專利名稱：人源化抗-cd70結(jié)合物和其應(yīng)用的制作方法
相關(guān)申請
本申請要求2005年4月19日提交的美國臨時專利申請60/673,070的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容納入本文作參考。
背景技術(shù)：
CD70是各種正常和惡性細(xì)胞類型表達(dá)的細(xì)胞膜-結(jié)合性分泌分子的腫瘤壞死因子(TNF)家族成員。CD70的一級氨基酸(AA)序列預(yù)測了跨膜II型蛋白，其羧基端暴露于細(xì)胞外，氨基端在質(zhì)膜的胞漿一側(cè)(Bowman等，1994，J.Immunol.1521756-61；Goodwin等，1993，Cell 73447-56)。人CD70由20AA胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、18AA跨膜結(jié)構(gòu)域和含有兩個可能的N連接糖基化位點(diǎn)的155AA胞外結(jié)構(gòu)域組成(Bowman等，同上；Goodwin等，同上)。用抗-CD70抗體對表達(dá)同位素標(biāo)記的CD70的細(xì)胞進(jìn)行特異性免疫沉淀，產(chǎn)生29和50kDa的多肽(Goodwin等，同上；Hintzen等，1994，J.Immunol.1521762-73)。根據(jù)它與TNF-α和TNF-β的同源性(尤其是結(jié)構(gòu)鏈C、D、H和I)，預(yù)計(jì)CD70具有三聚體結(jié)構(gòu)(Petsch等，1995，Mol.Immunol.32761-72)。
最初的免疫組織學(xué)研究揭示出，CD70在生發(fā)中心B細(xì)胞和扁桃體、皮膚和內(nèi)臟中的罕見T細(xì)胞上表達(dá)(Hintzen等，1994，Int.Immunol.6477-80)。后來，有報道稱CD70在最近抗原活化的T和B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)，去除抗原刺激后其表達(dá)降低(Lens等，1996，Eur.J.Immunol.262964-71；Lens等，1997，Immunology9038-45)。在淋巴系統(tǒng)中，活化的天然殺傷細(xì)胞(Orengo等，1997，Clin.Exp.Immunol.107608-13)和小鼠成熟外周血樹突細(xì)胞(Akiba等，2000，J.Exp.Med.191375-80)也表達(dá)CD70。在非淋巴譜系中，在胸腺髓狀上皮細(xì)胞中檢測到CD70(Hintzen等，1994，同上；Hishima等，2000，Am.J.Surg.Pathol.24742-46)。
正常非造血細(xì)胞上不表達(dá)CD70。在生理?xiàng)l件下，CD70表達(dá)大多限于最近抗原活化的T和B細(xì)胞，抗原刺激終止后其表達(dá)下調(diào)。來自動物模型的證據(jù)表明，CD70可能會引起免疫病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Brugnoni等，1997，Immunol.Lett.5599-104)、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎(Brugnoni等，1997，Immunol.Lett.5599-104)和狼瘡(Oelke等，2004，Arthritis Rheum.501850-60)。除可能在炎癥反應(yīng)中起作用外，CD70也表達(dá)于各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，包括淋巴瘤B細(xì)胞、霍奇金和里-施細(xì)胞、神經(jīng)來源的惡性細(xì)胞和許多癌。
因此，需要可對CD70-表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生臨床上有用的細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的，特別是不會對非CD70表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響的抗-CD70抗體和其它CD70結(jié)合物。這種化合物是表達(dá)CD70的癌癥或CD70-表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病的有用治療劑。(本申請中對任何參考文獻(xiàn)的引用并不意味著承認(rèn)該參考文獻(xiàn)是本申請的現(xiàn)有技術(shù)。) 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了CD70抗體和相關(guān)性CD70結(jié)合物，以及有關(guān)用這種結(jié)合物預(yù)防或治療表達(dá)CD70的癌癥和存在CD70-表達(dá)細(xì)胞的免疫病的方法。單獨(dú)的CD70結(jié)合物或與治療劑聯(lián)用時，對CD70-表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制和/或免疫調(diào)節(jié)作用。
一方面，提供了CD70結(jié)合物。CD70結(jié)合物可以是(例如)抗體。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物包括至少介導(dǎo)對象的ADCC、ADCP或CDC應(yīng)答的至少一種效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物在沒有偶聯(lián)于治療劑的情況下行使細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)作用。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物偶聯(lián)于具有細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的治療劑。該抗體可與單克隆抗體1F6或2F2競爭結(jié)合CD70。
在另一方面，提供了一種治療對象的表達(dá)CD70的癌癥的方法。所述方法通常包括給予所述對象有效量的CD70結(jié)合物。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物包括至少介導(dǎo)對象產(chǎn)生ADCC、ADCP或CDC應(yīng)答的至少一種效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物在沒有偶聯(lián)于治療劑的情況下行使細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)作用。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物偶聯(lián)于具有細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的治療劑。
所述CD70結(jié)合物可以是(例如)抗體。所述抗體可包括例如人IgM或IgG抗體的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。IgG抗體可以是(例如)人IgG1或IgG3亞型。在一些實(shí)施方式中，所述抗體包括人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述CD70結(jié)合物與單克隆抗體1F6或2F2競爭結(jié)合CD70。在其它實(shí)施方式中，所述抗體是人源化1F6。在其它實(shí)施方式中，所述抗體是人源化2F2。所述抗體可以是(例如)單價、二價或多價。
表達(dá)CD70的癌癥可以是腎腫瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)腸癌、霍奇金病、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、非霍奇金淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、鼻咽癌、腦腫瘤或胸腺癌。腎腫瘤可以是(例如)腎細(xì)胞癌。腦腫瘤可以是(例如)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤或腦膜瘤。所述對象可以是(例如)哺乳動物，如人。
在另一方面，提供了一種治療免疫病的方法。所述方法包括給予對象有效量的CD70結(jié)合物。在一些實(shí)施方式中，該結(jié)合物包括至少介導(dǎo)對象產(chǎn)生ADCC、ADCP或CDC應(yīng)答的至少一種效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，該結(jié)合物在沒有偶聯(lián)于治療劑的情況下行使細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)作用。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合物偶聯(lián)于具有細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的治療劑。所述CD70結(jié)合物可以是(例如)抗體。該抗體可包含(例如)人IgM或IgG抗體的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。所述IgG抗體可以是(例如)人IgG1或IgG3亞型。在一些實(shí)施方式中，該抗體包括人恒定區(qū)。
所述免疫病可以是(例如)T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫病。在一些實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病涉及表達(dá)CD70的活化T細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，給予抗體-藥物偶聯(lián)物不會大量消耗靜息T細(xì)胞。T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫病也可以是(例如)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎、血小板減少性紫癜、多發(fā)性硬化、牛皮癬、舍格倫綜合征、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫病、結(jié)核病或移植物抗宿主病。在其它實(shí)施方式中，所述免疫病是活化B-淋巴細(xì)胞病。所述對象可以是(例如)哺乳動物，如人。
在一個相關(guān)方面，也提供了用于治療表達(dá)CD70的癌癥或免疫病的藥物組合物。所述組合物包含CD70結(jié)合物和至少一種藥學(xué)相容性成分。還提供了一種藥盒，其包括含有CD70結(jié)合物的容器和含有藥學(xué)上可接受的稀釋劑的第二容器，其中所述結(jié)合物是凍干的。
參照以下發(fā)明詳述、本發(fā)明具體實(shí)施方式
的非限制性實(shí)施例以及附圖和序列表可以更全面地理解本發(fā)明。
附圖簡要說明

圖1是人源化1F6VH人源化變體hVHE和hVHJ與1F6mVH和人種系VH外顯子VH1-2和JH外顯子JH6的比對。在比對中，<·>表示該氨基酸與鼠殘基相同。hVHJ的H46上突出顯示的賴氨酸殘基(K)表示突變回鼠殘基。下劃線的氨基酸殘基表示根據(jù)Kabat定義在CDR1和CDR2中的位置，而框內(nèi)殘基表示用Chothia定義鑒定的相應(yīng)CDR中的位置。位置37、39、45、47、95和97上的<^>表示參與VH/VL接界面的殘基。
圖2是人源化1F6VH人源化變體hVHH和hVHM與1F6mVH和人種系VH外顯子VH1-18和JH外顯子JH6的比對。在比對中，<·>表示該氨基酸與鼠殘基相同。hVHM的H46、H67、H68、H69、H70和H71上突出顯示的殘基表示突變回鼠殘基。相似地，hVHH的H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82和H82A上突出顯示的殘基表示突變回鼠殘基。下劃線的氨基酸殘基表示根據(jù)Kabat定義在CDR1、CDR2和CDR3中的位置，而框內(nèi)殘基表示用Chothia定義鑒定的相應(yīng)CDR中的位置。位置37、39、45、47、98和100上的<^>表示參與VH/VL接界面的殘基。
圖3是人源化1F6VL變體hVLA與1F6mVL和人種系Vκ外顯子B3和Jκ外顯子Jκ-1的比對。在比對中，<·>表示該氨基酸與鼠殘基相同。下劃線的氨基酸殘基表示根據(jù)Kabat定義在CDR1、CDR2和CDR3中的位置，而框內(nèi)殘基表示用Chothia定義鑒定的相應(yīng)CDR中的位置。位置42、44、50、52和93上的<^>表示參與VH/VL接界面的殘基。
圖4A和4B顯示人源化1F6抗-CD70抗體介導(dǎo)抗體-依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。用抗體包被Na251CrO4-標(biāo)記的靶細(xì)胞(WIL2-S B淋巴樣干細(xì)胞、786-O腎細(xì)胞癌細(xì)胞和769-P腎細(xì)胞癌細(xì)胞)，并以10個CD16+(FcγIII受體)細(xì)胞比1個靶細(xì)胞的效應(yīng)物靶點(diǎn)比與外周血單核細(xì)胞(PBMC)一起孵育。4小時后，在閃爍計(jì)數(shù)器上測定裂解細(xì)胞的上清液。用下式計(jì)算特異性裂解百分?jǐn)?shù){(受試樣品cpm-自發(fā)性cpm)÷(總cpm-自發(fā)性cpm)}×100。點(diǎn)代表一式三份樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖4A顯示了與非結(jié)合抗體對照hIgG1和鼠1F6抗體相比，人源化1F6變體HHLA、HJLA和HELA介導(dǎo)的ADCC活性。圖4B顯示了嵌合1F6和人源化1F6變體HJLA和hIgG1介導(dǎo)的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的抗體導(dǎo)向的裂解。
圖5顯示了人源化1F6抗-CD70變體HJLA介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)。在人血清作為補(bǔ)體來源的情況下將LP-1、MHH PreB-1和WIL-S靶細(xì)胞與嵌合1F6、人源化1F6(HJLA)或非結(jié)合性人Ig混合。37℃孵育2小時后，加入碘化丙錠，通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞活力，計(jì)算裂解活性的量。柱代表一式三份樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖6顯示了人源化1F6抗-CD70抗體介導(dǎo)抗體-依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP)。用紅色熒光細(xì)胞膜染料(PKH26，Sigma-Aldrich，Inc.，密蘇里州圣路易斯)標(biāo)記786-OCD70+腎細(xì)胞癌靶細(xì)胞，然后用嵌合1F6、人源化1F6(HJLA)或非結(jié)合性人Ig在冰上包被30分鐘。標(biāo)記的經(jīng)抗體處理的靶細(xì)胞與單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞混合，37℃處理1小時，混合比為1個巨噬細(xì)胞比4個靶細(xì)胞。巨噬細(xì)胞用Alexa

488(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)抗-CD11b抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)分析時，通過發(fā)雙熒光的巨噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)確定細(xì)胞吞噬活性百分?jǐn)?shù)。
圖7顯示了人源化1F6抗-CD70抗體能延長彌散性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤異種移植瘤模型小鼠的存活期。(A)注射Raji細(xì)胞并用人源化1F6抗體或?qū)φ辗墙Y(jié)合性抗體治療的小鼠的存活期。在注射腫瘤細(xì)胞1天后開始治療，通過腹膜內(nèi)注射給藥，每四天給藥一次，共給藥6次(n＝10只/組)。(B、C，左側(cè))注射L363-或MM.1S-細(xì)胞和植入細(xì)胞1天后開始用人源化1F6治療的小鼠的存活期。通過靜脈內(nèi)注射每周給予一次抗體，共給予5次。每周監(jiān)測小鼠兩次，表現(xiàn)出疾病后處死動物(n＝7只/組)。(B、C，右側(cè))分析由注射L363-或MM.1S-細(xì)胞的小鼠收集的血清中λ輕鏈濃度。分別在注射腫瘤后第35天和第42天收集樣品。在所有研究中，給出的p值在人源化1F6-治療組和未治療組之間。
圖8顯示了人源化1F6介導(dǎo)消耗抗原-特異性CD8+/Vβ17+細(xì)胞。用M1肽刺激來自正常HLA-A0201供體的PBMC。(A)肽-刺激的培養(yǎng)物不處理或通過同時加入梯度劑量的人源化1F6抗體處理，如圖所示。9天后用流式細(xì)胞術(shù)測定CD8+/Vβ17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。(B)第0天，在不存在(實(shí)心柱)或存在(陰影柱)10μg/ml FcγRIII(CD16)特異性抗體的情況下不處理或用1μg/ml人源化1F6處理肽-刺激的培養(yǎng)物。9天后用流式細(xì)胞術(shù)測定CD8+/Vβ17+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖9顯示了抗-CD701F6抗體對旁觀(bystander)靜息T細(xì)胞的影響極小。在存在或不存在1μg/mL c1F6的情況下不處理(無刺激)或用M1肽刺激(肽刺激)來自正常HLA-A0201供體的PBMC。培養(yǎng)9天后，用

B Mark TCR VβRepertoire試劑盒以流式細(xì)胞術(shù)分析各組中CD4和CD8細(xì)胞中VβTCR的代表數(shù)量(representation)。
圖10顯示了腎細(xì)胞癌的小鼠異種移植瘤模型。(A)通過植入約30mm3的腫瘤片段在裸小鼠中產(chǎn)生皮下786-O腫瘤(N＝5或6只/組)。建立腫瘤生長，當(dāng)各組中平均腫瘤大小約為100mm3時開始治療。從植入腫瘤后第17天開始以q4dx4方案給予所示劑量的h1F6-mcMMAF4或h1F6-vcMMAF4，如箭頭所示。交叉斜杠表示腫瘤＞1000mm3的動物被處死的時間。(B)植入786-O腫瘤和開始治療的詳情與(A)相同。植入腫瘤后第13天開始以q4dx4或q4dx10方案給予小鼠組(N＝5-7只)0.17mg/kg的h1F6-mcMMAF4或h1F6-vcMMAF4。Kaplan-Meier曲線代表腫瘤生長。與第13天治療開始時相比小鼠腫瘤大小達(dá)到4倍時記錄一個事件。檢查第43天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時腫瘤大小仍未達(dá)到4倍的小鼠。用對數(shù)秩檢驗(yàn)產(chǎn)生治療組和未治療組的p值。
圖11顯示了多發(fā)性骨髓瘤的小鼠異種移植瘤模型。(A)將一千萬個MM-1S細(xì)胞靜脈內(nèi)注射給各SCID小鼠。小鼠組(N＝8-10只)不接受治療，或以q7dx5方案接受特定劑量的IgG-vcMMAF4、IgG-mcMMAF4、h1F6-vcMMAF4或h1F6-mcMMAF4，如箭頭所示。處死出現(xiàn)后肢癱瘓、弓狀體態(tài)、顱腫脹和/或皮毛不整潔癥狀的小鼠，對各組的存活百分?jǐn)?shù)作圖。用對數(shù)秩檢驗(yàn)產(chǎn)生治療組和未治療組的p值。(B)從由于上述疾病癥狀或在植入腫瘤細(xì)胞后第122天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死的小鼠的股骨回收骨髓細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)測定各小鼠股骨中表達(dá)CD138的MM-1S細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。用Mann-Whitney檢驗(yàn)獲得所示組之間的p值。
圖12顯示了多發(fā)性骨髓瘤的小鼠異種移植瘤模型。(A)將一千萬個L363細(xì)胞靜脈內(nèi)注射給各SCID小鼠。小鼠組(N＝7只)不接受治療，或以q7dx5方案接受特定劑量的IgG-vcMMAF4或h1F6-vcMMAF4，如箭頭所示。處死可觸知腫瘤的小鼠，對各組的存活百分?jǐn)?shù)作圖。用對數(shù)秩檢驗(yàn)產(chǎn)生治療組與未治療組的p值。(B)在腫瘤植入后40天獲得小鼠的血清樣品。用ELISA測定各小鼠的血清中人λ輕鏈的濃度。用Mann-Whitney檢驗(yàn)獲得所示組之間的p值。
發(fā)明詳述 本發(fā)明提供了CD70結(jié)合物和將這種結(jié)合物用于預(yù)防或治療表達(dá)CD70的癌癥和免疫病的方法。所述CD70結(jié)合物特異性結(jié)合于CD70(如胞外結(jié)構(gòu)域)。該結(jié)合物可包括介導(dǎo)ADCC、ADCP和/或CDC應(yīng)答的至少一種效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。該結(jié)合物可以在沒有偶聯(lián)于治療劑的情況下行使細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)作用。所述結(jié)合物可偶聯(lián)于具有細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的治療劑。
一方面，所述組合物和方法涉及CD70結(jié)合物，如抗體和抗體衍生物?？?CD70抗體可以是單克隆、嵌合或人源化抗體，或其片段或衍生物。在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體包括抗體恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域。所述抗體恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域可以是(例如)IgG亞型的抗體恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域。在示范性實(shí)施方式中，抗-CD70抗體、其片段或衍生物與鼠單克隆抗體(mAb)1F6或2F2競爭結(jié)合CD70，并含有人抗體恒定區(qū)序列。在另一示范性實(shí)施方式中，抗-CD70抗體、其片段或衍生物具有效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域(如Fc部分)，該效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域可與效應(yīng)物細(xì)胞或補(bǔ)體相互作用以介導(dǎo)細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制和/或免疫調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致消耗表達(dá)CD70的細(xì)胞或抑制其增殖。在另一示范性實(shí)施方式中，抗-CD70抗體缺少效應(yīng)物功能。在另一示范性實(shí)施方式中，抗-CD70抗體偶聯(lián)于治療劑。
本發(fā)明也包括包含CD70結(jié)合物(如人源化抗-CD70抗體)的藥盒和制品。
為了不以限制方式闡明本發(fā)明，將發(fā)明詳述分成以下小部分。
I.定義和縮寫 除非另有定義，本文所用的所有科技術(shù)語的含義與所述方法和組合物所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文使用商品名時，申請人想要獨(dú)立地包括該商品名的產(chǎn)品配方、該商品名產(chǎn)品的非專利藥和活性藥物成分。本文所用的以下術(shù)語和短語具有屬于它們的含義，除非另有說明。
本文所用術(shù)語“CD70結(jié)合物”和“抗-CD70結(jié)合物”指抗-CD70抗體、抗-CD70抗體的衍生物或片段，或者結(jié)合于CD70并含有至少一個CD70結(jié)合抗體的CDR或可變區(qū)的其它物質(zhì)或其衍生物。
術(shù)語“特異性結(jié)合”指該結(jié)合物以高度選擇性方式與其相應(yīng)抗原相互作用，而不與多種其它抗原(如非-CD70分子)相互作用。
在CD70結(jié)合物的內(nèi)容中，本文所用術(shù)語“功能性”指該結(jié)合物能夠結(jié)合于CD70。
本文所用術(shù)語“抑制”指降低可檢測的量，或完全阻止。
提到CD70結(jié)合物對表達(dá)CD70的細(xì)胞的影響時，術(shù)語“消耗”指表達(dá)CD70的細(xì)胞數(shù)量減少或消失。
本文將“完整抗體”和“完整免疫球蛋白”定義為異源四聚體糖蛋白，一般約為150,000道爾頓，由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。各輕鏈通過二硫鍵共價連接于重鏈，從而形成異源二聚體。通過此異源二聚體的兩條相同重鏈之間的共價二硫鍵連接形成異源四聚體。雖然輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起，但兩條重鏈之間的二硫鍵數(shù)量隨不同免疫球蛋白(Ig)同種型而變化。各條重鏈和輕鏈也含有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫橋鍵。各條重鏈的氨基端含有可變區(qū)(VH)，后接三個或四個恒定區(qū)(CH1、CH2、CH3和/或CH4)，以及CH1和CH2之間的鉸鏈(J)區(qū)。各輕鏈含有兩個結(jié)構(gòu)域，即氨基端可變區(qū)(VL)和羧基端恒定區(qū)(CL)。VL結(jié)構(gòu)域與VH結(jié)構(gòu)域非共價連接，而CL結(jié)構(gòu)域通常通過二硫鍵共價連接于CH1結(jié)構(gòu)域。相信特定氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面(Chothia等，1985，J.Mol.Biol.186651-663)。
術(shù)語“高變”指在抗體之間序列廣泛不同的可變區(qū)內(nèi)的某些序列，它含有直接參與各具體抗體與其特異性抗原決定簇的結(jié)合和特異性的殘基。輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)的高變性集中在稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變環(huán)(HVL)的三個部分。Kabat等，1991，《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，馬里蘭州貝塞斯達(dá)，其中通過序列比較確定了CDR，而如Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196901-917所述按照可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)從結(jié)構(gòu)上確定了HVL。這兩種方法鑒定的CDR略有不同時，優(yōu)選結(jié)構(gòu)定義。如Kabat所述(參見Kabat等，“免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列”(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，出版號91-3242，美國健康和人類服務(wù)部，馬里蘭州貝塞斯達(dá)，1991)，在輕鏈可變區(qū)中，CDR-L1大概位于殘基24-34處，CDR-L2大概位于殘基50-56處，CDR-L3大概位于殘基89-97處；在重鏈可變區(qū)中，CDR-H1大概位于31-35處，CDR-H2大概位于50-65處，CDR-H3大概位于95-102處。
各條重鏈和輕鏈中的三個CDR由構(gòu)架區(qū)(FR)隔開，構(gòu)架區(qū)含有不大容易變化的序列。從重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基端至羧基端以下述順序分布著FR和CDRFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。FR的大β-折疊構(gòu)型使各鏈的CDR互相接近，并且接近其它鏈的CDR。得到的構(gòu)象有助于產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat等，1991，NIH出版號91-3242，第I卷，第647-669頁)，但不是所有CDR殘基一定會直接參與抗原結(jié)合。
FR殘基和Ig恒定區(qū)一般不直接參與抗原結(jié)合，但可能有助于抗原結(jié)合或介導(dǎo)抗體效應(yīng)物功能。一些FR殘基可能通過至少以下三種方式對抗原結(jié)合施加顯著影響直接非共價結(jié)合于表位、與一個或多個CDR殘基相互作用、影響輕鏈和重鏈之間的接界面。恒定區(qū)介導(dǎo)各種Ig效應(yīng)物功能，如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)和/或抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP)。
根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列，將脊椎動物免疫球蛋白的輕鏈分為兩種明顯不同的類型κ和λ。與其相比，按照恒定區(qū)的序列將哺乳動物免疫球蛋白的重鏈分為五種主要類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA進(jìn)一步分為亞型(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。天然免疫球蛋白類型的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
術(shù)語“抗體”、“抗-CD70抗體”、“人源化抗-CD70抗體”和“變體人源化抗-CD70抗體”在本文中以最廣泛的含義使用，具體包括全長和天然抗體、單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體或其抗原結(jié)合片段，如具有所需生物學(xué)活性如CD70結(jié)合性的抗體的可變區(qū)和其它部分。
術(shù)語“單克隆抗體”(mAb)指獲自基本均一抗體群體的抗體；即，群體中所含的單個抗體相同，但可能存在少量天然產(chǎn)生的突變。單克隆抗體的特異性高，對抗一種抗原決定簇，也稱為表位。修飾詞“單克隆”表明是對抗相同表位的基本均一的抗體群體，并且不應(yīng)理解為要求用任何具體方法來產(chǎn)生該抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)或方法制備單克隆抗體；例如，本領(lǐng)域已知首先由

等，1975，Nature 256495描述的雜交瘤方法，或者重組DNA法(參見例如，美國專利號4,816,567)。在另一個實(shí)施例中，也可采用Clackson等，1991，Nature 352624-628和Marks等，1991，J.Mol.Biol.222581-597所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離單克隆抗體。
相反，多克隆抗體制劑中的抗體一般是異源免疫球蛋白同種型和/或類型的群體，并具有各種表位特異性。
本文所用術(shù)語“嵌合”抗體是一種單克隆抗體類型，其中重鏈和/或輕鏈的一個或多個區(qū)域或結(jié)構(gòu)域中部分或全部氨基酸序列與來自另一物種或?qū)儆诹硪环N免疫球蛋白類型或同種型的單克隆抗體的相應(yīng)序列相同、同源或是其變體，或來自共有序列。嵌合抗體包括這種抗體的片段，條件是該抗體片段具有其母體抗體的所需生物學(xué)活性，如結(jié)合于同一表位(參見例如美國專利號4,816,567；和Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855)。本領(lǐng)域已知生產(chǎn)嵌合抗體的方法。(參見例如Morrison，1985，Science 2291202；Oi等，1986，BioTechniques 4214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125191-202；美國專利5,807,715；4,816,567；和4,816,397.) 術(shù)語“抗體片段”、“抗-CD70抗體片段”、“人源化抗-CD70抗體片段”和“變體人源化抗-CD70抗體片段”指保留了可變區(qū)或功能能力如特異性CD70表位結(jié)合的全長抗-CD70抗體的一部分?？贵w片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv和scFv-Fc片段、雙抗體、三抗體、四抗體、線性抗體、單鏈抗體和由抗體片段形成的其它多特異性抗體。(參見Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.231126-1136.) “單鏈Fv”或“scFv”抗體片段是含有抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的單鏈Fv變體，其中該結(jié)構(gòu)域以單鏈多肽的形式存在，能夠識別和結(jié)合抗原。scFv多肽任選地含有位于VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，此接頭使scFv能夠形成用于結(jié)合抗原的三維結(jié)構(gòu)(參見例如，Pluckthun，1994，《單克隆抗體的藥理學(xué)》(The Pharmacology of MonoclonalAntibody)，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁)。
術(shù)語“雙抗體”指含有兩個抗原-結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段。各片段含有重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，VH和VL連接形成VH-VL或VL-VH多肽。采用對于同一條鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間配對來說太短的接頭，強(qiáng)迫連接的VH-VL結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，產(chǎn)生兩個抗原-結(jié)合位點(diǎn)。例如，EP 404097；WO 93/11161；和Hollinger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448中更詳細(xì)地描述了雙抗體。
術(shù)語“線性抗體”指含有能形成一對抗原結(jié)合區(qū)的一對串聯(lián)Fd節(jié)段(VH-CH1-VH-CH1)的抗體。線性抗體可以是雙特異性或單特異性，如Zapata等，1995，Protein Eng.8(10)1057-1062所述。
“人源化抗體”指能夠結(jié)合預(yù)定抗原并包含一可變區(qū)多肽鏈的免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段，該可變區(qū)多肽鏈包含主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的構(gòu)架區(qū)和主要具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。
通常，人源化抗體含有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基在本文中稱為″輸入″殘基，它們一般取自″輸入″抗體結(jié)構(gòu)域，具體是可變區(qū)。輸入的殘基、序列或抗體具有所需的親和力和/或特異性，或其它所需抗體生物學(xué)活性，如本文所述。
通常，人源化抗體包含基本上所有的至少一個、一般是兩個可變區(qū)，其中所有或基本上全部CDR區(qū)均對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且所有或基本上全部構(gòu)架區(qū)都是人免疫球蛋白序列的構(gòu)架區(qū)，如來自共有或種系序列。人源化抗體也任選地含有免疫球蛋白，一般是人免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域的至少一部分。例如，抗體可含有輕鏈，并且至少含有重鏈的可變區(qū)。抗體也可適當(dāng)?shù)匕ㄖ劓湹腃H1、鉸鏈(J)、CH2、CH3和/或CH4區(qū)域。
人源化抗體可選自任何類型的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)或者任何同種型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。當(dāng)需要人源化抗體具有細(xì)胞毒活性時，恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域可包括(例如)補(bǔ)體結(jié)合性恒定區(qū)(如IgG1)。不需要這種細(xì)胞毒活性時，恒定區(qū)可以來自另一類型(如IgG2)。人源化抗體可包含來自一種以上類型或同種型的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能通過選擇具體的恒定區(qū)來優(yōu)化所需的效應(yīng)物功能。
人源化抗體的FR和CDR區(qū)不需要準(zhǔn)確對應(yīng)于母體序列，例如可通過取代、插入或缺失至少一個殘基改變輸入CDR或共有FR，以使該位點(diǎn)的CDR或FR殘基不對應(yīng)于共有或輸入抗體。一般不會廣泛發(fā)生這種突變。通常，至少75％、更常見至少90％、最常見大于95％的人源化抗體殘基對應(yīng)于母體FR和CDR序列的殘基。
本文所用術(shù)語“抗體效應(yīng)物功能”指Ig的Fc結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的功能。這種功能可以是(例如)抗體-依賴性細(xì)胞毒作用、抗體-依賴性細(xì)胞吞噬作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用?？赏ㄟ^(例如)Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域結(jié)合于具有細(xì)胞吞噬或裂解活性的免疫細(xì)胞上的Fc受體或者Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域結(jié)合于補(bǔ)體系統(tǒng)的成分來實(shí)現(xiàn)這種功能。一般地，F(xiàn)c-結(jié)合細(xì)胞或補(bǔ)體成分介導(dǎo)的作用導(dǎo)致抑制和/或消耗CD70靶向細(xì)胞。不想受限于任何具體理論，抗體的Fc區(qū)可征集表達(dá)Fc受體(FcR)的細(xì)胞，并使它們與抗體-包被的靶細(xì)胞并列(juxtapose)。表達(dá)IgG的表面FcR(包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD64))的細(xì)胞可用作破壞IgG-包被細(xì)胞的效應(yīng)物細(xì)胞。這種效應(yīng)物細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞。IgG結(jié)合FcγR能激活抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP)。由CD16+效應(yīng)物細(xì)胞通過分泌膜孔道形成蛋白和蛋白酶而介導(dǎo)ADCC，由CD32+和CD64+效應(yīng)物細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞吞噬作用(參見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)，第4版，Paul編，Lippincott-Raven，紐約，1997，第3、17和30章；Uchida等，2004，J.Exp.Med.1991659-69；Akewanlop等，2001，Cancer Res.614061-65；Watanabe等，1999，Breast Cancer Res.Treat.53199-207)。除ADCC和ADCP外，細(xì)胞結(jié)合抗體的Fc區(qū)也可激活補(bǔ)體經(jīng)典通路，以引發(fā)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)。與抗體與抗原結(jié)合時，補(bǔ)體系統(tǒng)的Clq結(jié)合于抗體的Fc區(qū)。Clq結(jié)合于細(xì)胞-結(jié)合抗體可啟動級聯(lián)反應(yīng)，包括C4和C2的蛋白水解激活從而產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶。由C3轉(zhuǎn)化酶將C3切割成C3b能夠激活最終的補(bǔ)體成分，包括C5b、C6、C7、C8和C9。總之，這些蛋白在抗體包被的細(xì)胞上形成膜-攻擊復(fù)合物孔。這些孔破壞了細(xì)胞膜的完整性，從而殺死靶細(xì)胞(參見《免疫生物學(xué)》(Immunobiology)，第6版，Janeway等，Garland Science，紐約，2005，第2章)。
術(shù)語“抗體依賴性細(xì)胞毒作用”或ADCC是根據(jù)抗體-包被的靶細(xì)胞與具有裂解活性的免疫細(xì)胞(也稱為效應(yīng)物細(xì)胞)相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制。這種效應(yīng)物細(xì)胞包括天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。效應(yīng)物細(xì)胞連接于Ig的Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，Ig通過其抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合于靶細(xì)胞。效應(yīng)物細(xì)胞活性引起抗體-包被的靶細(xì)胞的死亡。
術(shù)語“抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用”或ADCP指通過結(jié)合于Ig的Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞吞噬性免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞)使抗體-包被的細(xì)胞被內(nèi)化(完全或部分)的過程。
術(shù)語“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用”或CDC指靶點(diǎn)結(jié)合抗體的Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域激活一系列酶反應(yīng)，導(dǎo)致在靶細(xì)胞膜中形成孔洞的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)機(jī)制。一般地，抗原-抗體復(fù)合物如抗體-包被的靶細(xì)胞上的復(fù)合物結(jié)合并激活補(bǔ)體成分Clq，進(jìn)而激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。補(bǔ)體的激活也可導(dǎo)致補(bǔ)體成分沉積在靶細(xì)胞表面上，通過結(jié)合白細(xì)胞上的補(bǔ)體受體(如CR3)而有助于ADCC。
本文所用術(shù)語“免疫細(xì)胞”指參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的造血譜系細(xì)胞。在典型的實(shí)施方式中，免疫細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞。
本文所用術(shù)語“效應(yīng)物細(xì)胞”指表達(dá)免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的表面受體(FcR)的細(xì)胞。例如，表達(dá)IgG的表面FcR包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD64)的細(xì)胞可用作效應(yīng)物細(xì)胞。這種效應(yīng)物細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。
“治療劑”是對癌細(xì)胞、活化免疫細(xì)胞或其它靶細(xì)胞群體產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制和/或免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)。治療劑的例子包括細(xì)胞毒劑、化療藥、細(xì)胞抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
“細(xì)胞毒作用”指消耗、消除和/或殺傷靶細(xì)胞。“細(xì)胞毒劑”指對細(xì)胞有細(xì)胞毒作用的物質(zhì)。該術(shù)語應(yīng)包括放射性同位素(如I131、I125、Y90和Re186)、化療藥和毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，以及它們的片段。這種細(xì)胞毒劑可偶聯(lián)于抗體，如人源化抗-CD70抗體，并用于(例如)治療需要用該抗體治療的患者。在一個實(shí)施方式中，“細(xì)胞毒劑”包括單克隆抗體，例如與本文所述人源化抗體聯(lián)用的抗體。
“化療藥”是用于治療癌癥的化合物?；熕幍睦影ㄍ榛瘎缌蛱媾珊铜h(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替派；氮丙啶和甲蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(特別是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(包括合成類似物拓?fù)涮婵?；苔蘚抑素；海綿他汀(callystatin)；CC-1065(包括其合成類似物阿多來新、卡折來新和比折來新)和其衍生物；自念珠藻環(huán)肽類(cryptophycine)(具體是自念珠藻環(huán)肽1和自念珠藻環(huán)肽8)；多拉司他汀，耳他汀類(auristatin)(包括類似物單甲基-耳他汀E和單甲基-耳他汀F(參見例如2005年10月27日公開的美國公開申請?zhí)?005-0238649，全文納入本文作參考)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；sarcodictyin；軟海綿素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、雙氯乙基甲胺、鹽酸氧氮芥、美法侖、新恩比興、苯乙酰膽固醇氮芥、潑尼莫司??；曲磷胺、烏拉莫司??；亞硝基脲如卡莫司汀、吡葡亞硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司?。豢股厝缦┒?enediyne)抗生素(如卡奇霉素，具體是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素phiI1，參見例如，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33183-186；達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達(dá)內(nèi)霉素A；二膦酸鹽，如氯屈膦酸鹽；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白生色團(tuán)和相關(guān)的色蛋白烯二炔抗生素生色團(tuán))、阿柔比星、放線菌素、安曲霉素、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c、卡拉比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素d、道諾霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(阿霉素TM)(包括嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、黃膽素、馬賽羅霉素、絲裂霉素如絲裂霉素C、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、波非羅霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、塊菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝劑如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酪；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑如葉烷酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；伊達(dá)曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地莫考辛(democolcine)；地吖醌；艾夫尼辛(elfornithine)；依利醋胺；大環(huán)內(nèi)酯；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達(dá)明；類美坦西醇如美登素和安絲菌素；米托胍腙、米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；二胺硝吖啶；噴司他?。坏鞍钡?；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；

雷佐生；根霉素；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯族毒素類(具體是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司汀；mitabronitol；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(″Ara-C″)；環(huán)磷酰胺；硫替派；紫杉烷類，如紫杉醇(

Bristol-Myers Squibb Oncology，新澤西州普林斯頓)和多西他賽(


-Poulenc Rorer，法國安東尼市)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(GemzarTM)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊甙(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱(諾維本TM)；二羥基蒽醌；替尼泊苷；依達(dá)曲沙；道諾霉素；氨蝶呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃醇如視黃酸；卡培他濱；以及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。此定義也包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥，如抗雌激素藥和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(FarestonTM)；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，它能調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素生產(chǎn)，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、乙酸甲地孕酮(MegaceTM)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(RivisorTM)、來曲唑(FemaraTM)和阿那曲唑(ArimidexTM)；和抗雄激素藥如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
本文所用術(shù)語“前藥”指與母體藥物相比對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低并能夠被酶激活或轉(zhuǎn)變成活性更高的母體形式的藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式。參見例如Wilman，1986，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌癥化療中的前藥)”，BiochemicalSociety Transactions(生物化學(xué)界交易)，14，第375-382頁，第615屆貝爾法斯特會議；和Stella等，1985，“ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前藥靶向藥物遞送的化學(xué)方法)”，Directed Drug Delivery(定向藥物遞送)，Borchardt等，(編)，第247-267頁，Humana Press。有用的前藥包括但不限于可轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩募?xì)胞毒性游離藥物的含磷酸的前藥、含硫代磷酸的前藥、含硫酸的前藥、含肽的前藥、D-氨基酸-修飾的前藥、糖基化的前藥、含β-內(nèi)酰胺的前藥、含任選取代的苯氧基乙酰胺的前藥和含任選取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前藥?？裳苌汕八幮问降募?xì)胞毒藥物的例子包括但不限于上述化療藥。
“細(xì)胞抑制作用”指抑制細(xì)胞增殖。“細(xì)胞抑制劑”指對細(xì)胞有細(xì)胞抑制作用，從而抑制特定的細(xì)胞亞組生長和/或擴(kuò)增的物質(zhì)。
本文所用術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)作用”指刺激(免疫刺激)或抑制(免疫抑制)免疫應(yīng)答的發(fā)生或維持?？赏ㄟ^(例如)清除免疫細(xì)胞(如T或B淋巴細(xì)胞)；誘導(dǎo)或產(chǎn)生可調(diào)節(jié)(如下調(diào))其它細(xì)胞的功能能力的免疫細(xì)胞；誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的不應(yīng)答狀態(tài)(如不應(yīng)性)；或提高、降低或改變免疫細(xì)胞的活性或功能，包括例如，改變這些細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的模式(如改變某些類型的分子如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、共刺激分子或其它細(xì)胞表面受體等的產(chǎn)生和/或分泌)實(shí)現(xiàn)抑制?！懊庖哒{(diào)節(jié)劑”指對細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)劑對促進(jìn)免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞有細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制作用。
術(shù)語“標(biāo)記”指直接或間接偶聯(lián)于抗體的可檢測的化合物或組合物。該標(biāo)記本身可以被檢測到(如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者，在酶標(biāo)記的情況下，該標(biāo)記可催化底物化合物或組合物發(fā)生可檢測的化學(xué)改變?？芍苽錁?biāo)記的抗-CD70抗體并用于各種應(yīng)用，包括體外和體內(nèi)診斷。
“分離的”核酸分子是從通常在天然來源的核酸中與其結(jié)合的至少一種污染性核酸分子中分離鑒定到的核酸分子。分離的核酸分子并非其天然發(fā)現(xiàn)的形式或情形。因此，分離的核酸分子不同于天然細(xì)胞中存在的核酸分子。然而，當(dāng)(例如)核酸分子在染色體上的位置不同于天然細(xì)胞時，分離的核酸分子包括通常表達(dá)抗體的細(xì)胞中所含的核酸分子。
術(shù)語“控制序列”指在具體的宿主生物體中表達(dá)操作性連接的編碼序列所必需的多核苷酸序列。適用于原核細(xì)胞的控制序列包括例如啟動子、操縱子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。真核控制序列包括但不限于啟動子、聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。這些控制序列可用于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)抗-CD70結(jié)合物。
一核酸序列與另一核酸序列形成功能性關(guān)聯(lián)時，它們“操作性連接”。例如，如果表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則核酸前序列或分泌前導(dǎo)物操作性連接于編碼多肽的核酸；如果影響了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子或增強(qiáng)子操作性連接于編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位有利于翻譯，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)操作性連接于編碼序列。通常，“操作性連接”指連接的DNA序列毗連，在分泌性前導(dǎo)物的情況下，毗連并且在閱讀框中。然而，增強(qiáng)子任選為毗連的?？赏ㄟ^在方便的限制性位點(diǎn)連接來實(shí)現(xiàn)連接。如果不存在這種位點(diǎn)，可采用合成寡核苷酸銜接子或接頭來連接DNA序列。
術(shù)語“多肽”指氨基酸聚合物和其等同物，不指特定長度的產(chǎn)物；因此，多肽的定義包括“肽”和“蛋白質(zhì)”。多肽的定義也包括本文所述的“抗體”?！岸嚯膮^(qū)”指多肽節(jié)段，該節(jié)段可含有(例如)一個或多個結(jié)構(gòu)域或基序(如抗體的多肽區(qū)可含有(例如)一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))。術(shù)語“片段”指一般含有該多肽的至少20個毗連或至少50個毗連氨基酸的多肽部分?！把苌铩笔窍鄬τ诘诙N多肽，含有一個或多個非保守性或保守性氨基酸取代的多肽或其片段；或者通過共價連接第二種分子，例如連接異源性多肽，或通過糖基化、乙?；⒘姿峄刃揎椀亩嚯幕蚱淦??！把苌铩钡亩x還包括例如，含有一種或多種氨基酸類似物(如非天然氨基酸等)的多肽、含有未取代連接以及本領(lǐng)域已知的其它(天然或非天然)修飾的多肽。
″分離的″多肽是從天然環(huán)境的組分中分離鑒定到和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染組分是會干擾該多肽的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。分離的多肽包括分離的抗體，或其片段或衍生物?！翱贵w”包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w天然環(huán)境的至少一種組分不存在。
在某些實(shí)施方式中，將抗體純化至(1)按照Lowry法測定，純化至95重量％以上，在其它方面純化至99重量％以上，(2)足以用轉(zhuǎn)杯順序分析儀獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或者(3)在還原或非還原條件下用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染料對SDS-PAGE染色時呈現(xiàn)均一性。
提到多肽時，術(shù)語“異源”指與另一多肽相比來自不同來源(如細(xì)胞、組織、生物體或物種)，因此兩種多肽不同。一般地，異源多肽來自不同物種。
提到免疫球蛋白多肽或其片段時，“保守取代”指基本不降低免疫球蛋白多肽或其片段與抗原的特異性結(jié)合(例如用KD測定)的一個或多個氨基酸取代(即經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)如ELISA測定，能提高結(jié)合親和力、不顯著改變結(jié)合親和力或使結(jié)合親和力降低不超過約40％、一般不超過約30％、更一般不超過約20％、更一般不超過約10％、或者最一般不超過約5％的取代)。
提到兩種或多種核酸或多肽序列時，術(shù)語“相同”或“相同性百分?jǐn)?shù)”指比較和比對最大對應(yīng)性時，兩種或多種序列或子序列相同或其中特定百分?jǐn)?shù)的核苷酸或氨基酸殘基相同。為了測定相同性百分?jǐn)?shù)，出于最優(yōu)比較目的比對序列(如可將缺口引入第一種氨基酸序列或核酸序列中，以與第二種氨基或核酸序列進(jìn)行最優(yōu)比對)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。如果第一種序列中的位置被與第二種序列的相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，那么這兩種分子在該位置上相同。兩種序列的相同性百分?jǐn)?shù)是序列共有的相同位置數(shù)量的函數(shù)(即％相同性＝相同位置的數(shù)量/位置總數(shù)(如重疊位置)×100)。在一些實(shí)施方式中，這兩種序列長度相同。
提到兩種核酸或多肽時，術(shù)語“基本相同”指兩種或多種序列或子序列的相同性為至少50％、至少55％、至少60％或至少65％；一般為至少70％或至少75％；更一般為至少80％或至少85％；更一般為至少90％、至少95％或至少98％(例如用下述方法之一測定)。
提到兩種或多種多肽序列時，術(shù)語“相似”或“相似性百分?jǐn)?shù)”指采用下述方法之一比較和比對最大對應(yīng)性時，兩種或多種序列或子序列中特定百分?jǐn)?shù)的氨基酸殘基相同或被保守取代。例如，與第一種序列所含氨基酸數(shù)量相同的氨基酸比較時，或與通過(例如)下述方法之一進(jìn)行的多肽比對比較時，如果第一種氨基酸序列與第二種氨基酸序列中至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同或被保守取代，則可認(rèn)為第一種氨基酸序列與第二種氨基酸序列相似。
提到多肽序列時，術(shù)語“基本相似”指多肽區(qū)序列與參比序列的序列相似性為至少70％，一般為至少80％，更一般為至少85％，或至少90％或至少95％。例如，當(dāng)兩種肽的差別僅在于一個或多個保守取代時，該多肽與第二種多肽基本相似。
經(jīng)過本領(lǐng)域已知或本文所述的各種標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗(yàn)測定，提到抗-CD70抗體或其衍生物時，含有與抗-CD70抗體的一種或多種抗原結(jié)合區(qū)(如重鏈或輕鏈可變區(qū)，或者重鏈或輕鏈CDR)基本相同或基本相似的一個或多個多肽區(qū)的蛋白質(zhì)能保持與抗-CD70抗體識別的CD70表位的特異性結(jié)合。
可用數(shù)學(xué)算法確定兩種序列之間的相同性百分?jǐn)?shù)或相似性百分?jǐn)?shù)。用于比較兩種序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選非限制性例子是經(jīng)Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877改進(jìn)的Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268所述的算法。將這種算法整合到Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410的NBLAST和XBLAST程序中?？捎肗BLAST程序、評分＝100、字長＝12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與編碼感興趣蛋白的核酸同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序、評分＝50、字長＝3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與感興趣蛋白同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對，可采用缺口BLAST，如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402所述。或者，可采用PSI-Blast進(jìn)行迭代搜索，其檢測分子之間的距離關(guān)系(Id.)。采用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序時，可利用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。用于比較序列的數(shù)學(xué)算法的另一非限制性例子是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。將這種算法整合到作為GCG序列比對軟件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)中。利用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可使用PAM120重量殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。本領(lǐng)域已知用于序列分析的其它算法，包括如Torellis和Robotti，1994，Comput.Appl.Biosci.103-5所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-8所述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定搜索的靈敏度和速度的控制選項(xiàng)。如果ktup＝2，通過觀察比對殘基對發(fā)現(xiàn)所比較兩種序列的相似區(qū)域；如果ktup＝1，則檢查單個比對氨基酸。對于蛋白質(zhì)序列ktup可設(shè)定為2或1，對于DNA序列可設(shè)定為1-6。如果沒有特別設(shè)定，ktup默認(rèn)設(shè)定為2(蛋白質(zhì))和6(DNA)?；蛘?，可用CLUSTAL W算法進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對，如Higgins等，1996，Methods Enzymol.266383-402所述。
本文所用術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，所有這些表述均包括其后代。因此，“轉(zhuǎn)化子”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代對象細(xì)胞和由其產(chǎn)生的培養(yǎng)物，而不管轉(zhuǎn)移次數(shù)。也應(yīng)理解，由于有意或天然產(chǎn)生的突變，所有后代的DNA含量不一定完全相同。包括其功能或生物學(xué)活性與在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的功能或生物學(xué)活性相同的突變后代。使用不同名稱時，應(yīng)能從文中明確理解。
出于治療目的，術(shù)語“對象”指任何動物，具體是分類為哺乳動物的動物，包括人、圈養(yǎng)動物和家畜、動物園動物、運(yùn)動動物或玩賞動物，如犬、馬、貓、牛等。對象優(yōu)選為人。
本文所用術(shù)語“疾病”和“CD70-相關(guān)性失調(diào)”和“CD70-相關(guān)性疾病”指能夠得益于本文所述抗-CD70結(jié)合物治療的任何疾病?！癈D70-相關(guān)性失調(diào)”和“CD70-相關(guān)性疾病”一般在細(xì)胞表面上表達(dá)CD70或其片段。它包括慢性和急性失調(diào)或疾病，包括使哺乳動物易患所研究疾病的病理學(xué)狀態(tài)。按本文治療的疾病的非限制性例子包括癌癥、血液惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、白血病和淋巴惡性腫瘤、癌以及炎性疾病、血管新生性疾病或免疫病。下文中公開了疾病的具體例子。
本文所用術(shù)語“治療”和“療法”等應(yīng)包括引起任何臨床上需要或有益的作用的治療和預(yù)防或抑制疾病或失調(diào)的方法，所述作用包括但不限于改善或緩解一種或多種癥狀、消退、減慢或終止疾病或失調(diào)的進(jìn)展。因此，例如，術(shù)語治療包括在發(fā)生疾病或失調(diào)的癥狀之前或之后給予藥物，從而預(yù)防或消除該疾病或失調(diào)的所有病征。另一個例子是，該術(shù)語包括在該疾病有臨床表現(xiàn)后給予藥物，以抵抗該疾病的癥狀。另外，給藥影響該疾病或失調(diào)的臨床參數(shù)，如組織損傷程度或轉(zhuǎn)移的量或程度、治療是否導(dǎo)致改善疾病時，在發(fā)病后或臨床癥狀后給予藥物是本文所述的“治療”或“療法”。
本文所用術(shù)語“預(yù)防”指在表達(dá)CD70的癌癥或免疫病出現(xiàn)臨床或診斷癥狀前給予對象抗-CD70結(jié)合物(如給予具有患表達(dá)CD70的癌癥或免疫病的傾向或高風(fēng)險的個體)，以(a)阻斷表達(dá)CD70的癌癥或免疫病，或者其臨床或診斷癥狀的出現(xiàn)或發(fā)病，(b)抑制表達(dá)CD70的癌癥或免疫病發(fā)病的嚴(yán)重性，或(c)降低表達(dá)CD70的癌癥或免疫病發(fā)病的可能性。
術(shù)語“靜脈內(nèi)輸注”指在大于約15分鐘，通常約30-90分鐘的時間內(nèi)將藥物如治療劑引入動物或人患者的靜脈內(nèi)。
術(shù)語“靜脈內(nèi)推注”或“靜脈內(nèi)推”指在約15分鐘或更短，通常為5分鐘或更短的時間內(nèi)將藥物給予動物或人的靜脈內(nèi)，以使機(jī)體接受該藥物。
術(shù)語“皮下給藥”指通過從藥物容器相對緩慢、持續(xù)遞送將藥物如治療劑引入動物或人患者皮膚以下，一般引入皮膚和下層組織之間的袋狀空間(pocket)內(nèi)。捏起或拉起皮膚、使其離開下層組織能產(chǎn)生所述袋狀空間。
用術(shù)語“藥品說明書”指通常包含在治療產(chǎn)品的市售包裝中的說明書，它含有關(guān)于使用這種治療產(chǎn)品的適應(yīng)癥、用途、給藥、禁忌征和/或警告的信息。
″脂質(zhì)體″是由各種類型的脂質(zhì)、磷脂或表面活性劑組成的小囊泡，可用于將藥物(如抗體)遞送給哺乳動物。脂質(zhì)體的組分通常排列成雙層構(gòu)象，類似于生物膜的脂質(zhì)排列形式。
術(shù)語“皮下輸注”指采用包括但不限于30分鐘或更短或者90分鐘或更短的時間通過從藥物容器相對緩慢、持續(xù)遞送將藥物引入動物或人患者皮膚以下，優(yōu)選引入皮膚和下層組織之間的袋狀空間內(nèi)。任選地，可通過在動物或人患者的皮膚下皮下植入藥物遞送泵進(jìn)行這種輸注，其中該泵在預(yù)定的時間如30分鐘、90分鐘，或在跨越整個治療方案的時間上遞送預(yù)定量的藥物。
術(shù)語“皮下推注”指向動物或人患者的皮膚下給藥，其中推注藥物遞送短于約15分鐘；在另一方面，短于5分鐘，在另一方面，短于60秒。另一方面，可以給予皮膚和下層組織之間的袋狀空間內(nèi)，所述袋狀空間是通過捏起或拉起皮膚、使其離開下層組織而產(chǎn)生的。
術(shù)語“有效量”指在對象中足以抑制或緩解表達(dá)CD70的癌癥或免疫病的一種或多種臨床或診斷癥狀的抗-CD70結(jié)合物(如抗體或衍生物或其它結(jié)合物)的量。按照本文所述方法以“有效方案”給予有效量的藥物。術(shù)語“有效方案”指足以治療或預(yù)防表達(dá)CD70的癌癥或免疫病的藥物量和給藥頻率的組合。
用術(shù)語“治療有效量”指產(chǎn)生有益患者效果，例如細(xì)胞的生長阻滯作用或消除的治療劑的量。一方面，治療有效量具有凋亡活性，或者能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。另一方面，治療有效量指能有效地(例如)減緩疾病進(jìn)展的目標(biāo)血清濃度。可以用常規(guī)方式測定效能，這取決于治療的疾病。例如，在特征是表達(dá)CD70的細(xì)胞的癌癥疾病或失調(diào)中，可通過評價至疾病進(jìn)展時間(TTP)或測定反應(yīng)速率(RR)來測定效能。
本文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指聯(lián)邦或州證據(jù)的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或美國藥典或其它普遍認(rèn)可的藥典所列的用于動物，更具體是人的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)相容性成分”指與其一起給予抗-CD70結(jié)合物的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。
本文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指藥學(xué)上可接受的抗-CD70結(jié)合物或治療劑的有機(jī)或無機(jī)鹽?？?CD70結(jié)合物或治療劑含有至少一個氨基，因此可用此氨基或其它合適基團(tuán)形成酸加成鹽。示范性鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯鹽、溴鹽、碘鹽、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、唾液酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、蔗糖鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和棕櫚酸鹽撲酸鹽(即1，1’亞甲基雙-(2羥基3萘甲酸鹽))。藥學(xué)上可接受的鹽可包含另一分子如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其它抗衡離子?？购怆x子可以是穩(wěn)定母體化合物上的電荷的任何有機(jī)或無機(jī)部分。而且，藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)中可帶有一個以上的帶電原子。多個帶電原子作為藥學(xué)上可接受的鹽的一部分時，它可含有多個抗衡離子。因此，藥學(xué)上可接受的鹽可包含一個或多個帶電原子和/或一個或多個抗衡離子。
“藥學(xué)上可接受的溶劑合物”或“溶劑合物”指一種或多種溶劑分子和抗-CD70結(jié)合物和/或治療劑的結(jié)合。形成藥學(xué)上可接受的溶劑合物的溶劑的例子包括但不限于水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
縮寫“AFP”指二甲基纈氨酸-纈氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸-對苯二胺。
縮寫“MMAE”指單甲基耳他汀E。
縮寫“AEB”指耳他汀E與對乙?；郊姿岱磻?yīng)產(chǎn)生的酯。
縮寫“AEVB”指耳他汀E與苯甲酰戊酸反應(yīng)產(chǎn)生的酯。
縮寫“MMAF”指dovaline-纈氨酸-dolaisoleunine-dolaproine-苯丙氨酸。
縮寫“fk”和“phe-lys”指接頭苯丙氨酸-賴氨酸。
II.抗-CD70抗體和其衍生物 本文所述的組合物和方法包括采用特異性結(jié)合于CD70的CD70結(jié)合物。CD70結(jié)合物可對表達(dá)CD70的癌細(xì)胞、活化的免疫細(xì)胞或其它靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。CD70結(jié)合物可以是(例如)抗-CD70抗體、抗-CD70抗體的抗原結(jié)合片段、其衍生物、或含有至少一個CD70結(jié)合抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的其它CD70結(jié)合物。
一方面，CD70結(jié)合物的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)與單克隆抗體1F6的一個或多個CDR相同、基本相同或基本相似。(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2以及SEQID NO21和SEQ ID NO22分別列出了1F6的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列，它們公開于國際專利公開號WO 04/073656；將其內(nèi)容納入本文作參考)。例如，該結(jié)合物可包含與mAb 1F6的相應(yīng)重鏈CDR(H1、H2或H3區(qū))或相應(yīng)輕鏈CDR(L1、L2或L3區(qū))相同或基本相同或基本相似的重鏈CDR和/或輕鏈CDR。在典型實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物含有與mAb 1F6的相應(yīng)重鏈和/或輕鏈CDR相同、基本相同或基本相似的兩個或三個重鏈CDR和/或兩個或三個輕鏈CDR。
例如，在一些實(shí)施方式中，當(dāng)抗-CD70結(jié)合物含有至少一個與mAb 1F6的重鏈CDR基本相同或基本相似的重鏈CDR時，該結(jié)合物還可含有至少一個與mAb 1F6的輕鏈CDR基本相同或基本相似的輕鏈CDR。
在一些實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物包含重鏈或輕鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)含有(a)與mAb 1F6的相應(yīng)CDR相同、基本相同或基本相似的一組三個CDR，和(b)一組四個來自人免疫球蛋白的可變區(qū)構(gòu)架區(qū)。例如，抗-CD70抗體可包含重鏈和/或輕鏈可變區(qū)，該可變區(qū)含有一組三個CDR，其中CDR組來自單克隆抗體1F6，和(b)一組四個衍生自人IgG的構(gòu)架區(qū)。該抗體任選含有絞鏈區(qū)。在示范性實(shí)施方式中，所述抗-CD70抗體是完全人源化抗體。
另一方面，該CD70結(jié)合物包含與單克隆抗體2F2的一個或多個CDR基本相同或基本相似的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。(SEQ ID NO27和SEQ ID NO28以及SEQ ID NO29和SEQ ID NO30分別列出了2F2的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列，它們公開于國際專利公開號WO 04/073656；將其內(nèi)容納入本文作參考)。例如，該結(jié)合物可包含與mAb 2F2的相應(yīng)重鏈CDR(H1、H2或H3區(qū))或相應(yīng)輕鏈CDR(L1、L2或L3區(qū))相同或基本相同或基本相似的重鏈CDR和/或輕鏈CDR。在典型實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物含有與mAb 2F2的相應(yīng)重鏈和/或輕鏈CDR相同、基本相同或基本相似的兩個或三個重鏈CDR和/或兩個或三個輕鏈CDR。
例如，在一些實(shí)施方式中，當(dāng)抗-CD70抗體含有至少一個與mAb 2F2的重鏈CDR基本相同或基本相似的重鏈CDR時，該抗體或其衍生物還可含有至少一個與mAb2F2的輕鏈CDR基本相同或基本相似的輕鏈CDR。
在一些實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物包含重鏈或輕鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)含有(a)與mAb 2F2的相應(yīng)CDR相同、基本相同或基本相似的一組三個CDR，和(b)一組四個來自人免疫球蛋白的可變區(qū)構(gòu)架區(qū)。例如，抗-CD70抗體可包含重鏈和/或輕鏈可變區(qū)，該可變區(qū)含有一組三個CDR，其中CDR組來自單克隆抗體2F2，和(b)一組四個衍生自人IgG的構(gòu)架區(qū)。該抗體任選含有絞鏈區(qū)。在示范性實(shí)施方式中，所述抗-CD70抗體是完全人源化抗體。
在一些實(shí)施方式中，構(gòu)架區(qū)選自人種系外顯子VH、JH、Vκ和Jκ序列。例如，用于人源化c1F6VH結(jié)構(gòu)域的FR的接受體(acceptor)序列可選自種系VH外顯子VH1-18(Matsuda等，1993，Nature Genetics 388-94)或VH1-2(Shin等，1991，EMBO J.103641-3645)，就絞鏈區(qū)(JH)而言，是外顯子JH-6(Mattila等，1995，Eur.J.Immunol.252578-2582)。在其它例子中，種系Vκ外顯子B3(Cox等，1994，Eur.J.Immunol.24827-836)和Jκ外顯子Jκ-1(Hieter等，1982，J.Biol.Chem.2571516-1522)可選作用于c1F6VL結(jié)構(gòu)域人源化的接受體序列。
在一些實(shí)施方式中，人源化抗-CD70抗體的構(gòu)架區(qū)序列包含所用的接受體人種系外顯子的衍生物，包括再次引入小鼠供體殘基的衍生物。這些殘基包括在VH的以下一個或多個位置上再次引入小鼠供體殘基H46、H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82、H82A和H91(按照Kabat編號規(guī)則編號)。
下表說明各SEQ ID NO.所對應(yīng)的人源化1F6的區(qū)域。
表1 在一些實(shí)施方式中，CD70結(jié)合物可以是抗體1F6或2F2的人源化抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有以下氨基酸序列的多肽鏈SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQID NO4的氨基酸20-137。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有氨基酸序列SEQ ID NO24的多肽鏈。
在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列至少80％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ IDNO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列至少85％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列至少90％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ IDNO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列至少95％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列至少99％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，該多肽不含抗體1F6或2F2的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO24的氨基酸序列至少80％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ IDNO24的氨基酸序列至少85％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO24的氨基酸序列至少90％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO24的氨基酸序列至少95％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與SEQ ID NO24的氨基酸序列至少99％相同的多肽鏈。在一些實(shí)施方式中，該多肽不含抗體1F6或2F2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物與單克隆抗體1F6或2F2競爭結(jié)合于人CD70。在一些實(shí)施方式中，CD70結(jié)合物結(jié)合于CD70時不誘導(dǎo)激動性或拮抗性信號(如不刺激增殖)。在一些實(shí)施方式中，CD70結(jié)合物將CD27與CD70的結(jié)合阻斷了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60、至少70％、至少80％或至少90％。
CD70結(jié)合物可任選地包含介導(dǎo)或刺激對表達(dá)CD70的靶細(xì)胞的ADCC、ADCP和/或CDC應(yīng)答的抗體效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域可以是(例如)Ig分子的Fc結(jié)構(gòu)域。這種CD70結(jié)合物在(例如)治療表達(dá)CD70的癌癥或免疫病時可分別對表達(dá)CD70的癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制作用，或者對活化的淋巴細(xì)胞或樹突細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。一般地，CD70結(jié)合物征集和/或激活細(xì)胞毒性白細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)和/或血清補(bǔ)體成分)。
抗-CD70抗體可以是人源化抗體、單鏈抗體、scFv、雙抗體、Fab、小抗體、scFv-Fc、Fv等。在一些實(shí)施方式中，CD70抗原結(jié)合區(qū)可連接于效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，例如免疫球蛋白的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域或者具有效應(yīng)物功能的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的一部分或片段?？乖Y(jié)合性抗體片段(包括單鏈抗體)可包含(例如)可變區(qū)以及整個或一部分效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域(如單獨(dú)的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域或與CH1、絞鏈區(qū)和/或CL結(jié)構(gòu)域組合)。另外，抗原結(jié)合片段可包含效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的任何組合。在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體可以是包含連接于鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的CD70-結(jié)合性可變區(qū)的單鏈抗體。
抗-CD70抗體的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域可來自任何合適的人免疫球蛋白同種型。例如，人免疫球蛋白介導(dǎo)CDC和ADCC/ADCP的能力通常分別為以下順序IgM≈IgG1≈IgG3＞IgG2＞IgG4和IgG1≈IgG3＞IgG2/IgM/IgG4。CD70-結(jié)合性多肽可表達(dá)為包含合適恒定區(qū)，以產(chǎn)生所需的效應(yīng)物功能的重組融合蛋白。結(jié)合于靶細(xì)胞后，抗-CD70抗體或衍生物可通過抗體效應(yīng)物功能如ADCC、CDC和ADCP引發(fā)體外和體內(nèi)的靶細(xì)胞破壞。
CD70結(jié)合物可任選地偶聯(lián)于治療劑，如細(xì)胞毒劑、細(xì)胞抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑。本文描述了合適的治療劑。
在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體可以是含有人或非人Fc區(qū)或其一部分的嵌合抗體。例如，該抗體可包含非人來源的Fc結(jié)構(gòu)域或部分，這些來源有(例如)嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、羊駝、馬、雞或猴(如獼猴、恒河猴等)。
抗-CD70結(jié)合物如抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性或更多特異性的。多特異性抗體可以對CD70不同表位特異和/或可以對CD70以及異源蛋白特異。(參見例如PCT公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360和WO 92/05793；Tutt等，1991，J.Immunol.14760-69；美國專利4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；和5,601,819；Kostelny等，1992，J.Immunol.1481547-1553)。用于實(shí)施本文所述方法的多特異性抗體，包括雙特異性和三特異性抗體是免疫特異性結(jié)合于CD70(包括但不限于含有單克隆抗體2F2和1F6的CDR的抗體)和介導(dǎo)ADCC、ADCP和/或CDC的第二種細(xì)胞表面受體或受體復(fù)合物，如CD16/FcγRIII、CD64/FcγRI、殺傷抑制性或激活性受體或補(bǔ)體控制蛋白CD59的抗體。在一些實(shí)施方式中，多特異性抗體的某部分與第二種細(xì)胞表面分子或受體復(fù)合物結(jié)合能提高抗-CD70抗體或其它CD70結(jié)合物的效應(yīng)物功能。
也可根據(jù)其與CD70的結(jié)合親和力描述或說明抗-CD70抗體和其衍生物和其它結(jié)合物。典型的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的親和力。
可用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生抗體。例如，可用各種技術(shù)制備單克隆抗體，例如，采用雜交瘤、重組技術(shù)和噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)，或它們的組合。通常，雜交瘤技術(shù)可參見例如，Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊)(Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版，1988)；和Hammerling等，Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas(單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤)，第563-681頁(Elsevier，紐約，1981)?？捎糜谥苽淇?CD70抗體的噬菌體呈現(xiàn)法的例子包括例如Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.227381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.222581；Quan和Carter，2002，The rise of monoclonal antibodies as therapeutics in Anti-IgE and AllergicDisease(開始將單克隆抗體用作抗-IgE和變應(yīng)性疾病的治療劑)，Jardieu和Fick Jr.編，Marcel Dekker，紐約州紐約市，第20章，第427-469頁；Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 18241-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24952-958；Persic等，1997，Gene1879-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57191-280；PCT申請?zhí)朠CT/GB91/01134；PCT公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和美國專利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108所述的方法(將其內(nèi)容納入本文作參考)。
可用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)的例子包括美國專利4,946,778和5,258,498；Huston等，1991，Methods in Enzymology(酶學(xué)方法)20346-88；Shu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907995-7999；和Skerra等，1988，Science 2401038-1040所述的技術(shù)。
本領(lǐng)域已知制備雙特異性抗體的方法。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法基于共同表達(dá)兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中這兩種鏈特異性不同(參見例如Milstein等，1983，Nature 305537-39)。由于隨機(jī)分配免疫球蛋白重鏈和輕鏈，這些雜交瘤(四體雜交瘤)會產(chǎn)生10種不同的抗體分子的潛在混合物，其中一些抗體分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。國際公開號WO 93/08829和Traunecker等，1991，EMBO J.103655-59中公開了相似的方法。
按照不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)融合于免疫球蛋白恒定區(qū)序列。該融合物一般具有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，含有鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域的至少一部分。在一些實(shí)施方式中，該融合物包含含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的第一種重鏈恒定區(qū)(CH1)，其出現(xiàn)于至少一種融合物中。將具有編碼免疫球蛋白重鏈融合物和(如果需要)免疫球蛋白輕鏈的序列的核酸插入不同的表達(dá)載體中，并用它們共轉(zhuǎn)染合適的宿主生物體。在將不等比例的三種多肽鏈用于構(gòu)建過程中以產(chǎn)生最優(yōu)產(chǎn)量的實(shí)施方式中，這將為調(diào)整三種多肽片斷的相互比例提供極大的靈活性。然而，當(dāng)相等比例的至少兩種多肽鏈的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量，或比例不是特別重要時，有可能將兩種或者全部三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
在此方法的一個實(shí)施方式中，雙特異性抗體的一條臂上含有具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，另一條臂上含有雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)。這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從不想要的免疫球蛋白鏈組合中分離所需雙特異性化合物，因?yàn)閮H在一半雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈便于分離(參見例如，國際公開號WO 94/04690，在此整體作為本文參考文獻(xiàn))。
關(guān)于雙特異性抗體的進(jìn)一步討論參見例如，Suresh等，1986，Methods inEnzymology 121210；Rodrigues等，1993，J.Immunology 1516954-61；Carter等，1992，Bio/Technology 10163-67；Carter等，1995，J.Hematotherapy 4463-70；Merchant等，1998，Nature Biotechnology 16677-81。利用此類技術(shù)，如本文所述，可制備用于治療或預(yù)防疾病的雙特異性抗體。
歐洲專利公開號EPA 0 105 360也描述了雙功能抗體。如該參考文獻(xiàn)所公開，雜交或雙功能抗體可衍生自生物學(xué)方法即細(xì)胞融和技術(shù)，或者化學(xué)方法，特別是利用交聯(lián)劑或二硫橋形成試劑，這種抗體還可包含整個抗體或其片段。例如國際公開WO83/03679和歐洲專利公開號EPA 0 217 577均公開了獲得這種雜交抗體的方法，兩者作為參考文獻(xiàn)納入本文。
在一些實(shí)施方式中，人構(gòu)架區(qū)的構(gòu)架殘基將被CDR供體抗體的對應(yīng)殘基取代，從而改變，優(yōu)選提高抗原結(jié)合。鑒別此類構(gòu)架取代的方法為本領(lǐng)域所熟知，如建立CDR和構(gòu)架殘基的相互作用的模型以鑒定抗原結(jié)合的重要構(gòu)架殘基，并建立序列比較的模型以鑒定在特定位置上的特殊構(gòu)架殘基(參見例如，美國專利號5,585,089；Riechmann等，1988，Nature 332323.)?？衫帽绢I(lǐng)域熟知的多種技術(shù)進(jìn)行抗體的人源化，例如，CDR-嫁接(參見例如，EP 0239400；PCT公開WO 91/09967；美國專利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、鑲面或表面重建(參見例如，EP 0592106；EP 0519596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering 7(6)805-814；Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91969-973)和鏈改組(參見例如，美國專利號5,565,332)(將所有這些參考文獻(xiàn)納入本文作參考)。
人源化單克隆抗體可通過本領(lǐng)域熟知的DNA重組技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，例如利用國際公開號WO 87/02671；歐洲專利公開號0184187；歐洲專利公開號0171496；歐洲專利公開號0173494；國際專利公開號WO 86/01533；美國專利號4,816,567；歐洲專利公開號0012023；Berter等，1988，Science 2401041-43；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-43；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-26；Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-18；Nishimura等，1987，Cancer Res.47999-1005；Wood等，1985，Nature 314446-449；Shaw等，1988，J.Natl.Cancer Inst.801553-59；Morrison，1985，Science 2291202-07；Oi等，1986，BioTechniques4214；美國專利號5,225,539；Jones等，1986，Nature 321552-25；Verhoeyan等，1988，Science 2391534；和Beidler等，1988，J.Immunol.1414053-60所述的方法；將上述各文獻(xiàn)以全文納入本文作參考。
如上所述，CD70結(jié)合物可以是抗-CD70抗體的衍生物。通常，抗-CD70抗體衍生物包含抗-CD70抗體(包括例如，抗原結(jié)合片段或保守取代多肽)和與抗-CD70抗體異源的至少一個多肽區(qū)或其它部分。例如，抗-CD70抗體可通過與任何類型的分子共價連接加以修飾。典型的修飾包括例如糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)/封端基團(tuán)衍生化、蛋白水解切割、連接至細(xì)胞配體(如清蛋白-結(jié)合分子)或其它蛋白等。可通過已知技術(shù)，包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙?；?、甲酰化和衣霉素代謝合成等進(jìn)行多種化學(xué)修飾。
在一些實(shí)施方式中，這些共價連接不干擾效應(yīng)物功能，如阻止抗體衍生物通過抗原結(jié)合區(qū)或其衍生區(qū)特異性結(jié)合于CD70，或阻止效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合于Fc受體。
在一些實(shí)施方式中，抗體衍生物為包含一個或多個單體的多聚體，如二聚體，其中各單體包括(i)抗-CD70抗體的抗原結(jié)合區(qū)或其衍生的多肽區(qū)(如用一個或多個氨基酸保守取代)和(ii)多聚化(如二聚化)多肽區(qū)，從而使該抗體衍生物形成特異性結(jié)合于CD70的多聚體(如同源二聚體)。在典型的實(shí)施方式中，通過重組或化學(xué)方法使抗-CD70抗體的抗原結(jié)合區(qū)或其衍生的多肽區(qū)與異源蛋白融合，其中所述異源蛋白包含二聚或多聚結(jié)構(gòu)域。在將抗體衍生物給予對象用于治療或者預(yù)防免疫病或表達(dá)CD70的癌癥之前，將衍生物置于可形成同源二聚體或異源二聚體的條件下。本文所用的異源二聚體可包含相同的二聚化結(jié)構(gòu)域而不包含不同的CD70抗原結(jié)合區(qū)，包含相同的CD70抗原結(jié)合區(qū)而不包含不同的二聚化結(jié)構(gòu)域，或者包含不同的CD70抗原結(jié)合區(qū)和二聚化結(jié)構(gòu)域。
典型的二聚化結(jié)構(gòu)域是起源于轉(zhuǎn)錄因子的二聚化結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方式中，二聚化結(jié)構(gòu)域是堿性區(qū)亮氨酸拉鏈(“bZIP”)的二聚化結(jié)構(gòu)域(參見Vinson等，1989，Science 246911-916)。有用的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域包括例如，酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4、哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白C/EBP和癌基因產(chǎn)物的核轉(zhuǎn)化物Fos和Jun的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。(參見例如，Landschultz等，1988，Science 2401759-64；Baxevanis和Vinson，1993，Curr.Op.Gen.Devel.3278-285；O’Shea等，1989，Science243538-542)。在另一實(shí)施方式中，二聚化結(jié)構(gòu)域?yàn)閴A性區(qū)螺旋-環(huán)-螺旋(“bHLH”)蛋白的二聚化結(jié)構(gòu)域。(參見例如，Murre等，1989，Cell 56777-783。也參見Davis等，1990，Cell 60733-746；Voronova和Baltimore，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA874722-26)。尤其有用的hHLH蛋白是myc、max和mac。
在另一實(shí)施方式中，二聚化結(jié)構(gòu)域?yàn)槊庖咔虻鞍缀愣▍^(qū)，如重鏈恒定區(qū)或其結(jié)構(gòu)域(如CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域)。(參見例如，美國專利5,155,027、5,336,603、5,359,046和5,349,053；EP 0367166；和WO 96/04388.)。
已知Fos和Jun之間(Bohmann等，1987，Science 2381386-1392)、ATF/CREB家族成員之間(Hai等，1989，Genes Dev.32083-2090)、C/EBP家族成員之間(Cao等，1991，Genes Dev.51538-52；Williams等，1991，Genes Dev.51553-67；Roman等，1990，Genes Dev.41404-15)以及ATF/CREB和Fos/Jun家族成員之間(Hai和Curran，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883720-24)形成異源二聚體。因此，當(dāng)CD70-結(jié)合蛋白作為含有不同二聚化結(jié)構(gòu)域的異源二聚體給予對象時，可采用上述任何組合。
在其它實(shí)施方式中，抗-CD70抗體衍生物是偶聯(lián)于第二抗體的抗-CD70抗體(“抗體異源偶聯(lián)物”)(參見例如美國專利號4,676,980)。用于實(shí)施本發(fā)明方法的異源偶聯(lián)物包含結(jié)合于CD70的抗體(如含有單克隆抗體2F2或1F6的CDR和/或重鏈的抗體)和結(jié)合于介導(dǎo)ADCC、吞噬作用和/或CDC的表面受體或受體復(fù)合物，如CD16/FcgRIII、CD64/FcgRI、殺傷細(xì)胞活化或抑制受體或者補(bǔ)體控制蛋白CD59的抗體。在典型的實(shí)施方式中，多特異性抗體部分與第二種細(xì)胞表面分子或受體復(fù)合物的結(jié)合能提高抗-CD70抗體的效應(yīng)物功能。在其它實(shí)施方式中，所述抗體可以是治療劑。本文描述了合適的抗體治療劑。
在一些實(shí)施方式中，經(jīng)過本領(lǐng)域已知的任何競爭性結(jié)合測定法(如本文所述的免疫試驗(yàn))測定，抗-CD70抗體或其衍生物競爭性抑制mAb 1F6或2F2與CD70的結(jié)合。在典型的實(shí)施方式中，該抗體將1F6或2F2與CD70的結(jié)合競爭性抑制了至少50％、至少60％、至少70％或至少75％。在其它實(shí)施方式中，該抗體將1F6或2F2與CD70的結(jié)合競爭性抑制了至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
可用任何已知方法測定抗體與CD70的特異性結(jié)合。可以采用的免疫測定包括例如采用以下技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)如Western印跡、放射性免疫試驗(yàn)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))、“夾心”免疫試驗(yàn)、免疫沉淀試驗(yàn)、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫放射試驗(yàn)、熒光免疫試驗(yàn)和蛋白A免疫試驗(yàn)。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域的常規(guī)和熟知試驗(yàn)。(參見例如，Ausubel等編，Short Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)小方法)(John Wiley &Sons，Inc.，紐約，第四版，1999)；Harlow和Lane，Using AntibodiesA LaboratoryManual(使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，紐約，1999.) 另外，可采用競爭性結(jié)合試驗(yàn)測定抗體與CD70的結(jié)合親和力和抗體CD70相互作用的解離速率。競爭性結(jié)合試驗(yàn)的一個例子是放射性免疫試驗(yàn)，其包括在遞增量的未標(biāo)記CD70存在下用感興趣抗體培育標(biāo)記(如3H或125I)的CD70，并檢測結(jié)合于標(biāo)記CD70的抗體。然后，可由Scatchard作圖分析的數(shù)據(jù)測定抗體與CD70的親和力和結(jié)合解離速率。也可采用放射性免疫試驗(yàn)測定與第二抗體(如mAb 1F6或2F2)的競爭。在這種情況下，在遞增量的未標(biāo)記第二抗體存在下用偶聯(lián)于標(biāo)記(如3H或125I)化合物的感興趣抗體培育CD70?；蛘?，可通過表面等離振子共振法測定抗體與CD70的結(jié)合親和力以及抗體-CD70相互作用的結(jié)合速率和解離速率。在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體或其衍生物可靶向或累積在表達(dá)CD70的細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
可用本領(lǐng)域已知的蛋白合成方法，一般是(例如)重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生抗-CD70抗體和其衍生物。結(jié)合于CD70的抗體或其衍生物的重組表達(dá)一般包括構(gòu)建含有編碼該抗體或其衍生物的核酸的表達(dá)載體?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù)用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)分子的載體?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如下述文獻(xiàn)所述的技術(shù)進(jìn)行核酸重組、核酸合成、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因摻入和重組蛋白表達(dá)Sambrook和Russell，MolecularCloningA Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，紐約，第3版，2001)；Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約，第2版，1989)；Short Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)小方法)(Ausubel等，John Wiley & Sons，紐約，第4版，1999)；和Glick和Pasternak，Molecular BiotechnologyPrinciples and Applications of Recombinant DNA(分子生物技術(shù)重組DNA的原理和應(yīng)用)(ASM Press，華盛頓特區(qū)，第2版，1998)。
例如，在抗-CD70抗體的重組表達(dá)中，表達(dá)載體可編碼操作性連接于啟動子的重鏈或輕鏈，或重鏈或輕鏈可變區(qū)。表達(dá)載體可包括例如，編碼抗體分子的恒定區(qū)的核苷酸序列(參見例如PCT公開WO 86/05807；PCT公開WO 89/01036；和美國專利號5,122,464)，可將抗體的可變區(qū)克隆入這種載體中用于表達(dá)完整的重鏈或輕鏈。用常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，然后用常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生抗-CD70抗體。在用于表達(dá)雙鏈抗體的典型實(shí)施方式中，編碼重鏈和輕鏈的載體可以在宿主細(xì)胞中共同表達(dá)，以表達(dá)出完整的免疫球蛋白分子。
可利用多種原核和真核宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)抗-CD70抗體或其衍生物。一般地，真核細(xì)胞(特別是就完整重組抗-CD70抗體分子而言)可用于表達(dá)重組蛋白。例如，哺乳動物細(xì)胞如中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)與載體如人巨細(xì)胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件組合時，是有效產(chǎn)生抗-CD70抗體和其衍生物的表達(dá)系統(tǒng)(參見例如，F(xiàn)oecking等，1986，Gene 45101；Cockett等，1990，Bio/Technology 82)。
其它宿主-表達(dá)系統(tǒng)包括例如細(xì)菌細(xì)胞中基于質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)(參見例如，Ruther等，1983，EMBO 1，21791；Inouye和Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.245503-5509)；昆蟲系統(tǒng)如在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中采用苜蓿夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒(AcNPV)表達(dá)載體；以及哺乳動物細(xì)胞中基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)，如基于腺病毒的系統(tǒng)(參見例如Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359；Bittner等，1987，Methods in Enzymol.15351-544)。
此外，可選擇以所需的特定方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)、或者修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞系?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證正確地修飾和加工(如糖基化、磷酸化和切割)所表達(dá)的蛋白質(zhì)。為此，可采用含有能夠適當(dāng)加工初級轉(zhuǎn)錄物和基因產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括例如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和W138。
一般用穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組抗-CD70抗體或其衍生物或其它CD70結(jié)合物的長期、高產(chǎn)率生產(chǎn)。例如，可通過用合適表達(dá)控制元件(如啟動子和增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn))控制的DNA和選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而工程改造穩(wěn)定表達(dá)抗-CD70抗體或其衍生物的細(xì)胞系。選擇性標(biāo)記對選擇產(chǎn)生抗性，并允許細(xì)胞將其DNA穩(wěn)定地整合到其染色體中，生長形成細(xì)胞灶，進(jìn)而可被克隆和擴(kuò)增成細(xì)胞系?？刹捎迷S多選擇系統(tǒng)，包括例如單純皰疹病毒胸苷激酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因，可將它們分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞?？勾x劑抗性也可用作以下基因的選擇基礎(chǔ)產(chǎn)生甲氨蝶呤抗性的dhfr；產(chǎn)生霉酚酸抗性的gpt；產(chǎn)生氨基葡糖苷G-418抗性的neo；和產(chǎn)生潮霉素抗性的hygro。通常，可采用本領(lǐng)域通常已知的重組DNA技術(shù)方法選擇所需的重組克隆，這種方法參見例如，Current Protocols inMolecular Biology(新編分子生物學(xué)方法)(Ausubel等編，John Wiley & Sons，紐約，1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual(基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室手冊)(Stockton Press，紐約，1990)；Current Protocols in Human Genetics(新編人類基因組方法)(Dracopoli等編，John Wiley & Sons，紐約，1994，第12和13章)；和Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501。
可通過載體擴(kuò)增提高抗體或其衍生物的表達(dá)水平。(通常參見例如Bebbington和Hentschel，The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression ofCloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning(將基于哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)克隆基因所用的基因擴(kuò)增的載體用于DNA克隆)，第3卷(Academic Press，紐約，1987))。當(dāng)表達(dá)抗-CD70抗體或其衍生物的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記物可擴(kuò)增時，提高宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的抑制劑水平能選擇具有高拷貝數(shù)的標(biāo)記物基因、從而對該抑制劑產(chǎn)生抗性的宿主細(xì)胞。相關(guān)抗體基因的拷貝數(shù)也會增加，從而提高了抗體或其衍生物的表達(dá)(參見Crouse等，1983，Mol.Cell.Biol.3257)。
當(dāng)抗-CD70抗體包含重鏈和輕鏈或其衍生物時，可用兩種表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中第一種載體編碼重鏈蛋白，第二種載體編碼輕鏈蛋白。這兩種載體可含有相同的選擇性標(biāo)記物，它們能夠使重鏈和輕鏈蛋白的表達(dá)量相等?；蛘撸刹捎镁幋a并能表達(dá)重鏈和輕鏈蛋白的一種載體。在這種情況下，輕鏈一般位于重鏈之前，以避免毒性游離重鏈過多(參見Proudfoot，1986，Nature 32252；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
一旦抗-CD70抗體或其衍生物產(chǎn)生(如由動物、化學(xué)合成或重組表達(dá)產(chǎn)生)后，可用任何合適的蛋白質(zhì)純化方法進(jìn)行純化，包括例如層析(例如，離子交換或親和層析(如用于純化具有完整Fc區(qū)的抗體的蛋白A層析))、離心、差異溶解性或任何其它蛋白質(zhì)純化標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？?CD70抗體或其衍生物可以(例如)融合于標(biāo)記物序列如肽，以幫助用親和層析進(jìn)行純化。合適的標(biāo)記物氨基酸序列包括例如六-組氨酸肽(如pQE載體(凱杰公司(QIAGEN，Inc.)，Chatsworth，CA，91311)中提供的標(biāo)簽)和“HA”標(biāo)簽(對應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白的表位)(Wilson等，1984，Cell 37767)和“flag”標(biāo)簽。
一旦抗-CD70抗體或其衍生物產(chǎn)生后，可用下述或本領(lǐng)域已知的方法測定它對表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒作用或者對表達(dá)CD70的免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
為了最大程度降低抗-CD70抗體對活化的免疫細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞之外細(xì)胞的活性，可采用特異性結(jié)合于細(xì)胞膜結(jié)合性CD70、而非溶解態(tài)CD70的抗體，以便使該抗-CD70抗體在活化的免疫細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上濃縮。
一般地，抗-CD70抗體或其衍生物是基本純化的(如基本不含限制其作用或產(chǎn)生不良副作用的物質(zhì))。在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體或其衍生物的純度為至少約40％，至少約50％，或至少約60％。在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體或其衍生物的純度為至少約60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％或95-98％。在一些實(shí)施方式中，抗-CD70抗體或其衍生物的純度約為99％。
III.其它CD70結(jié)合物 其它CD70結(jié)合物包括與異源蛋白(一般為至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或至少100個氨基酸)的融合蛋白(即通過重組方法融合或化學(xué)方法偶聯(lián)，包括共價和非共價偶聯(lián)的蛋白質(zhì))。這種CD70結(jié)合物可包括結(jié)合于CD70和免疫球蛋白效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域或其功能等同物的部分。本文所用的免疫球蛋白效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的功能等同物結(jié)合于具有吞噬細(xì)胞或裂解細(xì)胞活性的免疫細(xì)胞上的Fc受體，或者使Fc效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域結(jié)合于補(bǔ)體系統(tǒng)的成分。該融合蛋白不一定需要是直接連接，可通過接頭序列連接。
例如，可通過將抗-CD70抗體的一個或多個CDR或可變區(qū)的編碼區(qū)框內(nèi)融合于編碼異源蛋白的序列而重組產(chǎn)生CD70結(jié)合物。異源蛋白可包括例如效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域、其功能等同物或其它功能結(jié)構(gòu)域，以提供以下一種或多種特征促進(jìn)穩(wěn)定表達(dá)；提供有助于高產(chǎn)率重組表達(dá)的方式；提供細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)活性；和/或提供多聚化結(jié)構(gòu)域。
在一些實(shí)施方式中，CD70結(jié)合物可包括來自結(jié)合于CD70并且無需偶聯(lián)于細(xì)胞毒劑即能單獨(dú)消耗表達(dá)CD70的細(xì)胞或抑制其增殖的抗體的一個或多個CDR。
IV.改進(jìn)抗-CD70靶向劑的效應(yīng)物功能的方法 在一些實(shí)施方式中，可采用本領(lǐng)域已知的一種或多種抗體工程方法改進(jìn)其效應(yīng)物功能，從而增強(qiáng)CD70結(jié)合物的效應(yīng)物功能。下面提供這類方法的說明性、非限制性例子。
ADCC和ADCP是由細(xì)胞-結(jié)合抗體與效應(yīng)物細(xì)胞上表達(dá)的Fcγ受體(FcγR)相互作用介導(dǎo)的。IgG Fc區(qū)的糖基化狀態(tài)和一級氨基酸序列對Fcγ-FcγR相互作用有功能性影響。Fcγ-FcγR相互作用較強(qiáng)與效應(yīng)物細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力更高相關(guān)聯(lián)。
共價連接于保守性Asn297的寡糖參與了IgG Fc區(qū)與FcγR的結(jié)合(Lund等，1996，J.Immunol.1574963-69；Wright和Morrison，1997，Trends Biotechnol。1526-31)。工程改造IgG上的此種糖形式可顯著提高IgG介導(dǎo)的ADCC。將等分N-乙?；咸前沸揎?Umana等，1999，Nat.Biotechnol.17176-180；Davies等，2001，Biotech.Bioeng.74288-94)加入此糖形式或從此糖形式中去除巖藻糖(Shields等，2002，J.Biol.Chem.27726733-40；Shinkawa等，2003，J.Biol.Chem.2786591-604；Niwa等，2004，Cancer Res.642127-33)是能改善IgG Fc和FcγR的結(jié)合，從而提高Ig-介導(dǎo)的ADCC活性的IgG Fc工程改造的兩個例子。
系統(tǒng)取代人IgG1Fc區(qū)接觸溶劑的氨基酸會產(chǎn)生FcγR結(jié)合親和力改變的IgG變體(Shields等，2001，J.Biol.Chem.2766591-604)。與母體IgG1相比，在Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334或Ser298/Glu333/Lys334上用Ala取代的這些變體的亞組顯示出與FcγR的結(jié)合親和力和ADCC活性升高(Shields等，2001，J.Biol.Chem.2766591-604；Okazaki等，2004，J.Mol.Biol.3361239-49)。
抗體-介導(dǎo)的CDC從Clq結(jié)合于細(xì)胞結(jié)合性IgG分子開始。已經(jīng)報道了人IgG1上負(fù)責(zé)Clq結(jié)合的特定氨基酸殘基和Clq結(jié)合的物種特異性差別(Idusogie等，2000，J.Immunol.1644178-4184)。在Lys326和Glu333上的取代能改進(jìn)抗體的補(bǔ)體結(jié)合活性；例如，這種取代可改進(jìn)人IgG1抗體利妥昔單抗的Clq結(jié)合和CDC活性(Idusogie等，2001，J.Immunol.1662571-2575)。在人IgG2主鏈上的相同取代可將與Clq結(jié)合性能差和補(bǔ)體活化活性嚴(yán)重缺陷的抗體同種型轉(zhuǎn)變?yōu)榭赏瑫r結(jié)合Clq和介導(dǎo)CDC的同種型(Idusogie等，2001，J.Immunol.1662571-75)。也利用幾種其它方法改進(jìn)抗體的補(bǔ)體結(jié)合活性。例如，將IgM的18-氨基酸羧基-末端尾部分嫁接于IgG的羧基端能顯著提高其CDC活性。即使采用通常檢測不到CDC活性的IgG4也能觀察到這種現(xiàn)象(Smith等，1995，J.Immunol.1542226-36)。同時，用Cys取代接近IgG1重鏈羧基端的Ser444能誘導(dǎo)IgG1發(fā)生尾對尾二聚化，其CDC活性比單體IgG1高200倍(Shopes等，1992，J.Immunol.1482918-22)。此外，具有Clq特異性的雙特異性雙抗體構(gòu)建物也產(chǎn)生CDC活性(Kontermann等，1997，Nat.Biotech.15629-31)。
抗體的體內(nèi)半衰期也可能影響其效應(yīng)物功能。在一些實(shí)施方式中，需要延長或縮短抗體的半衰期，以改變其治療活性。FcRn是結(jié)構(gòu)上類似于非共價結(jié)合于β2-微球蛋白的MHC I類抗原的受體。FcRn調(diào)節(jié)IgG的異化作用和其跨組織胞運(yùn)作用(Ghetie和Ward，2000，Annu.Rev.Immunol.18739-766；Ghetie和Ward，2002，Immunol.Res.2597-113)。IgG-FcRn相互作用在pH 6.0(胞內(nèi)小泡的pH)時發(fā)生，但在pH 7.4(血液pH)時不發(fā)生；這種相互作用使IgG能夠循環(huán)回循環(huán)系統(tǒng)(Ghetie和Ward，2000，Ann.Rev.Immunol.18739-766；Ghetie和Ward，2002，Immunol.Res.2597-113)。對參與FcRn結(jié)合的人IgG1上的區(qū)域作圖(Shields等，2001，J.Biol.Chem.2766591-604)。人IgG1的位置Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382或Asn434上發(fā)生的丙氨酸取代能增強(qiáng)FcRn結(jié)合(Shields等，2001，J.Biol.Chem.2766591-604)。預(yù)計(jì)帶有這些取代的IgG1分子具有較長的血清半衰期。因此，與未修飾IgG1相比，這些修飾的IgG1分子可能在長時間內(nèi)進(jìn)行其效應(yīng)物功能，從而行使其治療功效。
V.細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制和免疫調(diào)節(jié)活性的試驗(yàn) 測定抗體是否介導(dǎo)對抗靶細(xì)胞的效應(yīng)物功能的方法是已知的。這種方法的說明性例子如下所述。
為了測定抗-CD70抗體或其衍生物是否介導(dǎo)對抗活化免疫細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒作用，可采用在抗體和效應(yīng)物免疫細(xì)胞的存在下測定靶細(xì)胞死亡的試驗(yàn)。用于測定此類細(xì)胞毒作用的試驗(yàn)可基于在效應(yīng)物細(xì)胞和靶點(diǎn)特異性抗體存在下培育后測定代謝標(biāo)記的靶細(xì)胞釋放的51Cr(參見例如，Perussia和Loza，2000，Methods in Molecular Biology 121179-92；和“51Cr Release Assay ofAntibody-dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC)(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的51Cr釋放試驗(yàn))”，Current Potocols in Immunology(新編免疫學(xué)方法)，Coligan等編，Wileyand Sons，1993)。例如，可用不同濃度的抗-CD70抗體處理用Na251CrO4標(biāo)記并以5,000個細(xì)胞/孔接種于96孔板的活化的免疫細(xì)胞(如活化的淋巴細(xì)胞)或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞30分鐘，然后與正常人外周血單核細(xì)胞細(xì)胞(PBMC)混合4小時。伴隨靶細(xì)胞死亡的膜破壞會將51Cr釋放到培養(yǎng)物上清液中，可收集這些上清液并測定其放射性，從而確定其細(xì)胞毒活性。測定ADCC的其它試驗(yàn)可包括非放射性標(biāo)記或基于誘導(dǎo)釋放特定酶。例如，基于時間分辨的熒光測定術(shù)的非放射性試驗(yàn)是市售的(Delphia，Perkin Elmer)。此試驗(yàn)基于在靶細(xì)胞上加載熒光增強(qiáng)配體的乙酸基甲酯(BATDA)，其能透過細(xì)胞膜、然后水解形成不能透過膜的親水性配體(TDA)。與靶點(diǎn)特異性抗體和PBMC效應(yīng)物細(xì)胞混合時，裂解細(xì)胞釋放TDA，并與銪混合時可形成發(fā)強(qiáng)熒光的螯合物。經(jīng)過時間分辨的熒光測定法測定，該信號與細(xì)胞裂解量相關(guān)聯(lián)。
為了確定抗-CD70抗體或其衍生物是否介導(dǎo)對抗活化免疫細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用，可采用測定效應(yīng)物免疫細(xì)胞(如新鮮培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞或已建立的巨噬細(xì)胞-樣細(xì)胞系)內(nèi)化靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)(參見例如，Munn和Cheung，1990，J.Exp.Med.172231-37；Keler等，2000，J.Immunol.1645746-52；Akewanlop等，2001，Cancer Res.614061-65)。例如，靶細(xì)胞可用親脂性膜染料如PKH67(Sigma)標(biāo)記，用靶點(diǎn)特異性抗體包被，并與效應(yīng)物免疫細(xì)胞混合4-24小時。然后，可采用吞噬細(xì)胞表面標(biāo)記物(如CD14)的特異性熒光染料標(biāo)記抗體復(fù)染、并用雙色流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微術(shù)分析細(xì)胞，從而鑒定效應(yīng)物細(xì)胞。雙陽性細(xì)胞代表含有內(nèi)化的靶細(xì)胞的效應(yīng)物細(xì)胞。在這些實(shí)驗(yàn)中，效應(yīng)物細(xì)胞可以是衍生自用M-CSF或GM-CSF培養(yǎng)5-10天分化為巨噬細(xì)胞的PBMC的單核細(xì)胞(參見例如，Munn和Cheung，同上)。獲自ATCC的人巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系U937(Larrick等，1980，J.Immunology 1256-12)或THP-1(Tsuchiya等，1980，Int.J.Cancer 26171-76)可用作另一種吞噬細(xì)胞來源。
也知道確定抗體結(jié)合于靶細(xì)胞后是否介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用的方法?？捎孟嗤姆椒ù_定CD70結(jié)合物是否介導(dǎo)對活化免疫細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的CDC。這類方法的說明性例子如下所述。
有效補(bǔ)體的來源可以是正常人血清或純化自實(shí)驗(yàn)室動物，包括兔。在標(biāo)準(zhǔn)測定中，在補(bǔ)體存在下CD70結(jié)合物與表達(dá)CD70的活化免疫細(xì)胞(如活化淋巴細(xì)胞)或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞一起培育?？梢杂脦追N讀數(shù)測定這類CD70結(jié)合物介導(dǎo)細(xì)胞裂解的能力。在一個實(shí)施例中，采用Na51CrO4釋放實(shí)驗(yàn)。在此實(shí)驗(yàn)中，用Na51CrO4標(biāo)記靶細(xì)胞。洗掉未摻入的Na51CrO4，以合適密度，一般是5,000-50,000個細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于96孔板。一般在正常血清或純化補(bǔ)體的存在下用CD70結(jié)合物37℃、5％CO2氣氛下培育2-6小時。用γ射線計(jì)數(shù)法測定等份的培養(yǎng)物上清液中釋放的放射性，表明細(xì)胞裂解程度。通過釋放摻入的Na51CrO4確定去污劑(0.5-1％NP-40或Triton X-100)處理引起的細(xì)胞裂解最大值。在僅有補(bǔ)體而沒有任何CD70結(jié)合物的孔中測定自發(fā)性背景細(xì)胞裂解。按照下式計(jì)算細(xì)胞裂解百分?jǐn)?shù)(CD70結(jié)合物誘導(dǎo)的裂解-自發(fā)性裂解)/細(xì)胞裂解最大值。第二個讀數(shù)是活細(xì)胞的代謝染料如Alamar Blue減少。在此實(shí)驗(yàn)中，用CD70結(jié)合物和補(bǔ)體培育靶細(xì)胞，培育方法如上所述。培育結(jié)束時，加入1/10體積的Alamar Blue(Biosource International，加利福尼亞州卡馬里奧)。繼續(xù)在37℃、5％CO2氣氛下培育16小時。用激發(fā)光530nm和發(fā)射光590nm的熒光分析測定Alamar Blue(代表有代謝活性的活細(xì)胞)減少。第三個讀數(shù)是細(xì)胞膜對碘化丙錠(PI)的通透性。由于補(bǔ)體激活在質(zhì)膜上形成孔洞有利于PI進(jìn)入細(xì)胞中，PI在細(xì)胞中會擴(kuò)散至核并結(jié)合DNA。結(jié)合于DNA后，600nm處的PI熒光顯著增強(qiáng)。用CD70結(jié)合物和補(bǔ)體處理靶細(xì)胞的過程如上所述。培育結(jié)束時，加入PI，使其終濃度為5μg/ml。接著用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞懸液，采用488nm氬氣激光器進(jìn)行激發(fā)。用600nm處的熒光發(fā)射檢測裂解細(xì)胞。
VI.免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的動物模型 可在免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的動物模型中檢測或評價抗-CD70結(jié)合物，如抗體或其衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多已經(jīng)建立的免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的動物模型，其中任何一種均可用于測定抗-CD70抗體或其衍生物的效能。這類模型的非限制性例子如下所述。
下述文獻(xiàn)描述了系統(tǒng)性和器官特異性自身免疫病、包括糖尿病、狼瘡、全身性硬化、舍格倫綜合征、實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(多發(fā)性硬化)、甲狀腺炎、重癥肌無力、關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎和炎性腸病的動物模型的例子Bigazzi，“Animal Models ofAutoimmunitySpontaneous and Induced(自身免疫的動物模型自發(fā)性和誘導(dǎo)性)”，The Autoimmune Diseases(自身免疫病)(Rose和Mackay編，Academic Press，1998)和“Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease(自身免疫和炎性疾病的動物模型)”，Current Protocols in Immunology(新編免疫學(xué)方法)(Coligan等編，Wiley和Sons，1997)。
也可用嚙齒動物建立變應(yīng)性疾病如哮喘和皮炎的模型?？梢杂寐亚宓鞍?Tomkinson等，2001，J.Immunol.1665792-800)或曼氏裂頭吸蟲(Schistosoma mansoni)卵抗原(Tesciuba等，2001，J.Immunol.1671996-2003)在小鼠中誘導(dǎo)呼吸道超敏反應(yīng)。Nc/Nga小鼠品系顯示出血清IgE顯著增加并自發(fā)性發(fā)生特應(yīng)性皮炎樣損傷(Vestergaard等，2000，Mol.Med.Today 6209-10；Watanabe等，1997，Int.Immunol.9461-66；Saskawa等，2001，Int.Arch.Allergy Immunol.126239-47)。
將免疫健全供體的淋巴細(xì)胞注射到致死性輻射的組織不相容性宿主中是在小鼠中誘導(dǎo)GVHD的經(jīng)典方法?；蛘?，親本B6D2F1鼠模型提供了誘導(dǎo)急性和慢性GVHD的系統(tǒng)。在此模型中，B6D2F1小鼠是親本C57BL/6和DBA/2小鼠品系雜交的F1后代。將DBA/2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未輻射B6D2F1小鼠中會引起慢性GVHD，而轉(zhuǎn)移C57BL/6、C57BL/10或B10.D2淋巴細(xì)胞會引起急性GVHD(Slayback等，2000，BoneMarrow Transpl.26931-938；Kataoka等，2001，Immunology 103310-318)。
此外，人造血干細(xì)胞和成熟的外周血淋巴細(xì)胞可移植給SCID小鼠，這些人淋巴-造血細(xì)胞在SCID小鼠中仍有功能(McCune等，1988，Science 2411632-1639；Kamel-Reid和Dick，1988，Science 2421706-1709；Mosier等，1988，Nature335256-259)。這為直接檢測人淋巴細(xì)胞的潛在治療劑提供了小動物模型系統(tǒng)。(參見例如，Tournoy等，2001，J.Immunol.1666982-6991)。
而且，可通過將表達(dá)CD70的人腫瘤細(xì)胞系植入合適的免疫缺陷型嚙齒動物品系，如無胸腺裸小鼠或SCID小鼠中，建立檢測抗-CD70抗體或其衍生物的體內(nèi)效能的小動物模型。表達(dá)CD70的人淋巴瘤細(xì)胞系的例子包括例如，Daudi細(xì)胞(Ghetie等，1994，Blood 831329-36；Ghetie等，1990，Int.J.Cancer 15481-85；de Mont等，2001，Cancer Res.617654-59)、HS-Sultan細(xì)胞(Cattan和Maung，1996，CancerChemother.Pharmacol.38548-52；Cattan和Douglas，1994，Leuk.Res.18513-22)、Raji細(xì)胞(Ochakovskaya等，2001，Clin.Cancer Res.71505-10；Breisto等，1999，Cancer Res.592944-49)和CA46細(xì)胞(Kreitman等，1999，Int.J.Cancer 81148-55)。表達(dá)CD70的霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系的非限制性例子是L428細(xì)胞(Drexler，1993，Leuk.Lymphoma 91-25；Dewan等，2005，Cancer Sci.96466-473)。表達(dá)CD70的人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的非限制性例子包括786-O細(xì)胞(Ananth等，1999，Cancer Res.592210-16；Datta等，2001，Cancer Res.611768-75)、ACHN細(xì)胞(Hara等，2001，J.Urol.1662491-94；Miyake等，2002，J.Urol.1672203-08)、Caki-1細(xì)胞(Prewett等，1998，Clin.Cancer Res.42957-66；Shi和Siemann，2002，Br.J.Cancer87119-26)和Caki-2細(xì)胞(Zellweger等，2001，Neoplasia 3360-67)。表達(dá)CD70的鼻咽癌細(xì)胞系的非限制性例子包括C15和C17(Busson等，1988，Int.J.Cancer42599-606；Bernheim等，1993，Cancer Genet.Cytogenet.6611-5)。表達(dá)CD70的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的非限制性例子包括U373細(xì)胞(Palma等，2000，Br.J.Cancer82480-7)和U87MG細(xì)胞(Johns等，2002，Int.J.Cancer 98398-408)。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的非限制性例子包括MM.1S細(xì)胞(Greenstein等，2003，ExperimentalHematology 31271-282)和L363細(xì)胞(Diehl等，1978，Blut 36331-338)。(也參見Drexler和Matsuo，2000，Leukemia Research 24681-703)?？梢栽诿庖呷毕菪蛧X動物宿主中建立這些腫瘤細(xì)胞系，具體是皮下注射形成實(shí)體瘤或靜脈內(nèi)注射形成彌散性腫瘤。一旦在宿主中建立后，可用這些腫瘤模型評價抗-CD70抗體或其衍生物對調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤生長的療效(如本文所述)。
VII.CD70-相關(guān)性疾病 本文所述的抗-CD70結(jié)合物(如抗體和衍生物)可用于治療或預(yù)防特征是通過不適當(dāng)?shù)丶せ蠲庖呒?xì)胞(如淋巴細(xì)胞或樹突細(xì)胞)表達(dá)CD70的癌癥或免疫病。這種CD70表達(dá)可能是由于(例如)細(xì)胞表面上CD70蛋白水平提高和/或表達(dá)的CD70抗原性改變。通過給予需要治療或預(yù)防的對象有效量的抗-CD70抗體或其衍生物按照本文所述方法治療或預(yù)防免疫病，其中所述抗體或其衍生物(i)結(jié)合于表達(dá)CD70并與疾病狀態(tài)有關(guān)的活化免疫細(xì)胞和(ii)對活化免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。在一些實(shí)施方式中，在不偶聯(lián)于細(xì)胞毒劑、細(xì)胞抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑的情況下產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。在一些實(shí)施方式中，通過偶聯(lián)于細(xì)胞毒劑、細(xì)胞抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。
特征是不適當(dāng)?shù)丶せ蠲庖呒?xì)胞并且可用本文所述方法治療或預(yù)防的免疫病可根據(jù)引起該疾病的超敏反應(yīng)類型分類。這些反應(yīng)一般分為四種類型過敏性反應(yīng)、細(xì)胞毒(細(xì)胞溶解)反應(yīng)、免疫復(fù)合物反應(yīng)或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)反應(yīng)(也稱為延遲型超敏(DTH)反應(yīng))。(參見例如，F(xiàn)undamental Immunology(基礎(chǔ)免疫學(xué))(William E.Paul編，Raven Press，紐約，第三版，1993).) 這類免疫病的具體例子包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性脫髓鞘病(如多發(fā)性硬化、變應(yīng)性腦脊髓炎)、內(nèi)分泌性眼病、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、格拉夫斯病、腎小球腎炎、自身免疫性肝病、炎性腸病(如，克羅恩氏病)、過敏反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、舍格倫綜合征、I型糖尿病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫病、纖維肌痛、多肌炎、皮肌炎、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭、Schmidt綜合征、自身免疫性葡萄膜炎、艾迪生病、腎上腺炎、甲狀腺炎、橋本甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺病、惡性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、動脈粥樣硬化、亞急性皮膚紅斑狼瘡、甲狀旁腺功能減退癥、Dressler綜合征、自身免疫性血小板減少、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常性天皰瘡、天皰瘡、皰疹樣皮炎、斑禿、類天皰瘡、硬皮病、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病、CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著、雷諾現(xiàn)象、食管張力減低、指趾硬化和毛細(xì)血管擴(kuò)張)、男性和女性自身免疫性不育、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎、混合型結(jié)締組織病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、全身壞死性血管炎、特應(yīng)性皮炎、特應(yīng)性鼻炎、肺出血-腎炎綜合征、查加斯病、結(jié)節(jié)病、風(fēng)濕熱、哮喘、習(xí)慣性流產(chǎn)、抗磷脂抗體綜合征、農(nóng)夫肺、多形性紅斑、心臟切開術(shù)后綜合征、庫欣綜合征、自身免疫性慢性活動性肝炎、鳥商肺、中毒性表皮壞死松解癥、Alport綜合征、肺泡炎、變應(yīng)性肺泡炎、纖維性肺泡炎、間質(zhì)性肺病、結(jié)節(jié)性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應(yīng)、高安動脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、暫時性動脈炎、血吸蟲病、巨細(xì)胞性動脈炎、蛔蟲病、曲霉病、Sampter綜合征、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫病、Behcet病、Caplan綜合征、川崎病、登革熱、腦脊髓炎、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑、牛皮癬、骨髓成紅血細(xì)胞增多癥、嗜酸性筋膜炎、Shulman綜合征、費(fèi)爾蒂綜合征、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異時性睫狀體炎、Fuch睫狀體炎、IgA腎病、Henoch-Schonlein紫癜、移植物抗宿主病、移植排斥、心肌病、Eaton-Lambert綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、冷球蛋白血癥、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、伊文綜合征和自身免疫性性腺衰竭。
因此，本文所述方法包括治療B淋巴細(xì)胞病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺出血-腎炎綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病)、Th1-淋巴細(xì)胞病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、舍格倫綜合征、橋本甲狀腺炎、格拉夫斯病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、韋格納肉芽腫病、結(jié)核病或移植物抗宿主病)或者Th2-淋巴細(xì)胞病(如特應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特應(yīng)性哮喘、鼻結(jié)膜炎、過敏性鼻炎、Omenn綜合征、全身性硬化或慢性移植物抗宿主病)。通常，涉及樹突細(xì)胞的疾病包括Th1-淋巴細(xì)胞病或Th2-淋巴細(xì)胞病。
在一些實(shí)施方式中，所述免疫病是T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫病，如T細(xì)胞病，其中與疾病相關(guān)的活化T細(xì)胞表達(dá)CD70?？山o予抗-CD70結(jié)合物(如抗體或衍生物)，以消耗這種表達(dá)CD70的活化T細(xì)胞。在一個具體實(shí)施方式
中，給予抗-CD70抗體或衍生物可消耗表達(dá)CD70的活化T細(xì)胞，而所述抗-CD70或衍生物基本不消耗靜息T細(xì)胞。在本文中，“基本不消耗”指少于約60％、或少于約70％或少于約80％的靜息T細(xì)胞未被消耗。
抗-CD70結(jié)合物(如抗體和衍生物)也可用于治療或預(yù)防表達(dá)CD70的癌癥。通過給予需要治療或預(yù)防的對象有效量的抗-CD70抗體或其衍生物按照本文所述方法治療或預(yù)防表達(dá)CD70的癌癥，其中所述抗體或其衍生物(i)結(jié)合于表達(dá)CD70的癌細(xì)胞和(ii)產(chǎn)生細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制作用以消耗或抑制表達(dá)CD70的癌細(xì)胞增殖。在一些實(shí)施方式中，在不偶聯(lián)于細(xì)胞毒劑、細(xì)胞抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑的情況下產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。在一些實(shí)施方式中，通過偶聯(lián)于細(xì)胞毒劑、細(xì)胞抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用。
可用本文所述方法治療或預(yù)防的表達(dá)CD70的癌癥包括例如非霍奇金淋巴瘤的不同亞型(緩和性(indolent)NHL、濾泡性NHL、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性NHL或邊緣區(qū)NHL)；霍奇金病(如里-施細(xì)胞)；B-細(xì)胞譜系的癌癥，包括例如彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、B-細(xì)胞淋巴細(xì)胞性白血病(如急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)；EB病毒陽性B細(xì)胞淋巴瘤；腎細(xì)胞癌(如透明細(xì)胞和乳頭細(xì)胞)；鼻咽癌；胸腺癌；膠質(zhì)瘤；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；星形細(xì)胞瘤；腦膜瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；多發(fā)性骨髓瘤；以及結(jié)腸、胃和直腸癌。所述癌癥可以是(例如)新診斷的、預(yù)先治療的癌癥，或者是不應(yīng)性或復(fù)發(fā)性癌癥。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)CD70的癌癥的每個細(xì)胞含有至少約15,000、至少約10,000或至少約5,000個CD70分子。
VIII.含有抗-CD70抗體和衍生物的藥物組合物及其給藥 將含有CD70結(jié)合物(如抗-CD70抗體或衍生物)的組合物給予患有免疫病或表達(dá)CD70的癌癥或處于患免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的風(fēng)險中的對象。本發(fā)明還提供了將CD70結(jié)合物(如抗-CD70抗體或衍生物)用于制備預(yù)防或治療表達(dá)CD70的癌癥或免疫病的藥物中的應(yīng)用。本文所用術(shù)語“對象”指可給予CD70結(jié)合物的任何哺乳動物患者，包括例如人和非人哺乳動物，如靈長動物、嚙齒動物和犬。特別考慮用本文所述方法治療的對象包括人?？贵w或衍生物可單獨(dú)給藥或與其它組合物聯(lián)合給藥，以預(yù)防或治療免疫病或表達(dá)CD70的癌癥。
已知各種遞送系統(tǒng)，可用于給予CD70結(jié)合物。引入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑?？赏ㄟ^(例如)輸注或推注(如靜脈內(nèi)或皮下)、通過上皮或粘膜表層吸收(如口腔粘膜、直腸和腸道粘膜等)給予CD70結(jié)合物，并可與其它生物活性劑如化療藥一起給藥。給藥可以是全身給藥或局部給藥。
在特定實(shí)施方式中，通過注射、導(dǎo)管、栓劑或植入物給予CD70結(jié)合物組合物，所述植入物是多孔性、非多孔性或明膠狀材料，包括膜如硅橡膠膜或纖維。一般地，給予該組合物時，采用抗-CD70結(jié)合物不吸附的材料。
在其它實(shí)施方式中，用控釋系統(tǒng)遞送抗-CD70結(jié)合物。在一個實(shí)施方式中，可采用泵(參見Langer，1990，Science 2491527-1533；Sefton，1989，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，Surgery 88507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實(shí)施方式中，可采用聚合材料。(參見Medical Applications ofControlled Release(控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用)(Langer和Wise編，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance(控制的藥物生物利用度、藥物產(chǎn)品設(shè)計(jì)和性能)(Smolen和Ball編，Wiley，紐約，1984)；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361。也參見Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105.)。其它控釋系統(tǒng)參見例如Langer，同上。
CD70結(jié)合物(如抗-CD70抗體或衍生物)可作為含有治療有效量的結(jié)合物和一種或多種藥學(xué)相容性成分的藥物組合物進(jìn)行給藥。例如，該藥物組合物一般含有一種或多種藥物載體(例如無菌液體如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的無菌液體，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。靜脈內(nèi)給藥時，水是更一般的載體。也可將鹽水溶液以及右旋糖和甘油水溶液用作液體載體，具體用于注射液。合適的藥物賦形劑包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物也可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以取溶液劑、懸液劑、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋制劑等形式。也可用傳統(tǒng)的粘合劑和載體如甘油三酯將該組合物配制成栓劑。口服制劑可包含標(biāo)準(zhǔn)載體如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的例子參見E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”(雷明頓藥物科學(xué))。這種組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)(一般是純化形式)和合適量的載體，以便提供適于給予患者的形式。該制劑對應(yīng)于給藥方式。
在典型的實(shí)施方式中，按照常規(guī)方法將藥物組合物配制成適合靜脈內(nèi)給予人的藥物組合物。一般地，靜脈內(nèi)給藥的組合物是用無菌等滲水性緩沖液配制的溶液。需要時，該藥物也可包含增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。通常，這些成分分別提供或者混合在單位劑型中，例如，以凍干粉末或無水濃縮物的形式在標(biāo)明活性物質(zhì)的量的密封容器如安瓿或藥囊(sachette)中提供。準(zhǔn)備通過輸注給藥時，可用含有無菌藥物級水或鹽水的輸注瓶配制藥物。準(zhǔn)備注射給藥時，可提供含有無菌注射用水或鹽水的安瓿，以便在注射前混合成分。
另外，可以藥盒的形式提供藥物組合物，所述藥盒包含(a)含有凍干形式的CD70結(jié)合物(如抗-CD70抗體或衍生物)的容器和(b)含有藥學(xué)上可接受的注射用稀釋劑(如無菌水)的第二容器。藥學(xué)上可接受的稀釋劑可用于重建或稀釋凍干的抗-CD70抗體或衍生物。所述容器可任選地與一告知單結(jié)合，該告知單的形式由管理藥品和生物制品的生產(chǎn)、使用和銷售的政府部門指定，該告知單應(yīng)反映出制造、使用或銷售管理部門批準(zhǔn)該藥品用于給予人類的信息。
可利用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定能有效治療或預(yù)防免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的CD70結(jié)合物(如抗-CD70抗體或衍生物)的用量。此外，可任選地利用體外試驗(yàn)幫助確定最優(yōu)劑量范圍。用于制劑的準(zhǔn)確劑量也取決于給藥途徑和免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的狀況，應(yīng)按照醫(yī)師的判斷和各患者的情況來確定。可由獲自體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推得到有效劑量。
例如，可用測定LD50(使50％群體死亡的劑量)和ED50(在50％群體中有效治療的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測定抗-CD70抗體或其衍生物在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中的毒性和療效。毒性和療效的劑量比為治療指數(shù)，可表示為LD50/ED50。優(yōu)選治療指數(shù)大的CD70結(jié)合物(如抗-CD70抗體或衍生物)。CD70結(jié)合物具有毒性副作用時，可采用使CD70結(jié)合物靶向患病組織位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)，以最大程度降低對不表達(dá)CD70的細(xì)胞的潛在損傷，從而減小副作用。
可將獲自細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動物研究的數(shù)據(jù)用于形成人用劑量范圍。CD70結(jié)合物的劑量一般在包括ED50但毒性很小或無毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。在此范圍內(nèi)，劑量可取決于所用劑型和所用的給藥途徑。就用于此方法的CD70結(jié)合物而言，最初可通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估計(jì)治療有效劑量?？稍趧游锬Ｐ椭写_定一個劑量，以使循環(huán)血漿濃度范圍包含細(xì)胞培養(yǎng)中測定的IC50(即對癥狀實(shí)現(xiàn)半數(shù)最大抑制的測試化合物濃度)?？捎么诵畔⒏鼫?zhǔn)確地確定人用劑量?？刹捎?例如)高效液相色譜測定血漿中的濃度。
通常，給予患有免疫病或表達(dá)CD70的癌癥的患者的抗-CD70抗體或衍生物的劑量約為0.1mg/kg體重-100mg/kg體重。更一般地，給予對象的劑量為0.1mg/kg體重-50mg/kg體重，更一般為1mg/kg-30mg/kg、1mg/kg-20mg/kg、1mg/kg-15mg/kg、1mg/kg-12mg/kg、1mg/kg-10mg/kg、or 1mg/kg-7.5mg/kg體重。通常，由于對外來蛋白的免疫應(yīng)答，人抗體在人體內(nèi)的半衰期長于其它物種來源的抗體。因此，常?？赡懿捎幂^低劑量的含有人源化或嵌合抗體的抗-CD70抗體或衍生物和較低的給藥頻率。
抗-CD70結(jié)合物的劑量可以(例如)每天、每周一次(每周)、每周兩次、每周三次、每周四次、每周五次、每兩周、每月或其它需要的頻率給藥。
在一些實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物的劑量對應(yīng)于次優(yōu)劑量(即低于抗-CD70結(jié)合物(如抗體藥物偶聯(lián)物)的EC50)。例如，抗-CD70結(jié)合物的劑量可包括選自治療窗口的最低25％、最低15％、最低10％或最低5％的劑量。本文所用術(shù)語“治療窗口”指提供安全有效治療的藥物劑量范圍或其在身體系統(tǒng)中的濃度范圍。
在一些實(shí)施方式中，抗-CD70結(jié)合物(如抗體藥物偶聯(lián)物)的劑量為約0.05mg/kg-1mg/kg，或約0.1mg/kg-0.9mg/kg，或約0.15-0.75mg/kg體重。此劑量可每周給藥1-約15次。各劑量可以相同或不同。例如，約0.15mg/kg抗-CD70結(jié)合物的劑量可每四天、每五天、每六天或每七天給予1-10次。
在一些實(shí)施方式中，含有CD70結(jié)合物的藥物組合物還可包含治療劑(如非偶聯(lián)的細(xì)胞毒劑或免疫調(diào)節(jié)劑，例如，本文所述的那些)。抗-CD70結(jié)合物也可與一種或多種治療劑聯(lián)合給藥，以治療或預(yù)防免疫病或表達(dá)CD70的癌癥。例如，聯(lián)合治療可包括治療劑(如細(xì)胞抑制劑、細(xì)胞毒劑或免疫調(diào)節(jié)劑，如未偶聯(lián)的細(xì)胞抑制劑、細(xì)胞毒劑或免疫調(diào)節(jié)劑，如通常用于治療癌癥或免疫病的藥物)。聯(lián)合治療也可包括例如，給予靶向活化淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的表面上除CD70以外的受體或受體復(fù)合物的藥物。這種藥物的例子包括結(jié)合于活化淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞的表面分子的第二種非-CD70抗體。另一個例子包括靶向此種受體或受體復(fù)合物的配體。一般地，這種抗體或配體結(jié)合于活化淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體，并通過將細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性信號遞送給活化的淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞或表達(dá)CD70的癌細(xì)胞而提高抗-CD70抗體的細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制作用。這種聯(lián)合給藥可以對疾病參數(shù)(如癥狀嚴(yán)重程度、癥狀數(shù)量或復(fù)發(fā)頻率)產(chǎn)生加成或協(xié)同作用。
提到聯(lián)合給藥的治療方案，在一個具體實(shí)施方式
中，抗-CD70結(jié)合物與治療劑同時給藥。在另一具體實(shí)施方式
中，在給予抗-CD70抗體或衍生物之前或之后至少1小時、至多數(shù)月，例如在給予抗-CD70抗體或衍生物之前或之后至少1小時、5小時、12小時、1天、1周、1個月或3個月給予該治療劑。在一些實(shí)施方式中，在給予抗-CD70結(jié)合物、任選給予該治療劑后監(jiān)測對象。
該治療劑可以是(例如)對癌細(xì)胞或活化免疫細(xì)胞產(chǎn)生療效的任何物質(zhì)。一般地，該治療劑是細(xì)胞毒劑或免疫調(diào)節(jié)劑。這種聯(lián)合給藥可對疾病參數(shù)(如癥狀嚴(yán)重程度、癥狀數(shù)量或復(fù)發(fā)頻率)產(chǎn)生加成或協(xié)同作用。
細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)劑的有用種類包括，例如抗微管劑、耳他汀、DNA小溝結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑，烷化劑(如，鉑復(fù)合物如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)和三環(huán)鉑復(fù)合物以及卡鉑)、蒽環(huán)類抗生素、抗生素、抗葉酸、抗代謝劑、化療增敏劑、多卡霉素(duocarmycin)、依托泊甙、氟嘧啶、離子載體、lexitropsins、亞硝基脲、順鉑順氯氨鉑、預(yù)成化合物(pre-forming compound)、嘌呤抗代謝劑、嘌呤霉素、放療增敏劑、類固醇、紫杉烷，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，長春花屬生物堿等。
單獨(dú)的細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)劑包括，例如雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮雜胞苷、硫唑嘌呤、博來霉素、白消安、丁硫氨酸硫酸亞胺、喜樹堿、卡鉑、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙素、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、胞苷阿糖胞苷、松胞菌素B、達(dá)卡巴嗪、放線菌素d(放線菌素)、道諾霉素、德卡巴嗪(decarbazine)、多西他賽、多柔比星、雌激素、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短桿菌肽D、羥基脲、黃膽素、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、絲裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼、雷帕霉素(西羅莫司)、鏈脲霉素、替諾泊甙(tenoposide)、6-硫鳥嘌呤、硫替派、拓?fù)涮婵怠㈤L春堿、長春新堿、長春瑞濱、VP-16和VM-26。
在典型的實(shí)施例中，治療劑為細(xì)胞毒劑。合適的細(xì)胞毒劑包括，例如多拉司他汀(如耳他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小溝粘合劑(如烯二炔和lexitropsin)、多卡霉素、紫杉烷(如紫杉醇和多西他賽)、嘌呤霉素、長春花屬生物堿、CC-1065、SN-38、拓?fù)涮婵?、嗎啉?多柔比星、根霉素、氰基嗎啉代-多柔比星、棘霉素、考布他汀、紡錘菌素、大環(huán)內(nèi)酯A和B、雌莫司汀、隱花素(cryptophysin)、西馬多丁、類美坦西醇、discodermolide、五加素(eleutherobin)和米托蒽醌。
在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑為常規(guī)化療藥，如多柔比星、紫杉醇、美法侖、長春花屬生物堿、甲氨蝶呤、絲裂霉素C或依托泊甙。在一些實(shí)施方式中，治療劑可為組合療法，如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、潑尼松龍和長春新堿)、CHOP-R(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松龍和利妥昔單抗)或ABVD(多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)。試劑如CC-1065同系物、卡奇霉素、美登素、多拉司他汀10的同系物、根霉素和水螅毒素可與抗-CD70抗體或其衍生物連接。
在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞毒或細(xì)胞抑制劑為耳他汀E(本領(lǐng)域也稱為多拉司他汀-10)或其衍生物。一般地，耳他汀E衍生物為，如耳他汀E與酮酸形成的酯。例如，耳他汀E可與對乙酰苯甲酸或苯甲酰戊酸反應(yīng)分別產(chǎn)生AEB和AEVB。其它典型耳他汀衍生物包括AFP、MMAF和MMAE。耳他汀E及其衍生物的合成和結(jié)構(gòu)參見美國專利申請公開號20030083263和20050009751)，國際專利申請?zhí)朠CT/US03/24209，國際專利申請?zhí)朠CT/US02/13435和美國專利號6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414中。
在特定實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑為DNA小溝結(jié)合物(參見例如，美國專利號6,130,237)。例如，在一些實(shí)施方式中，小溝結(jié)合物為CBI化合物。在其它實(shí)施方式中，小溝結(jié)合物為烯二炔(如卡奇霉素)。
抗微管劑包括但不限于紫杉烷(如

(紫杉醇)、

(多西他賽))、T67(Tularik)、長春堿(如長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱)和多拉司他汀(如耳他汀E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其它抗微管劑包括，例如漿果赤霉素衍生物、紫杉烷類似物(如大環(huán)內(nèi)酯A和B)、諾考達(dá)唑、秋水仙素和秋水仙胺、雌莫司汀、隱花素、西馬多丁、類美坦西醇、考布他汀、discodermolide和五加素。
在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑為類美坦西醇，它是另一類抗微管劑。例如，在特定實(shí)施方式中，類美坦西醇為美登素或DM-1(ImmunoGen，Inc.；參見Chari等，1992，Cancer Res.52127-131)。
在一些實(shí)施方式中，治療劑不是放射性同位素。在一些實(shí)施方式中，治療劑不是蓖麻毒蛋白或皂草毒蛋白。
在某些實(shí)施方式中，治療劑為抗VEGF試劑，如阿瓦斯汀(貝伐單抗)或多吉美(索拉非尼)；PDGF阻斷劑，如SUTENT(蘋果酸舒尼替尼)；或激酶抑制劑，如多吉美(甲苯磺酸索拉非尼)。
在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)劑為抗代謝劑?？勾x劑可以是(例如)嘌呤拮抗劑(如氮雜硫代嘌呤(azothioprine)或麥考酚酸嗎乙酯)、二氫葉酸還原酶抑制劑(如，甲氨蝶呤)、阿昔洛韋、更昔洛韋、齊多夫定、阿糖腺苷、利巴韋林、疊氮胸苷、胞苷阿糖胞苷、金剛烷胺、脫氧尿苷、二氯脫氧尿苷、poscarnet或三氟尿苷。
在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞毒或免疫調(diào)節(jié)劑為他克莫司、環(huán)孢霉素或雷帕霉素。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞毒劑為阿地白介素、阿來組單抗、阿利維A酸、別嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、蓓薩羅丁、蓓薩羅丁、卡普睪酮、卡培他濱、塞來考昔、克拉屈濱、Darbepoetin alfa、地尼白介素-毒素連接物、右雷佐生、丙酸屈他雄酮、表柔比星、阿法依伯汀、雌莫司汀、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、氟維司群、吉西他濱、吉妥單抗、戈舍瑞林、黃膽素、異環(huán)磷酰胺、甲磺酰伊馬替尼、干擾素a-2a、伊立替康、來曲唑、甲酰四氫葉酸、左咪唑、meclorethamine或氮芥、甲地孕酮、巰乙磺酸鈉、甲氨蝶呤、甲氧沙林、絲裂霉素C、米托坦、苯丙酸諾龍、奧普瑞白介素、奧沙利鉑、帕米膦酸二鈉、培加酶、培門冬酶、pegfilgrastim、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟芬姆鈉、丙卡巴肼、奎吖因、拉布立酶、沙莫司亭、鏈佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪內(nèi)酪、硫鳥嘌呤、托瑞米芬、托西莫單抗、曲妥珠單抗、維A酸、烏拉莫司汀、戊柔比星、長春堿、長春新堿、長春瑞濱或唑來膦酸鹽。
在其它實(shí)施方式中，治療劑為抗體，如人源化抗HER2單克隆抗體，美羅華(利妥昔單抗；基因泰克公司(Genentech)；嵌合抗CD20單克隆抗體)；OVAREX(阿爾他雷克斯公司(AltaRex Corporation)，MA)；PANOREX(葛蘭素衛(wèi)康公司(GlaxoWellcome)，NC；鼠IgG2a抗體)；西妥昔單抗愛必妥(依克隆系統(tǒng)公司(ImcloneSystems Inc.)，NY；抗EGFR IgG嵌合抗體)；Vitaxin(藥物免疫公司(MedImmune，Inc.)，MD；Campath I/H(瘤克斯公司(Leukosite)，MA；人源化IgG1抗體)；SmartMI95(蛋白設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室公司(Protein Design Labs，Inc.)，CA；人源化抗CD33IgG抗體)；LymphoCide(免疫醫(yī)學(xué)公司(Immunomedics，Inc.)，NJ；人源化抗CD22 IgG抗體)；Smart ID10(蛋白設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室公司(Protein Design Labs，Inc.)，CA；人源化抗HLA-DR抗體)；Oncolym(替尼克隆公司(Techniclone，Inc.)，CA；放射性標(biāo)記的鼠抗HLA-Dr10抗體)；Allomune(生物移植物公司(BioTransplant)，CA；人源化抗CD2mAb)；阿瓦斯汀(基因泰克公司(Genentech，Inc.)，CA；抗VEGF人源化抗體)；依帕珠單抗(免疫醫(yī)學(xué)公司(Immunomedics，Inc.)，NJ和Amgen，CA；抗CD22抗體)；CEAcide(免疫醫(yī)學(xué)公司(Immunomedics)，NJ；人源化抗CEA抗體)；或抗CD40抗體(如美國專利號6,838,261所公開)。
其它合適的抗體包括但不限于抗下列抗原的抗體CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis Y、Lewis X、甲胎蛋白、CA 242、胎盤堿性磷酸酶、前列腺特異性膜抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生長因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、p97、MUC1-KLH、CEA、gp100、MART1、前列腺特異性抗原、IL-2受體、CD20、CD52、CD30、CD33、CD22、人絨毛膜促性腺素、CD38、CD40、粘液素、P21、MPG和Neu癌基因產(chǎn)物。
在一些實(shí)施方式中，治療劑為免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑可為(例如)更昔洛韋、依那西普、他克莫司、環(huán)孢霉素、雷帕霉素、REVLIMID(來那度胺)、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、麥考酚酸嗎乙酯或甲氨蝶呤?；蛘撸庖哒{(diào)節(jié)劑可為(例如)糖皮質(zhì)激素(如氫化可的松或醛固酮)或糖皮質(zhì)激素同系物(如氯潑尼松或地塞米松)。
在通常的實(shí)施方式中，免疫抑制劑為消炎劑，如芳基羧基衍生物、含吡唑的衍生物、奧昔康衍生物和煙堿酸衍生物。消炎劑類包括例如，環(huán)加氧酶抑制劑、5-脂肪氧合酶抑制劑和白三烯受體拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，免疫調(diào)節(jié)劑為細(xì)胞因子，如G-CSF、GM-CSF或IL-2。
合適的環(huán)加氧酶抑制劑包括甲氯芬那酸、甲芬那酸、卡洛芬、雙氯芬酸、二氟尼柳、芬布芬、非諾洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、萘丁美酮、萘普生、舒林酸、替諾昔康、托美丁和乙?；畻钏?。
合適的脂肪氧合酶抑制劑包括氧化還原抑制劑(如鄰苯二酚丁烷衍生物、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)、馬索羅酚、菲尼酮、Ianopalen、吲唑啉酮、那法扎瓊、呋喃酚、烷基羥胺)和非氧化還原抑制劑(如羥基噻唑、甲氧基烷基噻唑、苯并吡喃及其衍生物、甲氧基四氫吡喃、乳香酸和乳香酸乙?；苌锖铜h(huán)烷基取代的喹啉甲氧基苯基乙酸)和氧化還原抑制劑前體。
其它合適的脂肪氧合酶抑制劑包括抗氧化劑(如苯酚、沒食子酸丙酯、類黃酮和/或天然產(chǎn)生的含類黃酮底物、黃酮羥基化衍生物、黃酮醇、二氫五羥黃酮、毛地黃黃酮、毛地黃黃酮、二羥四氫黃酮、查耳酮衍生物、4，2’，4’-三羥基查耳酮、鄰氨基苯酚、N-羥基脲、呋喃酚、依布硒以及提高還原含硒酶活性的物質(zhì))、離子螯合劑(如氧肟酸及其衍生物、N-羥基脲、2-芐基-1-萘酚、鄰苯二酚、羥胺、carnosol trolox C、鄰苯二酚、萘酚、柳氮磺吡啶、zyleuton、5-羥基鄰氨基苯甲酸和4-(ω-芳基烷基)苯基鏈烷酸)、含咪唑化合物(如酮康唑和伊曲康唑)、吩噻嗪和苯并吡喃衍生物。
其它合適的脂肪氧合酶抑制劑還可包括二十酸抑制劑(如十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳六烯酸和二十二碳六烯酸及其酯、PGE1(前列腺素E1)、PGA2(前列腺素A2)、維前列醇、15-單羥基二十碳四烯酸、15-單羥基-二十碳三烯酸和15-單羥基二十碳五烯酸和白三烯B5、C5和D5)、干擾鈣流的化合物、吩噻嗪、二苯基丁基胺、維拉帕米、fuscoside、姜黃素、氯原酸、咖啡酸、5，8，11，14-二十碳四烯酸(ETYA)、羥基苯基維胺脂、Ionapalen、七葉苷、二乙基乙胺嗪、菲咯啉(phenantroline)、黃芩素、普昔羅米、硫醚、二烯丙基一硫醚和二-(1-丙烯基)硫。
白三烯受體拮抗劑包括骨化三醇、昂唑司特、Bayer Bay-x-1005、Ciba-GeigyCGS-25019C、依布硒、Leo Denmark ETH-615、Lilly LY-293111、Ono ONO-4057、Terumo TMK-688、Boehringer Ingleheim BI-RM-270、Lilly LY 213024、Lilly LY264086、Lilly LY 292728、Ono ONO LB457、Pfizer 105696、Perdue Frederick PF10042、Rhone-Poulenc Rorer RP 66153、SmithKline Beecham SB-201146、SmithKline Beecham SB-201993、SmithKline Beecham SB-209247、SearleSC-53228、Sumitamo SM 15178、American Home Products Way 121006、BayerBay-o-8276、Warner-Lambert CI-987、Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982、Lilly LY 233569、Lilly LY-255283、MacroNex MNX-160、Merck and Co.MK-591、Merck and Co.MK-886、Ono ONO-LB-448、Purdue Frederick PF-5901、Rhone-Poulenc Rorer RG 14893、Rhone-Poulenc Rorer RP 66364、Rhone-PoulencRorer RP 69698、Shionoogi S-2474、Searle SC-41930、Searle SC-50505、SearleSC-51146、Searle SC-52798、SmithKline Beecham SKandF-104493、Leo DenmarkSR-2566、Tanabe T-757和Teijin TEI-1338。
通過下述實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，它們不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所述細(xì)胞系培養(yǎng)于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)或德國不倫瑞克的德國生物材料資源中心有限公司(Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)(DMSZ)所限定的條件或其它已知培養(yǎng)條件下。細(xì)胞培養(yǎng)試劑獲自加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corp.)。
實(shí)施例1人源化抗-CD70抗體變體的生產(chǎn) SEQ ID NO1、2、21和22分別列舉了抗CD70鼠單克隆抗體1F6及其嵌合變體c1F6的核苷酸和氨基酸序列。(另參見2005年1月19日提交的美國專利申請?zhí)?0/645,355)。人源化c1F6的人接受體序列選自人種系外顯子VH、JH、Vκ和Jκ序列。c1F6VH結(jié)構(gòu)域人源化的接受體序列選自種系VH外顯子VH1-18(Matsuda等，1993，Nature Genetics 388-94)或VH1-2(Shin等，1991，EMBO J.103641-3645)和JH外顯子JH-6(Mattila等，1995，Eur.J.Immunol.252578-2582)。種系Vκ外顯子B3(Cox等，1994，Eur.J.Immunol.24827-836)和Jκ外顯子Jκ-1(Hieter等，1982，J.Biol.Chem.2571516-1522)選作c1F6 VL結(jié)構(gòu)域人源化的接受體序列。將根據(jù)Kabat定義確定的1F6鼠CDR移植到所選人種系模板中。簡要說，產(chǎn)生跨越人源化VH或VL結(jié)構(gòu)域的合成重疊寡核苷酸并利用PCR重疊延伸來組裝各結(jié)構(gòu)域。利用摻入PCR產(chǎn)物的限制性位點(diǎn)將VH和VL結(jié)構(gòu)域定向克隆到pCMV表達(dá)載體中，分別與人IgG1恒定區(qū)或κ恒定區(qū)處于同一閱讀框中。
選擇數(shù)個框架位置以重新引入小鼠供體殘基。根據(jù)Kabat編號規(guī)則，它們是VH結(jié)構(gòu)域中的H46、H67、H68、H69、H70、H71、H80、H81、H82、H82A和H91位置。盡管選擇小鼠L25和L33位置上CDR1殘基用來引入該位置的人接受體殘基，但沒有改變VL結(jié)構(gòu)域中的框架位置。
可通過在VH結(jié)構(gòu)域中摻入小鼠框架供體殘基或在VL結(jié)構(gòu)域中摻入人CDR殘基的不同組合產(chǎn)生數(shù)種人源化1F6變體。下表2和表3中小結(jié)了這些變體。
表2 表3 圖1和圖2顯示具有鼠和人VH序列的一些人源化變體間的差別。圖1顯示人源化1F6VH變體hVHE和hVHJ與1F6mVH和人種系VH外顯子VH1-2和JH外顯子JH6間的比對。圖2顯示人源化1F6 VH變體hVHH和hVHM與1F6 mVH和人種系VH外顯子VH1-18和JH外顯子JH6間的比對。圖3顯示人源化1F6 VL變體hVLA與1F6 mVL和人種系Vκ外顯子B3和Jκ外顯子Jκ-1間的比對。
實(shí)施例2人源化1F6變體的結(jié)合親和力 選擇人源化1F6變體HDLA(hVHD和hVLA)、HHLA(hVHH和hVLA)和HJLA(hVHJ和hVLA)進(jìn)行結(jié)合親和力分析。在293細(xì)胞中瞬時表達(dá)人源化抗體和c1F6各1mg，采用Eu-N1碘代乙酰胺基螯合物(Perkin Elmer)以銪標(biāo)記。評估各標(biāo)記抗體與一系列CD70陽性細(xì)胞系的飽和結(jié)合。選擇的細(xì)胞系是ACHN、Caki-2、Caki-1和786-O，經(jīng)定量流式細(xì)胞術(shù)(或熒光活化的細(xì)胞分選即FACS)測定，抗原拷貝數(shù)/細(xì)胞分別為30,000、99,000、235,000和252,000。
在96孔板中將不同濃度的銪-標(biāo)記抗體與細(xì)胞一起4℃培育1小時。培育后，通過將細(xì)胞重懸于增強(qiáng)緩沖液(Perkin Elmer)釋放銪。用Fusion HT平板閱讀器以頂部檢測器形式以及335nm的激發(fā)光和620nm的發(fā)射光讀出熒光。用GraphPad Prism 4將數(shù)據(jù)擬合至單結(jié)合位點(diǎn)雙曲線。結(jié)果見下表4。
表4
人源化變體的KD值與c1F6對所有測試細(xì)胞系的KD值非常類似，這驗(yàn)證了該人源化方法不顯著降低抗原結(jié)合活性。
實(shí)施例3人源化1F6的ADCC活性 采用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗(yàn)測定人源化1F6抗體變體介導(dǎo)對抗CD70+細(xì)胞系WIL2-S、786-O和769-P的ADCC的能力。人源化1F6的HHLA、HJLA和HELA變體以劑量依賴性方式等同地裂解了WIL-2S靶細(xì)胞。相反，用CD70結(jié)合性鼠1F6(m1F6)或非結(jié)合性對照人Ig(hIg)處理的腫瘤細(xì)胞未被殺死(圖4A)。相似地，人源化1F6以與嵌合1F6相當(dāng)?shù)姆绞浇閷?dǎo)兩種腎細(xì)胞癌靶點(diǎn)的裂解(圖4B)。
實(shí)施例4人源化1F6的CDC活性 用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(LP-1)和兩種淋巴瘤細(xì)胞系(MHH PreB-1和WIL2-S)檢測人源化1F6介導(dǎo)CDC的能力。在正常人血清存在下用梯度劑量的嵌合1F6、人源化1F6HJLA或非結(jié)合性人Ig對照處理靶細(xì)胞。37℃培育2小時后，加入碘化丙錠(5μg/mL)后用流式細(xì)胞術(shù)鑒定裂解的細(xì)胞。認(rèn)為被碘化丙錠染色的細(xì)胞由于抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體活化和膜攻擊復(fù)合物的形成，已失去膜完整性。用此試驗(yàn)，嵌合1F6和人源化1F6以等同方式介導(dǎo)各靶點(diǎn)的劑量依賴性裂解(圖5)。
實(shí)施例5人源化1F6的ADCP活性 用紅色熒光膜染料預(yù)標(biāo)記的CD70+腎細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O檢測人源化1F6介導(dǎo)細(xì)胞吞噬的能力。用梯度劑量的嵌合1F6、人源化1F6HJLA或非結(jié)合性人Ig對照處理靶細(xì)胞，然后將靶細(xì)胞與獲自GM-CSF中培養(yǎng)的貼壁外周血單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞混合。37℃培育1小時后，用巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b的綠色熒光抗體檢測巨噬細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，通過紅色和綠色熒光雙染來鑒定吞噬了腫瘤細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。用熒光顯微鏡術(shù)驗(yàn)證了雙陽性群體中巨噬細(xì)胞內(nèi)存在腫瘤細(xì)胞的情況。如圖6所示，嵌合和人源化1F6有助于以抗體-劑量依賴性方式吞噬靶細(xì)胞，并達(dá)到相同程度。相反，用非結(jié)合性對照抗體培育的靶細(xì)胞很少被巨噬細(xì)胞吞噬。
實(shí)施例6人源化1F6變體藥物偶聯(lián)物的體外細(xì)胞毒活性 人源化1F6變體HELA(hVHE和hVLA)、HHLA、HJLA和HMLA(hVHM和hVLA)和c1F6在293細(xì)胞中瞬時表達(dá)，將它們偶聯(lián)于vcMMAF(參見美國序列號10/983,340；作為美國專利公開號2005-0238649于2005年10月27日公開)，加樣水平為每個抗體平均對應(yīng)8個藥物單位。檢測得到的偶聯(lián)物h1F6HELA-F8、h1F6HHLA-F8、h1F6HJLA-F8、h1F6HMLA-F8和c1F6-F8對兩種表達(dá)CD70的細(xì)胞系786-O和Caki-1的細(xì)胞毒作用。將該偶聯(lián)物與細(xì)胞一起培育92小時，然后加入50μM刃天青。培育4小時后，用Fusion HT熒光平板閱讀器(Packard Instruments，康涅狄格州梅里登)檢測染料還原。三復(fù)孔的結(jié)果見下表5。在兩種測試細(xì)胞系上，所有四種人源化變體的IC50值在c1F6的IC50值的兩倍以內(nèi)，強(qiáng)度排序?yàn)閏1F6-F8＞h1F6HHLA-F8＞h1F6HMLA-F8＞h1F6HJLA-F8＞h1F6HELA-F8。
表5 實(shí)施例7人源化1F6藥物偶聯(lián)物的體內(nèi)篩選 人源化1F6變體HDLA、HHLA、HJLA和HELA在293細(xì)胞中瞬時表達(dá)，將它們偶聯(lián)于mcMMAF(參見美國序列號10/983,340；作為美國專利公開號2005-0238649于2005年10月27日公開)，加樣水平為每個抗體對應(yīng)8個藥物單位。在裸小鼠的786-O腎細(xì)胞癌實(shí)體瘤模型中進(jìn)行了單一劑量3mg/kg或10mg/kg的效能研究。在腫瘤植入后80天中定期測定腫瘤體積。結(jié)果表明，與未治療小鼠相比，所有治療小鼠的腫瘤體積顯著減小，偶聯(lián)于mcMMAF的所有人源化1F6變體與c1F6mcMMAF的效能相當(dāng)。
實(shí)施例8在彌散性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的SCID小鼠異種移植瘤模型中人源化1F6的體內(nèi)活性 在彌散性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤異種移植瘤小鼠模型中檢測了人源化1F6(HJLA)的體內(nèi)抗腫瘤活性。為了建立彌散性疾病，將1×106Raji或1×107MM1.S或L363細(xì)胞注射到C.B.-17SCID小鼠的尾靜脈中。將人源化1F6(HJLA)或?qū)φ辗墙Y(jié)合性抗體通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射給予小鼠(Raji)，每四天給藥一次，共給藥6次，或者通過靜脈內(nèi)注射到側(cè)尾靜脈中給予小鼠(MM.1S和L363)，從植入細(xì)胞1天后開始每周給藥一次，共給藥4周。需要處死的疾病表現(xiàn)為弓狀體態(tài)以及缺少理毛行為、體重下降、顱腫脹和后肢癱瘓，或者在L363荷瘤小鼠中發(fā)生可觸知的淋巴組織相關(guān)腫瘤。
結(jié)果顯示，各腫瘤模型中(圖7A、7B和7C)，與未治療的小鼠或接受非結(jié)合性對照抗體的小鼠相比，用人源化1F6治療的小鼠的存活期顯著延長。通過測定單個小鼠血清中腫瘤衍生的單克隆蛋白(λ輕鏈)的水平在多發(fā)性骨髓瘤異種移植瘤(L363和MM.1S細(xì)胞)中進(jìn)一步評估了人源化1F6治療的作用。如圖7B和7C(右側(cè))所示，與未治療的小鼠相比，用人源化1F6治療的小鼠的循環(huán)λ輕鏈濃度顯著較低。用人源化1F6治療的L363荷瘤小鼠的λ輕鏈的平均血清濃度為0.006μg/mL，而未治療小鼠的血清濃度為0.10μg/mL。相似地，人源化1F6治療的MM.1S荷瘤小鼠的λ輕鏈濃度為0.03μg/mL，而未治療小鼠為1.25μg/mL。這些結(jié)果與小鼠存活率提高相符(圖7B和7C，右側(cè))。
實(shí)施例9人源化1F6抗體體外消耗CD70+抗原-特異性T細(xì)胞 為了檢驗(yàn)人源化1F6抗體消耗抗原特異性活化T細(xì)胞的能力，在存在或不存在不同濃度的人源化抗-CD70抗體的情況下，用M1肽刺激表達(dá)HLA-A0201的正常供體的PBMC。如上所述制備人源化1F6抗體(HJLA)。以0.5×106個細(xì)胞/ml的濃度將PBMC接種于24孔板，所用培養(yǎng)基為含有5μg/ml M1肽的補(bǔ)充有IL-2和IL-15的2ml培養(yǎng)基。第5天，用含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基替代一半培養(yǎng)物上清液。第9天，用流式細(xì)胞術(shù)分析用FITC-偶聯(lián)的抗Vβ17-和PE-Cy5-偶聯(lián)的抗-CD8抗體染色的細(xì)胞，從而確定抗原反應(yīng)性細(xì)胞(CD8+/Vβ17+群體)的百分?jǐn)?shù)。
圖8A顯示，在沒有抗體的情況下，抗原特異性CD8+/Vβ17+細(xì)胞擴(kuò)增至占培養(yǎng)的所有活細(xì)胞的33％。相反，在第0天向培養(yǎng)物中加入人源化1F6能以抗體-劑量依賴性方式顯著限制抗原反應(yīng)性群體的擴(kuò)增。這些結(jié)果顯示，人源化1F6能選擇性靶向抗原活化的T細(xì)胞并防止其擴(kuò)增。
在第二項(xiàng)研究中(圖8B)，在不存在或存在特異性阻斷FcγRIII(CD16)的抗體的情況下，不用或用人源化1F6處理M1-肽刺激的培養(yǎng)物。在未處理的培養(yǎng)物中，抗原特異性CD8+Vβ17+群體擴(kuò)增至占培養(yǎng)物中所有活細(xì)胞的39％。加入人源化1F6能顯著降低反應(yīng)性群體的擴(kuò)增。用抗CD16特異性抗體阻斷FcγRIII受體時，很大程度上逆轉(zhuǎn)了這種活性，這表明肽-反應(yīng)性細(xì)胞的缺失是通過人源化1F6與攜帶FcgRIII的效應(yīng)物細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)的。
實(shí)施例10抗-CD70抗體不影響抗原-陰性旁觀細(xì)胞 為了確定1F6-介導(dǎo)的消耗對抗原陰性旁觀T細(xì)胞的影響，在用或不用1F6嵌合變體(c1F6)(人IgG1同種型)處理的M1活化培養(yǎng)物上檢測CD4和CD8淋巴細(xì)胞的TCR Vβ家族代表(representation)，并與靜息的非抗原刺激的PBMC作比較。嵌合和人源化1F6變體的結(jié)合親和力、介導(dǎo)效應(yīng)物功能的能力和消耗活化CD8+T細(xì)胞亞組的能力相當(dāng)。
如圖9所示，用M1肽刺激HLA-A0201+PBMC會引起攜帶Vβ17 TCR的CD8+細(xì)胞擴(kuò)增約30倍，而CD8+細(xì)胞中檢測的所有其它Vβ TCR家族和CD4細(xì)胞群體中檢測的所有家族的改變很小。在對照群體中，細(xì)胞擴(kuò)增僅限于Vβ17+CD8+T細(xì)胞亞組，它從＜1％CD8+細(xì)胞增加至27％；此觀察結(jié)果驗(yàn)證了M1-肽免疫應(yīng)答的特異性。與在不存在CD 70-特異性抗體的情況下刺激的T細(xì)胞不同，將c1F6抗體加入培養(yǎng)物能防止M1-肽特異性CD8+細(xì)胞擴(kuò)增。在c1F6抗體的存在下，Vβ17+CD8+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與靜息的未經(jīng)肽刺激的細(xì)胞相當(dāng)。c1F6抗體處理不能顯著破壞其它CD8+或CD4+VβTCR家族的相對值；沒有觀察到一組被清除。這些數(shù)據(jù)表明，接觸c1F6抗體能選擇性消耗CD70+活化的T細(xì)胞，而不對旁觀T細(xì)胞群體產(chǎn)生可檢測的并行損傷。
實(shí)施例11腎細(xì)胞癌的小鼠異種移植瘤模型 用786-O皮下異種移植物模型評價以不同劑量和方案給藥的抗-CD70ADC的抗腫瘤活性。通過植入約30mm3的腫瘤片段(N＝5或6只/組)在裸小鼠中種入皮下786-O腫瘤。使腫瘤建立生長，當(dāng)平均腫瘤體積約為100mm3時開始治療。用游標(biāo)卡尺測定腫瘤大小以監(jiān)測其生長。用下式計(jì)算腫瘤大小(長×寬2)/2。在不進(jìn)行任何治療的情況下，腫瘤植入后40-50天平均腫瘤體積增加到約600mm3(參見圖10A)。在接受人源化1F6-mcMMAF4(HJLA，加載水平為每個抗體平均4個藥物單元)或人源化1F6-vcMMAF4(HJLA，加載水平為每個抗體平均4個藥物單元)的小鼠中觀察到腫瘤生長抑制的劑量-依賴性作用。甚至在0.5和0.17mg/kg h1F6-mcMMAF4和h1F6-vcMMAF4中，都分別檢測到腫瘤生長的延遲。
也通過腫瘤大小增大為4倍所需的時間來評估腫瘤生長(參見圖10B)。用0.17mg/kg的h1F6-mcMMAF4或h1F6-vcMMAF4治療顯著延遲了腫瘤生長。以q4dx4或q4dx10方案給予ADC時觀察到這種延遲。然而，與q4dx4方案相比，q4dx10方案所列的增加的給藥似乎具有更強(qiáng)的生長抑制活性。
實(shí)施例12CD70在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系上表達(dá) 在一系列多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系上評估細(xì)胞表面的CD70表達(dá)(表6)。通過定量流式細(xì)胞術(shù)，采用

(大科公司(Dako)，Carpinteria，CA)確定各細(xì)胞系表達(dá)的CD70分子拷貝數(shù)。測定這些細(xì)胞對抗-CD70ADC-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的反應(yīng)。在此模型中，嵌合抗-CD70ADC的活性是人抗-CD70ADC的活性的替代者(proxy)。嵌合1F6(c1F6)-vcMMAF4和c1F6-mcMMAF4都對表達(dá)CD70的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。用c1F6-vcMMAF4獲得的IC50值的范圍是1.2-160ng/mL，而用c1F6-mcMMAF4獲得的IC50值的范圍是1.7-500ng/mL。
表6 嵌合性抗-CD70ADC對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性
實(shí)施例13多發(fā)性骨髓瘤的小鼠異種移植瘤模型 還檢測了抗-CD70 ADC在多發(fā)性骨髓瘤異種移植瘤模型中的體內(nèi)活性。將人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系MM-1S(圖11A和11B)或L363(圖12A和12B)重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，濃度為10×106個細(xì)胞/300μL。為了建立腫瘤，通過SCID小鼠尾靜脈靜脈內(nèi)注射300μL細(xì)胞懸液。在MM-1S模型中，未治療的小鼠在腫瘤植入約40天后屈服于腫瘤細(xì)胞，并表現(xiàn)出癥狀，包括后肢癱瘓、弓狀體態(tài)、顱腫脹和/或皮毛不整潔。當(dāng)小鼠顯示出一種或多種上述癥狀時處死小鼠。與對照未結(jié)合的IgG-vcMMAF4和IgG-mcMMAF4相比，h1F6(HJLA)-vcMMAF4和h1F6(HJLA)-mcMMAF4對荷瘤小鼠提供了顯著的存活益處(參見圖11A)。也通過對表達(dá)人CD138(MM-1S細(xì)胞表達(dá)的漿細(xì)胞標(biāo)記物)的骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)評估MM-1S模型的腫瘤負(fù)擔(dān)?；厥沼捎诔霈F(xiàn)癥狀或于第122天試驗(yàn)結(jié)束時處死的小鼠的骨髓細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測定表達(dá)CD138的MM-1S細(xì)胞。與未治療小鼠相比，對照IgG-vcMMAF4和IgG-mcMMAF4不能顯著降低骨髓中表達(dá)CD138的MM-1S細(xì)胞的數(shù)量。另一方面，由于與對照ADC相比，骨髓中表達(dá)CD138的細(xì)胞數(shù)量少得多，說明h1F6-vcMMAF4和h1F6-mcMMAF4顯著降低了腫瘤負(fù)擔(dān)(參見圖11B)。
在L363模型中，不接受治療的小鼠中多個部位發(fā)生彌散性腫瘤，注射腫瘤約40天后，可以觸摸到腫瘤，此時處死荷瘤小鼠。與MM-1S模型類似，對照IgG-vcMMAF4沒有提供任何存活優(yōu)勢，而h1F6-vcMMAF4顯著延長了存活期(參見圖12A)。由于L363細(xì)胞分泌免疫球蛋白λ輕鏈(λLC)，所以可通過監(jiān)測荷瘤小鼠血漿中人λLC的濃度來確定腫瘤負(fù)擔(dān)。用ELISA檢測分泌的λLC。用100μL/孔以0.1M碳酸鈉/碳酸氫鈉配制的2μg/mL山羊抗人Ig(南方生物科技(SouthernBiotech)#2010-01，Birmingham，AL)包被96孔平底免疫板(Nunc Maxisorp，#442404，那格國際(Nalge Nunc International)，Rochester，NY)，4℃過夜。用1X PBST(PBS，0.05％吐溫-20)將孔洗滌五次，用200μL/孔的1％BSA/PBST(0.05％吐溫-20)室溫封閉1小時。用1X PBST洗滌5次后，加入連續(xù)稀釋的含有人λLC的小鼠血清樣品。純化的人λLC(貝西實(shí)驗(yàn)室(Bethyl labs)#P80-127，Montgomery，TX)用作標(biāo)準(zhǔn)品。室溫培育1小時后，用1X PBST洗孔5次。加入用1％BSA/PBST 1∶4000稀釋的HRP-山羊抗人λ鏈特異性F(ab′)2(南方生物科技(Southern Biotech)#2072-05)。再于室溫下培育1小時后，用1X PBST洗孔5次。用TMB底物100μL/孔(西格馬公司(Sigma)#T8665，St.Louis，MO)檢測捕獲的λLC。圖12B顯示了L363細(xì)胞植入血清后40天的結(jié)果。未治療小鼠和IgG-vcMMAF4-治療的小鼠的λLC水平相當(dāng)。相反，h1F6-vcMMAF4治療小鼠的血清λLC水平明顯較低，這確證了抗-CD70 ADC能夠降低荷有多發(fā)性骨髓瘤異種移植瘤的小鼠的腫瘤負(fù)擔(dān)。
實(shí)施例14霍奇金病細(xì)胞系和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系表達(dá)CD70 也在一系列霍奇金病(表7)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系上評估了細(xì)胞表面的CD70表達(dá)(表8)。用

(大科公司(Dako)，Carpinteria，CA)以定量流式細(xì)胞術(shù)分析測定各細(xì)胞系表達(dá)的CD70分子拷貝數(shù)。測定了這些細(xì)胞對嵌合抗-CD70 ADC-介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的應(yīng)答。在此模型中，嵌合抗-CD70 ADC的活性是人抗-CD70 ADC的活性的替代者。嵌合1F6(c1F6)-vcMMAF4和c1F6-mcMMAF4都對這些表達(dá)CD70的細(xì)胞系有細(xì)胞毒性。在霍奇金病板塊中，用c1F6-vcMMAF4獲得的IC50值的范圍是0.41-42ng/mL，而用c1F6-mcMMAF4獲得的IC50值的范圍是5.2-310ng/mL(表7)。在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤板塊中，用h1F6-vcMMAF4獲得的IC50值的范圍是2.3-27ng/mL，而用h1F6-mcMMAF4獲得的IC50值的范圍是15-110ng/mL(表8)。
表7 抗-CD70 ADC對霍奇金病細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性 IC50(ng/mL) CD70拷貝/細(xì)胞c1F6-vcMMAF4 c1F6-mcMMAF4 RPMI-6666 21,000 42 230 Hs445 64,000 7.3310 L428 105,000 1.435 KMH2 160,000 0.41 5.2 SUP-HD-1 221,000 6.353 表8 嵌合抗-CD70 ADC對成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性 IC50(ng/mL) CD70拷貝/細(xì)胞 h1F6-vcMMAF4h1F6-mcMMAF4 U251 117,000 5.3 15 SNB-1990,000 12 27 U373MG70,000 16 35 GMS-1064,000 27 110 DBTRG-05MG59,000 2.3 20 本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實(shí)施方式
的限制。實(shí)際上，除本文所述的修改以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過理解上述說明書和附圖可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改。這類修改應(yīng)落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文引用了各種參考文獻(xiàn)，包括專利申請、專利和科學(xué)文獻(xiàn)，將其全部內(nèi)容納入本文作參考。
序列表
<110>西雅圖基因公司(Seattle Genetics，Inc.)
C.麥克多納格(McDonagh，Charlotte)
P.卡特(Carter，Paul)
J.麥基切恩(McEarchern，Julie)
C.-L.勞(Law，Che-Leung)
<120>人源化抗-CD70抗體和其應(yīng)用
<130>018891-001600PC
<150>US 60/673,070
<151>2005-04-19
<160>30
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
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atccagttgg tgcagtctgg acctgaggtg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120
tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180
ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacacctaca ctggagagcc aacatatgct 240
gatgccttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300
cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag agactacggc 360
gactatggta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411
<210>2
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
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Ala Gly Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
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Asp Ala Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr
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Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210>3
<211>1404
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>鼠CDR，HV結(jié)構(gòu)域中的人FR
<400>3
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aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt720
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc1380
ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210>20
<211>467
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>鼠CDR，人FR中的鼠殘基
<400>20
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ala Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210>21
<211>396
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>21
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc120
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtat180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga ggttccgtgg360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgg 396
<210>22
<211>132
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>22
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
<210>23
<211>336
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>鼠CDR，人FR
<400>23
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtac120
cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacc ttgcatccaa cctagaatcc180
ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc240
agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc acagtaggga ggttccgtgg300
acgttcggtc agggcaccaa ggtggaaatc aaacgt 336
<210>24
<211>112
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>鼠CDR，人FR
<400>24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210>25
<211>717
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>鼠CDR，人FR
<400>25
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc120
atcaactgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtac180
cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacc ttgcatccaa cctagaatcc240
ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc300
agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc acagtaggga ggttccgtgg360
acgttcggtc agggcaccaa ggtggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc420
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg480
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg540
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc600
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc660
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717
<210>26
<211>238
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>鼠CDR，人FR
<400>26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>27
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>27
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgccagtaa ctgcagatgt ccaatcccag 60
gttcagctgc aacagtctgg aactgagctg atgacgcctg gggcctcagt gacgatgtcc120
tgcaagactt ctggctacac attcagtacc tactggatag agtgggtaaa acagaggcct180
ggacatggcc ttgagtggat tggagaaatt ttacctggaa gtggttatac tgactacaat240
gagaagttca aggccaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg300
caactcagca gcctggcatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag atgggatagg360
ctctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411
<210>28
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>28
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Asp
1 5 10 15
Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Thr
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Thr Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Thr Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Gly Pro Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Arg Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210>29
<211>396
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>29
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttaactgtat ctctggggca gaagaccacc120
atctcatgca gggccagcaa gagtgtcagt acatctggct atagttttat gcactggtac180
caactgaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc ttgcgtccaa cctaccatct240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caaaatccat300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gattccgtac360
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata acacgg396
<210>30
<211>132
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>30
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Lys Thr Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asp Leu Pro Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Thr Arg
130
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合于人CD70的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含人源化重鏈可變區(qū)，所述人源化重鏈可變區(qū)含有與人種系VH1-2或VH1-18的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有與SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137所列的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有與SEQ ID NO24的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ IDNO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有SEQID NO24的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ IDNO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有SEQID NO24的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO4、SEQ IDNO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO24的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO26的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，它是包含重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ IDNO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO24的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18或SEQ ID NO4的氨基酸20-137的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO24的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求9或10所述的抗原結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO4、SEQ IDNO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求9或10所述的抗原結(jié)合片段，其包含SEQ ID NO26的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求9或10所述的抗原結(jié)合片段，所述抗原結(jié)合片段是scFv、雙抗體、Fab、小抗體或scFv-Fc。
14.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含抗體效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。
15.如權(quán)利要求14所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含介導(dǎo)ADCC、ADCP或CDC的抗體效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。
16.如權(quán)利要求14所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含介導(dǎo)ADCP的抗體效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。
17.如權(quán)利要求14所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域是人抗體效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。
18.如權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)于治療劑。
19.如權(quán)利要求18所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述治療劑是化療藥或免疫調(diào)節(jié)劑。
20.如權(quán)利要求19所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述治療劑是化療藥。
21.如權(quán)利要求20所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述化療藥是MMAE或MMAF。
22.如權(quán)利要求19所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述治療劑是免疫調(diào)節(jié)劑。
23.一種用于治療表達(dá)CD70的癌癥或免疫病的藥物組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1-10和14-22中任一項(xiàng)所述的抗體和至少一種藥學(xué)相容性成分。
24.一種編碼權(quán)利要求2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的分離多核苷酸。
25.如權(quán)利要求24所述的分離多核苷酸，其包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的序列，其中所述序列編碼抗體重鏈或輕鏈或其片段。
26.如權(quán)利要求25所述的分離多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼抗體重鏈或其片段，所述多核苷酸包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19的序列。
27.如權(quán)利要求25所述的分離多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼抗體輕鏈或其片段，所述多核苷酸包含SEQ ID NO25的序列。
28.如權(quán)利要求25所述的分離多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQID NO3和SEQ ID NO25；SEQ ID NO7和SEQ ID NO25；SEQ ID NO11和SEQ ID NO25；SEQ ID NO15和SEQ ID NO25；或SEQ ID NO19和SEQID NO25的序列。
29.如權(quán)利要求25所述的分離多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO13或SEQ ID NO17的序列。
30.如權(quán)利要求25所述的分離多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQID NO23的序列。
31.如權(quán)利要求25所述的分離多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQID NO5和SEQ ID NO23；SEQ ID NO9和SEQ ID NO23；SEQ ID NO13和SEQ ID NO23；或SEQ ID NO17和SEQ ID NO23的序列。
32.如權(quán)利要求24所述的分離多核苷酸，還包含編碼人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的序列。
33.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-10和14-22中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，以及使用所述抗體或其抗原結(jié)合片段檢測生物樣品中的CD70蛋白的說明書。
34.一種抑制表達(dá)CD70抗原的細(xì)胞生長的方法，所述方法包括給予所述細(xì)胞一定量的權(quán)利要求1-10和14-22中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段以抑制細(xì)胞生長。
35.一種治療人對象的癌癥的方法，所述方法包括給予患有CD70表達(dá)性癌癥的所述對象有效量的權(quán)利要求1-10和14-22中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，還包括將治療劑給予所述對象。
37.一種誘導(dǎo)消耗外周血B細(xì)胞的方法，所述方法包括給予所述細(xì)胞權(quán)利要求1-10和14-22中任一項(xiàng)所述的抗-CD70抗體或其抗原結(jié)合片段。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，還包括將治療劑給予所述對象。
全文摘要
本發(fā)明公開了CD70結(jié)合物，如人源化抗-CD70抗體及其片段和衍生物，它們對CD70表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒、細(xì)胞抑制和免疫調(diào)節(jié)作用，還公開了包含所述抗體、片段或衍生物的藥物組合物和藥盒。也公開了治療表達(dá)CD70的癌癥和免疫病的方法，所述方法包括給予對象所述CD70結(jié)合物或藥物組合物。
文檔編號A61K39/395GK101203241SQ200680021851
公開日2008年6月18日 申請日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月19日
發(fā)明者C·麥克多納格, P·卡特, J·麥基切恩, C·-L·勞 申請人:西雅圖基因公司