專(zhuān)利名稱(chēng)：由基質(zhì)和血清組成的無(wú)細(xì)胞移植物的制作方法
由基質(zhì)和血清組成的無(wú)細(xì)胞移植物
本發(fā)明涉及用于再生組織，特別是用于再生軟骨的無(wú)細(xì)胞移植物， 涉及生產(chǎn)所述無(wú)細(xì)胞移植物的方法以及所述移植物用于再生組織的用 途。
背景技術(shù)：
軟骨是一種源自結(jié)締組織的中胚層組織形式，其是由多能的、未分 化的、間充質(zhì)前體細(xì)胞生成的。三種類(lèi)型的軟骨即透明軟骨、彈力軟骨 和纖維軟骨之間有所不同。透明軟骨是最常見(jiàn)的軟骨形式，例如其存在 于關(guān)節(jié)表面。磨損或損傷所引起的軟骨缺損是非常普遍的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。因 為軟骨被隔離于人體的傳統(tǒng)的炎癥和修復(fù)系統(tǒng)之外，所以軟骨只有非常 弱的自我愈合的能力。因此，在過(guò)去(特別是在過(guò)去的數(shù)年里)已經(jīng)開(kāi) 發(fā)出了多種方法和技術(shù)，用作替代關(guān)節(jié)軟骨的軟骨和骨軟骨區(qū)域的手 段。例如，已經(jīng)用骨膜、軟骨膜、異體的和自體的骨軟骨移植物、異體 的半月板或由合成材料制成的假體替代關(guān)節(jié)軟骨。
在涉及軟骨細(xì)胞的自體移植的情況中，將從患者中取得的軟骨細(xì)胞 在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，將其再重新放回到患者體內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)各種不同 的移植物形式將所述軟骨細(xì)胞放回到患者體內(nèi)，實(shí)例包括別注射到關(guān)節(jié) 內(nèi)的注射溶液、與軟骨細(xì)胞一起注射的基質(zhì)等等。
例如，專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)WO 97/15655描述了人工組織，其包括三維細(xì)胞 外基質(zhì)和經(jīng)遺傳學(xué)加工處理過(guò)的細(xì)胞，基質(zhì)能夠釋放免疫抑制因子或細(xì) 胞分化因子。這些基質(zhì)優(yōu)選地是聚合物絨狀物形式，通過(guò)所述基質(zhì)可以 分布細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液可以被懸浮于纖維蛋白原溶液內(nèi)。也可以 向基質(zhì)中加入生長(zhǎng)和/或分化過(guò)程所必需的相應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)的因子或組
分。為了將細(xì)胞保持于基質(zhì)內(nèi)，可以通過(guò)添加凝血酶固化細(xì)胞懸浮液， 據(jù)此形成最終的移植物。
專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)DE 44 31 598描述了生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物植入物的方法，其 中首先包裹其中被施加了細(xì)胞的三維支持結(jié)構(gòu)，然后灌注營(yíng)養(yǎng)液?？稍?吸收的微體被摻入到支持結(jié)構(gòu)內(nèi)，當(dāng)它們被再吸收時(shí)，其可釋放出影響 組織形成的因子。
專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)DE 43 06 661描述了一種三維支持結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地是由聚 合物絨狀物制成，細(xì)胞被摻入于其中。然后向支持物結(jié)構(gòu)灌注營(yíng)養(yǎng)液， 以便促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)以及促進(jìn)細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)。為了阻止細(xì)胞遷移或 流出，用瓊脂糖包裹支持結(jié)構(gòu)。
專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)DE 101 39 783也闡述了基質(zhì)細(xì)胞在滑液中的用途。如 果需要，該組合物也可以被施加于支持物例如絨狀物或塑料，并以這種 形式用作移植物。另外，滑液中的細(xì)胞懸浮液被照此注射到相關(guān)的關(guān)節(jié) 內(nèi)。
或者，合成事實(shí)上不含有任何細(xì)胞的基質(zhì)結(jié)構(gòu)。例如，專(zhuān)利說(shuō)明書(shū) US 2003/0003153描述了含有一種或多種適合于細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)形成性 蛋白的硬基質(zhì)膜。合適的蛋白例如是膠原。所形成的膜形式的基質(zhì)可以 與細(xì)胞一起被注射或它們自身可以被移植。在后一種情況中，推測(cè)來(lái)自 機(jī)體自身組織的細(xì)胞可以遷移到基質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)。例如通過(guò)傳統(tǒng)的Pridie穿 刺或微破損方式可以實(shí)現(xiàn)^^一點(diǎn)。利用這些技術(shù)，對(duì)關(guān)節(jié)骨進(jìn)行深達(dá)骨 髓的小穿刺或破損。流經(jīng)穿刺處的血液流入到缺損處，因此缺損處填充 滿了血液移植物。所述移植物含有經(jīng)合適動(dòng)員物剌激的間充質(zhì)前體細(xì) 胞，其能形成軟骨類(lèi)型的替代組織即所謂的纖維軟骨。如果基質(zhì)材料被 放置到Pridie穿刺處之上，血細(xì)胞能夠遷移到該基質(zhì)材料內(nèi)，并在該處 存活。
專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)DE 199 57 388和WO 2005/014027利用了這種作用并通 過(guò)在基質(zhì)結(jié)構(gòu)中摻入生長(zhǎng)和分化因子(DE 199 57 388)或趨化因子
(WO 2005/014027)作為募集工具可以強(qiáng)化這種作用。所有因子預(yù)期都 能造成對(duì)軟骨形成間充質(zhì)前體細(xì)胞的強(qiáng)化募集，最終的目標(biāo)是更快地再 生出軟骨。
最后，專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)WO 02/00272闡述了從血液和聚合物成分生成合 適的移植物的可能性。該文件所解決的潛在問(wèn)題是利用Pridie穿刺形成 的標(biāo)準(zhǔn)的血液移植物在凝血時(shí)收縮并因此會(huì)改變其形狀的事實(shí)。所添加 的聚合物阻止了這種形狀變化，并因此容許其真正地愈合成形。為了生 成所述移植物，將聚合物和血液或血液組分例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、單核 細(xì)胞、血小板、纖維蛋白原、凝血酶和富含血小板的血漿混合，并將其 引入到缺損處。但是如果使用血液組分，能夠凝血的材料的存在是實(shí)現(xiàn) 所需作用的重要因素。
由殼聚糖(Chitosan)和軟骨細(xì)胞制成的移植物可以作為另一種選擇。
當(dāng)如上所述將細(xì)胞引入到缺損處時(shí)，可以無(wú)需添加用于吸引目的的物質(zhì) 和/或生長(zhǎng)和分化因子。
上面所述的技術(shù)也有缺點(diǎn)，因?yàn)槿绻浦参锉旧砗屑?xì)胞，它們常 常會(huì)因?yàn)椴僮髌陂g的加工處理收到損傷，而如果細(xì)胞特別是自體細(xì)胞被 用于移植物，它們必須通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行生產(chǎn)，并且必須被仔 細(xì)地控制避免污染，最后還沒(méi)有儲(chǔ)存的可能性。相似的，通過(guò)Pridie穿 刺募集間充質(zhì)細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞移植物(有或沒(méi)有用于吸引目的的物質(zhì))已 經(jīng)證實(shí)是令人不滿意的。由少數(shù)細(xì)胞所啟動(dòng)的定植(colonization)是緩 慢的，也是非特異的。這意味著不同的細(xì)胞類(lèi)型從離開(kāi)Pridie穿刺處的 血液中被沖到了移植物內(nèi)并保留于此。但是，只有能分化成軟骨細(xì)胞的 間充質(zhì)前體細(xì)胞的定植是需要的。但是，在傳統(tǒng)的移植物中，這一點(diǎn)并 不能得到保證。
因此，本發(fā)明的目的之一是提出能簡(jiǎn)單生產(chǎn)的、能容易儲(chǔ)存的和簡(jiǎn) 單施用的移植物。此外，需要通過(guò)移植物的方式增加募集率，獲得更好 的對(duì)移植物所募集和沉積的細(xì)胞類(lèi)型的選擇性，以及盡可能地免除給機(jī)
體使用外源的生長(zhǎng)因子，'任選地甚至是重組生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子都 是潛在的過(guò)敏原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)已知的這些問(wèn)題和其他問(wèn)題。為此，提出了 無(wú)細(xì)胞移植物，其包括(i)由生物學(xué)和藥用可接受材料制成的具有開(kāi)放 多孔性的粘合性、結(jié)構(gòu)形成性基質(zhì)和(ii)血清。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí) 施方式中，基質(zhì)額外地包含凝膠。
在第二個(gè)方面，提出了生產(chǎn)這種無(wú)細(xì)胞移植物的方法，其中將基質(zhì) 和凝膠(如果提供)與血清接觸。任選地，將移植物與血清一起干燥。 或者，在與血清接觸之前，基質(zhì)和凝膠(如果提供)可以是干燥狀態(tài)。
根據(jù)第三個(gè)方面，本發(fā)明最終涉及無(wú)細(xì)胞移植物用于再生組織且特 別是用于再生軟骨和/或骨的用途。


圖1顯示了 CDMP1、 CDMP2、 SDFl-a禾Q IL8在體外對(duì)人間充質(zhì)干 細(xì)胞的趨化作用。
圖2顯示了人體血清在體外對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化作用。
具體實(shí)施例方式
如上所述，本發(fā)明涉及無(wú)細(xì)胞移植物，包括(i)由生物學(xué)和藥用可 接受材料制成的具有開(kāi)放多孔性的粘合性、結(jié)構(gòu)形成性基質(zhì)和(ii)血 清。令人驚訝的是，在本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞移植物中使用血清使得從流經(jīng)骨 髓的血液中募集間充質(zhì)干細(xì)胞的效率增加了數(shù)倍。募集效率的這種令人 驚訝的增加反過(guò)來(lái)消除了分別向移植物中引入分化細(xì)胞或前體細(xì)胞的需 要，這促進(jìn)并縮短了移植物的處理過(guò)程，也容許儲(chǔ)存移植物。
用傳統(tǒng)方式可以容易地得到血液血清。優(yōu)選地，可以在移植期間直
接從患者體內(nèi)取得血清。自體材料因此可以被植入到患者體內(nèi)，不需要 添加其他的、潛在過(guò)敏的和/或免疫活性的因子。
本發(fā)明所提出的無(wú)細(xì)胞移植物的基質(zhì)是具有開(kāi)放多孔性的粘合性、 結(jié)構(gòu)形成性基質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"粘合性"在此上下文中應(yīng)當(dāng)被解釋為表示基質(zhì) 使得移植物能夠被加工處理而不會(huì)分散為各個(gè)部分或小塊。并不需要基 質(zhì)的所有部分都通過(guò)化學(xué)鍵或相互作用彼此被結(jié)合在一起。交織、縮絨
(foiling)、扭曲等形式的機(jī)械連接足矣。
術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)形成性"在此上下文中應(yīng)當(dāng)被解釋為表示基質(zhì)作為用于 細(xì)胞遷移到所要生成的組織基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)形成物的特性?；|(zhì)也可以作 為細(xì)胞所能夠定植的框架或格柵，所述細(xì)胞在該處能夠得到支持，使得 它們不會(huì)被例如滑液或血液帶到基質(zhì)外。
最后，"開(kāi)放多孔性"在本發(fā)明的上下文中應(yīng)當(dāng)被解釋為表示基質(zhì) 的框架結(jié)構(gòu)之間的空間可以出入物質(zhì)，特別是可以進(jìn)行與基質(zhì)周?chē)鷧^(qū)域
的液體交換?？椎目讖降拇笮?yōu)選地被設(shè)定為使得細(xì)胞也能夠穿透或循 環(huán)。但是，在本發(fā)明的上下文中所用的術(shù)語(yǔ)開(kāi)放多孔性也打算表示例如 存在于凝膠中的結(jié)構(gòu)?；|(zhì)的框架結(jié)構(gòu)在此是由結(jié)構(gòu)形成物的骨架提供 的。排列于基質(zhì)的框架結(jié)構(gòu)之間的是水合物袋和液體，其中細(xì)胞能夠穿 透并使得能夠進(jìn)行液體交換。在本發(fā)明的上下文中，合適的凝膠結(jié)構(gòu)因 此也應(yīng)當(dāng)被解釋為具有幵放多孔性的基質(zhì)。
具有開(kāi)放多孔性的框架結(jié)構(gòu)優(yōu)選地選自交織型或非交織型織物(特 別是絨狀結(jié)構(gòu)和氈狀結(jié)構(gòu))、膜、海綿、填充物、開(kāi)孔泡沫、羊毛、編 織物、有序的和無(wú)序的纖維束、多孔陶瓷材料、松質(zhì)和凝膠，以及這些 材料的組合?；|(zhì)優(yōu)選地具有絨狀結(jié)構(gòu)或氈狀結(jié)構(gòu)。不同材料的組合， 例如分層排列的形式，也是可能的，并在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
原則上，基質(zhì)材料可以是任一合適的、生物學(xué)和藥用可接受的材 料。在本發(fā)明提出的基質(zhì)中所用的基質(zhì)材料可以是可再吸收的或不可再 吸收的?？稍傥盏牟牧鲜莾?yōu)選的。基質(zhì)優(yōu)選地是選自由天然和合成聚
合物組成的組中的材料，例如膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、殼多糖
(Chitin)、多糖、纖維素及其衍生物、蛋白、多肽、聚乙醇酸、聚乳酸、 乙交酯乳酸酯共聚物(poly(glycolide,lactate))、己內(nèi)酰胺；陶瓷材料例 如金屬的氧化物、碳化物、氮化物和碳氮化物，特別是氧化硅、氧化鈦 和氧化鈣；礦物質(zhì)例如金屬的鹵化物特別是氟化物、金屬的氫氧化物、 金屬的硫酸鹽、優(yōu)選為生理學(xué)無(wú)毒害的金屬例如磷酸鈣、appatite、 hydroxyl appatite;金屬例如鈦、鋁、金、銀、不銹鋼及其混合物。更特 別優(yōu)選的是聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、膠原或透明質(zhì)酸。
對(duì)于聚乙醇酸而言，優(yōu)選地使用分子量>20,000 g/mo1的純聚乙醇 酸，優(yōu)選地分子量為30,000到70，000g/mol ，更優(yōu)選地約為 50,000g/mol?；|(zhì)材料可以是聚乙醇酸絨狀物，例如Alpha Research Switzerland GmbH所售的商標(biāo)為PGA-Soft Felt7的聚乙醇酸。在這種產(chǎn) 品中，體內(nèi)的再吸收時(shí)間約為40到60天。在體外7天之后，由于水解 的原因，機(jī)械強(qiáng)度仍約為初始值的50%。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，無(wú)細(xì)胞移植物除了基質(zhì)外還包含凝 膠。凝膠被施加于基質(zhì)的至少一側(cè)或者至少部分滲透基質(zhì)。優(yōu)選地凝膠 完全滲透基質(zhì)。如果基質(zhì)含有這種凝膠，基質(zhì)本身優(yōu)選地具有不同于凝 膠的結(jié)構(gòu)。更特別優(yōu)選地，除了凝膠以外，還使用上面明確指定的更硬 的結(jié)構(gòu)。因此，凝膠優(yōu)選地具有比基質(zhì)更低的硬度。最優(yōu)選地使用其中 引入了凝膠的絨狀結(jié)構(gòu)和氈狀結(jié)構(gòu)。
凝膠可以是天然的或合成的水凝膠。其優(yōu)選地具有比基質(zhì)更低的硬 度。例如，凝膠可以選自多糖、多肽、透明質(zhì)酸、纖維蛋白、膠原、藻 酸鹽、瓊脂糖和殼聚糖、以及它們的鹽、衍生物和混合物。合適的鹽例 如是所述凝膠的堿金屬鹽和堿土金屬鹽。最優(yōu)選的是透明質(zhì)酸或透明質(zhì) 酸鹽例如透明質(zhì)酸鈉。
就透明質(zhì)酸品種而言，可以使用經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的品種?；蛘?，可以使 用從動(dòng)物中獲得的透明質(zhì)酸。所用品種的平均分子量一般是在250和
6，000kDa之間，優(yōu)選地是在1,000到2，000kDa之間，最優(yōu)選地是大約 1，200kDa。可以商品化獲得合適的透明質(zhì)酸產(chǎn)品。合適的透明質(zhì)酸品種 例如是以商標(biāo)Ostenil⑧出售的TRB Chemedika AG。該材料是經(jīng)EC認(rèn)證 的，因此適用于藥用目的。
可以自多種來(lái)源，通過(guò)在合適的凝膠形成物的生理學(xué)合適的溶液中 沉淀或聚合作用而獲得凝膠。這種合適的溶液的實(shí)例是水例如水性鹽溶 液(例如堿金屬和堿土金屬鹵化物(Cl、 Br、 I)、碳酸鹽、磷酸鹽、檸 檬酸鹽、醋酸鹽等)、有機(jī)酸、緩沖劑及其混合物。或者，可以使用更 為復(fù)雜的溶液，例如培養(yǎng)基或體液或源自體液的溶液例如滑液或血清。 選擇所用的凝膠形成物的量，以便獲得合適的凝膠粘度。對(duì)于透明質(zhì)酸 而言，它們通常是在0.5-50mg/ml范圍內(nèi)，優(yōu)選地是0.5-20mg/ml，最優(yōu) 選地是10mg/ml。
最優(yōu)選的移植物是具有由PGA絨狀物或氈狀物制成的基質(zhì)且其中 摻入有透明質(zhì)酸凝膠的移植物。
本發(fā)明提出的無(wú)細(xì)胞移植物的大小一般取決于所治療的缺損的尺寸 和移植物的必需尺寸。其大小可以適合于實(shí)施治療的醫(yī)生的需要。對(duì)于 軟骨組織的病變，特別是膝關(guān)節(jié)的病變，這些尺寸一般是長(zhǎng)度范圍為10 到50mm，寬度范圍為10'到50mm以及厚度范圍為0.5到3mm，優(yōu)選地 是長(zhǎng)度范圍為10到30mm，寬度范圍為10到30mm以及厚度范圍為U 到2mm。尺寸可以適合于非正方形的形狀例如矩形、圓形、橢圓形、多 面體形等。
本發(fā)明提出的無(wú)細(xì)胞移植物中的基質(zhì)和凝膠的組合的優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)于 除滲透過(guò)Pridie穿刺處或相似破損的血液的非間充質(zhì)前體細(xì)胞以外的其 他細(xì)胞而言，凝膠形成了機(jī)械屏障。這使得間充質(zhì)前體細(xì)胞選擇性地遷 移到移植物內(nèi)。只有這些細(xì)胞才能存在于基質(zhì)內(nèi)，并分化成所需的組織 細(xì)胞。因此阻止或顯著減少了除所需的組織形成細(xì)胞以外的其他細(xì)胞的 生長(zhǎng)。
同時(shí)，在機(jī)械應(yīng)激下，凝膠促進(jìn)了所需細(xì)胞的停留，然后在后者周 圍形成軟骨的天然的生物基質(zhì)。這樣一旦患者已經(jīng)接受移植物，便能夠 更早地解除應(yīng)激。
本發(fā)明提出的無(wú)細(xì)胞移植物所必需的第二個(gè)成分是血清，通常是人 體血清。這可以是自體的、同種異體的或異種的。用于本發(fā)明的血清是 指在血液已經(jīng)凝血后仍保持為液態(tài)的血液部分。血清不含任何血細(xì)胞， 與血漿不同的是其不不含纖維蛋白原。在血清中也能找到血漿的其他成 分，它們是脂肪、脂肪酸、甘油、糖、鹽、蛋白、酶、酶原、酶抑制 物、補(bǔ)體系統(tǒng)、免疫蛋白、炎癥介質(zhì)等。
通過(guò)加入至少一種成分和/或去除至少一種血清組分都可以修飾本發(fā) 明所用的血清。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，血清沒(méi)有被修飾。更特別優(yōu) 選的是自體血清。通過(guò)從患者體內(nèi)取血以及用傳統(tǒng)方法獲得血清就可以 實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。任選地實(shí)施治療的醫(yī)生可以將通過(guò)這種方式獲得的血清直 接放置在移植物的位置上，與基質(zhì)和凝膠(如果提供)接觸，并因此摻 入到移植物內(nèi)。
或者，使用修飾血清。如果修飾包括添加至少一種成分，后者優(yōu)選
地選自包括生長(zhǎng)因子、分化因子(對(duì)于這種情況，見(jiàn)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)DE199 57 388，在此通過(guò)引用將其并入本申請(qǐng))、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附 分子、趨化因子類(lèi)包括趨化因子例如在專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)WO 2005/014027中 所述的趨化因子(在此通過(guò)引用的方式將其并入本申請(qǐng))、酶、酶抑制 物、輔酶、礦物質(zhì)、脂質(zhì)、糖、藥用物質(zhì)例如抗生素、鎮(zhèn)痛藥、炎癥抑 制劑和免疫抑制劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑(特別是低溫穩(wěn)定劑)和維生素的 組，優(yōu)選地是激素、趨化因子、生長(zhǎng)因子和分化因子。激素、趨化因 子、生長(zhǎng)和分化因子優(yōu)選地選自胰島素、PDGF、 IGF、 GMCSF、 GDF5、 GDF6、 FGF、 BMP2、 BMP4、 BMP7、 IL8、 SDFl-a禾Q EGF。 最優(yōu)選地是胰島素。通過(guò)摻入上面所列的組分或其混合物也可以修飾基 質(zhì)和/或凝膠。
或者，例如通過(guò)親和層析的方式可以選擇性地去除特殊組分例如 酶、免疫蛋白、酶原、糖等。也可以稀釋血清。至此，血清可以與所需
量的生理學(xué)可接受液體例如檸檬酸緩沖液、PBS等混合。
通過(guò)所述方法可以產(chǎn)生上面所需的無(wú)細(xì)胞移植物，其中將基質(zhì)和凝 膠(如果提供)與血清接觸。通過(guò)點(diǎn)滴、軟化、浸滲或浸泡而施加可以 實(shí)現(xiàn)所述接觸。如果提供了凝膠，優(yōu)選地首先將其摻入到基質(zhì)內(nèi)和/或施 加于基質(zhì)，之后進(jìn)行與血清接觸的過(guò)程。如果無(wú)細(xì)胞移植物包含例如上 面所列的其他組分，它們可以被摻入到基質(zhì)、凝膠和血清中的其中一種
或多種內(nèi)。
本發(fā)明提出的方法可以包括干燥步驟。實(shí)施干燥步驟的優(yōu)點(diǎn)是移植 物可以以干燥的形式保存得更長(zhǎng)。如果基質(zhì)和凝膠(如果提供)在與血 清接觸之前被干燥，當(dāng)該結(jié)構(gòu)與血清接觸時(shí)，其通過(guò)浸泡或軟化可以被 重建，據(jù)此將其轉(zhuǎn)變成待用狀態(tài)?；蛘撸绻ɑ|(zhì)、凝膠(如果提 供)和血清的結(jié)構(gòu)被干燥，其通過(guò)浸泡或軟化于血清或一些其他合適的 藥用和生理學(xué)可已接受的溶液(例如在形成凝膠部分中所述的溶液)可 以被重建，并因此轉(zhuǎn)化成待用狀態(tài)。如果本發(fā)明提出的移植物包含其他 組分，這些組分也可以被摻入到用于重建無(wú)細(xì)胞移植物為待用狀態(tài)的溶 液中。如果其他組分是蛋白或不穩(wěn)定的輔助因子時(shí)，這可能是特別令人 需要的。 '
在由上面所述的聚乙醇酸絨狀物和透明質(zhì)酸凝膠制成的無(wú)細(xì)胞移植
物的優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用20mmx20mmx Umm大小的絨狀物和被 摻入到生理學(xué)合適的溶液中的材料中或者已經(jīng)被摻入到血清中的約 400^1透明質(zhì)酸溶液(10mg/ml)。在絨狀物為20mm x 20mm x 2mm大 小時(shí)，使用約73(^1透明質(zhì)酸溶液。如果通過(guò)低壓凍干法干燥這些大小 的移植物，它們通過(guò)浸泡于1到2ml溶液中可以被重建。對(duì)于沒(méi)有血清 的干燥基質(zhì)，優(yōu)選地用血清或稀釋血清重建所述基質(zhì)，而含有血清的干 燥基質(zhì)則優(yōu)選地在生理鹽水中重建。
合適的血清濃度是基質(zhì)中所含凝膠和液體的體積的1到100% (體 積)。優(yōu)選地，對(duì)于沒(méi)有凝膠的基質(zhì)，可以使用10到100%，優(yōu)選地是 50到100%，以及最優(yōu)選地是100%液體體積的血清濃度，血清通過(guò)毛細(xì) 管力等摻入于其中。為了將血清濃度降低到100%以下，可以使用經(jīng)生 理學(xué)可接受的鹽溶液稀釋的血清。
對(duì)于具有凝膠的基質(zhì)，根據(jù)凝膠、血清和任選的藥用可接受液體的 總體積，可以使用0.01到50% (體積)或更高的血清含量，優(yōu)選地0.5 到20% (體積)和最優(yōu)選地1到10% (體積)的血清。
本發(fā)明提出的無(wú)細(xì)胞移植物可用于再生組織，特別是用于再生軟骨 和/或骨。其優(yōu)選地被用于再生間充質(zhì)組織。最優(yōu)選地，其被用于再生軟 骨和/或骨，特別是用Pridie穿刺法或微破損法。移植物作為智能覆蓋 層，其在Pridie穿刺或微破損后被精確吻合地引入到軟骨內(nèi)，以便重塑 關(guān)節(jié)表面?；|(zhì)材料(優(yōu)選地是氈狀材料)提供機(jī)械穩(wěn)定性并起到傳導(dǎo) 結(jié)構(gòu)的作用，其促進(jìn)了從骨髓和松質(zhì)骨(spongicms bone)中遷移過(guò)來(lái)的 患者細(xì)胞的均勻的、三維的分布。凝膠例如透明質(zhì)酸作用為屏障，以便 阻止紅細(xì)胞和白細(xì)胞向內(nèi)遷移。血清(優(yōu)選地是自體血清)促進(jìn)了細(xì)胞 (特別是間充質(zhì)前體細(xì)胞)遷移到移植物內(nèi)，并因此遷移到缺損處。透 明質(zhì)酸、血清和關(guān)節(jié)所含的滑液誘導(dǎo)已經(jīng)遷移到移植物內(nèi)的間充質(zhì)前體 細(xì)胞的成熟或分化，以形成軟骨細(xì)胞并因此建立軟骨的再生組織。令人 驚訝的是，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用血清會(huì)顯著地增加募集數(shù)目。
下面給出的實(shí)施例只打算舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何 形式對(duì)發(fā)明加以限制。
實(shí)施例1:通過(guò)生長(zhǎng)和分化因子、趨化因子和人血清在體外募集人間充 質(zhì)干細(xì)胞
A.人間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
己經(jīng)描述了從骨髓中分離出人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的方法(DE
103 33 901)。將最大3ml骨髓穿刺液與10ml PBS混合，并在室溫、 310g下離心IO分鐘。重懸細(xì)胞沉淀并再次用PBS洗滌。將細(xì)胞放置于 20ml DME培養(yǎng)基(10-20% FBS 、 2%HEPES 、 4mM L-谷氨酰胺、 100U/ml青霉素、100 pg/ml鏈霉素)內(nèi)。將5ml這種細(xì)胞懸浮液引入到 20ml Perco密度梯度(密度為1.073g/ml)之上。將細(xì)胞在900g下離心 32分鐘。將上層轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)。在加入2.5倍體積PBS之后，將 其在310g下離心6分鐘。將細(xì)胞沉淀放置于DME培養(yǎng)基內(nèi)。將 1.5*105-3.5*105個(gè)細(xì)胞/^112轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，并在37°C、 5% CCb下進(jìn)行培養(yǎng)。在72個(gè)小時(shí)后首次更換培養(yǎng)基，然后每3至lj 4天 更換1次。按此方式分離的細(xì)胞在2到3周后融合生長(zhǎng)，然后通過(guò)胰蛋 白酶消化的方式將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)管內(nèi)，細(xì)胞密度為6，000個(gè)細(xì)胞 /cn^培養(yǎng)表面(傳代1).。在約1周后，再次用胰蛋白酶消化細(xì)胞(傳 代2)。用FACS分析驗(yàn)證這種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的均質(zhì)性，其中鑒 定到表面抗原Endoglin禾B ALCAM，沒(méi)有鑒定到CD34、 CD45和 CD14。
B.測(cè)試生長(zhǎng)和分化因子(CDMP1、 CDMP2)和趨化因子(SDF1-a、 IL8)在體外對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化活性
已經(jīng)描述了生長(zhǎng)和分化因子例如軟骨衍生型形態(tài)形成蛋白-1 (CDMP1或生長(zhǎng)和分化因子-5， GDF5)和軟骨衍生型形態(tài)形成蛋白-2 (CDMP2或生長(zhǎng)和分化因子-6， GDF6)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞和前體細(xì)胞的 趨化作用(DE 199 57 388)。也已經(jīng)描述了趨化因子例如基質(zhì)衍生因 子-la (Stromal derived Factor-la， SDFl-a)或白介素畫(huà)8 (IL8)用于募 集間充質(zhì)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的趨化作用或用途(DE 103 33 901)。
用所謂的96孔趨化板(ChemoTx system, Neuroprobe， USA)測(cè)試趨 化活性。測(cè)試原理依據(jù)于將給定數(shù)量和濃度的所測(cè)定的物質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到 孔內(nèi)。然后用帶有孔隙的膜(孔徑在此為8pm)覆蓋孔，使得膜的下表 面被含有趨化溶液的溶液所濕化。
將給定量的不含所測(cè)試物質(zhì)的細(xì)胞懸浮液放置于遠(yuǎn)離孔的膜的上表 面上。在數(shù)小時(shí)后，自下方的孔至膜產(chǎn)生了所測(cè)試物質(zhì)的濃度梯度。如 果所測(cè)試的物質(zhì)是有趨化活性的，細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞會(huì)遷移經(jīng)過(guò)膜的 孔隙，到達(dá)膜的下表面并到達(dá)下方的孔中。對(duì)所遷移的細(xì)胞進(jìn)行染色， 并借助于顯微鏡測(cè)定出其數(shù)目。
為了控制的目的，給下方的孔提供所測(cè)試物質(zhì)的溶劑，用膜覆蓋并
用細(xì)胞懸浮液覆蓋。通過(guò)用顯微鏡計(jì)數(shù)膜的下表面(面積為25mm2)和 下方的孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目，測(cè)定出在沒(méi)有刺激物時(shí)由于趨化物質(zhì)而發(fā)生自 發(fā)遷移的細(xì)胞。為了測(cè)定出趨化物質(zhì)所募集的細(xì)胞數(shù)目，要減去自發(fā)遷 移的細(xì)胞數(shù)目。
在開(kāi)始測(cè)試上面所提及的生長(zhǎng)和分化因子及趨化因子之前，將來(lái)自 骨髓的人間充質(zhì)干細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(DME培養(yǎng)基+1%青霉素/鏈霉素 +0.5%牛血清白蛋白(BSA))中放置24個(gè)小時(shí)。將不同量的生長(zhǎng)和分 化因子及趨化因子放置于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，以獲得濃度分別為250 nM、 500 nM、 750 nM和1000 nM因子的指定溶液。將3份36^1相應(yīng)溶液放 置于96孔趨化板的孔內(nèi)，用膜覆蓋，使得膜的下表面被溶液濕化。營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基用作對(duì)照。
將4(^1含30,000個(gè)人間充質(zhì)干細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基放置于膜的上表 面。在37。C、 5% CO2的育種箱內(nèi)培育20個(gè)小時(shí)后，取出膜并將其在冰 冷的乙醇/丙酮(1:1體積/體積)中放置3分鐘，以便固定細(xì)胞。用棉簽 充分地清洗膜的上表面，以去除所粘附的細(xì)胞。用Hemacolor溶液 (Merck， Darmstadt)染色膜的下表面上的細(xì)胞。在下方的孔中沒(méi)有檢 測(cè)到細(xì)胞。
通過(guò)在顯微鏡底下的計(jì)數(shù)可以計(jì)數(shù)出沉積于膜的下表面上的細(xì)胞數(shù) 目。在減去對(duì)照組(沒(méi)有趨化因子類(lèi))中的遷移細(xì)胞數(shù)目，可以確定出 不同濃度的CDMP1、 CDMP2、 SDFl-a和IL8所募集到的干細(xì)胞的數(shù) 目。圖1給出了相應(yīng)因子所募集到的細(xì)胞數(shù)目的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
CDMP1最多能夠誘導(dǎo)每25 mm2 156個(gè)MSC (750nM CDMP1)發(fā)生遷 移，CDMP2最多募集了每25 mm2 38個(gè)MSC (500nM CDMP2)， SDFl-a最多募集了每25 mm2 79個(gè)MSC (750nM SDFl-a)和IL8最多 募集了每25mm2 814個(gè)MSC (500nMIL-8)。
C.測(cè)試人血液的血清在體外對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化活性 令人驚訝的是，通過(guò)在B中所述的測(cè)試方法測(cè)定人血清發(fā)現(xiàn)人血清 具有比生長(zhǎng)和分化因子及趨化因子更強(qiáng)的在體外對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞和前 體細(xì)胞的趨化作用。圖2給出了不同配方的人血清(營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或透明 質(zhì)酸)所募集到的人間充質(zhì)干細(xì)胞和前體細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目以及相應(yīng)的標(biāo) 準(zhǔn)差。根據(jù)配方的不同，人血清所募集到的人間充質(zhì)干細(xì)胞和前體細(xì)胞 的最低值是2,135個(gè)(PGA - HA lyo. + HS)以及最大值是10,332個(gè) (5% HS-HA-培養(yǎng)基)。對(duì)沒(méi)有人血清的透明質(zhì)酸營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基作為趨化
因子類(lèi)的測(cè)試顯示所募集到的人間充質(zhì)干細(xì)胞和前體細(xì)胞的平均值分別 是24 (HA培養(yǎng)基)和48個(gè)(PGA-Halyo.+NaCl)。
在所述的測(cè)試方法中用下面的不同配方的人血清募集人間充質(zhì)干細(xì) 胞和前體細(xì)胞。在自然凝血下，從無(wú)抗凝劑的全血樣品(n=5)中獲得 人血清，將其等量混合并用于制備不同的血清配方。為了制備測(cè)試組 "5。/。HS培養(yǎng)基"和"10。/。HS培養(yǎng)基"，用人血清置換營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，生 成5%和10°/。溶液。"HA培養(yǎng)基"測(cè)試組包括等量的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和經(jīng)發(fā) 酵獲得的平均分子量為1,200kDa的透明質(zhì)酸(Ostenil ，TRB Chemedica AG) 。 "1。/。HS-HA培養(yǎng)基"、"5。/。HS-HA培養(yǎng)基"、"5。/。HS-HA培 養(yǎng)基"和"20%HS-HA培養(yǎng)基"測(cè)試組包含其中加入了人血清的"HA 培養(yǎng)基"，生成了 1%、 5%和10%濃度的溶液。
為了獲得"PGA - 10% Hs-HA, lyo."測(cè)試組，將27(^1經(jīng)發(fā)酵獲得 的透明質(zhì)酸(Ostenil , TRB Chemedica AG)與30|il人血清混合，并將 其施加于包括聚乙醇酸(PGA)的20mmxl5mmxl.lmm大小的絨狀 物(PGA-Soft Felt , Alpha Research Switzerland GmbH)。將經(jīng)透明質(zhì)
酸-血清混合物浸泡過(guò)的絨狀物在-20。C冷凍1個(gè)小時(shí)，然后在冷凍干燥 器中冷凍干燥16個(gè)小時(shí)。為了重建所述溶液，將冷凍干燥的絨狀物在 lml生理鹽水中放置10分鐘，以便通過(guò)在2,000rpm離心10分鐘的方式 獲得近80到lOOpil透明質(zhì)酸-血清溶液。通過(guò)用等量營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基稀釋溶 液，制備配方"PGA - 10% HS-HA， lyo."并將其直接用于測(cè)試趨化活 性。
為了制備"PGA-Ha， lyo. + HS"，將300pl經(jīng)發(fā)酵獲得的透明質(zhì)酸 (Osten胸，TRB Chemedica AG)施加于包括聚乙醇酸(PGA)的20 mm x 15 mm x 1.1 mm大小的絨狀物(PGA-Soft Felt , Alpha Research Switzerland GmbH)。將經(jīng)透明質(zhì)酸浸泡過(guò)的絨狀物在-20。C冷凍1個(gè)小 時(shí)，然后在冷凍干燥器中冷凍干燥16個(gè)小時(shí)。為了重建所述溶液，將 冷凍干燥的絨狀物在lml人血清中放置10分鐘，以便通過(guò)在2,000rpm 離心10分鐘的方式獲得近80到lOO[il透明質(zhì)酸-血清溶液。通過(guò)用等量 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基稀釋溶液，制備配方"PGA - HA， lyo.+ HS"并將其直接用 于測(cè)試趨化活性。
為了制備"PGA-Ha, lyo. + NaCl"測(cè)試組，將300^1經(jīng)發(fā)酵獲得的 透明質(zhì)酸(Ostenil , TRB Chemedica AG)施加于包括聚乙醇酸 (PGA)的20 mm x 15 mm x 1.1 mm大小的絨狀物(PGA-Soft Felt , Alpha Research Switzerland GmbH)。將經(jīng)透明質(zhì)酸浸泡過(guò)的絨狀物在-20。C冷凍1個(gè)小時(shí)，然后在冷凍干燥器中冷凍干燥16個(gè)小時(shí)。為了重 建所述溶液，將冷凍干燥的絨狀物在lml生理鹽水中放置10分鐘，以 便通過(guò)在2,000rpm離心10分鐘的方式獲得近80至lj lOO(al透明質(zhì)酸溶 液。通過(guò)用等量營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基稀釋溶液，制備配方"PGA - HA, lyo.+ NaCl"并將其直接用于測(cè)試趨化活性。
實(shí)施方式2的實(shí)施例
將Alpha Research Switzerland GmbH所售的商標(biāo)為PDA-Soft Felt
的商品化可獲得的聚乙醇酸絨狀物切割成20 mm x 15 mm x 1.1 mm大 小。如實(shí)施例l所述的那樣，用含有10%血清的透明質(zhì)酸混合物浸漬材 料，然后干燥。最初在-20。C進(jìn)行干燥，然后在冷凍干燥器中干燥16個(gè) 小時(shí)。通過(guò)用1至lj2ml生理鹽水浸泡IO分鐘可以重建絨狀物。
在另一個(gè)測(cè)試組中，用10mg/ml溶解于生理鹽水的純透明質(zhì)酸浸漬 絨狀物。如上所述干燥經(jīng)這種方式制備出的材料。通過(guò)將其在1到2ml 血清中浸泡IO分鐘重建所述材料。兩種絨狀物都可以直接用于移植。
權(quán)利要求
1.無(wú)細(xì)胞移植物，包括(i)由生物學(xué)和藥用可接受材料制成的具有開(kāi)放多孔性的粘合性、結(jié)構(gòu)形成性基質(zhì)和(ii)血清。
2. 權(quán)利要求1的無(wú)細(xì)胞移植物，其中基質(zhì)材料是可再吸收的或不 可再吸收的。
3. 權(quán)利要求1或2的無(wú)細(xì)胞移植物，其中基質(zhì)具有的結(jié)構(gòu)選自交 織型或非交織型織物(特別是絨狀結(jié)構(gòu)和氈狀結(jié)構(gòu))、膜、海綿、填充 物、開(kāi)孔泡沫、羊毛、編織物、有序的和無(wú)序的纖維束、多孔陶瓷材 料、松質(zhì)和凝膠、以及這些結(jié)構(gòu)的組合。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物，其中基質(zhì)是選自如下 一組中的材料天然和合成聚合物例如膠原、透明質(zhì)酸、殼聚糖、殼多 糖、多糖、纖維素及其衍生物、蛋白、多肽、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交 酯乳酸酯共聚物、己內(nèi)酰胺；陶瓷材料例如金屬的氧化物、碳化物、氮 化物和碳氮化物，特別是氧化硅、氧化鈦和氧化鈣；礦物質(zhì)例如金屬的 鹵化物特別是金屬的氟化物、金屬的氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽、磷酸 ,丐、Appatite、 Hydroxyl appatite;金屬例如鈦、鋁、金、銀、不銹鋼及 其混合物。
5. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物，其額外地包含凝膠， 所述凝膠被施加于基質(zhì)的一側(cè)和/或至少部分滲透基質(zhì)。
6. 權(quán)利要求5的無(wú)細(xì)胞移植物，其中凝膠是天然的或合成的水凝膠。
7. 權(quán)利要求5或6的無(wú)細(xì)胞移植物，其中凝膠具有比基質(zhì)更低的 硬度。
8. 權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物，其中凝膠選自多 糖、多肽、透明質(zhì)酸、纖維蛋白、膠原、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、及 其混合物，且優(yōu)選地是透明質(zhì)酸。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物，其中血清是自體的、 同種異體的或異種的，且任選地通過(guò)添加至少一種成分和/或去除至少一 種血清組分而修飾。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物，額外地含有一種或多 種成分，所述成分選自包括生長(zhǎng)因子、分化因子、激素、趨化因子、細(xì) 胞因子、細(xì)胞粘附分子、趨化因子類(lèi)、酶、酶抑制物、輔酶、礦物質(zhì)、 脂肪、脂質(zhì)、糖、藥用物質(zhì)例如抗生素、鎮(zhèn)痛藥、炎癥抑制物和免疫抑 制劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑特別是低溫穩(wěn)定劑、和維生素的組，所述組分優(yōu) 選地選自激素、生長(zhǎng)因子和分化因子。
11. 權(quán)利要求10的無(wú)細(xì)胞移植物，其中激素、生長(zhǎng)和分化因子是胰 島素、PDGF、 IGF、 GMCSF、 GDF5、 GDF6、 FGF、 BMP2、 BMP4、 BMP7、 IL8、 SDF1-a禾PEGF、及其組合。
12. 制備前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物的方法，其中將基 質(zhì)和凝膠(如果提供)與血清接觸。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)施加點(diǎn)滴、軟化、浸漬或浸泡實(shí) 現(xiàn)所述接觸。
14. 權(quán)利要求12或13的方法，其中凝膠首先被摻入于基質(zhì)和/或施 加于基質(zhì)，然后與血清接觸。
15. 權(quán)利要求12到14中任一項(xiàng)的方法，其中在接觸之前或之后干 燥凝膠(如果提供)和基質(zhì)以及其他任選組分的組合物。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中從干燥狀態(tài)中重建移植物。
17. 權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的無(wú)細(xì)胞移植物用于再生組織的用途。
18. 權(quán)利要求17的用途，其中所述用途是用于再生間充質(zhì)組織，特 別是用于再生軟骨和/或骨。
全文摘要
本發(fā)明涉及無(wú)細(xì)胞移植物，包括(i)由生物學(xué)和藥用可接受材料制成的具有開(kāi)放多孔性的粘合性、結(jié)構(gòu)形成性基質(zhì)和(ii)血清。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，基質(zhì)額外地包含凝膠。本發(fā)明還涉及制備這種無(wú)細(xì)胞移植物的方法，其中將基質(zhì)和凝膠(如果提供)與血清接觸。移植物可以任選地與血清一起干燥。或者，基質(zhì)和凝膠(如果提供)與血清接觸之前是干燥狀態(tài)。最后，本發(fā)明還涉及無(wú)細(xì)胞移植物用于再生組織且特別是用于再生軟骨和/或骨的用途。
文檔編號(hào)A61F2/08GK101184450SQ200680018571
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日
發(fā)明者C·卡普斯, E·坦措斯, M·西廷格爾 申請(qǐng)人:特蘭斯逖修科技有限責(zé)任公司