專利名稱：：機(jī)械生長(zhǎng)因子肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉^SJ汙生自E結(jié)構(gòu)域的生物活性多肽，所述E-結(jié)構(gòu)域形成已知為胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)剪接變體的機(jī)械生長(zhǎng)因子(mechanogrowthfactor,MGF)的C-末端。與天然存在的E結(jié)構(gòu)域lM目比，這些肽經(jīng)過(guò)了修飾以提高其穩(wěn)定性
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物IGF-I多肽具有許多同工型，這些同工型的出現(xiàn)是可變mRNA剪接的結(jié)果?？偟膩?lái)說(shuō)，有兩種類型的同工型，肝型同工型和非肝型同工型。肝型同工型可以在肝臟或其他器官中表達(dá)，但是如果在其他器官中表達(dá)，也等同于那些在肝臟中表達(dá)的同工型。所述肝型同工型具有全身作用且為哺乳動(dòng)物中主要的同工型。非肝型同工型較不常見(jiàn)，JLA們相信一些非肝型同工型具有自分泌作用/旁分泌作用。本發(fā)明涉及的MGF同工型為后者。在MGF中(Yang"a厶1996;MckoyW，1999)，可變剪接引入了一個(gè)插入片段，改變了該分子C-末端部分的讀碼框。在人MGF中這一插入片段長(zhǎng)度為49個(gè)^JJt。在大鼠和兔MGF中，一個(gè)52個(gè)^Jjt的插入片段具有相似的效果。結(jié)果是MGF比肝型IGF-I略長(zhǎng)(因?yàn)樽x碼框的改變導(dǎo)致終止子出現(xiàn)滯后)且C-末端E結(jié)構(gòu)域具有不同的序列。所述E結(jié)構(gòu)域因缺少糖基化而整體上較小。在人MGF中，C末端由24個(gè)氨基酸的E結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，該E結(jié)構(gòu)域有時(shí)被稱為Ec肽(SEQIDNO:27)。在大鼠和兔MGF中，對(duì)應(yīng)的E結(jié)構(gòu)域有時(shí)祐:稱為Eb肽，長(zhǎng)度為25個(gè)氨基酸(SEQIDNO:13/14)。而肝型IGF-1在C-末端含有Ea肽。由于上述的讀碼框改變，Ea肽和Ec/Eb肽序列彼此無(wú)關(guān)。ChewWW(1995)首先記錄了現(xiàn)在可以被看作是MGFC-末端的剪接變體的存在，他們?cè)谘芯扛伟┗颊叩倪^(guò)程中在肝臟組織中識(shí)別了該變體，但是根本沒(méi)有研究其潛在功能或治療意義。Goldspink及其同事已經(jīng)證實(shí)了MGF用于對(duì)抗骨格肌障礙，特別^J/L營(yíng)養(yǎng)不良的用途；用于對(duì)抗心肌障礙，特別是對(duì)于由心臟缺血或枳械過(guò)載導(dǎo)致的心肌損傷的預(yù)防或限制中的用途；用于一般神經(jīng)障礙的治療；特別是用于神經(jīng)f^復(fù)(W097/33997;WO01/136483;W001/85781;WO03/066082)。目前人們逐漸認(rèn)清，肝型IGF-1和MGF具有不同作用和功能。因此，Hill和Goldspink(2003)已經(jīng)證明，在大鼠脛骨前肌中，MGF會(huì)響應(yīng)由電刺激或注射布比卡因?qū)е碌臋C(jī)械損傷而快速表達(dá)，但是I^其表達(dá)量會(huì)在幾天之內(nèi)下降。相反，肝型IGF-I上調(diào)較慢且其增加量與MGF表達(dá)量的下降相當(dāng)。此夕卜，Yang和Goldspink(2002)已經(jīng)證實(shí)，利用小鼠C2C12肌細(xì)胞系作為體外模型，一種與人MGFC-末端Ec糾目關(guān)的24個(gè)氨基酸的肽具有與成熟IGF-I不同的活性，在于其可以增加成肌細(xì)胞增殖卻抑制肌管形成。所述24個(gè)氨基酸肽在倒數(shù)第二位為組氨酸而非天然的精氨酸，且有一個(gè)附加的C-末端半胱氨酸。Dluzniewskaefa7(2005年9月)也已經(jīng)證實(shí)了一個(gè)相關(guān)肽的強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用，該相關(guān)肽在倒數(shù)第二位也為組氨酸而非天然的精氨酸，且通#14和15位的L4氨酸轉(zhuǎn)化為D,氨酸以及C-末端的酰胺化和聚乙二醇化的方式進(jìn)4亍了一些{務(wù)飾。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)天然的人MGFC末端Ec#人血漿中的半衰期很短。因此，穩(wěn)定化修^飾可以增強(qiáng)其藥用的潛力。發(fā)明人也已經(jīng)證實(shí)穩(wěn)定的MGFC-末端E肽具有神經(jīng)保護(hù)和心臟保護(hù)性質(zhì)，以及增加正常的和營(yíng)養(yǎng)不良的骨膝肌力量的能力。因此，本發(fā)明提供了一種多肽，包括最多達(dá)50個(gè)M酸殘基；所述多肽包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的M^列；所述多肽包括一種或多種修飾，使得其與未修飾的MGFE似目比具有更高的穩(wěn)定性；且所述多肽具有生物活性。本發(fā)明還提供了一種包括本發(fā)明多肽的延伸多肽，并利用非野生型M酸序列延伸所述多肽的N-末端和/或C-末端。本發(fā)明還提供了一種組合物，包括本發(fā)明的多肽或延伸多肽和以及載體。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括本發(fā)明的多肽或延伸多肽以及可藥用的載體。本發(fā)明還提供了用于一種人體或動(dòng)物體治療方法中的本發(fā)明的多肽或延伸多肽。本發(fā)明還提供了一種治療肌肉障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的本發(fā)明的多肽或延伸多肽來(lái)實(shí)施。所述肌肉障礙可以為，例如，骨骼肌障礙或心肌障礙。本發(fā)明還提供了一種治療神經(jīng)障礙的方法，所述方法通*予所需患者有效量的本發(fā)明的多肽或延伸多肽來(lái)實(shí)施。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的多肽或延伸多肽在制備用于上述治療的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療神經(jīng)障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的最多包括50個(gè)氨基酸的多肽或包括所述多肽的延伸多肽來(lái)實(shí)施，所述多肽包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的積堿生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的M酸序列；所i^伸多肽包括所述多肽且利用非野生型M酸序列延伸所述多肽的N-末端和/或C-末端；所述多肽或延伸多肽具有生物活性。本發(fā)明還提供了一種治療心肌障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的最多包括50個(gè)氨基酸的多肽或包括所述多肽的延伸多肽來(lái)實(shí)施，所述多肽包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-1)的枳械生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的M酸序列；所ii^伸多肽包括所述多肽且利用非野生型M酸序列延伸所述多肽的N-末端和/或C-末端；所述多肽具有生物活性。本發(fā)明還提供了多肽或延伸多肽在制備用于治療神經(jīng)障礙或心肌障礙的藥物中的用途，所述多肽最多包括達(dá)50個(gè)氨基酸戎基，包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的枳械生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的氨基酸的N-末端和/或C-末端；所述多肽具有生物活性。圖1:序列比對(duì)，分別給出了人、大鼠和兔的MGF和肝型IGF-I部分序列編碼的序列(SEQIDNO:2的26至110位#^酸和SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的26至111位^J^斷，突出顯示了MGF和肝型IGF-I在C-末端的差異，這一差異是人MGF中49個(gè)4tt^t插入片段和大鼠/兔MGF中52個(gè)g對(duì)插入片段導(dǎo)致的，所述插入片段導(dǎo)致了讀碼框變化和C-末端的趨異差別。圖2:精氨酸置換以及C-末端和N-末端截短對(duì)穩(wěn)定性和生物活性的影響——進(jìn)一步的序列比對(duì)，比較肽1-6(SEQIDNO:15-20)和多肽1-4(SEQIDNO:21-24)的修飾序列，并且詳述了通it^人血漿中培養(yǎng)所測(cè)定的變化對(duì)穩(wěn)定性的影響和通過(guò)用肌細(xì)胞系測(cè)試所測(cè)定的變化對(duì)生物活性的影響(詳細(xì)的測(cè)試步驟見(jiàn)實(shí)施例)。在圖中，左側(cè)的前兩欄標(biāo)記出了肽并給出了其序列，標(biāo)記了通過(guò)置換方式所產(chǎn)生的變化。第三欄給出了穩(wěn)定性測(cè)試的結(jié)果(詳見(jiàn)實(shí)施例5),右側(cè)最后一欄給出了生物活性測(cè)試的結(jié)果(詳見(jiàn)實(shí)施例5)。圖3:注射穩(wěn)定化肽三周后鼠營(yíng)養(yǎng)不良肌肉力量的增加一一(A)注射穩(wěn)定化肽(左側(cè)柱)和IGF(右側(cè)柱)后，mdx小鼠的營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中強(qiáng)直性張力變化的百分?jǐn)?shù)。(B)注射穩(wěn)定化肽(左側(cè)柱)和PBS載體對(duì)照(右側(cè)柱)后，mdx小鼠的營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中強(qiáng)直性張力變化的百分?jǐn)?shù)。圖4:給予穩(wěn)定化肽后的心臟保護(hù)一一向梗塞的羊心分別給予穩(wěn)定化肽(第三柱，稱為"Ec結(jié)構(gòu)域")、全長(zhǎng)MGF(第四柱)、成熟IGF-1(第二柱)和對(duì)照制劑(第一柱)后射血分?jǐn)?shù)的比較。圖5:壓力/容積環(huán)數(shù)據(jù)顯示了心M^fe塞(MI)后功能的保持一一對(duì)于正常(上左)和梗塞(MI)(上右)的鼠心室，還顯示了將穩(wěn)定化肽系統(tǒng)地送遞到MI心臟(下右，稱為"MGF肽，，)和正常心臟(下左)的效果。在所有的圖中都用Y-軸表示壓力(mmHg),X-軸表示相對(duì)容積單位。圖6:大鼠腦片系統(tǒng)中的神經(jīng)保護(hù)作用一一從左至右，分別為用穩(wěn)定化肽(稱為"MGF")、IGF-I、TBH、TBH+穩(wěn)定化肽(24小時(shí))、TBH+IGF-I(24小時(shí))、TBH+穩(wěn)定化肽(48小時(shí))、TBH+IGF-I(48小時(shí))治療后，死亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖7:蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)包括精氨酸L至D型轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的穩(wěn)定化肽具有更高的穩(wěn)定性一一相比于缺少L至D型轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的相應(yīng)肽，穩(wěn)定化肽的穩(wěn)定性通過(guò)在新鮮人血漿中培養(yǎng)一系列不同時(shí)間的間隔來(lái)研究。然后用蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)評(píng)估經(jīng)過(guò)上述時(shí)間間隔后殘存的肽A—分鐘；B-30分鐘；C=2小時(shí)；D=24小時(shí)。包括L-D轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的肽的結(jié)果示于右圖；缺少L-D型轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的肽的結(jié)果示于左圖。圖8:8氨基酸C-末端^tC2C12肌細(xì)胞增殖的影響(A)DMGF和CMGF肽將C2C12細(xì)胞以2000細(xì)胞/孔的數(shù)量加入含有DMEM(1000mg/L葡萄糖)的培養(yǎng)基中，加入BSA(100jlig/ml)，加入IGF-1(2ng/ml)，并培養(yǎng)36小時(shí)。然后用AlamarBlue測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。圖表左側(cè)組給出了DMGF肽(詳見(jiàn)實(shí)施例1.3.l)濃度分別為2、5、50和100ng/ml的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖表中間組給出了CMGF肽(詳見(jiàn)實(shí)施例1.3.1)濃度分別為2、5、50和100ng/ral的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖表右側(cè)組給出了IGF-I(詳見(jiàn)實(shí)施例1.5)濃度分別為2、5、50和100ng/ml的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Y-軸為AlamarBlue測(cè)定法中的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)為535nm，在590腦測(cè)定；平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。(B)A2、A4、A6和A8肽C2C12肌細(xì)胞為500細(xì)胞/孔。在10%FBS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后在0.1%BSA中々幾餓24小時(shí)，刺激24小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。對(duì)濃度分別為O.1、1、10和100ng/ml的A2、A4、A6和A8肽進(jìn)4亍了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了O.l、1、10和100ng/ml的IGF-I(見(jiàn)圖右側(cè)組)。測(cè)定了BrdU的摻入以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了不含細(xì)胞，只含培養(yǎng)基、5。/。FBS和不含BrdU的對(duì)照。Y-軸上的值為熒光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。左側(cè)的第一柱為不含細(xì)胞的對(duì)照。之后的四個(gè)分別為濃度為0.1、1、10和100ng/ml的A2肽。之后的四個(gè)分別為濃度為0.1、1、10和100ng/ml的A4肽。中央的三個(gè)分別為只含培養(yǎng)基(med)、5"/nFBS和不含BrdU的對(duì)照。之后的四個(gè)分別為濃度為0.1、1、10和100ng/ml的A6肽。之后的四個(gè)分別為濃度為0.1、1、10和100ng/ml的A8肽。圖右側(cè)的組分別為濃度為0.1、1、10和100ng/ml的IGF-I(見(jiàn)實(shí)施例1.5)。圖9:對(duì)HSMM細(xì)胞增殖的影響(A)A5肽HS醒細(xì)胞為500細(xì)胞/孔。在10%FCS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用不含血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，刺激48小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。用濃度分別為O.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽進(jìn)^f亍了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了0.1、,1、10和100ng/ml的IGF-I。測(cè)定了BrdU的摻入以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了只含培養(yǎng)基、不含細(xì)胞(BLK)、本底染色(BG)和10%FBS的對(duì)照。Y-軸上的值為焚光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。前5個(gè)柱分別為濃度為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽。之后的柱分別為只含培養(yǎng)基的對(duì)照。之后的三個(gè)分別為濃度為100、10、和0.lng/ml的IGF-1(見(jiàn)實(shí)施例1.5)。之后的三個(gè)分別為含有10°/。FBS、本底染色和不含細(xì)胞的對(duì)照。承表示與只含培養(yǎng)基的對(duì)照相比P〈0.05。(B)A5肽HS固細(xì)胞為500細(xì)胞/孔。在10°/。FCS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用不含血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，刺激48小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。用含有2ng/mlIGF-1的濃度分別為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽進(jìn)4亍了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了O.1、1、10和100ng/ml的IGF-1。測(cè)定了BrdU的摻入以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了含添加2ng/mlIGF-I的培養(yǎng)基、不含細(xì)胞(BLK)和10%FBS的對(duì)照。Y-軸上的值為熒光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。前5個(gè)柱分別為濃度為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽。之后的三個(gè)分別為濃度為100、10、和0.lng/ml的IGF-I(見(jiàn)實(shí)施例1.5)。之后的三個(gè)分別為^sf10。/。FBS、添加2ng/mlIGF-I的培養(yǎng)基和不含細(xì)胞的對(duì)照。*表示與含有2ng/mlIGF-I的培養(yǎng)M照相比P<0.01,**表示P<0.001。圖10:對(duì)HS固細(xì)J!包增殖的影響(A)A5肽HSMM細(xì)胞為500細(xì)胞/孔。在10%FCS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用不^^血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，刺激48小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。用濃度分別為O.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽進(jìn)行了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了0.1、1、10和100ng/ml的IGF-I。測(cè)定了BrdU的摻入以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了只含培養(yǎng)基、不含細(xì)胞(BLK)、本底染色(BG)和10%FBS的對(duì)照。Y-軸上的值為焚光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。前5個(gè)柱分別為濃度為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽。之后的柱分別為只含培養(yǎng)基的對(duì)照。之后的三個(gè)分別為濃度為100、10、和0.lng/ml的IGF-1(見(jiàn)實(shí)施例1.5)。之后的三個(gè)分別為含有10°/。FBS、本底染色和不含細(xì)胞的對(duì)照。氺表示與只含培養(yǎng)基的對(duì)照相比P〈0.05。(B)A5肽HS薩細(xì)胞為500細(xì)胞/孔。在10%FCS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用不^^血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，刺激48小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。用含有2ng/mlIGF-1的濃度分別為0.1、1、10、100和500ng/ml的的A5肽進(jìn)行了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了0.1、1、10和100ng/ml的IGF-I。測(cè)定了BrdU的摻入以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了含添加2ng/mlIGF-I的培養(yǎng)基、不含細(xì)胞(BLK)和10%FBS的對(duì)照。Y-軸上的值為熒光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。前5個(gè)柱分別為濃度為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽。之后的柱分別為只含添加了2ng/mlIGF-I的培養(yǎng)基。之后的三個(gè)分別為濃度為100、10、和0.lng/ml的IGF-I(見(jiàn)實(shí)施例l.5)。之后的三個(gè)分別為含有10%FBS、本底染色和不含細(xì)胞的對(duì)照。*表示與含2ng/mlIGF-1的培養(yǎng)基對(duì)照相比P<0.1。圖11:對(duì)HS固細(xì)胞增殖的影響(A)A5肽HS薩細(xì)胞為1000細(xì)胞/孔。在10%FCS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用不含血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，刺激48小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。用濃度分別為O.1、1、10、IOO和500ng/ml的A5肽進(jìn)行了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了0.1、1、10和100ng/ml的IGF-1。測(cè)定了BrdU的摻入以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了只含培養(yǎng)基、不含細(xì)胞(BLK)、本底染色(BG)和1(WFBS的對(duì)照。Y-軸上的值為熒光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。前5個(gè)柱分別為濃度為0.1、1、10、IOO和500ng/ml的A5肽。之后的柱分別為只含培養(yǎng)基的對(duì)照。之后的三個(gè)分別為濃度為100、10、和0..lng/ml的IGF-1(見(jiàn)實(shí)施例1.5)。之后的三個(gè)分別為含有10%FBS、本底染色和不含細(xì)胞的對(duì)照。(B)A5肽HS固細(xì)胞為1000細(xì)胞/孔。在10%FCS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后用不^^血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，刺激48小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。用^^有2ng/mlIGF-I的濃度分別為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽進(jìn)行了測(cè)試，同時(shí)測(cè)試了0.1、1、10和100ng/ml的IGF-1。測(cè)定了BrdU的摻^v以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了含添加2ng/mlIGF-1的培養(yǎng)基、不含細(xì)胞(BLK)、本底染色(BG)和10"/nFBS的對(duì)照。Y-軸上的值為焚光(370nm處的吸光度；全部4孔的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差)。前5個(gè)柱分別為濃度為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5肽。之后的柱分別為只含附加2ng/mlIGF-1的培養(yǎng)基。之后的三個(gè)分別為濃度為100、10、和0.lng/ml的IGF-I(見(jiàn)實(shí)施例1.5)。之后的三個(gè)分別為含有10%FBS、本底染色和不含細(xì)胞的對(duì)照。*表示與含2ng/mlIGF-I的培養(yǎng)基對(duì)照相比P<0.1。序列信息人、大鼠和兔的MGF的DNA序列和M酸序列分別示于SEQIDNO:1/2、3/4和5/6。這些序列因其表示由IGF-1基因的外顯子3/4/5/6編碼的成熟MGF而被稱為全長(zhǎng)MGF序列，所述序列包括改變了讀碼框并且創(chuàng)造了特征性MGFC-末端的49/52^!^JJ^插入片段。外顯子1和2為可變前導(dǎo)序列。為了對(duì)比，人、大鼠和兔的肝型IGF-I對(duì)應(yīng)的DNA序列和M酸序列分別示于SEQIDN0:7/8、9/10和11/12。所述六種^J^齡列的對(duì)比在圖1中給出，對(duì)比從由外顯子4編碼的序列的起始端向前。來(lái)自大鼠MGFC-末端的天然大鼠Eb肽序列(25個(gè)氨基酸；SEQIDNO:4的87-111位^J^酌示于SEQIDNO:13。來(lái)自兔MGFC-末端的天然兔Eb肽序列(25個(gè)氨基酸；SEQIDNO:6的87-lll位^^酌示于SEQIDNO:14。來(lái)自人MGFC-末端的天然人Ec肽序列(24個(gè)氨基酸；SEQIDNO:2的87-110位^J^酌示于SEQIDNO:27。書亍生自SEQIDNO:27的肽的j奮飾序列示于SEQIDNO:28至32。在SEQIDNO在SEQIDNO在SEQIDNO在SEQIDNO28中，在5位的絲氨酸被丙氨酸置換。29中，在12位的絲氨酸被丙氨酸置換。30中，在18位的絲氨酸被丙氨酸置換。31中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換。在SEQIDNO:32中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且在15位的精氨酸也被丙氨酸置換。天然的人Ec肽的倒數(shù)第二位為精氨酸。合成了倒數(shù)第二位為組氨酸的天然肽變體并且示于SEQIDNO:15。這個(gè)肽也^皮描述為圖2中的肽l。SEQIDNO:26表示在倒數(shù)第二位引入組氨酸置換精氨酸的全長(zhǎng)的人MGF序列。SEQIDNO:25為SEQIDNO:26的DM編碼序列，其中倒數(shù)第二位的組氨酸由CAC編碼，余下的序列與SEQIDNO:l相同。衍生自SEQIDNO:15的肽的修飾序列示于SEQIDNO:16至24。在圖2中，這些肽與SEQIDNO:15的肽進(jìn)行了比較并JbN互之間進(jìn)行了比較。在肽2(SEQIDNO:16)中，在5位的絲氨酸被丙氨酸置換。在肽3(SEQIDNO:17)中，在12位的絲氨酸凈皮丙氨酸置換。在肽4(SEQIDNO:18)中，在18位的絲氨酸被丙氨酸置換。在肽5(SEQIDNO:19)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換。在肽6(SEQIDNO:20)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且在15位的精氨酸也被丙氨酸置換。在短肽1(SEQIDNO:21)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且兩個(gè)C-末端M酸被移除。在短肽2(SEQIDNO:22)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且四個(gè)C-末端M酸纟皮移除。在短肽3(SEQIDNO:23)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且三個(gè)N-末端M酸被移除。在短肽4中(SEQIDNO:24)，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且五個(gè)N-末端M酸被移除。四個(gè)8氨基酸肽序列也包含于序列列表中。SEQIDNO:33為SEQIDNO:15的變體序列的8個(gè)C-末端氨基酸，在倒數(shù)第二位為組氨酸。SEQIDNO:34為SEQIDNO:27的天然的人MGFC-末端的8個(gè)C-末端虞羞酸，在倒數(shù)第二位為精氨酸。SEQIDNO:35為在2位的絲氨酸被丙氨酸所置換的SEQIDNO:33的序列。因此這一序列相當(dāng)于SEQIDNO:18(肽4)的8個(gè)C-末端氨基酸。SEQIDNO:36為在2位的絲氨酸被丙氨酸所置換的SEQIDNO:34的序列。因此這一序列相當(dāng)于SEQIDNO:30的8個(gè)C-末端氨基酸。為了便于參考，這些序列也在下表中進(jìn)行了描述。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>具體實(shí)施例方式本發(fā)明的多肽和^1伸多肽本發(fā)明的多肽本發(fā)明的多肽的長(zhǎng)度最多達(dá)50個(gè)氨基酸。例如，多肽的長(zhǎng)度最多達(dá)IO個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度最多達(dá)30個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度為ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)#^酸，或長(zhǎng)度最多達(dá)35、40、45或50個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，這些多肽長(zhǎng)度為15至30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地長(zhǎng)度為20至28個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地長(zhǎng)度為22、23、24或25個(gè)氨基酸。還優(yōu)選長(zhǎng)度為5至10個(gè)氨基酸的多肽，即長(zhǎng)度為5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，特別是長(zhǎng)度為8個(gè)氨基酸的那些多肽。本發(fā)明的多肽包括衍生自IGF-1的MGF同工型的C-末端E肽的氨基酸序列。如上所述，MGF同工型是通過(guò)可變剪接在mRNA中引入了一個(gè)插入片段，所述插入片^Jl長(zhǎng)并改變了IGF-IC-末端的C-末端E肽的讀碼框從而產(chǎn)生了Ec或Eb肽。MGF同工型通常與SEQIDNO:2、4或6之一的MGF具有至少80%，優(yōu)選85%或90°/。的序列同一性。在人MGF中(SEQIDNO:1和2)，插入片段為49個(gè)g對(duì)，且已知C-末端E肽為24個(gè)氨基酸長(zhǎng)的Ec肽(SEQIDNO:27)。在大鼠和兔MGF中(SEQIDNO:3-6)，插入片段為49個(gè)磁基對(duì)，且已知C-末端E肽為25個(gè)氨基酸長(zhǎng)的Eb肽(SEQIDNO:13和l4)。本發(fā)明的序列可以衍生自這些MGFC-末端E肽的任一個(gè)或衍生自任何其他物種MGF的其它C-末端E肽的任一個(gè)。包括本發(fā)明多肽且衍生自MGF同工型C-末端E肽的序列可以是以任何方式衍生自所述C-末端E肽，只要滿足生物活性和穩(wěn)定性(如下所示)即可。特別地，從其完全具有C-末端E肽序列(例如SEQIDNO:13、14、27或34)且僅僅不存在于全長(zhǎng)MGF分子中的角度來(lái)講，所述序列可以為衍生自MGFC-末端E肽。從其序列是修改過(guò)(見(jiàn)下述的"修飾")的角度來(lái)講，所述序列也可以為衍生自MGFC-末端E肽，只要滿足生物活性和穩(wěn)定性(如下所示)即可。所述多肽具有最多達(dá)50個(gè)氨基酸的最大長(zhǎng)度，并且也可以包括天然MGF序列N-末端至衍生自C-末端E肽的序列?；蛘撸梢园ǚ?MGF-衍生的任何附加序列，即其可以是任何序列，只要滿足生物活性和穩(wěn)定性(如下所示)即可。矛汁生自C-末端MGFE肽的序列可以包括至少10個(gè)、至少15個(gè)或至少20個(gè)氮基酸，例如就人C-末端MGFEc肽來(lái)說(shuō)，包括15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個(gè)氨基酸；就大鼠或兔C-末端MGFEb肽來(lái)說(shuō)，包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)氨基酸?；蛘?，它可以最多包括10個(gè)M酸，優(yōu)選5至10個(gè)M酸，即5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，特別是8個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以裝配在一起形成含有兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明多肽的較大結(jié)構(gòu)，例如相同的本發(fā)明多肽或延伸多肽的多個(gè)拷貝或不同的多肽的多個(gè)拷貝的混合物。根據(jù)多肽的性質(zhì)且特別是其是否含有任何L-D轉(zhuǎn)化(如下所示)，這些結(jié)構(gòu)可以被制備成融合蛋白，通常利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由編碼DNA通過(guò)重組體表達(dá)來(lái)進(jìn)行，或合成性地裝配，或者以融合蛋白的形式表達(dá)然后經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾處理。本發(fā)明的延伸多肽本發(fā)明的延伸多肽包括本發(fā)明的多肽，通過(guò)非野生型序列來(lái)延伸。這意味著任一延伸序列均為非MGF序列，因?yàn)槿绻景l(fā)明的多肽的N-末端或C-末端代表天然MGF序列，那么該序列就不可以同其在天然MGF中相鄰的任一序列簡(jiǎn)單地相連。除此之外，延伸物可以是任何序列。因此，可以用任意長(zhǎng)度的M酸序列在本發(fā)明的多肽的C-末端和N-末端的任一端進(jìn)行延伸或兩端都進(jìn)行延伸。例如，延伸物可以包括最多5個(gè)、最多10個(gè)、最多20個(gè)、最多50個(gè)或最多IOO個(gè)或200個(gè)或更多的氨基酸。通常，4壬4可這類延伸物都比較短，例如長(zhǎng)度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸。例如為了減少外肽酶的攻擊，延伸物可以包括或甚至完全由D-型M酸組成(如下所示)。例如，可以用1至5個(gè)D-型^J^酸在多肽一端或兩端都進(jìn)行延伸。例如，在某些實(shí)施方案中，可以在C-末端引入一個(gè)附加的半胱氨酸戎基。修飾本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以用任何與未《務(wù)飾EAbf目比能增加其穩(wěn)、定性的方式來(lái)修飾，所述未修飾E肽是指本發(fā)明的多肽或延伸多肽包括的序列所來(lái)源的該E肽?？梢杂萌魏畏绞絹?lái)增加穩(wěn)定性。例如，可以預(yù)計(jì)到對(duì)蛋白質(zhì)的C-末端和/或N-末端的修飾(例如聚乙二醇化或其他化學(xué)修^飾或L-D型氨基酸轉(zhuǎn)化)將會(huì)保護(hù)其不被外肽酶攻擊，環(huán)化也可以做到這一點(diǎn)，且內(nèi)部修飾(例如置換、缺失、插入和內(nèi)部L-D型轉(zhuǎn)化)通過(guò)破壞它們的切割位點(diǎn)將可以保護(hù)其不被內(nèi)肽酶切割。例如，可以進(jìn)行聚乙二醇化，優(yōu)選在延伸物的N-末端進(jìn)行可以控制聚乙二醇化位點(diǎn)的程度的聚乙二醇化，但是也考慮到了在其他位點(diǎn)例如C-末端與C-和N-末端之間的聚乙二醇化。聚乙二醇化包括將聚乙二醇共價(jià)連接到所述多肽上?？梢允褂萌魏芜m合類型例如任何適合的分子量的聚乙二醇，只要所得的聚乙二醇化的多肽滿足生物活性和穩(wěn)定性的要求(如下所示)即可。不管是為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定還是實(shí)現(xiàn)其他目的，本發(fā)明的多肽都可以引入其它的化學(xué)修飾以及(或代替)聚乙二醇化。這類修飾包括糖基化、硫酸化、酰胺化和乙?；?。特別地，優(yōu)選在N-末端被乙?；亩嚯幕蛟贑-末端被酰胺化的多肽或同時(shí)#:乙?；王０坊亩嚯?。替代地或附加地，通?？梢栽贜-末端加入一個(gè)或多個(gè)己酸或氨基己酸部分，優(yōu)選一個(gè)己酸或氨基己酸部分。附加地或替代地，多肽或延伸多肽可以包括一個(gè)或多個(gè)D-型氨基酸。天然的M酸是L-型的。插入D-型M酸可以提高穩(wěn)定性，通常，可以使用少量D-型氨基酸，例如l、2、3、4或5個(gè)。但是也可以使用多個(gè)D-型氨基酸，例如5至10個(gè)、10至15個(gè)、15至20個(gè)或20個(gè)或20個(gè)以上，只要所得的聚乙二醇化多肽滿足生物活性和穩(wěn)定性的要求(如下所示)即可。如果能滿足這些要求，那么甚至整個(gè)多肽都可以用D-型氨基酸來(lái)合成。D-型氨基酸可以用于多肽中的任何位置。在SEQIDNO:27的人MGFC-末端E肽中，優(yōu)選用D-型氨基酸置換14位和15位精氨酸中的一個(gè)，或兩個(gè)都置換。也優(yōu)選在大鼠和兔的SEQIDNO:13和SEQIDNO:14序列(在14、15和16位，因?yàn)榇笫?兔的序列包括連續(xù)的三個(gè)精氨酸而人的序列只有兩個(gè))和SEQIDNO:15變體序列中進(jìn)行相應(yīng)的修飾?？梢允褂秒牧Ⅲw化學(xué)同工型和/或方向同工型。例如，可以使用反向(RE)肽，其中本發(fā)明的序列是用L-M酸按照逆序裝配的。或者可以使用反-倒位(RI)肽，其中序列是用D-M酸而且按照逆序合成的。附加地或替代地，D-型M酸可以存在于多肽的一端或另一端或兩端?？梢灶A(yù)計(jì)到這將有助于保護(hù)其不受外肽酶攻擊。這可以通過(guò)轉(zhuǎn)化末端氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如將書于生自MGFC-末端E肽的序列的一端或兩端的末端1、2、3、4或5個(gè)M酸轉(zhuǎn)化為D-型。替代地或附加地，可以通#多肽的一端或兩端加上l、2、3、4或5個(gè)另外的D-型氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些另外的氨基酸可以與那些與衍生自天然MGF中MGFC-末端E肽的序列鄰接的M酸相符或不相符。這些另外的氨基酸可以是任何的氨基酸。一個(gè)可能的以這種方式附加的D-型氨基酸為精氨酸。例如，D-型精氨酸可以附加于N-末端，C-末端或兩端都附加。在一個(gè)實(shí)施方案中，SEQIDN0:27的天然人MGFC-末端E肽的序列保持不變，但是SEQIDNO:27的14和15位的精氨酸被轉(zhuǎn)化為D-型，并且提供了N-末端的聚乙二醇化。也提供了C-末端的酰胺化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SEQIDNO:15的人MGFC-末端E肽變體的序列保持不變，但是SEQIDNO:15的14和15位的精氨酸被轉(zhuǎn)化為D-型，并且提供了N-末端的聚乙二醇化。在一些其它的實(shí)施方案中，4吏用了SEQIDNO:15或27的8個(gè)C-末端氨基酸的序列，即SEQIDNO:33或34的序列，并且提供了N-末端的聚乙二醇化或在C-末端附加了己酸或氨基己酸部分。也提供了C-末端的酰胺化。替代地或附加地，本發(fā)明的多肽也可包括其它的修飾，例如截短、插入、內(nèi)部缺失或置換。關(guān)于截短，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基于SEQIDNO:15的C-末端8個(gè)氨基酸的較短的肽是具有活性的。但是，下面實(shí)施例5的結(jié)果表明與MGFC-末端相關(guān)的較長(zhǎng)的肽的活性可能對(duì)截短一一特別是在這些肽的N-末端的截短非常敏感。在SEQIDNO:15的肽的N-末端，3個(gè)氛基酸的截短會(huì)導(dǎo)致實(shí)施例5中使用的肌細(xì)胞^莫型失去活性。在SEQIDNO:15的肽的C-末端，4個(gè)M酸的截短會(huì)導(dǎo)致肌細(xì)胞模型失去活性，但是2個(gè)氨基酸的截短不會(huì)導(dǎo)致失去活性。因此就天然的人、大鼠和兔E肽序列來(lái)說(shuō)，在SEQIDNO:15和本發(fā)明其它長(zhǎng)度與天然肽長(zhǎng)度(例如18個(gè)或更多個(gè)M船相近的肽的變體序列中，可以預(yù)計(jì)到在C-末端截短1、2或3個(gè)M酸將可能不會(huì)失去活性。也可以預(yù)見(jiàn)到在N-末端截短1或2個(gè)M酸將可能不會(huì)失去活性。關(guān)于插入，可以將短的M酸鏈插入到衍生自人C-末端MGFE肽的序列中，只要所得的多肽滿足生物活性和穩(wěn)定性的要求(如下所示)并且包括少于50個(gè)氨基酸即可。每個(gè)插入片段可以包括，例如l、2、3、4或5個(gè)M酸?？梢源嬖谝粋€(gè)或多個(gè)，例如2、3、4或5個(gè)這類插入片段。關(guān)于內(nèi)部缺失，可以將短的M酸鏈從衍生自人C-末端MGFE肽的內(nèi)部序列中刪除，只要所得的多肽滿足生物活性和穩(wěn)定性的要求(如下所示)即可。可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)這類缺失，例如l、2、3、4或5個(gè)缺失，最多總共缺失例如l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸。關(guān)于置換，原則上多肽中的任何M酸都可以被任何其他的氨基酸所置換，只要所得的多肽滿足生物活性和穩(wěn)定性的要求(如下所示)即可。可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)這類置換，例如總計(jì)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10，最多達(dá)15或最多達(dá)20個(gè)置換。優(yōu)選地，在4汙生自MGFC-末端E肽的序列中進(jìn)行不超過(guò)10個(gè)置換，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)置換。優(yōu)選地，在^f汙生自MGFC-末端E肽的序列中，至少50%、至少60°/。、至少70%、至少80%或至少90°/的氨基酸殘基應(yīng)與衍生出該序列的天然MGFC-末端E肽相同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方法中，在多肽一端或兩端的殘基(末端殘基)被置換?？梢灶A(yù)計(jì)到，這將保護(hù)多肽不受外肽酶攻擊。因此，例如，可優(yōu)選地置換N-末端和C-末端位置、或緊鄰末端的位置、或從一端或兩端起最多3、4或5個(gè)位置的殘基。置換可以增加穩(wěn)定性或生物活性。例如，下面實(shí)施例5和圖2中所討論的結(jié)果表明，SEQIDNO:15的肽的5、12、14和18位的一個(gè)或多個(gè)位置的置換會(huì)增加穩(wěn)定性。同樣的結(jié)果表明在12、14和18位的置換會(huì)增加生物活性。因此優(yōu)選SEQIDNO:27和SEQIDNO:15的肽的5、12、14和18位的置換，和SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的2位(相當(dāng)于SEQIDNO:15和SEQIDNO:27的18位)的置換。也優(yōu)選SEQIDNO:13和14的大鼠/兔MGFC-末端E肽的5、12、15和19位的相應(yīng)置換。如實(shí)施例5和圖2所示，不管是SEQIDNO:27和SEQIDNO:15的5、12、14或18位，SEQIDNO:33和SEQIDNO:34的2位，SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的5、12、15和19位，還是其他位置，用丙氨酸置換天然M^—個(gè)優(yōu)選的選擇。但是，同樣可以使用其它的氨基酸。替代地或附加地，多肽可以包括對(duì)穩(wěn)定性或生物活性沒(méi)有顯著影響的置換。這些通常是保守性置換。例如，可以按照下表進(jìn)行保守性置換。第二欄中同一組，優(yōu)選第三欄中同一行的氨基酸可以相互置換。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>通常，本發(fā)明多肽中的M^列修飾(例如L型至D型轉(zhuǎn)化、置換、插入和缺失)可以存在于衍生自MGFC-末端E肽的M酸序列中。但是，當(dāng)多肽含有另外的MGF序列時(shí)，所述修飾可以替代地或附加地存在于所述附加序列中。例如，如果本發(fā)明的多肽含有其它的MGF序列，那么修飾可以存在于該序列中，所述其它的MGF序列位于天然MGF的E肽序列(例如SEQIDNO:13、14或27)的N-末端。替代地或附加地，也可以通it^t本發(fā)明的多肽或延伸多肽進(jìn)行環(huán)化來(lái)增加穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)預(yù)計(jì)到這將保護(hù)多肽不受外肽酶攻擊。優(yōu)選的本發(fā)明的多肽包括(i)一種肽，長(zhǎng)度為24個(gè)氨基酸，并且具有SEQIDNO:15的序列，但是通過(guò)將SEQIDNO:15的兩個(gè)精氨酸(14和15位)從L-型轉(zhuǎn)化為D-型和N-末端的聚乙二醇化而被穩(wěn)定化。(ii)如上述(i)中的一種肽，但其缺少聚乙二醇化，即具有SEQIDN0:15的序列，但是通過(guò)將SEQIDNO:15的兩個(gè)精氨酸(14和15位)從L-型轉(zhuǎn)化為D-型而被穩(wěn)定化。(iii)實(shí)施例5和圖2中描述為肽2、3、4和5(SEQIDNO:16至19)的肽。(iv)實(shí)施例5和圖2中描述為短肽1(SEQIDNO:21)的肽，其具有SEQIDNO:19的序列(其中14位的精氨酸被丙氨酸所置換)，但是在C-末端^皮截短2個(gè)氨基酸。(v)與上述(i)的糾目當(dāng)?shù)珔s;0^于SEQIDNO:27的天然人C-末端肽的一種肽，其在倒數(shù)第二位為精氨酸而不是組氨酸，即具有SEQIDNO:27序列的一種肽，但是通過(guò)將SEQIDNO:27的14和15位的兩個(gè)精氨酸從L-型轉(zhuǎn)化為D-型和N-末端的聚乙二醇化而被穩(wěn)定化。(vi)如上述(v)中的一種肽，但其缺少聚乙二醇化，即具有SEQIDNO:27的序列，但是通過(guò)將SEQIDNO:27的14和15位的兩個(gè)精氨酸從L-型轉(zhuǎn)化為D-型而被穩(wěn)定化。(vii)與上述(iii)的似目當(dāng)?shù)珔sM于SEQIDNO:27的天然人C-末端肽的肽，其在倒數(shù)第二位含有精氨酸而不是組氨酸；本文表示為SEQIDNO:28至31。(viii)SEQIDNO:33-36任一個(gè)的肽，它們的N-末端被聚乙二醇化或連接一個(gè)N-末端己酸或氨基己酸部分。(ix)上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)或(viii)的肽的任一個(gè)，其C-末端被酰胺化，特別是C-末端酰胺化的上述(ii)和(vi)的肽，即具有SEQIDNO:15和27序列的肽，其14和15位的L老氨酸轉(zhuǎn)化為D,氨酸且C-末端被酰胺化，但是缺少聚乙二醇化。(X)上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)的肽的任一個(gè)，其C-末端帶有一個(gè)附加的半胱氨酸戎基。(xi)上述(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)的肽的任一個(gè)，其N-末端帶有一個(gè)附加的D-型精氨酸殘基。本發(fā)明的修飾可以產(chǎn)生穩(wěn)定性提高之外的其他優(yōu)勢(shì)。例如所述修飾可以產(chǎn)生增強(qiáng)的治療活性或更符合免疫學(xué)需要(例如P務(wù)低免疫原性)。對(duì)于包含L型至D型轉(zhuǎn)化和/或立體化學(xué)和/或定向異構(gòu)的(如上所示)修飾^如此。生物活性本發(fā)明的多肽或延伸多肽具有生物活性。這一活性可能為在小鼠、人或其它哺乳動(dòng)物中增加營(yíng)養(yǎng)不良和/或非營(yíng)養(yǎng)不良骨駱肌的肌肉力量的能力(參照下述實(shí)施例2)。優(yōu)選地，在營(yíng)養(yǎng)不良和/或非營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉中，本發(fā)明的多肽或延伸多肽能夠增加肌肉力量(例如通過(guò)最大可達(dá)的強(qiáng)直性張力來(lái)測(cè)定)至少5%、至少10%、至少20°/、至少25%、至少30%、至少50%、至少75%或至少100%。在綿羊、小鼠、人或其他哺乳動(dòng)物中心肌保護(hù)的能力(參照下述實(shí)施例3)。優(yōu)選地，在梗塞或機(jī)械過(guò)負(fù)荷的心臟中，本發(fā)明的多肽多肽或延伸多肽具有預(yù)防或限制心肌損傷的能力。這一點(diǎn)可以通過(guò)壓力/容積環(huán)或通過(guò)參照射血分?jǐn)?shù)的能力增加來(lái)測(cè)定，所述射血分?jǐn)?shù)的能力增加是指與未給予本發(fā)明多肽或延伸多肽的梗塞心斜目比較。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽具有使射血分?jǐn)?shù)增加至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%或更多的能力。在小鼠、沙鼠、人或其他哺乳動(dòng)物中體外或體內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)能力(參照下述實(shí)施例4)。優(yōu)選地，在大鼠海馬器官型培養(yǎng)物和/或其他類似的體外模型中，本發(fā)明的多肽或延伸多肽具有減少細(xì)胞死亡的能力。優(yōu)選地，在暴露于TBH或其它^i秀發(fā)氧化應(yīng)激或以其它方式導(dǎo)致?lián)p傷的試劑之后，本發(fā)明的多肽或延伸多肽會(huì)具有減少這類才莫型中細(xì)胞死亡的能力，減少幅度可達(dá)至少20%、至少25%、至少30%、至少50%、至少60°/。、至少70°/。、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%或更高。替代地或附加地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以具有神經(jīng)保護(hù)的能力。此外，本發(fā)明的多肽或延伸多肽具有全長(zhǎng)MGF(例如SEQIDN0S:2、4或6的MGF)的一種或多種生物學(xué)性質(zhì)特征()。例如本^發(fā)明的多肽或延伸多肽具有W097/33997中鑒定出的MGF的功能性質(zhì)。特別是，所述多肽或延伸多肽可以具有誘導(dǎo)骨骼肌組織生長(zhǎng)的能力。類似地，如本文所述，它們可以具有上調(diào)蛋白質(zhì)合成的能力，所述蛋白質(zhì)合成為骨骼肌修復(fù)和/或激活骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞(干細(xì)胞)時(shí)所需的蛋白質(zhì)合成。在這方面，一種評(píng)估生物活性的方法為實(shí)施例5.2.2中所述的AlamarBlue法。這種方法包括將多肽與單核成肌細(xì)胞接觸，并且評(píng)估所述多肽導(dǎo)致成肌細(xì)胞增殖的程度。該程度可以利用任何合適的方法來(lái)記錄，例如實(shí)施例中所述的0至3級(jí)?；钚砸部梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞周期蛋白來(lái)測(cè)定，例如作為細(xì)胞分裂的早期標(biāo)記的細(xì)胞周期蛋白1D。活性也可以使用溴脫氧尿嘧啶(BrdU)來(lái)測(cè)定。BrdU會(huì)在DM復(fù)制的過(guò)程中置目腺嘧"^氧核苷，因而可以祐:用于識(shí)別正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞并且測(cè)定發(fā)生復(fù)制和細(xì)胞分裂的次數(shù)。替代地或附加地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽可具有W001/136483中已經(jīng)鑒定出的神經(jīng)學(xué)性質(zhì)。因此，它們可具有實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元復(fù)蘇的能力。特別地，與未處理的實(shí)驗(yàn)對(duì)象中相同情況相比，所述多肽或延伸多肽能夠在神經(jīng)抽出術(shù)后將處理過(guò)的實(shí)駘^對(duì)象的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失減少20°/"30%、40%、50%、60%、70%、80%、90°/。、95%、99%或100%。優(yōu)選地運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失減少70%或更多，或多于80%(即丟失為30%或更少，或20%或更少)。復(fù)蘇的程度可以使用任何合適的技術(shù)來(lái)計(jì)算，例如已知技術(shù)如立體學(xué)技術(shù)。在具體的測(cè)試時(shí)，可以使用WO01/136483中用到的技術(shù)，所述技術(shù)依賴于測(cè)定大鼠面部神經(jīng)抽出后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元復(fù)蘇。替代地或附加地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以具有W003/060882中鑒定出的性質(zhì)，所述性質(zhì)是指通過(guò)防止心肌膜肌細(xì)胞的細(xì)胞死亡或凋亡來(lái)預(yù)防或限制缺血或機(jī)械過(guò)負(fù)荷后心肌損傷的能力。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽或;^f申多肽具有完全防止心肌區(qū)域細(xì)胞凋亡的能力，所述心肌區(qū)域是指給予了本發(fā)明的多肽或延伸多肽的區(qū)域。但是，凋亡也可以僅僅^皮部分防止，即限制。與不經(jīng)過(guò)本發(fā)明的治療所發(fā)生的損傷相比，如果能實(shí)現(xiàn)損傷的降低，例如如果能4吏損傷降4氐1°/或更多、5%或更多、10%或更多、20%或更多、30%或更多、50°/或更多、70°/或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多、98°/。或更多或99%或更多，那么就是損傷受到了限制，所述降低是通過(guò)死亡細(xì)胞的比例或數(shù)量、或通過(guò)失去功能的肌肉區(qū)域的大小、或通過(guò)心臟泵血的整體能力來(lái)測(cè)定。特別是，損傷的降低可以通#體內(nèi)用最低限度#^性方法測(cè)定心輸出量、射血分?jǐn)?shù)等指標(biāo)來(lái)評(píng)估。也可以測(cè)定血清中的標(biāo)記，如肌酸激酶和朋j丐蛋白T。這些都是在臨床條件下用于測(cè)定損傷后心肌受損程度的#。預(yù)防凋亡的能力可以使用任何適合的技術(shù)來(lái)測(cè)定。例如，參照實(shí)施例4以及圖3和圖6，可以利用在心肌細(xì)胞或類心肌細(xì)胞系中由DNA片段化顯示的預(yù)防凋亡的能力來(lái)測(cè)定。由DNA片段化顯示的預(yù)防凋亡的能力可以通過(guò)用山梨糖醇或另一種試劑處理細(xì)胞來(lái)測(cè)定，所述處理是指將細(xì)胞置于滲透應(yīng)力下最多達(dá)l、2、4、6、12、24或48小時(shí)，優(yōu)選最多達(dá)12至24小時(shí)，更優(yōu)選最多達(dá)24小時(shí)，并且研究是否可以觀察到由凋亡引起的片IS:化^^式。與未處理的細(xì)^^目比，在經(jīng)過(guò)6、12或24小時(shí)的山梨糖醇處理后，以這種方式表.達(dá)的本發(fā)明的MGF多肽通常會(huì)減少、優(yōu)選地會(huì)消除這些條件下的DM片段化。作為凋亡標(biāo)記的基因的表達(dá)缺失或^J^達(dá)也可以作為凋亡預(yù)防的指標(biāo)。一個(gè)合適的標(biāo)記為Bax基因。類似地，處于凋亡條件下的MGF-轉(zhuǎn)染細(xì)胞中抗凋亡標(biāo)記的增高表達(dá)也可以作為本發(fā)明多肽正在預(yù)防凋亡的標(biāo)志。一個(gè)合適的抗凋亡標(biāo)記基因?yàn)锽cl2。預(yù)防凋亡的能力的測(cè)定也可以參考MGF多肽在體外肌細(xì)胞中防止細(xì)胞數(shù)目下降的能力。本發(fā)明多肽或延伸多肽的另一個(gè)優(yōu)選的性質(zhì)是在心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)肥大表型的能力。特別地，可以通過(guò)評(píng)估體外原代心肌培養(yǎng)中誘導(dǎo)肥大表型的能力來(lái)測(cè)試這一性質(zhì)。測(cè)定這一性質(zhì)的一種優(yōu)選的方法是測(cè)試ANF(心房利鈉因子)和/或bMHC(P肌球蛋白重鏈)表達(dá)的增加。ANF為一種在肥大條件中被上調(diào)的胚胎標(biāo)記基因。bMHC為肌肉中一種重要的收縮蛋白質(zhì)。本發(fā)明多肽或延伸多肽的穩(wěn)定性與含有能衍生出本發(fā)明的多肽或延伸多肽的序列的天然C-末端MGFE及bN比，本發(fā)明的多肽或延伸多肽具有增加的穩(wěn)定性。這類比較在本發(fā)明的多肽或延伸多肽和天然C-末端MGFE肽之間進(jìn)行，所述所述天然C-末端MGFE肽為分離的、未f奮飾的形式(例如SEQIDNO:13、14、27或34的未^f奮飾形式，從MGF分子的其余部分中分離出來(lái)并且以24個(gè)堿基(SEQIDNO:27)、25個(gè)堿基(SEQIDNO:13/14)或8個(gè)堿基(SEQIDNO:34)的隔離型存在)。比較也可以在SEQIDNO:15和SEQIDNO:33的含組氨酸序列之間進(jìn)行。通過(guò)本文所述的修飾，可能增加任意程度的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性也可以用Aj6i漿中的半衰期或其他任何合適的技術(shù)來(lái)評(píng)估。特別地，可以根據(jù)下述實(shí)施例5.1的技術(shù)，通過(guò)評(píng)估新鮮人血漿中肽對(duì)蛋白7JC解裂解的敏感性來(lái)測(cè)定穩(wěn)定性，其中血漿在使用前一直儲(chǔ)存于-70。C，將10jag的肽加入到2ml血漿中，加7mlPBS，并將混合物在37。C下培養(yǎng)不同的時(shí)間間隔。然后用蛋白質(zhì)免疫印跡來(lái)檢測(cè)各時(shí)間間隔中的每個(gè)肽(在圖7中A=0分鐘；B=30分鐘；C=2小時(shí)；D=24小時(shí)。右側(cè)給出了具有L型至D型轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的肽的結(jié)果；左側(cè)為沒(méi)有L型至D型轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的肽的結(jié)果)。30分鐘后，可以檢測(cè)到的沒(méi)有L-D轉(zhuǎn)化和聚乙二醇化的肽比較少，2小時(shí)后非常少，24小時(shí)后沒(méi)有或幾乎沒(méi)有。相比而言，30分鐘、2小時(shí)和24小時(shí)后，可以檢測(cè)到的具有L-D轉(zhuǎn)化和聚乙二醇化的肽要多很多。其它的穩(wěn)定性測(cè)定方法可以基于測(cè)定生物活性隨時(shí)間的喪失。這一點(diǎn)可以用任何合適的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)任何本文所述的生物活性測(cè)定法的體外測(cè)定法。在相對(duì)數(shù)量上，與相應(yīng)的未修飾MGFC-末端E似目比，本發(fā)明優(yōu)選的多肽或延伸多肽的半衰期增加了至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少60%、至少80%、至少100°/。、至少200%或至少500%或更多。在絕對(duì)數(shù)量上，本發(fā)明優(yōu)選的多肽或延伸多肽的半衰期為至少1小時(shí)、至少2小時(shí)、至少4小時(shí)、至少8小時(shí)、至少12小時(shí)、至少24小時(shí)或至少48小時(shí)或更多。或者，如實(shí)施例5和圖2所述，也可以使用定性的或半定量的穩(wěn)定性測(cè)定方法，例如通過(guò)將多肽或延伸多肽的穩(wěn)定性記錄為0至3級(jí)。根據(jù)這一尺度，SEQIDNO:15的序列記為1。本發(fā)明的某些其它經(jīng)修飾的肽記為2或3。本發(fā)明的多肽或延伸多肽記錄的級(jí)別通常要比相應(yīng)的天然MGFC-末端E本發(fā)明其它的肽如上所述，盡管本發(fā)明的許多肽應(yīng)被穩(wěn)定化，但在某些情況下也可能要使用未經(jīng)穩(wěn)定化的多肽，所述未經(jīng)穩(wěn)定化的多肽包括SEQIDNO:13、14、27和34的天然多肽或SEQIDNO:15和33的^^且氨酸變體。在根據(jù)本發(fā)明對(duì)神經(jīng)障礙和心臟疾病的治療中，可能需要本發(fā)明的多肽或延伸多肽降解得相對(duì)快些，即在一個(gè)相對(duì)短的時(shí)期內(nèi)發(fā)揮其效力。因此，在這類治療中，穩(wěn)定化將不是必須的。當(dāng)不需要穩(wěn)定化時(shí)，優(yōu)選使用未經(jīng)穩(wěn)定化修飾的SEQIDNO:13、14、27和34的天然多肽或SEQIDNO:15和33的含組氨酸變體。但是，也可以使用經(jīng)修飾的多肽。就這方面而言，可以使用本文所述的任何修飾，指示不要求這些修飾會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性增加。根據(jù)本發(fā)明的治療本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以用于治療許多病癥。廣義上講，這些病癥可以劃分為三個(gè)方面骨骼肌障礙、心肌障礙和神經(jīng)障礙。但是，由于神經(jīng)和肌肉功能是相互依存的，這些分類之間會(huì)有一些重疊，例如神經(jīng)肌肉障礙方面。神經(jīng)障礙通?？梢詣澐譃閮深悾窠?jīng)源性障礙，即存在于神經(jīng)系統(tǒng)本身的缺陷，和肌源性或肌肉相關(guān)的神經(jīng)障礙。二者都可以用本發(fā)明的方法來(lái)治療。本發(fā)明的療法適用的骨骼肌障礙包括肌營(yíng)養(yǎng)不良，包括但不限于Duchenne或Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良(FSHD)、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良(CMD)和常染色體肌營(yíng)養(yǎng)不良，以及相關(guān)的進(jìn)行性骨骼肌無(wú)力和萎縮；肌萎縮，包括但不限于廢用性萎縮、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的萎縮、年長(zhǎng)者的肌萎縮和由脊髓損傷或神經(jīng)肌肉疾病誘導(dǎo)的肌萎縮；惡病質(zhì)，例如由癌癥、艾滋病、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性炎癥性疾病或燒傷等引起的惡病質(zhì)；肌無(wú)力，特別是某些肌肉中的肌無(wú)力，例如泌尿括約肌、肛門括約肌和骨盆底?。焕夏耆说募∪鉁p少(sarcopenia)或虛弱。本發(fā)明也可以應(yīng)用于創(chuàng)傷后的肌肉修復(fù)。就神經(jīng)障礙方面而言，可能會(huì)用于神經(jīng)退行性病變障礙的治療。也可能會(huì)用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙，特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)退行性病變障礙的治療。神經(jīng)(包括神經(jīng)肌肉)障礙的實(shí)例包括肌萎縮側(cè)索硬化；脊髓性肌萎縮；進(jìn)行性脊髓性肌萎縮；嬰兒型肌萎縮或青少年肌萎縮、脊M質(zhì)炎綜合征或脊MA質(zhì)炎后綜合征；由暴露于毒素導(dǎo)致的障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷或神經(jīng)損害；影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷；與衰老相關(guān)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失；常染色體遺傳以及伴性遺傳的肌營(yíng)養(yǎng)不良；阿爾茨海默氏?。慌两鹕喜?；糖尿病性神經(jīng)病變；外周神經(jīng)病變；松塞性中風(fēng)和出血性中風(fēng)；酒精相關(guān)的腦損傷。本發(fā)明的多肽或延伸多肽也可被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的維護(hù)。本發(fā)明也可以用于創(chuàng)傷后的神經(jīng)修復(fù)。本發(fā)明也可以用于治療神經(jīng)損傷。在這一實(shí)施方案中，通常用例如在已斷開(kāi)的外周神經(jīng)的兩端之間;改置導(dǎo)管的方法(參考WO01/85781),將多肽或延伸多肽集中于損傷位置附近以實(shí)現(xiàn)修復(fù)。關(guān)于心臟疾病，會(huì)涉及以下疾病適用促進(jìn)心肌蛋白合成的療法的心肌病變；急性心力衰竭或急性創(chuàng)傷，包括心肌炎或心4/*塞；病理性心臟肥大；和充血性心力衰竭。本發(fā)明的多肽或延伸多肽也可以用于通過(guò)增加心臟每搏輸出量提高心輸出量。特別地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以用于預(yù)防心臟缺血和/或才A^過(guò)負(fù)荷后的心肌損傷。在這種情況下，本發(fā)明的多肽或延伸多肽通常會(huì)在心臟缺血或心臟才/L^過(guò)負(fù)荷發(fā)作后盡快給藥。例如一經(jīng)診斷出心臟缺血導(dǎo)致的心臟病發(fā)作就立即給藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽應(yīng)在5、10、15、30或60分鐘內(nèi)，或者2或5小時(shí)內(nèi)給予。優(yōu)選地，給予MGF多肽或多核普酸所對(duì)應(yīng)的心臟缺血或機(jī)械過(guò)負(fù)荷為暫時(shí)性病癥。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予本發(fā)明的多肽或延伸多肽是因?yàn)樾呐K病發(fā)作。本發(fā)明的療法特別有利于幫助心臟病發(fā)作的患者實(shí)現(xiàn)令人滿意的復(fù)原；并且恢復(fù)正常積才及的生活方式。在某些情況下，可能需要與其它具有藥用活性的試劑聯(lián)合使用本發(fā)明的多狀或延伸多肽。例如，本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以與IGF-I聯(lián)合使用(參見(jiàn)實(shí)施例l.5，7和8)。這類聯(lián)合使用可以包括將本發(fā)明的多肽或延伸多肽與其它具有藥用活性的試劑以單一的可藥用載體或賦形劑聯(lián):合給藥，或者也可以包括「在同一位置或不同位置進(jìn)^亍獨(dú)立的、連續(xù)的或同時(shí)的注射。本發(fā)明多肽或延伸多肽的制備本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)制備。通常，它們可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)來(lái)獲得，如果需要的話，可以對(duì)所得的M酸序列進(jìn)行合適的化學(xué)修飾(例如聚乙二醇化)。當(dāng)沒(méi)有D-型氨基酸時(shí)，多肽和延伸多肽也可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，通過(guò)在宿主細(xì)胞中由適當(dāng)?shù)木幋aDM通過(guò)重組表達(dá)而獲得。也可以用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)分離和純化到任何所需的程度。本發(fā)明的多肽或延伸多肽通常會(huì)^皮完全或部分地分離或純化。分離多肽或延伸多肽的制品可品，只要該制品含有的多肽或延伸多肽的濃度比生產(chǎn)所述多以是任何一種制肽時(shí)的制品含有的濃度高即可。特別地，當(dāng)多肽或延伸多肽是通過(guò)重組體獲胞成分。以純化形式存在的多肽或延伸多肽通常會(huì)成為制品的一部分，在所述制品中超過(guò)90°/。、例如最高達(dá)95%、最高達(dá)98%或最高達(dá)99/的多肽物質(zhì)為本發(fā)明的多肽。分離和純化的制品通常為含有本發(fā)明多肽或延伸多肽的水性溶液。但是，本發(fā)明的多肽或延伸多肽也可以以例如晶體或其它干制品的其他形式尋皮純化或分離。組合物、制劑、給藥和劑量?jī)?yōu)選地，本發(fā)明的多肽或延伸多肽以含有多肽或延伸多肽和載體的組合物的形式提供。特別地，這種組合物可以是含有多肽或延伸多肽和可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。可以使用任何適合的藥物制劑。例如，適合的制劑可以包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，所述溶液可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、殺菌性抗生素和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使得制劑與預(yù)期受體的體液等滲；以及水性和非水性無(wú)菌懸液，所述懸液可包括助懸劑和增稠劑。制劑可以置于單位劑量或多劑量容器中。例如，密封的^或玻璃瓶，并且可以儲(chǔ)存于冷凍或凍干(低壓凍干)的條件下，僅要求在臨使用前加入無(wú)菌液體載體，例如注射用的水。應(yīng)當(dāng)理解的是，除了上面特別提到的成分之外，考慮到所討論制劑的類型，本發(fā)明的制劑可以包括本領(lǐng)域的其它常規(guī)試劑。優(yōu)選無(wú)菌的、不含熱原的水性和非水性溶液。通?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)制劑技術(shù)來(lái)使制劑滿足下面所討論的給藥方式。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)任何合適的、滿足所要治療病癥的方式來(lái)給予，例如局部、皮膚、腸胃外、肌內(nèi)、皮下或經(jīng)皮膚給藥；或者通過(guò)直接注射到血流中或直接施用至粘膜組織來(lái)給藥。在許多情況下，注射可能是優(yōu)選的方式，例如皮下注射、腸胃外肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射。在許多臨床情況下，靜脈內(nèi)注射通常是優(yōu)選的。在某些情況下，所謂的"無(wú)針"注射或經(jīng)皮膚給藥也是可以的。在骨骼肌障礙的治療中，靜脈內(nèi)和肌內(nèi)注射是優(yōu)選的方式。也可以考慮用局部給藥(例如通過(guò)貼片)來(lái)增強(qiáng)腹部肌肉或用于其他目的。在心肌障礙的治療中，通常使用靜脈內(nèi)送遞。在適合的臨床情況下(例如在心臟?？撇》恐?，直接送遞到心臟也是可以的，例如使用所謂的"無(wú)針"注射系統(tǒng)來(lái)將多肽送遞到心臟中。本發(fā)明的多肽或延伸多肽可以以任何合適劑量來(lái)送遞，并且可以使用任何適合的劑量方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，考慮到眾多的影響因素，可以調(diào)整采用的給藥劑量和方案以確保對(duì)待治療的特定病癥有最佳治療效果。這些因素可以是待治療的受試者的年齡、性別和臨床狀況。根據(jù)發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)，可以預(yù)計(jì)到0.2至lOmg范圍內(nèi)的劑量是有效的，例如0.2至0.8mg，優(yōu)選約0.5mg。例如，濃度為lmg/ml的含有多肽或延伸多肽的溶液的用量可以為0.1至lml。依據(jù)所討論的用法和臨床狀況，可以給予單劑量或多劑量。下述實(shí)施例闡述了^^發(fā)明。實(shí)施例1.肽1.1實(shí)施例2、3、4和6的肽實(shí)施例2、3、4和6中用到的肽具有SEQIDNO:15的序列，其中天然序列(參見(jiàn)SEQIDNO:1、2和27)倒數(shù)第二位的精氨酸被組氨酸所置換；并且通過(guò)在14和15位用D型精氨酸置換天然存在的L-型精氨酸，通過(guò)琥珀酸橋?qū)-末端共價(jià)連接至一個(gè)聚乙二醇(PEG)書f生物(O，O-雙(2-氨基丙基)聚乙二醇1900)(杰夫胺)，以及C-末端酰胺化來(lái)穩(wěn)定化所述天然序列。1.2實(shí)施例5的肽實(shí)施例5的肽購(gòu)自AltaBioscience,Birmingham,UK，4吏用肽合成4義通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)合成。這些肽是非聚乙二醇化的、不含L-D轉(zhuǎn)化以及C-末端酰胺化。此外，一種相當(dāng)于上述l.1中肽的、具有相同的L-D轉(zhuǎn)化但沒(méi)有聚乙二醇化的肽也被測(cè)試了穩(wěn)定性(參見(jiàn)下面的5.2.3)。這種肽是使用肽合成4義通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)合成的。所得產(chǎn)物用HPLC純化并且用MALDI-MS來(lái)分析。1.3實(shí)施例7的肽1.3.1實(shí)施例7.1的肽實(shí)施例7.1的肽具有8個(gè)氨基酸的序列，即Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys(SEQIDNO:33)，帶有提高穩(wěn)定性的修飾。在圖8中稱為DMGF的肽中，穩(wěn)定化可以通過(guò)上述1.1中的N-末端聚乙二醇化來(lái)實(shí)現(xiàn)。在圖8中稱為CMGF的肽中，穩(wěn)定化可以通過(guò)在N-末端連接己酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。DMGF和CMGF在C-末端也;tN皮酰胺化。1.3.2實(shí)施例7.2的肽在實(shí)施例7.2中，肽A2、A4和A6具有序列Gly-Ser_Thr-Phe-Glu-Glu-Arg-Lys(SEQIDNO:34)。肽A2、A4和A6在C-末端被酰胺化。肽A2在N-末端未被修飾。肽A4在N-末端連接了一個(gè)己酸部分。肽A6在N-末端具有一個(gè)氨基己酸部分。肽A8具有序列Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys(SEQIDNO:33)，在C-末端^皮酰胺化并且在N-末端連接了己酸。1.4實(shí)施例8的肽實(shí)施例8中用到的肽具有SEQIDNO:15的序列，其中天然序列(參見(jiàn)SEQIDNO:1、2和27)倒數(shù)第二位的精氨酸被組氨酸所置換；并且通#14和15位用D型精氨酸置換天然存在的L-型精氨酸以及C-末端酰胺化來(lái)穩(wěn)定化所述天然序列。實(shí)施例8中所用到的肽沒(méi)有被聚乙二醇化。1.5IGF-I肽為了比較，使用了IGF-I肽。它是由外顯子3和4編碼的IGF-I受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述IGF-I肽在所有剪接變體中都是共同的，長(zhǎng)度接近70個(gè)氨基酸。在實(shí)施例1-4中，所述IGF-I肽購(gòu)自PeproTech，EC，UK。在實(shí)施例6中，所述IGF-1肽購(gòu)自Sigma-Aldrich(ER2IGF-1)。IGF-I肽也用于實(shí)施例7。2.將穩(wěn)定化肽注射到營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中使用肌內(nèi)注射時(shí)(每周注射兩次含17pg化學(xué)穩(wěn)定化肽的25p1)，非營(yíng)養(yǎng)不良小鼠的脛骨前肌的肌肉力量在幾周之內(nèi)增加了超過(guò)25%。盡管這種肌肉可能由于反復(fù)注射而受到物理?yè)p傷，但是所述脛骨前肌并沒(méi)有像mdx小鼠(如下所示)的肌肉一樣的疾病。在對(duì)mdx小鼠的營(yíng)養(yǎng)不良肌肉進(jìn)行肌內(nèi)注射(每周兩次，持續(xù)三周)的過(guò)程中，記錄到最高達(dá)35%左右(圖3A、3B)的較高增加，所述mdx小鼠具有與人Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良相同類型的變異。如圖3A所示，IGF-I的注射只會(huì)導(dǎo)致增加5%左右。圖3B示出了在同樣的基礎(chǔ)上，穩(wěn)定化肽與僅用PBS載體對(duì)照的比較結(jié)果。這些與肌肉保護(hù)和修復(fù)有關(guān)的數(shù)據(jù)表明，穩(wěn)定化肽對(duì)于增加營(yíng)養(yǎng)不良和非營(yíng)養(yǎng)不良肌肉的力量都是有效的。3.穩(wěn)定化肽的心臟保護(hù)和心肌修復(fù)通過(guò)在冠狀動(dòng)脈回旋支的邊緣分支插入導(dǎo)管并且注射一小團(tuán)微球以誘發(fā)局部缺血，從而在羊心誘發(fā)心肌梗塞(MI)。當(dāng)動(dòng)物仍然處于麻醉時(shí)，在15分鐘后利用同樣的導(dǎo)管注射(冠狀動(dòng)脈內(nèi)200nm)全長(zhǎng)MGF(天然C-末端肽，外加由外顯子3和4編碼的、MGF和肝型IGF-I共有的序列)或穩(wěn)定化肽。使用成熟的肝型iGF-1作為對(duì)照。正如心M^fei:后對(duì)射血分?jǐn)?shù)的超聲心動(dòng)圖顯像和計(jì)算機(jī)分析所測(cè)得那樣，單獨(dú)使用穩(wěn)定化肽會(huì)顯著地增加存活心肌的百分比以及射血分?jǐn)?shù)。全長(zhǎng)MGF也具有明顯的但稍弱的效果。成熟的肝型IGF-I具有的效果更弱。在圖4中給出的結(jié)果顯示了與進(jìn)行治療前第一天的射血分?jǐn)?shù)相比，第6天的射血分?jǐn)?shù)的百分比變化。因此，穩(wěn)定化肽可以有效的保護(hù)缺血損傷后的心肌。對(duì)小鼠進(jìn)行了附加的實(shí)驗(yàn)。在這些研究中，通過(guò)結(jié)扎鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)產(chǎn)生心肌梗塞。這會(huì)引起左心室舒張，該過(guò)程會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。如利用壓力/容積環(huán)(圖5)所測(cè)得的，全身性給予的穩(wěn)定化肽會(huì)顯著改善心臟的力量和功能，所述壓力/容積環(huán)說(shuō)明了當(dāng)受損的心臟不再能適應(yīng)靜脈回流時(shí)，心臟泵血的能力及其所導(dǎo)致的舒張。這一點(diǎn)通過(guò)穩(wěn)定化肽的全身性給藥得以顯著改善，通過(guò)給予穩(wěn)定化肽使心壁肌肉得到保護(hù)并增加了厚度。因此，心臟病發(fā)后立即對(duì)患者進(jìn)^f亍的治療是相當(dāng)有效的。4.缺血和一般損傷后穩(wěn)定化肽的神經(jīng)保護(hù)4.1體外的神經(jīng)保護(hù)作用在體外使用大鼠海馬器官型培養(yǎng)物中選擇性神經(jīng)元死亡的明確模型，證實(shí)了穩(wěn)定化肽的神經(jīng)保護(hù)作用。按照進(jìn)行了細(xì)微修改的Stoppini等(1991)的方法，用7-10日齡的Wistar大鼠制備海馬切片，所述修改是按照Sarnowska(2002)進(jìn)行的。簡(jiǎn)言之，將大鼠用Vetbutal麻醉，用冰冷卻并斷頭。將鼠腦迅速移至用冰預(yù)冷的pH7.2的工作溶液中，所述工作溶液為含有2mmol/LL-型谷氨酰胺、5mg/ml葡萄糖、1%兩性霉素B、0.4%青霉素~^霉素的96%的HBSS/HEPES-(不含Ca"和Mg"。將海馬體分離出來(lái)并且用Mcllwain組織切片機(jī)切成400nm的切片。將6孔板上的Millicell-CM膜在32匸下置于空氣和5%0)2的濕潤(rùn)氣氛中用lmlpH7.2的培養(yǎng)基預(yù)平衡30分鐘，所述培養(yǎng)基含有50%DMEM、25%HBSS/HEPES、25%HS、2隱1/LL-型谷氨酰胺、5mg/ml葡萄糖、1%兩性霉素B、0.4%青霉素省霉素。在每張膜上放置四張選好的切片。將切片在32。C下置于濕度為100%的5%0)2氣氛中培養(yǎng)兩周。每天用光學(xué)顯凝:鏡檢查切片的活性，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天通過(guò)碘化丙咬染色對(duì)其評(píng)估，并用裝有MC-10095照相枳'(CarlZeissJenaGmbH)的焚光顯孩吏鏡(ZeissAxiovert25)》見(jiàn)察切片以記錄最初的PI吸收(Sarnowska,2002)。14天后，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入30mMTBH(叔丁基過(guò)氧化物)培養(yǎng)3小時(shí)來(lái)誘發(fā)氧化應(yīng)激。之后，將切片轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之后的24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)評(píng)估所得的細(xì)胞死亡情況。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，為了進(jìn)行比較，將穩(wěn)定化肽或重組體IGF-I加到培養(yǎng)基中至終濃度為lOOng/ml,并且使之持續(xù)的存在于培養(yǎng)基中。為了研究MGF作用的途徑，在切片暴露于TBH和MGF或IGF-I肽之前的1小時(shí)時(shí)將一種特異性抗IGF-I受體(AB-l)封閉抗體(Oncogene)加入到培養(yǎng)基中。根據(jù)廠商的建i義來(lái)確定抗體的濃度(1000ng/ml)。為了獲得切片的詳細(xì)圖像，使用了共焦激光掃描顯微鏡(ZeissLSM510)。使用氦氖激光器(543nm)來(lái)激發(fā)碘化丙啶(PI)。采集之后，用ZeissLSM510的軟件包v.2.8處理圖像。使用圖像分析器KS300(CarlZeissJenaGmbH)對(duì)組織損傷情況進(jìn)行定量測(cè)定。TBH攻擊后24和48小時(shí)的PI染色培養(yǎng)物的熒光圖像確定了細(xì)胞死亡的量。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化CA1區(qū)細(xì)胞死亡的相對(duì)程度用下列公式計(jì)算死亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)W卜(實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度(FI)-本底FI)/(最大FI-本底FI)xlOO，其中最大FI是通過(guò)暴露于lOOmM谷氨酸鹽來(lái)殺死全部細(xì)胞時(shí)獲得的熒光強(qiáng)度。所有的測(cè)定都用5個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)制品重復(fù)，且針對(duì)每種實(shí)驗(yàn)條件使用8個(gè)切片。先用單因素方差分析(one-wayAnova)再用Dunnet檢測(cè)法，計(jì)算結(jié)果之間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(GraphPadPrism3.02)。如上所述地用TBH(叔丁基過(guò)氧化氳)誘導(dǎo)局部損傷后，將大鼠腦切片分離出來(lái)。測(cè)定了經(jīng)處理和未經(jīng)處理的大鼠腦切片中的細(xì)胞死亡情況。結(jié)果示于圖6。沒(méi)有進(jìn)行肽處理時(shí)，TBH在24小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致約60%的細(xì)胞死亡，但是在用穩(wěn)定化肽(100ng)處理之后，可以觀察到85。/。的細(xì)胞受到了保護(hù)。IGF-1受體結(jié)構(gòu)域肽(rIGF-I)作為全長(zhǎng)MGF的一部分，也具有神經(jīng)保護(hù)能力(前人已有報(bào)道)。但是其程度較低(72%)且IGF-1的保護(hù)作用最多只能明顯地持續(xù)24小時(shí)；而穩(wěn)定化肽有作用的時(shí)間明顯更長(zhǎng)，其神經(jīng)保護(hù)作用在48小時(shí)后仍可以明顯地〗見(jiàn)察到。4.2沙鼠才莫型中的神經(jīng)保護(hù)作用使用腦缺血的沙鼠模型進(jìn)行了其它的實(shí)驗(yàn)。為了評(píng)估神經(jīng)保護(hù)作用，使用共聚焦顯微鏡對(duì)給予了穩(wěn)定化肽或IGF-I受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腦進(jìn)行觀察。在沙鼠腦中，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎必然會(huì)導(dǎo)致特定的海馬體損傷在CA1區(qū)中，缺血3-4天后錐體細(xì)胞開(kāi)始死亡。使用重50-60g的雄性蒙古沙鼠。按照文獻(xiàn)所述(Domanska-Janiketal.，2004)，使用含三氟溴氯乙烷(halotane)的N20:02(70:30)進(jìn)行麻醉并嚴(yán)格控制在正常體溫條件下，然后通過(guò)5分鐘的頸總動(dòng)脈結(jié)扎進(jìn)行缺血性損傷。使用激光多普勒血流儀(Muro，Inc.)持續(xù)監(jiān)測(cè)腦血流。在即將進(jìn)行再灌注前，通過(guò)在左側(cè)頸動(dòng)脈直接注射給予一組動(dòng)物25網(wǎng)劑量的穩(wěn)定化肽或IGF-I(溶于PBS，濃度為ljig/pl)。給模擬手術(shù)的動(dòng)物注射同樣劑量的肽。通常，處理后10-15分鐘，治療過(guò)的動(dòng)物就可以自己站立起來(lái)并JL^現(xiàn)得和未治療過(guò)的動(dòng)物一樣。讓動(dòng)物恢復(fù)一周時(shí)間，然后在用戊巴比妥麻醉的情況下，用冰冷的4。/。多聚甲醛(溶于PBS)灌注。利用石蠟包埋并固定的、經(jīng)蘇木精/伊紅染色的10mm厚切片來(lái)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。用ZeissAxioscop2將CA1海馬區(qū)的細(xì)胞損傷程度量化為冠狀縫切面中殘存完整神經(jīng)元的平均值。使用MC10095照相機(jī)(CarlZeissJenaGmbH)捕捉CAl區(qū)至少三個(gè)定長(zhǎng)300nm的視野，并且用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(KS300，CarlZeissJenaGmbH)來(lái)計(jì)數(shù)。對(duì)照動(dòng)物中，CA1區(qū)記錄的每300,長(zhǎng)度上形態(tài)完整的神經(jīng)元的平均數(shù)值為121.25士12.5(平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差，n-5)。與只有約12%(15.2±5，n=7)的神經(jīng)元在缺血后存活的未治療動(dòng)物相比，再灌注之后立即在左側(cè)頸動(dòng)J^注射(一次推注25jig)穩(wěn)定化MGFC-末端肽4C供了非常顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。在注射側(cè)記錄了83.2±25(n=10)個(gè)神經(jīng)元(未手術(shù)的對(duì)照值的74.5%)，在對(duì)側(cè)記錄了65.8土30(n-10)個(gè)(未手術(shù)的對(duì)照值的54%)。因此，使用穩(wěn)定化MGFC-末端肽的治療^f吏得高比例的CA1海馬神經(jīng)元在缺血損傷存活。在大多數(shù)動(dòng)物中，保護(hù)作用在兩側(cè)都很明顯；而在少數(shù)動(dòng)物中，保護(hù)作用在注射側(cè)最明顯。相比而言，僅注射25jag的IGF-I對(duì)于CA1神經(jīng)元的缺血后存活幾乎沒(méi)有影響；損傷7天后，存活19.2±7.3個(gè)神經(jīng)元(n=5)，該數(shù)值僅為對(duì)照神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)的15.8%,且與未治療的缺血后的組相比沒(méi)有明顯區(qū)別。5.經(jīng)修飾的肽的生物活性和穩(wěn)定性5.1經(jīng)L-D轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化穩(wěn)定化的肽上述實(shí)施例2、3和4中用到的肽具有SEQIDNO:15的序列(其相當(dāng)于人MGF的Ec肽(SEQIDNO:27)的序列，只是倒數(shù)第二位的精氨酸被組氨酸所置換)，所述序列通過(guò)在14和15位使用D型精氨酸代替天然存在的L-型精氨酸、N-末端共價(jià)連接聚乙二醇和C-末端酰胺化而被穩(wěn)定化。所述肽的生物活性在實(shí)施例2、3和4中得以確i人。所述肽的穩(wěn)定性通過(guò)圖7加以說(shuō)明。通過(guò)評(píng)估新鮮人血漿中所述肽對(duì)蛋白水解裂解的敏感性，研究了具有和不具有聚乙二醇化和14與15位精氨酸L-D轉(zhuǎn)化的肽的穩(wěn)定性。血漿在用前一直儲(chǔ)存于-70。C下。將lOpg歸口入到2ml血漿中，外加7ml的PBS。混合物在37'C培養(yǎng)不同的時(shí)間間隔。然后用蛋白質(zhì)免疫印跡來(lái)檢測(cè)各時(shí)間間隔的每個(gè)肽(在圖7中A-O分鐘；B-30分鐘；C-2小時(shí)；D=24小時(shí)。右側(cè)給出了具有L-D轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的肽的結(jié)果；左側(cè)為沒(méi)有L-D型轉(zhuǎn)化和N-末端聚乙二醇化的肽的結(jié)果)，所述蛋白質(zhì)免疫印跡使用了特異性針對(duì)具有SEQIDNO:15M酸序列的肽的單克隆抗體。30分鐘后，可以檢測(cè)到的沒(méi)有L-D轉(zhuǎn)化和聚乙二醇化的似目對(duì)較少，2小時(shí)后非常少，24小時(shí)后沒(méi)有或幾乎沒(méi)有。相比而言，即使在24小時(shí)后，可以檢測(cè)到的具有L-D轉(zhuǎn)化和聚乙二醇化的肽仍舊很多。5.2其它的肽一一用丙氨酸置換絲氨酸或精氨酸和C-末端與N-末端的截短5.2.1其它的肽本文中，來(lái)自人MGFC-末端的天然人Ec肽序列表示為SEQIDNO:27。在SEQIDNO:15的肽中，倒數(shù)第二位的M酸被組氨酸所置換，所述倒數(shù)第二位的M酸在天然肽(參見(jiàn)SEQIDNO:2和27)中為精氨酸。SEQIDNO:15的肽在圖2中描述為肽l。其它衍生自SEQIDNO:15序列的經(jīng)修飾的序列表示為SEQIDNO:16至24，并且與圖2中SEQIDNO:15的序列進(jìn)行比較，這些序列被稱為肽2-6和短肽1-4。在肽2(SEQIDNO:16)中，在5位的絲氨酸被丙氨酸置換。在肽3(SEQIDNO:17)中，在12位的絲氨酸被丙氨酸置換。在肽4(SEQIDNO:18)中，在18位的絲氨酸被丙氨酸置換。在肽5(SEQIDNO:19)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換。在肽6(SEQIDNO:20)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且在15位的精氨酸也被丙氨酸置換。在短肽l(SEQIDNO:21)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且兩個(gè)C-末端M酸被移除。在短肽2(SEQIDNO:22)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且四個(gè)C-末端M酸被移除。在短肽3(SEQIDNO:23)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換且三個(gè)N-末端M酸被移除。在短肽4(SEQIDNO:24)中，在14位的精氨酸被丙氨酸置換JLi個(gè)N-末端M酸^皮移除。5.2.2其它肽的生物活性使用體外系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)定C-末端肽誘導(dǎo)單核成肌細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)復(fù)制的能力來(lái)測(cè)定生物活性。使用AlamarBlue法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。用0-3級(jí)來(lái)評(píng)估生物活性，結(jié)果如圖2所示。0=在6小時(shí)細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有可計(jì)量的增加1=在4小時(shí)細(xì)胞數(shù)目有顯著增加2=在2小時(shí)細(xì)胞數(shù)目有顯著增加3=在1小時(shí)細(xì)胞數(shù)目有顯著增加使用T枱:驗(yàn)在P〉0.05時(shí)為達(dá)到顯著性水平。SEQIDNO:15的肽(肽1)因其半衰期很短而表現(xiàn)得生物活性較小或沒(méi)有。肽2(SEQIDNO:16)和短肽1(SEQIDNO:21)的活性級(jí)別記為1.肽4和肽5(SEQIDNO:18和19)的活性級(jí)別記為2。肽3(SEQIDNO:17)的活性級(jí)別記為3。肽6(SEQIDNO:20)和短肽2、3和4(SEQIDNO:22、23和24)沒(méi)有表現(xiàn)出可計(jì)量的活性(0級(jí))。5.2.3其它肽的穩(wěn)定性如上述實(shí)施例5.1所述，通過(guò)將^U口入到新鮮的人血漿中并且用蛋白質(zhì)免疫印跡來(lái)測(cè)定每個(gè)肽的穩(wěn)定性。像生物活性一樣，穩(wěn)定性也#:記錄為0-3級(jí)。結(jié)果如圖2所示。以下述方式，用保持完整并且結(jié)合到特異性抗體上的肽的數(shù)量來(lái)測(cè)定穩(wěn)定性。1=1/2小時(shí)時(shí)可4全測(cè)的抗體結(jié)合顯著性減少2=2小時(shí)時(shí)可檢測(cè)的抗體結(jié)合顯著性減少3=24小時(shí)時(shí)可檢測(cè)的抗體結(jié)合無(wú)顯著性減少SEQIDN0:15的肽(肽1)記為1。肽6(SEQIDNO:20)也記為1。肽3和4(SEQIDN0:17和18H己為2。肽2和5(SEQIDN0:16和19H己為3。按照這一尺度，實(shí)施例1-4的肽也記為3。沒(méi)有聚乙二醇化的同樣的肽按照這一尺度也記為3。雖然短肽l-4還沒(méi)有被測(cè)試過(guò)，但是短肽2-4似乎沒(méi)有生物活性。6.穩(wěn)定化^bt營(yíng)養(yǎng)不良、ALS和健康的人肌肉中的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響在這些實(shí)驗(yàn)中使用上述1.1中的穩(wěn)定化肽。并與上述1.3中的IGF-I進(jìn)行比較。原代人肌肉細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)自于先天性肌肉營(yíng)養(yǎng)不良(CMD)、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良(FSHD)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病或肌萎縮側(cè)索石更化(ALS)患者的活組織，以及使用增殖/分化測(cè)定法的健康肌肉。將細(xì)胞培養(yǎng)物用兩種肽處理，并且用免疫細(xì)胞化學(xué)技^r測(cè)表達(dá)分化標(biāo)記結(jié)蛋白的細(xì)胞和被DAPI染色的細(xì)胞核的總數(shù)。使用肌酸磷酸激酶(CPK)和蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定肽處理后的成肌分化。穩(wěn)定化肽極大地增加了正常(未患病的)肌肉的干(結(jié)蛋白陽(yáng)性)細(xì)胞增殖(在正常(未患病的)肢中從38.4±2.5%到57.9±3.2%，正常(未患病的)顱面肌活組織中從49.8±2.4%到68.8±3.9%)。盡管肌萎縮患者的初始肌肉干細(xì)胞數(shù)目比較低，但是穩(wěn)定化肽仍舊可以誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)目增加(CMD10.4±1.7%到17.5±1.6%;FSHD11.7±1.3%到20.4±2.1%;ALS4.8±1.1%到7.2±0.8%)。所得結(jié)果也證實(shí)了穩(wěn)定化肽對(duì)肌管形成沒(méi)有影響，但它可以增加成肌細(xì)胞祖細(xì)胞增殖，與此不同，成熟的IGF-I增強(qiáng)分化。6.2人肌源細(xì)胞的分離-使用前人所述的方法[Lewisetal.，2000;Si訓(xùn)anetal.，2004]，分離人類原代肌肉細(xì)胞培養(yǎng)物。簡(jiǎn)言之，征得同意后，在英國(guó)倫敦的EastmanandMiddlesex醫(yī)院的選擇性外科手術(shù)過(guò)程中，從健康成人和CMD患者身上獲取顱面肌(咬肌)活組織。在英國(guó)倫敦的皇家自由(RoyalFree)醫(yī)院，在局部麻醉的情況下利用針吸活組織檢查，從同意的健康成人、FSHD和ALS患者身上獲M下肢(股外側(cè)肌)肌樣品。從幾個(gè)患有同樣障礙的患者身上獲取活組織并集中起來(lái)以獲得足夠細(xì)胞數(shù)量的原代培養(yǎng)物。將這些活組織用添加了抗生素(青霉素，謂/ml;鏈霉素，100jig/ml;兩性霉素B，2.5jig/ml;Invitrogen)的DMEM(高葡萄糖；Invitrogen)洗滌，剪碎，并將組織碎片置于0.2%明膠包被(Sigma-Aldrich)的T150cm2培養(yǎng)瓶中(HelenaBiosciences)。將移植培養(yǎng)物用含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(sGM)培養(yǎng)，并在37°C下置于含5%C02、濕度95%的空氣中。所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基(sGM)由DMEM、20°/。FCS(PAALaboratories)、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100ng/ml)(Invitrogen)組成。第一批從外植塊遷移出的單核細(xì)胞記為□-批，整個(gè)研究過(guò)程中都使用的是il^細(xì)胞。將遷移的人肌肉細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)消化，在sGM中傳代培養(yǎng)至匯合率為70-80%。傳代數(shù)x(Px)定義為第x代連續(xù)收獲的亞匯合細(xì)胞。所有的實(shí)驗(yàn)都用Pw組。然后將擴(kuò)增的細(xì)胞置于低溫條件下^W直到其被用于下述實(shí)驗(yàn)中。對(duì)于用于每種患病肌肉培養(yǎng)物以及兩種1走康肌肉的療法，每種療法至少進(jìn)行6次。6.3體外成肌祖(干)細(xì)胞群的測(cè)定使用前人所述的方法(Sinananetal.，2004)，評(píng)估成肌前體的數(shù)目。將細(xì)胞重新置于明膠包被(O.2%)的13mm蓋玻片上，初始密度為4.5x103個(gè)細(xì)胞/cm2。為了防止IGF與FCS中的相關(guān)蛋白質(zhì)的混淆現(xiàn)象，將細(xì)胞置于不含血清的合成培養(yǎng)基(dGM)中培養(yǎng)，所述合成培養(yǎng)基為添加了下列成分的DMEM:EGF(10ng/ml)、bFGF(2ng/ml)、胰島素(5ng/ml)、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(5叫/ml)、亞硒酸鈉(5ng/ml)、地塞米松(390ng/ml)、維生素C(50ng/ml)、維生素H(D-生物素；250ng/ml)、維生素E(Trolox;25pg/ml)(Sigma—Aldrich)、白蛋白—1(0.5mg/ml)(Invitrogen)、月臺(tái)J求蛋白(5(%g/ml)(Clonetics/BioWhittaker)、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(l(%g/ml)(Invitrogen)。在培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁之后，在dGM中酌情加入含有和不含rIGF-1(10ng/ml)、含有和不含單克隆IGF-I受體抗體(Ab-l:lOOpg/ml,Oncogene)的穩(wěn)定化肽。所用的肽為(參見(jiàn)上述1.1和1.3)與MGF/IGF-IEc肽[24個(gè)氨基酸M]的E結(jié)構(gòu)域相關(guān)的穩(wěn)定化肽和人IGF-1肽[70個(gè)氨基酸殘基](Sigma-AldrichER2IGF-1)，所述MGF/IGF-1Ec肽的合成如前人所述[Dluzniewskaetal，2005]。所有的培養(yǎng)基每2-3天更換一次。將培養(yǎng)物在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣以用于免疫細(xì)胞化學(xué)分析。6.4免疫細(xì)胞化學(xué)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞用甲醇固定10分鐘(-2(TC)，然后用0.5%Triton-X100去祐劑透化10-15^^中。然后將細(xì)月包與抗結(jié)蛋白(1:100;cloneD33，DAKO，Glostrup，Denmark)抗體培養(yǎng)60分鐘，用抗體稀釋液稀釋(ADS;PBS加10°/。FCS、0.025%疊氮化納、0.1M賴氨船。使用一類與FITC偶聯(lián)的特異性抗小鼠IgG抗體(1:200;JacksonImmunoResearchLaboratories/Stra.techScientific)來(lái)顯^f象。通過(guò)在最后的抗體培養(yǎng)步驟引入熒光小溝DM-結(jié)合探針DAPI(l.0ng/ml;Sigma-Aldrich)來(lái)識(shí)別細(xì)胞^核。用基于甘油的抗褪色劑Citifluor(CitifluorLtd)來(lái)固定蓋玻片，并用透明指曱油密封。分別通it^面熒光和LeicaModulationContrast(LMC)顯樣i鏡來(lái)》見(jiàn)察細(xì)崩^目關(guān)熒光和形態(tài)，使用了裝有LeicaFW4000圖像處理軟件的倒置LeicaDMIRB顯凝:鏡。對(duì)于增殖測(cè)定，一個(gè)^L野里的所有藍(lán)色和綠色焚光陽(yáng)性細(xì)胞都要計(jì)數(shù)。每張蓋玻片系統(tǒng)地計(jì)數(shù)至少30個(gè)視野；因此每張蓋玻片計(jì)數(shù)了至少100個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞的數(shù)目是指結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞占4^PDAPI陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)并進(jìn)行比較。6.5肌酸磷酸激酶測(cè)定按照前y^公開(kāi)的方案[Aulucketal.，2005]進(jìn)行本測(cè)定。因?yàn)镃PK是肌管形成的標(biāo)志，因此CPK的測(cè)定使得肌形成可以進(jìn)行量化的比較[Gotoetal.，1999]。CPK酶催化腺苷-5-二磷酸(ADP)的可逆磷酸化以形成腺苦-5-三磷酸(ATP)和游離的肌酸。通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的形成可以跟蹤所述反應(yīng)在向兩者中的哪一個(gè)方向進(jìn)行，所述無(wú)枳i磷為正比于CPK活性的反應(yīng)終產(chǎn)物?？梢允褂没跓o(wú)機(jī)磷酸的生成過(guò)程的比色法來(lái)測(cè)定無(wú)機(jī)磷。然后將結(jié)果表示為培養(yǎng)物中的蛋白質(zhì)含量將前面擴(kuò)增的原代人肌細(xì)胞培養(yǎng)物重新鋪于0.2%明膠包被的96孔板上，濃度為10xl(T個(gè)細(xì)胞/孔。在sGM中培養(yǎng)細(xì)胞直至70/80°/匯^^度，然后將培養(yǎng)基更換為含有穩(wěn)定化肽[24個(gè)氨基酸殘基]和/或人IGF-I肽[70個(gè)#^酸殘基](Sigma-AldrichIGF-1ER2)的分化培養(yǎng)基(DM;DMEM,2°/FCS，青霉素(100U/ml)和鏈霉素(10(Vg/ml))，所述穩(wěn)定化肽的合成如前人所述[Dluzniewskaetal，2005]。48小時(shí)后，用水預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞兩次，并且在-7(TC下凍存于0.5raM甘氨酸緩沖液(pH6.75)中。通過(guò)快速融化裂解固定的細(xì)胞，并按照產(chǎn)商說(shuō)明書(Sigma-Aldrich)使用CPK測(cè)定試劑盒。使用PierceMicroBCA試劑盒(PerBioScience,UKUd.,Northumberland,UK)的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。6.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用StatView4.51(SASInstituteInc.,CherwellScientificPublishingLtd,Oxford,UK)進(jìn)^亍單因素方差分析，然后進(jìn)4亍Fisher，sPLSDposthoc分析。認(rèn)為p<0.05時(shí)具有顯著性。每種條件下(包括兩種健康肌肉)的4種實(shí)驗(yàn)的全部試驗(yàn)(最少為6)數(shù)據(jù)被匯集起來(lái)，并表示為平均值士s.d。6.7成肌前體在人肌肉原代培養(yǎng)物中的比例測(cè)定了全部被測(cè)肌肉中的成肌(結(jié)蛋白陽(yáng)性)細(xì)胞的百分比(參見(jiàn)下表)。正常(未患病的)肌肉含有相當(dāng)比例的結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，而患病肌肉含有的成肌細(xì)胞的比例刻氐得多。表-來(lái)自不同肌肉來(lái)源的人原代肌肉培養(yǎng)物，它們?cè)诩尤腚那昂胁煌壤某杉?結(jié)蛋白陽(yáng)性)細(xì)胞<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>6.8對(duì)正常(未患病的)人原4銀肉祖細(xì)胞的作用穩(wěn)定化肽明顯地增加了正常煩面(咬肌)原代培養(yǎng)物中的增殖(結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞核占總細(xì)胞核比例的變化)(從49.8±2.4%到68.8±3.9%;p<0.0001)。IGF-1也誘導(dǎo)了中等程度的增長(zhǎng)(從49.8±2.4%到58.4±4.2%;p<0.0001)。值得注意的是，當(dāng)加入IGF-I時(shí)，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定化tot結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞增殖比例的作用受到了抑制(從68.8±3.9%到59.5±4.2%;p<0.0001)。正常下肢(四頭肌)原代培養(yǎng)物中觀察到的影響與在顱面肌中觀察到的類似。穩(wěn)定化肽顯著地增加肌肉祖細(xì)胞的增殖(從38.4±2.5%到57.9±3.2%;p<0.0001)。IGF-1^M"增殖有很小的影響(從38.4±2.5%到47.1±3.5%;p<0.0001)，但是當(dāng)兩種肽共同加入時(shí)，IGF-I會(huì)完全抑制對(duì)穩(wěn)定化肽的響應(yīng)(從57.9±3.2%到38.8±0.6%;p<0.0001)。6.9對(duì)病態(tài)人原代肌肉源細(xì)胞增殖的作用在觀察到穩(wěn)定化肽可重現(xiàn)地且顯著地增加正常肌肉中結(jié)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量之后，研究了對(duì)病態(tài)肌肉的影響。在源自先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良(CMD)的原代培養(yǎng)物中，穩(wěn)定化肽可以顯著地增加肌肉祖細(xì)胞增殖(從10.4±1.7%到17.5±1.6%;p<0.0001)，而IGF-1只有很小的作用(從10.4±1.7%到13.2±1.7%;p=0.005)。當(dāng)共同使用這兩種肽時(shí)，可以再次觀察到如在正常肌肉中所觀察到的抑制作用，穩(wěn)定化肽的作用被降低到對(duì)照水平(從17.5±1.6%到13.1±1.2%;p=0.0001)。穩(wěn)定化財(cái)源自肌萎縮側(cè)索硬化-(ALS)和FSHD的肌肉細(xì)胞的增殖具有類似的作用。在這些障礙中穩(wěn)定化肽明顯增加了表達(dá)結(jié)謹(jǐn)-白的細(xì)胞的數(shù)目(ALS:從4.8±1.1%到7.2±0.8%;p=0.0002，F(xiàn)SHD:從11.7±1.3%到20.4±2.1%;p<0.0001)。如正常肌肉的情況一樣，IGF-I同樣具有很不顯著的作用(ALS:從4.8±1.1%到4.7±1.4%;p=0.7719，F(xiàn)SHD:從ll.7±1.3%到14.1±1.6%;p=0.0107)。當(dāng)一起4吏用兩種同工型時(shí)，MGF-誘導(dǎo)的結(jié)蛋白表達(dá)增加再次受到抑制(ALS從7.2±0.8%到5.3±1.0%;p=0.0024，F(xiàn)SHD從20.4±2.1%到14.5±1.4%;p<0.0001)。6.10IGF-1受體相關(guān)的MGFE結(jié)構(gòu)域?qū)е伦婕?xì)胞的增殖增加在正常肌肉中，穩(wěn)定化肽誘導(dǎo)的增殖的增加不會(huì)^皮抗IGFIR抗體抑制(在MGF處理的細(xì)月包中為68.8±3.9%,在MGF加Ab-1處理的細(xì)胞中為71.1±6.2%;p=0.2472)。在CMD和ALS肌肉中也觀察到了同樣的作用(對(duì)于CMD為17.5±1.6%對(duì)16.7±1.8%，p=0.4589;對(duì)于ALS為7.2±0.8%對(duì)6.5±0.8%，p=0.2933)。這說(shuō)明MGFE結(jié)構(gòu)域的作用方式中不涉及IGF-1受體。6.11MGFE結(jié)構(gòu)域?qū)σ种颇┒朔只淖饔迷谏鲜?.4的CPK測(cè)定中，穩(wěn)定化肽不能促進(jìn)原代成肌細(xì)胞分化和肌管形成。相比而言，濃度為10ng/ml的IGF-1可以明顯地促進(jìn)肌管形成，因?yàn)樵诩⌒纬呻A段加入IGF-1會(huì)降低表達(dá)結(jié)蛋白的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)際上，存在10ng/ml的IGF-I時(shí)，穩(wěn)定化肽起激動(dòng)劑的作用，并且以劑量-依賴的方式抑制成肌細(xì)l包向融合感受態(tài)的分化。100ng/ml穩(wěn)、定化肽和10ng/ml系統(tǒng)性IGF-I導(dǎo)致的P爭(zhēng)^^f氐于10ng/mlMGF和10ng/mlIGF-I導(dǎo)致的降低。6.12結(jié)論在來(lái)源于CMD、FSHD和ALS患者以及健康的個(gè)體的原代肌肉培養(yǎng)物中，穩(wěn)定化肽會(huì)顯著地誘導(dǎo)祖細(xì)胞增殖。穩(wěn)定化肽不會(huì)影響肌管形成，而IGF-1會(huì)顯著促進(jìn)肌管形成。這說(shuō)明與成熟IGF-I相比，生物活性的MGFE結(jié)構(gòu)域具有不同的活性。我們的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明IGF-1同工型的不同作用可能是由不同的受體.介導(dǎo)的。IGF-I受體的阻斷提供了證據(jù)，證明MGFE結(jié)構(gòu)域通過(guò)與IGF-I不同的信號(hào)途徑增加衛(wèi)星細(xì)胞增殖，并且初始衛(wèi)星細(xì)胞活化是不受成熟IGF--I影響的獨(dú)立過(guò)程。已經(jīng)有推測(cè)認(rèn)為，與神經(jīng)病癥和衰老相關(guān)的肌肉萎縮是由于衛(wèi)星細(xì)胞的缺失。我們已經(jīng)證實(shí)，源自CMD、FSHD和ALS患者的祖(結(jié)蛋白P曰性)細(xì)胞占全部成肌細(xì)胞的比例剩氐于健康個(gè)體。因此關(guān)于肌肉退化是由于缺少衛(wèi)星細(xì)胞還是由于不能表達(dá)某些因子使衛(wèi)星細(xì)胞活化仍存在爭(zhēng)議。我們已經(jīng)證實(shí)了老年A^達(dá)的MGF不能達(dá)到維持肌肉所需的水平[Hameedetal.，2004]，這一點(diǎn)與FSHD和ALS患者類似(未/Hf的發(fā)現(xiàn))。肌肉萎縮為患有某些神經(jīng)肌肉疾病的患者死亡的主要原因之一。肌肉喪失可能與不能表達(dá)MGF有關(guān)，即使在進(jìn)行才咸刺激的過(guò)程中，mdx營(yíng)養(yǎng)不良小鼠(一種人Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良的模型)的肌肉也不能生成MGF[Goldspinketal.，1996]。DeBari等人復(fù)現(xiàn)在mdx小鼠的營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中引入間質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，抗肌萎縮蛋白的肉膜表達(dá)和MGF表達(dá)得以恢復(fù)[DeBarietal.，2003]。因此，MGF的生成可能依賴于細(xì)胞膜的順應(yīng)性，并且可能涉及某種動(dòng)力傳導(dǎo)機(jī)制，例如抗肌萎縮蛋白復(fù)合物。已經(jīng)知道某些時(shí)候IGF-I為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，且具有治療神經(jīng)退行性病變障礙淋別是ALS)的潛在臨床用途。通過(guò)使用動(dòng)物模型，對(duì)動(dòng)物模型和進(jìn)行了人重組IGF-I(成熟IGF-I)的全身性給藥以治療ALS。最近，有報(bào)道稱使用AAV2載體的IGF-1基因組合療法對(duì)于治療ALS動(dòng)物模型具有協(xié)同作用[Kasparetal.，2005]。然而本文所提供的數(shù)據(jù)說(shuō)明，是MGF的活性而不是普通的IGF-1的活性對(duì)于治療肌肉萎縮最有用，因?yàn)槠涮峁┝艘环N補(bǔ)充肌肉衛(wèi)星(干)細(xì)胞池的有效方法，所述肌肉衛(wèi)星(干)細(xì)胞池B肉維持和修復(fù)所必需的。這就支持了本發(fā)明的肽作為障礙中肌肉退化的治療劑的用途，所述障礙如CMD、FSHD和ALS,其中在表達(dá)MGF剪接變體時(shí)存在明顯的病損。本發(fā)明的肽也具有增殖用于細(xì)胞療法的培養(yǎng)物中的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的潛力。7.8氨基酸肽的細(xì)胞增殖測(cè)定7.1DMGF和CMGF肽測(cè)試上述1.3.1中所述且在圖8A中凈皮稱為DMGF和CMGF的8氨基酸肽誘導(dǎo)密度為2000細(xì)胞/孔的C2C12肌肉細(xì)胞增殖的能力，所述C2C12肌肉細(xì)胞被置于含有DMEM(1000mg/L葡萄糖)、BSA(100jug/ml)和IGF-1(2ng/ml)的培養(yǎng)基中。測(cè)試了濃度為2、5、50和100ng/ml的DMGF和CMGF(參見(jiàn)圖8中左側(cè)和中間的結(jié)果)，以及單獨(dú)的濃度為2、5、50和100ng/ml的IGF-I(參見(jiàn)圖8中右側(cè)的結(jié)果)。培養(yǎng)36小時(shí)后，使用AlamarBlue測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也提供了僅含有培養(yǎng)基的對(duì)照。DMGF和CMGF都可以諸導(dǎo)細(xì)胞增殖。結(jié)果在圖8中以AlamarBlue測(cè)定法中熒光的形式給出。所有的DMGF和CMGF的結(jié)果值和單獨(dú)使用IGF-I的結(jié)果值都與僅使用培養(yǎng)基的對(duì)照值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)增加DMGF/CMGF的濃度觀察到了增殖水平的增加。7.2肽A2、A4、A6和A8測(cè)試上述1.3.2中所述且在圖8B中被稱為A2、A4、A6和A8的8酸肽誘導(dǎo)密度為500細(xì)胞/孔的C2C12肌肉細(xì)胞增殖的能力。在10%FBS中培養(yǎng)24小時(shí)，然后在0.1%BSA中々幾餓培養(yǎng)24小時(shí)，刺激24小時(shí)，然后用BrdU處理5小時(shí)。測(cè)試了濃度為0.1、1、IO和100ng/ml的肽A2、A4、A6和A8，以及濃度為0.1、1、10和lOOng/ml的IGF-1(參見(jiàn)圖8B中右側(cè)的結(jié)果)。測(cè)定摻入的BrdU以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了不含細(xì)胞、僅含培養(yǎng)基、5%FBS和不含BrdU的對(duì)照。肽A2、A4、A6和A8誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。結(jié)果在圖8中以熒光的形式給出(370nm;4個(gè)孔的平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差)。8.人原代細(xì)胞(HS醒)的細(xì)胞增殖測(cè)定測(cè)試上述1.4中所述且在圖9-11中被稱為A5的24氨基酸肽誘導(dǎo)人肌肉祖細(xì)胞(Cambrex)增殖的能力。這些是市售的原代人肌肉細(xì)胞，即人肌肉干細(xì)胞(祖細(xì)胞)。這些細(xì)胞有時(shí)也被稱為人骨骼肌成肌細(xì)胞(HSMM)。細(xì)胞是從一個(gè)39歲的男性受試者身上獲取的。在200m1的SkGM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，所述培養(yǎng)基添加了hEGF、L-Glut、地塞米爭(zhēng)>、抗生素和10%FCS。然后移除培養(yǎng)基并將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌兩次。測(cè)試A5諸導(dǎo)密度為500(圖9和IO)或IOOO(圖11)細(xì)胞/孔的CambrexHS醒的增殖能力，所述CambrexHS薩^皮置于添加了hEGF、L-Glut、地塞米木》和抗生素的CambrexSkGM2培養(yǎng)基中。測(cè)試了濃度為O.1、1、10、100和500rig/ml的A5(參見(jiàn)圖9A、10A和11A中左側(cè)的結(jié)果)，以及單獨(dú)的濃度為0.1,IO和100ng/ml的IGF-I(參見(jiàn)圖9A、10A和11A中的結(jié)果)。還測(cè)試了存在2ng/mlIGF-1時(shí)，濃度為0.1、1、10、100和500ng/ml的A5(參見(jiàn)圖9B、IOB和11B中左側(cè)的結(jié)果)。培養(yǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞用BrdU處理5小時(shí)。測(cè)定摻入的BrdU以評(píng)估細(xì)胞增殖達(dá)到的水平。也分別提供了不含細(xì)胞、僅含培養(yǎng)基、5%FBS和不含BrdU的對(duì)照。單獨(dú)使用任何劑量的IGF-I對(duì)HS醒的增殖都沒(méi)有明顯作用(參見(jiàn)圖9-11)。當(dāng)單獨(dú)使用小于等于10ng/ml劑量的A5肽48小時(shí)后，A5肽對(duì)HS醒的增殖具有顯著作用(p<0.1)(圖9A和10A)。將2ng/ml的IGF-I與A5共同加入到培養(yǎng)基中會(huì)導(dǎo)致對(duì)HS醒增殖的顯著性作用達(dá)到更高的置信水平(p〈0.001;圖9B、10B和11B)。由于細(xì)胞生勤目對(duì)^爰慢，因此推薦將培養(yǎng)時(shí)間增加到72小時(shí)。其次，通過(guò)增加BrdU的暴露時(shí)間可以增強(qiáng)信號(hào)。參考文獻(xiàn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>權(quán)利要求1.一種多肽，包括最多達(dá)50個(gè)氨基酸殘基；所述多肽包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的氨基酸序列；所述多肽包括一種或多種修飾，使得其與未修飾的MGFE肽相比具有更高的穩(wěn)定性；且所述多肽具有生物活性。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述生物活性選自增加肌肉力量的能力、心臟保護(hù)能力和神經(jīng)保護(hù)能力。3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中至少一種所述修飾為針對(duì)衍生自所述C-末端E肽的所述M酸序列的1參飾。4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述修飾包括將一個(gè)或多個(gè)L-型氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-型氨基酸。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述修飾包括聚乙二醇化或添加一個(gè)己酸部分或一個(gè)M己酸部分。6.權(quán)利要求5的多肽，其中是在N-末端進(jìn)行所述聚乙二醇化或添加一個(gè)己酸部分或一個(gè)氨基己酸部分。7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述修飾包括所述多肽的環(huán)化。8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述修飾包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換。9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述置換包括用丙氨酸置換不是丙氨酸的M酸。10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述C-末端E肽為SEQIDNO:13的大鼠Eb肽或SEQIDNO:14的兔Eb肽。11.權(quán)利要求l至9任一項(xiàng)的多肽，其中所述C-末端E肽為SEQIDNO:27的人Ec肽或SEQIDNO:15的肽。12.權(quán)利要求ll的多肽，其中所述修飾包括聚乙二醇化或添加一個(gè)己酸部分或一個(gè)氨基己酸部分。13.權(quán)利要求12的多肽，其中在N-末端進(jìn)行所述聚乙二醇化或添加一個(gè)己酸部分或一個(gè)^J^己酸部分。14.權(quán)利要求ll的多肽，其中所述修飾包括將一個(gè)或多個(gè)L-型M酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-型氨基酸。15.權(quán)利要求14的多肽，其中位于SEQIDNO:27或15的14和15位的精氨酸戎基的一個(gè)或兩個(gè)都為D-型。16.權(quán)利要求15的多肽，其中位于SEQIDNO:27或15的14和15位的兩個(gè)精氨酸殘J^為D-型。17.權(quán)利要求ll的多肽，其中所述修飾包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換。18.權(quán)利要求17的多肽，其中所述置換在5、12、14或18位。19.權(quán)利要求18的多肽，其中所述置換包括用丙氨酸置換不是丙氨酸的氨基酸。20.權(quán)利要求19的多肽，其中所述丙氨酸置換為對(duì)SEQIDNO:27或15進(jìn)行的下列一個(gè)或多個(gè)置換(a)在5位用丙氨酸置換絲氨酸，(b)在12位用丙氨酸置換絲氨酸，(c)在14位用丙氨酸置換精氨酸，和(d)在18位用丙氨酸置換絲氨酸。21.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的多肽，其中所述C-末端肽為SEQIDNO:33或34的多肽。22.權(quán)利要求21的多肽，其中所述修飾包括聚乙二醇化或添加一個(gè)己酸部分或一個(gè)氨基己酸部分。23.權(quán)利要求12的多肽，其中在N-末端進(jìn)行所述聚乙二醇化或添加一個(gè)己酸部分或一個(gè)氨基己酸部分。24.權(quán)利要求20的多肽，其中所述修飾包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換。25.權(quán)利要求17的多肽，其中所述置換是在2位。26.權(quán)利要求25的多肽，其中所述置換包括用丙氨酸置換不是丙氨酸的氨基酸。27.權(quán)利要求26的多肽，其中所述丙氨酸置換為一個(gè)或多個(gè)(a)在2位用丙氨酸置換絲氨酸。28.^又利要求21的多肽，其序列為SEQIDN0:33、34、35或36的序列。29.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述修飾包括在衍生自所述C-末端E肽的所述M酸序列的C-末端截短一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。30.權(quán)利要求29的多肽，其序列為SEQIDN0:21的多肽的序列。31.斥又利要求ll的多肽，其序列為SEQIDNO:16、17、18、19、28、29、30或31的多肽的序列。32.權(quán)利要求ll的多肽，其序列為SEQIDN0:15或27的序列，但是其在N-末端被聚乙二醇化，且其中位于SEQIDNO:15或27的14和15位的兩個(gè)精氨酸^^鄒為D-型。33.權(quán)利要求ll的多肽，其序列為SEQIDNO:15或27的序列，其中位于SEQIDNO:15或27的14和15位的兩個(gè)精氨酸g都為D-型，且所述多肽沒(méi)有被聚乙二醇化。34.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其在C-末端被酰胺化。35.—種延伸多肽，包括前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，并利用非野生型M酸序列延伸權(quán)利要求1所述的多肽的N-末端和/或C-末端。36.權(quán)利要求35的延伸多肽，其中所述延伸物包括C-末端的半胱氨酸殘基和/或N-末端的Di氨酸殘基。37.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽，通it^v血漿中用半衰期所測(cè)得的它們的穩(wěn)定性比未修飾E肽的穩(wěn)定性高至少10%。38.權(quán)利要求37的多肽或延伸多肽，通itA血漿中用半衰期所測(cè)得的它們的穩(wěn)定性比未^f務(wù)飾E肽的穩(wěn)定性高至少50%。39.權(quán)利要求38的多肽或延伸多肽，通itAj&漿中用半衰期所測(cè)得的它們的穩(wěn)定性比未修飾E肽的穩(wěn)定性高至少100%。40.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽，其在人血漿中的半衰期為至少2個(gè)小時(shí)。41.權(quán)利要求32的多肽或延伸多肽，其在人血漿中的半衰期為至少12個(gè)小時(shí)或至少24個(gè)小時(shí)。42.—種組合物，包括前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽和載體。43.—種藥物組合物，包括權(quán)利要求1至41任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽和可藥用載體。44.權(quán)利要求1至41任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽在一種人體或動(dòng)物體治療方法中的用途。45.—種治療肌肉障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的權(quán)利要求1至41任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽來(lái)實(shí)施。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述肌肉障礙為骨骼肌障礙。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述肌肉障礙為肌營(yíng)養(yǎng)不良或相關(guān)的進(jìn)行性骨骼肌無(wú)力或萎縮、肌萎縮、惡病質(zhì)、肌無(wú)力；年長(zhǎng)受試者的肌肉減少或虛弱；或其中給予所述多肽或延伸多肽以用于創(chuàng)傷后的肌肉修復(fù)。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良為Duchenne或Becker型肌營(yíng)養(yǎng)不良、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良(FSHD)或先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良(CMD);所述肌萎縮為廢用性萎縮、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的萎縮、年長(zhǎng)受試者的肌萎縮或由脊髓損傷或神經(jīng)肌肉疾病誘導(dǎo)的肌萎縮；所述惡病質(zhì)為與癌癥、艾滋病、慢性阻塞性肺病(C0PD)、慢性炎癥性疾病或燒傷相關(guān)的惡病質(zhì)；或所述肌無(wú)力為泌尿括約肌、肛門括約肌或骨盆底肌的肌無(wú)力。49.權(quán)利要求45的方法，其中所述肌肉障礙為心肌障礙。50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中給予所述多肽或延伸多肽以用于由心臟缺血或才咸過(guò)負(fù)荷引起的心M^員傷的預(yù)防或限制；促進(jìn)心I/L^成；通過(guò)增加心臟每搏輸出量提高心輸出量；治療心肌病變；響應(yīng)心臟的急性心力衰竭或急性創(chuàng)傷；治療病理性心臟肥大；或治療充血性心力衰竭。51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述急性心力衰竭或急性創(chuàng)傷包括心肌炎或心,塞。52.—種治療神經(jīng)障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的權(quán)利要求1至41任一項(xiàng)的多肽或延伸多肽來(lái)實(shí)施。53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中給予所述多肽或延伸多肽以用于與神經(jīng)系統(tǒng)受損障礙相關(guān)的神經(jīng)元丟失的預(yù)防，或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的維護(hù)。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述神經(jīng)元丟失與神經(jīng)退行性病變障礙、神經(jīng)損傷或缺血相關(guān)。55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述障礙為肌萎縮側(cè)索硬化；脊髓性肌萎縮；進(jìn)行性脊髓性肌萎縮；嬰兒型肌萎縮或青少年肌萎縮、脊ftA^炎綜合征或脊ty^炎后綜合征；由暴露于毒素導(dǎo)致的障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷或神經(jīng)損害；影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷；與衰老相關(guān)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失；常染色體遺傳以及伴性遺傳的肌營(yíng)養(yǎng)不良；阿爾茨海默氏病；帕金森氏??；糖尿病性神經(jīng)病變；外周神經(jīng)病變；栓塞性中風(fēng)或出血性中風(fēng)；酒精相關(guān)的腦損傷；或其中給予所述多肽或延伸多肽以用于創(chuàng)傷后的神經(jīng)修復(fù)。56.權(quán)利要求1至41任一項(xiàng)的多肽或延伸多Ab^制備用于權(quán)利要求45至55任一項(xiàng)所定義的治療的藥物中的用途。57.—種治療神經(jīng)障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的最高包括50個(gè)氨基酸的多肽或包括所述多肽的延伸多肽來(lái)實(shí)施，所述多肽包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-1)的機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的M酸序列；所述延伸多肽包括所述多肽且利用非野生型酸序列延伸所述多肽的N-末端和/或C-末端；所述多肽或延伸多肽具有生物活性。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述生物活性為神經(jīng)保護(hù)能力。59.權(quán)利要求57或58的方法，其中給予所述多肽或延伸多肽以用于與神經(jīng)系統(tǒng)受損障礙相關(guān)的神經(jīng)元丟失的預(yù)防，或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的維護(hù)。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述神經(jīng)元丟失與神經(jīng)退行性病變障礙、神經(jīng)損傷或缺血相關(guān)。61.根據(jù)權(quán)利要求57或58的方法，其中所述障礙為肌萎縮側(cè)索硬化；脊髓性肌萎縮；進(jìn)行性脊髄性肌萎縮；嬰兒型肌萎縮或青少年肌萎縮、脊髓灰質(zhì)炎綜合征或脊^炎后綜合征；由暴露于毒素導(dǎo)致的障礙、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷或神經(jīng)損害；影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷；與衰老相關(guān)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失；常染色體遺傳或伴性遺傳的肌營(yíng)養(yǎng)不良；阿爾茨海默氏??；帕金森氏?。惶悄虿⌒陨窠?jīng)病變；外周神經(jīng)病變；栓塞性中風(fēng)或出血性中風(fēng)；酒精相關(guān)的腦損傷；或其中給予所述多肽或延伸多肽以用于創(chuàng)傷后的神經(jīng)修復(fù)。62.—種治療心肌障礙的方法，所述方法通過(guò)給予所需患者有效量的最高包括50個(gè)氨基酸的多肽或包括所述多肽的延伸多肽來(lái)實(shí)施，所述多肽包括衍生自胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF)同工型的C-末端E肽的M酸序列；所述延伸多肽包括所述多肽且利用非野生型M酸序列延伸所述多肽的N-末端和/或C-末端；所述多肽具有生物活性。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述生物活性為心肌保護(hù)能力。64.根據(jù)權(quán)利要求62或63的方法，其中給予所述多肽或延伸多肽以用于由心臟缺血或才減過(guò)負(fù)荷引起的心M4員傷的預(yù)防或限制；促進(jìn)心M成；通過(guò)增加心臟每搏輸出量提高心輸出量；治療心肌病變；響應(yīng)心臟的急性心力衰竭或急性創(chuàng)傷；治療病理性心臟肥大；或治療充血性心力衰竭。65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述急性心力衰竭或急性創(chuàng)傷包括心肌炎或心^￡塞。66.權(quán)利要求57至65任一項(xiàng)的方法，其中所述C-末端E肽為SEQIDNO:13的大鼠Eb肽、SEQIDNO:14的兔Eb肽、SEQIDNO:27的人Ec肽、SEQIDNO:15的肽或SEQIDNO:33或34的肽。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述多肽或延伸多肽包括SEQIDNO:13、.14、15、27、33或34的序列。68.權(quán)利要求59的方法，其中所述多肽序列為SEQIDNO:13、14、15、27、33或34的序列。69.如權(quán)利要求57、58、62、63、66、67或68所定義的多肽或延伸多財(cái)制備用于權(quán)利要求59、60、61、64或65任一項(xiàng)所定義的治療的藥物中的用途。70.序列為SEQIDNO:27的多肽，其中位于SEQIDNO:27的14和15位的精氨酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)都為D-型。71.權(quán)利要求70的多肽，其中位于SEQIDNO:27的14和15位的兩個(gè)精氨酸殘基都為D-型。72.序列為SEQIDNO:33、34、35或36的多肽。73.權(quán)利要求70、71或72的多肽，進(jìn)一步包括在C-末端的一個(gè)至五個(gè)附加的M酸和/或在N-末端的一個(gè)至五個(gè)附加的氨基酸。74.權(quán)利要求73的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)所述附加氨基酸為D-型氨基酸。75.權(quán)利要求74的多肽，其中一個(gè)附加的D-型M酸存在于N-末端。76.權(quán)利要求75的多肽，其中所述一個(gè)附加的D-型M酸為D,氨酸。77.權(quán)利要求76的多肽，其中在C-末端沒(méi)有附加的氨基酸。78.權(quán)利要求70至74任一項(xiàng)的多肽，其中一個(gè)附加的M^在C-末端且為半胱氨酸。79.權(quán)利要求78的多肽，其中在N-末端沒(méi)有附加的氨基酸。80.序列為SEQIDN0:15或27的多肽，加上在C-末端的一個(gè)附加的半胱氨酸殘基，且任選地在C-末端還帶有一個(gè)至四個(gè)M酸和/或在N-末端還帶有一個(gè)至五個(gè)氨基酸。81.權(quán)利要求80的多肽，其中位于SEQIDN0:15或27的14和15位的精氨酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)都為D-型。82.權(quán)利要求81的多肽，其中位于SEQIDN0:27或15的14和15位的兩個(gè)精氨酸殘基都為D-型。83.權(quán)利要求80、81或82的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)所述其它的氨基酸為D-型氨基酸。84.權(quán)利要求83的多肽，其中一個(gè)D-型M酸存在于N-末端。85.權(quán)利要求84的多肽，其中所述一個(gè)D-型氨基酸為D老氨酸。86.權(quán)利要求70至85任一項(xiàng)的多肽，其在C-末端被酰胺化。87.權(quán)利要求70至86任一項(xiàng)的多肽，其被聚乙二醇化，或與一個(gè)己酸部分或氨基己酸部分相連接。88.權(quán)利要求87的多肽，其中所述聚乙二醇化或己酸或氨基己酸部分的連接是在N-末端。89.權(quán)利要求70至88任一項(xiàng)的多肽，其沒(méi)有^^皮聚乙二醇化。全文摘要本發(fā)明涉及衍生自E肽的生物活性多肽，所述E肽形成已知為胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)剪接變體的機(jī)械生長(zhǎng)因子(MGF)的C-末端。與天然存在的E肽相比，這些肽經(jīng)過(guò)了修飾以提高其穩(wěn)定性。文檔編號(hào)A61K38/30GK101300269SQ200680016653公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2006年3月20日優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日發(fā)明者P·戈德斯賓克,楊士鈺,杰弗里·戈德斯賓克申請(qǐng)人:Ucl商業(yè)有限公司;伊利諾伊大學(xué)評(píng)儀會(huì)