專利名稱：用于誘導免疫的脂質(zhì)體組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及應用被覆低聚糖的脂質(zhì)體的、用于誘導免疫的脂質(zhì)體組
合物。更具體地說，本發(fā)明涉及的被覆低聚糖的脂質(zhì)體的特征在于在 腹腔內(nèi)施用時被腹腔內(nèi)的巨噬細胞攝取，抗原肽呈遞在MHC I類分子和 II類分子上。
背景技術：
在癌癥死亡人數(shù)中，胃癌死亡人數(shù)僅次于肺癌，其主要原因是向腹 腔內(nèi)各器官播散性轉(zhuǎn)移。因此，為了克服該問題，必須開發(fā)可以控制腹 膜轉(zhuǎn)移及其發(fā)展的免疫療法。
通過免疫系統(tǒng)來排斥癌的主要效應細胞是細胞毒性T淋巴細胞 (cytotoxic T lymphocytes: CTL)，為了發(fā)揮其功能，輔助T細胞(Th)的輔 助發(fā)揮了很大的作用。因此，同時活化兩種細胞群對于誘發(fā)有效的免疫 反應是必須的，使用輔助細胞(Th)表位和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表 位兩者作為抗原的癌癥的免疫療法正在進行深入研究。
如上所述，為了獲得效率好的免疫反應，必須同時活化輔助T細胞 (Th)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL),為此，最理想的是用含有Th表位 (MHCII類)和CTL表位(MHCI類)兩者的抗原進行免疫。但是，已知如 果只是用蛋白質(zhì)直接免疫，則CTL難以,皮有效活化。通常已知內(nèi)源性抗 原呈遞在MHCI類上，外源性抗原呈遞在MHCII類上。但是，被象巨 噬細胞這樣的抗原呈遞細胞攝取的外源性抗原容易通過MHC II類呈 遞。即，在單獨接種抗原作為疫苗進行免疫時，與通過MHCI類分子的 抗原呈遞有關的CTL難以有效活化。
通過免疫系統(tǒng)來排斥癌癥的主要效應細胞是CTL,因此，人們進行 了使外源性抗原在I類分子上呈遞的嘗試。作為免疫療法，采取了(l)從 患者采集抗原呈遞細胞并培養(yǎng)，添加抗原肽，再返回到患者體內(nèi)的方 法；或者(2)向抗原呈遞細胞中導入抗原基因等方法。上述方法在技術、 倫理、成本等方面均存在很多問題，還必須要進行免疫所適合的癌癥抗 原的鑒定。并且，在上述(l)的方法為了同時活化多個Th/CTL,必須鑒
定Th/CTL的兩個表位。
結合多糖的脂質(zhì)體中，已知(普魯蘭和甘露聚糖)可被巨噬細胞攝 取，并且顯示在MHCI類分子上呈遞。免疫療法中嘗試了將抗原結合在 這些多糖上進行施用的方法。但是，這些多糖結構存在抗原性或毒性， 對人4吏用未必安全。并且還未見可在MHC II類分子上呈遞的證明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以解決上述以往技術的問題作為要解決的課題。即，本發(fā) 明要解決的課題是提供可以使抗原物質(zhì)在作為抗原呈遞細胞的MHC I 類分子和II類分子上有效呈遞的脂質(zhì)體組合物。
本發(fā)明人為解決上述課題進行了深入的研究，結果發(fā)現(xiàn)通過將抗 原包封于被覆有低聚甘露糖的脂質(zhì)體(MCL)來施用，可以將抗原送達至 巨噬細胞。這是巨噬細胞經(jīng)所表達的甘露糖受體介導的反應，因此巨噬 細胞特異性、且主動地攝取施用到腹腔內(nèi)的脂質(zhì)體并活化。繼而引發(fā)的 免疫反應中，在自身的MHC I類和II類分子上呈遞包封的抗原，并游 走至胃網(wǎng)膜與腸系膜的結外淋巴組織中，活化細胞性免疫。此時，巨噬 細胞中，可在自身的MHC I類和II類兩種分子上呈遞來自包封抗原的 肽，并游走至區(qū)域淋巴結中。在使用小鼠進行實驗中，攝取了腹腔內(nèi)施 用的MCL的巨噬細胞活化，并到達區(qū)域淋巴組織中，同時，在MHCI 類分子和MHC II類分子兩者上呈遞來自包封抗原的肽，活化Th和CTL 兩種細胞群，可以生成IFN-y。本發(fā)明4艮據(jù)上述i人識完成。
即，本發(fā)明可提供含有被覆低聚糖的脂質(zhì)體和抗原物質(zhì)、在抗原呈 遞細胞的MHC I類分子和II類分子上呈遞抗原肽的脂質(zhì)體組合物。
優(yōu)選低聚糖為低聚甘露糖。
優(yōu)選低聚糖為甘露五糖或甘露三糖。
優(yōu)選抗原物質(zhì)為癌抗原。
優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物腹腔內(nèi)、皮下或鼻腔粘膜內(nèi)施用，被巨 噬細胞等抗原呈遞細胞攝取，抗原肽在MHC I類分子和II類分子上呈遞。
優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物用于誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。 實施發(fā)明的最佳方式
以下，對本發(fā)明的實施方案進行具體說明。
本發(fā)明人使用卵清蛋白(OVA)作為模型抗原，在將外源性抗原蛋白 質(zhì)包封入被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體(MCL)中并施用時，明確了抗原不僅 在MHCII類上、也可在MHCI類上呈遞。卯清蛋白(OVA)或OVA肽包 封于被覆甘露糖的脂質(zhì)體中，直接施用腹腔，則可順暢地被巨噬細胞攝 取。之后，從腹腔內(nèi)回收巨噬細胞，培養(yǎng)24小時，與來自小鼠OT-I的 脾CD8陽性T淋巴細胞混合培養(yǎng)，從將OVA溶解于PBS并注入腹腔的 小鼠體內(nèi)回收時，幾乎未見IFN-y的生成，但是在包封于被覆低聚甘露 糖的脂質(zhì)體中時，則可見IFN-y的生成，其中，所述小鼠中導入了在I 類分子上呈遞的OVA肽特異性T細胞受體基因(Tg)。該結果明確了 包封入MCL中的OVA被巨噬細胞攝取后，OVA肽在MHC I類分子上 呈遞。另一方面，如果直接施用OVA,也同樣被巨噬細胞攝取，但未見 IFN-y的生成，因此，可以認為并未在MHCI類分子上呈遞。由此證實 通過將抗原蛋白質(zhì)或抗原肽包封入MCL中并施用，可以在抗原呈遞細 胞MHC I類分子上有效地呈遞抗原。
另一方面，與來自小鼠OT-2的脾CD4陽性T淋巴細胞混合培養(yǎng)， 該小鼠中導入了在MHC II類分子上呈遞的OVA肽特性異T細胞受體基 因(Tg),則誘導生成在MHC II類分子上呈遞的OVA肽特異性IFN-y, 包封于被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體中時、直接接種時均顯示可效率良好地 呈遞。
將包封了小鼠EL4淋巴瘤可溶性蛋白的MCL皮下施用于同系小鼠 時，觀察到在直接施用可溶解物時幾乎沒有見過的、對EL4的強烈的 CTL活性，即，這顯示皮下施用時也尋皮抗原呈遞細胞攝取，抗原肽在 MHCI類分子上有效呈遞。并且，該結果顯示即使抗原蛋白未知或者 未純化，通過將癌細胞的提取液包封于被覆甘露糖的脂質(zhì)體中進行施 用，也可以在MHC I類分子上呈遞例如可誘導CTL的肽，由此顯示可 有效地作為獲得癌癥疫苗效果的手段。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以作為藥物遞送系統(tǒng)使用。這里，藥物遞 送系統(tǒng)是指藥劑送達系統(tǒng)。通常，施用藥時，藥物在全身擴散，該系統(tǒng) 是指防止擴散并將藥物有效地送達目標組織或細胞的技術。藥物遞送系 統(tǒng)可以降低副作用，提高藥效。
本發(fā)明中所述的脂質(zhì)體是指由磷脂構成的雙層膜的人工小泡。膜的
內(nèi)側分布親水性部分，外側分布疏水性部分。內(nèi)腔可包封親水性的化合 物，可用作抗癌藥等的藥物遞送系統(tǒng)。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的特征在于含有被覆低聚糖的脂質(zhì)體和抗 原物質(zhì)，用于使來自抗原物質(zhì)的抗原肽在抗原呈遞細胞的MHC I類分子 和II類分子上呈遞。更具體地說，本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物于腹腔內(nèi)施用 時，被腹腔內(nèi)巨噬細胞等抗原呈遞細胞攝取，抗原肽在MHCI類分子和 II類分子上呈遞。
巨噬細胞是具有吞噬作用的細胞，識別體內(nèi)不存在的外來物質(zhì)、或 者已經(jīng)不能認為是構成生物體的細胞的死亡細胞(編程性細胞死亡)、癌 細胞等并將其攝取、消化。被消化的蛋白質(zhì)、特別是作為免疫系統(tǒng)攻擊 對象的標志肽片段在細胞表面呈遞，發(fā)揮向免疫網(wǎng)絡通知攻擊對象的司 令塔的作用。
本發(fā)明中使用的被覆低聚糖的脂質(zhì)體例如可使用日本專利第 2828391號公報所述的脂質(zhì)體。構成低聚糖的糖成分的種類沒有特別限 定，例如有D-甘露糖(D-Man)、 L-巖藻糖(L-Fuc)、 D-乙酰葡糖胺(D-GlcNAc)、 D-葡萄糖(D畫Glc)、 D-半乳糖(D-Gal)、 D漏乙酰半乳糖胺(D畫 GalNAc)、 D-鼠李糖(D-Rha)等。
j氐聚糖中，各構成糖可以通過a1—2 4建、al—3 4建、a1—4 4定、a1—6 鍵或(31—4鍵等或它們的組合結合。例如，甘露糖可以通過上述鍵構成 單鏈，或者通過al—3鍵與al—6鍵的組合構成分支結構。低聚糖中的 單糖數(shù)目優(yōu)選為2-11個。具體的低聚糖例如有甘露二糖(Man2)、甘露三 糖(Man3)、甘露四糖(Man4)、甘露五糖(Man5)、甘露六糖(Man6)、甘露 七糖(Man7)、各種混合低聚糖、例如下式M5 (化l)和RN(化2)等。
<formula>formula see original document page 6</formula>[化2]<formula>formula see original document page 7</formula>
(式中，al—2鍵合得到的Man各自獨立，可以存在也可以不存在)。
含有葡萄糖的低聚糖可以是具有[化3]表示的結構的低聚糖，也可 以是化4所示的、含有N-乙酰葡糖胺的低聚糖形式，還可以是化5所示 的、含有巖藻糖的低聚糖形式。
<formula>formula see original document page 7</formula><formula>complex formula see original document page 8</formula>(p為0或1, n各自獨立，為0-3,式中右側的4GlcNAc卩1—4GlcNAc 表示的兩個GlcANc殘基可以各自獨立也可以不獨立，由(GlcNAc(31—)n 表示的GlcNAc均與右側相鄰的Man的空羥基某一位置形成配糖體)。
<formula>complex formula see original document page 8</formula>
(p為0或1, n各自獨立，為0-3, (GlcNAc卩1—)n表示的GlcNAc 均與右側相鄰的Man的空羥基某一位置形成配糖體)。
<formula>complex formula see original document page 8</formula>
(k為l-5， p各自獨立，為O或l,箭頭的先端沒有編號的可以與《
羥基的某一位置形成配糖體)。
<formula>formula see original document page 9</formula>(p各自獨立，為O或l, n各自獨立，為0-3,箭頭的先端沒有編號 的可以與空羥基的某 一 位置形成配糖體，式中右側的以 4GlcNAc卩1—4GlcNAc表示的兩個GlcNAc殘基可以分別獨立或不獨立)。
<formula>formula see original document page 9</formula>
(p各自獨立，為O或l, n各自獨立，為0-3，箭頭的先端沒有編號 的可以與空羥基的某 一 位置形成配糖體，式中右側的以 4GlcNAc卩1—4GlcNAc表示的兩個GlcNAc殘基可以分別獨立或不獨
本發(fā)明中使用的低聚糖優(yōu)選低聚甘露糖，特別優(yōu)選甘露五糖或甘露三糖。
上述低聚糖均具有一個還原末端醛基。從而可以將該醛基作為將低 聚糖導入到脂質(zhì)體表面的手段使用。即，通過該醛基與具有氨基的脂質(zhì) 之間的反應形成席夫堿，接著將該席夫堿按照常規(guī)方法進行還原、優(yōu)選
化學還原，例如通過NaBH3CN進行還原，可以使低聚糖與脂質(zhì)結合(水
落次男、糖質(zhì)工學、224-232頁、產(chǎn)業(yè)調(diào)查會生物學信息中心、1992)。
上述的具有氨基的脂質(zhì)優(yōu)選為具有氨基的磷脂，例如可使用磷脂酰 胺、例如二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE) 等。上述得到的低聚糖與脂質(zhì)的結合物在本發(fā)明中可以稱為人工糖脂。
構成脂質(zhì)體的脂質(zhì)可以將已知的構成脂質(zhì)體的任意常用脂質(zhì)單獨 或多種組合使用。例如，天然產(chǎn)物可以使用例如卯黃、大豆或其它由動 植物得到的脂質(zhì)、將這些脂質(zhì)進行修飾得到，例如通過氫化使不飽和度 降低、或者化學合成品。具體來說，例如有甾醇類例如膽甾醇(CHol); 磷脂酰乙醇胺類例如二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺(DSPE);磷脂酰膽堿類例如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、 二硬脂酰 磷脂酰膽堿(DSPC);磷脂酰絲氨酸類例如二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸 (DPPS)、 二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPS);磷脂酸類例如二棕櫚酰磷脂酸 (DPPA)、 二硬脂酰磷脂酸(DSPA)等。
脂質(zhì)體的制備可采用公知的方法[D.W.Deeamer, P.S.Uster, ，，Liposome"ed. By M丄Ostro, Marcel Dekker Inc., N.Y. Basel, 1983,p27]進行。通常是漩渦攪拌和超聲波法，除此之外也可以使用乙醇 注入法、醚法或逆相蒸發(fā)法等，也可以將它們組合4吏用。
例如在漩渦攪拌和超聲波法中，可以將規(guī)定的脂質(zhì)溶解于有機溶劑 例如甲醇、乙醇、氯仿、或它們的混合物例如甲醇與氯仿的混合物中，
然后通過蒸發(fā)除去該有機溶劑，獲得脂質(zhì)的薄層。接著，向該脂質(zhì)的薄 層中加入水性介質(zhì)，通過旋渦攪拌或超聲波處理形成脂質(zhì)體。此時，可 以向上述水性介質(zhì)中混入藥物、標記或造影劑等待施用物質(zhì)，例如溶解 或懸浮，可以將該待施用物質(zhì)封于脂質(zhì)體中。
為了將低聚糖導入到脂質(zhì)體的表面，例如可以使用以下兩種方法的 任意一種。上述人工糖脂為水溶性、無法充分溶解于有機溶劑時，例如 在使用上述的M5與DPPE的結合物(M5-DPPE)、 RN與DPPE的結合物 (RN-DPPE)時，制備它們的水性溶液，將其與形成的脂質(zhì)體混合，例如 在4。C-室溫下溫育24-120小時，例如約72小時。
人工糖脂溶解于有機溶劑時，將該人工糖脂質(zhì)與用于構成脂質(zhì)體的 脂質(zhì)一起在脂質(zhì)體制造過程中溶解于上述有機溶劑，之后可按照常規(guī)方 法形成脂質(zhì)體。低聚糖的量相對于脂質(zhì)體的量根據(jù)低聚糖的種類、待包 封的抗原種類、脂質(zhì)體的組合結構等而不同，通常相對于1 mg構成脂
質(zhì)體的脂質(zhì)為5 ^g。
本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體可以是多層型(多層脂質(zhì)體)，也可以是單層 型(單層脂質(zhì)體)。它們可按照已知的常規(guī)方法制備，還可按照常規(guī)方法，
將一種類型轉(zhuǎn)換為另一種類型，例如將多層型的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)換為單層型的 脂質(zhì)體。本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體的粒徑?jīng)]有特別限定，可根據(jù)需要、按 照常規(guī)方法例如通過所需孔徑的濾器過濾來使粒徑均勻。
本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體。被覆低聚甘露 糖的脂質(zhì)體是將廣泛地保存于由酵母至人的生物中的、糖鏈結構之一的 多個甘露糖糖鏈(低聚甘露糖)進行脂化，并純化，然后與脂質(zhì)體結合(抱 合)。被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體是使用人所原本具有的結構，因此沒有 毒性。如果存在于巨噬細胞的受體特異性地識別低聚甘露糖，則被覆低 聚甘露糖的脂質(zhì)體可通過吞噬作用迅速地攝取到細胞內(nèi)。
本發(fā)明中使用的抗原物質(zhì)的種類沒有特別限定，例如有存活蛋白 (廿"4匕、、》)、卩匕、、7 、氨曱環(huán)酸(Rikavarin卩力乂《'J > ) 、 gpl 10、 MART-1、 NY-ESO-l、 SSX、 PBF、 HER2 、 SYT-SSX、 CEA、 MUC-1 等?？乖镔|(zhì)優(yōu)選癌抗原。
抗原物質(zhì)相對于脂質(zhì)體的量只要是可得到所施用的脂質(zhì)體組合物 被腹腔內(nèi)的巨噬細胞攝取、抗原肽在抗原呈遞細胞的MHC I類分子和/ 或II類分子上呈遞的本發(fā)明的效果即可，沒有特別限定，可以通過施用 物質(zhì)的種類或脂質(zhì)體的組成或結構等適當設定。通常，施用物質(zhì)的量是 每1 mg構成脂質(zhì)體的脂質(zhì)為1險100 |ig。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以根據(jù)需要含有藥學上可接受的載體。載 體可以使用無菌水、緩沖液或食鹽水。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可以根據(jù) 需要含有鹽類、糖類、蛋白質(zhì)、淀粉、明膠、植物油和聚乙二醇等。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的施用途徑?jīng)]有特別限定，優(yōu)選腹腔內(nèi)、腹 腔內(nèi)、皮下或鼻腔內(nèi)黏膜施用。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的施用量根據(jù)所 施用的物質(zhì)的種類、施用途徑、癥狀的嚴重程度、患者的年齡和狀態(tài)、 副作用程度等而不同，通常為0.1-100 mg/kg/天的范圍。
通過以下實施例進一步具體說明本發(fā)明，本發(fā)明并不受這些實施例 的限定。
實施例
實施例1:被覆低聚糖的脂質(zhì)體的制備方法和抗原的包封方法
按照以下方法，使具有甘露三糖(M3) (Manal—6 (Manal—3)Man 結構的甘露三糖(Man3))和二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)通過還原氨基 化反應化學結合，合成M3-DPPE。
首先，向2.5 mg甘露三糖(M3)中加入600 pi蒸餾水，攪拌溶解， 制備低聚糖溶液。接著以5mg/ml的濃度溶解于氯仿/曱醇(l:l、體積比) 混合液中，制備DPPE溶液。還以10 mg/ml的濃度在甲醇中溶解 NaBH3CN,制備NaBH3CN溶液。向600 pl上述低聚糖的各溶液中加入 9.4 ml上述DPPE溶液和1 ml上述NaBH3CN溶液，攪拌混合。將該反 應混合液在60。C下溫育16小時，生成人工糖脂。合成的人工糖脂質(zhì)使 用HPLC純化成高純度。
包封抗原蛋白(卵清蛋白(OVA)或EL4抗原)的脂質(zhì)體如下制備。 首先，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、月旦甾醇和人工糖脂(M3-DPPE) 以1:1:0.1混合，制成氯仿/甲醇溶液或乙醇溶液，將該溶液裝入茄形燒 瓶，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行減壓干燥固化，制備脂質(zhì)膜。接著，將0.3ml 含有抗原蛋白的PBS溶液(5 mg/ml)加入到脂質(zhì)膜中，用漩渦攪拌器劇烈 攪拌，制備被覆M3-DPPE的脂質(zhì)體。
然后用PBS洗滌脂質(zhì)體多次，通過離心除去未包封到脂質(zhì)體中的可 溶性物質(zhì)。再用1 pm的濾器使該脂質(zhì)體的粒徑均勻化。包封蛋白質(zhì)量 通過蛋白質(zhì)進行定量，脂質(zhì)體的脂質(zhì)組成比以及藥物通過HPLC進行定 量。
實施例2:在MHC I類和MHC II類分子上進行的抗原呈遞的確認
將卵清蛋白(OVA)或OVA肽包封于被覆甘露糖的脂質(zhì)體中，直接 施用于C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠的腹腔，被表達MHC I類以及同時 表達達MHCI類和II類的CDllb陽性細胞順利撮取。已知CDllb陽性 細胞發(fā)揮抗原呈遞細胞的作用，因此，為了明確包封OVA的被覆低聚 甘露糖(M3)的脂質(zhì)體被CD1 lb陽性細胞攝取后可在MHC I類和MHC II 類分子上任意中呈遞，進行了以下實驗。 (1)實"瞼組
A組是將用PBS制成200 )il包封有50 jig溶解于PBS的OVA、并
被覆M3的脂質(zhì)體，施用于小鼠的腹腔內(nèi)。 B組是將10 pl以5 mg/ml的濃度溶解于PBS的OVA溶液用PBS 制成共200 pl，施用于小鼠腹腔內(nèi)。與A組同樣，施用50pg的OVA。
C組是將38 |il只包封了 PBS、并被覆M3的脂質(zhì)體用PBS制成共 200 pi,施用小鼠的腹腔內(nèi)。
D組是將200 )il PBS施用小鼠的腹腔。
(2) 由腹腔回收的CDllb陽性細胞的前處理
小鼠使用出生8周齡的C57BL/6或BALB/c小鼠。將腹部用浸泡在 70%乙醇中的脫脂棉消毒，然后用注射筒對各組分別施用結核菌素。施 用l小時后，施用戊巴比妥麻醉藥使其安樂死，迅速向小鼠腹腔內(nèi)注入 5ml的Hanks液，清洗腹腔，從腹腔內(nèi)回收，回收腹腔內(nèi)的游離細胞。 將各組3只小鼠用Hanks液回收的腹腔內(nèi)細胞各組分別匯集在一支試管 內(nèi)，然后以1,000 rpm離心5分鐘。沉淀的細胞懸浮于10 ml含有10% 胎牛血清的RPMI液(RPMI-A液)，然后再用1,000 rpm離心5分鐘。將 相同操作重復兩次，以含有1 ]llM的2-巰基乙醇和10%胎牛血清的RPMI 液(RPMI-B液)懸浮，以100 )Lil分注到96孔板中，在C02培養(yǎng)箱中以37 °C、 5。/。C02培養(yǎng)2小時，在CDllb陽性細胞貼壁之后沖洗未貼壁細胞， 然后用100 |ul的RPMI-B液培養(yǎng)24小時。
(3) 在MHC I類分子和II類分子上呈遞的抗原的檢測 判斷OVA肽是否在B6小鼠的MHC I類或II類分子上呈遞，這可
以分別使用B6系統(tǒng)的小鼠OT-1小鼠(識別在MHC I類分子H-2Kb上呈 遞的OVA257—264)和OT-2小鼠(MHC II類分子的H-2Ab/OVA32W39)進行。 從這些小鼠中取出脾臟，浸泡在5ml Hank's液中，同時用2片載玻片將 其劃散。然后轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中靜置5分鐘，使構建脾臟組織的纖 維性組織沉淀并除去，然后使用小鼠淋巴細胞比重分離液M-SMF (日本 抗體研究所)，通過離心得到淋巴細胞。在II類分子上呈遞的效率也可 使用BALB/c系統(tǒng)的小鼠DO11.10小鼠(識別在H-2Ad/OVA323-339上呈遞 的OVA肽)進行實驗。將lxl(^個淋巴細胞用1 ml RPMI-B液懸浮，分 別以100 pi混合到已準備的含有CDllb陽性細胞(2-d)的孔中進行培 養(yǎng)。48小時后回收培養(yǎng)上清，對其中所含的IFN-y值進行定量。
結果如圖l和圖2所示。由圖l和圖2的結果證實將卵清蛋白(OVA) 包封于被覆甘露糖的脂質(zhì)體中并施用，則抗原在MHC I類分子和II類 分子兩者上呈遞，有效地誘導了 IFN-y。
實施例3:小鼠淋巴瘤EL4中CTL的誘導
將EL4細胞施用于同系小鼠C57BL/6小鼠的皮下，得到EL4的細 胞團。將該細胞團在PBS中進行勻漿，使用100,000 g上清作為EL4抗 原。將EL4抗原包封于被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體中，將l嗎蛋白質(zhì)量 施用C57BL/6小鼠的皮下，進行免疫(每周三次)。
初次免疫三周后，從小鼠體內(nèi)摘除脾臟，浸泡到5mlHank，s液中， 用2片載玻片劃散。然后轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中靜置5分鐘，使構建脾 臟組織的纖維性組織沉淀并除去，用小鼠淋巴細胞比重分離液M-SMF (曰本抗體研究所)，通過離心分離淋巴細胞，作為效應細胞使用。然后 將效應細胞用可溶解的蛋白抗原(100 mg EL4/1(^個細胞)進行3天的刺 激。將效應細胞與耙細胞(EL4細胞104個細胞/孔)按照以下的比混合 (E/T比二50:l、 25:1、 12.5:1、 6.25:1、 3.125:1、 1:1)。培養(yǎng)8小時，通過 CytoTox96測定試劑盒(Promega)測定細胞毒性。
測定結果如圖3所示。由圖3的結果可知，將EL4抗原包封于被覆 低聚甘露糖的脂質(zhì)體并施用，則可有效誘導CTL。
實施例4:
腹腔內(nèi)施用包封了 OVA的OML (被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體 OML/OVA)、包封了 OVA的無被覆的脂質(zhì)體(BL/OVA)或只施用5昭 OVA, l小時后回收腹腔內(nèi)細胞，接種于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)1小時。除去浮 游細胞，然后向貼壁細胞中加入新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基，24小時后回 收培養(yǎng)基，通過ELISA法測定培養(yǎng)基中的細胞因子。結果如圖4所示。 只從OML/OVA中確認有IL12的生成。
實施例5:
與實施例4同樣，腹腔內(nèi)施用OML/OVA或LPS (10 ng), 1小時后 回收腹腔內(nèi)細胞，測定由巨噬細胞生成的細胞因子。結果如圖5所示。 在LPS刺激下,優(yōu)先生成了 IL1、 TNF,在OML刺激下優(yōu)先生成了 IL12。
實施例6:
從識別H-2Kb (MHC I類)上呈遞的OVA257-264的TCR轉(zhuǎn)基因小鼠
OT-l、和識別H-2Ab (MHC II類)上呈遞的OVA323-339的TCR轉(zhuǎn)基因 小鼠OT-2中分別制備CD8陽性T細胞和CD4陽性T細胞，作為效應 細胞。另一方面，將包封了 OVA的OML施用C57/BL6小鼠腹腔，l小 時后回收腹腔內(nèi)細胞并培養(yǎng)，用貼壁細胞作為巨噬細胞。將上述T細胞 與巨噬細胞混合培養(yǎng)，24小時后回收培養(yǎng)液，測定培養(yǎng)基的細胞因子。 結果如圖6所示。
實施例7:
對單獨施用OVA時和將OVA包封在OML中施用時的抗原呈遞效 率進行比較。方法與實施例6同樣。結果如圖7所示。施用2昭包封在 OML中的OVA時，細胞因子的生成量與單獨施用1000 pg OVA時相 同，因此，可以認為在MHCII類上的呈遞高約500倍。同樣，在MHC I類上的呈遞高約50倍。即，通過將抗原包封在OML中，可以以非常 高的效率呈遞抗原。
實施例8:
將OVA/OML以相當于1 pg OVA的量免疫C57CL/6小鼠(以1周的 間隔皮下施用兩次)。為了活化腸道免疫，免疫計劃如圖8所示。由最終 免疫1周后取出脾臟細胞，用抗原刺激后測定培養(yǎng)基中的細胞因子(圖 9)。同時以EG7細胞(向EL4細胞中導入OVA基因，在自身的MHC I 類上呈遞OVA肽抗原的細胞)作為靶細胞，測定細胞障礙性能(圖9)。在 用包封了 OVA的OML免疫的小鼠中觀察到顯著的Thl細胞因子的生 成，也觀察到顯著的細胞障礙性能。另一方面，在以母細胞株EL4為靶 時，均未觀察到細胞障礙性能。因此，可以說誘導了抗原特異性的CTL。
實施例9:
如實施例8所述，對于免疫的小鼠，在最終免疫1周后將lxl()S的 EG-7移植到背部，3周后測定胂瘤體積。結果如

圖10所示。用OVA/OML 免疫的小鼠中，腫瘤的生長完全受到抑制。
實施例10:
將^106的EG-7移植到背部，第9天(腫瘤體積大約為100mmS)將
OML/OVA按照1 pgOVA接種。然后測定腫瘤體積。結果如圖11所示。 在OML/OVA施用組中，所有的小鼠均觀察到肺瘤縮小，至少3例中完 全縮小。接種了胂瘤的小鼠的存活率如圖12所示。OVA/OML施用組的 存活率顯著提高。
實施例11:
將OML/OVA按照5 pg OVA以1周的間隔鼻腔內(nèi)施用于小鼠三 次，最終施用l周后，采集鼻腔相關淋巴組織(NALT)和脾臟，抗原刺激 后測定細胞因子的生成。結果如圖13所示。在OML/OVA施用組中， 在NALT中可見顯著的Thl細胞因子的生成。
產(chǎn)業(yè)實用性
本發(fā)明可提供一種脂質(zhì)體組合物，該脂質(zhì)體組合物可使癌抗原等抗 原肽在抗原呈遞細胞的MHC I類分子和II類分子上有效呈遞。根據(jù)本 發(fā)明，無需從患者中取出細胞并返回的操作，可以構建簡便的免疫方 法。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物特別可以將作為癌抗原的蛋白質(zhì)包封，直接 施用患者，可用作疫苗療法。
附圖簡述
圖1表示來自MHC I類限制的OVA肽特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的脾 臟細^^的IFN-y生成量。
圖2表示攝取了 OVA的對于腹腔內(nèi)巨噬細胞MHC II類限制的OVA 肽特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠(DOl 110)的脾臟細胞的應答。
圖3表示Man3-脂質(zhì)體免疫誘導細胞毒性T淋巴細胞。
圖4表示腹腔內(nèi)施用被覆低聚甘露糖的脂質(zhì)體(OMA/OVA)等后腹 腔內(nèi)細胞的細胞因子的生成量。
圖5表示腹腔內(nèi)施用OML/OVA或LPS后腹腔內(nèi)的細胞因子的生成量。
圖6表示從識別OVA257-264 (MHC I類)的TCR轉(zhuǎn)基因小鼠OT-l 和識別OVA323-339 (MHC II類)的TCR轉(zhuǎn)基因小鼠OT-2中分別混合培 養(yǎng)CD8陽性T細胞和CD4陽性T細胞與巨噬細胞時細胞因子的生成量。圖7表示單獨施用OVA時與將OVA包封于OML中施用時的抗原 呈遞效率的比較結果。
圖8表示用于活化腸道免疫的免疫計劃。
圖9表示腸道免疫中，由活化免疫的最終免疫1周后取出脾臟細 胞，用抗原刺激后測定培養(yǎng)基中細胞因子量的結果，以及以EG7細胞作 為耙細胞測定細胞障礙性能的結果。
圖IO表示對腸道免疫的小鼠，在最終免疫1周后將EG-7移植到背 部，3周后測定肺瘤體積的結果。
圖11表示將EG-7移植到背部第9天時接種OML/OVA,然后測定 肺瘤體積的結果。
圖12表示腫瘤接種小鼠的存活率。
圖13表示對小鼠鼻腔內(nèi)施用OML/OVA,最終施用1周后采集鼻腔 相關淋巴組織(NALT)和脾臟，測定抗原刺激后細胞因子的生成的結果。
權利要求
1.脂質(zhì)體組合物，其含有被覆低聚糖的脂質(zhì)體和抗原物質(zhì)，用于使抗原肽在抗原呈遞細胞MHCI類分子和II類分子上呈遞。
2. 權利要求1的脂質(zhì)體組合物，其中，所述的低聚糖為低聚甘露糖。
3. 權利要求1或2的脂質(zhì)體組合物，其中，所述的低聚糖為甘露 五糖或甘露三糖。
4. 權利要求1-3中任一項的脂質(zhì)體組合物，其中，所述的抗原物質(zhì) 為癌纟元原。
5. 權利要求1-4中任一項的脂質(zhì)體組合物，該脂質(zhì)體組合物在腹腔 內(nèi)、皮下或鼻腔內(nèi)粘膜施用，被巨噬細胞等抗原呈遞細胞攝取，抗原肽 在MHC I類分子和II類分子上呈遞。
6. 權利要求1-5中任一項的脂質(zhì)體組合物，該脂質(zhì)體組合物誘導細 胞毒性T淋巴細胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供可使抗原物質(zhì)在抗原呈遞細胞的MHC I類分子和II類分子上有效呈遞的脂質(zhì)體組合物。本發(fā)明可提供含有被覆低聚糖的脂質(zhì)體和抗原物質(zhì)、使抗原肽在抗原呈遞細胞的MHC I類分子和II類分子上呈遞的脂質(zhì)體組合物。
文檔編號A61K9/127GK101208075SQ20068001892
公開日2008年6月25日 申請日期2006年3月29日 優(yōu)先權日2005年3月29日
發(fā)明者小島直也, 池原讓, 辻村邦夫 申請人:學校法人東海大學;愛知縣