jié)的能力。如圖2A所示，sTF-annV和天然TF相比sTF，在更;^體上縮短了血漿凝結(jié)時(shí)間。接著，用IWaPTT實(shí)驗(yàn)，確定sTF-annV效果是否育^lil^加sTFMM聯(lián)蛋白V復(fù)制。在,aPTT試齊O(用作磷腺勒和sTF，膜聯(lián)蛋白V，sTF+膜聯(lián)蛋白V組合，或sTF-annV存在情況下，將血漿復(fù)f5(recalcified)。如圖2B所示，同時(shí)加入sTF和膜聯(lián)蛋白V，不能重現(xiàn)sTF-annV的促凝效果。在該條件下，sTF-annV顯示出血漿凝結(jié)的兩相效應(yīng)，在更高濃度下延長(zhǎng)凝結(jié)時(shí)間。該結(jié)驟示，在更低濃度下因sTF結(jié)構(gòu)域而雜促M(fèi)^IS，在更高濃度下膜聯(lián)蛋白V抗凝效應(yīng)則占主導(dǎo)。為了艦該假說(shuō)，構(gòu)建！WsTF結(jié)構(gòu)域在165位和166位(218aasTF的164和165位)l^氨自變?yōu)楸彼岬臉?gòu)建體，該突變已知會(huì)損傷X因子激活。所得嵌合俠sTFAA-annV)也,出血漿凝結(jié)雙相效應(yīng)(圖2C)，但其比sTF-annV有更低的促凝活性，并且在M,度下還展示出抗凝活性。在存在TF-annV和sTFAA-annV能改^ifiL漿凝結(jié)證據(jù)的情況下，對(duì)其組分結(jié)構(gòu)域再進(jìn)行詳細(xì)功能鑒定。磷脂結(jié)合活性sTF-annV和sTFAA-annV結(jié)合PS的能力，用公開的PS-結(jié)合實(shí)驗(yàn)之6^Sit行分析，其中膜聯(lián)蛋白V,sTF-annV或sTFAA-annV與FITC-膜聯(lián)蛋白V競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磷贈(zèng)泡囊。如圖3所示，兩種嵌合體都展示出與膜聯(lián)蛋白V相當(dāng)?shù)腜S-結(jié)合活性。膜聯(lián)蛋白V的Kd為12nM;sTF-annV，為13nH以及sTFAA-annV，為llnM。Vn因子自激活活性先前已顯示，TF而不是sTF，在PS和Ca2+存在情況下，■VII因子自激活。sTT不能增加VII因子自激活的原因在于，sTF:VHa復(fù)^tl對(duì)含PS膜的低親和力。由于嵌合體的膜聯(lián)蛋白V結(jié)構(gòu)鵬示出對(duì)含PS月旨質(zhì)體的高親和力，我們鄉(xiāng)IJsTF-annV可皿與TF相當(dāng)?shù)腣II因子自'^:活，而不與sTF相當(dāng)。如圖4戶標(biāo)，sTF-araiV以與天然TF相當(dāng)?shù)乃俾剩灹薞H因子自激活而不是sTF(其無(wú)活性)。該結(jié)果也際，sTF-annV能結(jié)合VII因子，與天然TF相當(dāng)。VHa因子結(jié)合活性為了測(cè)量嵌^^體的VHa因子結(jié)合，我們對(duì)Vila因子結(jié)合TF/sTF時(shí)其胺,活性的增加，進(jìn)行了定量。由于sTF結(jié)合膜的情況不佳，所以我們?cè)谌狈S情況下進(jìn)行分析。sTF-annV和sTFAA-annV都可以與sTF相同的程度，增加Vila因子的胺,活性，這表明，膜聯(lián)蛋白V結(jié)構(gòu)域并不干擾sTF結(jié)構(gòu)域結(jié)合VHa因子的能力(數(shù)據(jù)未示出)。s!F的Vila因子結(jié)合IQ為8.17nM;sTF-annV為7.05nM;以及sTFAA-annV為3.47nM，所有f^lte稀在磷脂泡囊瞎況下得出。X因子撒活檢測(cè)了sTF-annV和sTFAA-annV，對(duì)Vila因子介導(dǎo)X因子激、，率的效果。如圖5A所示，在sTF-annV或sTFAA-annV存在情況下，X因子撒活速率高于sTF存在情況下的激活速率。如sTFAA在先研究所預(yù)期的那樣，sTF-annV將比sTFAA-annV更有能力支持X因子的激活。如表1所示，在sTF-annV存在情況下戰(zhàn)因子催化效^(KA)約為天然TF存在情況下的67%，但其約為sTFAA-annV催化效率的5倍。由于高濃度sTF-annV與延^JfiL漿凝結(jié)時(shí)間有關(guān)，所以劍門研究了逐步增加、濃度的sTF-annV對(duì)VHa因子介導(dǎo)X因子激M率的，。如圖5B所示，sTF-annV展示出X因子、激活的雙相效應(yīng)，這與血漿凝結(jié)，相類似。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>sTF，sTF-膜聯(lián)蛋白V和sTFAA-annV對(duì)Vila因子介導(dǎo)的X因子撒皿率的艦。sTF-膜聯(lián)蛋白ffi素存在情況下對(duì)凝結(jié)的效應(yīng)肝素為常用抗凝劑，其ffl^增強(qiáng)serpin(—種抗WL酶蛋白X主要卿制Xa因子和WL酶的能力而起作用。在各種sTF-annV濃度下，我們將未分級(jí)肝素鈉或依諾肝素，低分子量肝素，加入至檸檬酸鹽化血漿中，然后測(cè)量血漿aPTT。sTF-annV縮短了含1單你mL未分級(jí)肝素(圖6A)或1單你mL依諾肝素(圖6B)血漿的aPTT。Vila因子，雜多種與WL酶產(chǎn)量M^相關(guān)的臨床狀況中用作治療劑治療出血，該因子也縮短了肝素處理血漿的aPTT，盡管不如sTF-annV那么纟iyc(圖6A和6B)。sTF-annV對(duì)小鼠尾出血時(shí)間的效應(yīng)雖然人模型出血時(shí)間實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是主要反映了血小板功能，但是小鼠凝血酶生產(chǎn)的缺陷卻是由延長(zhǎng)的出血時(shí)間所反映。因此，我們給予正常小鼠依諾肝素，以確定s!P-annV是否會(huì)影響體內(nèi)方式的MlfiL酶產(chǎn)生。將小鼠皮下注射依諾肝素辨20mg/kg)，一種已知會(huì)抑帶JWL酶產(chǎn)生的藥物，然后2小時(shí)后測(cè)量出血時(shí)間。該出血時(shí)間傷口其出血停止后，將動(dòng)物靜脈注射sTF-annV(90mcg/kg)，5min后再次測(cè)量出血時(shí)間。(初步實(shí)驗(yàn)顯示，依諾肝素處理的動(dòng)物的第二次出血時(shí)間與第一次出血時(shí)間不存在顯著差異，p=0.3，自,t-test)。如圖7A所示，sTF-annV顯著縮短了依諾肝素處理小鼠的出血時(shí)間(p:O.Ol，成對(duì)鵬t-test)。依諾肝素處理導(dǎo)致的平均出血時(shí)間10.7溯(中值，6.1^H+)。sTF-annV處理后的平均出血時(shí)間為1.4，(平均值，U併中)。未處理動(dòng)物的平均出血時(shí)間為1.2併中。在其它組小鼠中測(cè)量尾出血時(shí)間。sTF-annV縮短了未用依諾肝素處理動(dòng)物的出血時(shí)間(1.5±0.7minVS3.6±0.2mii^pX).02，Welch's艦未艦t-test;圖7B)。然后將幼稚動(dòng)物用依諾肝素(20mg/kg,SQ)處理，2小時(shí)后，DSf注射sTF-annV(90mcg/kg)或等摩爾量的sTF，膜聯(lián)蛋白V，或者81￥+膜聯(lián)蛋白V組合。如圖7B所示，縮短的出血時(shí)間僅在sTF-annV處理動(dòng)物中觀察至lj(p<0.0001,Welch's校正鵬未艦t-test)，錄明嵌合體本身而不是其M成分，縮短了出血時(shí)間。先前研條明，分離的TF鵬卜結(jié)構(gòu)織sTF褓留了足以允許結(jié)合Vila因子并增強(qiáng)其小肝三肽合鵬物的構(gòu)象。然而，sTF在艦Vila因子介導(dǎo)的X因子激活方面，效率更低。這似乎是因?yàn)閟TF與sTF-VHa復(fù)，對(duì)膜表面有相對(duì)較低親和力。通過(guò)取代TF跨膜結(jié)構(gòu)域的糖磷脂酰肌醇錨定部分，Paboreky改al能產(chǎn)生有完全促凝活性的膜結(jié)合sTF變體，這表明如果適當(dāng)限制于細(xì)胞表面，sTF的功能將與天然TF相當(dāng)。其它人也偶聯(lián)了sTF與肽部分，并顯示了其體內(nèi)和體夕隙結(jié)系統(tǒng)的活化。各種研究都禾,了特定細(xì)胞類型^l剖區(qū)特異的耙向結(jié)構(gòu)域，所有這些研究及開^[癌劑，而不，的ihlfiL化合物。在本工作中，含sTF結(jié)構(gòu)域的嵌合體蛋白在雌的實(shí)施方式中創(chuàng)建，有下列幾種新特征(l)它對(duì)在止血中扮演作用的細(xì)胞類型具有"多特異性"；(2)它具有具抗凝結(jié)特性的膜耙向結(jié)構(gòu)域。因此，雖然膜聯(lián)蛋白V作為PS結(jié)合蛋白的能力，使其作為耙向部分具有吸引力，但是其抗凝活性卻阻礙了它應(yīng)用于設(shè)計(jì)為促aibfe劑的構(gòu)建體中。因此，sTF-annV初始研究涉及確定其是否確實(shí)為促凝劑，如果是，其促凝活性與sTF和天然TF比較如何。因?yàn)槲覀冋J(rèn)識(shí)到膜聯(lián)蛋白V與磷脂的比例是重要的，所以我們?cè)诜治鲋欣昧字瑧乙?，而不是激活?xì)胞，以保持一致性。在我們發(fā)現(xiàn)sTF-annV具有促凝活髓(圖2A)，劍門確定促凝活性是嵌合鵬異的，其不育^13±添加等摩爾量的3拉的sTF和膜聯(lián)蛋白V混^tl來(lái)重現(xiàn)(圖2B)。謝門也制備了嵌合辨本文稱為sTFAA-annV)，其中sTTF165和166位魏酸具彌氨輕丙氨酸的突變，該改變已知會(huì)顯著斷氐TF促凝活性，我們發(fā)現(xiàn)，該嵌合糊失了促凝活性(圖2C)。最后，劍門研究了改變反應(yīng)混^tl中嵌合做S比例的后果。我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)sTF-annV和sTFAA-annV而言，蛋白/PS比例增加艦?zāi)滁c(diǎn)時(shí)，將產(chǎn)生抗凝^0^(圖2C)。因此，當(dāng)雜能結(jié)合其它凝結(jié)因子的功能性過(guò)量PS結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，MM聯(lián)蛋白V結(jié)構(gòu),sTF靶向至膜表面，將是促凝的。當(dāng)膜聯(lián)蛋白v存在難加時(shí)，這離點(diǎn)將變得敦隹以艦?zāi)Y(jié)因子vn/vn^x,vm，D^v和n，且凝結(jié)減慢。接著我們對(duì)包含sTF-araiV的功能結(jié)構(gòu),行了分析，以確定將該它們連接在一起是否將導(dǎo)致兩者之一的功能增加或損失。齢體結(jié)始PS泡囊能力的實(shí)對(duì)圖3)、皿vn因子自激活實(shí)觀圖4)、增強(qiáng)vna因子胺(W及x因子,活性實(shí)驗(yàn)(圖5)，表明sTF和膜聯(lián)蛋白V結(jié)構(gòu)域都具有功能，盡管天然TF，Vila因子至X因子的催化效率是sTF-araiV的兩傲參見(jiàn)表1)。闕這對(duì)開究表明，sTF彌V可用作促凝劑，但其促凝活性很;^上繊于磷脂濃度。因?yàn)轶w內(nèi)傷口位置的PS局部濃度并彌切了解，所以體外實(shí)驗(yàn)只能有限預(yù)測(cè)PS結(jié)合蛋白(例如sTF-amV)的體內(nèi)行為。為了在可由身體,傷的應(yīng)激確定PS濃度的情況下體內(nèi)檢測(cè)sTF-amV，我們進(jìn)行了小鼠尾出血時(shí)間實(shí)驗(yàn)。在之前給予依諾肝素，低^fSfF素，用于損傷tt酶產(chǎn)生盼瞎況下，該方法已知對(duì)缺陷的Wl酶制造敏感。在預(yù)備該實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谝乐Z肝素及未分級(jí)肝素存在情況下，研究了sTF-annV對(duì)血漿凝結(jié)的^^，并且將其與Vila因子效應(yīng)相比較，所述Vila因子是目前用于治療具有多種出血癥患者的蛋白。Vila因子和sTTF-annV都縮短了肝素和依諾肝素處理血漿的凝結(jié)時(shí)間，盡管sTF-annV比Vila因子強(qiáng)大幾個(gè)|^(圖6)。我們用逐步升高劑量的依諾肝素處理小鼠，確立了再現(xiàn)性增加兩次Jl,出血時(shí)間的劑量。然后劍門在第一次和第二次尾出血時(shí)間之間，尾靜脈注射sTF-annV。在所有測(cè)試的動(dòng)物中，第二次出血時(shí)間顯謝氏于第一次出血時(shí)間。用其它動(dòng)物實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)sTF-annV的玄娘，不能由^^湖slP，膜聯(lián)蛋白V，或兩者的混^tim現(xiàn)。因?yàn)槿薞Ha因子在小鼠血槳中不具有完全活性，所以Vila因子不肖調(diào)于直接比較。選用該sTF-annV劑量是因?yàn)樵搫┝?基于^S)與常規(guī)推薦重組vna因子的劑量相當(dāng)。這些研究顯示，似乎拮抗性蛋白結(jié)構(gòu)域可在嵌合分子中組合形成蛋白，所形成蛋白其離并不簡(jiǎn)單地由主結(jié)構(gòu)域凈M所確定。蛋白sTF-annV展示出可反映其任一相對(duì)結(jié)構(gòu)域的，，這取決于相關(guān)瞎況。sTF-annV展示出促凝和抗凝活性的能力使^ihlfiL好中獨(dú)樹一峽。因?yàn)锳nnV結(jié)合PS，而PSML液凝結(jié)所需，所以單獨(dú)4OTAnnV可,凝結(jié)機(jī)制蛋白結(jié)合PS，因此AmV實(shí)際上抑制血液凝結(jié)，因雌常不會(huì)將其認(rèn)為^lhlflL劑。盡管sTF在高濃度下肖劭BM液凝結(jié)，但本發(fā)明記載的sTF與annV的復(fù)，，將不會(huì)是提高血液凝結(jié)顯而易見(jiàn)的方法，而且因?yàn)锳nnV結(jié)構(gòu)鵬在，很可能被本領(lǐng)域知識(shí)人員預(yù)期，其要么不具有她效應(yīng)，要么具有抗凝效應(yīng)。血^fe源的lhJfiL劑已經(jīng)顯示出在某些患者中誘導(dǎo)血栓(不期望的血液凝結(jié))，血栓也已經(jīng)棚重組VHa因子治療的某些夕M先患者中觀察到。本發(fā)明提供了定位sTF至撒活血小板區(qū)域的方^(本文記載的AnnV結(jié)構(gòu),其它結(jié)構(gòu)域)，與在脈管系統(tǒng)中循環(huán)的效力相當(dāng)?shù)膇bfiL化^tl相比，其可能更娃。我們的工作顯示，在更高濃度下，sTF-annV蛋白喪失了促凝^iS(止血)，變成了抗繊U，這一點(diǎn)可iiillfiL液凝結(jié)時(shí)間的延長(zhǎng)來(lái)證明。這可能是因?yàn)橐韵率聦?shí)在高濃度下，由于占領(lǐng)了X因子潛在結(jié)合位點(diǎn)，AnnV結(jié)構(gòu)域玄M變得比其定位sTF結(jié)構(gòu)^SM表面的艦更重要。沒(méi)有手隨其它她劑在高濃度下具有抗凝活性。該特征可能使sTF-AnnV比其它當(dāng)前可獲得的ihlfiL劑更安全。[薩]實(shí)用性本發(fā)明嵌合蛋白可用于各種與ihJfe和血栓形成相關(guān)的治療應(yīng)用。用作lhlfiL劑本發(fā)明構(gòu)思^嵌合蛋白sTF-armV(^文記載與其它PS結(jié)合元件連接的sTF嵌合體)于出血患者，以在出血區(qū)域增加MlfiL酶產(chǎn)生而使出血停止。通常，按壓或縫合能使出血停止。然而，有些時(shí)候這些方法不能容易地^^，在此情況下，化^tl例如sTF-annV將是有用的。這樣的情況包括(l旌抗凝藥物存在瞎況下的出血，(2)缺乏(先誠(chéng)非先天)一種或多種WL因子的出血，例如這可以在夕唯和大量輸血、維4也命K缺乏、血友病、血液》疑結(jié)因子抗體皿中觀察到，(3)肝臟疾病，(4)在壓迫出血區(qū)無(wú)效頓法應(yīng)用情況下的出血，例如損傷彌散區(qū)出血，食道脈管曲張、胃炎、膀胱炎、子宮內(nèi)膜炎、血管損傷或頭創(chuàng)傷出血，(5)在血小板不以適當(dāng)量存在情況下的出血，(6)Ml小板不能正確辦功21能瞎況下的出血，^#(7班出血癥患者治療中，用作重組Vila因鄰DA-批準(zhǔn)藥物)的輔助藥。也可預(yù)期本文記載的sTF-annV^^[以嵌合蛋白，用于在不與癌狀態(tài)相關(guān)的血管中誘導(dǎo)血栓形成，但^t宿主可能是有害的。這樣的血管收1包括但不限于，毛細(xì)管擴(kuò)張、動(dòng)脈畸形、靜脈畸形、^ffl血管畸形、淋巴管畸形、動(dòng)靜脈畸形、血管瘤、或動(dòng)脈瘤。此外，本發(fā)明預(yù)期用該記載蛋白治療以結(jié)構(gòu)正常的血管生長(zhǎng)為特征的區(qū)域，其方式或位點(diǎn)可能^1S:宿主健康，有時(shí)統(tǒng)稱其為"新血管生成"區(qū)。可以預(yù)期，將sTF-annV或其變體^宿主(M:本文記載的多種途徑中的任一種)，從而以治療方式誘導(dǎo)局部血栓形成。在之前或同時(shí)利用另一治療藥征以提高sTF-annV效力可能^i、要的。這種輔助治療可能包括藥物，化學(xué)物，頓躐，或者娜治療。膜聯(lián)蛋白V可在腫瘤內(nèi)結(jié)合腫瘤禾n^jfiL管細(xì)胞。膜聯(lián)蛋白V(^文記載的其它PS結(jié)合結(jié)構(gòu))介導(dǎo)的sTF腫瘤定位，將導(dǎo)致弓l刻中瘤內(nèi)血液凝結(jié)，從而切,輸?shù)街辛龅臓I(yíng)養(yǎng)流，導(dǎo)致腫瘤死亡。本發(fā)明利用AnnV結(jié)構(gòu)域或PS結(jié)合結(jié)構(gòu)將嵌合蛋白定,腫瘤。本發(fā)明也構(gòu)思將sTF-amV用于縦治療物質(zhì)，例如娜性物質(zhì)或化療化合物，到中瘤離常血管床。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如將治療性增強(qiáng)的(例如放射性的)sTF-annV^it至患癌宿主。將治療活性的sTF-annV定位于腫瘤血管中，可能離截好化療、放療或其徵作以增強(qiáng)sTF-annV對(duì)目標(biāo)區(qū)域的耙向，這將增強(qiáng)分子的治療效果。使用這種^^的、與放射性或化療部分連接的sTF-annV好可用于治療各種癌癥、血管瘤、或血管畸形中的任一種?；熁蚍派湫晕镔|(zhì)與蛋白如何連接的實(shí)例，在U.S.6,074,643;6,696,478;6，403，771;5,620,675;5,346,686;5，219，556;6，852，318,5,863,538;7,001,991;5,108,987;5,000,935;4,895,714;和4，886，780中有記載，將^&tk明確iM^弓講入。本發(fā)明化合物的"治g效量"或"生物有效量"，是指可有效^S制、抑制、減少劍J^llML頓栓形成，或者控制、抑制或M^、腫瘤生長(zhǎng)的量。術(shù)語(yǔ)"控制"意指減慢、打斷、阻止或停lK病或狀7皿展，且不一定顯示出完全消除,所有癥狀的一切過(guò)程。[OIOS]術(shù)語(yǔ)"治療有效量"或"生物有效量"進(jìn)一步意在定義產(chǎn)生疾病狀況特征性的ffi可參數(shù)或臨床癥狀,的量。實(shí)際劑量針對(duì)不同特定^f會(huì)有不同，其根據(jù)患者^(guò)M^況、癥^重禾i^相反J際而變化。本文使用的術(shù)語(yǔ)"個(gè)體(subject)"或"患者"是指患有特定疾病、需要本文附己載治療的溫血?jiǎng)游铮绮溉閯?dòng)物。應(yīng)該理解，豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、牛、綿羊、動(dòng)物園動(dòng)物(200animals)、家畜、以及人類，都是本術(shù)語(yǔ)意義范圍內(nèi)的動(dòng)物實(shí)例。用于本文記載的治療的化合物的治旅效量或生物有效量，可M使用常規(guī)技將卩觀^^似斜牛下獲得的結(jié)果，由參與診斷醫(yī)師(本領(lǐng)域的技術(shù)人員)容易地確定。在確定治療有效劑量時(shí)，參與診斷醫(yī)師要考慮多種因素，包括但不限于B甫乳動(dòng)物的種類；動(dòng)物尺寸、年齡和總體狀況；所涉及特定g或狀況；疾病^^況的相關(guān)禾號(hào)#重程度；個(gè)體的反應(yīng)；給藥的特定化合物;給藥方式；給藥制齊鵬征性的的生物利用度；戶腿的劑量方案；伴隨藥物的使用；以及其它相關(guān)情況。本發(fā)明化合物的治旅效量或生物有效量，也指治療本文記病狀況或另一狀況有效的化合物量。本發(fā)明組合物的治療有效量或生物有效量，通常包含足量活性成分(即嵌合蛋白)以iim約0.1ng/kg至約100mg/kg(活性成分驢患者體重)。優(yōu)選地，組^,至少10ng/kg至50mg/kg，最，至少100ng/kg至10mg/kg。本發(fā)明方法的執(zhí)行，包括以任意誠(chéng)系統(tǒng)鵬部制劑、以有效3IU^h文所歹柳量的量，給予個(gè)體治旅效量或生物有效量的活性成分。藥劑給藥可以一次性給藥，爽例如)每天1-5次、或每周1次或2次，^lil靜脈滴注連續(xù)給藥，這取決于所期望的治療效果。顯然，im的給藥劑量和給藥方式，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。制劑制備領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以容易髓當(dāng)?shù)慕o藥形式和給藥方式，這取決于戶膽化合髓定特性，所治療疾病的狀態(tài)或狀況，疾病或微J^f處的階段，以及4頓本領(lǐng)域已知審U劑技術(shù)的其它相關(guān)瞎況，這些瞎況例如記載在Remington'sPharmaceuticalSciences,latestedition^MackPublishingCo.中。藥物組^t/可用本領(lǐng)域的己知技術(shù)進(jìn)^f格。典型地，將治旅效量tt^^J與藥學(xué)可接受的載^^t行混合。本發(fā)明的化，或組合物可以多種途格合藥，例如口S蜮胃腸外給藥(即皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、im內(nèi)給藥、或氣管內(nèi)給夠，眼內(nèi)給藥，或噴內(nèi)給藥。對(duì)于口鵬合藥而言，化，可制備成固體或液體制劑，例如膠囊、丸齊IJ、片抓錠劑、熔融物、粉末、懸浮劑、或乳劑。固脾位劑型可為常規(guī)明膠形式的膠囊，包含例如表面活性劑、潤(rùn)滑劑以及惰性填充抓諸如乳糖、蔗糖和就淀粉，或者它們可為緩糊柳。藥劑可以腸衣包被。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明化，可用傳統(tǒng)片劑基質(zhì)例如乳糖、繊和玉米淀粉，結(jié)合粘合齊綱如阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠，崩解劑例如馬鈴薯淀粉或藻酸，以及潤(rùn)滑劑例如硬脂酸或硬脂,，制成片劑。液體制劑可將活性成分、溶解于水性或非水性藥學(xué)上可接受的1」而制備，所述藥學(xué)上可接受'凝l」還可包含懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、以及防腐劑，這些都是本領(lǐng)域已知的。對(duì)胃腸外給麵言，可糊七^(guò)tl溶解于生理可接受的藥繊體，以溶液或懸浮液纟好。說(shuō)明性的魏藥物載體是，水、鹽水、^H溶液、果糖溶液、乙醇、或者動(dòng)植物或合成來(lái)源的油。藥物載體也可包含本領(lǐng)域己知的防腐劑和緩沖劑。本發(fā)明化合物在某些剝牛下，也可局部給予。這可通過(guò)簡(jiǎn)單配制待給藥化合物的溶鵬行，在存在或不存在其它賦形劑情況下，雌i頓已矢艦M皮吸收的激W，例如乙醇或二甲基亞P(DMSO)進(jìn)行。優(yōu)選的局部給藥，使用貯庫(kù)和多子,藥貼或固體基質(zhì)類藥貼進(jìn)行。如上所述，組合物也可包括飾載體。對(duì)于局部應(yīng)用而言，任何常規(guī)賦形劑tN"添加，將活性成分制成乳液、軟膏、粉末、乳膏、噴霧劑、或氣溶膠。對(duì)于外科^A而言，活性成分可與任一公知生物可降解和生物可t^載體組合，例如聚乳酸和膠原制劑。這些材料可以是固^^A物、縫合物、海綿物、傷口敷料，等等形式。在fti可情況下，對(duì)于這些材料的局部應(yīng)用而言，活性成分通常以龍比約1:1^至1:20,000在載體^!W劑中出現(xiàn)，但不限于該范圍內(nèi)的比例。局部用組合物的制備，在Remington'sPharmaceuticalSciences,latestedition,(MackPublishing)中有詳細(xì)記載。其它的藥物方法可用于調(diào)節(jié)藥效持續(xù)肌半衰期增加的制齊訴暖釋制劑，可ffl3^頓聚合物結(jié)合、復(fù)合或吸收本文記載的蛋白而獲得?？刂迄i和/鵬加半衰期，可m^擇魏大賴?yán)缍嗵恰⒕埘?、聚m^酸、聚乙烯吡咯烷酮均聚物、乙烯醋酸乙烯酯、甲基纖維素、或羧甲基纖維素，以及丙烯鵬，例如N《2條丙萄甲基丙烯鵬、大肝的^^濃度、以及齡的方法而獲得，以控制釋放。另一控制緩釋制劑藥效持續(xù)期或半衰期的可能方法是，將嵌合蛋白或其功能衍生物整合至多聚物材料顆粒中，例如聚酯、聚酰胺、聚氨基酸、水》鵬、爽乳酸)、乙烯醋酸乙烯共聚物、諸如PEG的共聚物麟、以及聚(l-天本文記載蛋白的半衰期，可用本領(lǐng)域已知方法將其與其它分子例如聚合物結(jié)合形成藥物-聚合物綴而增加。例如，蛋白可結(jié)合至本領(lǐng)域已知的惰性聚，^，例如在稱為"PEG化"的方法中的聚乙二SKPEG)分子。PEG化由此可增加體內(nèi)半衰期，從而增加蛋白好治療效果。PEG化也可斷氐蛋白肝潛在抗原性。PEG化也能增強(qiáng)蛋白溶解度，從而提高其治療效果。所用PEGs可為線性^5:鏈。PEG好可被官能團(tuán)f,，例如Harris改al，(9)戶標(biāo)，其頓內(nèi)被此明確M31援引引入，而且蛋白的氨基^或半胱氨^S(如果存在)或其中的其它連接氨基酸,用于連接PEG，其中PEG^T可載有一種或多種類型蛋白中的一個(gè)或多個(gè)，棘蛋白可載有一個(gè)以上PEG肝。"PEG化蛋白"是指本發(fā)明的蛋白，其具有的聚乙二,EG)部分共^Hi接在蛋白的M^^B^^^,團(tuán)上。"聚乙二醇"或"PEG"是指聚亞^S二醇化，或其衍生物，有或沒(méi)有偶職蜮偶軟活化部分衍生化(例如硫醇、triflate、lresylate、氮丙啶、環(huán)氧乙烷，或者雌馬來(lái)艦麟分)?；澹T如馬來(lái)艦胺單甲縫PEG，是本發(fā)明示例性或活化PEG化^tl。其它的聚亞皿二醇化合物，例如聚丙二醇，可用于本發(fā)明中。其它的魏聚^t/^^/包括但不P艮于例如，非多肽聚^tl，下列類型的帶電或中性聚合物葡聚糖、多聚唾液酸或其它糖類聚合物，生物素衍生物，以及樹狀聚，。術(shù)語(yǔ)PEG也包括其它聚亞^^化物類的聚^。例如，PEG可連接于蛋白的任意N端錢酸，禾P/^i接于N端錢酸的下游氨基酸,，例如賴氨酸、組氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸，棘本領(lǐng)職術(shù)人員已知的其它此類S^酸。例如，半胱氨酸-PEG化蛋白可M;將聚乙二醇與蛋白的半胱氨^S的含硫基團(tuán)進(jìn)fi^i接而制成?；瘜?duì),齢蛋白包含至少一個(gè)PEG部分，itiiM少兩個(gè)PEG部分超不消除活性、結(jié)舒蛋白的最多數(shù)量PEG部分，例如，PEG部分可結(jié)針M^酸BS，,在蛋白的N端部分或其P(逝。結(jié)合于蛋白的PEG部分，肝量分布可從約200至20,000MW。優(yōu)i^J:也，PEG部分從約1,000至8,000MW，更t^A^勺3-50至5,000MW，最優(yōu)選約5,000MW。PEG分子共價(jià)結(jié)合于^本發(fā)明化學(xué)傲布蛋白上的實(shí)際數(shù)量，可根據(jù)所期望的蛋白穩(wěn)定銜即血清半衰鄉(xiāng)而大幅變化。本文構(gòu)思的蛋白可用，例如(但不限于)美國(guó)專利Nos.，4,179,337;5，382，657;5,972,885;6,177,087;6,165,509;5,766,897;和6^17,869公開的fe^連接于PEG分子；該各文獻(xiàn)說(shuō)明書和附圖&tk明確M31M引引入。JtW卜，嵌合蛋白的血清半衰期可M用額外氨基酸或多肽延長(zhǎng)嵌合蛋白而增加，例如艦添加數(shù)個(gè),sTF結(jié)構(gòu)域，或#附著與治療個(gè)體相容的^1蛋白，例如人類個(gè)體的Arfl清白蛋白。此外，也可將嵌合蛋白包埋于制備的微膠囊中，例如，通過(guò)團(tuán)聚技術(shù)或界面聚合技術(shù)制備(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚"(甲基丙烯酸甲酯)微膠彰，或包埋于膠狀藥物m系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒、以及納米膠囊)或巨乳液(macroemulsions)中。這些技術(shù)在:W版本的Remington'sPharmaceuticalSciences中有公開。美國(guó)專利4,789,734記載了脂質(zhì)體中包埋生化物質(zhì)的方法，^ifc明確通過(guò)援弓l引入?？傮w而言，將物質(zhì)溶于水溶液，加入適當(dāng)?shù)牧字椭|(zhì)，如果需要，加A^面活性劑，然后將物質(zhì)進(jìn)行必要的透析鋼聲。GGregoriadis(10)對(duì)已知方法進(jìn)行了綜述。聚，或蛋白形成的微球，是本領(lǐng),術(shù)人員公知的，其能定制以通過(guò)胃Mil直接^A血流。或者，可整^劑，而且微球或微球復(fù)合物^A，以緩釋一定時(shí)期，范圍從數(shù)超數(shù)月。參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,906,474;4，925，673;和3,625^14，它們?cè)诖艘胱鳛閰⒖?。?duì)于本發(fā)明凍干產(chǎn)品的重構(gòu)而言，可使用無(wú)菌,液，所述稀釋液可含有,生理剩牛的通常接受的物質(zhì)稱或官方規(guī)定所要求的物質(zhì)。在S^面，無(wú)菌,液可包含緩沖劑以獲得生理可接受的pH，例如氯化鈉、鹽水、沖鹽水、禾p/^它生理學(xué)可接受并^gy^可安全JOT的物質(zhì)。一般而言，人體靜脈注射物質(zhì)應(yīng)與食品藥品監(jiān)督管理局所確立的規(guī)則一致，其可由本領(lǐng)m員獲得。藥物組^t/也可以是含上述多種相同物質(zhì)的水溶液形式，用于重構(gòu)凍干產(chǎn)品?；衔镆部梢运帉W(xué)可接受的酸或働卩成鹽給予，戶腿鹽M與無(wú)機(jī)酸反應(yīng)，例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、和磷酸，以及與有機(jī)酸反應(yīng)，例如甲酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙,、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、和反丁烯二酸，^K1與無(wú)機(jī)販應(yīng)，例如M^化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀，以M31與有機(jī)ms應(yīng)，例如單-,二-，三烷凝n芳基胺、以及取代的乙醇胺，而形成。如上所述，本發(fā)明化合物可并入用于治療目的的藥物制劑。然而，術(shù)語(yǔ)"藥物制劑"在本文中廣義意指包皿有本發(fā)明嵌合蛋白組合物的制劑，其不僅用于治療目的，而且用于本領(lǐng)域己知的試劑或診斷目的，或者用于組織培養(yǎng)目的。用于治療應(yīng)用的藥物制劑，應(yīng)包含"藥學(xué)上可接受的"或"治療有效量的"嵌合蛋白，即該用量是預(yù)防性或治療性繊措M0f必需的。如果藥物制劑用作試劑或診斷目的，那么它應(yīng)包含試劑量或診斷量的齢蛋白。本發(fā)明的范圍并不受限于本文戶;H己載的具體實(shí)施方式，因?yàn)檫@些實(shí)施方式意在說(shuō)明本發(fā)明的某一方面，而^M功能Wr實(shí)施方式都在本發(fā)明范圍內(nèi)。的瓶本發(fā)明化合物和方法的各種z鄉(xiāng)以及本文記載和顯示的那些，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，根據(jù)前文記載,而易見(jiàn)的。5.RufW,RehemtullaAMorrisseyJH,EdgingtonTS.PhosphcNi(ritHnd^)enderitand~dependentinteraclionsrequdredfbrtissuefactorreceptormidco^ctorfunction.JChem1^1;286(4):2158-86.01486.vanhtoerdeWL,deGrootPG,ReuteHngspergerCP.ThecomplexityofthephosphollfAlbfndb^proteinAnne:dnV.ThrambHa抓ost1995;73(2):172-9.01487.TaltJF.GibsonD.Phos(MpidblndftigofannexinV:effectsofcericiumandrrombrarwfrfwsphaWylserine咖tentArchBfochemBiophys1992;298(1):187-91.01幼8.ReuMr^spergerCP.Annex!ns:keyregulatorsofhaemostasis,thrombosis,andapoptosls.ThrombHaemost2001;86(":4139.0151]9.Harrisetal..Peflvlafl肌ANovelProoessfor,tfyjngPhararmacoklnetlcs.qinPharmacokinet2001:40(7);539"5015210.Gregn^sG.Chapter14.Uposomes,DrugCarriereinBiologyandMedldne,pp.287-341(AcademicPress,1979).015311DrakeMorrisseyJH,EdgingtonTS.Selectivecellularexpressionoftissuefactorinhumantissues.Implicationsfbrdisordersofhemostasisandthrombosis.AmJPathol.1989;134:1087-1097.0154RufW,RehwntirtlaA,MorrteseyJH,Ec^ngtonTS.Phosphol一cHndepenctentand-dependentInteractionsrequiredfortissuefactorreceptorandcoladorfiNfic^m.JBiolChem.1891',266:215821明.卵夠NeuwschwarK)~PF,MorrisseyJH.Deletionofthemembraneandio陶regionoftissueVictoraboHshesautoacSvationof紐ctorVIIbutnotcofaciorfunction.AnalysisofamutantwithaselectivedeficiencyInactivity.JBiolChem.1992;267:14477-14482.01敦PabwskyLR,CarasIW,FisherKL,GormanCM.UpWassociation,butnotthetransmembranedwnain,isrequiredfwtissuefactoractivity.Subs麵wiofthetransmembranedomainwithaphosphstW^inositolanchor,JBiolChem.1991;266:21911-21916.280157]MacfeuiaRG,BiggsR.Athrombingenerationtest;theappNcationbihaemophUiaandthrombo(ytopente.JCfinPath汰1953;6:3"8.01關(guān)CaenJ,BeHuociS.ThedefectiveprothrombinconsumptioninBemard-Souliersyndrome.Hypcrthesesfrcwn1948to1982BloodCells.1983:汰389-399.P效〗Rosh^J,Be\rsEM,ConrfuriusP,etaLImj^edfactorXandprothrombinacBvafonassociatedwithdecreasedphosphollpkiexposureinplateletsfromapatientwithaWeedingdisorder.Blood.1985;65:1557-1561.0160}ReverterJC,BeguinS,KesselsH,KumarR，HemkerHC,Coi(erBS.InhibitionofplateletHTimiiated,tissuefactor-Inducedthrombingenerationbythemouse/humancNmerte7E3antibody.Potentialimplicationsfortheeffectofc7E3Fabtreatmentonacutettvombosisand'clinicairestenosis'.JClinInvest1996鄰:863>874.0161HemkerHC,AlDieriR,Be^jinS.Thrombingenerationassays:accruingdinicalrelevance.CurrOpinHematol.2004;11:170-175.vanHeenfeWL,PoortS,vantVeerC.ReutellngspergerCP，deGrootPG.BindingofrecombinantannexinVtoendothelialcells:efTectofannexinVbindingonendothelial"cell"med，atedthrombinforntion.Biochem丄1994;302(Pt1):305"312.GabrielNE,Roberts.MF.Spontaneousformationofstableunilamellarvesteles.Biochembhry.1984,23:40114016.01731ChenPS,TwlbaraTY,WarnerH.Microdeterminationofphosphorus.AnalytChem.1956;28:17S6~1758.10174礎(chǔ)mmsLT,ZampighlG,NozaWY,TanfordC'ReynoldsPhosf^oBf*!vesicleformatk)nandtransmembranepro她incorpafionusingoctylghjcoside.Biochemistry.1981;20:833"840.0173NeuensdwvancterP(=,Rore畫，Moniss辨JH.FactorVII￡HJtoactivationproceedsviainteradionWdistinctprotease~cofactorandzymogen-cofactorcompla(es.Implic^ionsofafwo-dimensionafenzymefcinelicmechanism.JBfofO^m.1993;268:214fiS-2"92.P)178]KeQeyRF,ReflnoCJ,O'ConneUMP,atal.AsolubletissuefactormutantIsaselectiveantlcoagutentandantithromboticag的tBlood.1997;89:3219-3227.〖0177]TaitJF,EngelhardtS,SmithC,FijlkawaK.Prourokin助o-annexinVchimeras.Consta"uction,鄉(xiāng)re幼Son,andcharaderizattonofrecombinantproteins.J胸Chem.1995;270:21504-21599.0178]RandJH,WuXX,LapinskiR,etal.Detectionofantibody~mediatedreductionofannexinA5anticoagulantadMtyinplasmasofpatientsv#ithea加phospho議pidsyndrome,Btood.2004;1沐2783"2790.HuangQ，Ne,sdiwanderPF,RezsrieAR,Morris幼yJH.Substraterecognitionbytissuefodor-faclorVila.EvidenceforinteractionofresiduesLysl肪andLys1肪oftissuefacieiwiththe4~carboxyglutamate-richdomainof^ctorX.JBiolCh抓.1996;271:21752-21757.01抑YamamotoM,NakagakiT,KisielW.T鵬uefactor-dependentautoactivationofhumanbloodcopulationfactorVII.JBiolChem.1992;267:19089-1恥94.018"RoreMM,Nsuensc^iwanderPF,Monlss^JH.Thebiochemtealbasisfortheapparentdefectofsolubiemutanttissuefectorinenhanci叩theprotedytlcadivttiesoffactorVilaJBtolChem.1994;269:143^149.01關(guān)Morri8ssyJH,NeuenschwanderPF,H咖gQ,McCallumGD,SuB,JohnsonAE.FactorV11a-^sue扭加nfunctionalimportanceofproteiivmembrane(nter^Oons.ThroneHaemost.1997;78:112-116.0183alDteriR,AlbanS,BegulnS,HemkerHC.Thrombingenerationforthecontrolofheparintreatmentcomparisonvriththeactivatedpartialthromboplastintime.JThrombHaemost2004;2:1395-1401.|HednerU.DosingwithreccxnW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2、權(quán)利要求16的藥物或組^J，用于治療動(dòng)物血管化區(qū)域，其中動(dòng)物血管化區(qū)域出血是因?yàn)榇嬖诳鼓幬?；因外傷、輸注、抗體或先天^K牛而缺乏7因子；肝臟疾??；血管或頭部損傷；胃腸道狀況，包括胃炎、潰瘍、和食道脈管曲張；膀胱炎，子宮內(nèi)膜炎；或者因血小板不足或血小板功能異常而出血，或者包括毛細(xì)管擴(kuò)張、動(dòng)脈畸形、靜脈畸形、毛細(xì)血管畸形、淋巴管畸形、動(dòng)靜脈畸形、血管瘤、或動(dòng)脈瘤。23、權(quán)利要求16的藥物或組合物，其中嵌合蛋白進(jìn)一步包括治療化，或物質(zhì)，其中嵌合蛋白用于,該治療化，或物質(zhì)至需要治療的位點(diǎn)。24、權(quán)利要求23的藥物或組^/，其中戶皿治療物質(zhì)或化，是化療的或W"性的。全文摘要描述了含可溶性組織因子(sTF)和另一亞基(例如膜聯(lián)蛋白V)的嵌合蛋白。該蛋白通過(guò)將sTF靶向至特定受體，例如激活細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸(PS)，而促進(jìn)血液凝結(jié)和/或抑制癌癥。這些嵌合蛋白用于治療因先天因素、藥物治療、外傷或手術(shù)所引起的過(guò)量出血患者，和/或用作抗癌治療劑，例如通過(guò)使供應(yīng)癌癥的血管凝結(jié)，而阻止充足血液流進(jìn)腫瘤，由此導(dǎo)致腫瘤抑制和死亡，或者可用于治療使血管內(nèi)發(fā)生凝結(jié)，其中所述血管在非癌狀態(tài)下對(duì)受試者產(chǎn)生威脅。文檔編號(hào)A61K38/00GK101405017SQ200680015811公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2006年3月9日優(yōu)先權(quán)日2005年3月9日發(fā)明者丁偉群,小羅杰·G·哈里森,斯圖爾特·E·林德申請(qǐng)人:斯圖爾特·E·林德;丁偉群;小羅杰·G·哈里森