專利名稱：：聚乙二醇化g-csf多肽及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從聚乙二醇化(PEGylated)G-CSF蛋白中去除不穩(wěn)定的聚乙二醇部分(PEGmoieties)以增加穩(wěn)定性和均勻性的方法，并且涉及所得的聚乙二醇化G-CSF蛋白。本發(fā)明還涉及包含所述聚乙二醇化蛋白的藥用組合物和通過施用該藥用組合物進行治療的方法。
背景技術(shù)：
：將聚乙二醇(PEG)部分共價連接于蛋白質(zhì)或多肽("聚乙二醇化")是用于改進這些蛋白質(zhì)或多肽尤其是藥用蛋白的性質(zhì)的公知方法，例如為了改善循環(huán)半衰期和/或為了屏蔽潛在表位從而減少發(fā)生不期望的免疫應(yīng)答的潛在可能。有許多基于活化PEG的技術(shù)可用來提供PEG部分對蛋白質(zhì)上一種或多種基團的連接。例如，通常認為mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酉旨(mPEG-succinimidylpropionate;mPEG-SPA,可從NektarTherapeutics獲得)通過酰胺《建選4奪性連接于N末端和賴氨酸殘基的s-氨基。然而，在實踐中mPEG-SPA并不總是專一地連接于這些基團，而是還有可能通過酯鍵連接于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸殘基的羥基。結(jié)果是，使用這種技術(shù)制備的聚乙二醇化蛋白可能不具有足夠的均勻度，并且可能除了需要的PEG之外還包含許多不同的PEG異構(gòu)體。這是人們所不期望的，原因有很多，其中之一是這使得表征這些蛋白質(zhì)更加復(fù)雜。另外，結(jié)合于目的基團之外的基團的PEG部分可能是相對不穩(wěn)定的。例如，在胺特異性PEG例如mPEG-SPA的情況下，通過酯鍵結(jié)合于羥基的PEG部分與那些通過酰胺鍵結(jié)合于N末端或賴氨酸殘基的部分相比傾向于相對不穩(wěn)定。取決于配制和貯存條件，這可能導(dǎo)致這些不穩(wěn)定PEG基團發(fā)生不期望的損失，并從而潛在可能導(dǎo)致所述聚乙二醇化蛋白的性質(zhì)隨著時間推移發(fā)生改變。此外，對于聚乙二醇化蛋白藥物而言可能有潛在的監(jiān)管或安全性上的問題所述藥物施用于患者之后，存在一個或多個PEG部分在體內(nèi)從蛋白質(zhì)上脫離的風(fēng)險。本發(fā)明通過提供將這些不穩(wěn)定PEG基團簡單去除的方法來應(yīng)對這些問題，由此產(chǎn)生更均勻和穩(wěn)定的聚乙二醇化蛋白產(chǎn)品。發(fā)明簡述本發(fā)明一般性地涉及用于增加聚乙二醇化多肽的穩(wěn)定性和均勻性的方法，所述多肽具有至少一個連接于賴氨酸殘基或N末端的PEG部分和至少一個連接于羥基的PEG部分，所述方法包括以一段適合于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述多肽施加改變的pH,之后將該pH調(diào)節(jié)至適合于長期貯存所述多肽的pH。在一個具體的方面，本發(fā)明涉及一種增加聚乙二醇化粒細胞集落刺激因子(G-CSF)多肽的穩(wěn)定性和均勻性的方法，所述多肽具有至少一個連接于賴氨酸殘基的s-氨基或N末端氨基的PEG部分，和至少一個連接于羥基的PEG部分，所述方法包括以一段適合于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述多肽施加8.0以上的高pH,然后將pH降低至大約8.0或更低。本發(fā)明的另一方面涉及一種產(chǎn)生聚乙二醇化G-CSF多肽的方法，包括使G-CSF多肽與胺特異性活化聚乙二醇(amine-specificactivatedPEG)進行聚乙二醇化反應(yīng)，以產(chǎn)生聚乙二醇化多肽中間體，隨后以一段適合于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述聚乙二醇化多肽中間體施加至少大約9.0的高pH,以產(chǎn)生聚乙二醇化G-CSF多肽。本發(fā)明的另一方面涉及一種組合物，它包含聚乙二醇化G-CSF多肽變體的PEG4立置異構(gòu)體(positionalPEGisomer)的均質(zhì)混合物(homogeneousmixture),其中所述混合物中至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，每一種都具有由兩個結(jié)合于賴氨酸的s-氨基的PEG部分和一個結(jié)合于N末端氨基的PEG部分組成的PEG部分。本發(fā)明的另一方面涉及一種組合物，它包含聚乙二醇化G-CSF多肽的PEG位置異構(gòu)體的混合物，其中所述多肽相對于野生型人G-CSF(SEQIDNO:l)包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K,且其中所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體是連接有三個PEG部分的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一方面涉及一種產(chǎn)生重組G-CSF多肽的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的混合物的方法，所述重組G-CSF多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K，所述方法包括a)在宿主細胞中表達重組G-CSF多肽；b)分離所述重組G-CSF多肽；c)將所述分離的重組G-CSF多肽與胺特異性活化PEG反應(yīng)以產(chǎn)生該重組G-CSF多肽的多種PEG位置異構(gòu)體；d)將所述多種PEG位置異構(gòu)體在8.5至10.5的pH進行反應(yīng)以產(chǎn)生所述重組G-CSF多肽的多種部分脫聚乙二醇化的(partiallydePEGylated)賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體。和以它們的PEG位置異構(gòu)體分布為特征的聚乙二醇化G-CSF多肽及包含這些聚乙二醇化G-CSF多肽的組合物，以及在患有或有風(fēng)險患上嗜中性粒細胞水平不足(insu伍cientneutrophillevel)的患者中通過施用本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽或組合物來提高嗜中性粒細胞水平的方法。本發(fā)明另外的方面和優(yōu)選的實施方式根據(jù)以下說明書以及所附權(quán)利要求將是易于想到的。附圖簡述圖1顯示如本文所述聚乙二醇化、部分脫聚乙二醇化和純化的G-CSF變體的SDS-PAGE分析的掃描圖。圖2顯示如本文所述聚乙二醇化和部分脫聚乙二醇化G-CSF的SDS-PAGE分析的掃描圖。圖3顯示根據(jù)本發(fā)明制備的部分脫聚乙二醇化產(chǎn)物集合(productpool)的陽離子交換層析圖。圖4顯示未經(jīng)本發(fā)明的脫聚乙二醇化的純化聚乙二醇化G-CSF的陽離子交換層析圖。描述定義在本說明書的上下文和權(quán)利要求中應(yīng)用以下定義術(shù)語"多肽"或"蛋白質(zhì)"可以在本文中互換使用，用來指氨基酸的聚合物，而不限于任何具體長度的氨基酸序列。這些術(shù)語意圖不僅包括全長蛋白質(zhì)，還包括例如任何給定蛋白質(zhì)或多肽的片l殳或截短形式(tmncatedversion)、哭體、域等。"G-CSF"多肽是具有如SEQIDNO:l所示的人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)序列的多肽，或呈現(xiàn)G-CSF活性的hG-CSF變體。所述"G-CSF活性"可以是結(jié)合G-CSF受體的能力(Fukunagaetal.，所o.C7zem.，265:14008,1990),但優(yōu)選是G-CSF細胞增殖活性，具體而言是在使用鼠細胞系NFS-60(ATCC編號CRL-1838)的體外活性測定中測得的活性。使用NFS-60細胞系的適合于G-CSF活性的體外測定由Hammerling等人在J尸/2flm2.所owW.^加/.13(1):9-20,1995中描述。"呈現(xiàn)"G-CSF活性的多肽在它展現(xiàn)可測量的功能時被認為具有這種活性，所述可測量的活性例如在體外測定中可測量的增殖活性。"變體"是在一個或多個氨基酸殘基上不同于親本多肽的多肽，其中所述親本多肽通常是具有天然的、野生型氨基酸序列的多肽，典型地是天然哺乳動物多肽，更典型地是天然人多肽。因此所述變體與天然多肽相比包含一個或多個if又代、插入或缺失。這些可能包括例如N末端和/或C末端截短一個或多個氨基酸殘基，或在N末端和/或C末端添加一個或多個額外的殘基，例如在N末端添加曱辟u氨酸殘基。最通常地，變體將與親本多肽有至多15個氨基酸殘基的不同，例如至多12、10、8或6個氨基酸殘基的不同。"胺特異性活化PEG"是通過酰胺鍵優(yōu)先連接于N末端氨基或賴氨酸殘基s-氨基的任何活化PEG衍生物。胺特異性活化PEG衍生物的實例包括mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酉旨(mPEG-SPA):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(succinimidylbutanoate;mPEG-SBA):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>和mPEG-琥珀酰亞胺a-甲基丁酸酯(mPEG-succinimidy!a-methylbu.tanoate)(mPEG-SMB):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>mPEG-SPA、mPEG-SBA和mPEG-SMB可從NektarTherapeutics獲得;參見NektarAdvancedPEGylationCatalog2004和2005-2006,《PolyethyleneGlycolandDerivativesforAdvancedPEGylation》。其它胺特異性活化PEG衍生4勿包4舌可乂人SunBioCorporation.獲《尋的PEG-SS(SucchiimidylSuccinate;王虎珀酰亞胺琥珀酸酯)，PEG-SG(SuccimmidylGluta.rate;琥珀酰亞胺戊二酸酯)，PEG-NPC(碳酸對硝基笨酯)和PEG-異氰酸酯(isocyanate);和可從NOFCorporation獲得的PEG-SCM。"不穩(wěn)定"PEG部分在本發(fā)明的上下文中指連接于多肽的羥基，尤其是通過酯鍵連接于絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸殘基的羥基的PEG部分。如上所述，這些PEG部分通過羥基的連接有不穩(wěn)定的傾向，因此隨著時間的推移這些PEG部分傾向于通過酯鍵的水解而從多肽脫離，例如當包含這些部分的多肽以水;:容液的形式貯存時。如在本文中所用，"穩(wěn)定性"指PEG部分結(jié)合于多肽的連接穩(wěn)定性，即這些PEG部分是否隨著時間的推移保持結(jié)合于多肽，例如在貯存于水溶液期間，或它們是否傾向于脫離，例如由于酯鍵水解。如在本文中所用，術(shù)語蛋白質(zhì)的"PEG位置異構(gòu)體"指蛋白質(zhì)的不同聚乙二醇化形式，其中PEG基團位于該蛋白質(zhì)中不同的氨基酸位置。術(shù)語蛋白質(zhì)的"賴氨酸/N末端PEG異構(gòu)體"的意思是PEG基團連接于蛋白質(zhì)的氨基末端和/或連接于蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的s-氨基。例如，短語"連接有3個PEG部分的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體"，如用于G-CSF時，意思是G-CSFPEG位置異構(gòu)體的混合物，所述異構(gòu)體中有三個PEG基團連接于所述蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基s-氨基和/或所述蛋白質(zhì)的N末端。典型地，"連接有3個PEG部分的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體"將具有兩個連接于賴氨酸殘基的PEG部分和一個連接于N末端的PEG部分。PEG位置異構(gòu)體的分析可以如以下實施例中所述使用陽離子交換HPLC來進行。多肽的"賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的基本上純化的混合物"指已經(jīng)經(jīng)過層析或其它純化程序以去除雜質(zhì)(例如非賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體)的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體混合物。例如，在缺少如本文所述的部分脫聚乙二醇化步驟及后續(xù)純化的情況下會存在的連接于輕基的不穩(wěn)定PEG部分，大多數(shù)不會包含在所述"賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的基本上純化的混合物"中；并且所述"賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的基本上純化的混合物"中有通常少于大約20%,更通常少于15%的多肽包含連接于羥基的不穩(wěn)定PEG部分。優(yōu)選將有少于大約10%，例如少于大約5%的多肽包含連接于羥基的不穩(wěn)定PEG部分。術(shù)語"多肽變體的PEG位置異構(gòu)體的均質(zhì)混合物"意思是不同PEG位置異構(gòu)體的多肽部分是相同的。這意味著所述混合物中不同的PEG位置異構(gòu)體全部基于單個多肽變體序列。例如，聚乙二醇化G-CSF多肽變體的PEG位置異構(gòu)體的均質(zhì)混合物的意思是所述混合物中不同的PEG位置異構(gòu)體是基于單一的G-CSF多肽變體。如本文中所用，"均勻性(imiformity)"指聚乙二醇化多肽就不同的位置異構(gòu)體(即包含連接在不同位置、不同數(shù)量的PEG部分的不同多肽異構(gòu)體)的數(shù)量以及這些位置異構(gòu)體的相對分布而言的均質(zhì)性。對于意在供人或動物中治療用途的藥用多肽而言，通常期望的是將不同的PEG位置異構(gòu)體的數(shù)量最小化。"部分脫聚乙二醇化"指本發(fā)明的方法起去除連接于羥基的不穩(wěn)定PEG部分的作用，而同時更穩(wěn)定地連接于N末端或賴氨酸殘基的氨基的PEG部分保持完整。如下文將說明的，所述脫聚乙二醇化方法的進行取決于具體的高pH值和處于所述高pH的持續(xù)時間。因此，取決于在任何具體情況下所選擇的條件，有可能一小部分多肽在脫聚乙二醇化步驟結(jié)束時仍然具有結(jié)合于羥基的PEG部分。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文所提供的信息和蛋白質(zhì)分析
技術(shù)領(lǐng)域：
的一般常識將能夠?qū)λ龇椒右哉{(diào)整，從而使基本上所有不穩(wěn)定的PEG部分均得以去除，并且任何剩余的不穩(wěn)定PEG部分對最終產(chǎn)品的期望性質(zhì)均無顯著影響。在本文中任何對"脫聚乙二醇化"的述及應(yīng)該理解為意指"部分脫聚乙二醇化"。詳述如上所示，本發(fā)明的一個具體方面涉及用于增加聚乙二醇化G-CSF多肽的穩(wěn)定性和均勻性的方法，所述多肽具有至少一個連接于賴氨酸殘基e-氨基或N末端氨基的PEG部分和至少一個連接于羥基的PEG部分，所述方法包括以一段適于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述多肽施加8.0以上的高pH，然后將pH降低至大約8.0或更低。雖然此方法適合于任何哺乳動物G-CSF多肽，但所述多肽優(yōu)選是人G-CSF多肽，即具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，任選地在:N末端添加有曱疏氨酸殘基，或其變體。在G-CSF變體的情況下，相比于天然的、野生型G-CSF多肽，典型地，相比于人G-CSF(SEQIDNO:l)，這些變體可以具有一個或多個取代、插入或缺失，并且/或者N末端和/或C末端截短一個或多個氨基酸殘基；例如1-15個取代，例如至多6、8、10或12個取代。優(yōu)選的G-CSF變體包括公開于WO01/51510和WO03/006501中的那些變體。例如在WO03/006501中所述，hG陽CSF在第16、23、34和40位包含四個賴氨酸殘基，當使用優(yōu)先與賴氨酸殘基或N末端結(jié)合的活化PEG對G-CSF進行聚乙二醇化時，通常期望去除這些賴氨酸殘基中的至少一個，例如去除兩個、三個或所有這些殘基，例如通過缺失，但優(yōu)選通過取代。因此用于本發(fā)明方法的G-CSF多肽可以是這樣的變體，其中選自K16、K23、K34和K40的氨基酸殘基的至少一個已經(jīng)缺失或為其它氨基酸殘基所取代。典型地，賴氨酸殘基的去除將通過取代來實現(xiàn)，一般通過用R或Q殘基，優(yōu)選用R殘基取代。由此，所述G-CSF多肽可以具有選自K16R/Q、K23R/Q、K34R/Q、K40R/Q的取代中的一個、兩個、三個或四個(其中，例如，"K16R/Q"表示第16位的賴氨酸替換為精氨酸或谷氨酰胺殘基)。優(yōu)選所述多肽包括取代Kl6R+K34R+K40R，而第23位的賴氨酸保留不變。除了在不期望聚乙二醇化時去除賴氨酸殘基之外，WO03/006501還描述了添加賴氨酸殘基以產(chǎn)生用于聚乙二醇化的位點。這些位點可以通過插入來添加，但優(yōu)選通過取代來添加。對于引入聚乙二醇化位點而言優(yōu)選的氨基酸取代的實例包括Q70K、Q90K、T1()5K、Q120K、T133K、S159K和H17()K的一個或多個，例如這些取代中的兩個、三個、四個或五個，優(yōu)選的取代是T105K+S159K。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述G-CSF多肽包含耳又代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K。在具體的實施方式中，所述G-CSF多肽相對于hG-CSF僅具有這五個取代。G-CSF多肽的產(chǎn)生將根據(jù)本發(fā)明加以聚乙二醇化的G-CSF多肽可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來產(chǎn)生，例如本文引"^正的WO03/006501中所述。這些方法包^fe構(gòu)建編碼多肽的核香酸序列及在合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主中表達該序列。然而，:較低，本發(fā)明的多成和重組DNA技術(shù)的組合來產(chǎn)生。可以通過分離或合成編碼親本G-CSF的核苷酸序列，例如具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的hG-CSF,來構(gòu)建編碼本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的偶聯(lián)物(conjugate)的多肽部分的核苷酸序列，繼而改變所述核芬酸序列從而實現(xiàn)相關(guān)氨基酸殘基的引入(即插入或取代)或缺失(即去除或取代)。所述核苷酸序列可便宜地根據(jù)常規(guī)方法通過位點定向誘變來修飾?；蛘?，通過化學(xué)合成制備所述核苦酸序列，例如通過使用寡核苦酸合成儀，其中寡核苷酸以期望多肽的氨基酸序列為基礎(chǔ)來設(shè)計，并且優(yōu)選將產(chǎn)生重組多肽的宿主細胞中偏好的那些密碼子。例如，可以通過PCR、連接反應(yīng)或連接4連式反應(yīng)(LCR)來合成和裝配若干編碼期望多肽的一部分的小寡核香酸(Barany,iWz〗5、88:189-193,1991)。單獨的寡核苷酸通常包含用于互補裝配的5'或3'突出端。一旦編碼多肽的核芬酸序列完成裝配(通過合成、位點定向誘變或其它方法)，則將其插入到重組載體中并且與G-CSF在期望的轉(zhuǎn)化宿主細胞中表達所必需的調(diào)控序列可操作地連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇適于表達所述多肽的載體、表達調(diào)控序列和宿主。重組載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在、其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒?；蛘?，所述載體可以是當被引入宿主細胞時，整合至宿主細胞基因組并同其所整合的染色體一起復(fù)制的載體。所述載體優(yōu)選是這樣的表達載體，其中編碼本發(fā)明多肽的核苦酸序列可操作地連接至所述核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所必需的其它片段。所述載體通常源自質(zhì)?；虿《綝NA。許多適合用于在本文所提及的宿主細胞中表達的表達載體是可通過商業(yè)途徑獲得或在文獻中有所描述的。關(guān)于適用于表達G-CSF的載體的詳細信息可以參見WO03/006501。術(shù)語"調(diào)控序列"在本文定義為包括所有包括對本發(fā)明多肽的表達是必需的或有利的所有成分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、增強子或上游激活序列、信號肽序列、合成內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，調(diào)控序列包括啟動子。許多種表達調(diào)控序列均可在本發(fā)明中使用，例如公開于WO03/006501中的任何調(diào)控序列。編碼呈現(xiàn)G-CSF活性的本發(fā)明的核苦酸序列，無論是通過位點定向誘變、合成、PCR還是其它方法制備，均可任選地還包括編碼信號肽的核苦酸序列。當多肽將從表達該多肽的細胞分泌時，則有信號肽存在。這種信號肽，如果有的話，應(yīng)該是由選擇用于表達該多肽的細胞所識別的多肽。信號肽對于所述多肽可以是同源的(例如是通常與hG-CSF有關(guān)的信號肽)或異源的(即源自hG-CSF以外的其它來源)；或者，信號肽對于所述宿主細胞可以是同源的或異源的，即是通常從所述宿主細胞表達的信號肽或是通常不從宿主細胞表達的信號肽。因此，信號肽可以是原核的，例如源自細菌如大腸桿菌，或是真核的，例如源自哺乳動物，或源自昆蟲或酵母細胞。有關(guān)合適信號肽的其它信息可參見WO03/006501。任何合適的宿主均可用于產(chǎn)生G-CSF多肽，包括細菌(盡管不特別優(yōu)選)、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物，或其它合適的動物細胞或細胞系，以及轉(zhuǎn)基因動物或植物。哺乳動物細胞是優(yōu)選的。細菌宿主細胞的實例包括革蘭氏陽性細菌例如芽孢桿菌屬(^^,7/w)菌株，例如短芽孢桿菌Zwv,'"或枯草芽孢桿菌(/.^/>〃//^)菌抹，假單胞菌屬(尸化議fowo""5)菌株或鏈霉菌屬(5yre/to,w少'cra)菌株；或革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌菌抹。合適的絲狀真菌宿主細胞的實例包括曲霉屬(J'sye廠g7'〃附)菌林,例如米曲霉(/!.、黑曲霉(zl.Wge,')或構(gòu)巢曲霉(/1."/A,/朋.y)菌抹，鐮孢屬(F"y"r/MW)菌抹或木霉屬(7Wc/oaferma)菌抹。合適的酵母宿主細胞的實例包括酵母屬(5"acc/2arawyc^)菌才朱，例如酉良酒酵母(/S.cev/w,fle),裂殖酵母屬(5b/2/zos"(3cc/7aram少cas")菌才朱，克魯維酵母屬(幻，eramyces)菌抹，畢赤酵母屬CP/c//fl)菌抹，例如巴斯德畢赤酵母(P/xw/or,:s')或Pwef/7"o//'c"菌抹，漢遜酵母屬(i/a"化"M/a)菌才朱，例如多形漢遜酵母(//.Po(ywo甲/w)菌抹，或西洋蓍霉屬(7arraw/a)菌抹。合適的昆蟲宿主纟田月包的實例包4舌鱗翅目(丄印/(/o/tora)細月包系，例如Spodoptera/rag7>eWa(Sf9或Sf21)或7Hc—/柳'oam'細胞(HighFive)(US5,077,214)。合適的哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，(例如CH(〕-K1;ATCCCCL-61),非洲綠猴細胞系(GreenMonkeycelllines;COS)(例如COS1(ATCCCRL-1650)、COS7(ATCCCRL-1651));小鼠細胞(例如NS/O),幼小倉鼠腎(BabyHamsterKidney;BHK)細胞系(例如ATCCCRL-1632或ATCCCCL-10),和人細胞(例如HEK293(ATCCCRL-1573))。其它合適的細胞系是本領(lǐng)域已知并且可以從公共保藏機構(gòu)例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Rockville,Maryland獲得。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的包含碳源、氮源和無機鹽營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽被分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該可從所述培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽不被分泌，則從細胞裂解物(lysate)加以回收。可通過本領(lǐng)域已知方法回收所得多肽。例如，可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。所述多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括(旦不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(參見，例^口，/Vofe/w尸w7"7'/,、""/cw，J.-C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989》，D.Metcalf和N.A.Nicola在7Tze/zewo/o/e/7'cc油w少'-、'//mw/"〃《g,/t/"cv\y，p.50-51,CambridgeUniversityPress(1995)，byC.S.Baeetal,Appl.Microbiol.Biotechnol，52:338-344(1999)中和l)S4,810,643中描述了用于純化呈現(xiàn)G-CSF活性的多肽的具體方法。聚乙二醇化隨后可將純化的G-CSF多肽通過多種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法聚乙二醇化。例如，可以使G-CSF多肽與胺特異性活化聚乙二醇(PEG)發(fā)生聚乙二醇化。所述胺特異性活化PEG可以是上文提到的任一種，例如mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺a-甲基丁酸酯(m.PEG-SMB)。PEG部分的分子量可以基于例如待連接到多肽的PEG部分的數(shù)量來選擇，通常會在大約1kDa至大約20kDa的范圍內(nèi)，諸如大約1kDa至大約12kDa,例如大約2kDa至大約10kDa,諸如大約4kDa至大約6kDa，例如大約5kDa。例如，活化PEG可以是分子量大約為5kDa的.mPEG-SPA。聚乙二醇化例如可以在大約7.5-9.0的pH，例如大約8.0-8.5的pH進行。當本文中使用大約PEG部分時，詞語"大約"指近似的平均分子量，并且反映出在給定的聚合物制備物中將存在特定分子量分布的事實。對于其它有關(guān)聚乙二醇化方法的概括說明，參見例如，NektarAdvancedPEGylationCatalog2004和2005-2006,以及本文所引用的參考文獻。WO03/006501中也提供了對于G-CSF多肽的聚乙二醇化方法更詳細的描述。部分脫聚乙二醇化用于脫聚乙二醇化步驟的高pH是基于例如脫聚乙二醇化步驟發(fā)生的溫度、脫聚乙二醇化步驟的持續(xù)時間和包括進行聚乙二醇化的pH在內(nèi)的用于聚乙二醇化的條件等因素來進行選擇的。通常而言，脫聚乙二醇化期間使用的pH越高，脫聚乙二醇化發(fā)生得越快。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，可以將脫聚乙二醇化條件例如pH、時間和溫度相對彼此加以調(diào)節(jié)，以在任何給定的情況下獲得期望的結(jié)果。例如，雖然有可能使用相對低的高pH,例如8和9之間，但使用較高pH例如9到11之間、諸如9到10之間，將導(dǎo)致更快的脫聚乙二醇化。因此，典型地，高pH將在大約8.5至大約11.0的范圍內(nèi)，例如大約8.5至大約10.5，諸如大約9.0至大約10.0的范圍內(nèi)。所述高pH可以是例如在大約9.2至大約9.8的范圍內(nèi)，例如大約9.5。通常而言，脫聚乙二醇化步驟將緊接著聚乙二醇化立即發(fā)生，因為這一般是最有效率的，并且將導(dǎo)致較短的處理時間和較高的產(chǎn)率。因此在其基本形式中，本發(fā)明的特征在于對大部分聚乙二醇化的中間體進行部分脫聚乙二醇化，然后進行常規(guī)分離，例如使用如下所述的層析純化。然而，如果因為任何原因而有需要，可在聚乙二醇化步驟之后進行中間體純化步驟，然后再進行脫聚乙二醇化。所述中間體純化步驟可以例如包含如下所述的層析純化，隨后是超濾和/或滲濾。如有需要，可在脫聚乙二醇化和任何后續(xù)的純化步驟之前，將從任何這種中間體純化步驟獲得的中間產(chǎn)物貯存起來。在這種情況下，可使用本領(lǐng)域公知的方法將所述聚乙二醇化的中間產(chǎn)物通過例如冷凍或凍干法來貯存,，脫聚乙二醇化可在任何在其它情況下適合于所述多肽的溫度進行，例如大約5。C至大約4CTC，例如大約lcrc至大約35。c。脫聚乙二醇化將通常在大約15。C至大約25。C的溫度進行，例如在大約20-22。C的環(huán)境溫度。如上所述，盡管為了獲得期望的結(jié)果而在高pH下進行的脫聚乙二醇化步驟的持續(xù)時間將依賴于其它因素例如pH和溫度，但所述持續(xù)時間將通常在大約2小時至大約IOO小時的范圍內(nèi)，通常大約4小時至大約72小時，更通常是大約8小時至大約48小時。由于一般來說進行脫聚乙二醇化步驟的時間越短越好，通常將對所述多肽施加高pH的時間不多于大約24小時，例如大約12小時至大約30小時，諸如大約18小時至大約24小時。如上文所指出的，在高pH下相對短的脫聚乙二醇化時間將通常伴隨著相對高的pH,例如大約9-10。在高pH脫聚乙二醇化之后，將pH降低至大約8.0或更低，具體的pH根據(jù)需要的多肽貯存條件來選擇。對于G-CSF而言，適合于長期貯存的pH將通常在大約2.0至大約5.0的范圍內(nèi)，例如大約2,5至大約4.5，例如大約4.0。在某些情況下，依賴于例如要使用的具體制劑，可選擇稍高的pH,即大約5.0-8.0的pH,例如大約6.0-7.5，諸如大約7.0-7.5。G-CSF的各種藥用制劑在例如US5,104,651、US5,919,757、US6,497,869和US6,776,983中有所描述。對于本發(fā)明上下文中pH的調(diào)節(jié)，可使用任何合適的酸或堿，包括有機和無機的酸和堿。類似地，可使用任何合適的緩沖液來保持pH在期望的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知任何給定情況下適用的酸、石威和緩沖液，根據(jù)例如所述的多肽和期望的pH而定。降低pH之后，通常將對多肽進行至少一個層析純化步驟，例如離子交換層析或凝膠過濾層析，以分離連接有期望數(shù)量的PEG基團的多肽?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的方法進行層析純化。例如，若脫聚乙二醇化之后降低的pH在大約7.0以下，則可以使用陽離子交換層析?；蛘?并且，層析可以在降低pH之前進行，在所述高pH值下使用陰離子交換層析。也可使用本領(lǐng)域已知的標準方法進行進一步的純化以及任何期望的產(chǎn)物分析。例如，可以使用例如超濾或滲濾在層析純化步驟之后進行進一步的純化。如上所述，本發(fā)明的另一方面涉及用于產(chǎn)生聚乙二醇化G-CSF多肽的方法，包括用胺特異性活化聚乙二醇(PEG)將G-CSF多肽聚乙二醇化，隨后以少大約9.0的高pH。這種方法產(chǎn)生具有至少一個連接于賴氨酸殘基s-氨基或N末端氨基的PEG部分、并且基本上沒有連接于羥基的PEG部分的聚乙二醇化G-CSF。在一個實施方式中，本發(fā)明的此方面使用在大約pH7.0-9.0條件下的聚乙二醇化來進行，隨后提高pH以去除不穩(wěn)定的PEG部分。在另一個實施方式中，可在9.0以上的更高pH，例如9-11范圍內(nèi)的pH:,例如大約9.2至10.0,例如大約9.5的pH進行聚乙二醇化。在這種情況下，聚乙二醇化和脫聚乙二醇化可以作為單一的步驟在單一的pH值進行，所持續(xù)的時間足以導(dǎo)致N末端和賴氨酸殘基發(fā)生期望的聚乙二醇化而同時避免PEG部分與羥基發(fā)生不期望的結(jié)合。胺特異性活化PEG可以是上述的任何一種，例如mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酉旨(mPEG-SPA)、mPEG-琥詢酰亞胺丁酸酉旨(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺a-曱基丁酸酯(mPEG-SMB)。PEG部分的分子量將類似于如上所述，例如在大約1kDa至大約20kDa的范圍內(nèi)，諸如大約.1kDa至大約12kDa，例如大約2kDa至大約10kDa,諸如大約4kDa至大約6kDa，例如大約5kDa。例如，活化PEG可以是分子量大約5kDa的mPEG-SPA。聚乙二醇化可以例如在大約7.5-9.0，例如大約8.0-8.5的pH進行。取決于聚乙二醇化期間所用的pH,所選擇的高pH也將類似于上文一般描述的范圍，例如在大約9.2至11.0的范圍內(nèi)，例如大約9.2至H).O。類似地，處于高pH的時間段也可如上所述地選擇，對后續(xù)的純化等也是如此。本文描述的方法為旨在產(chǎn)生均勻和穩(wěn)定聚乙二醇化蛋白的生產(chǎn)方法提供了許多優(yōu)勢，包括該方法簡單快捷，僅需要將pH改變一段有限的時間的單個額外步驟，并且無需另外改變既定生產(chǎn)方法中所用的聚乙二醇化或純化方法。因此，同樣的將pH改變足以去除不穩(wěn)定PEG基團的一段時間的一般方法可用于任何聚乙二醇化蛋白的生產(chǎn)。一般而言，堿性或酸性pH均可用于去除連接于鞋基的不穩(wěn)定PEG部分，其中當pH越呈酸性(對于酸性pH而言)或越呈堿性(對于堿性pH而言)時，不穩(wěn)定PEG部分的脫離發(fā)生得越快。對于實現(xiàn)不穩(wěn)定PE.G脫離的條件，將基于例如具體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，包括PEG部分連接位點的微環(huán)境，來加以選擇。聚乙二醇化G-CSF多肽如上所述，本發(fā)明方法的優(yōu)勢在于，其導(dǎo)致聚乙二醇化多肽的就不同PEG位置異構(gòu)體的數(shù)量而言的均勻性增加。取決于連接基團的數(shù)量和所用的具體聚乙二醇化化學(xué)，所述方法與其它可能手段相比，可以分離到更加均勾，且在貯藏期間更加穩(wěn)定的聚乙二醇化G-CSF。例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相對于野生型人(:-CSF具有取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K的聚乙二醇化G-CSF多肽有可能獲得其中至少大約90-95%的多肽PEG位置異構(gòu)體連接有3個PEG部分的產(chǎn)品。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種包含聚乙二醇化G-CSF多肽變體的PEG位置異構(gòu)體的均質(zhì)混合物的組合物，其中所述混合物中至少大約80%,優(yōu)選至少大約85%，更優(yōu)選至少大約90%,例如至少大約95%的PEG位置異構(gòu)體由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，每一種都具有由兩個結(jié)合于賴氨酸殘基￡-氨基的PEG部分和一個結(jié)合于N末端氨基的PEG部分組成的PEG部分。因此本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K的聚乙二醇化G-CSF多肽，其中所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體連接有3個PEG部分。典型地，連接有3個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體的比例將大于80%,例如至少大約85%或至少大約90%，并且甚至可以更高，例如至少大約91%,至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，或至少大約95%。而在又一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種相對于野生型人G-CSF僅包含取代K16R、K34R、K40R、T1()5K和S159K的聚乙二醇化G-CSF多肽，其中所述多肽的至少8()%的PEG位置異構(gòu)體連接有3個PEG部分。通常而言，連接有3個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體的比例將大于80%,例如至少大約85%或至少大約90%，并且甚至可以更高，例如至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%,至少大約94%,或至少大約95%。在另外的實施方式中，本發(fā)明涉及一種包含聚乙二醇化G-CSF多肽混合物的組合物，所述多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K,其中所述混合物中至少大約80%,優(yōu)選至少大約85%，更優(yōu)選至少大約卯％，例如至少大約95。/。的聚乙二醇化G-CSF多肽由兩種G-CSFPEG位置異構(gòu)體組成，每一種都包含三個PEG基團，其中一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lys23和Lysl59的PEG基團，另一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lysl05和Lysl59的PEG基團。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種包含聚乙二醇化G-CSF多肽混合物的組合物，所述多肽相對于野生型人G-CSF僅包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S〗59K，其中所述混合物中至少大約80%，優(yōu)選至少大約85%，更優(yōu)選至少大約90%,諸如至少大約95%的聚乙二醇化G-CSF多肽由兩種G-CSFPEG位置異構(gòu)體組成，每一種都包含三個PEG基團，其中一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lys23和Lysl59的PEG基團，而另一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lysl05和Lysl59的PEG基團。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的聚乙二醇化G-CSF多肽相對于它們的聚乙二醇化程度而言是高度貯藏穩(wěn)定性的。如下文中實施例所示，這些聚乙二醇化G-CSF多肽的含水制劑(aqueousformuJations)能夠長期貯藏而聚乙二醇化模式大體上沒有改變。所述組合物貯存在5"C的溫度時尤其如此，但令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)即使將所述組合物貯存在25'C或35"C的高溫時其也是相對穩(wěn)定的。因而本發(fā)明的另一方面涉及貯存穩(wěn)定(storage-stable)的聚乙二醇化G-CSF多肽，所述多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K,其中在含水參考組合物中于5。C的溫度貯存3個月之后，所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體連接有3個PEG部分。典型地，于5。C的溫度貯存3個月之后，連接有3個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體的比例將大于80%，諸如至少大約85%或至少大約90%。在某些情況下這個比例甚至可能更高，諸如至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%或至少大約95%。為了測定根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的聚乙二醇化G-CSF多肽的穩(wěn)定性的目的，可如實施例4中所述測試穩(wěn)定性，例如使用其中所述的制劑A、B、C或D之一，尤其是制劑D,作為所述參考組合物。藥用組合物本發(fā)明的另一個方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽的藥用組合物。因此本發(fā)明的一個實施方式涉及一種組合物，其包含藥用載體和聚乙二醇化G-CSF多肽，其中所述多肽相對于野生型人G-CSF(SEQIDNO:1)包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K,并且其中所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體連接有3個PEG部分。典型地，連接有3個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體的比例將是至少大約85%,優(yōu)選至少大約90%,甚至可以更高，例如至少大約91%,至少大約92%,至少大約93%,至少大約94%或至少大約95%。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種藥用組合物，其包含藥用載體和聚乙二醇化G-CSF多肽，其中所述多肽相對于野生型人G-CSF(SEQIDNO:l)僅包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K,并且其中所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體連接有3個PEG部分。典型地，連接有3個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體的比例將是至少大約85%,優(yōu)選至少大約90%,甚至可以更高，例如至少大約91%，至少大約92%,至少大約93%,至少大約94%或至少大約95%。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種藥用組合物，其包含聚乙二醇化G-CSF多肽變體的PEG位置異構(gòu)體的均質(zhì)混合物，其中所述混合物中至少大約80%，優(yōu)選至少大約85%,更優(yōu)選至少大約90%,例如至少大約95%的PEG位置異構(gòu)體由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，每一種都具有由兩個結(jié)合于賴氨酸殘基s-氨基的PEG部分和一個結(jié)合于N末端氨基的PEG部分組成的PEG部分。在本發(fā)明另一實施方式中涉及一種包含藥用載體和聚乙二醇化G-CSF多肽混合物的藥用組合物，所述聚乙二醇化G-CSF多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K，其中在所述混合物中至少大約80%,優(yōu)選至少大約85%,更優(yōu)選至少大約90%,例如至少大約95%的聚乙二醇化G-CSF多肽由兩種PEGG-CSF位置異構(gòu)體組成，每一種都包含三個PEG基團，其中一種異構(gòu)體具有連4妾在N末端、Lys23和Lysl59的PEG基團，而另一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lysl05和Lysl59的PEG基團。而在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種包含藥用載體和聚乙二醇化G-CSF多肽混合物的藥用組合物，所述多肽相對于野生型人G-CSF僅包含取代K16R、K34R、K40R、T1()5K和S159K，其中所述混合物中至少大約80%,優(yōu)選至少大約85%，更優(yōu)選至少大約90%，例如至少大約95%的聚乙二醇化G-CSF多肽由兩種PEGG-CSF位置異構(gòu)體組成，每一種都包含三個PEG基團，其中一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lys23和Lysl59的PEG基團，而另一種異構(gòu)體具有連接在N末端、Lysl05和Lysl59的PEG基團。包含本發(fā)明的G-CSF多肽的藥用組合物可配制成多種形式，例如凍干形式，或優(yōu)選穩(wěn)定的液體制劑，典型的是配制為含水制劑。這些組合物通常包含一種或多種選自下組的成分緩沖劑、防腐劑、等滲劑(isotonicifier)、穩(wěn)定劑、非離子表面活性劑或洗滌劑，和附加的各種賦形劑(excipients)諸如膨脹劑(bulkingagent)或填充劑(fille.r)、螯合劑、抗氧化劑和助溶劑(cosoivent)。G-CSF的合適制劑的一個實例是用于Neulasta(pegfilgrastim)的制劑，其以pH4.0的水溶液提供，每0.6ml包含0.35mg乙酸鹽(acetate)、30.0mg山梨糖醇、0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg鈉。藥用組合物的一個實例是設(shè)計用于腸胃外施用(parenteraladministration)的溶液。盡管在許多情況下藥用溶液制劑是以適于直接使用的液體形式提供的，這些腸胃外制劑也可以冷凍或凍干的形式提供。在前一種情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一種形式通常用來增強所述組合物中所含活性化合物在更多不同貯存條件下的穩(wěn)定性，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員公認凍千制劑通常比它們的液體對應(yīng)物更加穩(wěn)定。在使用之前通過添加一種或多種合適的藥用稀釋劑例如注射用無菌水或無菌生理鹽水來復(fù)原這些凍干制劑。然而，本發(fā)明的組合物優(yōu)選為水溶液的形式。對于腸胃外制劑(parenterals)，將它們制備成凍干制劑或水溶液以便貯存，所述制備是通過適當混合具有期望純度的多肽與一種或多種通常用于本領(lǐng)域的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(其均可稱為"賦形劑")，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子洗滌劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。緩沖劑有助于將pH保持在期望的范圍。它們通常以大約2mM至大約50niM的濃度范圍存在。合適的緩沖劑包括有機和無機酸以及它們的鹽，例如檸檬酸緩沖劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸緩沖劑(例如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸緩沖劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸緩沖劑(例如，延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡糖酸緩沖劑(例如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸緩沖劑(例如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸緩沖劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸緩沖劑(例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能性是磷酸緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三曱胺鹽例如Tris。防腐劑是添加來延緩微生物生長的，并且當存在時通常以大約0.2%-1%(w/v)的量添加。合適的防腐劑包括苯酚、苯曱醇、間曱苯酚(meta-cresol)、對羥基笨曱酸曱酯(methylparaben)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)、氯化十八烷基二曱基千基銨(octadecyldimethylbenzylchloride)、卣化苯曱烴銨(benzalkoniumhalides)(例如氯化笨曱烴銨、溴化苯曱烴銨或碘化苯曱烴4妄)、六甲氯銨(hexamethoniumchloride)、對羥基苯曱酸烷基酯(alkylparabens)例如對羥基苯曱酸曱酯或?qū)αu基苯曱酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。等滲劑是添加來保證液體組合物的等滲性的，包括多羥基糖醇(polyhydricsugaralcohols),優(yōu)選三鞋基或高級糖醇(trihydricorhighersugaralcohols),例如丙三醇(glycerin)、赤蘚糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇(木糖醇)、山梨糖醇(sorbitol)和甘露糖醇(甘露糖醇)?？紤]其它成分相對的量，多鞋基醇可以按重量計在0.1%和25%之間的量存在，通常是1%至5%。穩(wěn)定劑是指一大類可具有不同功能的賦形劑，從膨脹劑到溶解治療劑或有助于防止變性或粘附容器壁的添加劑。典型的穩(wěn)定劑可以是多羥基糖醇(如上列舉)；氨基酸例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-笨丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等;有機糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油(glycerol)等，包括環(huán)多醇例如環(huán)己六醇(inositol);聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、a-—硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即<10個殘基)；蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；單糖例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖例如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖例如棉子糖，和多糖例如葡聚糖。穩(wěn)定劑可以例如基于活性蛋白質(zhì)重量以按重量計從0.1份至IO，OOO份的范圍存在。可以有非離子表面活性劑或洗滌劑(也稱為"潤濕劑")來幫助溶解治療劑以及保護治療用多肽免于攪拌所誘發(fā)的聚集，其還使得所述制劑能夠經(jīng)受剪切表面應(yīng)力(shearsurfecestress)而不引起多肽的變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamers(184、188等)、PJuronic⑧多元醇、聚氧化乙烯山梨聚糖單醚(Tween⑧-20、Tween-80等)。其它可添加的各類賦形劑包括膨脹劑或填充劑(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、曱石危氨酸、維生素E)和助溶劑。在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳狀液、納米顆粒和納米膠嚢)或在大乳狀液(macroemulsion)中，活性成分還可以包埋到通過例如凝聚技術(shù)(coacervationtechinique.)或界面聚合制備的微嚢，例如羥曱基纖維素、明膠或聚(曱基丙烯酸曱酯:)微嚢中。將用于體內(nèi)施用的腸胃外制劑必須是無菌的。這點通過本領(lǐng)域熟知的方法輕易地實現(xiàn)，例如，通過經(jīng)無菌過濾膜的過濾。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽的治療方法和制備藥物的方法。白細胞減少(白細胞水平降低)和中性粒細胞減少(嗜中性粒細胞水平降低)是導(dǎo)致對多種類型感染的易感性增加的病癥。中性粒細胞減少可以是慢性的，例如在感染了HIV的患者中；或是急性的，例如在經(jīng)受化療或放射療法的癌癥患者中。對于患有嚴重中性粒細胞減少，例如由化療產(chǎn)生的嚴重中性粒細胞減少的患者而言，即使相對較小的感染也可能是嚴重的，而且中性粒細胞減少經(jīng)常需要中斷化療方案。本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽尤其適合于下述應(yīng)用預(yù)防或治療正在經(jīng)受某些類型的化療、放射治療和骨髓移植的癌癥患者中的感染，在外周血祖細胞移植中動員祖細胞以便收集，治療嚴重慢性或相對性白細胞減少，治療患有急性髓性白血病的患者，治療AIDS或其它免疫缺陷性疾病，以及抗真菌治療，尤其是用于治療全身性或侵入性念珠菌病。就本發(fā)明而言，"患者"同時包括人和其它哺乳動物，盡管本發(fā)明的治療方法主要旨在治療人類患者。因此本發(fā)明的這個方面涉及在患有或有風(fēng)險患上嗜中性粒細胞水平不足的患者中提高嗜中性粒細胞水平的方法，包括向所述患者施用有效劑量的如上所述的聚乙二醇化G-CSF多肽，或包含該聚乙二醇化G-CSF多肽的如上所述的藥用組合物。在本發(fā)明這個方面的一個實施方式中，患有或有風(fēng)險患上嗜中性粒細胞水平不足的患者是癌癥患者，尤其是正在接受化療或放射療法治療，特別是化療治療的癌癥患者。設(shè)想本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽可用于在患有多種不同類型癌癥的患者中刺激嗜中性粒細胞的產(chǎn)生，所述癌癥包括乳腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮癌、卵巢癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和霍奇金氏病。類似地，設(shè)想將本發(fā)明的多肽施用于接受多種不同類型化療劑中任一種的患者，所述化療劑包括*烷化劑，例如芥子氣衍生物，諸如環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)、苯丁酸氮.芥(Chlorambucil)、異環(huán)石岸酰胺(lfosfemkie)、氮'芥(Mechlorethamine)或美法侖(Melphalan);乙烯亞胺(ethylenimines)，諸如六甲蜜胺(Hexamethylmdamine)或石危替^底(Thiotepa);》克.基石黃酉交鹽(alkylsulfonates)例^口白消安(Busulfan);月并(hydrazines)禾口三。秦(triazines)例^口六曱蜜胺(Altretamine)、達卡巴口秦(Dacarbazine)、丙卡巴月并(Procarbazine)或^^莫口坐月安(Temozolomid.e);亞；肖基/尿(nitrosoureas)例^口卡莫司、-丁(Carmustine)、；各莫司汀(Lomustine)或鏈佐星(Streptozocin);和無才幾金屬絡(luò)合劑例如順賴(Cisplatin)、卡鉑(Carboplatin)或奧沙利輛(Oxaliplatin);植物生物堿，例如紫杉烷類(taxanes)(例如，多西紫杉醇(Docetaxel)或紫杉醇(Paclitaxel))、長春花生物堿(vincaalkaloids)(例如長春石咸(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)或長春瑞濱(Vinorelbine))、喜樹堿類4以4勿(camptothecananalogs)(例^口<尹立考奈康(Irinotecan)或4乇泊4奈乂襲(Topotecan))禾口-鬼臼-桊素(podophyllotoxins)(例,依4乇泊普(Etoposide)j3戈替尼泊苷(Tenisopide));抗腫瘤抗生素，例如蒽環(huán)類(anthracyclines)，例如柔紅霉素(Daunorubicin)、多柔比星(Doxorubicin)、.表來比星(Epirubic.in)、j衣達比星(Idambicin)或米4乇蒽酉昆(Mitoxantrone);色3實-,f:(chromomycins)，例i口方欠線菌素D(Dactinomycin)或普卡霉素(Plicamycin);和其它抗腫瘤抗生素例如博來霉素(Bleomycin)或絲裂霉素(Mitomycin);抗代謝物，例如葉酸拮抗物，例如甲氨蝶呤(Methotrexate);嘧"定拮抗物，例如卡培他濱(Capecitabine)、阿糖胞苦(Cytarabine)、5-氟尿嘧咬(5-Fluorouracil;5-FU)、Foxuridine或吉西他濱(Gemckabine);口票呤拮抗物，例如6-巰基噤呤(6-Mercaptopurine)或6-石克代鳥噤呤(6-Thioguanine);腺香Mi氛酵4卬制齊'j(adenosinedeaminaseinhibitors),例i口克-t立屈濱(Cladribine)、氟達拉濱(Fludarabine)、奈拉濱(Nelarabine)或噴司他丁(Pentostatin);和核糖核苦酸還原酶抑制劑，例如羥基脲(Hydroxyurea);拓樸異構(gòu)酶抑制劑，例如拓樸異構(gòu)酶1.抑制劑(topoisomerase.1inhibitors),例如伊立替康(Ironotecan)或托泊替康；和拓樸異構(gòu)酶II抑制齊'](topoisomeraseIIinhibitors),例^口安口丫口定(Amsacrine)、f衣4乇泊苦、依托泊普石舞商吏(EtoposidePhosphate)或替尼泊苦。本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽將以"有效的"或"治療上有效的"劑量，即相應(yīng)于其施用條件足以產(chǎn)生期望效果的劑量，具體而言在給定條件下足以導(dǎo)致期望的對嗜中'〖生粒細胞的刺激的劑量施用于患者。確切的劑量可能依賴于患者個體和治療的癥狀等因素，并且能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員來決定，典型的是由醫(yī)師(medicaldoctor)來決定。所述聚乙二醇化G-CSF多肽的劑量可以是例如與pegfilgrastim(Neulasta)目前的推薦劑量在大約相同的數(shù)量級，即每個成人患者6mg。因此設(shè)想本發(fā)明的聚乙二醇化G-CSF多肽的合適劑量在大約1mg至大約15mg的范圍內(nèi)，例如大約2mg至大約15mg，例如大約3mg至大約12mg。由此合適的劑量可以是，例如，大約3mg，大約6mg,或大約9mg。在所有情況下，若所述患者是成人或體重至少為45kg,則劑量表示為每個患者的標準劑量?；蛘?，所述劑量可以根據(jù)患者的體重來確定，由此本發(fā)明的G-CSF多肽的合適劑量在大約10叱/kg至大約200嗎/kg，諸如大約25jig/kg至大約150jig/kg,例如大約30嗎/kg至大約120嗎/kg。因而合適的劑量可以是，例如，大約30|ig/kg,大約60|ig/kg，大約90pg/kg或大約120(ig/kg。實施例實施例1部分脫聚乙二醇化G-CSF變體的制備和分析樣品制備和脫聚乙二醇化基本如WO03/006501中所述從CHO-K1細胞制備與野生型人G-CSF(SEQIDNO:])相比具有取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K的G-CSF變體。使用mPEG-SPA5000(Nektai'Therapeutics)將200mL4.5mg/mL的所述G-CSF變體(卯0mgG-CSF)聚乙二醇化。簡而言之，在10分鐘內(nèi)將100mL的1.3.2%(w/w)mPEG-SPA5000溶液添加至200mL的G-CSF溶液中并溫和攪拌以確保充分混合。使樣品在21士3。C、pH8.5溫育44分鐘，伴以溫和的攪拌。接下來使用pH10.0的800mM硼酸母液將所述樣品混合物調(diào)節(jié)至pH9.5。隨后將樣品在21土3。C無攪拌溫育24小時。再將樣品用100mmol/kg檸檬酸、20mmol/kgNaOH、pH2.5稀釋大約2.5倍，至最終pH3.5。部分脫聚乙二醇化G-CSF的分離將pH降低至3.5之后，將所述樣品立即加載至VL44(Millipore)柱子上，其中該柱子填充了大約225mLSP-S印haroseHP(Amersham,GEHealthcare),并用20mmo歐g檸檬酸、15mmol/kgNaOH、pH3.4加以平衡。加載物泮+之后，洗滌柱子以去除未結(jié)合的物料例如游離的mPEG-酸。使用25-100%洗脫緩沖液(20mmol/kg才對蒙酸、20mmol/kgNaOH、200mmoi/kgNaCl、pH3.5)的線性梯度以從柱子上洗脫聚乙二醇化G-CSF。以25個CV(columnvolumes;柱容積)展開所述梯度。柱步驟在21+3。C進行，并且將所用的全部緩沖液調(diào)節(jié)至相同溫度。柱載量(columnload)為4.1mg蛋白質(zhì)/ml樹脂，流速(flow)為8CV/小時。收集樣品大小為40mL的級分并且通過SDS-PAGE加以分析?；赟DS-PAGE分析，制成相應(yīng)于大約6.5CV的1440mL的集合產(chǎn)物，其主要包含每個G-CSF分子附有3個PEG基團的分離的G-CSF。預(yù)期通過提高洗脫梯度的陡度(steepness)可降低所述集合產(chǎn)物的體積。將集合產(chǎn)物滲濾至大約200mL，接著在10mM乙酸鈉，43mg/mL甘露糖醇，pH4.0中滲濾，然后使用裝有兩個分子量截留(molecularweightcutoffiMWCO)為30kDa的50cm2MilliporePelliconXL膜的MilliporeLabScaleTFF-system濃纟宿至4.9mg/mL結(jié)果將所述集合產(chǎn)物超濾和滲濾到10mM乙酸鈉、43mg/ml甘露糖醇、pH4.0中，并且進行物理化學(xué)表征。圖1顯示如上所述聚乙二醇化、部分脫聚乙二醇化和純化的G-CSF變體的SDS-PAGE分析的掃描圖，所示七個泳道如下1分子量標記2聚乙二醇化之后3pH9.5，T=0小時4pH9.5，T:24小時5施加于陽離子交換柱時6陽離子交換的穿透液(flowthrough)7純化的產(chǎn)物泳道7中觀察到單一的主帶，相應(yīng)于每個多肽分子攜帶3個mPEG-SPA5000基團的G-CSF變體。此外，在泳道7中還^見察到相應(yīng)亍攜帶4個mPEG-SPA5000基團的G-CSF的小帶。如有需要，利用本領(lǐng)域公知方法對所述純化方法進行最優(yōu)化或調(diào)整，將可減少或基本上消除這條相應(yīng)于4個PEG基團的小帶，盡管這樣做將導(dǎo)致產(chǎn)率根據(jù)所需的純度而稍有降低。這種方法的產(chǎn)率是450mg純化的、每個多肽分子主要攜帶3個PEG基團且部分脫聚乙二醇化G-CSF,相當于總產(chǎn)率為50%。實施例2部分脫聚乙二醇化G-CSF變體的制備和分析樣品制備、脫聚乙二醇化和純化基本如上實施例1中所述，從CH0-K1細胞制備與野生型人G-CSF(SEQIDNO:1)相比具有取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K的G-CSF變體，然后使用mPEG-SPA5000將其聚乙二醇化，產(chǎn)生29mL3.5mg/mL的聚乙二醇化G-CSF變體。使用裝有10kDaMWCO濾器的Vivaspin過濾設(shè)備將其滲濾至150mM硼酸鈉、pH9.5中。最終樣品濃度是4.7mg/mL。隨后將樣品在21士3。C溫育42小時。溫育之后，使用30mM檸檬酸、10mMNaOH、pH2.9稀釋樣品以備陽離子交換層析。隨后將樣品施加到填充有28mLSP-SepharoseHP樹脂的XK16/20柱(AmershamBiosciences)。在加樣之前，用20mM檸檬酸、15mMNaCl、pH3.5的平衡緩沖液平衡柱子。加樣之后，用相同的緩沖液洗滌柱子，再使用20mM檸檬酸、pH3.5中從15mM至200mMNaCl的線性梯度進行洗脫，以分離不同種類的聚乙二醇化物。將級分收集至試管中并通過SDS-PAGE分析?；赟DS-PAGE分析制成包含主要含3個連接的PEG部分的聚乙二醇化G-CSF變體的集合產(chǎn)物。使用帶有10kDa的MWCO的Vivaspin過濾設(shè)備對此集合產(chǎn)物進行滲濾并更換緩沖液。將樣品滲濾至10mM琥珀酸鈉，43mg/mL甘露糖醇，pH4.0中，并且最終濃縮至3.0mg/mL。位置異構(gòu)體分析使用結(jié)合唾液酸酶預(yù)處理的陽離子交換HPLC(CIEX-HPLC),獲得了關(guān)于包含多種聚乙二醇化物的集合產(chǎn)物中不同PEG位置異構(gòu)體之組成的數(shù)據(jù)。除了聚乙二醇化之后因存在不同位置異構(gòu)體所致的異質(zhì)性之外，聚乙二醇化G-CSF的異質(zhì)性還因為其包含一個0-糖基化位點(Thr133)，所述位點可連接有0、l或2個唾液酸基團。為了減少色譜中由于不同數(shù)量的唾液酸基團所致的山奪的數(shù)量，在分析之前引入唾液酸酶預(yù)處理步驟。唾液酸酶預(yù)處理如下進行首先，如有必要，用50mM:乙酸鈉緩沖液(pH5.0)將G-CSF溶液稀釋至1mg/ml，之后每嗎蛋白添加0.05pl(0.25mUnit)的唾液酸酶，再將樣品在37°C溫育18小時以去除唾液酸。隨后在同一天分析樣品或?qū)悠繁４嬖?°C直到分析當日。使用PolySULFOETHYLA頂陽離子交換HPLC柱(PolyLCInc.)進行HPLC,在24nm進行UV檢測。從PolySULFOETHYLAC[EX柱手動收集之后，通過SDS-PAG-E分析進行不同峰的表征。結(jié)果——PEG損失通過SDS-PAGE分析緩沖液更換的樣品以評估作為時間的函數(shù)的PEG損失程度。結(jié)果(參見圖2)類似于圖1所示的實施例的結(jié)果，整體聚乙二醇化程度在溫育24或42小時的樣品之間(圖2,泳道4和5)僅觀察到極小的改變。結(jié)果一一集合產(chǎn)物中位置異構(gòu)體的評估圖3顯示如上所述獲得的本發(fā)明的部分脫聚乙二醇化集合產(chǎn)物的陽離子交換層析圖，所述集合產(chǎn)物根據(jù)SDS-PAGE判斷主要包含三個PEG5000基團。兩個主峰各代表一種攜帶三個PEG5000基團的主要位置異構(gòu)體。三個小峰代表兩種攜帶四個PEG基團的位置異構(gòu)體和一種攜帶兩個PEG基團的位置異構(gòu)體。收集兩種主山奪并進行天然肽圖i普分析(nativepeptidemapanalysis)以測定連接PEG基團的位置。發(fā)現(xiàn)兩種主要位置異構(gòu)體在以下氨基酸殘基上被聚乙二醇化異構(gòu)體A:N末端、Lys23和Lys159異構(gòu)體B::N末端、Lysl05和Lys.159這兩種主要異構(gòu)體代表了樣品中存在的超過95。/。的位置異構(gòu)體。實施例3比較例為了進行比較，圖4顯示純化的、未進行本發(fā)明的脫聚乙二醇化的聚乙二醇化G-CSF變體的陽離子交換層析圖。這種情況下的G-CSF變體如以上實施例1和2中所述一樣，與天然人G-CSF相比也具有相同的五個取代，即K16R、K34R、K40R、T105K和S159K。該G-CSF變體基本上如實施例1中所述制備并用mPEG-SPA5000聚乙二醇化，^旦不對其進行pH9.5條件下的溫育以去除不穩(wěn)定PEG部分。結(jié)果，所述聚乙二醇化變體包含許多不同的連接有2-6個PEG部分的PEG異構(gòu)體混合物?；旧先鐚嵤├?中所述使用陽離子交換層析純化該位置異構(gòu)體混合物,，分離主要含有4-5個連接的PEG部分的級分，基本上如實施例1中所述加以超濾和滲濾，然后對其進行如上所述的CIEX-HPLC分析。這種級分相當于實施例1和2中所述的3PEG級分，但相對于部分脫聚乙二醇化的3PEG產(chǎn)物，它在一個或兩個位置連接有額外的(不穩(wěn)定的)PEG基團，也就是說，在這種情況下純化的產(chǎn)物主要包含4-5個連^f妻的PEG基團。與根據(jù)本發(fā)明制備的部分脫聚乙二醇化產(chǎn)物(組成示于圖3)相比，圖4所示的產(chǎn)物明顯是更加復(fù)雜和異質(zhì)的混合物。圖3中根據(jù)本發(fā)明制備的產(chǎn)物包含超過95。/。的兩種各具有3個PEG部分的主要的位置異構(gòu)體，而圖4所示產(chǎn)物包含六種主要的位置異構(gòu)體，每種均連接有4或5個PEG部分。這六種4-5PEG位置異構(gòu)體在Ser66或Tyrl65中一處或兩處包含不穩(wěn)定PEG部分(數(shù)據(jù)未顯示)，并且在N末端和位置K23、K105和K159中一處或兩處包含穩(wěn)定PEG部分。由于位阻作用，單個G-CSF多肽上所有這些位置并非都可4皮PEG部分所占據(jù)。因此圖4所示產(chǎn)物包含以下六種主要的PEG異構(gòu)體的異質(zhì)混合物N末端、K23、S66、K159、Y165(5-PEG)N末端、S66、K105、K159、Y165(5-PEG)'N末端、K23、S66、K159(4-PEG)N末端、K23、S66、Y165(4-PEG)N末端、S66、K105、K159(4-PEG)N末端、S66、K105、Y165(4-PEG)實施例4穩(wěn)定性數(shù)據(jù)在儲存于四種不同溫度的不同含水制劑中測試了連接的PEG部分的穩(wěn)定性。多肽是具有實施例1中所列五個取代的G-CSF變體，且同樣如實施例中所述進行制備、聚乙二醇化，并且加以部分脫聚乙二醇化繼而純化。所測試的制劑如下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>各制劑的pH均是4.0。在26天、56天和89天之后使用CIEX-HPLC測定各樣品中的PEG異構(gòu)體分布以研究聚乙二醇化的穩(wěn)定性。結(jié)果示于下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>以上結(jié)果顯示，與制劑和貯存溫度無關(guān)，聚乙二醇化是高度穩(wěn)定的；第26、56或89天取樣時在所有溫度下3PEG異構(gòu)體所占比例均非常接近95%。從表中顯而易見的唯一差別是主要對于貯存在25"C或35"C的樣品而言，使用-80。C數(shù)據(jù)作為參考，隨著時間的推移其它/未表征形式的比例稍有降低，并且這些樣品的2PEG異構(gòu)體的比例相應(yīng)增加。相比之下，下表顯示的是在與上述類似的制劑中的相同的G-CSF變體，但不經(jīng)過本發(fā)明的脫聚乙二醇化步驟而制備，即對應(yīng)于上文對比例3中所述的產(chǎn)物，貯存20和83天之后測得的類似數(shù)據(jù)。這種情況下的制劑具有4.0的pH，由15mM乙酸鈉、45mg/ml甘露糖醇和5mg/ml的聚乙二醇化G-CSF變體組成，在實驗開始時主要(98-99%)包含4-5個連接的PEG部分。下表顯示的是于83天后在所示四個溫度下測定的PEG異構(gòu)體(isoform)分布，以及20天后在其中兩個溫度下的PEG異構(gòu)體分布?？梢娰A存于5。C時，包含4-5PEG部分的G-CSF多肽的比例在83天后僅稍許降低，但貯存于25。C時4-5PEG異構(gòu)體有顯著的損失而3PEG異構(gòu)體相應(yīng)地增加，而在35。C時有大得多的4-5PEG異構(gòu)體損失和相應(yīng)的3PEG異構(gòu)體增加。這說明在沒有本發(fā)明的脫聚乙二醇化方法的情況下，當貯存在含水制劑中時，如上制備的聚乙二醇化G-CSF多肽所包含的不穩(wěn)定PEG基團將隨著時間的推移以依賴于溫度的方式從多肽脫離。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>為了闡述清晰且易于理解，在上文中對本發(fā)明進行了詳細描述，盡管如此，對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員顯而易見的是，通過閱讀本發(fā)明的公開文本，可在不背離本發(fā)明真實范圍的前提下對形式和細節(jié)進行各種修改。應(yīng)該理解的是，本文所描述的實例和實施方式僅出于說明性目的，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將對其提出各種明顯的修飾或改變，而這些修飾或改變將被包括在本申請和所附權(quán)利要求的宗旨和范圍內(nèi)。在此引證本申請引用的全部公開文獻、專利、專利申請和/或其它文獻的全部內(nèi)容以用于所有目的，相當于分別單獨引證所述公開文獻、專利、專利申請和/或其它文獻的全部內(nèi)容以用于所有目的。序列表SEQIDNO:l-人G-CSFThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeuLys151015CysLeuGluGinValArgLyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeuGin202530GluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuVal354045LeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSerCys505560ProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHisSer65707580GlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylieSer859095ProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspValAlaAsp100105110PheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAlaPro115120125AlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe130135140GinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSerPhe145150155160LeuGluValSerTyrArgVaiLeuArgHisLeuAlaGinPro165170權(quán)利要求1.一種增加聚乙二醇化G-CSF多肽穩(wěn)定性和均勻性的方法，所述多肽具有至少一個連接于賴氨酸殘基ε-氨基或N末端氨基的PEG部分和至少一個連接于羥基的PEG部分，所述方法包括以一段適合于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述多肽施加8.0以上的高pH，再將pH降低至大約8.0或更低。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述高pH在大約8.5至大約10.5的范圍內(nèi)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述高pH在大約9.0至大約IO.O的范圍內(nèi)。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述高pH在大約9.2至大約9.8的范圍內(nèi)，例如大約9.5。5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中以大約2小時至大約100小時的時間對所述多肽施加高pH。6.權(quán)利要求5的方法，其中以大約4小時至大約72小時的時間對所述多肽施加高pH。7.權(quán)利要求6的方法，其中以大約8小時至大約48小時的時間對所述多肽施加高pH。8.權(quán)利要求7的方法，其中以大約12小時至大約30小時的時間對所述多肽施加高pH。9.前述權(quán)利要求任一項的方法，進一步包括對所述處于降低的pH的多肽施加至少一個層析純化步驟。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述層析純化步驟是離子交換層析。11.權(quán)利要求10的方法，其中將pH降低至大約7.0以下，并且其中所述層析純化步驟是陽離子交換層析。12.權(quán)利要求9的方法，其中所述層析純化步驟是凝膠過濾層析。13.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述降低的pH在大約2.0至大約5.0的范圍內(nèi)。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述降低的pH在大約2.5至大約4.5的范圍內(nèi)。15.—種產(chǎn)生聚乙二醇化G-CSF多肽的方法，包括使G-CSF多肽與胺特異性活化聚乙二醇(PEG)進行聚乙二醇化反應(yīng)以產(chǎn)生聚乙二醇化G-CSF多肽中間體，隨后以一段適合于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述聚乙二醇化多肽中間體施加至少大約9.0的高pH,以產(chǎn)生聚乙二醇化G-CSF多肽。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述聚乙二醇化反應(yīng)在大約7.0-9.0的pH范圍進行。17.權(quán)利要求15的方法，其中所述聚乙二醇化反應(yīng)在pH9.0以上進行。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述聚乙二醇化反應(yīng)和隨后對連接于羥基的PEG部分的去除是作為單一步驟在單一pH值進行的。19.權(quán)利要求15的方法，其中所述胺特異性活化PEG是mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酉旨(mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺a-曱基丁酸酯(mPEG-SMB)。20.權(quán)利要求15的方法，其中所述胺特異性活化PEG是具有大約5kDa分子量的mPEG-SPA。21.權(quán)利要求15的方法，其中所述高pH在大約9.2至大約11.0的范圍內(nèi)。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述高pH在大約9.2至大約10.0的范圍內(nèi)。23.通過前述權(quán)利要求任一項的方法產(chǎn)生的聚乙二醇化G-CSF多肽。24.權(quán)利要求23的聚乙二醇化G-CSF多肽，其中所述多肽是相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K的G-CSF變體。25.—種組合物，其包含聚乙二醇化G-CSF多肽的PEG位置異構(gòu)體的混合物，其中所述多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K,并且其中所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體是連接有三個PEG部分的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述多肽的至少大約85%的PEG位置異構(gòu)體是連接有三個PEG部分的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體。27.權(quán)利要求25的組合物，其中所述多肽的至少大約90%的PEG位置異構(gòu)體是連接有三個PEG部分的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體。28.權(quán)利要求25的組合物，其中所述連接有三個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體中的至少大約80%由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，其中一種PEG位置異構(gòu)體在N末端、Lys23和Lysl59連4^有PEG部分，另一種PEG位置異構(gòu)體在N末端、Lysl05和Lysl59連接有PEG部分。29.權(quán)利要求26的組合物，其中所述連接有三個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體中的至少大約85%由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，其中一種PEG位置異構(gòu)體在N末端、Lys23和Lysl59連接有PEG部分，另一種PEG位置異構(gòu)體在N末端、Lys105和Lys159連接有PEG部分。30.權(quán)利要求27的組合物，其中所述連接有三個PEG部分的PEG位置異構(gòu)體中的至少大約90%由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，其中一種PEG位置異構(gòu)體在N末端、Lys23和Lysl59連4妾有PEG部分，另一種PEG位置異構(gòu)體在N末端、Lys105和Lys159連接有PEG部分。31.—種組合物，其包含聚乙二醇化G-CSF多肽的PEG位置異構(gòu)體的混合物，其中所述多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K，且其中在含水參考組合物中于5°C的溫度貯存3個月之后，所述多肽的至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體是連接有3個PEG部分的賴氨酸/N-末端PEG位置異構(gòu)體。32.—種組合物，其包含藥用載體和根據(jù)權(quán)利要求23或24的聚乙二醇化G-CSF多肽或根據(jù)權(quán)利要求25-31任一項的組合物。33.—種產(chǎn)生重組G-CSF多肽的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的混合物的方法，所述多肽相對于野生型人G-CSF包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K，所述方法包4舌a)在宿主細胞中表達重組G-CSF多肽；b)分離所述重組G-CSF多肽；c)使分離的重組G-CSF多肽與胺特異性活化PEG反應(yīng)以產(chǎn)生所述重組G-CSF多肽的多種PEG位置異構(gòu)體；和d)將所述多種PEG位置異構(gòu)體在pH8.5-10.5反應(yīng)以產(chǎn)生所述重組G-CSF多肽的多種部分脫聚乙二醇化賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述胺特異性活化PEG選自下組mPEG-琥珀酰亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(mPEG-SBA)或mPEG-琥珀酰亞胺a-曱基丁酸酯(mPEG-SMB)。35.權(quán)利要求33或34的方法，進一步包括對所述重組G-CSF多肽的多種賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體施以一個或多個層析純化步驟，以產(chǎn)生該重組G-CSF多肽的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的基本上純化的混合物。36.權(quán)利要求35的方法，進一步包括將所述重組G-CSF多肽的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的基本上純化的混合物以有效劑量與至少一種藥用賦形劑組合，以產(chǎn)生藥用組合物。37.通過權(quán)利要求33的方法產(chǎn)生的多種部分脫聚乙二醇化賴氨S吏/N末端PEG位置異構(gòu)體。38.通過權(quán)利要求35的方法產(chǎn)生的賴氨酸/N末端PEG位置異構(gòu)體的基本上純化的混合物。39.通過權(quán)利要求36的方法產(chǎn)生的藥用組合物。40.—種在患有或有風(fēng)險患上嗜中性粒細胞水平不足的患者中提高嗜中性粒細胞水平的方法，包括對所述患者施用有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求23或24的聚乙二醇化G-CSF多肽或根據(jù)權(quán)利要求25-32或36-39任一項的組合物。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述嗜中性粒細胞水平不足是化療或放射治療的結(jié)果。42.根據(jù)權(quán)利要求23或24的聚乙二醇化G-CSF多肽或根據(jù)權(quán)利要求25-32或36-39任一項的組合物在制備用于在患有或有風(fēng)險患上嗜中性粒細胞水平不足的患者中4是高嗜中性粒細胞水平的藥物中的用途。43.根據(jù)權(quán)利要求42的用途，其中所述嗜中性粒細胞水平不足是化療或放射治療的結(jié)果。44.一種組合物，其包含聚乙二醇化G-CSF多肽變體的PEG位置異構(gòu)體的均質(zhì)混合物，其中所述混合物中至少大約80%的PEG位置異構(gòu)體由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，每一種都具有由兩個結(jié)合于賴氨酸s-氨基的PEG部分和一個結(jié)合于N末端氨基的PEG部分組成的PEG部分。45.權(quán)利要求44的組合物，其中所述均質(zhì)混合物中至少大約85%的PEG位置異構(gòu)體由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，每一種都具有由兩個結(jié)合于賴氨酸s-氨基的PEG部分和一個結(jié)合于N末端氨基的PEG部分組成的PEG部分。46.權(quán)利要求44的組合物，其中所述均質(zhì)混合物中至少大約90%的PEG位置異構(gòu)體由兩種PEG位置異構(gòu)體組成，每一種都具有由兩個結(jié)合于賴氨酸s-氨基的PEG部分和一個結(jié)合于N末端氨基的PEG部分組成的PEG部分。47.—種組合物，其包含藥用載體和根據(jù)權(quán)利要求44-46任一項的組合物。48.—種用于在患有或有風(fēng)險患上嗜中性粒細胞水平不足的患者中提高嗜中性粒細胞水平的方法，包括對所述患者施用有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求44_46任一項的組合物。49.權(quán)利要求44-46任一項的組合物在制備財"有或有餘患上嗜中性粒細胞水平不足的患者中提高嗜中性粒細胞水平的藥物中的用t全文摘要本發(fā)明涉及用于增加聚乙二醇化G-CSF多肽穩(wěn)定性和均勻性的方法，所述多肽具有至少一個連接于賴氨酸殘基ε-氨基或N末端氨基的PEG部分和至少一個連接于羥基的PEG部分，所述方法包括以一段適合于去除連接于羥基的PEG部分的時間對所述多肽施加8.0以上的高pH，再將pH降低至大約8.0或更低；本發(fā)明還涉及根據(jù)所述方法產(chǎn)生的聚乙二醇化G-CSF多肽和組合物，以及使用所述聚乙二醇化G-CSF多肽和組合物增加患者中嗜中性粒細胞水平的方法。文檔編號A61K47/48GK101193658SQ200680019558公開日2008年6月4日申請日期2006年5月26日優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日發(fā)明者博比·索尼,卡斯滕·杰曼森,格雷思·拉斯馬森申請人:馬克西根控股公司