專利名稱：：使用可溶性ctla4突變型分子治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可溶性CTLA4突變型分子在與移植物移植有關(guān)的免疫病癥治療中的用途，與野生型CTLA4比較所述可溶性CTLA4突變型分子與CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的結(jié)合抗體親抗原性增加。
背景技術(shù)：
：考慮到T細(xì)胞在移植排斥中的重要作用，目前免疫抑制療法中的一個(gè)共同目標(biāo)是阻斷T細(xì)胞激活和功能(SayeghMH，TurkaLA.TheroleofT-cellcostimulatoryactivationpathwaysintransplantrejection.NEnglJMed1998;338(25):1813-21)。T細(xì)胞需要抗原特異性(信號1)和共刺激信號(信號2)兩者用于完全激活(LenschowDJ,WalunasTL，BluestoneJA.CD28/B7systemofTcellcostimulation.AnnuRevImmunol1996;14:233-58)。最佳表征的共刺激途徑之一涉及CD28-CD80/86(B7—1/2)相互作用(LinsleyPS,LedbetterJA.TheroleoftheCD28receptorduringTcellresponsestoantigen.AnnuRevImmunol1993;11:191-212)。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA4)以比CD28更高的抗體親抗原性結(jié)合CD80/86，并且在其激活后瞬時(shí)表達(dá)在T細(xì)胞上，在其中它中斷CD"和CDS0/86之間的一目互4乍用(OosterwegelMA,GreenwaldRJ，MandelbrotDA,LorsbachRB，SharpeAH.CTLA-4andTcellactivation.CurrOpinImmunol1999;11(3):294-300)。這產(chǎn)生了對于T細(xì)胞激活的負(fù)反饋信號。先前已使用CTLA4Ig尋求這個(gè)途徑中的干涉。CTLA4Ig已成功地用作治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性病癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(KremerJM,WesthovensR,LeonM，等人，TreatmentofrheumatoidarthritisbyselectiveinhibitionofT-cellactivationwithfusionproteinCTLA4Ig.NEnglJMed2003;349(20):1907-15)和牛皮癬(Ab麗sJR,LebwohlMG，GuzzoCA，等人，CTLA4Ig-mediatedblockadeofT-cellcostimulationinpatientswithpsoriasisvulgaris.JClinInvest1999;103(9):1243-52)的策略。LEA29Y已在非人靈長類動(dòng)物移植模型中單獨(dú)以及與其他免疫抑制劑組合進(jìn)行研究。ChristianLarsen等人(C.Larsen,T.Pearson,A.Adams,P.Tso，N.Shirasugi,E.Strobert，D,Anderson,S.Cowan，K.Price,J.Naemura,J.Emswiler,J.Greene，L.A.Turk,J.Bajorath，R.Townsend,D.Hagerty,P.Linsley和R.Peach;RationalDevelopmentofLEA29Y(belatacept),aHigh—AffinityVariantofCTLA4—IgwithPotentImmunosuppressiveProperties;AmericanJournalofTransplantation;第5巻，Issue3,March2005，第443頁)已顯示在用于研究腎同種異體移植排斥的非人靈長類動(dòng)物模型中與CTLA4-Ig比較時(shí)，LEA29Y的免疫抑制活性增強(qiáng)。LEA29Y在手術(shù)中(10mg/kg，靜脈內(nèi))、在第4天時(shí)(15mg/kg)以及在手術(shù)后第14、28、42、56和70天時(shí)(20mg/kg,靜脈內(nèi))施用。CTLA4Ig(16mg/kg)在手術(shù)中以及在手術(shù)后第4、8、11和16天時(shí)施用。治療方案還包括MMF(15mg/kg,在第0-14天時(shí)每天2次皮下，在第15-180天時(shí)每日)、曱基強(qiáng)的松龍(根據(jù)下列時(shí)間表皮下(subcutaneouse)注射，第O天20mg，第1天16mg，第3天8mg，第4天4mg，第5-14天3mg，第15-180天1mg)和巴利昔單抗(basiliximab)(0.3gm/kg,在第0和4天時(shí)靜脈內(nèi))。盡管血清濃度相當(dāng)，但用LEA29Y治療的腎同種異體移植受體的存活明顯優(yōu)于用CTLA4-Ig治療組的那種。用清蛋白治療的對照受體顯示與用CTLA4-Ig治療組類似的中值存活時(shí)間。然而，盡管正在進(jìn)行使用LEA29Y的治療，但所有受體經(jīng)歷腎功能的顯著衰退(血清肌酸酐升高)。AndrewAdams等人(A.Adams,N.Shirasugi，T.Jones,M.Durham,E.Strobert,S.Cowan,P.Rees,R.Hendrix，K.Price,N.Kenyon，D，Hagerty，R.Townsend,D.Hollenbaugh，T.Pearson和C.Larsen;DevelopmentofaChimericAnti-CD40MonoclonalAntibodyThatSynergizeswithLEA29YtoProlongIsletAllograftSurvival;TheJournalofImmunology;Jan2005;174;第542頁)已顯示LEA29Y和Chi220(嵌合抗人CD40mab)的組合在胰島移植的非人靈長類動(dòng)物模型中協(xié)同作用以延長同種異體移植物的存活。LEA29Y在手術(shù)中(20mg/kg);在手術(shù)后第4、7和14天時(shí)；隨后每2周靜脈內(nèi)施用直至第100天。另外的劑量(20mg/kg)每月施用1次經(jīng)過6個(gè)月。測試4種方案1)單獨(dú)的LEA29Y，2)Chi220(抗CD40),3)LEA29Y與Chi220組合，和4)LEA29Y與抗CD20組合。AndrewAdams等人(A.Adams,N.Shirasugi,M.Durham,E.Strobert,D.Anderson,P.Rees,S.Cowan,H.Xu,Y.Blinder,M.Cheung,D.Hollenbaugh,N.Kenyon，T.Pearson和C.Larsen;CalcineurinInhibitor-FreeCD28Blockade-BasedProtocolProtectsAllogeneicIsletsinNonhumanPrimates;Diabetes,第51(2)巻,February2002,第265頁)已顯示在胰島移植的非人靈長類動(dòng)物模型中LEA29Y、雷帕霉素和抗-IL-2RmAb的組合顯著延長胰島同種異體移植物的存活。LEA29Y在手術(shù)中(10mg/kg)和在手術(shù)后第4天時(shí)(15mg/kg)靜脈內(nèi)施用。另外的20mg/kg劑量在手術(shù)后第14天時(shí)和每2周給予直至手術(shù)后第154天。在2003年期間，在美國移植了超過25,000個(gè)器官。腎移植代表大約60%的實(shí)體器官移植，隨后為21%的肝移植，8%的心臟、4%的肺，并且剩余的7%代表其他器官移植例如胰和腸。(在www.optn.org上的OPTN/SRTRAnnualReport2004)。腎移植是關(guān)于終末期腎病的最有效治療。它提供了改善的存活和生活質(zhì)量(QoL)。功能腎移植的維持要求終生免疫抑制療法以防止移植物的免疫破壞。當(dāng)前的免疫抑制方案產(chǎn)生對于尸體89%以及對于活供體移植物94%的l年存活率。然而，隨著時(shí)間過去，存在受試者和移植物兩者的漸進(jìn)性丟失。對于尸體和活相關(guān)供體腎移植的5年存活分另l]為66%和79%。(在www.unos.org上的UnitedNetworkforOrganSharingRenalTransplantRegistry2003)長期受試者和移植物丟失的最常見原因分別是心血管疾病和慢性同種異體移才直物腎病(CAN)。(L.C.Paul,Chronicallograftnephropathy-AmodelofimpairedrepairrominjuryNephrolDialTransplant2000;15:149-151)荒謬的是，關(guān)于腎移植的主要療法-鈣依賴磷酸酶抑制劑(CNIs)、CsA和他克莫司直接促成長期同種異體移植物丟失和受試者死亡，因?yàn)樗鼈儽緛砭褪悄I毒性的，并且還引起或加劇心血管危險(xiǎn)，包括高血壓、高膽固醇血癥和糖尿病。雖然如此，但是這些試劑形成了關(guān)于腎移植的所有常規(guī)免疫抑制方案的基礎(chǔ)。目前，沒有批準(zhǔn)的試劑可以代替CNIs作為在廣泛范圍的受試者中維持免疫抑制劑療法的基礎(chǔ)。一種試劑西羅莫司(雷帕霉素，來自Wyeth/Ayerst的Rapamune)已被批準(zhǔn)用于在CNI-節(jié)制方案中使用。然而，對于移植后至少3個(gè)月CNIs仍必須與西羅莫司一起使用。更重要的是，只在受試者處于移植物丟失的低至中等危險(xiǎn)中的背景下西羅莫司已被批準(zhǔn)作為CNI-節(jié)制劑。因此，對于處于移植物丟失較高危險(xiǎn)中、其CNIs腎毒性作用的避免將具有最大利益的那些，沒有關(guān)于CNIs的批準(zhǔn)的替代物。因此，存在對于免疫抑制劑的未滿足的醫(yī)學(xué)需要，其可以提供與期受試者死亡和移植物丟失的毒性。理想地，該試劑將不僅在低危險(xiǎn)的受試者中有用，還在處于移植物丟失的較高危險(xiǎn)中的受試者中有用。發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過施用CTLA4突變型分子治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，所述CTLA4突變型分子與CD80和/或CD86抗原結(jié)合的抗體親抗原性大于野生型CTLA4或非突變型CTLA4Ig。CTLA4分子具有包括CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的第一種氨基酸序列，其中在S25-R33區(qū)和M97-G107區(qū)內(nèi)的某些氨基酸殘基是突變的。本發(fā)明的突變型分子還可以包括增加突變型分子溶解性的第二種氨基酸序列。CTLA4突變型分子的一個(gè)例子是如本文描述的L104EA29YIg(圖7，SEQIDNOS:3和4)。CTLA4突變型分子的另一個(gè)例子是如本文描述的L104EIg(圖8,SEQIDNOS:5和6)。L104EA29YIg和L104EIg比CTLA4Ig以更高抗體親抗原性結(jié)合CD80和CD86。本發(fā)明的CTLA4突變型分子的施用可以經(jīng)過各種時(shí)間進(jìn)行。一般地，施用方案包括其中在最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)期過程中劑量較高且施用頻率增加的早期，隨后為維持期。早期可以是移植后的前3-6個(gè)月。在早期過程中的施用方案可以依受體/移植物的狀態(tài)而變。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，所述CTLA4突變型分子具有如SEQIDNO:8中所示、起始于第26位的丙氨酸或第27位的甲硫氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。另外，在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分中第55位的丙氨酸由酪氨酸置換，并且第130位的亮氨酸由谷氨酸置換。此外施用方案包括早期方案，其中早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月l次更頻繁的施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，所述CTLA4突變型分子具有SEQIDNO:4的起始于第27位的甲硫氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的氨基酸序列，或具有SEQIDNO:4的起始于第26位的丙氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的氨基酸序列。此外CTLA4突變型分子施用方案包括早期方案，其中早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月1次更頻繁的施用。附圖簡述圖1顯示了L104EA29YIg、L104EIg和野生型CTLA4Ig與CD86Ig的平衡結(jié)合分析。圖2A和2B舉例說明了來自FACS測定的數(shù)據(jù)，顯示了如下文實(shí)施例2中所述L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig與人CD80-或CD86-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的結(jié)合。圖3A和3B描述了如下文實(shí)施例2中所述CD80-陽性和CD86-陽性CHO細(xì)胞的增殖抑制。圖4A和4B顯示如下文實(shí)施例2中所述在抑制初級和次級同種刺激的(allostimulated)T細(xì)胞增殖方面，L104EA29YIg比CTLA4Ig更有效。圖5A-C舉例說明了如下文實(shí)施例2中所述在抑制同種刺激的人t細(xì)胞的IL-2(圖5A)、IL-4(圖5B)和y-干擾素(圖5C)細(xì)胞因子生產(chǎn)方面，LI04EA29YIg比CTLA4Ig更有效。圖6證實(shí)了如下文實(shí)施例2中所述在抑制植物凝集素(PHA)刺激的猴T細(xì)胞增殖方面，L104EA29YIg比CTLA4Ig更有效。圖7(SEQIDNOS:3和4)描述了如下文實(shí)施例1中所述的CTLA4突變型分子("L104EA29YIg")的核苷酸和氨基酸序列，其包括信號肽；起始于第+1位的曱硫氨酸且終止于第+124位的天冬氨酸、或起始于第-1位的丙氨酸且終止于第+K4位的天冬氨酸的CTLA4突變細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；和Ig區(qū)。SEQIDNOS:3和4分別描述了CTLA4突變型分子("L104EA29YIg")的核苷酸和氨基酸序列，其包括信號肽；起始于第+27位的甲硫氨酸且終止于第+150位的天冬氨酸、或起始于第+26位的丙氨酸且終止于第+150位的天冬氨酸的CTLA4突變細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；和Ig區(qū)。圖8(SEQIDNOS:5和6)描述了如下文實(shí)施例1中所述的CTLA4突變型分子("L104EIg")的核苷酸和氨基酸序列，其包括信號肽；起始于第+1位的曱硫氨酸且終止于第+124位的天冬氨酸、或起始于第-l位的丙氨酸且終止于第+124位的天冬氨酸的CTLA4突變細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；和Ig區(qū)。SEQIDNOS:5和6分別描述了CTLA4突變型分子("L104EIg")的核苷酸和氨基酸序列，其包括信號肽；起始于第+27位的曱石危氨酸且終止于第+150位的天冬氨酸、或起始于第+26位的丙氨酸且終止于第+150位的天冬氨酸的CTLA4突變細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；和Ig區(qū)。圖9(SEQIDNOS:7和8)描述了CTLA4Ig的核苷酸和氨基酸序列，其具有信號肽；起始于第+1位的甲硫氨酸至第+124位的天冬氨酸、或起始于第-1位的丙氨酸至第+124位的天冬氨酸的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的野生型氨基酸序列；和Ig區(qū)。SEQIDNOS:7和8分別描述了CTLA4Ig的核普酸和氨基酸序列，其包括信號肽；起始于第+27位的曱硫氨酸且終止于第+150位的天冬氨酸、或起始于第+26位的丙氨酸且終止于第+150位的天冬氨酸的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的野生型氨基酸序列；和Ig區(qū)。圖10A-C是關(guān)于CTLA4Ig(泳道1)、L104EIg(泳道2)和L104EA29YIg(泳道3A)的SDS凝膠(圖10A);以及CTLA4Ig(圖10B)和L104EA29YIg(圖10C)的大小排阻層析。圖IIA和IIB舉例說明了由通過NMR光譜學(xué)測定的溶液結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的CTLA4細(xì)胞外IgV-樣折疊的帶狀圖解。圖11B顯示S25-R33區(qū)和MYPPPY區(qū)的放大圖，顯示了抗體親抗原性增強(qiáng)突變L104和A29的定位和側(cè)鏈方向。圖12描述了具有L104EA29YIg插入片段的載體piLN-L104EA29Y的示意圖。圖13描述了CTLA4受體的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNOS:9和10)。發(fā)明詳述定義除非另有說明，本申請中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語都具有本領(lǐng)域通常使用的含義。如本申請中使用的，下列單詞或短語具有說明的含義。如本文使用的，"配體"指特異性識別并結(jié)合另一分子的分子，例如關(guān)于CTLA4的配體是B7分子。如本文使用的，"野生型CTLA4"或"非突變型CTLA4"具有如圖13中所示(SEQIDNOS:9和10;還如美國專利號5,434,131、5,844,095、5,851,795中所述)天然存在的全長CTLA4的氨基酸序列，或其任何部分或衍生物，其識別并結(jié)合B7或干擾B7，從而使得它阻斷與CD28和/或CTLA4(例如內(nèi)源性CD28和/或CTLA4)的結(jié)合。在具體實(shí)施方案中，野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域起始于第+1位的曱石克氨酸且終止于第+124位的天冬氨酸，或野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域起始于第-1位的丙氨酸且終止于第+124位的天冬氨酸。野生型CTLA4是細(xì)胞表面蛋白，具有N末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C末端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶分子，例如B7分子。在細(xì)胞中，天然存在的野生型CTLA4蛋白質(zhì)翻譯為未成熟的多肽，其包括在N末端的信號肽。未成熟的多肽經(jīng)歷翻譯后加工，這包括切割并去除信號肽以產(chǎn)生CTLA4切割產(chǎn)物，其具有的新生成的N末端不同于未成熟形式的N末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以存在另外的翻譯后加工，其從CTLA4切割產(chǎn)物的新生成的N末端去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸?？商娲?，信號肽可以不完全去除，從而產(chǎn)生在共同的起始氨基酸甲硫氨酸之前開始的分子。因此，成熟的CTLA4蛋白質(zhì)可以起始于第+1位的甲硫氨酸或第-1位的丙氨酸。成熟形式的CTLA4分子包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合B7的任何部分。"CTLA4Ig"是可溶性融合蛋白，其包括與Ig尾連接的野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其結(jié)合B7的部分。具體實(shí)施方案包括起始于第+1位的曱石危氨酸且終止于第+124位的天冬氨酸；或起始于第-1位的丙氨酸至第+124位的天冬氨酸的野生型CTLA4(如圖9中所示，SEQIDNOS:7和8)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；在第+125位的接頭氨基酸殘基谷氨酰胺；和包括第+126位的谷氨酸到第+357位的賴氨酸或第+356位的甘氨酸的免疫球蛋白部分(編碼CTLA4Ig的DNA根據(jù)布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)的規(guī)定于1991年5月31日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,并且已給予ATCC登記號ATCC68629;Linsley,P.，等人，1994/mw冊/(y1:793-80。表達(dá)CTLA4Ig的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系CTLA4Ig-24于1991年5月31日保藏，ATCC識別號為CRL-10762)。可溶性CTLA4Ig分子可以包括或不包括信號(前導(dǎo))肽序列。如本文使用的，"融合蛋白"定義為使用本領(lǐng)域眾所周知的且如美國專利號5,434,131或5,637,481中描述的方法連接在一起的一種或多種氨基酸序列。連接的氨基酸序列從而形成一種融合蛋白。如本文使用的，"可溶的"指任何分子，或其片段和衍生物不結(jié)合或附著至細(xì)胞，即流動(dòng)的。例如，CTLA4、B7或CD28可以通過將免疫球蛋白Ug)部分分別附著至CTLA4、B7或CD28的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域變得可溶?？商娲?，分子例如CTLA4可以通過去除其跨膜結(jié)構(gòu)域變得可溶。如本文使用的，"CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域"是識別并結(jié)合CTLA4配體例如B7分子的CTLA4部分。例如，CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括第+1位的甲硫氨酸至第+124位的天冬氨酸(圖13,SEQIDNOS:9和10)。可替代地，CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括第-1位的丙氨酸至第+124位的天冬氨酸(圖13，SEQIDNOS:9和10)。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合B7分子的CTLA4片段或衍生物。如圖13(SEQIDNOS:9和10)中所示的CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域還可以包括改變CTLA4分子對B7分子的結(jié)合抗體親抗原性的突變。如本文使用的，"CTLA4突變型分子"意指如(SEQIDNOS:9和IO)中顯示的野生型CTLA4或其任何部分或衍生物，其具有一個(gè)突變或多個(gè)突變(優(yōu)選在野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中)。CTLA4突變型分子具有的序列類似但不等同于野生型CTLA4分子的序列，但仍然結(jié)合B7。突變可以包括由具有保守(例如用異亮氨酸置換亮氨酸)或非保守(例如用色氨酸置換甘氨酸)結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸置換的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、氨基酸缺失、添加、移碼或截短。CTLA4突變型分子可以包括在其中或與其附著的非CTLA4分子。突變型分子可以是可溶的(即，流動(dòng)的)或結(jié)合至細(xì)胞表面。另外的CTLA4突變型分子包括美國專利申請序列號09/865,321、60/214,065和60/287,576;美國專利號6,090,914、5，844，095和5,773,253中描述的那些；以及如Peach,R.J.,爭乂，在/￡xp^fed180:2049-2058(1994))中描述的。CTLA4突變型分子可以合成或重組制備。"L104EA29YIg"是可溶性CTLA4突變型分子的融合蛋白，所述CTLA4突變型分子包括與Ig尾連接、具有氨基酸改變A29Y(酪氨酸氨基酸殘基置換第29位的丙氨酸)和L104E(谷氨酸氨基酸殘基置換第+104位的亮氨酸)的野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其結(jié)合B7分子的部分(包括在圖7中，SEQIDNOS:3和4;編碼L104EA29YIg的DNA于2000年6月20日保藏，ATCC號為PTA-2104;在引入本文作為參考的美國專利申請序列號09/579,927、60/287,576和60/214,065中共同未決)。在本發(fā)明的方法和/或試劑盒中使用的可溶性L104EA29YIg分子可以包括或不包括信號(前導(dǎo))肽序列。一般地，在本發(fā)明的方法和/或試劑盒中，該分子不包括信號肽序列。如本文使用的，術(shù)語"突變"意指野生型分子的核苷酸或氨基酸序列中的變化，例如，野生型CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的DNA和/或氨基酸序列中的變化。DNA中的突變可以改變密碼子，從而導(dǎo)致氨基酸序列中的變化。DNA變化可以包括置換、缺失、插入、可變剪接或截短。氨基酸變化可以包括置換、缺失、插入、添加、截短、或蛋白質(zhì)的加工或切割錯(cuò)誤?？商娲兀似账嵝蛄兄械耐蛔兛梢詫?dǎo)致如本領(lǐng)域充分理解的氨基酸序列中的沉默突變。在那點(diǎn)上，某些核普酸密碼子編碼相同的氨基酸。例子包括編碼氨基酸精氨酸(R)的核苷酸密碼子CGU、CGG、CGC和CGA;或編碼氨基酸天冬氨酸(D)的密碼子GAU和GAC。因此，蛋白質(zhì)可以由在其具體核普酸序列方面不同，但仍編碼具有相同序列的蛋白質(zhì)分子的一種或多種核酸分子編碼。氨基酸編碼序列如下<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>突變型分子可以具有一個(gè)或多個(gè)突變。如本文使用的，"非CTLA4蛋白質(zhì)序列"或"非CTLA4分子"意指不結(jié)合B7且不干擾CTLA4與其靶結(jié)合的任何蛋白質(zhì)分子。例子包括但不限于，免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)或其部分。優(yōu)選地，Ig恒定區(qū)是人或猴Ig恒定區(qū)，例如人c(y)1，包括鉸鏈、ch2和ch3區(qū)。Ig恒定區(qū)可以被突變以減少其效應(yīng)子功能(美國專利5,637,481、5，844，095和5，434，131)。如本文使用的，"片段"或"部分"是識別并結(jié)合其靶例如B7分子的CTLA4分子的任何部分或區(qū)段，優(yōu)選CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分或區(qū)段。CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包括改變CTLA4分子對B7分子的結(jié)合抗體親抗原性的突變。如本文使用的，"B7"指可以識別并結(jié)合CTLA4和/或CD28的B7分子家族，包括但不限于，B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。如本文使用的，"B7陽性細(xì)胞"是在細(xì)胞表面上表達(dá)一種或多種類型的B7分子的任何細(xì)胞。如本文使用的，"衍生物"是共有其親本分子的序列同源性和活性的分子。例如，CTLA4的衍生物包括具有至少70%類似于野生型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列并且識別并結(jié)合B7的可溶性CTLA4分子，例如CTLA4Ig或可溶性CTLA4突變型分子L104EA29YIg。如本文使用的，"調(diào)節(jié)"免疫應(yīng)答是激活、刺激、上調(diào)、抑制、阻斷、下調(diào)或修改免疫應(yīng)答。本文描述的自身免疫性疾病可以通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來治療，例如通過調(diào)節(jié)功能性CTLA4-和/或CD28-陽性細(xì)胞與B7陽性細(xì)胞的相互作用。例如，用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法包括使B7陽性細(xì)胞與本發(fā)明的可溶性CTLA4分子接觸，從而形成可溶性CTLA4/B7復(fù)合物，可溶性CTLA4分子干擾內(nèi)源性CTLA4和/或CD28分子與所述B7細(xì)胞的反應(yīng)。如本文使用的，"阻斷"或"抑制"受體、信號或分子意指如通過領(lǐng)域公認(rèn)的測試檢測的，干擾受體、信號或分子的激活。阻斷或抑制可以是部分或全部的。例如，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的阻斷可以通過測定移植物的功能性來檢測，例如腎移植后的血清肌酸酐濃度。如本文使用的，"阻斷B7相互作用"意指干擾B7與其配體例如CD28和/或CTLA4的結(jié)合，從而阻礙T細(xì)胞和B7陽性細(xì)胞的相互作用。阻斷B7相互作用的試劑的例子包括但不限于，識別并結(jié)合任何CTLA4、CD28或B7分子(例如B7-1、B7-2)的分子例如抗體(或其部分或衍生物)；可溶形式的分子(或其部分或衍生物)例如可溶性CTLA4;設(shè)計(jì)為通過CTLA4/CD28/B7介導(dǎo)的相互作用干擾細(xì)胞信號的肽片段或其他小分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，阻斷劑是可溶性CTLA4突變型分子，例如L104EA29YIg(ATCCPTA-2104)。如本文使用的，"治療"病癥或疾病意指通過醫(yī)學(xué)或其他療法處理疾病或病癥。疾病或病癥的治療可以抑制與疾病有關(guān)的免疫介導(dǎo)事件，改善疾病或病癥的癥狀，減少疾病或病癥的嚴(yán)重性，改變疾病或病癥進(jìn)展的過程，和/或改善或治愈基本疾病或病癥問題。例如，治療過調(diào)節(jié)功能性CTLA4-和/或CD28-陽性細(xì)胞與B7陽性細(xì)胞的相互作用?？商娲兀委熋庖呒膊』虿“Y可以通過經(jīng)由使用本文描述的排斥包括如i過腎小球i過率(gf1)測量的腎移植排斥的抑制。例如，治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥包括通過施用L104EA29YIg預(yù)防器官排斥。此外，治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥可以延長宿主和移植器官的存活。如本文使用的，"免疫系統(tǒng)疾病"包括由T細(xì)胞與B7陽性細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的任何疾病，包括但不限于，自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、以及與移^i物移纟直有關(guān)的免疫病癥。如本文使用的，"與移植物移植有關(guān)的免疫病癥"意指由T細(xì)胞與B7陽性細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的任何移植相關(guān)疾病，包括但不限于，與移纟直物移纟直排斥有關(guān)的免疫病癥，移;ti物相關(guān)病癥，移#_物抗宿主病(GVHD)(例如，可以由骨髓移植引起，或在耐受性的誘導(dǎo)中)，移植物或移植體排斥包括移植物或移植體的急性排斥和移植物或移植體的慢性排斥。移植物可以是實(shí)體器官同種異體移植物或異種移植物、組織或細(xì)胞同種異體移植物或異種移植物、或外解剖學(xué)同種異體移植物或異種移植物，包括但不限于皮膚、胰島細(xì)胞(也稱為胰島)、肌肉、肝細(xì)胞、神經(jīng)元、心臟、肝、腎、肺、附肢、肢、鼻、耳或臉。1如本文使用的，免疫增生性疾病包括但不限于，T細(xì)胞淋巴瘤；急性T細(xì)胞型淋巴母細(xì)胞白血??；睪丸血管中心(testicularangiocentric)T細(xì)胞淋巴瘤；和良性淋巴細(xì)胞性脈管炎。如本文使用的，自身免疫性疾病包括但不限于，疾病例如狼瘡(例如紅斑狼瘡、狼瘡腎炎)，牛皮癬；Hashimoto氏曱狀腺炎，原發(fā)性粘液性水腫，Grave氏病，惡性貧血，自身免疫性萎縮性胃炎，Addison氏病，糖尿病(例如胰島素依賴性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病)，goodpasture氏綜合4正，重癥月幾無力，天皰癡，Crohn氏病，炎性腸病(IBD),交感性眼炎，自身免疫性葡萄膜炎，多發(fā)性硬化，自身免疫性溶血性貧血，特發(fā)性血小板減少癥，原發(fā)性膽汁性肝硬變，慢性活動(dòng)性肝炎，潰瘍性結(jié)腸炎，Sjogren氏綜合征，風(fēng)濕性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)，多發(fā)性肌炎，硬皮病，和混合型結(jié)締組織病。為了本文描述的本發(fā)明可以被更充分地理解，闡述了下列描述。本發(fā)明的組合物和方法本發(fā)明提供了用于移植的一類新的免疫抑制療法。其是結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(APCs)表面上的B7分子的融合蛋白，抑制T細(xì)胞激活必需的共刺激。本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子在其分子靶的限制別并結(jié)合CD80和/或CD86的^T溶性C^l14突變型分子。在^些實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變體對于CD80和/或CD86的抗體親抗原性比CTLA4Ig更高。例如，L104EA29YIg與CD80的結(jié)合抗體親抗原性為野生型CTLA4Ig(以下稱為CTLA4Ig)的大約2倍，并且與CD86的結(jié)合抗體親抗原性為大約4倍。這種更強(qiáng)烈的結(jié)合導(dǎo)致L104EA29YIg在阻斷免疫應(yīng)答方面比CTLA4Ig更有效。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于治療免疫系統(tǒng)疾病的方法。該方法包括給受試者施用包括本文公開的可溶性CTLA4突變型分子的治療組合物，其量有效減輕與免疫系統(tǒng)疾病有關(guān)的至少一種癥狀。另外，本文公開的可溶性CTLA4突變型分子可以提供用于免疫系統(tǒng)疾病的長期治療，這通過阻斷T細(xì)胞/B7陽性細(xì)胞的相互作用，從而阻斷經(jīng)由共刺激信號例如B7與CD28結(jié)合的T細(xì)胞激活/刺激，從而導(dǎo)致T細(xì)胞無反應(yīng)性或耐受性的誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。免疫系統(tǒng)疾病包括但不限于，自身免疫性疾病、免疫增生性疾病以及上文討論的與移植物移植有關(guān)的免疫病癥。另一實(shí)施方案提供了通過施用包括本文公開的可溶性CTLA4突變型分子的治療組合物用于在患有與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的受試者中誘導(dǎo)耐受性的方法。本文公開的可溶性CTLA4突變型分子顯示出體內(nèi)抑制特性。在其中T細(xì)胞/B7陽性細(xì)胞相互作用，例如T細(xì)胞/B細(xì)胞相互作用由于T細(xì)胞和B7陽性細(xì)胞之間的接觸而發(fā)生的條件下，引入的CTLA4突變型分子與B7陽性細(xì)胞例如B細(xì)胞的結(jié)合可以干擾，即抑制T細(xì)胞/B7陽性細(xì)胞相互作用，從而導(dǎo)致免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。另一實(shí)施方案提供了用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。通過本文公開的可溶性CTLA4突變型分子下調(diào)(減少)的免疫應(yīng)答可以經(jīng)由抑制或阻斷已經(jīng)在進(jìn)行中的免疫應(yīng)答，或可以涉及預(yù)防免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。本文公開的可溶性CTLA4突變型分子可以通過抑制T細(xì)胞應(yīng)答或通過誘導(dǎo)T細(xì)胞中的特異性耐受，或兩者來抑制活化T細(xì)胞的功能，例如T淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和/或細(xì)胞因子生產(chǎn)。此外，本文公開的干擾CTLA4/CD28/B7途徑的可溶性CTLA4突變型分子可以抑制T細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞因子分泌，并因此導(dǎo)致組織破壞減少和T細(xì)胞無應(yīng)答性或無反應(yīng)性的誘導(dǎo)。CTLA4突變型分子包括CTLA4的至少細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其結(jié)合CD80和Z或CD86的部分。CTLA4突變型分子的細(xì)胞外部分包括起始于第+1位曱硫氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸序列(圖7,SEQIDNOS:3和4;或圖8,SEQIDNOS:5和6)。可4奪代地，CTLA4的細(xì)胞外部分可以包括起始于第-l位丙氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸序列(圖7，SEQIDNOS:3和4;或圖8，SEQIDNOS:5和6)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變型分子是包括CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其在起始于第+25位的絲氨酸且終止于第+33位的精氨酸的氨基酸序列(S25-R33)區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變。例如，野生型CTLA4的第+29位的丙氨酸可以由酪氨酸(密碼子UAU、UAC)置換。可替代地，丙氨酸可以由亮氨酸(密碼子UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG)、苯丙氨酸(密碼子UUU、UUC)、色氨酸(密碼子UGG)或蘇氨酸(密碼子ACU、ACC、ACA、ACG)置換。如本領(lǐng)域j支術(shù)人員容易理解的，RNA序列中的尿嘧-定(U)核苷酸對應(yīng)DNA序列中的胸腺嘧啶(T)核苷酸。在另一實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變型分子是包括CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其在起始于第+97位的甲疏氨酸且終止于第+107位的甘氨酸的氨基酸序列(M97-G107)區(qū)域中或附近具有一個(gè)或多個(gè)突變。例如，野生型CTLA4的第+104位的亮氨酸可以由谷氨酸(密碼子GAA、GAG)置換，具有這種置換的CTLA4突變型分子在本文中稱為L104EIg(圖8,SEQIDNOS:5和6)。在再一實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變型分子是包括CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其在S25-R33和M97-G107區(qū)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，CTLA4突變型分子包括第+29位的酪氨酸代替丙氨酸；和第+104位的谷氨酸代替亮氨酸。具有這些置換的CTLA4突變型分子在本文中稱為L104EA29YIg(圖7,SEQIDNOS:3和4)。編碼L104EA29YIg的核酸分子包含在pD16U04EA29YIg中，并且于2000年6月20日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manasas，VA20110—2209(ATCC號PTA-2104)。pD16L104EA29YIg栽體是pcDNA3栽體(INVITROGEN)的衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括如圖7(SEQIDNOS:3和4)或圖8(SEQIDNOS:5和6)中所示的CTLA4突變體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，以及改變CTLA4突變型分子的溶解性、親和力和/或效價(jià)的部分的可溶性CTLA4突變型分子。依照本發(fā)明的實(shí)踐，該部分可以是免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分，例如CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)。對于體內(nèi)使用，優(yōu)選免疫球蛋白恒定區(qū)不在受試者中引起有害的免疫應(yīng)答。例如，在臨床方案中，優(yōu)選突變型分子包括人或猴免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分。合適的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的例子包括但不限于，IgCyl(IgCgamma1)、IgCy2(IgCgamma2)、IgCy3(IgCgamma3)、IgCy4(IgCgamma4)、IgCp(IgCmu)、IgCal(IgCalphal)、IgCa2UgCalpha2)、IgCS(IgCdelta)或IgCs(IgCepsilon)。其他同種型也是可能的。此外，其他免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分也是可能的(優(yōu)選其他弱或非免疫原性的免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分)。對于臨床方案，優(yōu)選免疫球蛋白部分不在受試者中引起有害的免疫應(yīng)答。優(yōu)選的部分是免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分，包括人或猴免疫球蛋白分子恒定區(qū)或其部分。合適的免疫球蛋白區(qū)的一個(gè)例子是人Cy1，包括鉸鏈、CH2和CH3區(qū)，其可以介導(dǎo)效應(yīng)子功能例如結(jié)合Fc受體、介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、或介導(dǎo)依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。免疫球蛋白部分可以在其中具有一個(gè)或多個(gè)突變(例如在CH2結(jié)構(gòu)域中，以減少效應(yīng)子功能，例如CDC或ADCC)，其中所述突變通過增加或減少免疫球蛋白與Fc受體的結(jié)合能力調(diào)節(jié)免疫球蛋白與其配體的結(jié)合能力。例如，免疫球蛋白部分中的突變可以包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域內(nèi)的任何或所有其半胱氨酸殘基中的變化，例如第+130、+136和+139位的半胱氨酸由絲氨酸置換(圖9,SEQIDNO:8)。免疫球蛋白部分還可以包括如圖9(SEQIDNO:8)中所示由絲氨酸置換的第+148位的脯氨酸。此外，免疫球蛋白部分中的突變可以包括由苯丙氨酸置換第+144位的亮氨酸，由谷氨酸置換第+145位的亮氨酸，或由丙氨酸置換第+147位的甘氨酸。免疫球蛋白部分的例子包括美國專利7>開號2002/0114814Al和2004/0151725Al，美國專利號6,444,792和6,750，334，以及WO97/28267中描述和公開的那些。其他部分包括多肽標(biāo)記。合適標(biāo)記的例子包括但不限于p97分子、envgpl20分子、E7分子和ova分子(Dash，B.，等人，(1994)J.G饑PW.75:1389-97;Ikeda，T.,等人，(1994)G騰138:193-6;Falk，K.,等人，(1993)Ce〃./mm腸/.150:447-52;Fujisaka,K.等人，(1994)P7ra/ogy204:789-93)。用作標(biāo)記的其他分子也是可能的(Gerard，C.等人，(1994)A^^osc^"ce62:721-739;Byrn，R.等人，(1989)63:4370—4375;Smith,D.等人，(1987)Sc〖騰e238:1704-1707;Lasky，L.,(1996)Sc/e,233:209_212)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可溶性突變型CTLA4Ig融合蛋白，優(yōu)選與野生型CTLA4比較與CD80和/或CD86抗原更有反應(yīng)性。一個(gè)例子是如圖7(SEQIDNOS:3和4)中所示的L104EA29YIg。在另一實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變型分子包括接頭氨基酸殘基，其位于CTLA4部分和免疫球蛋白部分之間。接頭氨基酸可以是任何氨基酸，包括谷氨酰胺。接頭氨基酸可以通過本領(lǐng)域已知的分子或化學(xué)合成方法引入。在另一實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變型分子包括免疫球蛋白部分(例如，鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)，其中免疫球蛋白部分的鉸鏈結(jié)構(gòu)域內(nèi)的任何或所有半胱氨酸殘基由絲氨酸置換，例如第+130、+136或+139位的半胱氨酸(圖7,SEQIDNOS:3和4;或圖8,SEQIDNOS:5和6)。突變型分子還可以包括如圖7(SEQIDNOS:3和4)或圖8(SEQIDNOS:5和6)中所示由絲氨酸置換的第+148位的脯氨酸?？扇苄訡TLA4突變型分子可以包括與突變型分子CTLA4部分的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的N末端連接的信號肽序列。信號肽可以是將允許突變型分子分泌的任何序列，包括來自制瘤素M(Malik,等人，(1989)M/ec.Ce〃.肌o/.9:2847-2853)或CD5(Jones，N.H.等人，(1986)323:346-349)的信號肽，或來自任何細(xì)胞外蛋白質(zhì)的信號肽。突變型分子可以包括在CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的N末端連接的制瘤素M信號肽，以及與CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的C末端連接的人免疫球蛋白分子(例如，鉸鏈、CH2和CH3)。這種分子包括包含第-26位的曱硫氨酸到第-1位的丙氨酸的氨基酸序列的制瘤素M信號肽，包含第+1位的曱硫氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4部分，第+125位的接頭氨基酸殘基谷氨酰胺，以及包含第+126位的谷氨酸到第+357位的賴氨酸或第+356位的甘氨酸的氨基酸序列的免疫球蛋白部分。本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子可以通過分子或化學(xué)合成方法獲得。分子方法可以包括下列步驟將表達(dá)且編碼可溶性CTLA4突變型分子的核酸分子引入合適的宿主細(xì)胞；在允許宿主細(xì)胞表達(dá)突變型分子的條件下培養(yǎng)這樣引入的宿主細(xì)胞；并分離表達(dá)的突變型分子。突變型分子的信號肽部分允許蛋白質(zhì)分子表達(dá)在細(xì)胞表面上并由宿主細(xì)胞分泌。翻譯的突變型分子可以經(jīng)歷翻譯后修飾，涉及切割信號肽以產(chǎn)生具有CTLA4和免疫球蛋白部分的成熟蛋白。切割可以在第-1位的丙氨酸后發(fā)生，從而導(dǎo)致具有第+1位的曱硫氨酸作為第一個(gè)氨基酸的成熟的突變型分子(圖7，SEQIDNOS:3和4;或圖8，SEQIDNOS:5和6)。可替代地，切割可以在第-2位的曱硫氨酸后發(fā)生，從而導(dǎo)致具有第-1位的丙氨酸作為第一個(gè)氨基酸的成熟的突變型分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)L104EA29YIg可以導(dǎo)致N和C末端變體的產(chǎn)生，從而使得產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以具有氨基酸殘基序列(i)+l至+357,(ii)-1至+357;(iii)+1至+356或(iv)-1至356(圖7,SEQIDNOS:3和4;或圖8，SEQIDNOS:5和6)。優(yōu)選實(shí)施方案是具有與人免疫球蛋白分子(例如，鉸鏈、CH2和CH3)的全部或部分連接的人CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變型分子。這種優(yōu)選分子包括包含第+1位的曱硫氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸序列的可溶性分子CTLA4部分，第+125位的接頭氨基酸殘基谷氨酰胺，以及包含第+126位的谷氨酸到第+357位的賴氨酸或第+356位的甘氨酸的免疫球蛋白部分。具有CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的部分被突變，從而使得第+29位的丙氨酸由酪氨酸置換，并且第+104位的亮氨酸由谷氨酸置換。突變型分子的免疫球蛋白部分可以被突變，從而使得第+130、+136和+139位的半胱氨酸由絲氨酸置換，并且+148位的脯氨酸由絲氨酸置換。這種突變型分子在本文中被稱為L104EA29YIg(圖7,SEQIDNOS:3和4)。L104EA29YIg的另一實(shí)施方案是具有第-1位的丙氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸序列，第+125位的接頭氨基酸殘基谷氨酰胺，以及包含第+126位的谷氨酸(例如+126到第+357位的賴氨酸或第+356位的甘氨酸)的免疫球蛋白部分的突變型分子。具有CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的部分被突變，從而使得第+29位的丙氨酸由酪氨酸置換；并且第+104位的亮氨酸由谷氨酸置換。突變型分子的免疫球蛋白部分可以被突變，從而使得第+130、+136和+139位的半胱氨酸由絲氨酸置換，并且+148位的脯氨酸由絲氨酸置換。這種突變型分子在本文中被稱為L104EA29YIg(圖7,SEQIDNOS:3和4)。在信號序列已切割后，L104EA29YIg可以起始于第+1位的曱硫氨酸，或起始于第-1位的丙氨酸。本發(fā)明的另一種突變型分子是具有與人免疫球蛋白分子(例如鉸鏈、CH2和CH3)連接的人CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變型分子。這種分子包括編碼起始于第+1位的甲硫氨酸到第+124位的天冬氨酸的CTLA4的氨基酸序列部分，第+125位的接頭氨基酸殘基谷氨酰胺，以及包含第+126位的谷氨酸到第+357位的賴氨酸或第+356位的甘氨酸的氨基酸序列的免疫球蛋白部分。具有CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的部分被突變，從而使得第+104位的亮氨酸由谷氨酸置換。突變型分子的鉸鏈部分可以被突變，從而使得第+130、+136和+139位的半胱氨酸由絲氨酸置換，并且+148位的脯氨酸由絲氨酸置換。這種突變型分子在本文中稱為L104EIg(圖8，SEQIDNOS:5和6)?？商娲兀琇104EIg的一個(gè)實(shí)施方案是具有與人免疫球蛋白分子(例如鉸鏈、CH2和CH3)連接的人CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變型分子。這種優(yōu)選的分子包括包含起始于第-1位的丙氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4部分，第+125位的接頭氨基酸殘基谷氨酰胺，以及包含第+126位的谷氨酸到第+357位的賴氨酸或第+356位的甘氨酸的免疫球蛋白部分。具有CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的部分被突變，從而使得第+104位的亮氨酸由谷氨酸置換。突變型分子的鉸鏈部分可以被突變，從而使得第+130、+136和+139位的半胱氨酸由絲氨酸置換，并且+148位的脯氨酸由絲氨酸置換。這種突變型分子在本文中稱為L104EIg(圖8，SEQIDNOS:5和6)。此外，本發(fā)明提供了可溶性CTLA4突變型分子，其具有(a)與第二種氨基酸序列融合的，膜糖蛋白例如CD28、CD86、CD80、CDM和gp39的第一種氨基酸序列，其阻斷T細(xì)胞增殖；(b)是突變型CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域片段的第二種氨基酸序列，其阻斷T細(xì)胞增殖，例如包括第+1位的甲硫氨酸到第+124位的天冬氨酸的氨基酸分子(圖7,SEQIDNOS:3和4;或圖8,SEQIDNOS:5和6);和(c)第三種氨基酸序列，其充當(dāng)鑒別標(biāo)記或增強(qiáng)分子的溶解度。例如，第三種氨基酸序列可以基本上由非免疫原性的免疫球蛋白分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的氨基酸殘基組成。合適的免疫球蛋白分子的例子包括但不限于，人或猴免疫球蛋白，例如IgCyl。其他同種型也是可能的。本發(fā)明還提供了通過給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，所述CTLA4突變型分子具有如SEQIDNO:8中所示、起始于第26位的丙氨酸或第27位的甲硫氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。另外，在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分中第55位的丙氨酸由酪氨酸置換，并且第130位的亮氨酸由谷氨酸置換。此外，施用方案包括早期方案，其中早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月1次更頻繁的施用。另外，本發(fā)明提供了通過給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，所述CTLA4突變型分子具有SEQIDNO:4的起始于第27位的甲硫氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的氨基酸序列，或SEQIDNO:4的起始于第26位的丙氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的氨基酸序列。此外CTLA4突變型分子施用方案包括早期方案，其中早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月l次更頻繁的施用。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括編碼氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列對應(yīng)于本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子是DNA(例如cDNA)或其雜交體?？商娲?，核酸分子是RNA或其雜交體。另外，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的核苷酸序列的載體。還提供了宿主載體系統(tǒng)。宿主載體系統(tǒng)包括在合適的宿主細(xì)胞中的本發(fā)明載體。合適的宿主細(xì)胞的例子包括但不限于，原核和真核細(xì)胞。本發(fā)明包括用于在與移植物移植有關(guān)的免疫病癥治療中使用的藥物組合物，其包括藥學(xué)有效劑量的可溶性CTLA4突變型分子。在某些實(shí)施方案中，與移植物移植有關(guān)的免疫病癥由CD28-和/或CTLA4-陽性細(xì)胞與CD80和/或CD86陽性細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)。可溶性CTLA4突變型分子優(yōu)選是在CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中具有一個(gè)或多個(gè)突變的CTLA4分子。藥物組合物可以包括可溶性CTLA4突變型蛋白質(zhì)分子和/或核酸分子，和/或編碼所述分子的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可溶性CTLA4突變型分子具有如圖7(SEQIDNOS:3和4)或8(SEQIDNOS:5和6)中所示的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，分別為L104EA29Y或L104E。再更優(yōu)選地，可溶性CTLA4突變型分子是如本文公開的L104EA29YIg。組合物可以另外包括其他治療劑，包括但不限于，藥物毒素、酶、抗體或綴合物。藥物組合物還優(yōu)選包括合適的載體和佐劑，其包括當(dāng)與本發(fā)明的分子(例如可溶性CTLA4突變型分子，例如L104EA29Y或L104E)組合時(shí)保留分子的活性且與受試者的免疫系統(tǒng)不反應(yīng)的任何材料。合適的載體和佐劑的例子包括但不限于，人血清清蛋白；離子交換劑；氧化鋁；卵磷脂；緩沖物質(zhì)，例如磷酸鹽；甘氨酸；山梨酸；山梨酸鉀；以及鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚精蛋白。其他例子包括任何標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)載體例如磷酸緩沖鹽水溶液；水；乳狀液，例如油/水乳狀液；以及各種類型的濕潤劑。其他載體還可以包括無菌溶液；片劑，包括糖衣片劑和膠嚢。一般地此類載體包含賦形劑，例如淀粉、乳、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或鈣、滑石、植物脂肪或油、樹膠、乙二醇、或其他已知的賦形劑。此類載體還可以包括食用香料或色料添加劑或其他成分。包括此類載體的組合物通過眾所周知的常規(guī)方法進(jìn)行配制。此類組合物還可以在各種脂質(zhì)組合物例如脂質(zhì)體以及各種聚合物組合物例如聚合物微球體內(nèi)進(jìn)行配制。本發(fā)明的藥物組合物可以使用常規(guī)施用方式給受試者施用，包括但不限于，靜脈內(nèi)(i.v.)施用，腹膜內(nèi)(i.p.)施用，肌內(nèi)(i.m.)施用，皮下施用，經(jīng)口施用，作為栓劑、或作為局部接觸、或緩釋裝置例^口孩么型；參透泵(miniosmoticpump)的才直入施用。本發(fā)明的藥物組合物可以是各種劑型，其包括但不限于，液體溶液或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、栓劑、聚合微型膠嚢劑或微泡、脂質(zhì)體、以及可注射或可輸注的溶液。優(yōu)選的形式取決于施用方式和治療應(yīng)用。用于靜脈內(nèi)(i.v.)施用的本發(fā)明的一般藥物組合物在下文列出。凍干的L104EA29YIg100mg/小瓶藥物產(chǎn)品的組成<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a每個(gè)小瓶包含對于重構(gòu)溶液的小瓶、針及注射器容納量的10%過滿。凍干的藥物產(chǎn)品可以用水載體構(gòu)建。本文的目的水載體是藥學(xué)可接受的(對于給人的施用是安全且無毒的)且在凍干后對于液體制劑制備有用的水載體。一般地，凍干的藥物產(chǎn)品用10ml無菌注射用水，USP(SWFI)或0,9%氯化鈉注射液，USP構(gòu)建為約25mg/ml。構(gòu)建的溶液用0.9。/。氯化鈉注射液，USP進(jìn)一步稀釋至1-10mg/ml的藥物產(chǎn)品濃度。用于注射的稀釋藥物產(chǎn)品是等滲的且適合于通過靜脈內(nèi)輸注施用。表面活性劑可以加入制劑中，其量足以減少或預(yù)防構(gòu)建的藥物產(chǎn)品與硅化處理注射器的相互作用。關(guān)于本發(fā)明組合物的最有效的施用方式和劑量方案i[又決于疾病的嚴(yán)重性和病程、患者的健康狀態(tài)和對治療的應(yīng)答以及治療醫(yī)生的判斷。因此，組合物的用量(也稱為劑量)應(yīng)當(dāng)?shù)味ńo個(gè)別患者?？扇苄訡TLA4突變型分子可以給受試者施用，其量、在時(shí)間段內(nèi)的頻率(例如，時(shí)間的長短和/或多次)足以阻斷受試者中的內(nèi)源性B7(例如CD80和/或CD86)分子結(jié)合其各自的配體。內(nèi)源性B7/配體結(jié)合的阻斷從而抑制了B7陽性細(xì)胞(例如CD80-和/或CD86-陽性細(xì)胞)與CD28-和/或CTLA4-陽性細(xì)胞之間的相互作用。治療劑的劑量取決于許多因素，包括但不限于，受影響的組織類型、治療的與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的類型、疾病的嚴(yán)重性、受試者的健康狀態(tài)以及受試者對試劑治療的應(yīng)答。本發(fā)明的分子或藥物組合物的劑量基于體重，并且施用方案可以由靶血清谷特征指定。一般地，在移植后的前3-6個(gè)月內(nèi)約3pg/mL-約30pg/mL的本發(fā)明CTLA4突變型分子的靶谷血清濃度將足以維持同種異體移植物的功能，優(yōu)選約5ng/mL-約20pg/mL。一般地，在維持期過程中的本發(fā)明CTLA4突變型分子的靶谷血清濃度為約0.2fig/mL-約3(ig/mL,優(yōu)選約0.25(ig/mL-約2.5|ug/mL。本發(fā)明的CTLA4突變型分子可以以約0.1-約20.0mg/kg患者重量的量施用，一般為約1.0-約15.0mg/kg。例如，L104EA29Y在早期-移植后的高危險(xiǎn)期可以以10mg/kg患者重量施用，并且對于維持劑量減少至5mg/kg患者重量。本發(fā)明的分子或藥物組合物的施用可以經(jīng)過各種時(shí)期進(jìn)行。一般地，施用方案包括其中在最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)期過程中劑量較高且施用頻率增加的早期，隨后為維持期。早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月1次更頻繁的施用，取決于免疫學(xué)危險(xiǎn)和/或靶谷血清濃度優(yōu)選頻繁至每天1次、每周1次或每2周1次。維持期在早期結(jié)束時(shí)開始且涉及不比每月l次更頻繁的施用，并且持續(xù)所需的時(shí)間長度，一般為患者保留移植物的時(shí)間長度。如本文使用的，第1天定義為移植當(dāng)天或用本發(fā)明的分子或藥物組合物治療的第一天。早期中本發(fā)明的CTLA4突變型分子的劑量為約8-約12mg/kg患者重量，優(yōu)選約10mg/kg。維持期中本發(fā)明的CTLA4突變型分子的劑量為約3-約7mg/kg患者重量，優(yōu)選約5mg/kg。早期可以是移植后的前3-6個(gè)月。在早期過程中的施用方案可以依受體和/或移植物的狀態(tài)而變。例如，較加強(qiáng)的早期方案將在第1天、第5天、第2周就診時(shí)(例如第13-17天)、隨后對于前3個(gè)月每2周1次(例如，在第4周就診、第6周就診、第8周就診、第10周就診和第12周就診時(shí))，隨后為每月l次的施用到第6個(gè)月就診(例如，在第4個(gè)月就診、第5個(gè)月就診和第6個(gè)月就診時(shí))施用較高劑量的本發(fā)明的分子或藥物組合物。一般較加強(qiáng)的早期方案的例子是在第1、5、15、29、43、57、71、85、113、141和169天時(shí)施用10mg/kg患者重量的L104EA29YIg。較不加強(qiáng)的方案，例如，將在第1天、第2周就診、第4周就診、隨后為每月1次到第3個(gè)月就診時(shí)施用本發(fā)明的分子或藥物組合物。一般較不加強(qiáng)的早期方案的例子是在第1、15、29、57和85天時(shí)施用10mg/kg患者重量的L104EA29YIg。一般地，早期隨后為維持期，其中較低劑量的本發(fā)明的分子或藥物組合物以1-2個(gè)月的時(shí)間間隔施用所需時(shí)間長度，一般為患者保留移植物的時(shí)間長度。關(guān)于上文描述的較加強(qiáng)方案的維持期例子包括起始于第7個(gè)月就診每月施用1次5mg/kg患者重量的L104EA29YIg。同時(shí)關(guān)于較不加強(qiáng)方案的維持期例子將包括起始于第4個(gè)月就診每月施用1次5mg/kg患者重量的L104EA29YIg。可替代地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠響應(yīng)于患者的危險(xiǎn)狀態(tài)和/或響應(yīng)于移植后的治療修改施用方案。例如，上文描述的早期較不加強(qiáng)方案可以修改為給方案添加第5天的施用，從而增加最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)期過程中的施用頻率。如本文使用的，"4周"、"月"或"每月"指28±5天的時(shí)間段。如本文使用的，"2周"指14土3天的時(shí)間段。施用方案中的靈活性是促進(jìn)移植受體生活中的施用時(shí)間安排所必需的，同時(shí)維持本發(fā)明的CTLA4突變型分子的耙谷特征。關(guān)于施用劑量的允許窗口如下<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>靶曰期是先前實(shí)際就診日期加所需持續(xù)時(shí)間的結(jié)果。對于第2周就診的所需持續(xù)時(shí)間是10天。對于計(jì)劃離先前就診為2周的就診，所需持續(xù)時(shí)間是l4天，例如第6周就診在第4周就診之后。對于計(jì)劃離先前就診為1個(gè)月或4周的就診，所需持續(xù)時(shí)間是28天，例如第4個(gè)月的就診在第3個(gè)月的就診之后。對于計(jì)劃離先前就診為2個(gè)月的就診，所需持續(xù)時(shí)間是56天，例如第8個(gè)月就診在第6個(gè)月就診之后。例如，第15天的實(shí)際就診日期加14天產(chǎn)生第29天的第4周靶日期?；谏衔牡木驮\窗口，施用可以在第29天±3天發(fā)生。如果施用發(fā)生在第26天，那么那天變成用于計(jì)算下一個(gè)革巴日期的實(shí)際就診日期。低危險(xiǎn)的急性排斥受體一般包括接受來自活相關(guān)供體的移植以及匹配良好的受體/供體的那些。高危險(xiǎn)的急性排斥受體一般包括接受來自邊緣供體的移植或再次移植，具有高系列反應(yīng)性抗體或者是非裔美國人的那些。除了中等危險(xiǎn)的急性移植排斥之外，維持藥物例如4丐依賴磷酸酶抑制劑和類固醇經(jīng)過長期的使用導(dǎo)致負(fù)面影響長期結(jié)果和患者生活質(zhì)量的毒性。例如，維持藥物的副作用包括導(dǎo)致腎功能衰退和/或移植物丟失的腎毒性(CAN),以及心血管和代謝疾病例如高血壓、高脂血癥和糖尿病，其導(dǎo)致心血管疾病和死亡。另外的副作用包括多毛癥(hirsuitism)、禿頭(alpecia)、牙齦增生、震顫、神經(jīng)毒性和骨丟失，其導(dǎo)致不順從和生活質(zhì)量降低。本發(fā)明的分子或藥物組合物在治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥，或治療處于這些結(jié)果危險(xiǎn)中的受試者中與移植物移植有關(guān)的免疫病癥時(shí)，可以用于避免這些結(jié)果，減少這些結(jié)果的發(fā)生率、發(fā)展和/或進(jìn)展。本發(fā)明的分子或藥物組合物可以用于改善例如經(jīng)由GFR測量的腎功能。本發(fā)明的分子或藥物組合物的施用可以經(jīng)由30分鐘至1個(gè)或更多小時(shí)的靜脈內(nèi)輸注?？商娲?，單至多次皮下注射可以遞送所需劑量。一般地，當(dāng)患者在醫(yī)院和/或進(jìn)行用于監(jiān)控的健康護(hù)理專業(yè)人員的預(yù)定就診時(shí)，30分鐘的靜脈內(nèi)輸注是在治療早期過程中使用的施用途徑。皮下注射是在維持期過程中使用的一般施用方式，從而允許患者通過減少用于靜脈內(nèi)輸注的健康護(hù)理專業(yè)人員的就診回到其正常時(shí)間表。本發(fā)明的可替代實(shí)施方案提供了用于治療已接受移植后的可替代免疫抑制療法的受試者中與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法。接受可替代藥物免疫抑制療法的受試者可以改變或轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)變至包括本發(fā)明的分子或藥物組合物的療法，從而除去替代藥物。一般地被除去的藥物基于開處的那種特定藥物的指導(dǎo)經(jīng)過合適的時(shí)間段斜降(rampdown)，同時(shí)本發(fā)明的分子或藥物組合物比每月1次更頻繁地施用。一旦受試者已完全脫離替代藥物，受試者就可以回到使用本發(fā)明的分子或藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn)維持方案。例如，接受CsA/MMF士皮質(zhì)類固醇方案的受試者可以用L104EA29YIg轉(zhuǎn)換CsA成為L104EA29YIg/MMF士皮質(zhì)類固醇方案。轉(zhuǎn)變的施用時(shí)間表可以包括經(jīng)過2個(gè)月斜降CsA的劑量，并在那2個(gè)月過程中每2周施用5mg/kgL104EA29YIg。一旦CsA已除去，受試者隨后就可以進(jìn)入維持期并繼續(xù)每4或8周接受5mg/kg用于在CsA不存在下治療的持續(xù)。一個(gè)實(shí)施方案提供了關(guān)于本文公開的可溶性CTLA4突變型分子的合適劑量，其有效用于阻斷B7與其配體的相互作用和/或治療免疫系統(tǒng)疾病。例如，劑量可以基于體重，并且施用方案可以由靶血清谷特征指定。例如，本文公開的可溶性CTLA4突變型分子治療免疫系統(tǒng)疾病有效的靶谷血清濃度可以為約0.2|ug/mL-約30pg/mL。可替代地，本文公開的可溶性CTLA4突變型分子可以以約0.1-約20.0mg/kg患者體重的量施用以治療免疫系統(tǒng)疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法。在具體實(shí)施方案中，與移植物移植有關(guān)的免疫病癥由CD28-和/或CTLA4-陽性細(xì)胞與CD80/CD86-陽性細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，T細(xì)胞相互作用被抑制。這些方法包括給受試者施用本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子，以調(diào)節(jié)T細(xì)胞與CD80-和/或CD86-陽性細(xì)胞的相互作用。與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的例子在上文討論。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于預(yù)防或抑制或防止經(jīng)受試者的實(shí)體器官、組織、細(xì)胞和/或外解剖學(xué)移植排斥，該受試者是實(shí)體器官、組織、細(xì)胞和/或外解剖學(xué)的移植受體。一般地，在移植中，移植物的排斥通過其被T細(xì)胞識別為異物開始，隨后為破壞移植物的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子通過抑制T淋巴細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞因子分泌可以導(dǎo)致組織破壞減少和抗原特異性T細(xì)胞無應(yīng)答性的誘導(dǎo)，這可以導(dǎo)致長期移植物接受。實(shí)施例3中描述的研究比較了在腎移植受體中用作由巴利昔單抗(Simulect;Novartis)誘導(dǎo)、霉酚酸酯(MMF;CellCept;Roche)和皮質(zhì)類固醇組成的無CNI組合方案的部分時(shí)，L104EA29YIg作為維持免疫抑制劑與環(huán)孢菌素A(CsA)在12個(gè)月內(nèi)的功效和安全性。目的包括在6個(gè)月和1年時(shí)評估急性排斥的發(fā)生率(活組織檢查證實(shí)的或推測的)；在1、6和12個(gè)月時(shí)經(jīng)由碘海醇清除率測量的腎小球?yàn)V過率(GFR);高血壓參數(shù)包括血清膽固醇和甘油三酯；和總體安全性。其他預(yù)先指定的分析包括在1年時(shí)患者死亡或移植物丟失；急性排斥的嚴(yán)重性；移植后糖尿病的發(fā)生率[定義為在以前不知道是糖尿病的患者中，高血糖癥^4周，或血紅蛋白A1C(HbAlc)>7%所需的任何治療];使用腎病飲食調(diào)整(MDRD，LeveyAS，BoschJP，LewisJP,GreeneT,RogersN,RothD.Amoreaccuratemethodtoestimateglomerularfiltrationratefromserumcreatinine:anewpredictionequation.ModificationofDietinRenalDiseaseStudyGroup.AnnInternMed1999;130:461-470),Jelliffe(RW.Creatinineclearance:Bedsideestimate.AnnInterMed.1973;79:604—605)，Cockcroft—Gault(CockcroftDW,GaultMH.Predictionofcreatinineclearancefromserumcreatinine.Nephron1976;16:31-41)，和Nankivell(NankivellBJ，GruenewaldSM,AllenRD,ChapmanJR.Predictingglomerularfiltrationrateafterkidneytransplantation.Transplantation.1995;59(2):1683-I689)公式計(jì)算的GFR;藥物代謝動(dòng)力學(xué)和免疫原性。急性排斥(AR)的診斷和治療基于Banff97標(biāo)準(zhǔn)和等級(RacusenLC,SolezK,ColvinRB,等人,TheBanff97workingclassificationofrenalallograftpathology.KidneyInt1999;55(2):713-23.)。由此進(jìn)行慢性同種異體移植物腎病(CAN)發(fā)生率的分析。這項(xiàng)12個(gè)月的研究證實(shí)與CsA比較，基于L104EA29YIg的維持療法在防止AR以及類似的患者和移植物存活方面賦予等價(jià)的功效。此外，與基于CsA的維持免疫抑制比較，L104EA29YIg證實(shí)腎功能的顯著改善和CAN的減少。L104EA29YIg是安全和良好耐受的并且不伴隨一般的CNI相關(guān)毒性。在移植后第一年過程中改善的腎功能已顯示與更佳的長期結(jié)果關(guān)聯(lián)(HariharanS,McBrideMA，CherikhWS,TollerisCB,BresnahanBA，JohnsonCP.Post-transplantrenalfunctioninthefirstyearpredictslong-termkidneytransplantsurvival.KidneyInt2002;62(1):311-8)，這是因?yàn)镃NIs的長期使用受到其腎毒性的限制(DanovitchGM.Immunosuppressivemedicationsforrenaltransplantation:amultiplechoicequestion.KidneyInt2001;59(1):388-402),這導(dǎo)致具有所有其伴隨問題的移植物功能減少和腎機(jī)能不全。因此，用Ll(MEA"YIg治療觀察到的最顯著發(fā)現(xiàn)可能是與CsA比較與12個(gè)月的腎組織學(xué)偶聯(lián)的較佳GFRs,其顯示CAN發(fā)展和/或進(jìn)展的減少。這是個(gè)令人驚訝的結(jié)果并且是這類發(fā)現(xiàn)首次已在免疫抑制療法的隨機(jī)化II期試驗(yàn)中顯示。因?yàn)橥ㄟ^防止免疫學(xué)、心血管和/或代謝損傷保存腎單位量促成對患者和移植物存活的有利作用，所以L104EA29YIg可能與較佳的長期結(jié)果有關(guān)。這些問題對于來自擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體或受體的器官使用增加是特別重要的，因?yàn)檫@些對CNI相關(guān)毒性特別易感。已經(jīng)歷腎移植的患者中CV和代謝事件的發(fā)生率減少對于改善長期結(jié)果也是關(guān)鍵的。本發(fā)明的分子或藥物組合物可以用于治療受試者中與移植物移植有關(guān)的免疫病癥，所述受試者是擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)受體和/或接受來自擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體的移植物的受體。這些標(biāo)準(zhǔn)部分基于由器官共享聯(lián)合網(wǎng)(UnitedNetworkofOrganSharing)(UNOS)提出的標(biāo)準(zhǔn)，可以包括下列中的一個(gè)或多個(gè)供體年齡小于10歲或大于或等于60歲；心源性死亡后的供體；供體器官的預(yù)期冷缺血時(shí)間大于或等于24小時(shí)；經(jīng)歷第1次移植當(dāng)前PRA》50%，或經(jīng)歷再次移植PRA》30。/。的患者；在移植后的前6個(gè)月過程中由于急性排斥先前移植物丟失的受試者；使用供體淋巴細(xì)胞和受體血清的T細(xì)胞淋巴細(xì)胞毒性交叉配型陽性的受試者；具有HIV感染的受試者；在前3年內(nèi)具有需要治療的活動(dòng)性結(jié)核的受試者；或由器官共享聯(lián)合網(wǎng)(UNOS)提出的其他標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于供體和/或供體腎的可能擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)的例子包括關(guān)于器官捐贈(zèng)的下列擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)中的至少一個(gè)a)供體年齡^60歲或b)供體年齡50-59歲以及下列之一(i)腦血管意外(CVA)+高血壓+8(^>1.5mg/dL或(ii)CVA十高血壓或(iii)CVA+SCr>1.5mg/dL或(iv)高血壓+SCr>1Jmg/dL或c)CIT224小時(shí)，供體年齡〉10歲或d)心源性死亡的供體(無心跳供體)。本發(fā)明還提供了用于抑制受試者中的移植物抗宿主病的方法。這種方法包括伴隨或順次地給受試者單獨(dú)或連同與IL-2、IL-2R、IL-4或y干擾素反應(yīng)的進(jìn)一步另外配體施用本發(fā)明可溶性CTLA4突變型分子。例如，本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子可以施用于骨髓移植受體以抑制供體T細(xì)胞的同種反應(yīng)性?？商娲兀撬枰浦参飪?nèi)的供體T細(xì)胞可以在移植前對受體的同種異體抗原先體外后體內(nèi)耐受化。本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子，例如L104EA29Y，可以作為唯一的活性成分或與免疫調(diào)諧方案中的一種或多種其他藥物、免疫抑制劑和/或其他抗炎劑一起伴隨或順次施用，例如用于治療、防止或抑制或預(yù)防同種異體移植物或異種移植物的急性或慢性排斥或誘導(dǎo)耐受性。例如，它可以與下列試劑組合使用鉤依賴磷酸酶抑制劑(例如環(huán)孢菌素A或FK506);免疫抑制性大環(huán)內(nèi)酯(例如他克莫司、雷帕霉素、西羅莫司)或其衍生物(例如40-0-(2-羥基)乙基-雷帕霉素、西羅莫司、centican);淋巴細(xì)胞歸巢劑(例如FTY720)或其類似物(FK778，Jak-3)，皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；azathioprene;氨曱蝶呤；來氟洛米或其類似物；咪唑立賓；霉酚酸；霉酚酸酯；15-deoxyspergualine或其類似物;4十對白細(xì)月包受體(例如，MHC、CD2、CD3、CD4、CDlla/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、0X40、4-lBB或其配體)的免疫抑制性單克隆抗體(例如，巴利昔單抗、達(dá)克珠單抗(daclizumab))、配體、單克隆抗體或其抗體片段；或其他免疫調(diào)諧化合物(例如CTLA4/CD28-Ig)，或其他粘附分子抑制劑(例如mAbs)或低分子量抑制劑包括LFA-1拮抗劑、選擇素拮抗劑和VLA-4拮抗劑。該化合物與干擾CD40及其配體(例如，針對CD40的抗體或針對CD40-L的抗體)的化合物例如Chi220(美國專利6,051,228)組合，例如在上述適應(yīng)癥例如耐受性的誘導(dǎo)中特別有用。當(dāng)本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子與其他免疫抑制/免疫調(diào)諧療法例如如本文說明的一起伴隨或順次施用時(shí)，共施用的免疫抑制劑或免疫調(diào)諧化合物的劑量當(dāng)然將依采用的共同藥物(co-drug)的類型例如它是類固醇還是環(huán)孢菌素、采用的具體藥物、待治療的狀況等而變。依照前述，本發(fā)明進(jìn)一步提供了例如用于在如上限定的任何方法中使用的治療組合例如試劑盒，其包括游離形式或藥學(xué)可接受鹽形式的L104EA29YIg,以用于與包括免疫抑制劑、免疫調(diào)諧劑或消炎藥的至少一種藥物組合物伴隨或順次使用。試劑盒可以包括關(guān)于其施用的說明書。依照前述，本發(fā)明在再進(jìn)一步的方面提供了如上限定的方法，其包括例如伴隨或順次共施用治療有效劑量的本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子與免疫抑制劑。免疫抑制劑包括可溶性gp39(也稱為CD40配體(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)，可溶性CD29，可溶性CD40,可溶性CD80(例如ATCC68627),可溶性CD86,可溶性CD28(例如68628),可溶性CD56,可溶性Thy-1，可溶性CD3,可溶性TCR,可溶性VLA-4,可溶性VCAM-1,可溶性LECAM-1,可溶性ELAM-1，可溶性CD44，與gp39反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段(例如ATCCHB-10916、ATCCHB-12055和ATCCHB-12056)，與CD40反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段(例如ATCCHB-9110)，與B7反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段(例如ATCCHB-253、ATCCCRL-2223、ATCCCRL-2226、ATCCHB-301、ATCCHB—11341等)，與CD28反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段(例如ATCCHB-11944或如Martin等人(J.Clin.Immun.4(1):18-22,1980描述的mAb9.3)，與LFA-l反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段(例如ATCCHB-9579和ATCCTIB-213),與LFA-2反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與IL-2或IL-2R反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與IL-12反應(yīng)的配體、抗體或抗體片^:,與IFN-y反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CD2反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CD48反應(yīng)的抗體配體、抗體或抗體片段，與任何ICAM(例如ICAM-1(ATCCCRL-2252),ICAM-2和ICAM-3)反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CTLA4反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段(例如，ATCCHB-304)，與Thy-1反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CD56反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CD3反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CD29反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與TCR反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與VLA-4反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與VCAM-1反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與LECAM-1反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與ELAM-1反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段，與CD44反應(yīng)的配體、抗體或抗體片段。在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體是優(yōu)選的。在其他實(shí)施方案中，抗體片段是優(yōu)選的。抗體片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs),包括但不限于WO2006/030220中描述的那些。如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，組合可以包括本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子和1種其他免疫抑制劑，可溶性CTLA4突變型分子和2種其他免疫抑制劑，可溶性CTLA4突變型分子和3種其他免疫抑制劑等。最佳組合和劑量的確定可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法確定和最優(yōu)化。一種特別有用的組合是L104EA29YIg或其藥物組合物與干擾IL-2及其配體的化合物，特別是針對在活化T淋巴細(xì)胞表面上選擇性表達(dá)的IL-2R(a)的拮抗劑。結(jié)合IL-2R(a)的化合物竟?fàn)幮砸种艻L-2介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞激活，這是同種異體移植物排斥中涉及的細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵途徑。某些具體組合包括下列L104EA29YIg和CD80單克隆抗體(mAbs);L104EA29YIg和CD86mAbs;L104EA29YIg、CD80mAbs和CD86mAbs;L104EA29YIg和gp39mAbs;L104EA29YIg和CD40mAbs;L104EA29YIg和CD28mAbs;L104EA29YIg、CD80和CD86mAbs以及gp39mAbs;L104EA29YIg、CD80和CD86mAbs和CD40mAbs;和L104EA29YIg、抗-LFAlmAb和抗-gp39mAb。gp39mAb的具體例子是MR1。其他組合也是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解和理解的。依照前述，本發(fā)明在再進(jìn)一步的方面提供了如上限定的方法，其包括例如伴隨或順次共施用治療有效劑量的本發(fā)明的可溶性CTLA4突變型分子與附加劑和/或皮質(zhì)類固醇。目的是用本發(fā)明的CTLA4突變型分子代替毒性鈣依賴磷酸酶抑制劑。然而，本發(fā)明的CTLA4突變型分子還可以與CNIs例如環(huán)孢菌素(Neoral,來自Novartis的Sandimmune)和他克莫司(FK506,來自Fujisawa的Progra產(chǎn))伴隨或順次共施用。附加劑的例子包括但不限于肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)的抑制劑，例如霉酚酸酯(MMF;來自RocheLaboratories的Cellcept)和霉酚酸(來自Novartis的Myfortic);雷帕霉素(西羅莫司，來自Wyeth/Ayerst的Rapamune);口米p坐3危噪口令(來自Salix的Azarsan,Imuran,—般的);淋巴細(xì)胞歸巢劑,例如FTY720(來自Novartis);FK778(來自Fujisawa);Jak-3(來自Pfizer);和Certican(來自Novartis的依維莫司(everolimus))。皮質(zhì)類固醇的例子包括但不限于，倍他米松、布地奈德、氫化可的松、可的松、地塞米松、hydrocritisone、曱基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的+〉禾口去炎+>。一般的共施用組合包括但不限于L104EA29YIg和選自上文列出的組的至少一種附加劑；L104EA29YIg和選自上文列出的組的至少一種皮質(zhì)類固醇；L104EA29YIg、MMF(來自Roche的Cellcept)和選自上文列出的組的一種皮質(zhì)類固醇；L104EA29YIg、雷帕霉素(西羅莫司，來自Wyeth/Ayerst的Rapamune)含或不含選自上文列出的組的皮質(zhì)類固醇。上文描述的共施用組合可以與誘導(dǎo)劑例如免疫抑制性單克隆抗體一起使用，例如巴利昔單抗(來自Novartis的Simulect)、莫羅單抗(m腦monab)(來自O(shè)rthoBiotech的OrthocloneOKT3)、利妥昔單抗(來自Genentech的Rituxan)和達(dá)克3朱單抗(來自RocheLabs的Zenapax);或抗胸腺細(xì)胞球蛋白(來自SangStat的Thymoglobulin)。例如，合適的組合包括但不限于巴利昔單抗(來自Novartis的Simulect)與L104EA29YIg,MMF(來自Roche的Cellcept)詳口強(qiáng)的+〉龍；或達(dá)克玉朱單4元(來自RocheLabs的Zenapax)、L104EA29YIg和雷帕霉素(西羅莫司，來自Wyeth/Ayerst的Rapamune)。一般地，上文描述的共施用藥物的標(biāo)準(zhǔn)劑量和施用方案不受向治療方案中加入本發(fā)明CTLA4突變型分子的影響。然而，由于向治療方案中摻入較低毒性的本發(fā)明CTLA4突變型分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開處較低劑量的共施用藥物，例如附加劑和/或皮質(zhì)類固醇。處方信息可以基于關(guān)于每種共施用藥物的包裝插頁。皮質(zhì)類固醇可以與本發(fā)明的分子或藥物組合物共施用。例如，受試者可以用皮質(zhì)類固醇每天治療1次。一種類固醇維持和逐漸減少的策略可以包括在到達(dá)手術(shù)室(OR)時(shí)500mg靜脈內(nèi)曱基強(qiáng)的松龍，在第2天時(shí)250mg靜脈內(nèi)甲基強(qiáng)的松龍，隨后為在第3天時(shí)經(jīng)口100mg強(qiáng)的松(或強(qiáng)的松龍)，隨后為到第2周結(jié)束時(shí)逐漸減少至20-30mg/天的強(qiáng)的松(或強(qiáng)的松龍)，隨后為到第6個(gè)月逐漸減少至不低于2.5mg/天的強(qiáng)的松(或強(qiáng)的松龍)。受試者可以在其治療過程中自始至終保持在至少2.5mg/天。另外的共施用藥物可以包括霉酚酸酯(MMF)。一般地MMF根據(jù)與時(shí)刻和膳食有關(guān)的一致時(shí)間表以2次分開的劑次施用。關(guān)于MMF的施用方案的例子包括每天2g。第l劑可以在手術(shù)前施用。后續(xù)劑可以在受試者一能夠耐受經(jīng)口藥物時(shí)就經(jīng)口(p.o.)施用。劑次和時(shí)間表可以基于實(shí)驗(yàn)室值(例如減少的WBCs)和受試者可容許性來調(diào)整。包裝插頁提供了完整的處方信息。另一種共施用藥物可以包括巴利昔單抗。重構(gòu)的巴利昔單抗(溶于5mL中的20mg)可以用生理鹽水或葡萄糖5%稀釋至50mL的體積并且作為靜脈內(nèi)輸注在20-30分鐘內(nèi)施用。第1次20mg劑量可以在第1天時(shí)(移植當(dāng)天)施用。第2次^mg劑量可以在第5天時(shí)給予。包裝插頁提供了完整的處方信息。另外提供的是例如用于在如上限定的任何方法中使用的治療組合例如試劑盒，其包括游離形式或藥學(xué)可接受鹽形式的L104EA29YIg,以用于與包括附加劑和皮質(zhì)類固醇的至少一種藥物組合物伴隨或順次使用。試劑盒可以包括關(guān)于其施用的說明書。標(biāo)簽和/或說明書可以指出藥物組合物可以單獨(dú)或與第二種試劑組合伴隨或順次使用，以治療選擇的狀況，例如如上所述的免疫系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、與移植物移植有關(guān)的免疫病癥。標(biāo)簽可以指出關(guān)于本文公開的分子的合適劑量。例如，標(biāo)簽可以指出對于阻斷B7與其配體相互作用和/或治療免疫系統(tǒng)疾病有效的分子劑量可以基于體重，并且施用方案可以由靶血清谷特征指出。例如，標(biāo)簽可以指出本文公開的CLTA4突變型分子治療免疫系統(tǒng)疾病的有效靶谷血清濃度可以為約0.2|Lig/mL-約30貼/mL。可替代地，標(biāo)簽可以指出本文公開的CLTA4突變型分子可以以約0.1-約20.0mg/kg患者重量的量施用以治療免疫系統(tǒng)疾病。用于生產(chǎn)本發(fā)明分子的方法CLTA4突變型分子的表達(dá)可以是在原核細(xì)胞中。最常見的原核生物由各種細(xì)菌菌林代表。細(xì)菌可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的。一般地，革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌(E.coli)是優(yōu)選的。其他微生物菌抹也可以使用。編碼CLTA4突變型分子的序列可以插入到設(shè)計(jì)用于在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中表達(dá)外來序列的載體內(nèi)。這些載體可以包括常用的原有操縱基因，連同核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，包括此類常用啟動(dòng)子如P內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang，等人，(l977)Wo^re198:1056),色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel,等人，(1980)Wwc/e/cJc/Ai^^.8:4057)和X衍生的PL啟動(dòng)子和N基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shimatake，等人，(1981)7V"^292:128)。此類表達(dá)載體還將包括復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，例如賦予抗生素抗性的P內(nèi)酰胺酶或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，從而使得載體可以在攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌和細(xì)胞中復(fù)制，當(dāng)在抗生素例如氨千青霉素或卡那霉素的存在下生長時(shí)可以選擇。表達(dá)質(zhì)?？梢越?jīng)由各種標(biāo)準(zhǔn)方法引入原核細(xì)胞內(nèi)，包括但不限于CaCl2^木克(Cohen，(1972)A^".Jc"dfAS^69:21IO，和Sambrook等人，(eds.)，"Mo/ecM/crC7om'"gv^丄G6ora/^7Mtm冊/",2ndEdition,ColdSpringHarborPress,(1989))和電穿孑L。依照本發(fā)明的實(shí)踐，真核細(xì)胞也是合適的宿主細(xì)胞。真核細(xì)胞的例子包括無論是原代還是無限增殖化的任何動(dòng)物細(xì)胞，酵母(例如啤酒并唐酵母(Sacc/zaromycesceww\s/ae)、粟酒裂歹直#唐酵母(5V/2/zosacc/zaraw;KCM/o"6e)和巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/z/a/7"5ton、))，和植物細(xì)胞。骨髓瘤、COS和CHO細(xì)胞是可以用作宿主的動(dòng)物細(xì)胞的例子。具體的CHO細(xì)胞包括但不限于，DG44(Chasin,等人，1986S纖CW/.G潔A12:555-556;Kolkekar1997肌oc/^脂.W^y36:10901—10909)，CHO-Kl(ATCCNo.CCL_61),CHO—KlTet-On細(xì)胞系(Clontech)，稱為ECACC85050302的CHO(CAMR，Salisbury,Wiltshire,UK)，CHO克隆13(GEIMG，Genova,IT)，CHO克隆B(GEIMG,Genova,IT),稱為ECACC93061607的CHO—Kl/SF(CAMR，Salisbury,Wiltshire,UK),以及稱為ECACC92052129的RR—CHOK1(CAMR，Salisbury,Wiltshire,UK)。示例性植物細(xì)胞包括煙草(完整植物、細(xì)胞培養(yǎng)物或愈傷組織)、玉米、大豆和稻細(xì)胞。玉米、大豆和稻種子也是可接受的。編碼CTLA4突變型分子的核酸序列也可以插入到設(shè)計(jì)用于在真核宿主中表達(dá)外來序列的載體內(nèi)。載體的調(diào)節(jié)元件可以根據(jù)具體的真核宿主而變。用于在表達(dá)載體中使用的常用真核控制序列包括與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相容的啟動(dòng)子和控制序列，例如，CMV啟動(dòng)子(CDMS載體)和鳥類肉瘤病毒(ASV)ULN載體)。其他常用的啟動(dòng)子包括來自猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期啟動(dòng)子(Fiers，等人，(1973)A^w"273:113)，或其他病毒啟動(dòng)子例如來源于多瘤、腺病毒2和牛乳頭瘤病毒的那些。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如hMTII(Karin,等人，(1982)A^fwre299:797-802)也可以-使用。用于在真核生物中表達(dá)CTLA4突變型分子的載體也可以攜帶稱為增強(qiáng)子區(qū)的序列。這些在基因表達(dá)最優(yōu)化中是重要的并且在啟動(dòng)子區(qū)的上游或下游找到。用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的例子包括但不限于用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的載體(例如BPV-1,pHyg，pRSV,pSV2，pTK2(Maniatis);pIRES(Clontech);pRc/CMV2，pRc/RSV,pSFVl(LifeTechnologies);pVPakc載體，pCMV載體，pSG5載體(Stratagene))，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如pFB載體(Stratagene))，pCDNA-3(Invitrogen)或其修飾形式，腺病毒載體；腺伴隨病毒載體，桿狀病毒載體，酵母載體(例如pESC載體(Stratagene))。編碼CTLA4突變型分子的核酸序列可以整合到真核宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)并且當(dāng)宿主基因組復(fù)制時(shí)進(jìn)行復(fù)制?？商娲兀瑪y帶CTLA4突變型分子的載體可以包含允許染色體外復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。對于在啤酒糖酵母中表達(dá)核酸序列，可以使用來自內(nèi)源性酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)_2|^環(huán)。(Broach,(1983)Me仇￡"z.101:307)。可替代地，可以使用能夠促進(jìn)自主復(fù)制的來自酵母基因組的序列(參見，例如，Stinchcomb等人，(1979)to匿282:39);Tschemper等人，(1980)10:157;以及Clarke等人，(1983)Mw/z.101:300)。關(guān)于酵母載體的轉(zhuǎn)錄控制序列包括用于合成糖酵解酶的啟動(dòng)子(Hess等人，(1968)J.Jdv.7:149;Holland等人，(1978)B/oc/zem&^y17:4900)。本領(lǐng)域已知的另外啟動(dòng)子包括CDM8載體中提供的CMV啟動(dòng)子(Toyama和Okayama，(1990)i^L8S268:217-221);用于3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子(Hitzeman等人，(1980)J.肌o/.C/zew.255:2073)，以及用于其他糖酵解酶的那些。長培i基i調(diào)節(jié)。這些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包口括來自關(guān)于熱激蛋白:醇i氬酶2、異細(xì)胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、與氮分解代i射有關(guān)的酶、以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的基因的那些。調(diào)節(jié)序列還可以被置于編碼序列的3'末端。這些序列可以用于穩(wěn)定信使RNA。此類終止子在幾種酵母來源的和哺乳動(dòng)物基因中編碼序列后的3'非翻譯區(qū)內(nèi)找到。關(guān)于植物和植物細(xì)胞的示例性載體包括但不限于，土壤桿菌屬(Agrobacterium)Tj質(zhì)粒、花椰菜花葉病毒(CaMV)和番茄金黃花葉病毒(TGMV)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面已由Axel描述(1983年8月16日授權(quán)的美國專利號4，399，216)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過下列方法轉(zhuǎn)化，包括但不限于在磷酸鈣的存在下轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔或經(jīng)由使用病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)。用于將外來DNA序列引入植物和酵母基因組內(nèi)的方法包括(1)機(jī)械法，例如將DNA顯微注射到單細(xì)胞或原生質(zhì)體內(nèi)，在DNA的存在下使細(xì)胞與玻璃珠一起渦旋，或?qū)NA包被的鴒或金球體射入細(xì)胞或原生質(zhì)體；(2)通過經(jīng)由聚乙二醇處理或?qū)嵤└邏弘娒}沖(電穿孔)使細(xì)胞膜對大分子可滲透而引入DNA;或(3)使用與細(xì)胞膜融合的脂質(zhì)體(包含cDNA)。CTLA4突變型分子的表達(dá)可以通過本領(lǐng)域已知的方法來4企測。例如，突變型分子可以通過考馬斯染色SDS-PAGE凝膠和使用結(jié)合CTLA4的抗體的免疫印跡來檢測。蛋白質(zhì)回收可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法例如親和層析或離子交換層析進(jìn)行，以產(chǎn)生基本上純的產(chǎn)物(R.Scopes:"Proto'w尸wWca"ow,/VZwc/p/esa/W尸ra"/ce",ThirdEdition,Springer-Verlag(1994))。美國專利申請美國/^開號2005/0019859、2005/0084933和WO04/058944教導(dǎo)了通過動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，特別是重組糖蛋白產(chǎn)物的方法，并引入本文作為參考。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本文上文生產(chǎn)的可溶性CTLA4突變型分子?；贑TLA4Ig密碼子的誘變在一個(gè)實(shí)施方案中，使用定點(diǎn)誘變和新型篩選操作來鑒別CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中改善對于CD86的結(jié)合抗體親抗原性的幾種突變。在這個(gè)實(shí)施方案中，突變在絲氨酸25至精氨酸33的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域區(qū)內(nèi)、C，鏈(丙氨酸49和蘇氨酸51)、F鏈(賴氨酸93、谷氨酸95和亮氨酸96),以及曱硫氨酸97到酪氨酸102、酪氨酸103到甘氨酸107區(qū)內(nèi)，以及G鏈中谷氨酰胺111、酪氨酸113和異亮氨酸115位上的殘基中進(jìn)行。這些位點(diǎn)基于嵌合CD28/CTLA4融合蛋白的研究(Peach等人，J.Exp.Med，1994，180:2049-2058)，以及預(yù)測哪個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈將是溶劑暴露的模型且在CD28和CTLA4之間的某些位置上缺乏氨基酸殘基同一性或同源性選擇。同樣地，在空間上緊密接近于(5-20埃單位)被鑒別殘基的任何殘基都視為本發(fā)明的部分。為了合成并篩選對于CD80和/或CD86親和力改變的可溶性CTLA4突變型分子，采用2步策略。實(shí)驗(yàn)需要首先產(chǎn)生在CTLA4細(xì)胞外部分的特定密碼子上的突變文庫，并隨后通過BIAcore分析篩選這些，以鑒別對于CD80或CD86反應(yīng)性改變的突變。Biacore測定系統(tǒng)(Pharmacia,Piscataway,N丄)使用表面等離振子共振檢測器系統(tǒng)，其基本上涉及CD80Ig或CD86Ig與位于檢測器內(nèi)的葡聚糖包被的傳感器芯片的共價(jià)結(jié)合。測試分子隨后可以注射到包含傳感器芯片的室內(nèi)并且結(jié)合的互補(bǔ)蛋白質(zhì)的量可以基于分子量中的變化進(jìn)行評估，所述分子量與傳感器芯片的葡聚糖包被側(cè)物理關(guān)聯(lián)；分子量中的變化可以通過檢測器系統(tǒng)進(jìn)行測量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)因?yàn)镃TLA4與CD80和CD86結(jié)合的特征在于快速"結(jié)合(on)"速率和快速解離("解離(off)")速率，并且因?yàn)镃TLA4Ig-CD86復(fù)合物的解離為CTLA4Ig-CD80復(fù)合物的大約5-8倍，所以推斷CTLA4Ig從CD80和/或CD86解離的速率減慢將導(dǎo)致具有更有效的免疫抑制特性的分子。因此，與野生型CTLA4或非突變形式的CTLA4Ig比較，對于CD80-或CD86-陽性細(xì)胞抗體親抗原性更高的可溶性CTLA4突變型分子預(yù)期比野生型CTLA4或非突變形式的CTLA4Ig更有效地阻斷抗原特異性活化細(xì)胞的啟動(dòng)。實(shí)施例呈現(xiàn)下列實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員制備并使用其。實(shí)施例不希望以任何方式在其他方面限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1這個(gè)實(shí)施例提供了用于產(chǎn)生編碼本發(fā)明可溶性CTLA4突變型分子的核香酸序列的方法描述。產(chǎn)生單位點(diǎn)突變體L104EIg并測試對于CD80和/或CD86的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。將L104EIg核苷酸序列用作模板以產(chǎn)生雙位點(diǎn)突變體CTLA4序歹'JL104EA29YIg，測試其對于CD80和/或CD86的結(jié)合動(dòng)力學(xué)?；贑TLA4Ig密碼子的誘變開發(fā)一種誘變和篩選策略以鑒別從CD80和/或CD86分子解離的速率("解離"速率)較慢的突變型CTLA4Ig分子。使用CTLA4Ig(美國專利號:5,844,095;5,851,795;和5,885,796;ATCC登記號68629)作為模板產(chǎn)生單位點(diǎn)突變體的核苦酸序列。誘變寡核苷酸PCR引物被設(shè)計(jì)為通過允許密碼子的第l和2位上是任何堿基，但第3位只是鳥嘌呤或胸腺嘧啶(XXG/T;也稱為NNG/T)用于特定cDNA密碼子的隨機(jī)誘變。以這種方式，編碼氨基酸的特定密碼子可以被隨機(jī)突變以編碼20種氨基酸中的每一種。在那點(diǎn)上，XXG/T誘變產(chǎn)生編碼20種氨基酸中的每一種的32種可能密碼子。編碼緊密接近于CTLA4Ig的-M97-G107的突變的PCR產(chǎn)物(參見圖7，SEQIDNOS:3和4;或圖8,SEQIDNOS:5和6)用Sacl/Xbal消化并亞克隆到類似切割的CTLA4Ig兀LN(也稱為piLN)表達(dá)載體內(nèi)。這種方法用于產(chǎn)生單位點(diǎn)CTLA4突變型分子L104EIg(圖8，SEQIDNOS:5和6)。對于接近于CTLA4Ig的S25-R33的誘變，首先通過PCR引物指導(dǎo)的誘變向這個(gè)環(huán)的5'引入沉默Nhel限制位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物用Nhel/Xbal消化并亞克隆到類似切割的CTLA4Ig或L104EIg表達(dá)載體內(nèi)。這種方法用于產(chǎn)生雙位點(diǎn)CTLA4突變型分子L104EA29YIg(圖7，SEQIDNOS:3和4)。具體地，編碼單位點(diǎn)CTLA4突變型分子L104EIg的核酸分子用作模板以產(chǎn)生雙位點(diǎn)CTLA4突變型分子L104EA29YIg。具有L104EA29YIg的piLN載體在圖12中顯示。實(shí)施例2下文提供了用于鑒別由實(shí)施例1中所述構(gòu)建體表達(dá)的單和雙位點(diǎn)突變型CTLA4多肽的篩選方法描述，與非突變的CTLA4Ig分子比較其顯示出對于CD80和CD86抗原更高的結(jié)合抗體親抗原性。目前的體外和體內(nèi)研究指出CTLA4Ig自身不能完全阻斷抗原特異性活化T細(xì)胞的啟動(dòng)。使用CTLA4Ig以及對CD80或CD86特異的單克隆抗體測量T細(xì)胞增殖抑制的體外研究指出抗CDSO單克隆抗體不增力。CTLA4Ig抑制。然而，抗CD86單克隆抗體的確增加抑制，從而表明CTLA4Ig在阻斷CD86相互作用方面不夠有效。這些數(shù)據(jù)支持Linsley等人，(/mw冊/(y,(1994)，1:793-801)的早期發(fā)現(xiàn)，其顯示CD80介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的抑制需要為對于CD86介導(dǎo)的應(yīng)答的大約1/100的CTLA4Ig濃度。基于這些發(fā)現(xiàn)，推測具有對于CD86的抗體親抗原性比野生型CTLA4更高的可溶性CTLA4突變型分子應(yīng)當(dāng)能夠比CTLA4Ig更好地阻斷抗原特異性活化細(xì)胞的啟動(dòng)。為此，使用新型篩選方法篩選上文實(shí)施例1中描述的可溶性CTLA4突變型分子，以鑒別CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中改善對于CD80和CD86的結(jié)合抗體親抗原性的幾種突變。這種篩選策略提供了無需蛋白質(zhì)純化或定量而直接鑒別具有明顯較慢的"解離"速率的突變體的有效方法，因?yàn)?解離，，速率測定是濃度依賴性的(O，Shannessy等人，(1993)肌oc/ze肌，212:457-468)。COS細(xì)胞用單個(gè)小量制備純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染并繁殖幾日。將3天條件培養(yǎng)基施加于由可溶性CD80Ig或CD86Ig包被的BIAcore生物傳感器芯片(PharmaciaBiotechAB,Uppsala,瑞典)。突變蛋白的特異性結(jié)合和解離通過表面等離振子共振測量(O，Shannessy，D.J.,等人，(1993)肌oc/7em.212:457—468)。所有實(shí)驗(yàn)都于25。C在BIAcoreTM或BIAcore2000生物傳感器上進(jìn)行。配體使用標(biāo)準(zhǔn)N-乙基-N，(二曱氨基丙基)碳二亞胺-N-羥基琥珀酰亞胺偶聯(lián)固定在研究級NCM5傳感器芯片(Pharmacia)上(Johnsson,B.,等人，(1991)^wa/.5/oc/76>"7.198:268—277;Khilko，S.N.,等人(1993)丄腸/.C7z縱268:5425-15434)。篩選方法在24孔組織培養(yǎng)板中生長的COS細(xì)胞用編碼突變型CTLA4Ig的DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。3天后收集包含分泌的可溶性突變型CTLA4Ig的培養(yǎng)基。允許COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基流經(jīng)用CD86Ig或CD80Ig衍生化的BIAcore生物傳感器芯片(如Greene等人，1996歷o/,C/zem.271:26762-26771中描述的)，并且鑒別具有比對于野生型CTLA4Ig觀察到的那種更慢的"解離"速率的突變型分子。測序?qū)?yīng)于所選培養(yǎng)基樣品的cDNAs并且制備DNA以進(jìn)行大規(guī)模的COS細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)基的A蛋白純化后由其制備突變型CTLA4Ig蛋白質(zhì)。如J.Greene等人，1996J.Biol.Chem.271:26762-26771中所述，并如本文所述進(jìn)行BIAcore分析條件和平衡結(jié)合數(shù)據(jù)分析。BIAcore數(shù)據(jù)分析傳感圖(Senosorgram)基線在分析前對零應(yīng)答單位(RU)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。樣品經(jīng)過模擬衍生化的流動(dòng)室以測定由于溶液之間的體積折光指數(shù)差異的背景應(yīng)答單位(RU)值。平衡解離常數(shù)(Kd)由R叫對C的圖計(jì)算，其中Req是穩(wěn)定狀態(tài)的應(yīng)答減去對模擬衍生化的芯片的應(yīng)答，并且c是分析物的摩爾濃度。結(jié)合曲線使用商業(yè)非線性曲線擬合軟件(Prism,GmphPADSoftware)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首先對單配體結(jié)合單受體的模型擬合(1位點(diǎn)模型，即簡單朗格繆爾系統(tǒng)，A+B屮AB),并且平衡解離常數(shù)(Kd=[A]*[B]\[AB])由等式R二R隨'C/(Kd+C)計(jì)算。隨后，數(shù)據(jù)對最簡單的2位點(diǎn)配體結(jié)合模型擬合(即，如等式R^R,x,'CA(Kdl+C)+Rmax2'C\(Kd2+C)描述的具有2個(gè)非相互作用的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)的受體)。這2個(gè)模型的擬合優(yōu)度通過比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在視覺上以及通過平方和的F檢驗(yàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析。選擇較簡單的單位點(diǎn)模型作為最佳擬合，除非2位點(diǎn)模型擬合明顯更佳(p<0.1)。使用BIA評估2.1Software(Pharmacia)進(jìn)行結(jié)合和解離分析。結(jié)合速率常數(shù)k。n以2種方式計(jì)算，假定同質(zhì)單位點(diǎn)相互作用和平行的2位點(diǎn)相互作用。對于單位點(diǎn)相互作用，k。。值根據(jù)等式R產(chǎn)R叫(1-exp—ks(tA)計(jì)算，其中Rt是在給定時(shí)間t的應(yīng)答；Req是穩(wěn)定狀態(tài)的應(yīng)答；t。是注射開始時(shí)的時(shí)間；以及ks=dR/dt=k。n*Ck。ff，并且其中C是分析物的濃度，根據(jù)單體結(jié)合位點(diǎn)計(jì)算。對于2位點(diǎn)相互作用，k。n值根據(jù)等式R產(chǎn)R叫(1-exp—ksl(t—V+R叫2(1-expks2(t—V計(jì)算。對于每種模型，k。J直由ks對C的圖計(jì)算的斜率(至約70%的最大結(jié)合)測定。解離數(shù)據(jù)根據(jù)單位點(diǎn)(AB=A+B)或2位點(diǎn)(AiBj=Ai+Bj)模型分析，并且速率常數(shù)(k。ff)由最佳擬合曲線計(jì)算。使用結(jié)合位點(diǎn)模型，除了殘留比機(jī)器背景(2-10RU,根據(jù)機(jī)器)更高時(shí)，在這種情況下使用2結(jié)合位點(diǎn)模型。受體占有的半衰期使用關(guān)系t1/2=0.693/k。ff計(jì)流式細(xì)胞術(shù)鼠類mAbL307.4(4元CD80)購自BectonDickinson(SanJose,California)并且IT2.2(抗B7-0[也稱為CD86])購自Pharmingen(SanDiego，California)。對于免疫染色，CD80陽性和/或CD86陽性的CHO細(xì)胞通過在包含10mMEDTA的磷酸緩沖鹽水(PBS)中溫育從其培養(yǎng)瓶中取出。CHO細(xì)胞(1-10x105)首先在包含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中與mAbs或免疫球蛋白融合蛋白溫育，隨后洗滌并與異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗小鼠或抗人免疫球蛋白第二步試劑(Tago，Burlingame,California)溫育。對細(xì)胞給予最終洗滌并在FACScan(BectonDickinson)上分析。SDS-PAGE和大小排阻層析SDS-PAGE在Tris/甘氨酸4-20%丙烯酰胺凝膠(Novex,SanDiego,CA)上進(jìn)行。分析型凝膠用考馬斯藍(lán)染色，并通過數(shù)字掃描獲得濕凝膠的圖像。CTLA4Ig(25嗎)和L104EA29YIg(25嗎)通過大小排阻層析使用在包含0.02%NAN3的磷酸緩沖鹽水中平衡的TSK-GELG300SWxl柱(7.8x300mm,Tosohaas,Montgomeryville,PA)以1.0ml/分鐘的流速進(jìn)行分析。CTLA4Xc,2os和L104EA29YXC120S單鏈CTLA4Xd2。s如先前所述進(jìn)行制備(Linsley等人，(1995)J.Biol.Chem.，270:15417—15424)。簡言之，制瘤素MCTLA4(OMCTLA4)表達(dá)質(zhì)粒用作模板，選擇正向引物GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG以匹配載體中的序列；并且反向引物GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC對應(yīng)于CTLA4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的最后7個(gè)氨基酸(即氨基酸118-124)，并且包含限制酶位點(diǎn)和終止密碼子(TGA)。反向引物限定C120S(第120位的半胱氨酸至絲氨酸)突變。具體地，上文所示反向引物的核苷酸序列GCA(核苦酸34-36)由下列核苷酸序列之一代替AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，核普酸序列GCA是關(guān)于半胱氨酸的密碼子TGC的反向互補(bǔ)序列。類似地，核苷酸序列AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT是關(guān)于絲氨酸的密碼子的反向互補(bǔ)序列。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物用///"t/III/X^I消化并直接亞克隆到表達(dá)載體兀LN(Bristol-MyersSquibbCompany,Princeton，NJ)內(nèi)。以相同方式制備L104EA29YXC12QS。每種構(gòu)建體通過DNA測序驗(yàn)證。高抗體親抗原性突變體的鑒別和生物化學(xué)表征選擇24個(gè)氨基酸用于誘變并通過表面等離振子共振(SPR;如上所述)分析所得到的2300種突變蛋白的CD86Ig結(jié)合。每個(gè)位點(diǎn)上的誘變的占優(yōu)勢作用概括于表II中。S25-R33中某些氨基酸的隨機(jī)誘變顯然不改變配體結(jié)合。E31和R33以及殘基M97-Y102的誘變顯然導(dǎo)致配體結(jié)合減少。殘基S25、A29和T30、K93、L96、Y103、L104和G105的誘變導(dǎo)致具有緩慢"結(jié)合"和/或緩慢"解離"速率的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果證實(shí)先前發(fā)現(xiàn)S25-R33區(qū)內(nèi)的殘基，以及M97-Y102中或附近的殘基影響配體結(jié)合(Peach等人，(1994)J.Exp.Med.，180:2049—2058。位點(diǎn)S25、T30、K93、L96、Y103和G105的誘變導(dǎo)致鑒別從CD86Ig"解離"速率較慢的某些突變蛋白。然而，在這些情況下，緩慢的"解離"速率被緩慢的"結(jié)合"速率折衷，這導(dǎo)致具有對于CD86Ig的總體抗體親抗原性的突變蛋白，這顯然類似于由野生型CTLA4Ig觀察到的那種。此外，K93的誘變導(dǎo)致顯著聚集，這可能已負(fù)責(zé)觀察到的動(dòng)力學(xué)變化。L104的隨機(jī)誘變隨后為COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并且培養(yǎng)基樣品經(jīng)過固定化的CD86Ig的SPR篩選產(chǎn)生包含突變蛋白的6種培養(yǎng)基樣品，所述突變蛋白具有為野生型CTLA4Ig的大約1/2的"解離"速率。當(dāng)對這些突變體的相應(yīng)cDNA進(jìn)行測序時(shí)，發(fā)現(xiàn)每種都編碼亮氨酸至谷氨酸的突變(L104E)。顯然亮氨酸104至天冬氨酸的置換(L104D)不影響CD86Ig結(jié)合。隨后如上所述在表II中列出的每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)誘變，這次使用L104E代替野生型CTLA4Ig作為PCR模板。再次使用固定化的CD86Ig的SPR分析鑒別來自丙氨酸29誘變的6個(gè)培養(yǎng)基樣品，其具有為野生型CTLA4Ig的大約1/4的"解離"速率的蛋白質(zhì)。最慢的2種是酪氨酸置換(L104EA29Y)，2種是亮氨酸(L104EA29L)，1種是色氨酸(L104EA29W),并且1種是蘇氨酸(L104EA29T)。顯然當(dāng)丙氨酸29在野生型CTLA4Ig中單獨(dú)隨機(jī)突變時(shí)，沒有鑒別出緩慢"解離"速率的突變體。純化的L104E和L104EA29YIg的相對分子量和聚集狀態(tài)通過SDS-PAGE和大小排阻層析評估。L104EA29YIg(~1嗎；泳道3)和L104EIg(~1)ag;泳道2)在還原(~50kDa;+13ME;力口2-巰基乙醇)和非還原(~100kDa;-BME)條件下顯然具有與CTLA4Ig(~1|ig;泳道1)相同的電泳遷移率(圖10A)。大小排阻層析證實(shí)L104EA29YIg(圖10C)顯然具有與二聚CTLA4Ig(圖10B)相同的遷移率。主峰代表蛋白質(zhì)二聚物，而圖10B中較快洗脫的次峰代表較高分子量的聚集物。大約5.0%的CTLA4Ig呈現(xiàn)為較高分子量的聚集物，但沒有L104EA29YIg或L104EIg聚集的證據(jù)。因此，對于L104EIg和L104EA29YIg觀察到的與CD86Ig的較強(qiáng)結(jié)合不能歸因于由誘變誘導(dǎo)的聚集。平tf和動(dòng)態(tài)結(jié)合分析使用表面等離振子共振(SPR)對A蛋白純化的CTLAWg、L104EIg和L104EA29YIg進(jìn)行平衡和動(dòng)態(tài)結(jié)合分析。結(jié)果顯示于表I中。表I<table>complextableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>(值是來自3次不同實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)觀察到的平衡解離常數(shù)(Kd;表I)由經(jīng)過一定濃度范圍(5.0-200nM)產(chǎn)生的結(jié)合曲線來計(jì)算。L104EA29YIg比L104EIg或CTLA4Ig更強(qiáng)烈地結(jié)合CD86Ig。L104EA29YIg(3.21nM)比L104EIg(6.06nM)或CTLA4Ig(13.9nM)更低的Kd表明L104EA29YIg與CD86Ig更高的結(jié)合抗體親抗原性。L104EA29YIg(3.66nM)比L104EIg(4.47nM)或CTLA4Ig(6.51nM)更低的Kd表明L104EA29YIg與CD80Ig更高的結(jié)合抗體親抗原性。動(dòng)態(tài)結(jié)合分析揭示關(guān)于CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg結(jié)合CD80的比較"結(jié)合"速率是類似的，關(guān)于CD86Ig的"結(jié)合"速率(表I)也一樣。然而，關(guān)于這些分子的"解離"速率并不相等(表I)。與CTLA4Ig比較，L104EA29YIg從CD80Ig"解離"的速率為大約1/2，并且從CD86Ig"解離"的速率為大約1/4。L104E具有在L104EA29YIg和CTLA4Ig中間的"解離"速率。因?yàn)檫@些突變的引入沒有明顯地影響"結(jié)合"速率，所以由L104EA29YIg觀察到的對于CD80Ig和CD86Ig的抗體親抗原性增加很可能主要是由于"解離"速率減少。為了確定L104EA29YIg對于CD86Ig和CD80Ig的抗體親抗原性增加是由于突變影響每種單體結(jié)合為二聚物的方式，還是有抗體親抗原性增強(qiáng)性結(jié)構(gòu)變化引入每種單體中，如上文以及Linsley等人，(1995)J.Biol.Chem.，270:15417-15424所述,將半胱氨酸120誘變至絲氨酸后制備CTLA4和L104EA29Y細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單鏈構(gòu)建體。在其配體結(jié)合特性通過SPR分析前，純化蛋白質(zhì)CTLA4XC120S和L104EA29YXd2。s通過凝膠滲透層析顯示是單體的(Linsley等人，(1995),同上)。結(jié)果顯示2種單體蛋白質(zhì)對于CD86Ig的結(jié)合親和力為對于其分別的二聚物觀察到的大約1/80-1/35(表I)。這支持先前公布的數(shù)據(jù)，其確定CTLA4的二聚作用對于高抗體親抗原性配體結(jié)合是必需的(Greene等人，(1996)J.Biol.Chem.，271:26762-26771)。L104EA29YXC12QS以為CTLA4XC12QS的大約2倍的親和力結(jié)合CD80Ig和CD86Ig。增加的親和力是由于從兩種配體解離的大約1/3的速率。因此，經(jīng)由L104EA29Y的較強(qiáng)配體結(jié)合最可能是由于已引入每種單體鏈內(nèi)的抗體親抗原性增強(qiáng)性結(jié)構(gòu)變化而不是其中分子二聚化的改變?？贵w親抗原性增強(qiáng)性突變的定位和結(jié)構(gòu)分析CTLA4的纟田月包夕卜IgV樣結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)最近已通過NMR光語學(xué)測定(Metzler等人，(1997)NatureStruct.Biol.,4:527-531。這允許亮氨酸104和丙氨酸29在三維折疊中的精確定位(圖11A-B)。亮氨酸104位于高度保守的MYPPPY氨基酸序列附近。丙氨酸29位于S25-R33區(qū)的C末端附近，其在空間上鄰近于MYPPPY區(qū)。雖然這2個(gè)區(qū)底部的殘基之間有明顯的相互作用，但顯然L104和A29之間沒有直接的相互作用，盡管它們都構(gòu)成蛋白質(zhì)中的鄰接疏水核的部分。2個(gè)抗體親抗原性增強(qiáng)性突變的結(jié)構(gòu)結(jié)果通過建模來評估。A29Y突變可以容易地容納在S25-R33區(qū)和MYPPPY區(qū)之間的裂縫中，并且可以用于穩(wěn)定MYPPPY區(qū)的構(gòu)象。在野生型CTLA4中，L104與MYPPPY區(qū)附近的L96和V94形成廣泛的疏水相互作用。由于2個(gè)原因，谷氨酸突變采用類似于L104的那種的構(gòu)象是非常不可能的。首先，如果不顯著干擾S25-R33區(qū)就沒有足夠的空間容納結(jié)構(gòu)中更長的谷氨酸側(cè)鏈。其次，在疏水區(qū)內(nèi)隱藏谷氨酸側(cè)鏈的負(fù)電荷的能量成本將是大的。相反，建模研究預(yù)測谷氨酸側(cè)鏈向外翻轉(zhuǎn)至表面上，在那里它的電荷可以通過溶劑化來穩(wěn)定。此類構(gòu)象變化可以容易地被G105適應(yīng)，而區(qū)內(nèi)的其他殘基具有最低限度的變高抗體親抗原性突變體與表達(dá)CD80或CD86的CHO細(xì)胞的結(jié)合CTLA4Ig和突變型分子與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CD80+和CD86+CHO細(xì)胞結(jié)合的FACS分析(圖2)如本文所述進(jìn)行。CD80陽性和CD86陽性CHO細(xì)胞與濃度增加的CTLA4Ig、L104EA29YIg或L104EIg溫育，并隨后洗滌。結(jié)合的免疫球蛋白融合蛋白使用異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗人免疫球蛋白片全測。如圖2中所示，CD80陽性或CD86陽性CHO細(xì)胞(1.5x105)與指示濃度的CTLA4Ig(閉合方塊)、L104EA29YIg(圓圈)或L104EIg(三角形)于23。C溫育2小時(shí)，洗滌，并與異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗人免疫球蛋白抗體溫育。在FACScan上分析關(guān)于總共5,000個(gè)存活細(xì)胞的結(jié)合(單個(gè)測定)，并使用PC-LYSYS由數(shù)據(jù)直方圖測定平均熒光強(qiáng)度(MFI)。數(shù)據(jù)對于只與第二步試劑溫育的細(xì)胞測量的背景熒光(MFI=7)進(jìn)行校正。對照L6mAb(80jug/ml)產(chǎn)生MFI<30。這些結(jié)果代表4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig與人CD80轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的結(jié)合大約相等(圖2A)。L104EA29YIg和L104EIg比CTLA4Ig更強(qiáng)烈地結(jié)合由人CD86穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(圖2B)。功能測定人CD4陽性T細(xì)胞通過免疫磁性負(fù)選擇分離(Linsley等人，(1992)J.Exp.Med.176:1595-1604)。分離的CD4陽性T細(xì)胞在滴定濃度的抑制劑的存在下用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)力。CD80陽性或CD86陽性CHO細(xì)胞刺激。CD4陽性T細(xì)胞(8-10x104/孔)在1nMPMA的存在下與或不與被照射的CHO細(xì)胞刺激劑一起培養(yǎng)。增殖應(yīng)答通過在72小時(shí)培養(yǎng)的最后7小時(shí)過程中添加1pCi/孔[3H]胸苷測量。進(jìn)行經(jīng)由L104EA29YIg和CTLA4Ig的PMA力口CD80陽性CHO或CD86陽性CHO、刺激的T細(xì)胞的抑制。結(jié)果顯示于圖3中。L104EA29YIg抑制CD80陽性PMA處理的CHO細(xì)胞增殖超過CTLA4Ig(圖3A)。L104EA29YIg在抑制CD86陽性PMA處理的CHO細(xì)胞增殖方面同樣比CTLA4Ig有效(圖3B)。因此，L104EA29YIg是CD80和CD86介導(dǎo)的T細(xì)胞共刺激的更有效的抑制劑。圖4顯示通過L104EA29YIg和CTLA4Ig抑制上文制備的同種刺激的人T細(xì)胞，以及用表達(dá)CD80和CD86、稱為PM的人B類淋巴母細(xì)胞系(LCL)進(jìn)一步同種刺激的(T細(xì)胞為3.0xl0V孔，并且PM為8.0xl0V孔)。初級同種刺激發(fā)生6天，隨后細(xì)胞用3H胸苷脈沖7小時(shí)，之后測定4參入的》文射性標(biāo)記。次級同種刺激如下進(jìn)行。7天初級同種刺激的T細(xì)胞經(jīng)由淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(LSM)(ICN,Aurora,OH)收獲并靜置24小時(shí)。T細(xì)胞隨后在滴定量的CTLA4Ig或L104EA29YIg的存在下通過加入與上文相同比率的PM再刺激(次級)。刺激發(fā)生3天，隨后細(xì)胞如上用放射性標(biāo)記脈沖并收獲。L104EA29YIg對初級同種刺激的T細(xì)胞的作用顯示于圖4A中。L104EA29YIg對次級同種刺激的T細(xì)胞的作用顯示于圖4B中。L104EA29YIg比CTLA4Ig更好地抑制初級和次級T細(xì)胞增殖應(yīng)答。為了測量細(xì)胞因子生產(chǎn)(圖5)，建立一式兩份的次級同種刺激板。3天后，使用ELISA試劑盒(Biosource，Camarillo,CA)使用由制造商推薦的條件測定培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)在阻斷次級同種異體刺激后T細(xì)胞的IL-2、IL-4和y-IFN細(xì)胞因子生產(chǎn)方面L104EA29YIg比CTLA4Ig更有效(圖5A-C)。L104EA29YIg和CTLA4Ig對猴的混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答(MLR)的作用顯示于圖6中。來自2只猴的外周血單核細(xì)胞(PBMC，S;來自每只猴的3.5xl0"細(xì)胞/孔)經(jīng)由淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(LSM)純化并與2pg/ml植物凝集素(PHA)混合。細(xì)胞被刺激3天隨后在收獲前用放射性標(biāo)記脈沖16小時(shí)。L104EA29YIg抑制猴T細(xì)胞增殖比CTLA4Ig更佳。表II通過所列位點(diǎn)上的CTLA4Ig誘變對CD86Ig結(jié)合的作用<table>complextableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>(占優(yōu)勢的作用由符號"+"指示)實(shí)施例3這項(xiàng)研究比較了在腎移植受體中用作由巴利昔單抗(Simulect;Novartis)誘導(dǎo)、霉酚酸酯(MMF;CellCept;Roche)和皮質(zhì)類固醇組成的無CNI組合方案的部分時(shí)，上文描述的L104EA29YIg作為維持免疫抑制劑與CsA在12個(gè)月內(nèi)的功效和安全性。來自活或已故供體、非HLA相同(non-HLA-identical)的腎同種異體移植物的成人受體是合格的。具有先前腎移植、系列反應(yīng)性抗體史>20%的受試者，或由研究者視為處于急性排斥的較高危險(xiǎn)中的那些限制為S10%的研究人群。排除標(biāo)準(zhǔn)包括局灶性和節(jié)段性腎'J、球硬化癥、I或II型膜性增生性腎小球腎炎或溶血性尿毒性綜合征/血栓形成性血小板減少性紫癜的潛在腎病；活動(dòng)性乙型或丙型肝炎，或HIV;以及供體年齡>60或<6,心源性死亡的供體，或供體腎冷缺血時(shí)間〉36小時(shí)。這是在美國、歐洲和加拿大進(jìn)行的開放(open-label)、隨機(jī)化、活性對照、多劑、多中心研究。經(jīng)歷腎移植的各性別年齡^18歲的合格患者(已故或活供體，除了當(dāng)供體和受體HLA相同時(shí))被隨機(jī)化以以1:1:1的比率使用L104EA29YIg較加強(qiáng)(MI)的治療方案、L104EA29YIg較不加強(qiáng)(LI)的治療方案、或環(huán)孢菌素A(CsA)治療；全都與使用巴利昔單抗(Simulect;Novartis)的誘導(dǎo)療法、使用霉酚酸酯(MMF;CellCept;Roche)的輔助維持療法和皮質(zhì)類固醇組合。2種L104EA29YIg方案包括其中L104EA29YIg以10mg/kg施用的早期，以及其中L104EA29YIg以5mg/kg、每4(q4)周或每8(q8)周的時(shí)間間隔施用的維持期。關(guān)于每種方案的劑量基于體重。這些劑量通過在非人靈長類動(dòng)物研究過程中顯示有效的靶谷特征指示。這些特征使在最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)期(第0-90天)過程中最初較高的劑量成為必要。早期在MI方案中更長(6對3個(gè)月)，并且包括更頻繁的給藥。L104EA29YIg較加強(qiáng)(MI)的治療方案由第1、5、15、29、43、57、71、85、113、141和169天10mg/kg,隨后每4或8周5mg/kg的施用組成。L104EA29YIg較不加強(qiáng)(LI)的治療方案由第1、15、29、57和85天10mg/kg,隨后每4或8周5mg/kg組成。L104EA29YIg以30分鐘的靜脈內(nèi)輸注施用。隨機(jī)化至CsA的患者接受每天2次的劑量(7土3mg/kg)，以達(dá)到預(yù)先指定的第l個(gè)月期間150-400ng/ml以及第2-12個(gè)月期間150-300ng/ml的靶血清濃度范圍，這與目前的醫(yī)療實(shí)踐一致。所有患者都接受每天2gMMF和每4天20mg巴利昔單抗。還給予皮質(zhì)類固醇逐漸減少方案，其由第l天時(shí)甲基強(qiáng)的松龍靜脈內(nèi)快速灌注(bolus)500mg以及第2天時(shí)250mg,隨后為第3天時(shí)經(jīng)口強(qiáng)的松100mg，第4天時(shí)50mg，第5-30天時(shí)25mg，第31一44天時(shí)22.5mg,第45-58天時(shí)20mg,第59—72天時(shí)17.5mg,第73-86天時(shí)15mg，第87-100天時(shí)12.5mg,以及第101-114天時(shí)10mg組成。第114天后，強(qiáng)的松劑量可以每隔一月減少2.5mg,^旦不J氐于5mg/天。初級目的是證實(shí)在6個(gè)月時(shí)在預(yù)防急性排斥中L104EA29YIg不劣于CsA。次級目的包括在6個(gè)月和1年時(shí)評估急性排斥的發(fā)生率(活組織檢查證實(shí)的或推測的)；在l、6和12個(gè)月時(shí)經(jīng)由碘海醇清除率測量的腎小球?yàn)V過率(GFR);高血壓參數(shù)；血清膽固醇和甘油三酯；和總體安全性。其他預(yù)先指定的分析包括在l年時(shí)患者死亡或移植物丟失；急性排斥的嚴(yán)重性；移植后糖尿病的發(fā)生率[定義為在以前不知道是糖尿病的患者中，高血糖癥24周，或血紅蛋白A1C(HbAlc)>7%所需的任何治療];使用腎病飲食調(diào)整(MDRD，LeveyAS,BoschJP，LewisJP，GreeneT,RogersN,RothD.Amoreaccuratemethodtoestimateglomerularfiltrationratefromserumcreatinine:anewpredictionequation.ModificationofDietinRenalDiseaseStudyGroup.AnnInternMed1999;130:461-470),Jelliffe(RW.Creatinineclearance:Bedsideestimate.AnnInterMed.1973;79:604-605)，Cockcroft-Gault(CockcroftDW，GaultMH.Predictionofcreatinineclearancefromserumcreatinine.Nephron1976;16:31-41)，和Nankivell(NankivellBJ,GruenewaldSM,AllenRD，ChapmanJR.Predictingglomerularfiltrationrateafterkidneytransplantation.Transplantation.1995;59(12):1683-1689)公式計(jì)算的GFR;藥物代謝動(dòng)力學(xué)和免疫原性。急性排斥(AR)的診斷和治療基于Banff97標(biāo)準(zhǔn)和等級(RacusenLC,SolezK,ColvinRB,等人,TheBanff97workingclassificationofrenalallograftpathology.KidneyInt1999;55(2):713-23.)。由此進(jìn)行慢性同種異體移植物腎病(CAN)發(fā)生率的分析。急性排斥(AR)的診斷和治療基于Banff97標(biāo)準(zhǔn)和等級(RacusenLC,SolezK,ColvinRB,等人,TheBanff97workingclassificationofrenalallograftpathology.KidneyInt1999;55(2):713-23.)。進(jìn)行手術(shù)中的腎同種異體移植物活組織檢查以評估基線組織學(xué)。活組織檢查的組織根據(jù)Banff97腎移植病理學(xué)工作分類進(jìn)行染色和分級?；罱M織沖全查由對治療不知情的獨(dú)立病理學(xué)家評估以確纟人在AR治療前所有發(fā)作的臨床上可疑的AR。另外的終末點(diǎn)包括在12個(gè)月時(shí)臨床上可疑和活組織檢查證明的急性排斥(CSBPAR);在1年時(shí)死亡或移植物丟失；AR發(fā)作的嚴(yán)重性(使用Banff97刻度表測量)；治療失敗(定義為研究者的意見；^1IB級排斥；復(fù)發(fā)或抗類固醇排斥)；在l、6和12個(gè)月時(shí)的腎功能(經(jīng)由碘海醇清除率評估的腎小球?yàn)V過率[GFRs])以及慢性同種異體移植物腎病(CAN)的證據(jù)(間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮)；高血壓參數(shù)(舒張血壓[BP]^90mmHg和/或收縮壓BP^140mmHg);血清脂質(zhì)；與CsA治療的患者比較，在用L104EA29YIg治療的患者中的安全性、可容許性和不利事件(AEs)。對于安全性和可容許性評估，在常規(guī)預(yù)定的臨床就診期間記錄AEs、實(shí)驗(yàn)室測量值(血液學(xué)、生物化學(xué)和尿分析)和生命體征。結(jié)果總共218名患者經(jīng)歷腎移植，并且隨機(jī)化至MI組(N=74)、LI組(N二71)或CsA(N=73)?；€人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征在3個(gè)治療組之間是相似的?？偣?64名患者完成了l年的治療。在l年之前中斷的患者中(N爿6對16對20;MI方案對LI方案對CsA)，最常見的原因是AEs(N=5對8對9)和治療失敗(N=7對5對3)。CSBPAR的發(fā)生率在所有3個(gè)治療組中很少出現(xiàn)，并且在CSBPAR或活組織檢查證明的急性排斥(BPAR)的發(fā)生率中在治療組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。在6和12個(gè)月時(shí)，CSBPAR的發(fā)生率對于MI、LI和CsA治療分別為6.8%、5.6%和8.2°/0。BPAR的發(fā)生率在6和12個(gè)月時(shí)在組之間也是相似的，盡管BPAR在LI組中略微高于其他2個(gè)組中(對于MI、LI和CsA治療分別為18.9%、29.6%和17.8%)?；罱M織檢查證明的急性排斥在所有治療組中都比CSBPAR更頻繁，并且在LI組中最普遍。然而，發(fā)現(xiàn)這些事件中的許多發(fā)生在L104EA29YIg低于所需谷血清濃度的患者中。在AR嚴(yán)重性中沒有看到治療組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異；然而，數(shù)目小并且不導(dǎo)致移植物丟失。這項(xiàng)研究對研究藥物不是不知情的以允許關(guān)于CsA的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，這可能促成與CsA組(N=144)比較，L104EA29YIg組(N=345)中獲取的活組織檢查的數(shù)目增加。盡管這對于以這種方式設(shè)計(jì)的研究并不意外，但它可能已增加L104EA29YIg治療組中腎組織學(xué)異常的診斷率。死亡和/或移植物丟失在所有治療組中很少發(fā)生，在MI組中報(bào)告了1例死亡，CsA組中4例并且在LI組中沒有。大多數(shù)移植物丟失不是由免疫學(xué)事件引起的，并且與LI組中的1個(gè)比較在MI和CsA組中只有3個(gè)移植物丟失。與基于CsA的免疫抑制比較，使用基于L104EA29YIg的治療觀察到腎功能的顯著改善。在所有時(shí)間點(diǎn)上使用Ll(MEA29YIg治療的碘海醇清除率更大，在12個(gè)月時(shí)與CsA比較平均改善為11ml/分鐘/1.73m2(~20%)。在12個(gè)月時(shí)，相對而言，慢性同種異體移植物腎病(CAN)在L104EA29YIg治療患者中比CsA治療患者中低30-50%地更不常見。在12個(gè)月時(shí)新或惡化的CAN比率對于MI、LI和CsA組分別為29%、19%和44%。在1年時(shí)，與MI(130mmHg)和LI(129mmHg)治療組中的患者比較，在用CsA治療的患者(133mmHg)中平均收縮血壓高3"mmHg。盡管在L104EA29YIg組中較少使用抗高血壓藥物(MI:87.5%;LI84.1%:CsA92.2%)也如此。與CsA(212mg/dL)治療的患者比較，使用L104EA29YIg(MI:198mg/dL;LI:201mg/dL)的總血清膽固醇略微更低，盡管對于L104EA29YIg降脂質(zhì)藥物的使用同樣較少(MI:36.1%;LI:31.9%;CsA:53.1%)。與L104EA29YIg治療組中的1名比較，在CsA組中4名(5.5%)患者死亡。不利事件(AEs)的比率在治療組之間是可比較的；然而，相關(guān)AEs在L104EA29YIg治療后比CsA治療明顯更低。L104EA29YIg的靜脈內(nèi)施用是良好耐受的，沒有輸注反應(yīng)。L104EA29YIg治療的患者沒有顯示出一般的CsA相關(guān)的不利事件，例如貧血、白細(xì)胞減少癥、多毛癥、震顫和牙齦增生。與基于CsA的治療比較，基于L104EA29YIg的治療與任何感染或惡性腫瘤的危險(xiǎn)增加無關(guān)。結(jié)論這項(xiàng)12個(gè)月的研究證實(shí)與CsA比較，基于L104EA29YIg的維持療法給予預(yù)防AR中的相等功效以及類似的患者和移植物存活。另外，與基于CsA的維持免疫抑制比較，L104EA29YIg證實(shí)腎功能的顯著改善和CAN的減少。L104EA29YIg是安全和良好耐受的并且不伴隨一般的CNI相關(guān)毒性。CSBPAR和BPAR的比率在3個(gè)治療組之間是相似的，從而證實(shí)使用基于CsA的療法觀察到的低AR比率使用L104EA29YIg同樣達(dá)到了。大多數(shù)BPARs分類為亞臨床的，從而提示腎功能未受損。與LI組比較MI組中數(shù)字上較低的AR比率提示對于L1(MEA29YIg可能的劑量依賴性應(yīng)答。L104EA29YIg組中更頻繁的活組織檢查可能已導(dǎo)致這些組中急性和慢性排斥的過度診斷，從而提示L104EA29YIg治療的利益在這項(xiàng)研究中可能被少說。大多數(shù)BPAR事件在移植后的前3個(gè)月內(nèi)發(fā)生，這并不意外，因?yàn)槠渌艘扬@示在移植后的早期過程中需要較高劑量的免疫抑制劑(WiecekA,NowickiM,KokotF,RitzE.Acutefailureofthetransplantedkidney-一pathophysiology,diagnosisandprevention.AnnTransplant1996;1(4):5—9和BennettWM.Posttransplantacuterenalfailure.RenFail1997;19(2):225-6)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)這些事件在低于所需谷值發(fā)生，所以應(yīng)當(dāng)考慮改變在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前的第1個(gè)月治療方案。在維持期過程中可見的大多數(shù)BPARs在非常低或不可檢測的L104EA29YIg水平上發(fā)生，從而提示在那些時(shí)間段過程中AR的發(fā)生率與不足的免疫抑制相關(guān)，這可以通過劑量方案中的改變避免。這項(xiàng)研究證實(shí)與CsA比較L104EA29YIg伴隨類似的總AE比率，而與研究藥物相關(guān)的AE較少。在3個(gè)治療組之間沒有鑒別出病毒相關(guān)的AEs數(shù)目中的實(shí)際差異。在低AR比率的存在下，維持免疫抑制的新目標(biāo)是減少長期健康并發(fā)癥，包括高血壓、高脂血癥、藥物毒性和預(yù)防瘢痕形成。如在自身免疫性疾病中，出現(xiàn)了新一代的免疫選擇性維持免疫抑制劑。經(jīng)由用L104EA29YIg免疫選擇性共刺激阻斷抑制T細(xì)胞共刺激代表了新的范例，從而在腎移植中提供更有選擇性的維持免疫抑制、減少的毒性和改善的長期結(jié)果的希望。實(shí)施例4存在對腎移植中新療法的相當(dāng)大的未滿足的醫(yī)學(xué)需要，所述療法可以提供與CNIs可比較的短期受試者和移植物存活，而無其長期腎毒性、心血管和代謝作用。該需要在ECD定義的腎同種異體移植物的受體中特別重大，其長期受試者和移植物存活率明顯低于來自符合標(biāo)準(zhǔn)合格標(biāo)準(zhǔn)的供體的同種異體移植物受體的那些。具有新型作用機(jī)制的免疫抑制劑L104EA29YIg是用于在ECD同種異體移植物的腎移植受體中使用的有希望的非腎毒性候選者。因?yàn)長l(MEA"YIg可以在移入時(shí)而不是以延遲方式施用，如對于CNIs通常必需的-特別是在腎功能最初受損的那些同種異體移植物中-所以它提供了及時(shí)方式的免疫抑制并且無需多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑。這可以轉(zhuǎn)化為具有有利的安全特征的可比較的急性排斥率。因?yàn)長104EA29YIg預(yù)期不是腎毒性的，所以可見關(guān)于同種異體移植物結(jié)構(gòu)(即，CAN)和功能(即GFR)的另外利益。最后，與CNIs不同，L104EA29YIg作用的靶定機(jī)制應(yīng)提供免疫抑制而不會(huì)不利地影響心血管/代謝特征。下文提供了關(guān)于L104EA29YIg在這種受試者群體中使用的總體利益-危險(xiǎn)評估。將研究2種劑量方案(如實(shí)施例3中所述，伴隨LI方案的較小修改并使用每4周的維持輸注時(shí)間表)。初鄉(xiāng)及目的1)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)受試者和移植物存活復(fù)合的作用。2)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<60mL/分鐘/1.73!!12或從第3個(gè)月到第12個(gè)月測量的GFR減少三10mL/分鐘/1.73m2復(fù)合的作用。次級目的1)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR的作用。2)評估L104EA29YIg相對于CsA對由12個(gè)月的活組織檢查證明的CAN的作用。3)評估L104EA29YIg相對于CsA對在3個(gè)月時(shí)測量的GFR，以及從基線(3個(gè)月)到12個(gè)月的變化的作用。4)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR〈30mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。5)評估L104EA29YIg相對于CsA對在3、12、24和36個(gè)月時(shí)測量的GFR,以及從基線(3個(gè)月)到12、24和36個(gè)月的變化的作用。6)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)PTDM的作用。7)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)高血壓測量的作用，包括SBP和DBP、高血壓和受控制的高血壓的發(fā)生率和流行率、以及治療方案的強(qiáng)度。8)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)血脂異常測量的作用，包括血清總、非HDL、低密度脂蛋白(LDL)和HDL膽固醇和TGs,血脂異常和受控制的血脂異常的發(fā)生率和流行率，以及治療方案的強(qiáng)度。9)評估L104EA29YIg相對于CsA對在24和36個(gè)月時(shí)受試者和移植物存活的作用。10)評估L104EA29YIg相對于CsA對在6個(gè)月時(shí)急性排斥測量的作用，包括急性排斥的發(fā)生率和嚴(yán)重性、用于受損的腎功能和預(yù)期DGF的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑的使用、用于治療急性排斥的淋巴細(xì)胞消耗療法的最初使用、抗類固醇急性排斥的發(fā)生率、急性排斥后完全恢復(fù)(SCr回到基線)的發(fā)生率、亞臨床性排斥的發(fā)生率、以及不管組織學(xué)發(fā)現(xiàn)所有治療的急性排斥發(fā)作的發(fā)生率。11)評估L104EA29YIg相對于CsA對QoL的作用。12)評估L104EA29YIg相對于CsA的總體安全性。第三級目的1)評估L104EA29YIg相對于CsA對從基線(3個(gè)月)到12、24和36個(gè)月計(jì)算的GFR的斜率和截距的作用。2)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<45mL/分鐘/1.731112的受試者比例的作用。3)評估L104EA29YIg相對于CsA對在第12個(gè)月時(shí)計(jì)算的GFR<75mL/分鐘/1.731112的受試者，以及從第3個(gè)月到第12個(gè)月計(jì)算的GFR減少至少15mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。4)評估L104EA29YIg相對于CsA對DGF發(fā)生率的作用。5)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)急性排斥測量的作用，包括急性排斥的發(fā)生率和嚴(yán)重性、用于受損的腎功能和預(yù)期DGF的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑的使用、用于治療急性排斥的淋巴細(xì)胞消耗療法的最初使用、抗類固醇急性排斥的發(fā)生率、急性排斥后完全恢復(fù)(SCr回到基線)的發(fā)生率、亞臨床性排斥的發(fā)生率、以及不管組織學(xué)發(fā)現(xiàn)所有治療的急性排斥發(fā)作的發(fā)生率。6)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)復(fù)合心血管疾病終末點(diǎn)(判定的心血管性死亡、心肌梗死、缺血性發(fā)作、由于心血管原因的非選擇性住院治療、和經(jīng)皮冠狀介入)的作用。7)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)復(fù)合心腎疾病終末點(diǎn)(死亡、移植物丟失、非致命性心肌梗死和中風(fēng))的作用。8)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)Framingham危險(xiǎn);平分的作用。9)評估L104EA29YIg相對于CsA對研究藥物中斷發(fā)生率的作用。10)評估L104EA29YIg相對于CsA對抗供體人白細(xì)胞抗原(HLA)抗體的作用。11)評估L104EA29YIg相對于CsA對活組織4企查樣品中C4d陽性的作用。研究設(shè)計(jì)該研究的持續(xù)時(shí)間是3年，伴隨關(guān)于安全性評估的后續(xù)8周隨訪期。在3年治療期結(jié)束時(shí)，受試者可能對于長期延伸研究是合格的。這是隨機(jī)化、半盲、活性對照、平行組研究。所有受試者都將接受來自具有如下定義的擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)的供體的腎。這些標(biāo)準(zhǔn)部分基于由器官共享聯(lián)合網(wǎng)(UNOS)提出的那些；它們還包括廣泛用于鑒別潛在的損害器官的其他特征，例如來自心源性死亡(DCD,無心跳)或延長的冷缺血時(shí)間(CIT)供體的那些。大約540名受試者將以1:1:1的比率隨機(jī)化至使用L104EA29YIg(MI方案)、Ll(MEA"YIg(LI方案)或CsA的治療。所有受試者還將接受使用巴利昔單抗的誘導(dǎo)，以及MMF和皮質(zhì)類固醇的背景維持免疫抑制方案。隨機(jī)化至MI方案的受試者將接受第1和5天時(shí)，隨后每2周到第3個(gè)月(第2、4、6、8、IO和12周)，以及隨后每4周到第6個(gè)月(第16、20和24周)的靜脈內(nèi)L104EA29YIg(10mg/kg)。6個(gè)月后，MI治療組中的受試者將接受每4周施用的L104EA29YIg5mg/kg的維持劑量，直至36個(gè)月試驗(yàn)完成時(shí)。隨機(jī)化至LI方案的受試者將接受第1和5天時(shí)，以及隨后每2周到第1個(gè)月(第2和4周)，以及每4周到第3個(gè)月(第8和12周)的靜脈內(nèi)L104EA29YIg(10mg/kg)。3個(gè)月后，LI治療組中的受試者將接受每4周施用的L104EA29YIg5mg/kg的維持劑量，直至36個(gè)月試-險(xiǎn)完成時(shí)。LI和MI組之間的不知情將借助于在第6和10周時(shí)LI治療組中的安慰劑輸注來保持。隨機(jī)化至CsA的受試者將接受每天2次的劑次，其設(shè)計(jì)為達(dá)到與目前醫(yī)療實(shí)踐一致的指定谷血清濃度范圍。多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑(Thymoglobulin或ATGAM)的使用對于隨機(jī)化至CsA、經(jīng)歷受損的腎同種異體移植物功能和預(yù)期DGF的受試者是允許的-但不是必需的。這些試劑以這種能力廣泛用于提供免疫抑制，直至移植物功能恢復(fù)用于施用CsA。在這種臨床情況中多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑使用和劑量的決定由研究者在方案指南內(nèi)自行決定。L104EA29YIg的安全性和功效將在1、2和3年時(shí)評估。初級結(jié)果測量每種基于L104EA29YIg的方案將對于下列初級功效結(jié)果測量與基于CsA的方案進(jìn)行比較(1)在12個(gè)月時(shí)受試者和移植物存活的復(fù)合；(2)在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<60mL/分鐘/1.731!12或從第3個(gè)月到第12個(gè)月測量的GFR減少>10mL/分鐘/1.73m2的復(fù)合。目的是證實(shí)對于死亡和移植物丟失的非劣勢以及對于腎功能的優(yōu)勢。選擇受試者和移植物存活的終末點(diǎn)，因?yàn)檫@些測量是關(guān)于同種異體移植物受體的最重要的臨床結(jié)果。盡管同種異體移植物丟失可以通過有效的免疫抑制療法來預(yù)防，但相同療法可增加由于感染、PTLD、惡性腫瘤、腎毒性或心血管疾病死亡的危險(xiǎn)。因此，一企查受試者和移才直物存活的復(fù)合終末點(diǎn)作為同種異體移植物受體中免疫抑制療法的凈利益的概括測量是合適的。這種復(fù)合終末點(diǎn)具有在所有受試者中不由于漏失數(shù)據(jù)或受試者錯(cuò)誤分類而偏性評估的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)。選擇腎功能作為終末點(diǎn)，這是因?yàn)橐浦埠竽I功能和長期腎結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)已在各種情況下重復(fù)證實(shí)。無論腎功能在移植后數(shù)天、出院時(shí)、還是在移植后6和12個(gè)月時(shí)測量，這種關(guān)聯(lián)都存在。這已在來自活和尸體供體腎的受體、來自較年輕和較年長的尸體供體腎的受體、第2次移植受體、以及成年人和兒科受體中觀察到。來自多中心研究的結(jié)果證實(shí)SCr對于預(yù)期長期移植物存活的重要性。腎功能和長期預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)是強(qiáng)烈且可重現(xiàn)的，但不是嚴(yán)格線性的。在成年人腎移植受體的分析中，1年時(shí)的SCr和預(yù)計(jì)的移植物中值半衰期之間的關(guān)聯(lián)檢查揭示SCr>1.5mg/dL時(shí)的顯著拐點(diǎn)。類似地，從6個(gè)月到l年的SCr變化(△SCr)和預(yù)計(jì)的移植物中值半衰期之間的關(guān)聯(lián)檢查揭示△SCrmg/dL時(shí)的顯著拐點(diǎn)。因此，l年時(shí)腎功能的絕對水平和從6個(gè)月(或類似穩(wěn)定的早期移植后時(shí)間點(diǎn))到1年的腎功能變化適合于用作結(jié)果測量。腎功能與長期結(jié)果關(guān)聯(lián)的一線性的存在提示腎功能的分類測量將比空間測量具有更大的臨床關(guān)聯(lián)性。關(guān)于腎功能在l年時(shí)>1.5mg/dL的闊值以及從第6個(gè)月到第1年SCr20.3mg/dL的變化看起來是合適的。在上文參考的研究中，腎功能的預(yù)后重要性使用SCr作為標(biāo)記證實(shí)。這些研究一般太大而不能使用腎小球?yàn)V過的直接測量。SCs作為腎功能標(biāo)記的局限性是眾所周知的。SCs水平主要反映肌酸酐的腎排泄和肌酸酐的內(nèi)源性產(chǎn)生之間的平衡。后者可以受肌肉量、感染、炎癥和類固醇使用中的變化的顯著作用，所述變化在移植群體中是非常普遍的。此外，肌酸酐的腎排泄可以通過2種途徑-腎小球?yàn)V過和腎小管分泌發(fā)生。腎小球?yàn)V過的喪失對SCr的影響通常被腎小管分泌中的補(bǔ)償性增加掩蓋，并且增加的SCr作為腎損傷標(biāo)記的效用從而減少。已估計(jì)40。/。GFR減少的受試者將具有正常或低SCr。已開發(fā)了眾多公式，其尋求通過說明人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)因素的作用來改善SCr和GFR之間的關(guān)聯(lián)。在具有穩(wěn)定腎功能的294名移植受體中研究由各種公式估計(jì)的GFR和通過菊粉清除率測量的真實(shí)GFR之間的一致水平。預(yù)測的GFR值與測量的菊粉清除率的不同為至少10mL/分鐘/1.73m2的比例對于Jelliffe公式為34%，至對于Nankivell公式為53%。由Levey等人提出的公式將在這項(xiàng)研究中用于計(jì)算GFR。這個(gè)公式已顯示在移植群體中比其他公式例如Nankivell更精確地預(yù)測GFR，在預(yù)測和測量值之間具有最佳關(guān)聯(lián)。考慮到真實(shí)GFR和計(jì)算的GFR之間的相當(dāng)大差異，真實(shí)腎小球?yàn)V過標(biāo)記的清除率將用于評估腎功能的初級終末點(diǎn)(附錄l)。60mL/分鐘/1.73m2的GFR，或至少10mL/分鐘/1.731112的GFR變化將用作在大流行病學(xué)研究中確立的1.5mg/dL的SCr閾值或至少0.3mg/dL的SCr變化的近似等價(jià)物。復(fù)合終末點(diǎn)的變化組分將從第3-12個(gè)月評估，這是因?yàn)橐浦埠竽I功能在第3個(gè)月大部分穩(wěn)定。其他結(jié)果測量關(guān)鍵的次級目的是評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR以及對在12個(gè)月時(shí)活組織檢查證明的CAN的作用。這些終末點(diǎn)與其他次級終末點(diǎn)分開以強(qiáng)調(diào)其在L104EA29YIg評估中的重要性。如上文討論的，ECD腎中的功能性腎單位量和腎保存由于供體特征(例如，較大的年齡、心血管共病(co-morbidities)、獲得操作和CIT)在移植時(shí)很可能是減少的，所得到的受試者和移植物存活率顯著低于使用標(biāo)準(zhǔn)條件供體器官觀察到的那種。因?yàn)槟I功能在移入時(shí)可能是減少的，所以可能相當(dāng)大比例的受試者可以滿足在研究入組或基線腎同種異體移植物功能測定時(shí)共同初級腎功能終末點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，方案的關(guān)鍵次級目的是評估L104EA29YIg相對于CsA在12個(gè)月時(shí)測量的GFR中的差異中的作用。這種關(guān)鍵次級終末點(diǎn)允許不考慮這種ECD群體中預(yù)先存在的供體變異性而區(qū)別L104EA29YIg與CsA比較的作用。它還促成腎功能的總體評估，并進(jìn)一步鞏固L104EA29YIg在腎移植受體中提供顯著醫(yī)學(xué)利益的結(jié)論。其余的關(guān)鍵次級目的是由12個(gè)月的活組織沖全查證明的CAN。CAN是死亡的^又僅第二位的原因，其中功能性移植物是晚期腎同種異體移植物丟失的主要原因。荒謬的是，CNIs被視為通過直接(即直接腎毒性作用)和間接途徑(即不利的心血管和代謝作用)促成CAN。由于其具體作用機(jī)制，L104EA29YIg不可能是直接腎毒性的，或不可能不利地改變心血管和代謝參數(shù)。在上文實(shí)施例中，在L104EA29YIg治療的受試者中可見CAN發(fā)生率減少中的有利作用。在目前研究中，確立CAN發(fā)生率的減少連同腎功能的改善將鞏固L104EA29YIg在腎移植受體中提供顯著醫(yī)學(xué)利益的結(jié)論。L104EA29YIg在預(yù)防急性排斥中的功效將通過各種結(jié)果測量來評估。這些包括其發(fā)生率、嚴(yán)重性、對治療的應(yīng)答性和結(jié)果。然而，這些測量的解釋被L104EA29YIg和CsA中的固有差異復(fù)雜化。L104EA29YIg在移植時(shí)施用，而CsA在存在初始腎功能證據(jù)時(shí)開始。預(yù)期在這項(xiàng)研究中隨機(jī)化至CsA的某些受試者將接受多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑以提供免疫抑制覆蓋，如果初始腎功能是受損的并且預(yù)期DGF的話。這種治療作用可以預(yù)防或掩蓋CsA治療的受試者中急性排斥的發(fā)展，并且使得受試者對于急性排斥的結(jié)果測量不可評價(jià)。因?yàn)樵陔S機(jī)化至L104EA29YIg、從移植時(shí)開始治療的受試者中無需采取類似作用，所以急性排斥的比較評估是不相等的。為了更精確地評估L104EA29YIg在預(yù)防急性排斥中的功效，這種能力的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑的使用還連同其他急性排斥測量一起報(bào)告。研究群體研究群體包括由于供體特征、獲得操作、CIT或其他因素可能是不最理想的腎同種異體移植物的受體。具體的合格標(biāo)準(zhǔn)基于由UNOS提出的器官捐贈(zèng)'擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)，。來自延長的CIT或來自DCDs供體腎的受體也將是合格的。一般地，免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在受試者選擇中將不起主要作用。各種免疫學(xué)危險(xiǎn)水平上的受試者是合格的。然而，該研究將排除最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)的受試者(交叉配型陽性、系列反應(yīng)性抗體[PRA]230%，或先前移植的那些)。這些受試者可能需要減少其抗體負(fù)荷的治療，例如血漿去除術(shù)，這超出這種方案的范圍。受試者將在全球大約90個(gè)地點(diǎn)入選。初級功效結(jié)果測量1)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)受試者和移植物存活復(fù)合的作用。2)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<60mL/分鐘/1.73m2或從第3個(gè)月到第12個(gè)月測量的GFR減少210mL/分鐘/1.73m2復(fù)合的作用。次級功效結(jié)果測量1)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR的作用。2)評估L104EA29YIg相對于CsA對由12個(gè)月的活組織4全查證明的CAN的作用。3)評估L104EA29YIg相對于CsA對在3個(gè)月時(shí)測量的GFR,以及從基線(3個(gè)月)到12個(gè)月的變化的作用。4)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<30mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。5)評估L104EA29YIg相對于CsA對在3、12、24和36個(gè)月時(shí)測量的GFR,以及從基線(3個(gè)月)到12、24和36個(gè)月的變化的作用。6)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)PTDM的作用。7)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)高血壓測量的作用，包括SBP和DBP、高血壓和受控制的高血壓的發(fā)生率和流行率、以及治療方案的強(qiáng)度。8)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)血脂異常測量的作用，包括血清總、非HDL、LDL和HDL膽固醇和TGs,血脂異常和受控制的血脂異常的發(fā)生率和流行率，以及治療方案的強(qiáng)度。9)評估L104EA29YIg相對于CsA對在24和36個(gè)月時(shí)受試者和移植物存活的作用。10)評估L104EA29YIg相對于CsA對在6個(gè)月時(shí)急性排斥測量的作用，包括急性排斥的發(fā)生率和嚴(yán)重性、用于受損的腎功能和預(yù)期DGF的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑的使用、用于治療急性排斥的淋巴細(xì)胞消耗療法的最初使用、抗類固醇急性排斥的發(fā)生率、急性排斥后完全恢復(fù)(SCr回到基線)的發(fā)生率、亞臨床性排斥的發(fā)生率、以及不管組織學(xué)發(fā)現(xiàn)所有治療的急性排斥發(fā)作的發(fā)生率。11)評估L104EA29YIg相對于CsA對QoL的作用。10)評估L104EA29YIg相對于CsA的總體安全性。第三級結(jié)果測量1)評估L104EA29YIg相對于CsA對從基線(3個(gè)月)到12、24和36個(gè)月計(jì)算的GFR的斜率和截距的作用。2)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<45mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。3)評估L104EA29YIg相對于CsA對在第12個(gè)月時(shí)計(jì)算的GFR<75mL/分鐘/1.731112的受試者，以及從第3個(gè)月到第12個(gè)月計(jì)算的GFR減少至少15mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。4)評估L104EA29YIg相對于CsA對DGF發(fā)生率的作用。5)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)急性排斥測量的作用，包括急性排斥的發(fā)生率和嚴(yán)重性、用于受損的腎功能和預(yù)期DGF的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑的使用、用于治療急性排斥的淋巴細(xì)胞消耗療法的最初使用、抗類固醇急性排斥的發(fā)生率、急性排斥后完全恢復(fù)(SCr回到基線)的發(fā)生率、亞臨床性排斥的發(fā)生率、以及不管組織學(xué)發(fā)現(xiàn)所有治療的急性排斥發(fā)作的發(fā)生率。6)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)復(fù)合心血管疾病終末點(diǎn)(判定的心血管性死亡、心肌梗死、缺血性發(fā)作、由于心血管原因的非選擇性住院治療、和經(jīng)皮冠狀介入)的作用。7)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)復(fù)合心腎疾病終末點(diǎn)(死亡、移植物丟失、非致命性心肌梗死和中風(fēng))的作用。8)評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)Framingham危P企"i平分的4乍用。9)評估L104EA29YIg相對于CsA對研究藥物中斷發(fā)生率的作用。10)評估L104EA29YIg相對于CsA對抗供體HLA抗體的作用。11)評估L104EA29YIg相對于CsA對活組織;險(xiǎn)查樣品中C4d陽性的作用。移植物丟失的定義移植物丟失定義為功能喪失或軀體缺失。功能喪失將定義為如通過中心實(shí)驗(yàn)室測定的SCr^6.0mg/dL(530(mol/L)的持續(xù)水平^4周或^56連續(xù)透析天數(shù)，或腎功能損害至這樣的程度，從而使得受試者接受第2次移植。移植物丟失的所有原因?qū)⒂瑟?dú)立的EAC判定。移植物功能延遲(DGF)的定義DGF定義為到研究第8天(手術(shù)后第7天)的透析治療。慢性同種異體移植物腎病(CAN)的定義活組織檢查證明的CAN將通過不知情的中心組織病理學(xué)家使用Banff97腎移植病理學(xué)工作分類來測定。CAN發(fā)生率將通過比較所有第1天后的活組織檢查與移植時(shí)獲得的基線活組織檢查來測定。這種比較確定隨后可能解釋為CAN的任何預(yù)先存在的組織病理學(xué)的存在和嚴(yán)重性。移植后糖尿病的定義PTDM將根據(jù)由近期國際一致指南20闡述的定義進(jìn)行定義。這些標(biāo)準(zhǔn)概括為a)糖尿病癥狀加血漿葡萄糖(PG)濃度偶爾^200mg/dL(11.1mmol/L)，或b)空腹血糖(FPG)2126mg/dL(7.0mmol/L),或c)在經(jīng)口葡萄糖耐量測試過程中2小時(shí)PG2200mgZdL(11.1mmol/L)，和d)在伴隨急性代謝失代償?shù)拿鞔_高血糖癥不存在下必須在另一天進(jìn)行基于靜脈PG測量的證實(shí)性實(shí)驗(yàn)室測試。該研究將利用FPG用于評估PTDM，然而，如果受試者使用這些其他方法評估且發(fā)現(xiàn)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，那么他們將被視為患有PTDM。高血壓測量的定義高血壓在這項(xiàng)研究中將根據(jù)關(guān)于預(yù)防、檢測、評估和治療高血壓的全國聯(lián)合委員會(huì)第7次報(bào)告(SeventhReportoftheJointNationalCommitteeonthePrevention，Detection,Evaluation,andTreatmentofHighBloodPressure)21對于患有慢性腎病的受試者進(jìn)行定義。這個(gè)定義依據(jù)SBP2130mmHg或DBP蘭80mmHg。另夕卜，SBP<130mmHg和DBP<80mmHg、正在接受用于高血壓適應(yīng)癥的抗高血壓藥物或具有高血壓醫(yī)療史的所有受試者包括在這個(gè)定義內(nèi)。高血壓發(fā)生率定義為在隨機(jī)化和移植后發(fā)展高血壓的受試者比例。高血壓流行率定義為在任何給定時(shí)間滿足上文說明的高血壓定義的受試者比例。受控制的高血壓定義為SBP<130mmHg和DBP<80mmHg，同時(shí)4妻受用于高血壓適應(yīng)癥的抗高血壓藥物，或具有高血壓醫(yī)療史、接受用于另一種適應(yīng)癥的抗高血壓藥物。SBP<130mmHg和DBP<80mmHg、沒有高血壓醫(yī)療史、開處用于除高血壓以外的適應(yīng)癥的抗高血壓藥物(例如用于偏頭痛預(yù)防的(3阻滯劑)的受試者，將不視為具有高血壓或受控制的高血壓。治療方案的強(qiáng)度定義為用于控制高血壓的抗高血壓藥物的總數(shù)目。所有抗高血壓藥物將對于患有高血壓或受控制的高血壓的受試者中的高血壓適應(yīng)癥計(jì)H因?yàn)榭垢哐獕盒?yīng)的存在與適應(yīng)癥無關(guān)。血脂異常測量的定義血脂異常依據(jù)來自全國腎臟基金會(huì)腎臟疾病纟吉果質(zhì)量4昌i義(NationalKidneyFoundationKidneyDisaseOutcomesQualityInitiative)(NKF-K/DOQI)22的近期指南進(jìn)行定義。血脂異常定義為高甘油三酸酯血癥(TGss500mg/dL[5.65mmol/L])、高膽固醇血癥(LDLs100mg/dL[2.59mmol/L])、或在高TGs(TGss200mg/dL[2.26mmol/L的存在下非HDL升高(非HDLs130mg/dL[3.36mmol/L])。受控制的血脂異常在這項(xiàng)研究中定義為接受用于上文說明的血脂異常之一的藥理學(xué)處理的受試者，所述血脂異常被成功治療，并且其脂質(zhì)值降到先前段落中描述的閾值之下。這些試劑中的一些具有關(guān)于伴隨CsA使用的起始劑量或最大推薦劑量，關(guān)于腎機(jī)能不全給藥的特殊預(yù)防措施和/或警告，或可以引起CsAPK改變。參考關(guān)于具體推薦的合適的包裝插頁。用作抗高血脂藥的任何其他試劑(即，非抑制素療法)將視為水平I的治療強(qiáng)度。抑制素和另一類試劑(例如依澤替米貝(ezetimibe))的伴隨使用將抑制素治療的強(qiáng)度水平提高l個(gè)水平；因此，超過5的強(qiáng)度水平是可能的。急性排斥將定義為需要臨床證據(jù)和活組織檢查證實(shí)的臨床病理學(xué)事件。同種異體移植物活組織檢查將通過不知情的中心獨(dú)立病理學(xué)家使用Banff97腎移植病理學(xué)工作分類來評估急性排斥的存在和嚴(yán)重性。在急性排斥的分析中，通過中心病理學(xué)家的活組織檢查解釋和分級將代替地方性解釋。對于沒有完全滿足標(biāo)準(zhǔn)，但由中心病理學(xué)家解釋為是急性排斥并導(dǎo)致用于急性排斥的治療的可疑急性排斥進(jìn)行的活組織檢查將作為急性排斥計(jì)數(shù)。亞臨床性排斥定義為與急性排斥一致但缺乏其臨床關(guān)聯(lián)的中心病理學(xué)家的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)?？诡惞檀技毙耘懦舛x為在使用皮質(zhì)類固醇治療后缺乏SCr改善和/或使淋巴細(xì)胞消耗療法的使用成為必要的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)。Framingham危險(xiǎn)評分這種危險(xiǎn)評分利用來自FraminghamHeartStudy23的數(shù)據(jù)以估計(jì)關(guān)于'頑固性(hard)，冠心病(心肌梗死和冠狀死亡)的10年危險(xiǎn)。包括在這種計(jì)算中的危險(xiǎn)因素是年齡、性別、總膽固醇、HDL膽固醇、SBP、糖尿病、關(guān)于高血壓的治療以及在先前月份中的任何吸煙。樣本大小測定初級目的是評估L104EA29YIg與CsA比較對在12個(gè)月時(shí)受試者和移植物存活以及腎功能的作用。2個(gè)共同初級終末點(diǎn)是(l)在移植后12個(gè)月時(shí)具有存活移植物的受試者比例和(2)在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<60mL/分鐘/1.73n和/或從第3個(gè)月到第12個(gè)月測量的GFR減少210mL/分鐘/1.73rr^的受試者比例。每個(gè)治療組180名受試者的樣本大小將提供83%能力，以確定在第一個(gè)共同初級終末點(diǎn)(受試者和移植物存活)中關(guān)于絕對差異(每個(gè)L104EA29YIg方案和CsA方案之間)的97.3%雙側(cè)CIs的上限將不超過10%,如果在12個(gè)月時(shí)真實(shí)受試者和移植物存活率對于CsA方案是80。/。并且對于2個(gè)L104EA29YIg方案中的每一個(gè)為83%的話。對于腎功能終末點(diǎn)，每組180名受試者的樣本大小能夠檢測與CsA方案比較對于每個(gè)L104EA29YIg方案滿足測量的GFR終末點(diǎn)的受試者比例25%的減少，其中假定75%的CsA受試者滿足腎功能終末點(diǎn)以及每個(gè)治療組25%的退出?？偟膩碚f，每個(gè)治療組180名受試者將提供至少80%的能力，以檢測1L104EA29YIg方案滿足2個(gè)共同初級終末點(diǎn)，其總第I類誤差控制在0.05顯著性水平(Dunnett調(diào)整)。包括標(biāo)準(zhǔn)靶群體1)受試者是已故供體腎移植的第1次受體2)供體和/或供體腎滿足關(guān)于器官捐贈(zèng)的下列擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)中的至少一個(gè)a)供體年齡^60歲或b)供體年齡50-59歲以及下列之一(i)腦血管意外(CVA)+高血壓+SCr〉1.5mg/dL或(ii)CVA+高血壓或(iii)CVA+SCr>1.5mg/dL或(iv)高血壓+SCr>1.5mg/dL或c)CIT》24小時(shí)，供體年齡>10歲或d)心源性死亡的供體(無心跳供體)3)男性和女性，年齡18或更大，包含性的4)WOCBP必須使用適當(dāng)?shù)谋茉蟹椒ㄒ砸赃@樣的方式避免整個(gè)研究期間以及研究后最高達(dá)8周懷孕，從而使得懷孕的危險(xiǎn)最小化。WOCBP包括已經(jīng)歷月經(jīng)初潮并且未經(jīng)歷成功的外科手術(shù)絕育(子宮切除術(shù)、兩側(cè)輸卵管結(jié)扎或雙側(cè)卵巢切除術(shù))或不是絕經(jīng)后(定義為閉經(jīng)^連續(xù)12個(gè)月；或使用激素代替療法的女性，其具有文件證明的血清促卵泡激素水平〉35mlU/mL)的任何女性。甚至使用經(jīng)口、植入或可注射的避孕激素或機(jī)械產(chǎn)品例如宮內(nèi)器具或障礙方法(隔膜、避孕套、殺精子劑)以預(yù)防懷孕或?qū)嵭泄?jié)欲或其中配偶不育(例如輸精管切除術(shù))的女性都應(yīng)當(dāng)視為有分娩的可能性。WOCBP必須具有在研究藥物開始前72小時(shí)內(nèi)的陰性血清妊娠測試(最小靈敏度25IU/L或人絨毛膜促性腺激素[HCG]的等價(jià)單位)。5)男性整個(gè)研究期間以及最后輸注后最高達(dá)8周必須使用足夠的避孕方法，從而使得其配偶的懷孕危險(xiǎn)降到最低。排除標(biāo)準(zhǔn)1)不愿意或不能使用可接受的方法以避免整個(gè)研究時(shí)間段以及最后輸注后最高達(dá)8周懷孕的WOCBP。2)懷孕或進(jìn)行母乳喂養(yǎng)的女性3)在入選時(shí)或在研究藥物施用前妊娠測試陽性的女性4)對于整個(gè)研究時(shí)間段以及研究藥物最后輸注后最高達(dá)8周不愿意或不能使用適當(dāng)?shù)谋茉蟹椒ǖ哪行?)供體年齡<10歲6)具有下列潛在腎病的受試者a)局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(活組織檢查證明的)b)I或II型膜性增生性腎小球腎炎c)溶血性尿毒性綜合征/血栓形成性血小板減少性紫癜綜合征7)目前PRA^30%的受試者8)T細(xì)胞淋巴細(xì)胞毒性交叉配型陽性的受試者9)具有任何先前實(shí)體器官移植(包括腎)的受試者10)接受同時(shí)發(fā)生的實(shí)體器官(心臟、肝、胰)或細(xì)胞(胰島、骨髓、干細(xì)胞)移植的受試者11)接受來自擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體的成對腎的受試者(雙腎移植)12)丙型肝炎抗體陽性或關(guān)于丙型肝炎的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)陽性的受試者13)乙型肝炎表面抗原陽性或關(guān)于乙型肝炎的PCR陽性的受試者14)已知人免疫缺陷病毒(HIV)感染的受試者15)在前3年內(nèi)具有需要治療的活動(dòng)性結(jié)核(TB)的受試者或先前需要關(guān)于TB的三重(或更多)組合治療的任何受試者。已知純化的蛋白衍生物(PPD)陽性的受試者對于研究將不是合格的，除非他們完成關(guān)于潛伏TB的治療并且在入選時(shí)具有陰性胸部X射線檢查。在最后12個(gè)月內(nèi)進(jìn)行的PPD測試是可接受的，只要存在結(jié)果的文件證明。具有先前的陰性結(jié)果、在最后12個(gè)月中沒有PPD的受試者可以入選，如果他們在入選時(shí)還具有陰性胸部X射線斥企查，沒有指示TB的癥狀，沒有已知的TB接觸，目前沒有居住在TB地方性流行區(qū)域、近期沒有去所述區(qū)域旅游、或先前不是從所述區(qū)域移來的話。210mm硬結(jié)的PPD應(yīng)答或在非卡介苗(非BCG)免疫受試者中>1或在BCG免疫受試者中〉2的Heaf得分應(yīng)當(dāng)視為陽性測試。根據(jù)16)具有活性感^染或通常將排除移植的其他禁k癥的受試者'17)生命期望受疾病狀態(tài)或其他潛在醫(yī)學(xué)狀況嚴(yán)格限制的受試者18)在最后5年內(nèi)具有癌癥史(通過局部切除術(shù)治愈的除非黑素瘤皮膚細(xì)胞癌外的)的受試者19)在過去5年內(nèi)具有物質(zhì)濫用(藥物或酒精)史，或與適當(dāng)?shù)难芯侩S訪不相容的精神病癥的受試者20)具有活性消化性潰瘍病、慢性腹瀉或胃腸吸收不良的受試者21)地方實(shí)驗(yàn)室值為通用毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTC)II級或更大的受試者不能參與該研究。然而，對于CTCII級是例外的某些特定實(shí)驗(yàn)室參數(shù)將是允許的。注意下列允許血液學(xué)血紅蛋白可以低于CTCII級(但不低于8g/dL)。血小板可以低于CTCII級，j旦不低于80,000/mm3(80x109/L)。總白細(xì)月包(WBC)計(jì)數(shù)可以低于CTCII級，但不低于3000/mm3(3x109/L)。粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)可以是任何值?；瘜W(xué)SCr和血液尿素氮(BUN)值可以是任何值。血糖可以是任何值。尿分析尿分析結(jié)果可以是任何值22)所有40歲或更大的女性，和具有乳癌史的一級親屬或具有乳癌的其他危險(xiǎn)因素的任何年齡的女性必須具有篩選乳房X線照片、或提供在入選6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行的篩選乳房X線照片結(jié)果。具有懷疑惡性腫瘤的乳房X線照片以及在另外的臨床、實(shí)驗(yàn)室或其他診斷評估后不能合理地排除惡性肺瘤可能性的受試者將被排除。如果篩選乳房X線照片沒有在入選6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行，但受試者由地方標(biāo)準(zhǔn)視為合適的移植候選者，那么基線乳房X線照片可以在移植后4周內(nèi)獲得23)具有靜脈內(nèi)進(jìn)入困難或可能將排除測量的GFR共同初級終末點(diǎn)評估的其他原因的受試者，或不太可能(例如由于預(yù)先存在的凝固問題)或不愿意經(jīng)歷方案指定的12個(gè)月同種異體移植物活組織檢查的受試者24)具有對靜脈內(nèi)注射碘化X射線造影劑的真實(shí)變態(tài)反應(yīng)史的受試者25)在第1天就診前30天內(nèi)已使用任何試驗(yàn)藥的受試者26)先前用L104EA29YIg治療的受試者27)囚犯或由于精神病或身體(例如傳染病)疾病治療被強(qiáng)制拘留(非自愿的禁閉)的受試者必須不能入選這項(xiàng)研究。L104EA29YIg的施用第1天定義為移植當(dāng)天(移植后第0天)。第1天給藥的輸注應(yīng)當(dāng)在外科醫(yī)生已進(jìn)行最初手術(shù)中評估，且已得出結(jié)論為受試者仍然是移植候選者并且將進(jìn)行移植后，以及在開始移植血管吻合前開始。輸注劑量將基于在研究第l天時(shí)的受試者實(shí)際體重，并且在研究過程期間將不修改，除非體重變化±10%。研究藥物應(yīng)當(dāng)以相對恒定的速率經(jīng)過30分鐘施用于受試者。第1天和第5天(移植后第4天)的劑量應(yīng)當(dāng)隔開大約96小時(shí)(±6小時(shí))施用。后續(xù)就診和輸注窗口在下文提供。對于進(jìn)行透析的受試者，L104EA29YIg的輸注以及受試者重量的測定應(yīng)當(dāng)在透析治療后發(fā)生。L104EA29YIgMI方案隨機(jī)化至MI方案的受試者將接受第1和5天時(shí)，以及隨后2個(gè)月每隔一周(第2、4、6、8、10和12周)，以及隨后每4周到第6個(gè)月(第16、20和24周)的靜脈內(nèi)L104EA29YIg(10mg/kg)。6個(gè)月后，MI治療組中的受試者將接受每4周的L104EA29YIg5mg/kg的維持劑量，直至36個(gè)月時(shí)試驗(yàn)完成。L104EA29YIgLI方案隨機(jī)化至LI方案的受試者將接受第1和5天時(shí)，以及隨后2周每隔一周(第2和4周)，以及2個(gè)月每4周(第8和12周)的靜脈內(nèi)L104EA29YIg(10mg/kg)。3個(gè)月后，LI治療組中的受試者將接受每4周的L104EA29YIg5mg/kg的維持劑量，直至36個(gè)月時(shí)試驗(yàn)完成。LI和MI組之間的不知情將借助于LI治療組中的2次安慰劑輸注來保持。因此，隨機(jī)化至LI方案的受試者將在第6和10周時(shí)施用安慰劑(溶于注射用水的葡萄糖5%[D5W])輸注。環(huán)孢菌素(CsA)的施用CsA的日劑量應(yīng)當(dāng)根據(jù)與時(shí)刻和膳食有關(guān)的一致時(shí)間表以2次分開的劑次施用。在研究就診日時(shí)，受試者必須停止早晨CsA劑次直至獲得谷CsA血液水平后。在研究就診日時(shí)，當(dāng)受試者將具有標(biāo)準(zhǔn)化的BP監(jiān)控和/或測量的GFR評估時(shí)，這些測量將在CsA給藥前完成。最初日劑量應(yīng)為7±3mg/kg(即，4-10mg/kg)。后續(xù)劑量應(yīng)當(dāng)進(jìn)行調(diào)整以維持預(yù)定范圍的谷血清濃度第1個(gè)月靶水平l50-300ng/mL第l個(gè)月后耙水平100-250ng/mL。使用給藥后2小時(shí)的血漿濃度(C2)監(jiān)控CsA水平在這項(xiàng)研究中不使用。盡管通過C2監(jiān)控管理Neoral的近期國際一致聲明支持C2監(jiān)控的使用，但它也清楚地聲明缺乏關(guān)于對腎功能的長期作用、CAN的發(fā)生率、以及與C2監(jiān)控有關(guān)的一般安全性特征的數(shù)據(jù)。24此外，不是所有受試者都適合于C2監(jiān)控，包括患有糖尿病、緩慢胃排空的受試者，或者使用改變CsA清除率的伴隨藥物的受試者。此外，低C2水平可以由真實(shí)的低吸收(其中CsA劑量應(yīng)當(dāng)增加)或由慢吸收(其中存在延遲的最大血漿濃度并且劑量增加可能產(chǎn)生毒性)引起。最后，這種實(shí)踐并不普遍，并且預(yù)期證實(shí)這種實(shí)踐超過目前方案的范圍。關(guān)于另外的處方信息，參見包裝插頁。CsA應(yīng)當(dāng)在所有受試者中第7天開始。對于其中研究者認(rèn)為開始CsA根本不是為了受試者的最佳利益(例如，由于腎功能受損)，并且相反選擇使用非研究藥物(例如西羅莫司)的受試者，這種行為將被視為中斷研究藥物。對于具有立即同種異體移植物功能的受試者對于隨機(jī)化至使用CsA治療的受試者，CsA的第1劑應(yīng)當(dāng)一有適當(dāng)?shù)耐N異體移植物功能的證據(jù)就施用，但直到那時(shí)才施用。適當(dāng)?shù)耐N異體移植物功能定義為與最初的移植后值比較SCr減少至少lmg/dL,或在移植后12小時(shí)(或更少)的時(shí)間段內(nèi)尿排出量2250mL。對于具有受損的腎同種異體移植物功能和預(yù)期DGF的受試者具有手術(shù)后受損的同種異體移植物功能和預(yù)期DGF的受試者對于接受多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑合格-但不是必需的。無論受試者接受多克隆淋巴細(xì)胞制劑與否，當(dāng)存在同種異體移植物功能恢復(fù)的證據(jù)(如上文限定)或第7天時(shí)應(yīng)當(dāng)開始CsA。皮質(zhì)類固醇這項(xiàng)研究中的所有受試者將每天用皮質(zhì)類固醇治療。類固醇維持-逐漸減少。移植日(第1天)在到達(dá)手術(shù)室(OR)后靜脈內(nèi)500mg曱基強(qiáng)的松龍(作為琥珀酸鈉)第2天甲基強(qiáng)的松龍(作為琥珀酸鈉)250mg靜脈內(nèi)第3天強(qiáng)的松(或強(qiáng)的松龍)100mg經(jīng)口(口月良)第4天到第14天(即，第2周結(jié)束時(shí))強(qiáng)的松(或強(qiáng)的松龍)逐漸減少至20-30mg每天1次口服第15天到第6個(gè)月強(qiáng)的松(或強(qiáng)的松龍)逐漸減少至不低于2.5mg每天1;欠口月良受試者必須保持在至少2.5mg每天1次口服到第3年。前2個(gè)劑量(研究第1天，移植日和研究第2天，手術(shù)后第1天)將靜脈內(nèi)施用。其余劑量將口服施用。然而，當(dāng)經(jīng)口給藥不可能時(shí)靜脈內(nèi)給藥相等劑量的曱基強(qiáng)的松龍有時(shí)也是允許的。關(guān)于靜脈內(nèi)而不是口服給藥的此類原因是并發(fā)性疾病、手術(shù)后腸梗阻、或由研究者自行決定的其他原因。如果甲基強(qiáng)的松龍不可用，那么允許使用與甲基強(qiáng)的松龍劑量等價(jià)的另一種靜脈內(nèi)皮質(zhì)類固醇試劑。霉酚酸酯給藥這項(xiàng)研究中的所有受試者將用MMF治療。每天的MMF應(yīng)當(dāng)根據(jù)與時(shí)刻和膳食有關(guān)的一致時(shí)間表以2次分開的劑次施用。劑量應(yīng)當(dāng)是每天2g;然而，在非裔美國人中，可以由研究者自行決定施用每天3g。25MMF應(yīng)當(dāng)口服施用。由于并發(fā)性疾病、手術(shù)后腸梗阻、或由研究者自行決定的其他原因，如果需要，靜脈內(nèi)給藥是允許的。第1次劑量應(yīng)當(dāng)在手術(shù)前施用。后續(xù)劑量應(yīng)當(dāng)一旦受試者能夠耐受經(jīng)口藥物就口服施用。劑量和時(shí)間表可以基于實(shí)驗(yàn)室值(例如減少的WBCs)和受試者可容許性(參見下文)來調(diào)整。關(guān)于完整的處方信息，參見包裝插頁。對于發(fā)展惡心、腹瀉或其他MMF相關(guān)胃腸不利作用的受試者(例如癥狀充分評估并且—見為不具有除對MMF不耐受以外的病因)，MMF劑量可以減少至最大耐受劑量。對于發(fā)展嗜中性白細(xì)胞減少癥(絕對嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)〈1.3xl03/fL)的受試者，使用MMF的給藥應(yīng)當(dāng)中斷或按照包裝插頁減少劑量。巴利昔單抗給藥這項(xiàng)研究中的所有受試者將用巴利昔單抗的推薦給藥方案治療。巴利昔單抗應(yīng)當(dāng)只通過外周或中央靜脈施用。重構(gòu)的巴利昔單抗(溶于5mL中的20mg)應(yīng)當(dāng)用生理鹽水或葡萄糖5%稀釋至50mL的體積并且作為靜脈內(nèi)輸注在20-30分鐘內(nèi)施用。第1次20mg劑量應(yīng)當(dāng)在第1天時(shí)(移植當(dāng)天；手術(shù)后第0天)施用。對于隨機(jī)化至L104EA29YIg的受試者，這種第1次巴利昔單抗輸注應(yīng)當(dāng)在L104EA29YIg輸注完成后盡快發(fā)生。第2次20mg劑量應(yīng)當(dāng)在第5天時(shí)(手術(shù)后第4天)給予。第2次巴利昔單抗劑量不應(yīng)施用于受試者，如果他們已接受或預(yù)期接受淋巴細(xì)胞消耗療法的話。關(guān)于另外的信息，參見包裝插頁。用于受損的腎同種異體移植物功能和預(yù)期DGF的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑(Thymoglobulin或ATGAM)的使用對于隨機(jī)化至CsA、移植后經(jīng)歷受損的腎同種異體移植物功能和預(yù)期DGF的患者是允許的-但不是必需的。在其中存在市場授權(quán)的區(qū)域內(nèi)，并且如果它們標(biāo)明用于治療腎移植中的急性排斥，則允許使用其他多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑或多克隆抗胸腺細(xì)胞球蛋白。值得注意的是，0KT3不用于這個(gè)目的，但可以用于治療Banff97IIb級或更大的急性排斥或抗類固醇急性排斥。Campath1-H(阿侖單抗(alemtuzumab))的使用在這種方案中是不允許的，因?yàn)樗鼪]有標(biāo)明用于在腎移植中使用。這些試劑以這種能力廣泛用于提供免疫抑制，直至移植物功能允許施用CsA。因此，在這種臨床情況中可以由研究者自行決定在滿足>1個(gè)下列標(biāo)準(zhǔn)的受試者中使用多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑，所述標(biāo)準(zhǔn)在存在移植物動(dòng)脈和靜脈未閉，并且通過聲波圖沒有'If積水的證據(jù)的情況下觀察到a)尿排出量〈250cc/12小時(shí)b)SCr從基線值經(jīng)過移植后的前24-72小時(shí)沒有顯著改善(<lmg/dL)c)透析治療。用于受損的腎同種異體移植物功能和預(yù)期DGF的這些試劑的使用在L104EA29YIg治療的受試者中是不允許的。新諾明/曱氧千啶給藥參與這項(xiàng)研究、沒有禁忌癥的所有受試者都應(yīng)當(dāng)接受新諾明/曱氧千咬預(yù)防以防止泌尿道和卡氏月市孢子蟲(尸"ewmoqy"^c"n'm7)感染。給藥和施用將由與包裝插頁一致的腎功能水平?jīng)Q定。具有針對磺胺藥或曱氧節(jié)啶的禁忌癥或不耐受的受試者可以由研究者自行決定接受使用吸入的戊烷脒的預(yù)防治療。關(guān)于完整的處方信息，參見包裝插頁。瓦更昔洛韋/更昔洛韋，阿昔洛韋/伐昔洛韋給藥沒有針對瓦更昔洛韋、更昔洛韋、阿昔洛韋和伐昔洛韋的禁忌癥的所有受體都應(yīng)當(dāng)用這些藥物預(yù)防性治療以防止由于CMV和單純皰滲(//erp"w'wp/ex)的感染。下列是關(guān)于預(yù)防性治療的給藥和持續(xù)時(shí)間的指南用于移植后的前10天或在T細(xì)胞消耗療法過程中的預(yù)防所有移植受試者都將根據(jù)關(guān)于手術(shù)后10天的方案接受瓦更昔洛韋或更昔洛韋。如果使用關(guān)于誘導(dǎo)治療的T細(xì)胞消耗療法或關(guān)于急性排斥的療法治療，那么受試者對于T細(xì)胞消耗療法的持續(xù)時(shí)間將接受瓦更昔洛韋或更昔洛韋。如果受試者在10天前出院，那么將如下文所述基于CMV免疫狀態(tài)開始經(jīng)口瓦更昔洛韋、更昔洛韋、伐昔洛韋或阿昔洛韋。用于預(yù)防的瓦更昔洛韋肌酸酐清除率^60mL/分鐘，劑量900mg每日；肌酸酐清除率40-59mL/分鐘，劑量450mg每日；肌酸酐清除率〈40mL/分鐘，劑量450mg每隔一曰。用于預(yù)防的更昔洛韋如果受試者不能耐受經(jīng)口藥物，或者瓦更昔洛韋不能用于使用，那么更昔洛韋懸浮液或膠嚢可以代替。肌酸酐清除率S70mL/分鐘，劑量lg每天3次；肌酸酐清除率50-69mL/分鐘，劑量500mg每天3次；肌酸酐清除率25-49mL/分鐘，劑量500mg每天2次；肌酸酐清除率10-24mL/分鐘，劑量500mg每日；肌酸酐清除率〈10mL/分鐘，劑量500mg,血液透析后3次/周。如果需要靜脈內(nèi)更昔洛韋，那么參見包裝插頁用于給藥。移植后IO天后到至少3個(gè)月的預(yù)防CMV抗體血清反應(yīng)陽性供體對CMV抗體血清反應(yīng)陰性受體上文列出的瓦更昔洛韋或更昔洛韋方案持續(xù)>3個(gè)月。CMV抗體血清反應(yīng)陽性或血清反應(yīng)陰性供體對CMV抗體血清反應(yīng)陽性受體經(jīng)口阿昔洛韋>移植后3個(gè)月血清肌酸肝250mL/分鐘，劑量800mg經(jīng)口每天4次；血清肌酸酐25-49mL/分鐘，劑量800mg經(jīng)口每天3次；血清肌酸酐11-24mL/分鐘，劑量800mg經(jīng)口每天2次；血清肌酸酐〈10mL/分鐘，劑量800mg經(jīng)口每日；對于血液透析，血液透析后劑量800mg每日。在出院時(shí)為了受試者方便伐昔洛韋可以代替阿昔洛韋。血清肌酸酐^50mL/分鐘，劑量500mg經(jīng)口每天2次；血清肌酸酐25-49mL/分鐘，劑量500mg經(jīng)口每日；血清肌酸酐11-24mL/分鐘，劑量500mg經(jīng)口每日；血清肌酸酐<10mL/分鐘，劑量250mg經(jīng)口每日；對于血液透析，血液透析后劑量250mg每日。CMV抗體血清反應(yīng)陰性供體對CMV抗體血清反應(yīng)陰性受體經(jīng)口阿昔洛韋方案只對于皰滲預(yù)防需要持續(xù)^移植后3個(gè)月。阿昔洛韋400mg口服每天2次，或在出院時(shí)為了患者方便伐昔洛韋可以代替阿昔洛韋。關(guān)于完整的處方信息，參考包裝插頁。僅輸注就診操作a)對于隨機(jī)化至L104EA29YIg治療的受試者在L104EA29YIg施用前要求陰性妊娠測試。劑量基于最近的先前研究就診時(shí)的受試者重量。應(yīng)當(dāng)監(jiān)控受試者的生命體征(輸注前和后)，并且應(yīng)當(dāng)評估AEs。在某些就診時(shí)可能需要PK樣品。b)對于隨機(jī)化至CsA治療的受試者受試者應(yīng)當(dāng)只對于AEs評估進(jìn)行聯(lián)系。這種就診可以是電話聯(lián)系，并且應(yīng)當(dāng)在關(guān)于指定就診開處的就診窗口內(nèi)發(fā)生。就診窗口a)對于隨機(jī)化至L104EA29YIg治療的受試者第1天和第5天的劑量應(yīng)當(dāng)隔開大約96小時(shí)(±6小時(shí))施用。為了促進(jìn)僅輸注就診的時(shí)間安排，下列窗口對于后續(xù)劑量是允許的就診第2周，就診窗口靶日期±2天；就診第4周-第6個(gè)月就診窗口靶日期土3天，就診第7個(gè)月-第36個(gè)月，就診窗口靶日期士5天；就診隨訪8周，就診窗口耙日期士5天。b)對于隨機(jī)化至CsA治療的受試者第5天后，受試者只需要參加第2、4、8和12周的臨床就診；隨后每3個(gè)月時(shí)間間隔的就診。在非3個(gè)月時(shí)間間隔的就診時(shí)(即，第6、10、16、20、28、32周等)，將進(jìn)行電話聯(lián)系以收集AE信息。臨床和聯(lián)系就診應(yīng)當(dāng)在與上文指定的關(guān)于隨機(jī)化至L104EA29YIg的受試者相同的就診窗口發(fā)生。關(guān)于第3和12個(gè)月GFR評估的靶日期是第U周士M天和第52周±14天。在某些情況下，且使用先前批準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)監(jiān)控，在第3個(gè)月和12個(gè)月時(shí)測量的GFR評估可以分別到第6個(gè)月和15個(gè)月進(jìn)^f亍?？梢?吏測量作的存在或由于技術(shù)原因需要重復(fù)評估。、5''''關(guān)于第12個(gè)月的同種異體移植物活組織檢查的靶日期是第52周±14天。類似地，在某些情況下且使用先前批準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)監(jiān)控，同種異體移植物活組織檢查可以到第15個(gè)月獲得。可以使同種異體移植物活組織檢查延長有正當(dāng)理由的此類原因包括關(guān)于抗凝作用的臨時(shí)需要。實(shí)施例5本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用上文實(shí)施例4中描述的施用時(shí)間表以設(shè)計(jì)包括不同研究群體、供體標(biāo)準(zhǔn)和/或目的的研究。例如，這項(xiàng)移植研究將評估接受來自活供體或已故供體、預(yù)期冷缺血時(shí)間<24小時(shí)的腎移植的受試者。各種免疫學(xué)危險(xiǎn)水平上的受試者將是合格的。然而，該研究將排除最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)的受試者。受試者將如上文實(shí)施例4中所述隨^M匕至MI、LI或CsA組。初級目的評估L104EA29YIg相對于CsA對12個(gè)月的受試者和移才直物存活復(fù)合的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR〈60mL/分鐘/1.73n^或從第3個(gè)月到第12個(gè)月測量的GFR減少上10mL/分鐘/1.73m2復(fù)合的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對12個(gè)月的急性排斥發(fā)生率的作用。次級目的評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)的活組織沖全查證明的CAN的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)測量的GFR<60mL/分鐘/1.731112或從第3個(gè)月到第12個(gè)月測量的GFR減少>10mL/分鐘/1.73n^的初級復(fù)合終末點(diǎn)中個(gè)別組分的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對12、24和36個(gè)月的死亡、移植物丟失和急性排斥的三重復(fù)合終末點(diǎn)的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在24個(gè)月時(shí)測量的GFR<60mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在3和24個(gè)月時(shí)測量的GFR,以及從基線(3個(gè)月)到12和到24個(gè)月的變化的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12和24個(gè)月時(shí)測量的GFR<30mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在6、12、24和36個(gè)月時(shí)計(jì)算的GFR,以及從6個(gè)月到12、24和36個(gè)月的變化的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對12、24和36個(gè)月的PTDM的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)高血壓測量的作用，包括SBP和DBP、高血壓和受控制的高血壓的發(fā)生率和流行率、以及治療方案的強(qiáng)度。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)血脂異常測量的作用，包括血清總、非HDL、低密度脂蛋白(LDL)和HDL膽固醇和TGs,血脂異常和受控制的血脂異常的發(fā)生率和流行率，以及治療方案的強(qiáng)度。評估L104EA29YIg相對于CsA對24和36個(gè)月的受試者和移植物存活的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在24和36個(gè)月時(shí)計(jì)算的GFR<60mL/分鐘/1.73m2的受試者比例的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對6、12、24和36個(gè)月時(shí)急性排斥測量的作用，包括急性排斥的發(fā)生率和嚴(yán)重性、用于受損的腎功能和預(yù)期移植物功能延遲(DGF)的多克隆抗淋巴細(xì)胞制劑的使用、用于治療急性排斥的淋巴細(xì)胞消耗療法的最初使用、抗類固醇急性排斥的發(fā)生率、急性排斥后完全恢復(fù)(SCr回到基線)的發(fā)生率、亞臨床性排斥的發(fā)生率、以及不管組織學(xué)發(fā)現(xiàn)所有治療的急性排斥發(fā)作的發(fā)生率，以及急性排斥發(fā)作的時(shí)間。評估L104EA29YIg相對于CsA對QoL的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA的總體安全性。評估L104EA29YIg相對于CsA對從3個(gè)月到12、24和36個(gè)月計(jì)算的GFR的斜率和截距的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12個(gè)月時(shí)計(jì)算的GFR〈60mL/分鐘/1.731112的受試者，或從第3個(gè)月到第12個(gè)月計(jì)算的GFR減少至少10mL/分鐘/1.731112的受試者比例的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對DGF發(fā)生率的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12和24個(gè)月時(shí)如通過測量的GFR評估，具有1期到5期慢性腎臟疾病的受試者比例的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在36個(gè)月時(shí)如通過計(jì)算的GFR評估，具有1期到5期慢性腎臟疾病的受試者比例的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對12、24和36個(gè)月的復(fù)合心血管疾病終末點(diǎn)(判定的心血管性死亡、心肌梗死、缺血性發(fā)作、和血管再通[外科手術(shù)或經(jīng)皮]操作)的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對12、24和36個(gè)月的復(fù)合心腎疾病終末點(diǎn)(死亡、移植物丟失、非致命性心肌梗死和中風(fēng))的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對在12、24和36個(gè)月時(shí)Framingham危險(xiǎn)評分的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對研究藥物中斷發(fā)生率的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對抗供體人白細(xì)胞抗原(HLA)抗體的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對血管緊張素II1型(ATI)-受體抗體的作用。評估L104EA29YIg相對于CsA對活組織檢查樣品中C4d陽性的作用。研究設(shè)計(jì)該研究的持續(xù)時(shí)間是3年，隨后是關(guān)于安全性評估的8周隨訪期。這是隨機(jī)化、半盲、活性對照、平行組研究。所有受試者都將接受來自預(yù)期CIT<24小時(shí)的活供體或已故供體的腎移植。大約660名受試者將以1:1:1的比率隨^/L化至^f吏用L104EA29YIg(MI方案)、L104EA29YIg(LI方案)或CsA的治療。所有受試者還將接受使用巴利昔單抗的誘導(dǎo)，以及MMF和皮質(zhì)類固醇的背景維持免疫抑制方案。隨機(jī)化至MI方案的受試者將接受第1和5天時(shí)，隨后每2周到第3個(gè)月(第2、4、6、8、10和U周)，以及隨后每4周到第6個(gè)月(第16、20和24周)的靜脈內(nèi)L104EA29YIg(10mg/kg)。6個(gè)月后，MI治療組中的受試者將接受每4周施用的L104EA29YIg5mg/kg的維持劑量，直至36個(gè)月時(shí)試驗(yàn)完成。隨機(jī)化至LI方案的受試者將接受第1和5天時(shí)，以及隨后每2周到第1個(gè)月(第2和4周)，以及每4周到第3個(gè)月(第8和12周)的靜脈內(nèi)L104EA29YIg(10mg/kg)。3個(gè)月后，LI治療組中的受試者將接受每4周施用的L104EA29YIg5mg/kg的維持劑量，直至36個(gè)月時(shí)試驗(yàn)完成。LI和MI組之間的不知情借助于在第6和IO周時(shí)LI治療組中的安慰劑輸注來保持。隨機(jī)化至CsA的受試者將接受每天2次的劑量，其設(shè)計(jì)為達(dá)到與目前醫(yī)療實(shí)踐一致的指定谷血清濃度范圍。L104EA29YIg的安全性和功效將在1、2和3年時(shí)評估。獨(dú)立的DSMB將在正在進(jìn)行的基礎(chǔ)上再檢查來自研究的數(shù)據(jù)，并在必要時(shí)作出關(guān)于改變試驗(yàn)進(jìn)行的建議。研究群體研究群體包括來自預(yù)期CIT<24小時(shí)的活供體或已故供體的腎同種異體移植物的受體。一般地，免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在受試者選擇中將不起主要作用。各種免疫學(xué)危險(xiǎn)水平上的受試者是合格的。然而，該研究將排除最大的免疫學(xué)危險(xiǎn)的受試者(交叉配型陽性、目前系列反應(yīng)性抗體[PRA]250。/。，或目前PRA》30%的先前移植的那些)。這些受試者可能需要減少其抗體負(fù)荷的治療，例如血漿去除術(shù)，這超出這種方案的范圍。受試者將在全球大約100個(gè)地點(diǎn)入選。包括標(biāo)準(zhǔn)靶群體1)受試者是預(yù)期CIT<24小時(shí)的活供體或已故供體腎移植的受體2)男性和女性，年齡18或更大，包含性的3)WOCBP必須使用適當(dāng)?shù)谋茉蟹椒ㄒ砸赃@樣的方式避免整個(gè)研究期間以及研究后最高達(dá)8周懷孕，從而使得懷孕的危險(xiǎn)最小化。WOCBP包括已經(jīng)歷月經(jīng)初潮并且未經(jīng)歷成功的外科手術(shù)絕育(子宮切除術(shù)、兩側(cè)輸卵管結(jié)扎或雙側(cè)卵巢切除術(shù))或不是絕經(jīng)后(定義為閉經(jīng)連續(xù)12個(gè)月；或使用激素代替療法[HRT]的女性，其具有文件證明的血清促卵泡激素[FSH]水平〉35mlU/mL)的任何女性。甚至使用經(jīng)口、植入或可注射的避孕激素或機(jī)械產(chǎn)品例如宮內(nèi)器具或障礙方法(隔膜、避孕套、殺精子劑)以預(yù)防懷孕或?qū)嵭泄?jié)欲或其中配偶不育(例如輸精管切除術(shù))的女性都應(yīng)當(dāng)視為有分娩的可能性。WOCBP必須具有在研究藥物開始前72小時(shí)內(nèi)的陰性血清妊娠測試(最小靈敏度25IU/L或人絨毛膜促性腺激素[HCG]的等價(jià)單位)。排除標(biāo)準(zhǔn)1)不愿意或不能使用可接受的方法以避免整個(gè)研究時(shí)間段以及最后輸注后最高達(dá)8周懷孕的WOCBP。2)懷孕或進(jìn)行母乳喂養(yǎng)的女性。3)在入選時(shí)或在研究藥物施用前妊娠測試陽性的女性。4)遺傳上相同的供體受體對(即單卵雙生)。5)供體年齡<10歲。6)接受和擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)的供體器官的受試者，其如下定義a)供體年齡》60歲或b)供體年齡50-59歲以及下列之一(i)腦血管意外(CVA)+高血壓+SCr〉1.5mg/dL或(ii)CVA+高血壓或(iii)CVA+SCr>1.5mg/dL或(iv)高血壓+SCr〉1.5mg/dL或c)預(yù)期CIT224小時(shí)或d)心源性死亡的供體(無心跳供體)。7)具有下列潛在腎病的受試者a)原發(fā)性局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥b)I或II型膜性增生性腎小球腎炎c)溶血性尿毒性綜合征(HUS)/血栓形成性血小板減少性紫瘋綜合征。如果受試者具有病因不明的ESRD和/或沒有組織學(xué)證實(shí)的診斷，那么受試者將入選該研究，只要如研究者判斷的，沒有與原發(fā)性局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥、I或II型膜性增生性腎小球腎炎或HUS的臨床診斷一致的臨床病征或癥狀。8)經(jīng)歷初次(第1次)移植目前PRA^50y。的受試者，或經(jīng)歷再次移植PRAs30%的受試者。9)由于急性排斥先前移植物丟失的受試者。10)T細(xì)胞淋巴細(xì)胞毒性交叉配型陽性的受試者。11)具有先前非腎實(shí)體器官移植(在其他研究標(biāo)準(zhǔn)滿足前經(jīng)歷腎再次移植的受試者是合格的)，或經(jīng)歷多器官移植(例如腎-胰)的受試者，或由研究者認(rèn)為在接下來的3年內(nèi)可能具有第2次實(shí)體器官或細(xì)胞移植(例如胰或胰島移植)的受試者。12)接受同時(shí)發(fā)生的實(shí)體器官(心臟、肝、胰)或細(xì)胞(胰島、骨髓、干細(xì)胞)移植的受試者。13)接受成對腎的受試者(雙或全腎移植)。14)已知丙型肝炎抗體陽性或關(guān)于丙型肝炎的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)陽性的受試者。15)已知乙型肝炎表面抗原陽性或關(guān)于乙型肝炎的PCR陽性的受試者。16)已知人免疫缺陷病毒(HIV)感染的受試者。17)在前3年內(nèi)具有需要治療的活動(dòng)性結(jié)核(TB)的受試者或先前需要關(guān)于TB的三重(或更多)組合治療的任何受試者。已知純化的蛋白衍生物(PPD)陽性的受試者對于研究將是不合格的，除非他們完成關(guān)于潛伏TB的治療并且在入選時(shí)具有陰性胸部X射線檢查。在最后12個(gè)月內(nèi)進(jìn)行的PPD測試是可接受的，只要存在結(jié)果的文件證明。具有先前的陰性結(jié)果、在最后12個(gè)月中沒有PPD的受試者可以入選，如果他們在入選時(shí)還具有陰性胸部X射線檢查，沒有TB指示的癥狀，沒有已知的TB接觸，目前沒有居住在TB地方性流行區(qū)域、近期沒有去所述區(qū)域旅游、或先前不是從所述區(qū)域移來的話。mm硬結(jié)的PPD應(yīng)答或在非卡介苗(非BCG)免疫受試者中〉1或在BCG免疫受試者中>2的Heaf得分應(yīng)當(dāng)視為陽性測試。根據(jù)公布的指南和i染或通常將排除移植的其他J忌、癥的受試;T。、19)生命期望受疾病狀態(tài)或其他潛在醫(yī)學(xué)狀況嚴(yán)格限制的受試者。20)在最后5年內(nèi)具有癌癥史(通過局部切除術(shù)治愈的除非黑素瘤皮膚細(xì)胞癌外的)的受試者。21)在過去5年內(nèi)具有物質(zhì)濫用(藥物或酒精)史，或與適當(dāng)?shù)难芯侩S訪不相容的精神病癥的受試者。22)具有活性消化性潰瘍病、慢性腹瀉或胃腸吸收不良的受試者。關(guān)于L104EA29YIgMI和LI以及CsA方案的施用和就診窗口，包括所需的列表，將如上文和實(shí)施例4中描述的。如對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見的，在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，本發(fā)明可以以除上文具體公開的那些以外的形式具體化。因此上文描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案視為說明性而不是限制性的。本發(fā)明的范圍如附加權(quán)利要求中闡述的而不是限制于前述說明書中包含的實(shí)施例。權(quán)利要求1.一種用于治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，其包括給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子，所述CTLA4突變型分子包括如SEQIDNO8中所示、起始于第26位的丙氨酸或第27位的甲硫氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的CTLA4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，其中在所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其部分中，第55位的丙氨酸由酪氨酸置換，并且第130位的亮氨酸由谷氨酸置換，并且其中所述施用方案包括早期方案，其中所述早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月1次更頻繁的施用。2.—種用于治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，其包括給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子，所述CTLA4突變型分子包括(a)SEQIDNO:4的起始于第27位的曱硫氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的氨基酸序列，或(b)SEQIDNO:4的起始于第26位的丙氨酸且終止于第150位的天冬氨酸的氨基酸序列，并且其中所述CTLA4突變型分子施用方案包括早期方案，其中所述早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月1次更頻繁的施用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述早期施用方案包括在第1天、第2周就診、第4周就診、第8周就診和第12周就診時(shí)施用CTLA4突變型分子。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述早期施用方案包括在第5天時(shí)施用CTLA4突變型分子。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述早期施用方案包括在第6周就診、第10周就診、第4個(gè)月就診、第5個(gè)月就診和第6個(gè)月就診時(shí)施用CTLA4突變型分子。6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5的方法，其中所述施用方案進(jìn)一步包括維持期方案，其中所述維持期方案在所述早期方案結(jié)束后開始并且其中CTLA4突變型分子的施用不比每月1次更頻繁。7.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5的方法，其中在所述早期過程中所述有效劑量的CTLA4突變型分子是約10mg/kg所述受試者重量。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在所述維持期過程中所述有效劑量的CTLA4突變型分子是約5mg/kg重量。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述有效劑量的CTLA4突變型分子是約10mg/kg所述受試者重量，其施用方案包括在第1、15、29、57、85天時(shí)施用，以及其后每月1次5gm/kg。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述有效劑量的CTLA4突變型分子是約10mg/kg所述受試者重量，其施用方案包括在第1、5、15、29、57、85天時(shí)施用，以及其后每月1次5mg/kg。11.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述有效劑量的CTLA4突變型分子是約10mg/kg所述受試者重量，其施用方案包括在第1、5、15、29、43、57、71、85、113、141、169天時(shí)施用，以及其后每月1次5mg/kg。12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中與移植物移植有關(guān)的所述免疫病癥包括實(shí)體器官、組織和/或細(xì)胞移植排斥。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中與移植物移植有關(guān)的所述免疫病癥包括腎移植排斥。14.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述CTLA4突變型分子進(jìn)一步包括改變所述可溶性CTLA4突變型分子的溶解性、親和力和/或效價(jià)的氨基酸序列。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中改變?nèi)芙庑?、親和力和/或效價(jià)的所述氨基酸序列包括免疫球蛋白部分。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述免疫球蛋白部分是免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分被突變以減少效應(yīng)子功能。18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分包括人或猴免疫球蛋白分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分包括人或猴免疫球蛋白分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。20.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述免疫球蛋白包括如SEQIDNO:4中所示、起始于第+152位的谷氨酸且終止于第+383位的賴氨酸的氨基酸序列。21.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包括接頭氨基酸殘基和免疫球蛋白，其中所述接頭氨基酸殘基位于終止于第+150位的天冬氨酸的所述氨基酸序列和所述免疫球蛋白之間。22.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述CTLA4突變型分子與選自下列的至少一種試劑共施用巴利昔單抗、達(dá)克珠單抗、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、鈣依賴磷酸酶抑制劑、環(huán)孢菌素、他克莫司、霉酚酸酯、霉酚酸、雷帕霉素、咪唑巰噤呤、莫羅單抗、利妥昔單抗、西羅莫司、依維莫司、FTY720、FK778、Jak-3、centican、皮質(zhì)類固醇、倍他米松、布地奈德、氫化可的松、可的松、地塞米松、hydrocritisone、曱基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松和去炎松。23.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中選自CAN、高脂血癥、高血壓、糖尿病、多毛癥、殼頭、牙齦增生、震顫、神經(jīng)毒性和骨丟失的結(jié)果的發(fā)展和/或進(jìn)展減少。24.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包括約3pg/ml-約30pg/ml靶谷血清濃度的所述CTLA4突變型分子。25.—種用于治療與移植物移植有關(guān)的免疫病癥的方法，其包括給受試者施用有效劑量的CTLA4突變型分子，所述CTLA4突變型分子包括(a)圖7的起始于第27位的甲硫氨酸且終止于第+357位的賴氨酸或第+356的甘氨酸的氨基酸序列，或(b)圖7的起始于第26位的丙氨酸且終止于第+357位的賴氨酸或第+356的甘氨酸的氨基酸序列，并且其中所述CTLA4突變型分子施用方案包括早期方案，其中所述早期方案可以是移植后的前3-6個(gè)月且涉及最初比每月1次更頻繁的施用。26.根據(jù)權(quán)利要求1、2或25的方法，其中所述CTLA4突變型分子與包括巴利昔單抗和MMF的試劑伴隨或順次地共施用。27.根據(jù)權(quán)利要求1、2或25的方法，其中所述CTLA4突變型分子與包括達(dá)克珠單抗和西羅莫司的試劑伴隨或順次地共施用。全文摘要本發(fā)明提供了可溶性CTLA4突變型分子在與移植物移植有關(guān)的免疫病癥治療中的用途，所述可溶性CTLA4突變型分子與CD80和/或CD86抗原結(jié)合的抗體親抗原性大于野生型CTLA4或非突變型CTLA4Ig。文檔編號A61K38/17GK101198347SQ200680019897公開日2008年6月11日申請日期2006年4月5日優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日發(fā)明者D·哈格爾蒂,J·魯斯納克申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司