專利名稱：：凝血酶純化的制作方法凝血酶純化本申請是遞交日為2005年5月26日、美國專利申請11/140,374的部分繼續(xù)申請，在此將其全文引用作為參考。本申請還將申請日為2006年5月24日、題為"凝血酶純化"的部分繼續(xù)美國專利申請全文引用作為參考。本發(fā)明要求遞交日為2005年5月26日、美國專利申請11/140,374以及申請日為2006年5月24日、題為"凝血酶純化"的部分繼續(xù)美國專利申請的優(yōu)先權(quán)。1.發(fā)明領(lǐng)域制備物本發(fā)明涉及純化凝血酶的制備物，其基本上不含對患者產(chǎn)生副作用的大分子量雜質(zhì)，例如因子Va，朊病毒和/或病毒介質(zhì)。本發(fā)明還涉及制備基本上不含病毒介質(zhì)、具有較高純度和較高比活性的凝血酶的方法。更具體地，本發(fā)明包括含有從凝血酶制備物中排除高分子量雜質(zhì)的方法。本發(fā)明還涉及具有較高純度，較高比活性和穩(wěn)定性的凝血酶制備物的制劑。2.
背景技術(shù)：
：凝血酶是一種蛋白水解酶，其是由于凝血酶原蛋白水解在凝血系統(tǒng)活化之后出現(xiàn)在血液中。通過催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，形成血凝塊，并釋放出纖維蛋白肽A和B,凝血酶協(xié)助血液的凝固。在血管系統(tǒng)失調(diào)之后，凝血酶的產(chǎn)生對于凝血過程而言是至關(guān)重要的。凝血酶制備物已獲得FDA的批準(zhǔn)，可以局部施用從而作為對當(dāng)出現(xiàn)來自于毛細(xì)血管的滲血或少量流血時(shí)的體內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)的輔助措施，且可以到底小靜脈。商業(yè)可獲得的凝血酶的局部施用顯著加速血液的凝固并顯著的縮短了凝固的時(shí)間。使用低純度凝血酶制劑的研究表明凝血病可以在患者對暴露于低純度，局部凝血酶制劑的應(yīng)答中出現(xiàn)。在商業(yè)可獲得的凝血酶制備物中通常存在的雜質(zhì)包括因子Va，牛血清白蛋白(BSA)，以及其他高分子量蛋白。商業(yè)牛凝血酶制劑中的因子Va污染可以刺激患者產(chǎn)生抗牛因子Va的抗體，其可與患者自身的因子Va交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致受損的止血作用。凝血酶的凝血強(qiáng)度是以單位/ml進(jìn)行測定的。所述樣本的濃度越高，效力越大，凝血(或產(chǎn)生纖維蛋白原)就越快。比活性是樣本的效力除以其蛋白含量的比值且以單位/毫克蛋白進(jìn)行表達(dá)。凝血酶的比活性依賴于所述凝血酶的純度。當(dāng)與具有較低純度的制備物進(jìn)行比較時(shí)，具有較高純度的凝血酶在比活性方面表現(xiàn)出了增加。在此之前，對凝血酶的純化一般局限于使用常規(guī)的離子交換層析。美國專利5,397,704描述了牛的凝血酶制備物，其是使用一系列陰離子和陽離子交換層析制備的。美國專利5,151,355描述了牛凝血酶制備物，其是通過將1單位的凝血酶原與低于5單位的促凝血酶原激酶在存在鈣的條件下進(jìn)行反應(yīng)而制備的。然后向?qū)⑺瞿敢来问┘佑陉庪x子交換瓊脂糖柱和陽離子交換瓊脂糖柱。美國專利4,965,203公開了純化牛凝血酶的方法，其中將所述凝血酶通過一系列離子交換層析柱，然后使用聚醇和緩沖液進(jìn)行配制。雖然上述的凝血酶制備物被認(rèn)為是具有較高的比活性，但這樣的純化方案并未提供任何有效去除高分子量雜質(zhì)的手段。美國專利申請公開2001/0033837公開了使用疏水相互作用層析，然后任選通過陽離子交換層析純化凝血酶制備物的方法。盡管所述純化凝血酶的方法包括疏水相互作用層析，但所述用于純化和去除病毒的方法并不能夠達(dá)到本發(fā)明所包括的病毒去除和比活性或純度。所以，需要能夠被用于制備具有較高純度凝血酶的方法。因此，所述純化的凝血酶具有較低水平的高分子量雜質(zhì)，例如因子Va，以及較高清除界限的病毒介質(zhì)和朊病毒。盡管具有較高純度的凝血酶可進(jìn)行更安全的使用，因?yàn)橹T如因子Va和BSA的雜質(zhì)得以降低或消除，但高純度的凝血酶依然難以被配制成穩(wěn)定的制劑。凝血酶越純，其穩(wěn)定性就越低且越難以被配制成穩(wěn)定的制劑。因此，亟需含有具有較高純度和較高比活性的凝血酶的穩(wěn)定制劑。3.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及凝血酶組合物以及制備這些組合物的方法。如本說明書所述，術(shù)語制劑，組合物和制備物可以相互替換使用。本發(fā)明所涵蓋的制劑，組合物和制備物包含有凝血酶，優(yōu)選為具有提高純度的凝血酶，還含有額外的賦形劑，特別是那些賦予所述制劑，組合物或制備物穩(wěn)定性的賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了制備具有較高比活性，提高純度且基本上不含雜質(zhì)，包括病毒顆粒，因子Va和朊病毒的凝血酶的方法。如本發(fā)明所述，制備具有提高雜質(zhì)的凝血酶制備物的方法包括一或多個(gè)以下步驟大小排阻過濾，離子交換或大小排阻層析，熱處理，pH調(diào)節(jié)，以及電磁輻射。在本發(fā)明中，所述凝血酶來源可以是?；蛉?。在其他實(shí)施方案中，與商業(yè)可獲得的制備物，例如Thrombin-JMI相比，本發(fā)明的方法能夠?qū)⑺鲋苽湮镏械碾s質(zhì)降低至少50%。更優(yōu)選地，與本文所述的經(jīng)過純化之前或低純度的牛凝血酶相比，本發(fā)明的方法能夠?qū)⑺瞿钢苽湮镏械碾s質(zhì)降低至少80%。如本發(fā)明的另一實(shí)施方案所述，與本文所述的純化之前或低純度的牛凝血酶相比，本發(fā)明的方法能夠?qū)⑺瞿钢苽湮锏谋然钚蕴岣咧辽?000%，1200%或1500%。如本發(fā)明所述，大小排阻過濾步驟被用來排除分子量大于40kDa的雜質(zhì)。優(yōu)選地，大小排阻過濾器被用來排除分子量介于40kDa至300kDa的雜質(zhì)。更優(yōu)選地，所述大小排阻過濾器具有50kDa至150kDa的截流分子量。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的截流分子量為50kDa。在又一實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的截流分子量為100kDa。本發(fā)明的方法還可包括向凝血酶制備物施用到更多的層析步驟，例如離子交換層析和/或大小排阻層析。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括向凝血酶制備物施加熱處理。優(yōu)選地，所述熱處理包括將所述凝血酶在60。C保持IO小時(shí)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將凝血酶的pH降低至約5或更低。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括向凝血酶制備物施加電磁輻射。所述電磁輻射可以是Y輻射或UV輻射。本發(fā)明包括大規(guī)模制備具有提高純度凝血酶制備物的方法，包括將至少15L凝血酶制備物施加于大小排阻過濾器。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及大規(guī)模制備具有提高純度的凝血酶制備物的方法，包括將至少15L凝血酶制備物施加于大小排阻過濾器，其中所述15L凝血酶制備物中含有約300,000,000單位的凝血酶。本發(fā)明還涉及凝血酶組合物，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血酶組合物基本上不含雜質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，所述凝血酶組合物基本上不含分子量大于40kDa的雜質(zhì)。優(yōu)選地，所述凝血酶組合物基本上不含分子量為40kDa至300kDa的雜質(zhì)。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述凝血酶組合物是基本上純的。優(yōu)選地，所述凝血酶組合物基本上不含因子Va。更優(yōu)選地，因子Va的存在量低于0.4/ig/lOOO單位凝血酶。此外，可通過因子Va活性分析，ELISA，或Western印跡測定因子Va的量。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述凝血酶組合物具有大于1800u/mg蛋白的比活性并基本上不含分子量大于40kDa的雜質(zhì)。本發(fā)明的所述凝血酶組合物可具有介于約1800至3000u/mg蛋白的比活性。優(yōu)選地，所述凝血酶組合可具有介于約2400至2500u/mg蛋白或介于約2500至2600u/mg蛋白，介于約2600至2700u/mg蛋白，介于約2700至2800u/mg蛋白，介于約2800至2卯0u/mg蛋白或介于約2900至3000u/mg蛋白的比活性。此外，所述凝血酶組合物還可具有大于3000u/mg蛋白的比活性。本發(fā)明還涉及基本上不含病毒介質(zhì)的凝血酶組合物。本發(fā)明的所述凝血酶組合物可基本上不含病毒介質(zhì)，其中每種病毒的對數(shù)下降值大于3.5。本發(fā)明還涉及包括具有較高純度和較高比活性的凝血酶的穩(wěn)定制劑以及制備和使用這類制劑的方法。即使所述制劑的穩(wěn)定性隨著凝血酶純度的增加而降低，本發(fā)明人依然發(fā)現(xiàn)了包含具有較高純度和較高比活性的凝血酶的穩(wěn)定制劑。本發(fā)明的穩(wěn)定的凝血酶制劑包括凝血酶以及至少一種藥物可接受的賦形劑。本發(fā)明的穩(wěn)定的制劑可包括從任意來源，包括但不限于，牛和人來源分離的凝血酶。除此之外，所述凝血酶可以是任意的凝血酶制備物或組合物，例如本發(fā)明的純化的凝血酶組合物或目前可商業(yè)獲得的Thrombin-JMI。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述凝血酶具有較高程度的純度和較高的比活性。除凝血酶之外，本發(fā)明所述的穩(wěn)定凝血酶制劑還包括賦形劑。在某些實(shí)施方案中，適于本發(fā)明所述制劑的賦形劑包括，但不限于，甘油；聚乙二醇；鹽；水溶液，例如水，酸和堿或其組合。優(yōu)選地鹽包括，但不限于，氯化鈉，乙酸鈉，檸檬酸鈉或其組合。適合的酸和堿包括，但不限于，鹽酸或氫氧化鈉。優(yōu)選地，本發(fā)明所述制劑具有的pH為5-9或更優(yōu)選地pH為6-8。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑包括20-40%體積的甘油，1-20%體積的聚乙二醇，0.15-0.3M濃度的氯化鈉以及0.025-0.05M濃度的乙酸鈉。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑包括純化的凝血酶；甘油；聚乙二醇；氯化鈉；乙酸鈉且pH為6-8。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑是液體的?；蛘?，本發(fā)明所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑可以是固體，其中，在施用之前，將所述穩(wěn)定的，固體凝血酶制劑溶解或懸浮于液體中。除此之外，本發(fā)明還涉及施用本發(fā)明所述穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑可局部施用或施用于體腔的表面。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明所述穩(wěn)定的凝血酶制劑的藥劑盒。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述藥劑盒包括穩(wěn)定的凝血酶制劑；能夠容納所述凝血酶制劑的小管；以及針。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，藥劑盒包括凝血酶制劑以及能夠噴射所述凝血酶制劑的裝置。適合的噴射裝置包括，但不限于，噴嘴或噴射泵。本發(fā)明涉及保持至少其60%原始效力達(dá)2年的穩(wěn)定的凝血酶制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制劑能夠保持至少65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%的原始效力。本發(fā)明特別地涉及在3個(gè)月后保持至少其80%，85%,90%或95%原始效力，在6個(gè)月后能夠保持至少其70%，80%，85%或90%，95%原始效力，在9個(gè)月后能夠保持至少其70%，80%，85%，90%或95%原始效力，在12個(gè)月后能夠保持至少其70%，80%,85%，90%或95%原始效力，以及在18個(gè)月后能夠保持至少其60%，70%,80%，85%，90%或95%原始效力的制劑。本發(fā)明還涉及保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%初始標(biāo)簽宣稱效力達(dá)兩年的穩(wěn)定的凝血酶制劑。本發(fā)明涉及在3個(gè)月后能夠保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%初始標(biāo)簽效力，在6個(gè)月后能夠保持至少其70%，75%，80%，85%,卯％或95%初始標(biāo)簽效力，在9個(gè)月后能夠保持至少其70%，75%，80%，85%,卯％或95%初始標(biāo)簽效力，在12個(gè)月后能夠保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽效力，在18個(gè)月后能夠保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽效力的制劑。4.圖1所示為如本發(fā)明所述方法，用來制備凝血酶制備物的全部步驟的流程圖。圖2所示為在作為當(dāng)前制造的Thrombin-JM^(泳道4和5)與加入本發(fā)明所述純化步驟之后(泳道7，8和9)的Thrombin-JMr以及示出了高分子量的雜質(zhì)(泳道ll)的大小排阻過濾滯留物的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)比較圖。圖3所示為制備本發(fā)明所述穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法。5.發(fā)明詳述本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即可單獨(dú)使用大小排阻過濾或與其他凝血酶純化的純化步驟組合使用，比現(xiàn)有技術(shù)的凝血酶純化方法提供了更顯著的益處。由于基本上去除或清除了高分子量的雜質(zhì)，本發(fā)明中純化凝血酶的方法提供了明顯更純和更安全的凝血酶。本發(fā)明的方法還提供了較高程度的病毒清除并具有一致性，可靠性且簡便易用。本發(fā)明包括向凝血酶制備物施加純化步驟并回收所純化的凝血酶。這些步驟包括，但不限于，層析純化；將所述凝血酶制備物施加于大小排阻過濾器；向離子交換過濾器施加所述凝血酶制備物；降低pH;或采用電磁輻射輻射所述凝血酶制備物。雖然本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了大小排阻過濾的使用，但這樣的純化步驟依然能夠獨(dú)立或組合進(jìn)行應(yīng)用。除此之外，所述方法能夠應(yīng)用于大規(guī)模，商業(yè)性的生產(chǎn)和純化。本發(fā)明的方法能夠生產(chǎn)大量基本上不含分子量大于40kDa，以及病毒介質(zhì)的雜質(zhì)的凝血酶。本發(fā)明還包括向凝血酶中加入一種或多種賦形劑，從而得到比現(xiàn)有可獲得的凝血酶制劑更穩(wěn)定的凝血酶制劑。同樣地，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中凝血酶制劑的許多問題。不想為任意特定的理論所束縛，穩(wěn)定本發(fā)明所述高度純化的凝血酶組合物的能力可以導(dǎo)致一致性和有效的處理。優(yōu)選地，本發(fā)明的穩(wěn)定的凝血酶制劑包括具有較高純度和比活性的凝血酶以及至少一種藥物可接受的的賦形劑。本發(fā)明還包括液體的，穩(wěn)定的凝血酶制劑。5.1凝血酶的來源來自于任意來源的凝血酶都可以用于本發(fā)明的組合物，制劑及方法中。適合使用于本發(fā)明組合物，制備物和方法的凝血酶來源的示例包括，但不限于從?；蛉藖碓捶蛛x的凝血酶。同樣，商業(yè)來源的凝血酶，例如ThrombinJMI也可用于本發(fā)明之中。同樣，任意純度水平的凝血酶或得自任意制備物的凝血酶都可以使用。例如，如本文所述的純化之前的凝血酶可用于本發(fā)明的組合物，制劑和方法中。此外，從天然或重組制備物中得到的凝血酶也可適用于本發(fā)明。5.2凝血酶的純化本發(fā)明包括制備由于雜質(zhì)，例如因子Va，朊病毒和病毒顆粒的雜質(zhì)水平較低從而具有提高的純度，增加的比活性以及增加的安全性的凝血酶的方法。在某些實(shí)施方案中，與Thrombin-JMI,或其他純化的凝血酶相比，本發(fā)明的方法能夠?qū)⒛钢苽湮锏募兌忍岣叱^30%，超過50%，超過75%或超過90%。另一種定量純度的方法是通過測定凝血酶的比活性完成的。可通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，包括凝固分析和顯色分析來測定凝血酶的比活性(參見，例如，Gaffhey等人，1995，ThrombHaemost74:900-卯3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了這樣的凝血酶制備物，與純化之前的凝血酶相比，其中所述凝血酶制備物的比活性增加了至少1000%,至少1200%，至少1500%或至少1800%。本發(fā)明的凝血酶組合物具有較高的比活性；優(yōu)選地本發(fā)明所述凝血酶組合物的比活性超過1800u/mg蛋白。本發(fā)明所述的本發(fā)明的方法提供了比活性介于約1800u/mg至3000u/mg，更優(yōu)選為介于約1800u/mg至2400u/mg的凝血酶制備物。在其他實(shí)施方案中，所述比活性介于約2400u/mg至2500u/mg，介于約2500u/mg至2600u/mg，或介于約2600u/mg至2700u/mg，介于約2700u/mg至2800u/mg，介于約2800u/mg至2900u/mg或介于約2900u/mg至3000u/mg蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述凝血酶的比活性大于3000u/mg。優(yōu)選地，經(jīng)過大小排阻過濾之后，所述比活性從2約1500u/mg提升至2約2300u/mg。使用本發(fā)明的某些方法，病毒介質(zhì)和/或高分子量雜質(zhì)降低至少50%,至少60%,至少75%，至少80%，至少85%。至少90%，至少95%，或至少99%。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述凝血酶制備物中的高分子量雜質(zhì)和/或病毒顆粒雜質(zhì)降低至少80%。本發(fā)明還提供了純化凝血酶的方法，包括排除分子量大于凝血酶的分子。本發(fā)明提供了純化凝血酶的方法從而消除了至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%和至少99%分子量大于凝血酶的雜質(zhì)。在達(dá)到消除較高分子量雜質(zhì)的過程中，所希望的是達(dá)到回收至少70%,至少75%,至少80%，至少85%，至少卯％，至少95%或至少99%的凝血酶。同樣，在本發(fā)明所述方法的某些實(shí)施方案中，凝血酶的回收也大于80%，大于85%，大于90%，或大于95%。本發(fā)明的方法包括向凝血酶制備物施加純化步驟并回收所述純化的凝血酶。本發(fā)明的純化步驟包括將凝血酶制備物施加于大小排阻過濾器；層析純化；向離子交換過濾器施加凝血酶制備物；降低pH;或釆用電磁輻射輻射所述凝血酶制備物。這樣的步驟可單獨(dú)或組合實(shí)施。5.2.1大小排阻過濾和層析如本發(fā)明的方法所述，可使用涉及基于分子量的分離技術(shù)通過排除雜質(zhì)來完成對凝血酶制備物的回收和純化。在一般情況下，可以使用涉及基于分子量來進(jìn)行分離的任意方法，包括大小排阻過濾和層析。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用的是大小排阻過濾，優(yōu)選的情況是過濾器的孔大到足以允許凝血酶分子通過，卻又小到足以截留住眾多雜質(zhì)，包括較大的蛋白雜質(zhì)和病毒。因?yàn)槟傅姆肿恿繛榧s40kDa，優(yōu)選的情況是，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括將凝血酶制備物施用于能夠從所述凝血酶制備物中排除分子量超過40kDa雜質(zhì)的大小排阻過濾器。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器能夠排除分子量介于40kDa至300kDa的雜質(zhì)。因此，可使用分子量截留值，即，大小排阻限，為50，100，150，300kDa或更大的大小排阻過濾器。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的分子量截留值介于40kDa至300kDa。在其他實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的分子量截留值介于50kDa至300kDa。在又一實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的分子量截留值介于50kDa至150kDa。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的分子量截留值為50kDa。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器的分子量截留值為100kDa。這一步驟還可任選包括實(shí)施等容滲濾(diafiltration)從而使凝血酶的回收最大化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述大小排阻過濾器具有分子量截留值為約100kDa的孔徑。優(yōu)選地，適合于本發(fā)明的大小排阻過濾器同樣可以有效地降低細(xì)菌劑和內(nèi)毒素。在某些實(shí)施方案中，大小排阻過濾器是由改性的聚醚砜在高度多孔的聚烯烴支持物上制成的。同樣，所使用的過濾器也可以是切向流過濾器。可用于本發(fā)明的一種過濾器示例是由PALLFILTRON公司生產(chǎn)的Omega100KVR。其他可適用于本發(fā)明的大小排阻過濾器包括，但不限于，Millipore公司生產(chǎn)的Viresolve/70;A/GTechnology公司生產(chǎn)的VirA/Gard500以及由Pall公司生產(chǎn)的UltiporDV20。采用大小排阻過濾器，大分子，包括病毒雜質(zhì)都被濾膜上的孔截留住了。所述濾膜可以在使用后丟棄或者，換言之，所述濾膜可重復(fù)使用。獲得足夠高log降低的濾膜是可以考慮被接受的，并可進(jìn)行使用。每一個(gè)log降低都意味著90%的降低。還可以在所述過濾器上進(jìn)行其他檢測從而確保所述過濾器具有可接受的孔徑范圍。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，病毒清除具有超過3.5，優(yōu)選為超過4.0，更優(yōu)選為超過4.5的log降低值(LRV)。在某些實(shí)施方案中，朊病毒清除具有超過3.5，優(yōu)選為超過4.0，更優(yōu)選為超過4.5的log降低值(LRV)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，向大小排阻過濾器施加50ml，100ml，150ml，200ml，250ml，300ml，350ml,400ml，450ml，500ml，其倍數(shù)體積，或更多體積的初始體積。本發(fā)明還包括向大小排阻過濾器施加至少300ml凝血酶制備物的方法。本發(fā)明還包括適用于大規(guī)模，商業(yè)化純化凝血酶的方法，包括向大小排阻過濾器施加至少40L凝血酶制備物，優(yōu)選為向大小排阻過濾器施加至少60L凝血酶制備物，最優(yōu)選為向大小排阻過濾器施加至少90L的凝血酶制備物。在某些實(shí)施方案中，向所述大小排阻過濾器所施加的凝血酶制備物的體積取決于所用過濾器的表面積和/或所用過濾器的數(shù)量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，向大小排阻過濾器施加40L-60L，60L-80L，80L-100L，大于IOOL，或更多以及其倍數(shù)的初始體積。本發(fā)明的某些方法特別適合于大規(guī)模的凝血酶純化。同樣地，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可向大小排阻過濾器施加15L-20L及其倍數(shù)的初始體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)向所述大小排阻過濾器施加15L凝血酶制備物時(shí)，所述凝血酶制備物包括300,000,000單位的凝血酶。5.2.2離子交換層析無論是單獨(dú)使用或與大小排阻過濾一同使用，離子交換過濾的使用都能夠?yàn)槟讣兓峁?shí)質(zhì)性的益處。離子交換過濾提供了較高程度的病毒清除并具有一致性，可靠性且簡便易用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還可進(jìn)一步地包括向離子交換過濾器施加所述凝血酶。離子交換過濾是一種根據(jù)其電荷性質(zhì)對溶質(zhì)進(jìn)行過濾的分離方法。離子交換過濾器在離子交換濾膜上含有電荷中心。當(dāng)樣本通過過濾器時(shí)，樣本中荷電的化合物會被吸附至所述濾膜的電荷中心上。選用具有正電荷的過濾器會且其能夠過濾掉來自于所述凝血酶制備物中荷電的蛋白質(zhì)和病毒雜質(zhì)。與所述過濾器具有相同凈電荷的病毒不會與樹脂結(jié)合并會在貫通過程中得以清除。用于本發(fā)明的離子交換過濾器優(yōu)選是荷正電的，而通常用于凝血酶純化的離子交換層析樹脂則是荷負(fù)電的。離子交換過濾器可有效地去除核酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，離子交換過濾器具有季銨側(cè)基?？膳c本發(fā)明一同使用的優(yōu)選的離子交換過濾器是由Pall公司生產(chǎn)的MstangQ過濾器。其他可使用的離子交換過濾器是CunoZetaPlusVR05。5.2.3熱處理適當(dāng)加熱的實(shí)施也是可用于本發(fā)明中對凝血酶進(jìn)行純化的方法的一個(gè)適合步驟。適當(dāng)加熱的實(shí)施可單獨(dú)使用或與大小排阻過濾或?qū)游鲆约氨疚闹兴懻摰娜我黄渌兓襟E共同使用?？梢韵蚰甘┘尤我活愋?，來自任一來源，持續(xù)任一時(shí)間長度的加熱，只要病毒雜質(zhì)被滅活而凝血酶還能夠保持較高的比活性。在某些實(shí)施方案中，可將凝血酶加熱至4(TC-10(TC。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述凝血酶被加熱至約6(TC?？蓪λ瞿笇?shí)施任一長度或時(shí)間的熱處理。例如，可對凝血酶加熱l-60分鐘或可對凝血酶加熱1，2，3，4，5，6，7，8，9或10小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可使用對凝血酶進(jìn)行10小時(shí)60°C的熱處理。5,2.4pH調(diào)節(jié)其他可用于本發(fā)明方法的純化步驟還可以是調(diào)節(jié)凝血酶的pH?？蓪⒛傅膒H調(diào)節(jié)至任一水平，只要所得的凝血酶組合物具有較低量的病毒雜質(zhì)。例如，降低凝血酶的pH可有效地滅活病毒雜質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，凝血酶的pH被調(diào)節(jié)至低于約5或低于約4。然而，降低所述凝血酶的pH也會導(dǎo)致凝血酶活性的部分喪失。5.2.5電磁輻射可用于本發(fā)明方法的又一種純化步驟是實(shí)施Y或者電磁輻射，或UV光。對凝血酶實(shí)施的輻射可以是單獨(dú)進(jìn)行的或可以與本說明書所述的任一其他純化步驟共同進(jìn)行。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)電磁輻射和Y輻射是強(qiáng)大的且有力的病毒滅活工具。據(jù)報(bào)道，Y輻射可有效地抗多種病毒。然而，在商業(yè)可獲得凝血酶的情況中，只能獲得低于70%的回收率。UV光的實(shí)施可以是單獨(dú)進(jìn)行的或者與本發(fā)明的其他純化歩驟共同進(jìn)行的，且其可同樣是有效的病毒滅活程序。然而，采用這種方法同樣也會觀察到凝血酶活性的某些喪失。本發(fā)明人注意到較短的暴露階段可能會使得活性的喪失有所降低。5.3純化的凝血酶制備物/制劑本發(fā)明還涉及通過上述方法純化的凝血酶組合物。本發(fā)明的凝血酶組合物具有提高的純度，較高的比活性和較低的雜質(zhì)水平，包括較低水平的雜質(zhì)，例如，因子Va，朊病毒和病毒顆粒。本發(fā)明的凝血酶組合物具有較高的比活性；優(yōu)選地，本發(fā)明所述凝血酶組合物的比活性大于1800u/mg蛋白。本發(fā)明包括比活性介于約1800u/mg至3000u/mg，更優(yōu)選為介于約1800u/mg至2400u/mg的凝血酶組合物。在其他實(shí)施方案中，所述比活性介于約2400u/mg至2500u/mg，介于約2500u/mg至2600u/mg，或介于約2600u/mg至2700u/mg，介于約2700u/mg至2800u/mg蛋白，介于約2800u/mg至2900u/mg蛋白或介于約2900u/mg至3000u/mg蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述凝血酶具有大于3000u/mg的比活性。同樣地，本發(fā)明的所述凝血酶組合物也基本上不含高分子量的雜質(zhì)，包括，因子Va，細(xì)菌介質(zhì)，朊病毒和病毒介質(zhì)。正如在本說明書中所使用的，"基本上不含"高分子量雜質(zhì)的組合物是指該組合物含有低于約5-20%重量比，優(yōu)選為低于約15%重量比，更優(yōu)選為低于約10%重量比的雜質(zhì)。正如在本說明書中所使用的，"基本上是純的"組合物含有低于5%重量比的高分子量雜質(zhì)，且最優(yōu)選為含有低于約3%重量比的高分子量雜質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝血酶組合物基本上不含分子量大于40kDa的雜質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，所述凝血酶基本上不含分子量介于40kDa-300kDa的雜質(zhì)。高分子量雜質(zhì)的示例包括因子Va(重鏈(分子量=105kDa)以及輕鏈(分子量=71kDa/74kDa))以及牛血清白蛋白(BSA;分子量-66kDa)。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基本上不含病毒顆粒雜質(zhì)的凝血酶組合物。病毒顆粒雜質(zhì)同樣也是高分子量雜質(zhì)的示例。可通過本發(fā)明方法去除的病毒包括，但不限于，牛病毒性腹;寫病毒(BVDV)，假狂犬病毒(PRV)，腦心肌炎病毒(EMCV)，牛細(xì)小病毒(BPV)，狗細(xì)小病毒(CPV)，刺魚病毒(SBV)，蜱媒腦炎病毒(TBEV)，馬鼻病毒l(ERV-l)，人免疫缺陷病毒l(HIV-l)，甲肝病毒(HAV)，乙肝病毒(HBV)以及丙肝病毒(HCV)。可通過多種基于抗體的分析，包括ELISA以及基于核酸的分析，包括PCR以及雜交分析來測定病毒。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基本上不含因子Va的凝血酶組合物。在一些實(shí)施方案中，因子Va被降低了至少50。/。，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%或至少99%。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在經(jīng)過大小排阻過濾之后，因子Va在濃縮的樣本中(在其稀釋成最終制劑之前)幾乎不被檢測到且通常在最終制劑中也完全檢測不到。在其他實(shí)施方案中，因子Va的量被降低到低于0.4，低于0.35，低于0.3，低于0.25，低于0.2,低于0.15，低于O.l，低于0.02/xg/1000單位凝血酶或任一其他現(xiàn)有技術(shù)檢測不到的量。優(yōu)選地，可通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法，例如，層析方法，包括凝膠電泳，因子Va活性分析以及基于抗體的分析方法來確定因子Va的不存在或降低的水平。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝血酶組合物具有高于1800u/mg蛋白的比活性并且基本上不含高分子量的雜質(zhì)。經(jīng)過本發(fā)明方法純化的凝血酶可被進(jìn)一步配制以適于臨床使用。本發(fā)明的凝血酶制劑優(yōu)選地比現(xiàn)有可獲得的凝血酶制劑更穩(wěn)定。此外，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑是液體的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的穩(wěn)定制劑包括凝血酶，其中所述凝血酶基本上不含雜質(zhì)；以及至少一種藥物可接受的賦形劑。在這樣的實(shí)施方案中，所述凝血酶是牛凝血酶。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定制劑包括凝血酶，至少一種聚合物，至少一種醇，至少一種鹽和將所述pH調(diào)節(jié)至所希望范圍內(nèi)的適量酸和/或堿。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定制劑包括凝血酶，甘油，聚乙二醇，乙酸鈉和氯化鈉以及調(diào)節(jié)pH至5-8的鹽酸或氫氧化鈉或這二者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定制劑包括凝血酶，約30體積％的甘油，約10體積％的聚乙二醇，0.025-0.05M濃度的乙酸鈉和0.15-0.3M濃度的氯化鈉以及調(diào)節(jié)pH至6-7的鹽酸或氫氧化鈉或這二者。本發(fā)明的純化凝血酶可以在配制和/或滅菌處理之前在0-l(TC保存直至48小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用0.2微米無菌過濾器獲得滅菌的本發(fā)明制劑。在未進(jìn)行滅菌處理的條件下，本發(fā)明的制劑可在25。C保存直至2年。本發(fā)明涉及能夠保持至少其60%原始效力達(dá)2年的穩(wěn)定的凝血酶制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述制劑能夠保持其至少65%，70%，75%，80%,85%，90%或95%的原始效力。本發(fā)明特別地涉及在3個(gè)月后能夠保持至少其80%，85%，90％，或95%原始效力，在6個(gè)月后能夠保持至少其70%，80%，85%，90%或95%原始效力，在9個(gè)月后能夠保持至少其70%，80%，S5%，％或95%原始效力，在12個(gè)月后能夠保持至少其70%，80%,85%，90%或95%原始效力，以及在18個(gè)月后能夠保持至少其60%，70%,80%，85%，90%或95%原始效力的制劑。本發(fā)明還涉及能夠保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽所宣稱效力達(dá)兩年的穩(wěn)定的凝血酶制劑。本發(fā)明涉及在3個(gè)月后能夠保持至少其70%，75%,80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽效力，在6個(gè)月后保持至少其70%，75%,80%,85％，90%或95%原始標(biāo)簽效力，在9個(gè)月后保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽效力，在12個(gè)月后保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽效力，在18個(gè)月后保持至少其70%，75%，80%，85%，90%或95%原始標(biāo)簽效力的制劑。5.3.1賦形劑適合的藥物可接受的賦形劑包括輔助穩(wěn)定本發(fā)明凝血酶制劑的任一賦形劑。適用于本發(fā)明的所述藥物可接受的賦形劑可作為稀釋劑，緩沖劑，穩(wěn)定劑，表面活性劑，螯合劑，防腐劑發(fā)揮作用。適合的藥物可接受賦形劑包括，但不限于，水性液體，例如水，酸和堿；有機(jī)溶劑，例如醇；聚合物；鹽或其組合。適合的酸包括，但不限于，鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，甲酸，乙酸，檸檬酸以及磷酸。優(yōu)選的酸是鹽酸。適合的堿包括，但不限于，氫氧化鈉，氫氧化鉀和氫氧化銨。優(yōu)選的堿是氫氧化鈉。包含于本發(fā)明所述穩(wěn)定的，液體凝血酶制劑中的酸和堿可用來調(diào)節(jié)所述穩(wěn)定的，液體凝血酶制劑的pH。可將本發(fā)明所述穩(wěn)定的，液體制劑的pH調(diào)節(jié)至穩(wěn)定本發(fā)明所述凝血酶制劑的任意pH。在某些實(shí)施方案中，所述凝血酶制劑的pH為4-9。優(yōu)選地，本發(fā)明所述凝血酶制劑的pH為5-8。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述凝血酶制劑的pH為5.5-7.7。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述凝血酶制劑的pH為6.7±0.1。適合的醇包括，但不限于，多羥基醇，例如甘油，乙二醇，丙二醇，丁二醇，1,6-己二醇，新戊二醇，二甘醇，三甲醇基丙烷(trimethylolpropane)和季戊四醇；優(yōu)選的醇是甘油。在本發(fā)明所述穩(wěn)定的，液體凝血酶制劑中的醇的量可以是0-80體積％。在某些實(shí)施方案中，醇的量，例如甘油為10-50體積％。在優(yōu)選實(shí)施方案中，醇的量，例如甘油，為20-40%，25-35%或30體積％。適合的聚合物包括，但不限于，聚乙二醇，苯乙烯-異丁烯-苯乙烯，聚氨酯，硅酮，聚酯，聚烯烴，聚異丁烯，乙烯-a烯烴共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物，鹵乙烯聚合物，聚乙烯醚，聚偏二鹵乙烯，聚丙烯腈，聚乙烯酮，聚乙烯芳香族化合物，聚乙烯酯，乙烯單體的共聚物，乙烯單體和烯烴的共聚物，聚酰胺，醇酸(alkyd)樹脂，聚碳酸酯，聚甲醛，聚酰亞胺，聚醚，環(huán)氧樹脂，聚氨酯，人造絲-三乙酸酯，纖維素，乙酸纖維素，丁酸纖維素，乙酸丁酸纖維素，玻璃紙(cellophane),硝酸纖維素，丙酸纖維素，纖維素醚，羧甲基纖維素，膠原，幾丁質(zhì)，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚環(huán)氧乙烷共聚物(polylacticacid-polyethyleneoxidecopolymers),EPDM橡膠，氟硅氧烷，多糖，磷脂或其組合。優(yōu)選的聚合物是聚乙二醇。特別優(yōu)選的聚合物是聚乙二醇200-400。在本發(fā)明所述穩(wěn)定的，液體凝血酶制劑中的聚合物的量可以是0-50體積％。在某些實(shí)施方案中，聚合物，例如聚乙二醇的量為1-30體積％。在優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物，例如聚乙二醇，的量為1-20%或5-15%或10體積％。適合的鹽包括，但不限于，氯化或溴化鈣，鉀或鈉等；乙酸l丐，鉀，銫或鈉；擰檬酸鉀，銫或鈉；硝酸鉀，銫或鈉；甲酸鉀，銫或鈉。優(yōu)選的鹽是乙酸鈉和氯化鈉。在本發(fā)明制劑中的鹽的濃度可以是0-0.5M。在某些實(shí)施方案中，鹽濃度可以是0.01-0.45M。在其他實(shí)施方案中，所述鹽濃度可低于0.3M。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述鹽是氯化鈉和乙酸鈉的組合，其中氯化鈉的濃度為0.15-0.3M且乙酸鈉的濃度為0.025-0.05M。其他優(yōu)選的氯化鈉范圍為0.28-0.32M。5.4效力檢測可使用本領(lǐng)域公知的分析方法對凝血酶的效力進(jìn)行檢測，或測定其活性。曾經(jīng)這樣的方法是基于對凝固時(shí)間的測定。凝固時(shí)間測定可通過使用ACL7000凝固計(jì)時(shí)器來確定?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間的雙對數(shù)回歸對u/ml作圖，將所測定的凝固時(shí)間轉(zhuǎn)化成u/ml。將u/ml值乘以稀釋因數(shù)可得到所述樣本的實(shí)際效力。由于包括吸取技術(shù)，不同ACL機(jī)器，以及所檢測樣本粘度等因素的組合，分析結(jié)果會有一定程度的可變性。5.5藥劑盒與施用本發(fā)明還包括含有本發(fā)明所述穩(wěn)定凝血酶制劑的藥劑盒。所述藥劑盒可包括容納有本發(fā)明所述穩(wěn)定凝血酶制劑的小管。在所述小管中，所述的穩(wěn)定的凝血酶制劑應(yīng)該滿足以下產(chǎn)品說明<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>凝血酶制劑，能夠容納凝血酶制劑的小管；以及針。該藥劑盒還可以包括至少一種海綿。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥劑盒是噴射藥劑盒，其中藥劑盒含有穩(wěn)定的凝血酶制劑和能夠噴射凝血酶制劑的裝置。合適的噴射裝置包括噴嘴或者噴射泵以及致動裝置。另外，噴射藥劑盒還可以包括針。連同噴射藥劑盒，穩(wěn)定的凝血酶制劑還可以含有小管。包括在噴射藥劑盒中容納穩(wěn)定的、液體凝血酶制劑的小管應(yīng)該滿足以下產(chǎn)品說明<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>無菌情況在經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后滿足USP和21CFR610.12滅菌檢測的要求總的動物安全性在經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后滿足修改的21CFR610.il的要求本發(fā)明還涉及制備穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法。在某些實(shí)施方案中，制備穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法包括(a)增加凝血酶的純度；以及(b)向純化的凝血酶中添加至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑。制備本發(fā)明的穩(wěn)定的制劑的方法還可以包括用酸或者堿調(diào)節(jié)pH值。圖3是描述了本發(fā)明制備穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法的流程圖。在制備具有提高純度和比活性的凝血酶組合物后，向純化的凝血酶中添加28-33體積。/。的甘油，和7-11體積％的、分子量在200-600之間的聚乙二醇。添加氯化鈉和乙酸鈉直至(poly-lined)的容器中。在約0-15T將磨碎的肺懸浮于稀釋的氯化鈉中并提取約12-72小時(shí)。將肺懸液過濾通過粗織物和/或，或者進(jìn)行離心，并收集液體提取物。在保持?jǐn)嚢璧臈l件下，向每升肺提取物中加入大約100ml含有50y。氫氧化鎂凝膠的懸液并徹底混合。將懸液離心，或者通過過濾器輔助手段進(jìn)行過濾，并將離心液或?yàn)V液收集起來。在約0-15°C的攪拌條件下，向每升肺提取物中加入約1升的冷卻飽和硫酸銨并混合約15-480分鐘對所吸附的肺提取物進(jìn)行分餾。通過離心，或者通過使用過濾器輔助手段進(jìn)行過濾收集不溶性的漿糊。以每升初始肺提取物對應(yīng)約0.25-1L冷的稀氯化鈉的量對所述漿糊進(jìn)行再次溶解。在約0-15°C的攪拌條件下，向每升溶液加入約1升的冷卻飽和硫酸銨，并混合約15-480分鐘對所分餾的肺提取物進(jìn)行再次沉淀。通過離心，或者通過使用過濾器輔助手段收集不溶性的漿糊。將第二次的漿糊再次溶解于冷的稀氯化鈉溶液中并通過過濾進(jìn)行澄清。在適當(dāng)?shù)某瑸V系統(tǒng)中將促凝血酶原激酶溶液濃縮至其原始體積的約10-50%并隨后通過等容滲濾去除可檢測到的硫酸銨。超濾是這樣一種過程，其中通過實(shí)施水壓將溶質(zhì)分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溶劑的溶液與所述溶質(zhì)分離開來。所述水壓迫使所述溶劑通過適當(dāng)?shù)臑V膜并濃縮所述溶質(zhì)。通過加入8倍或更多倍體積的0.05MNaCl實(shí)施等容滲濾或直到所述透過物穿過氯化鋇檢測。等容滲濾是采用連續(xù)加入溶劑通過超濾從大分子溶液中分離小分子溶質(zhì)的方法。所述濃縮物可隨后進(jìn)一步地任選濃縮并完成超濾?？墒褂萌舾缮涞南÷然c潤洗所述超濾系統(tǒng)并將這樣的洗液加入到濃縮物中?？墒褂孟←}酸或稀氫氧化鈉將所述濃縮物的pH調(diào)節(jié)至約7.0。將所得的促凝血酶原激酶保存于-15。C或溫度更低的密封塑料容器中?？梢岳鋬龌蚶洳氐墓捃嚪绞浇邮軝幟仕崽幚淼男迈r的牛血漿。如果接受到的是冷凍的血槳，則所述血漿通常是以冷凍形式保存的直至融解待用。融解的血漿保存于0-l(TC的不銹鋼罐中?？墒褂镁彌_的乙酸將所述血漿的pH調(diào)節(jié)至約6.6-6.8并保持約3-30小時(shí)。在保持時(shí)間結(jié)束之時(shí)，所述血漿會變得澄清。使用氫氧化鈉溶液將所述澄清的血漿調(diào)節(jié)至pH6.9-7.2。凝血酶原的制備在攪拌的條件下，在約0-10。C的溫度下，向每升牛血漿中加入約1.5-2.5(干重)g的離子交換樹脂并混合0.5-6小時(shí)，與此同時(shí)將pH控制在約6.9-7.2。將所得的懸液過濾或離心從而收獲所述樹脂。在約pH6.9-7.2的條件下用0.15-0.2摩爾的磷酸緩沖鹽水徹底洗滌所述樹脂并將其保存。在約pH6.9-7.2的條件下，使用0.5-1摩爾的磷酸緩沖鹽水將凝血酶原從所洗滌的樹脂上洗脫下來，過濾，將所述提取物保存并合并起來進(jìn)行進(jìn)一步處理?？墒褂玫臉渲?，但不限于，DEAE-SephadexA-50，Macro-PrepDEAESupport，Macro-PrepHighQSupport，Macro-PrepQSupport，UNOsphereQ離子交換，CaptoQ，DEAE-SepharoseFastFlow,QSepharoseHP或其等價(jià)物。如果在超過濾前有需要的話，可將所合并的提取物進(jìn)行粗過濾。用過的樹脂可在后續(xù)的再生之前用酸處理并保存，并在類似的凝血酶原復(fù)合物制備過程中得以再次使用?？稍谶m當(dāng)?shù)某瑸V系統(tǒng)中將凝血酶原復(fù)合提取物濃縮至其原始體積的約10-50%,然后進(jìn)行等容滲濾以去除不需要的鹽。等容滲濾是首先通過向每升濃縮物中加入約2-5升冰冷的純水進(jìn)行的直到滲透物被去除，然后向每升濃縮物加入約2-5升冰冷的稀氯化鈉直到滲透物被去除。然后對濃縮物進(jìn)行進(jìn)一步地任選濃縮，并完成超濾。使用若干升冰冷的稀氯化鈉潤洗所述超濾系統(tǒng)并將這樣的洗液加入到所述濃縮物中。將所得的凝血酶原復(fù)合物保存在約-15T或更低的溫度的密封容器中。將凝血酶原復(fù)合物在約35°C或更低的溫度融解。通過加入含有足量氯化鈣的純水將凝血酶原復(fù)合物稀釋至約1，000-5,000u/ml從而得到約0.005-0.03摩爾的終氯化f丐濃度。在溫和攪拌的條件下，與此同時(shí)向具有氯化鈣的凝血酶原復(fù)合物中加入促凝血酶原激酶懸液。將所述pH調(diào)節(jié)至約7.3并混合約15-60分鐘。然后在約15-3(TC進(jìn)行活化，將所述懸液冷卻至約^1(TC。凝血酶的活化與純化使用pH約6.6的稀檸檬酸鈉緩沖液將活化的凝血酶原復(fù)合物稀釋至約500-3，000u/ml。然后按照需要對所述材料進(jìn)行再過濾。通過加入稀鹽酸或稀氫氧化鈉將上述混合物的pH調(diào)節(jié)至約6.6。將活化的凝血酶原復(fù)合物加入被調(diào)節(jié)至pH為約6.6的陽離子交換樹脂中?？墒褂玫臉渲ǎ幌抻?，AmberliteCG-50，Macro-PrepCMSupport,Macro-PrepHighSSupport,Macro-PrepSSupport,UNOsphereS離子交換，SPSepharoseHP，CaptoS樹脂或其等價(jià)物。使用pH6.6的稀檸檬酸鈉洗滌柱子，然后使用約0.1-0.25摩爾的氯化鈉進(jìn)行洗滌從而去除應(yīng)該被丟棄的低親和性蛋白。這一步驟之后通過施加約0.5-1摩爾的氯化鈉來洗脫純化的凝血酶。將洗脫液按部分收集，并將所述部分按照進(jìn)行中的分析要求進(jìn)行合并。在整個(gè)過程中，未滅菌的大量體積可保存在約0-l(TC直至約48小時(shí)。可通過加入進(jìn)行沖洗的水，30%甘油，10。/。PEG和約0.15-0.3M的氯化鈉將未滅菌的大量凝血酶配制成不低于約1000u/ml的濃度。使用稀鹽酸或氫氧化鈉將所配制凝血酶溶液的pH調(diào)節(jié)至pH為約6.7±1.0。在進(jìn)行滅菌處理之前可將所配制的未滅菌的大量凝血酶保存在約0-l(TC直至約48小時(shí)?？赏ㄟ^將所配制的未滅菌的大量凝血酶通過無菌的，細(xì)菌保持的非纖維釋放過濾器進(jìn)入適合的無菌容納罐中對其進(jìn)行滅菌。所得產(chǎn)物是高度濃縮的具有分子量為約40kDa的a-凝血酶。樣本具有21500u/mg蛋白的平均比活性。此外，還使用離子交換層析純化步驟進(jìn)行了朊病毒清除的研究。所得結(jié)果說明通過凝血酶層析純化步驟獲得的朊病毒清除水平等于3.5log。所使用的小規(guī)模柱子具有1.6cm的內(nèi)徑并裝填了50.2cm高的樹脂。所以所述柱床體積相當(dāng)于約101ml。使用100ml的1MNaCl然后是100mlpH6.61的0.025M檸檬酸鈉來平衡所裝填的柱子。所述層析系統(tǒng)的流速設(shè)定為3.3ml/分鐘。摻加的(spike)樣本由8ml263K株系的瘙癢病倉鼠腦勻漿組成。將所述勻漿物超聲波處理20分鐘，然后過濾通過0.45，0.2和0.1/rni的過濾器。在樣本摻加之后，總共12ml被用于層析前的檢測，留下了396ml的過柱前的摻加的樣本(400+8-12ml)。向平衡前柱子上樣396ml摻加的粗凝血酶，用144ml0.025M檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫直到洗脫液的吸收值低于0.4AU，然后用275ml0.2MNaCl洗脫直到洗脫液的吸收值低于0.2AU。然后使用0.65MNaCl洗柱子并將從吸收值達(dá)到2AU的時(shí)間開始直到其回落至2AU時(shí)間內(nèi)的37ml純化的凝血酶收集起來。在進(jìn)行朊病毒W(wǎng)estern印跡分析之前將層析之前和之后的樣本收集起來并保存在-60。C或更低的溫度。結(jié)果如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*總1ogK)(PrpRESh最終滴度(logK)(PrpRES/ml))+log,o(樣本體積(m1))實(shí)施例2使用大小排阻過濾進(jìn)行病毒清除用于本實(shí)施例中的濾膜是Omega100KVR并且是"在賦予所完成濾膜以強(qiáng)度和剛性的高度多孔聚烯烴支持物上從改性的聚醚砜澆鑄得來的"。理論上的分子量截留點(diǎn)是100kDa。只有在切向流過濾條件下才有可能通過小分子。大分子和病毒可通過大小排阻得以保留。對牛細(xì)小病毒(BPV)，一種非常小(20nm)的非包膜型病毒而言，其log降低值(LRV)被確定為超過了約3.5log。在這一病毒清除研究中評定的凝血酶溶液是純化前的凝血酶。所述樣本通常具有大于約1500u/mg蛋白的比活性。所述蛋白濃度估計(jì)為約1.2%且鹽濃度為約0.65MNaCl。這種凝血酶溶液的主要成分是具有活性的藥物成分a-凝血酶，其具有約40kDa的分子量。當(dāng)選擇將一組模式病毒包括于病毒清除研究時(shí)有幾個(gè)方面是需要考慮的。一個(gè)方面是模式相關(guān)病毒必須具有明顯的潛力能夠污染初始材料。另一方面是所包括的病毒必須在模式病毒組中具有廣譜的物理和化學(xué)特征，從而當(dāng)病毒清除研究表現(xiàn)出對這些病毒具有較高的清除時(shí)，能夠確保所述制備過程能夠有效地清除不需要的病毒介質(zhì)。將牛細(xì)小病毒(BPV)考慮在內(nèi)是相當(dāng)重要的，因?yàn)檫@是一種能夠明顯污染初始材料的相關(guān)病毒，并且其極其微小，沒有包膜，并對物理-化學(xué)處理極具抗性。異嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)以及假狂犬病毒(PRV)和BPV—樣也被包括在內(nèi)。這一組病毒為相關(guān)病毒提供了模式病毒，并提供了廣泛的物理和化學(xué)特征從而對這些病毒的清除能夠說明所述制造過程也能夠清除不需要的介質(zhì)。這組病毒的特征如表2所示。表2所選擇的4種病毒的特征總結(jié)<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>對所考慮到的4種病毒中的每一種而言，都進(jìn)行了兩輪過濾一次是在靶進(jìn)料壓力為8psi的條件下完成的，另一次是在耙進(jìn)料壓力為12psi。每一輪都是使用新的Omega100KVR濾膜進(jìn)行的。所有的輪次都是在較冷的房間進(jìn)行的。每一輪次都由以5%(v/v)的四種病毒之一摻加到樣本中，過濾通過0.45/xm過濾器以除去任一的病毒聚合體，然后過濾通過PallOmegaIOOKVR濾膜組成。在樣本摻加之后，經(jīng)過0.45iLim過濾之后，以及經(jīng)過OmegaIOOKVR濾膜過濾之后進(jìn)行病毒檢測。凝血酶過濾由將約400ml純化前的凝血酶過濾通過O.lft2的Omega100KVR濾膜組成。在滲透物中收集了80。/。(320ml)初始凝血酶體積之后，所剩余的80ml滯留物中還含有除病毒和非凝血酶雜質(zhì)之外的大量凝血酶。為了最大化凝血酶的透過率可對這80ml溶液進(jìn)行連續(xù)的等容滲濾。這可以通過使用NaCl溶液以6倍所述體積(480ml)對這80ml溶液進(jìn)行等容滲濾來實(shí)現(xiàn)。終滲透物的體積因此是初始凝血酶樣本體積的兩倍。然后將這種滲透物的濃縮物通過10KVR濾膜盒變回所述體積并得到所希望水平的濃度。作為這一過濾的結(jié)果，所述終產(chǎn)物的純度得到了極大的提高。例如，通過競爭性的酶聯(lián)免疫吸附分析(CELISA)的測定，在終產(chǎn)物中所述比活性增加了超過30%而因子Va含量則降低至不可檢測的水平。通過大小排阻實(shí)現(xiàn)了病毒的去除(以及大分子去除)。在所考慮的4個(gè)病毒組(牛細(xì)小病毒，牛病毒性腹瀉病毒，異嗜性小鼠白血病病毒和牛假狂犬病毒)中觀察到了極高的log降低值。Omega處理后的凝血酶制品穩(wěn)定性并未由于產(chǎn)物純度的增加而被降低。表3總結(jié)了8輪過濾的參數(shù)和條件。因?yàn)檫^濾前的凝血酶樣本等于400ml而過濾器的表面積等于O.lft2，所以凝血酶體積與過濾器表面積的比值為4L/ft2。病毒摻加的體積等于20ml/輪(5y。v/v)。進(jìn)料壓力在第一輪維持在8±2psi，在第一輪維持在12±2psi。滯留物的壓力在所有輪次中都為0±2psi。表38輪過濾的參數(shù)和條件的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>對每一輪次而言，將420ml摻加的凝血酶樣本過濾通過0.1&2的Omega100KVR濾膜。當(dāng)收集了340ml滲透物之后，使用6倍于所述體積的0.65MNaCl溶液對剩余的80ml滯留物溶液進(jìn)行等容滲濾。因此總的滲透物體積為340+(6x80)=820ml。這些過濾條件產(chǎn)生了可接受的凝血酶回收以及提高程度的凝血酶純度。在8psi開始的橫向流速度為41-44ml/分鐘。橫向流過濾是這樣一種操作方法，其中殘留的液體在濾膜表面循環(huán)從而防止過濾材料在所述濾膜上的堆積。在12psi開始的橫向流速度為54-56ml/分鐘。對8psi的處理時(shí)間為236-257分鐘。對12psi的處理時(shí)間為1卯-223分鐘。對四種不同病毒的清除結(jié)果如表4所示。表4病毒清除結(jié)果的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>在對所有病毒重復(fù)輪次中所得的較高的清除值以及所得結(jié)果的相似性說明所述過濾步驟是相當(dāng)有力的。除了BPV，其log降低值為3.74±0.39，以上所有病毒的平均log降低值都大于4。即使這一log降低值略為低于41og，在所使用的設(shè)定條件下這依然是很高的。此外，使用大小排阻過濾步驟進(jìn)行了朊病毒清除的研究。所得結(jié)果說明通過凝血酶過濾純化步驟獲得的朊病毒清除水平為3.6k)g。摻加凝血酶樣本之前的體積是400ml。所摻加的樣本由8ml263K株系的瘙癢病倉鼠腦勻漿組成。將所述勻漿物超聲波處理20分鐘，然后過濾通過0.45,0.2和0.1/mi過濾器。在樣本摻加之后，12ml被用于Omega過濾前的檢測，留下了396ml的過濾前摻加的樣本(400+8-12ml)。所使用的過濾器是表面積為0.1&2的Pall公司的Omega100KVR濾膜。所以凝血酶體積與過濾器表面積的比值為4L/ft2。將Omega100KVR濾膜設(shè)置于所述過濾系統(tǒng)中并使用500ml純水潤洗。進(jìn)行了使用前的完整性檢測并通過了可接受的標(biāo)準(zhǔn)。然后使用100ml0.65MNaCl以10psi的進(jìn)料壓力使濾膜達(dá)到正常條件。滲透物和橫向流的速度，以有刻度的量筒計(jì)算，分別為約5和52ml/分鐘。開始進(jìn)行初始396ml的摻加的樣本的過濾。當(dāng)收集了315ml過濾液(即，約80%的初始體積)時(shí)，使用總共475ml的0.65MNaCl(即，約6倍滯留物體積)對剩余的樣本進(jìn)行等容滲濾。在整個(gè)過濾過程中，進(jìn)料壓力保持在約10psi而滯留物壓力為0psi。所述過濾條件是之前所示的能夠產(chǎn)生可接受的凝血酶回收以及較高病毒清除的條件。最終的過濾后體積是790ml且過程時(shí)間為172分鐘。在進(jìn)行朊病毒W(wǎng)estern印跡分析之前將過濾之前和之后的樣本收集起來并保存在-6(TC或更低的溫度。結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*總1ogK)(PrpREs—最終滴度(log)o(PrpRES/ml))+log,o(樣本體積(ml》實(shí)施例3使用離子過濾器進(jìn)行病毒清除首先使用具有10KMWCO和lf^表面積的Pall過濾器對純化的凝血酶進(jìn)行濃縮。然后使用純水將所濃縮的樣本稀釋至所希望的鹽濃度。總共制備了15批次。全部批次制備的結(jié)果總結(jié)于表6和7。表6各個(gè)輪次的平均回收百分率<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表7結(jié)果總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>首先將來自輪次l-3(50mMNaCl)的樣本用于MustangQ過濾器的病毒清除確證，并得到了針對于牛細(xì)小病毒(BPV)的極高的log降低值。然而，由于凝血酶回收率較低，平均僅有74%，使用了來自于輪次4，5和7(108mMNaCl)的樣本重復(fù)了所述病毒清除研究，其得到了99.8%的平均凝血酶回收率但針對于BPV的log降低值卻低于2。最終，使用來自輪次14，15和16(72mMNaCl以及91.7%)的樣本重復(fù)了所述病毒清除研究，且所述針對于BPV的log降低值是可接受的(3.6±0.62)。此外，還使用離子交換過濾器進(jìn)行了朊病毒減少研究。所得結(jié)果表明通過凝血酶過濾純化步驟獲得的朊病毒清除水平大于3.9log。摻加的凝血酶樣本之前的體積為91ml。摻加的樣本由1.6ml263K株系的瘙癢病倉鼠腦勻槳組成。將所述勻漿物超聲波處理20分鐘，然后過濾通過0.45，0.2和0.1/mi過濾器。將12ml用于MustangQ過濾之前的檢測，留下了80.6ml的過濾前摻加的樣本(91+1.6-12ml)。所使用的過濾器是表面積為0.35ml的Pall公司的MustangQ過濾器。所以凝血酶體積與過濾器表面積的比值為230ml樣本/ml過濾器?？墒褂?0mlINNaOH保持20分鐘而無需濾片來對過濾器支架進(jìn)行消毒。將MustangQ過濾器放置于支架上，用20mlINNaOH洗滌然后用lMNaCl洗滌直到洗脫液的pH為中性為止。然后使用25ml72mMNaCl以約3ml/分鐘的流速在對80.6ml摻加的樣本進(jìn)行實(shí)際的過濾之前使所述過濾器達(dá)到正常條件。最終的過濾后體積是77ml且過程時(shí)間為49分鐘。在進(jìn)行朊病毒W(wǎng)estern印跡分析之前將離子過濾之前和之后的樣本收集起來并保存在-6(TC或更低的溫度。結(jié)果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>實(shí)施例4各種條件下的大小排阻過濾本實(shí)施例同樣使用PallOmega100KVR過濾器進(jìn)行大小排阻過濾。以8psi的進(jìn)料壓力進(jìn)行了三個(gè)輪次并以12psi的進(jìn)料壓力進(jìn)行了三個(gè)輪次。選擇了按比例縮小的過濾器的參數(shù)從而使得體積與表面積的比值保持恒定，并確保操作是在特定的進(jìn)料壓力范圍內(nèi)進(jìn)行的。每一輪次都使用新的0.1ft2PallOmega100KVR過濾器進(jìn)行并且所有輪次都是在較冷的房間(^約『C)中進(jìn)行的。所述系統(tǒng)中包括有流量計(jì)從而可以更好地監(jiān)測過濾過程中的橫向流。在進(jìn)行使用之前將流量計(jì)在較冷的房間中進(jìn)行校正。表9總結(jié)了六輪過濾的條件和參數(shù)。對于8psi輪次而言，初始材料的凝血酶活性平均為22，091u/ml而對終過濾液混合物而言，其平均值為11,130u/ml。在經(jīng)過6輪次等容滲濾循環(huán)之后所得的凝血酶回收百分率為平均86%。以Spsi進(jìn)料壓力進(jìn)行的輪次表明比以12psi進(jìn)行的輪次具有略高的凝血酶回收率。表9凝血酶過濾和回收結(jié)果的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>有一個(gè)區(qū)別在于當(dāng)進(jìn)料壓力為12psi時(shí)，更高的橫向流產(chǎn)生了更快的凝血酶通過，從而縮短了處理時(shí)間。表10說明了對于8psi輪次而言，所述過濾步驟導(dǎo)致了凝血酶純度或比活性具有36.4%的提高，對12psi輪次而言其提高為37.1%。所述比活性從在過濾前的樣本中1688.4-1986.0凝血酶/mg蛋白增加到了過濾后樣本中的2324.6-2690.1凝血酶/mg蛋白的范圍。表10OMEGA100過濾前與過濾后樣本的比活性<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>所述滲透物組分比其各自的初始凝血酶樣本要清潔的多，如圖2所示。通過對滯留物進(jìn)行的過濾保留了在所述初始材料中觀察到的幾乎全部的高分子量雜質(zhì)。表11說明過濾步驟同樣導(dǎo)致了因子Va含量的顯著降低。在進(jìn)行兩個(gè)進(jìn)料壓力輪次中所得的平均降低是具有可比性的在8psi輪次中為88,5%,在12psi輪次中為89.3%。因子V/Va是與患者在對手術(shù)暴露于局部的牛凝血酶時(shí)產(chǎn)生的凝血病相關(guān)的?，F(xiàn)有的知識提示在牛凝血酶中的因子V/Va污染刺激患者產(chǎn)生抗牛因子Va的抗體，其能夠與患者自身的因子Va交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致受損的止血作用。這一過濾步驟提供了這樣的益處，即在最終Thrombin-JM鵬中基本上將因子Va的含量降低到了通過競爭性酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)也不能夠檢測到的水平。表ll通過ELISA測定的OMEGA100過濾之前與過濾之后樣本中因子Va的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>可根據(jù)圖3所述的方法構(gòu)建適于所述穩(wěn)定的凝血酶制劑的凝血酶。通過加入進(jìn)行沖洗的水，可將未滅菌的大量凝血酶組合物配制成不低于1,400單位/ml。然后加入大約30體積％的甘油。再加入約10體積％的200-400MW的聚乙二醇。加入氯化鈉直到所述氯化鈉的濃度為約0.15-0.3M,并加入乙酸鈉直到所述乙酸鈉的濃度為約0.025-0.05M。使用稀鹽酸或稀氫氧化鈉將所述凝血酶溶液的pH調(diào)節(jié)至6.7土0.1。然后將所述穩(wěn)定的，未滅菌的，凝血酶制劑放置于室溫(23。C士2。C)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測，并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上檢測所述樣本。將所述樣本檢測三次。用于分析凝血酶效力或活性的檢測方法是基于凝固時(shí)間測定。用于確定凝固時(shí)間的機(jī)器是ACL7000凝固計(jì)時(shí)器。將所述樣本稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的濃度之內(nèi)并放置于機(jī)器的轉(zhuǎn)子上。將人血漿也同樣放置于機(jī)器的小杯上，并將血漿和稀釋的凝血酶樣本都在37T進(jìn)行孵育。然后將給定量的每一種血槳和稀釋的凝血酶一同泵入并混合?；旌现螅构饩€通過所述血漿/凝血酶混合物，當(dāng)凝塊形成時(shí)，光線會發(fā)生散射。有一個(gè)檢測器會檢測所散射的光并將結(jié)果轉(zhuǎn)化成凝固時(shí)間(秒)。然后使用標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間對于u/ml的雙對數(shù)回歸將凝固時(shí)間轉(zhuǎn)換成u/ml。最后，將所述u/ml值乘以稀釋倍數(shù)從而獲得了所述樣本的實(shí)際效力。表13所示為本發(fā)明的制劑在室溫(23。C士2。C)經(jīng)過6個(gè)月之后的穩(wěn)定性結(jié)果。表13穩(wěn)定的凝血酶制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表M所示為配制成具有改善穩(wěn)定性，未經(jīng)過本發(fā)明所述純化方法處理的凝血酶制劑。表14穩(wěn)定的凝血酶制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>盡管給出了具體的實(shí)施例，這些依然僅是優(yōu)選的實(shí)施方案，而且也旨在對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步解釋和說明。其并非旨在對本發(fā)明的全部范圍進(jìn)行限制。本文所引用的全部參考文獻(xiàn)都是將其全文引用并出于全部目的用作本發(fā)明參考的，其程度就像將每一個(gè)單獨(dú)的公開，專利或?qū)＠暾埦唧w地且單獨(dú)指名地全文引用作為參考以出于全部目的一樣。凝血酶制劑，能夠容納凝血酶制劑的小管；以及針。該藥劑盒還可以包括至少一種海綿。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥劑盒是噴射藥劑盒，其中藥劑盒含有穩(wěn)定的凝血酶制劑和能夠噴射凝血酶制劑的裝置。合適的噴射裝置包括噴嘴或者噴射泵以及致動裝置。另外，噴射藥劑盒還可以包括針。連同噴射藥劑盒，穩(wěn)定的凝血酶制劑還可以含有小管。包括在噴射藥劑盒中容納穩(wěn)定的、液體凝血酶制劑的小管應(yīng)該滿足以下產(chǎn)品說明說明<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>本發(fā)明還涉及制備穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法。在某些實(shí)施方案中，制備穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法包括(a)增加凝血酶的純度；以及(b)向純化的凝血酶中添加至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑。制備本發(fā)明的穩(wěn)定的制劑的方法還可以包括用酸或者堿調(diào)節(jié)pH值。圖3是描述了本發(fā)明制備穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法的流程圖。在制備具有提高純度和比活性的凝血酶組合物后，向純化的凝血酶中添加28-33體積％的甘油，和7-11體積％的、分子量在200-600之間的聚乙二醇。添加氯化鈉和乙酸鈉直至權(quán)利要求1.制備純化的凝血酶的方法，所述方法包括(a)向能夠排除分子量大于40kDa的雜質(zhì)的大小排阻過濾器施加凝血酶制備物；以及(b)回收所述純化的凝血酶。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述凝血酶來源于牛。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述凝血酶來源于Thrombin-JM^。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述大小排阻過濾器能夠排除分子量從40kDa至300kDa的雜質(zhì)。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述大小排阻過濾器選自能夠排除分子量為50kDa，100kDa或150kDa的雜質(zhì)的過濾器。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述大小排阻過濾器選自能夠排除分子量為50kDa的雜質(zhì)的過濾器。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述大小排阻過濾器選自能夠排除分子量為100kDa的雜質(zhì)的過濾器。8.權(quán)利要求l的方法，其中在所述回收的純化凝血酶中的雜質(zhì)降低至少50%。9.權(quán)利要求l的方法，其中在所述回收的純化凝血酶中的雜質(zhì)降低至少80%。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶的比活性增加至少1000%。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶的比活性增加至少1200%。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶的比活性增加至少1500%。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶基本上不含雜質(zhì)。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶基本上不含有因子Va。15.權(quán)利要求1的方法，Ji:中所述M收的純化凝血酶基本h不含朊病^。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶具有的朊病毒降低了至少3.5的log值。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶基本上不含病毒介質(zhì)。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述回收的純化凝血酶基本上是純的。19.權(quán)利要求1的方法，還包括向離子交換過濾器施加所述回收的純化凝血酶。20.權(quán)利要求1的方法，還包括向?qū)游黾兓襟E施加所述回收的純化凝血酶。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述層析純化步驟包括離子交換層析柱。22.基本上不含分子量大于40kDa的雜質(zhì)的凝血酶組合物。23.權(quán)利要求22的凝血酶組合物，其中所述凝血酶組合物基本上不含分子量介于50kDa至300kDa之間的雜質(zhì)。24.基本上不含有雜質(zhì)的凝血酶組合物。25.基本上是純的凝血酶組合物。26.基本上不含有因子Va的凝血酶組合物。27.權(quán)利要求27的凝血酶組合物，其中因子Va是通過因子Va活性分析，ELISA，或Western印跡進(jìn)行測定的。28.權(quán)利要求27的凝血酶組合物，其中所述因子Va低于0,4/xg/lOOO單位的凝血酶。29.基本上不含病毒介質(zhì)的凝血酶組合物，其中每種病毒的所述1og降低值大于3.5。30.凝血酶比活性介于約1800至3000u/mg蛋白的凝血酶組合物。31.權(quán)利要求30的凝血酶組合物，其中所述比活性在約1800至2400u/mg蛋白之間。32.權(quán)利要求30的凝血酶組合物，其中所述比活性在約2400至2500u/mg蛋白之間。33.權(quán)利要求30的凝血酶組合物，其中所述比活性在約2500至2600u/mg蛋白之間。34.權(quán)利要求30的凝血酶組合物，其中所述比活性在約2600至2700u/mg蛋白之間。35.權(quán)利要求28的凝血酶組合物，還包括賦形劑。36.權(quán)利要求30的凝血酶組合物，還包括賦形劑。37.權(quán)利要求1的方法，還包括向離子交換過濾器施加所述凝血酶制備物。38.權(quán)利要求l的方法，還包括對所述凝血酶制備物施加熱處理。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述熱處理包括將所述凝血酶在60X保持10小時(shí)。40.權(quán)利要求1的方法，還包括將所述凝血酶制備物的pH降低至約5以下。41.權(quán)利要求1的方法，還包括向所述凝血酶制備物施加電磁輻射。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述電磁輻射是Y輻射。43.權(quán)利要求41的方法，其中所述電磁輻射是UV輻射。44.權(quán)利要求1的方法，其中施加于所述大小排阻過濾器的凝血酶制備物的量為至少15L。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述凝血酶制備物含有至少3OO，OOO，OOO單位的凝血酶。46.制備具有增加純度的凝血酶的方法，所述方法包括(a)向?qū)游黾兓襟E施加所述凝血酶制備物；(b)向大小排阻過濾器施加所述凝血酶制備物；(C)向離子交換過濾器施加所述凝血酶制備物；以及(d)回收純化的凝血酶。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述層析純化步驟包括離子交換層析柱或大小排阻層析柱。48.權(quán)利要求36的制劑，其中所述制劑是液體的。49.權(quán)利要求36的制劑，其中所述藥物可接受的賦形劑是水，甘油，聚乙二醇或其組合。50.權(quán)利要求49的制劑，其中所述甘油占20-40%的體積。51.權(quán)利要求49的制劑，其中所述聚乙二醇占1-20%的體積。52.權(quán)利要求49的制劑，其中所述賦形劑是氯化鈉，乙酸鈉，檸檬酸鈉或其組合。53.權(quán)利要求49的制劑，還包括酸或堿。54.權(quán)利要求53的制劑，其中所述酸或堿是鹽酸或氫氧化鈉。55.權(quán)利要求53的制劑，其中所述制劑的pH在5-9之間。56.權(quán)利要求53的制劑，其中所述制劑的pH在6-8之間。57.含冇凝血酶纟J[合物和節(jié)少種賦形劑的穩(wěn)定的液休凝血酶制劑，其中所述凝血,組合物—戰(zhàn)木丄:不含雜質(zhì)。58.權(quán)利要求57的穩(wěn)定的液體凝血酶制劑，其中所述制劑可在長達(dá)兩年的時(shí)間內(nèi)保持其初始效力的至少60%。59.權(quán)利要求57的穩(wěn)定的液體凝血酶制劑，其中所述制劑在長達(dá)兩年的時(shí)間內(nèi)保持其標(biāo)簽宣稱效力的至少70%。60.穩(wěn)定的液體凝血酶制劑，其包括凝血酶組合物，其中所述凝血酶組合物基本上不含雜質(zhì)；廿汕;聚乙二醇氯化鈉-,乙酸鈉；且其中所述制劑的pH在6-8之間。61.施用權(quán)利要求57的穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法，所述方法包括局部施用所述穩(wěn)定的凝血酶制劑。62.施用權(quán)利要求57的穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法，所述方法包括:將所述凝血酶制劑吸入注射器；迫使所述凝血酶制劑通過所述汴射器；用所述凝血酶制劑淹沒體腔的表面。63.施用權(quán)利要求57的穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法，所述方法包括向體腔的表面噴射所述凝血酶制劑。64.施用權(quán)利要求57的穩(wěn)定的凝血酶制劑的方法，所述方法包括用所述凝血酶制劑浸透海綿；以及將所述海綿施加于體腔的表面。65.藥劑盒，其包括權(quán)利要求57的穩(wěn)定的凝血酶制劑；能夠容納所述凝血酶制劑的小管；以及針。66.藥劑盒，其包括權(quán)利要求57的穩(wěn)定的凝血酶制劑；以及能夠噴射所述凝血酶制劑的裝置。67.權(quán)利要求65的藥劑盒，其中所述裝置是噴嘴或噴射泵。68.穩(wěn)定的液體凝血酶制劑，其包括凝血酶；甘油；聚乙二醇；氯化鈉；乙酸鈉；且其中所述制劑的pH在6-8之間。69.權(quán)利要求69的穩(wěn)定的液體凝血酶制劑，其中所述制劑在長達(dá)兩年的時(shí)間內(nèi)保持其初始效力的至少60%。70.權(quán)利要求69的穩(wěn)定的液體凝血酶配方，其中其中所述配方可在長達(dá)兩年的時(shí)間內(nèi)保持其初始標(biāo)簽宣稱效力的至少70%。全文摘要本發(fā)明涉及具有降低的高分子量雜質(zhì)水平的凝血酶組合物。尤其是，因子Va，朊病毒和/或病毒介質(zhì)的水平也大幅降低。本發(fā)明還一般性地涉及制備具有較高純度和較高比活性的凝血酶的方法。更具體地，本發(fā)明包括了通過大小排阻過濾從凝血酶制備物中去除高分子量雜質(zhì)的步驟。在附加的實(shí)施方案中，凝血酶的制備還包括離子交換過濾的步驟。本發(fā)明的方法特別適合于凝血酶的大規(guī)模純化。本發(fā)明還一般性地涉及含有凝血酶組合物的穩(wěn)定制劑。更具體地，本發(fā)明涉及含有具有較高純度和較高特異活性的凝血酶的穩(wěn)定的、液體制劑，及其制備和應(yīng)用方法。文檔編號A61K38/00GK101365467SQ200680018392公開日2009年2月11日申請日期2006年5月25日優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日發(fā)明者J·福斯特·歐文,丹·帕夫拉克,布拉德利·H·克諾爾,杰拉爾德·凱薩莫爾,阿布德爾·哈克·特拉布申請人:王者制藥研究發(fā)展有限公司