專利名稱：：用于藥物用途的蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白酶的藥物用途，所述蛋白酶涉及源自地衣芽孢桿菌C6a"/ws//c/zem/o^mX)的絲氨酸蛋白酶(SEQIDNO:2的氨基酸1-274)，在所述用途中任選地將該蛋白酶與脂肪酶和/或淀粉酶組合。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥(medicalindication)的實(shí)例是治療消化性病癥(digestivedisorder)、胰腺外分泌機(jī)能不全(pancreaticexocrineinsu伍ciency)(PEI)、胰腺炎、嚢性纖維化、I型糖尿病和/或n型糖尿病。
背景技術(shù)：
：已知幾種以胰酶補(bǔ)充劑形式存在的商業(yè)藥物用于治療胰腺外分泌機(jī)能不全。這些產(chǎn)品的活性組分是消化酶，主要為淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，其通常產(chǎn)生于胰腺并分泌至小腸上部(十二指腸)。這些藥物中使用的酶源自牛或豬的胰腺，然而市場也存在含有微生物酶的產(chǎn)品，例如產(chǎn)品Nortase⑧，其包含來自米根霉(i^&opwwy加e)的月旨肪酶、來自米曲霉(J^wg/〃ww^加e)的蛋白酶和來自米曲霉的淀粉酶。US5614189(EP600868)描述源自疏棉狀腐質(zhì)霉(^Twm'co/"/"m^/"o")的脂肪酶在胰酶替代療法中的用途，例如在對患有嚢性纖維化的患者的治療中。所述脂肪酶來自疏棉狀腐質(zhì)霉DSM4109，具有SEQIDNO:14的氨基酸1-269的氨基酸序列。WO00/54799描述在治療I型和n型糖尿病中，有脂肪分解、蛋白水解和淀粉分解活性的、生理上可以接受的酶混合物的用途。WO02/060474描述來自德氏根霉(//n'zopwA/emar)的濃縮脂肪酶、來自蜂蜜曲霉(^pe^///^me〃ez^)的中性蛋白酶和來自米曲霉的淀粉酶在對消化不良的治療中的用途。WO01/62280描述在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防胃腸病癥時(shí)，與多功能交聯(lián)劑交聯(lián)的特定的非真菌脂肪酶晶體、蛋白酶和淀粉酶的用途，其中所述脂肪酶晶體在從約2.0至9.0的pH范圍內(nèi)具有活性。優(yōu)選的脂肪酶來自假單胞菌屬CRse^fomo"a力，優(yōu)選的淀粉酶來自芽孢桿菌屬(Sa"'〃附)或曲霉菌(A^ergz7/w力，優(yōu)選的蛋白酶是菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶或無花果蛋白酶。EP0828509描述在對外分泌胰腺機(jī)能不全的治療中，特定的酸穩(wěn)定性淀粉酶的用途，任選地可與特定的酸穩(wěn)定性脂肪酶和/或蛋白酶組合。優(yōu)選的淀粉酶來自黑曲霉(Aperg///^"/取r)，優(yōu)選的脂肪酶來自少根根霉(i/zizopwa^r/n'zM》或爪唾才艮審(A/zz.zopus/avam'citf)。WO91/00345描述許多用于洗滌劑組合物中的絲氨酸枯草桿菌蛋白酶(serinesubtilisinprotease)及其改進(jìn)的變體。WO2005/115445(在本申請的優(yōu)先權(quán)日后公布)描述蛋白酶的藥物用途，所述蛋白酶涉及源自擬諾卡氏菌屬菌種(A^carafcp^sp.)NRRL18262的蛋白酶(該蛋白酶具有本引用文獻(xiàn)中SEQIDNO:1的氨基酸1-188的氨基酸序列)，任選地將所述蛋白酶與脂肪酶和/或淀粉酶組合。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥和本發(fā)明中相同。WO02/077187公開具有改變的T-細(xì)胞表位的解淀粉芽孢桿菌(Bac/〃wamj;/o/^we/ac/em)枯草桿菌蛋白酶及其各種用途。對藥物組合物提出權(quán)利要求。WO01/12795公開蛋白水解酶組合物的藥物用途。優(yōu)選的蛋白酶來自米曲霉、黑曲霉、醬油曲霉(Js/erg/〃M^/"e)、黃曲霉(Ay/7^"g/〃us/fl/vws)、泡盛曲霉(^^perg7'〃z^awamon')或才古草芽孑包4干菌C6acz7/iwsw6"/h)。WO2004/078773公開如何將蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶保持在非活性狀態(tài)，所述非活性狀態(tài)能夠在外部信號的請求時(shí)激活。在其它用途中公開原枯草桿菌蛋白酶(pro-subtilisin)在傷口清潔制劑中的用途，和如何引發(fā)活性枯草桿菌蛋白酶的形成。優(yōu)選的蛋白酶是ProD-枯草桿菌蛋白酶或ProD-負(fù)載枯草桿菌蛋白酶(ProD-loadedsubtilisin)(Yabuta等，J.Biol.Chem.278:15246-51，2003)。US2002/0081703公開用于降低非人蛋白質(zhì)變應(yīng)原性的方法，其中用人枯草桿菌蛋白酶中的類似區(qū)域(analogousregion)鑒定和代替表位。對包含人枯草桿菌蛋白酶的藥物組合物提出權(quán)利要求。在本領(lǐng)域中需要可供選擇的，優(yōu)選改進(jìn)的酶，所述酶用于藥物用途，特別用于上述醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥(medicalindication)。發(fā)明簡述本發(fā)明提供可供選擇的，優(yōu)選改進(jìn)的酶，所述酶用于醫(yī)療用途，特別用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全(PEI)、胰腺炎、嚢性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。所述新酶是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的用途的酶在體內(nèi)和/或體外有改進(jìn)的效能；改進(jìn)的pH穩(wěn)定性分布；改進(jìn)的pH活性分布；對蛋白酶的降解穩(wěn)定；在膽汁鹽存在時(shí)穩(wěn)定；和/或具有降低的變應(yīng)原性。本發(fā)明涉及用作藥物的蛋白酶，其中所述蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸1-274有至少50%同一性，任選地將該蛋白酶與脂肪酶和/或淀粉酶組合。本發(fā)明還涉及這些蛋白酶在生產(chǎn)藥物中的用途，所述藥物用來治療消化性病癥、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性)、嚢性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病，這些用途任選地還包含脂肪酶和/或淀粉酶的用途。此外本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含這樣的蛋白酶，以及至少一種可藥用的輔助材料，任選地包括脂肪酶和/或淀粉酶。本發(fā)明還涉及消化性病癥、PEI、胰腺炎(急性和/或慢性)、嚢性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的治療方法，其通過施用治療上有效量的這樣的蛋白酶，任選地與脂肪酶和/或淀粉酶一起施用。發(fā)明詳述整本發(fā)明涉及蛋白酶的藥物用途，所述蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶具有至少50%的同一性，所述蛋白酶是源自地衣芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶，也稱作枯草芽孢桿菌蛋白酶Carisberg。本發(fā)明還涉及這些蛋白酶用于產(chǎn)生藥物的用途，所述藥物用來治療消化性病癥、PEI、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含這樣的脂肪酶，和至少一種可藥用的輔助材料；以及通過施用治療上有效量的這樣的蛋白酶治療上述疾病的方法。在下文中，用于本發(fā)明的組合物、方法和用途中的蛋白酶稱作"本發(fā)明的蛋白酶"。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸l-274具有至少51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或至少60%的同一性程度。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或至少70%的同一性程度。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或至少80%的同一性程度。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸l-274具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86°/。、87%、88°/。、89%或至少90%的同一性程度。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的同一性程度。在本文中，術(shù)語"蛋白酶"定義為水解肽一建的酶。它包括任何屬于EC3.4酶組的酶(包括其中全部十三個(gè)亞類，這些酶在下文中稱作"屬于EC3.4,.-組")。EC號參考NC-IUBMB，AcademicPress,SanDiego，California的EnzymeNomenclature1992，包括分別在Eur.J.Biochem.1994,223，1-5;Eur.J.Biochem.1995,232,1-6;Eur.J,Biochem.1996,237,1-5;Eur.J.Biochem.1997,250，1-6;andEur.J.Biochem.1999，264,610-650中公布的補(bǔ)充材料1-5。所述命名法經(jīng)常性地補(bǔ)充和更新；參見，例如環(huán)球網(wǎng)http:〃www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。根據(jù)蛋白酶的催化機(jī)制將它們分成下述組絲氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金屬蛋白酶(M)，和未知的或尚未分類的蛋白酶(U),參見HandbookofProteolyticEnzymes,A丄Barrett，N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds)，AcademicPress(1998)(在下文中稱作"手冊")，特別是簡介部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。術(shù)語絲氨酸蛋白酶指絲氨酸肽酶和它們的同族異種體(clan)，如手冊所定義，具體參見1-175章。絲氨酸蛋白酶是肽酶，其中的催化機(jī)制依賴于作為攻擊肽鍵的親核試劑發(fā)揮作用的絲氨酸殘基的羥基。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶和/或源自枯草桿菌蛋白酶家族。術(shù)語枯草桿菌蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶家族包括所有SB族(ClanSB)絲氨酸蛋白酶，特別是其S8家族(FamilySB)(手冊中第93章介紹SB族)。為了測定指定的蛋白酶是否是枯草桿菌蛋白酶，參考手冊和其中說明的原理。這種測量能夠針對所有類型的蛋白酶進(jìn)行，所述蛋白酶可以是天然存在的或野生型蛋白酶；或者基因工程或合成蛋白酶。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶中催化三聯(lián)體(catalytictriad)的順序是Asp-His-Ser。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)包括a-螺旋和p-折疊。SB族包括內(nèi)肽酶和外肽酶。在更進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶是內(nèi)肽酶。內(nèi)肽酶表現(xiàn)出對N-和C-末端阻斷的肽底物的活性，所述底物與所述蛋白酶的特異性相關(guān)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶不是ProD-枯草桿菌蛋白酶或ProD-負(fù)載的枯草桿菌蛋白酶(Yabuta等，J.Biol.Chem.278:15246-51,2003)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶不是野生型枯草芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，和/或不源自枯草芽孢桿菌。因此，在第一方面，本發(fā)明的蛋白酶選自下組(a)屬于EC3.4,.-酶組的蛋白酶；(b)絲氨酸蛋白酶；(c)肽酶SB族的枯草桿菌蛋白酶；和(d)S8家族的枯草桿菌蛋白酶。在第二方面，本發(fā)明的蛋白酶源自微生物，例如源自真菌，或源自細(xì)菌。細(xì)菌的實(shí)例是芽孢桿菌屬的菌抹，如嗜堿芽孢桿菌(^a"7/^a/y^/o/7/n7w"、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌C5ac說^6rev&)、克勞氏芽孢桿菌0^"7/附daww力、環(huán)狀芽孢桿菌(Ba"7/w">cw/ara)、凝結(jié)芽孢桿菌(5"c/〃wcoagwAmy)、燦爛芽孢桿菌CBacz7/t^/m^力、遲緩芽孢桿菌CBac說w/e"&力、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5ac〃/usmegafen.wm)、腸膜芽孢4f菌(萬"c/〃wj、納豆芽孢桿菌(^a"7/^wa加)、短小芽孢桿菌(5a"'〃wpw;w7w力、芽孢桿菌屬菌種(5a"-〃wssp.)、嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(萬a"7/wWeflraAe7770//7//1^)、枯草芽孢桿菌、枯草芽孑包桿菌納豆變種(Bacillussubtilisvarnatto)或蘇云金芽孢桿菌(5acz'〃wsf/wn7^&"^)的菌抹；特別是解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、腸膜芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、芽孢桿菌屬菌種、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌納豆變種的菌抹；優(yōu)選地衣芽孢桿菌菌抹。在本上下文中，術(shù)語"源自，，包括可從或已從野生型菌抹獲得的酶；以及，優(yōu)選地，具有至少一個(gè)取代、插入和/或缺失至少一個(gè)氨基酸殘基的所述酶的變體。術(shù)語變體還包括改組的(shufflant)、雜合的、嵌合的酶和共有酶(consensusenzyme)。變體可以用本領(lǐng)域任何已知方法產(chǎn)生，^口定點(diǎn)i秀變(site-directedmutagenesis)、卩逸才幾突變、共有書亍生方法(consensusderivationprocesses)(EP897985)和基因改組(geneshuffling)(WO95/22625、WO96/00343)等。下述為本發(fā)明的蛋白酶的實(shí)例，其源自芽孢桿菌屬的菌抹并且涉及下述蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶Swissprotsubt—bacli登錄號P00780(源自地衣芽孢桿菌，SEQIDNO:5的氨基酸1-274);Swissprotsubn—bacna登錄號P35835(源自納豆芽孢桿菌，SEQIDNO:6的氨基酸1-275);Swissprotsubt—bacpu登錄號P07518(源自短小芽孢桿菌，SEQIDNO:7的氨基酸1-275);Swissprotsubt—bacsu登錄號P04189(源自枯草芽孢桿菌，SEQIDNO:8的氨基酸1-275);Swissprotsubt一bacst登錄號P29142(源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，SEQIDNO:9的氨基酸1-275);Swissprotsubt—bacam登錄號P00782(源自解淀粉芽孢桿菌，SEQIDNO:10的氨基酸1-275);Swissprotsubs—bacle登錄號P29600(源自遲緩芽孢桿菌，SEQIDNO:11的氨基酸1-269);Swissprotelya一baccs登錄號P41362(源自克勞氏芽孢桿菌，SEQIDNO:12的氨基酸1-269);和Swissprotelya_bacya登錄號P20724(源自芽孢桿菌屬菌種，SEQIDNO:13的氨基酸1-268);以及它們的變體，如上所定義。本發(fā)明的蛋白酶的其它具體實(shí)例是下述商業(yè)產(chǎn)品中包含的蛋白酶PurafectMA、Purafect、PurafectOx(變體M222S)、PurafectPrime(Y217L)、Properase(S87N+S101G+V104N)、FN3(N76D+SI03A+VI041)、FN4(S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K)-SEQIDNO:10的成熟部分的所有優(yōu)選變體并可從Genencor/Danisco以商業(yè)方法獲得；Blap(SEQIDNO:11的成熟部分，具有S99D+S101R+S103A+V104I+G160S)、BLAPR(具有S3T+V4I+V199M+V205I+L217D的Blap),和BLAPX(具有S3T+V4I+V205I的Blap)-全部來自Henkel/Kemira;和來自Kao的KAP(A230V+S256G+S259N)。在第三方面，本發(fā)明的蛋白酶是，或者能夠^皮視為，SEQIDNO:2的蛋白酶的變體，即它包含SEQIDNO:2的氨基酸1-274中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一個(gè)。優(yōu)選地，氨基酸改變的性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能，例如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域來促進(jìn)純化的小延伸。在本文的上下文中，術(shù)語"小，，獨(dú)立地表明多至25個(gè)氨基酸殘基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語"小"獨(dú)立地表明多至24、23、22、21或多至20個(gè)氨基酸殘基。在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，術(shù)語"小"獨(dú)立地表明多至19、18、17、16、15、14、13、12、11或多至IO個(gè)氨基酸殘基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語"小，，獨(dú)立地表明多至9、8、7、6、5、4、3、2或多至1個(gè)氨基酸殘基。在可供選擇的實(shí)施方案中，術(shù)語"小"獨(dú)立地表明多至40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27或多至26個(gè)氨基酸殘基。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和曱硫氨酸)?？晒┻x擇地，保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.NeurathandR丄.Hill,1979,77zePrafe/似，AcademicPress,NewYork描述。最普遍發(fā)生的交換是AWSer、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gy、AWThr、Ser/Asn、Ala賜、Ser/Gly、Tyr/Phe、A旨ro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。SEQIDNO:5-13的任何成熟蛋白酶部分的優(yōu)選變體，例如SEQIDNO:13的氨基酸1-268的優(yōu)選變體，包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一個(gè)(與親本或祖先酶比較，例如，與SEQIDNO:13的氨基酸1-268比較)，如上述就SEQIDNO:2的氨基酸1-274的變體所解釋的。更優(yōu)選這些變體具有保守氨基酸取代或插入、小缺失、小接頭或具有小延伸，同樣如上述就SEQIDNO:2的氨基酸1-274的變體所解釋的。本發(fā)明的蛋白酶變體的具體實(shí)例是SEQIDNO:11的變體99aE(參見實(shí)施例4)。在第四方面，本發(fā)明的蛋白酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸l-274的差異不多于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或不多于11個(gè)氨基酸的氨基酸序列；或者，它與SEQIDNO:2的氨基酸1-274的差異不多于IO、9、8、7、6、5、4、3、2或不多于1個(gè)氨基酸。在可供選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶具有與SEQIDNO:2的氨基酸l-274的差異不多于40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27或不多于26個(gè)氨基酸的氨基酸序列。SEQIDNO:5-13的任何成熟蛋白酶部分的優(yōu)選變體，例如SEQIDNO:7的氨基酸1-275的優(yōu)選變體，具有與SEQIDNO:5-13中任一的成熟部分(例如SEQIDNO:7的氨基酸l-275)的差異不多于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或不多于11個(gè)氨基酸的氨基酸序列；或者，它們與SEQIDNO:5-13中任一的成熟部分(例如SEQIDNO:7的氨基酸l-275)的差異不多于10、9、8、7、6、5、4、3、2或不多于1個(gè)氨基酸。在第五方面，本發(fā)朋的蛋白酶是SEQIDNO:2的等位變體(優(yōu)選為其成熟部分的等位變體)、SEQIDNO:5-13中任一的等位變體(優(yōu)選為它們的成熟部分中任一的等位變體)或任何這些序列的具有蛋白酶活性的片段。術(shù)語等位變體表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。術(shù)語片段在本文中定義為從SEQIDNO:2的氨基酸1-274的氨基和/或羧基末端，或者從SEQIDNO:5-13中任一的氨基和/或羧基末端，優(yōu)選從其成熟部分，缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。優(yōu)選地，缺失小數(shù)目的氨基酸，小如上述所定義。更優(yōu)選地，片段包含至少244、245、246、247、248、249或至少250個(gè)氨基酸。最優(yōu)選地，片段包含至少251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272或至少273個(gè)氨基酸殘基?？偠灾景l(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于藥物用途的蛋白酶，其中a)所述蛋白酶包含選自下組的氨基#列SEQIDNO:2的氨基酸l-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或b)所述蛋白酶是選自下組的氨基酸序列的變體SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268,其中所述變體與相應(yīng)氨基S吏序列的差異不多于25個(gè)氨基酸，并且其中(i)與相應(yīng)的氨基酸序列相比，所述變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一個(gè)；和/或(ii)與相應(yīng)的氨基酸序列相比，所述變體包含至少一個(gè)小缺失；和/或(iii)與相應(yīng)的氨基酸序列相比，所述變體包含至少一個(gè)小的N-或C-末端延伸；和/或c)所述蛋白酶是具有選自下組的氨基酸的蛋白酶的變體SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或d)所述蛋白酶是具有選自下組的氨基酸的蛋白酶的片段SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。具體而言，本發(fā)明涉及用于藥物用途的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶可以與其它蛋白酶組合使用。其它蛋白酶的實(shí)例是哺乳動(dòng)物蛋白酶，和微生物蛋白酶。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物蛋白酶是胰腺提取物，例如來自豬或牛(ox)，如胰酶制劑(pancreatin)。胰酶制劑可以以未包覆(未加工)產(chǎn)品的形式使用，或者以配方產(chǎn)品(formulatedproducts)的形式(包有腸溶衣的(entericcoated)(提供對胃酸的抗性)，或非功能性包覆的(包覆的，但不提供對胃酸的抗性))使用。胰酶制劑可能包含另外的酶活性組分，如胰脂肪酶、BSSL(BileSaltStimulatedLipase)和/或胰淀粉酶。優(yōu)選的微生物蛋白酶源自細(xì)菌或真菌菌抹，例如源自曲霉屬菌4朱，如米曲霉或蜂蜜曲霉，具體而言產(chǎn)品Prozyme6TM(中性、堿性蛋白酶EC3.4.21.63)，可從AmanoPharmaceuticals,Japan以商業(yè)方法獲得。任選地，將本發(fā)明的蛋白酶與脂肪酶組合使用，有或沒有淀粉酶，如下文進(jìn)一步解釋的。在本文的上下文中，脂肪酶指羧酸脂水解酶EC3丄1,,其包括活性如EC3.1.1.3三醜甘、油月旨肪酵、EC3.1.1.4石粦月旨酵A1、EC3.1.1.5;容血石粦月旨酵、EC3.1.1.26半乳糖酯酶(galactolipase)、EC3.1.1.32磷月旨酶Al、EC3丄1.73阿魏酸脂酶。在具體實(shí)施方案中，脂肪酶是EC3丄I.3三酰甘油脂肪酶。在具體實(shí)施方案中，脂肪酶是哺乳動(dòng)物脂肪酶，例如來自豬或牛的胰腺提取物，如胰酶制劑。胰酶制劑可以以未包覆(未加工)產(chǎn)品的形式使用，或者以配方產(chǎn)品的形式(包有腸溶衣的，或非功能性包覆的，如上所述)使用。胰酶制劑可能包含另外的酶活性組分，如胰蛋白酶、BSSL(BileSaltStimulatedLipase),和/或胰淀粉酶。脂肪酶可以是^:生物脂肪酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌抹，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬或根霉屬(i/7izop"s)。脂肪酶可以具體源自根霉屬的菌抹，如爪哇根霉、米根霉或德氏根霉，例如產(chǎn)品LipaseDAmano2000(也一爾4乍LipaseD2)，其可乂人AmanoPharmaceuticals,Japan以商業(yè)方法獲得。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，脂肪酶是重組產(chǎn)生的微生物脂肪酶，例如源自真菌如腐質(zhì)霉屬(7/ww/co/a)或根毛霉屬CR/n'zomwcor)，源自酵母如念珠菌屬(C朋AWfl)，或源自細(xì)菌如假單胞菌屬。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脂肪酶源自疏棉狀腐質(zhì)霉或米赫才艮毛霉(i/^omwcor脂'e/ze/)的菌才朱。疏棉狀腐質(zhì)霉(與細(xì)毛嗜熱霉(77zmwowyc^/a"wgz'"ow力同義)月旨肪酶(SEQIDNO:14)在EP305216中描述，具體的脂肪酶變體在下述文獻(xiàn)中描述，例如WO92/05249、WO92/19726、WO94/25577、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、WO99/42566、WO00/32758、WO00/60063、WO01/83770、WO02/055679和WO02/066622。優(yōu)選的疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶變體是包含SEQIDNO:15的氨基酸l-269或2-269的脂肪酶，如下述(i)SEQIDNO:15的氨基酸+1至+269，(ii)SEQIDNO:15的氨基酸-5至+269，(iii)SEQIDNO:15的氨基酸-4至+269;(iv)SEQIDNO:15的氨基酸誦3至+269;(v)SEQIDNO:15的氨基酸-2至+269;(vi)SEQIDNO:15的氨基酸-1至+269，(vii)SEQIDNO:15的氨基酸+2至+269，以及(viii)(i)-(vii)脂肪酶中的兩種或更多種的任何混合物-以及它們的變體。在具體實(shí)施方案中，脂肪酶選自(i)、(ii)的脂肪酶和(i)與(ii)的任意混合物。(i)與(ii)的優(yōu)選混合物包含至少5%,優(yōu)選至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或至少95%的脂肪酶(i),百分比使用Edman方法通過N-末端測序確定，如要求DK專利申請200500929的優(yōu)選權(quán)的PCT申請中實(shí)施例5所述)。其它優(yōu)選混合物是(a)包含35-75。/。的脂肪酶(ii)，優(yōu)選40-70%,更優(yōu)選45-65。/。的脂肪酶(ii)的組合物；(b)包含20-60%,優(yōu)選25-55%,更優(yōu)選30-50%,最優(yōu)選35-47。/。的脂肪酶(i)的組合物；(c)包含多至30。/。，優(yōu)選多至25%，更優(yōu)選多至20°/。，最優(yōu)選多至16%的脂肪酶(vii)的組合物；和(d)(a)、(b)和/或(c)的任意組合，如包含45_65°/。的脂肪酶(ii)、35-47。/。的脂肪酶(i),和多至16。/。的脂肪酶(vii)的組合物。SEQIDNO:14和15的脂肪酶可例如按美國專利號5，869，438所述制備(美國專利中的SEQIDNO:1是編碼SEQIDNO:14的脂肪酶的DNA序列)。SEQIDNO:15的脂肪酶可例如通過在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)DNA序列而制備，所述DNA序列是美國專利的SEQIDNO:1的修飾序列，所述修飾反映出本文的SEQIDNO:14和15之間的氨基酸差異。這些修飾可以用定點(diǎn)誘變實(shí)現(xiàn)，如本領(lǐng)域所了解的。真菌脂肪酶另外的實(shí)例是EP785994中所述來自特異腐質(zhì)霉的角質(zhì)酶(cutinase)，和EP869167中所述來自尖鐮孢(Fwsan'i^o;c^pwwm)的磷脂酶。酵母脂肪酶的實(shí)例是來自南極假絲酵母(Ca"&Waa"torc"ca)的脂肪酶A和B，其中脂肪酶A在EP652945中有所描述，并且脂肪酶B由例如Uppenberg等在Structure,2(1994)，293中描述。細(xì)菌脂肪酶的實(shí)例是EP214761中所述源自洋蔥々i單月包菌ce/7flc/a)的月旨肪酵。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脂肪酶與SEQIDNO:15的脂肪酶是至少70%同一的，優(yōu)選與SEQIDNO:15的氨基酸1-269是至少70%同一的。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，對于SEQIDNO:15的同一性程度，優(yōu)選對于其氨基酸1-269的同一性程度，是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在可選的實(shí)施方案中，對于SEQIDNO:15的同一性程度，優(yōu)選對于其氨基酸1-269的同一性程度，是至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。在還進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酶，如哺乳動(dòng)物胰脂肪酶，是1，3-位特異性的脂肪酶。任選地，本發(fā)明的蛋白酶，和或不和上述的脂肪酶一起，與淀粉酶組合使用。在本文的上下文中，淀粉酶是催化淀粉與其它直鏈和支鏈的寡糖和多糖的內(nèi)部水解(endo-hydorlysis)的酶。淀粉的直鏈淀粉部分富含1,4-a-糖苦鍵，而支鏈淀粉部分更支鏈化，不僅包含1,4-a-糖苷鍵，也包含1,6-a-糖苷鍵。在具體實(shí)施方案中，淀粉酶是屬于EC3.2.1.1組的酶。在具體實(shí)施方案中，淀粉酶是哺乳動(dòng)物淀粉酶，例如來自豬或牛的胰腺提取物，如胰酶制劑。胰酶制劑可以以未包覆(未加工)產(chǎn)品的形式使用，或者以配方產(chǎn)品的形式(包有腸溶衣的，或非功能性包覆的)使用。胰酶制劑可能還包含另外的酶活性組分，如胰蛋白酶、BSSL和/或胰脂肪酶。淀粉酶還可以是微生物淀粉酶，例如源自細(xì)菌或真菌菌抹，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬或根霉屬。淀粉酶可以特別地源自曲霉屬的菌林，如黑曲霉、米曲霉或蜂蜜曲霉，例如源自米曲霉的產(chǎn)品AmylaseA1，其可乂人AmanoPharmaceuticals，Japan以商業(yè)方法獲得，或源自蜂蜜曲霉的AmylaseECTM，其可從Extract-Chemie,Germany以商業(yè)方法獲得。真菌淀粉酶的其它實(shí)例是黑曲霉淀粉酶(SWISSPROTP56271),其也在WO89/01969的實(shí)施例3中描述，和米曲霉淀粉酶。米曲霉淀粉酶的變體的實(shí)例在WO01/34784中描述。源自地衣芽孢桿菌的a-淀粉酶是細(xì)菌a-淀粉酶的實(shí)例。該淀粉酶，例如，在WO99/19467中描述，其中還描述有其它同源的細(xì)菌a-淀粉酶，例如，源自解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的淀粉酶，以及它們的變體。其它淀粉酶變體的實(shí)例是美國專利號4,933,279、EP722490和EP904360中描述的那些。優(yōu)選的淀粉酶是包含下述序列的淀粉酶SEQIDNO:16的氨基酸1-481(如其氨基酸1-4S1、1-484或1-486),SEQIDNO.'17的氨基酸1-481,和/或SEQIDNO:18的氨基酸1-483。在優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉酶與下述的任一是至少70%同一的:(i)SEQIDNO:16的氨基酸1-481，(ii)SEQIDNO:17的氨基酸1-481,和/或(iii)SEQIDNO:18的氨基酸1-483。SEQIDNO:16-18的淀粉酶可例如按共同待審的丹麥專利申請?zhí)?00500931所述的制備，所述申請的標(biāo)題為"用作醫(yī)療用途的淀粉酶(AmylasesforPharmaceuticalUse)",由PharmaceuticalsGmbH和NovozymesA/S于2005年6月24日提出申i青。在(i)、(ii)或(m)中任一的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，對于SEQIDNO:16、17或18的對應(yīng)部分的同一性程度是至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。在可供選擇的實(shí)施方案中，對于SEQIDNO:16、17或18的對應(yīng)部分的同一性程度是至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%或至少69%。就本發(fā)明而言，酶的特別優(yōu)選的組合為下述(i)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，與包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶組合；(ii)SEQIDNO:2的氨基酸l-274的蛋白酶，與包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481(如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶組合；(iii)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，與具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶組合；(iv)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，與具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶組合；(v)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，與包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481(如其氨基酸1-481、1-484或l-486)的淀粉酶，和包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶組合；(vi)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，與具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶組合；和(vii)SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶，與具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶，和包含SEQIDNO:15的氨基酸1-269或2-269的脂肪酶組合。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及與脂肪酶和/或淀粉酶組合用于藥物用途的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶是本文定義的蛋白酶;(U)所述脂肪酶包含SEQIDNO:15的氨基酸2-269;并且(iii)所述淀粉酶是選自下組的淀粉酶a)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。具體而言，本發(fā)明涉及與脂肪酶和/或淀粉酶組合用于藥物用途的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶包含或優(yōu)選是，或具有，SEQIDNO:2的氨基酸1-274;(ii)所述脂肪酶包含SEQIDNO:15的氨基酸2-269;并且(iii)所述淀粉酶是選自下組的淀粉酶a)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。酶的其它優(yōu)選組合是下述(i)與SEQIDNO:2的氨基S臾1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶組合；(ii)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:16的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶組合；(iii)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:17的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶組合；(iv)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50°/。同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:18的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶組合；(v)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:16的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶，及與SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶組合；(vi)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:17的氨基酸1-481具有至少50%同一性的淀粉酶，及與SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶組合；和(vii)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50°/。同一性的蛋白酶，和與SEQIDNO:18的氨基酸1-483具有至少50%同一性的淀粉酶，及與SEQIDNO:15的氨基酸1-269具有至少50%同一性的脂肪酶組合。在(i)-(vii)的優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)同一性程度獨(dú)立為，至少51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%65%、66%、67%、68。/。、69%、70%77%、78%、79%、80%、81%、82%89%、90%、91%、92%、93%、94%因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及與脂肪酶和/或淀粉酶組合用于藥物用途的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶選自下組a)與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的蛋白酶；b)包含選自下組的氨基酸序列的蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、、59%、60%、61%、62%、63%、64%、、71%、72%、73%、74%、75%、76%、、83%、84%、85%、86%、87%、88%、、95%、96%、97%、98%或至少99%。SEQIDNO:9的氨基酸l-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基S交1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;c)選自下組的氨基酸序列的變體的蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268,其中所述變體與相應(yīng)氨基酸序列的差異不多于25個(gè)氨基酸，并且其中(i)與相應(yīng)的氨基酸序列相比，所述變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入中的至少一種；和/或(ii)與相應(yīng)的氨基酸序列相比，所述變體包含至少一個(gè)小缺失；和/或(iii)與相應(yīng)的氨基酸序列相比，所述變體包含至少一個(gè)小的N-或C-末端延伸；d)蛋白酶，其是具有選自下組的氨基酸的蛋白酶的等位變體SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;e)蛋白酶，其是具有選自下組的氨基酸的蛋白酶的片段SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和f)具有選自下組的氨基酸序列的蛋白酶SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;(ii)所述脂肪酶與具有SEQIDNO:15的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%同一性；并且(iii)所迷淀粉酶與選自下組的淀粉酶有至少70%同一性a)具有SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。通常而言，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶(下文稱作"酶"，即本發(fā)明的酶)可以是天然或野生型酶(獲得自動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人或豬的酶；獲得自植物，或獲得自微生物)，也可以是任何其顯示期望的酶活的突變體、變體、片段等，以及合成酶，如改組、雜交或嵌合酶，和共有酶。在特定的實(shí)施方案中，酶是低變應(yīng)原性變體，將所述酶設(shè)計(jì)成當(dāng)曝露于動(dòng)物包括人時(shí)產(chǎn)生降低的免疫應(yīng)答。術(shù)語免疫應(yīng)答可以理解為由曝露于酶的動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的任何反應(yīng)。免疫應(yīng)答的一種類型是變應(yīng)性應(yīng)答，其導(dǎo)致曝露的動(dòng)物中IgE的水平增加。低變應(yīng)原性變體可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。例如可將酶與聚合物基團(tuán)屏蔽部分(polymermoietiesshieldingportion)或者免疫應(yīng)答涉及的酶的表位結(jié)合。與聚合物的結(jié)合可涉及聚合物對酶的體外化學(xué)偶聯(lián)，例如，如WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489所述。所述結(jié)合可以另外或可選地涉及聚合物對酶的體內(nèi)偶聯(lián)。這種結(jié)合可以用下述方法實(shí)現(xiàn)編碼酶的核酸序列的基因工程，在酶中插入編碼額外糖基化位點(diǎn)的共有序列和在能夠?qū)⒚柑腔乃拗髦斜磉_(dá)酶，參見例如WO00/26354。提供低變應(yīng)原性變體的另一種方法是編碼酶的核酸序列的基因工程，以引起酶的自寡聚，致使所述酶單體可屏蔽其它酶單體的表位，并且由此降低寡聚體的變應(yīng)原性。這些產(chǎn)品和它們的制備在例如WO96/16177中有所描述。免疫反應(yīng)涉及的表位可以由各種方法鑒定，如WO00/26230和WO01/83559中所述的噬菌體展示方法，或EP561907中所述的隨機(jī)方法。一旦將表位鑒定，可通過已知的基因操作技術(shù)，如定向誘變(參見例如WO00/26230、WO00/26354和/或WO00/22103)改變它的氨基S吏序列以產(chǎn)生改變的酶的免疫性質(zhì)，和/或可在足夠接近表位處進(jìn)行聚合物的結(jié)合，以使聚合物屏蔽所述表位。在具體實(shí)施方案中，酶為(i)在pH2-8穩(wěn)定，優(yōu)選也在pH3-7穩(wěn)定，更優(yōu)選在pH4-6穩(wěn)定；(ii)在pH4-9，優(yōu)選4-8有活性;(iii)對胃蛋白酶和其它消化蛋白酶(如月夷蛋白酶(pancreasprotease),即主要為月夷蛋白酶(trypsin)和月夷凝乳蛋白酶)的降解穩(wěn)定；和/或(iv)在膽汁鹽存在下穩(wěn)定和/或有活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白酶是酸穩(wěn)定的，這表示即使在持續(xù)曝露于酸性環(huán)境后，純蛋白酶仍然保持有活性。優(yōu)選地，保留活性是已知用于藥物用途的比較蛋白酶的保留活性的1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5和3.0倍高。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，酸穩(wěn)定性指將純蛋白酶稀釋到相當(dāng)于A280=1.0，之后在緩沖液(100mM琥珀酸、100mMHEPES、100mMCHES、100mMCABS、1mMCaCl2、150mMKC1、0.010/0TritonX-100,pH3.5)中于37。C溫育2小時(shí)，如使用WO01/58276的實(shí)施例2C中所述試驗(yàn)方法測定的(底物Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25°C)，所述純蛋白酶的活性是參照活性(referenceactivity)的至少40%(或至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少97%)。術(shù)語參照活性指相同蛋白酶在以下處理之后的蛋白酶活性將所述蛋白酶以純的形式溫育，稀釋至A28o=1.0,在緩沖液(IOOmM琥珀酸、100mMHEPES、100mMCHES、100mMCABS、lmMCaCl2、150mMKCl、0.01%TritonX-100，pH9.0)中于5。C溫育2小時(shí)，其中所述酶活性用如上所述方法確定。術(shù)語A280=l.O指所述純蛋白酶的這樣的濃度(稀釋度)其在1cm通徑長度(pathlength)的比色皿中，于280nm相對于緩沖液空白產(chǎn)生1.0的吸光度。術(shù)語純蛋白酶指A28o/A26()比率在1.70以上或等于1.70的樣品(參見WO01/58276的實(shí)施例2E),并且通過掃描考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠測得所述樣品在對應(yīng)于所述蛋白酶的條帶中具有該樣品掃描密度的至少95%(參見WO01/58276的實(shí)施例2A)。術(shù)語"與......組合"指根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶的組合用途。組合用途可以是同時(shí)的、重疊的或順序的，這三個(gè)術(shù)語通常按照醫(yī)師的處方來解釋。術(shù)語"同時(shí)的，，指酶同時(shí)有活性的環(huán)境，例如當(dāng)它們作為一種或多種單獨(dú)的藥物產(chǎn)品同時(shí)施用時(shí)，或者如果將它們在一種和同樣的藥物組合物中施用時(shí)。術(shù)語"順序的，，指這樣的情況，其中一種和/或兩種酶先作用，而第二種和/或第三種酶隨后作用。順序的作用能夠這樣獲得將所述酶作為單獨(dú)的藥物制劑施用，中間有期望的間歇；或者作為一種藥物組合物施用，其中對所述酶進(jìn)行不同的配制(區(qū)分)，例如為了獲得不同的釋放時(shí)間，提供改進(jìn)的產(chǎn)品穩(wěn)定性，或?yàn)榱俗顑?yōu)化酶劑量。術(shù)語"重疊的，，指這樣的情況，其中酶活性時(shí)期既不完全是同時(shí)的，也不完全是順序的，即存在特定的時(shí)期，其中兩種酶或全部酶都有活性。術(shù)語"一"，例如當(dāng)用于本發(fā)明的酶的上下文中時(shí)，指至少一種。在具體實(shí)施方案中，"一"表示"一種或多種"或"至少一種"，其也表示一種、兩種、三種、四種、五種等。用參數(shù)"同一性，，描述兩個(gè)氨基酸序列之間的相關(guān)性。對于本發(fā)明，通過使用來自EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)2.8.0版的Needle程序，確定兩個(gè)氨基酸序列之間的比對。Needle程序運(yùn)行Needleman,S.B.andWunsch,C.D,(1970)J.Mol.Biol.48,443-453所述的全局比對算法(globalalignmentalgorithm)。Y吏用的耳又頭巨卩車(substitutionmatrix)是BLOSUM62,缺口開放罰分(gapopeningpenalty)是10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。本發(fā)明的氨基酸序列("發(fā)明序列"；例如SEQIDNO:2的氨基酸1-274)與不同的氨基酸序列("外源序列"；例如WO2005/115445的SEQIDNO:1的氨基酸1-188)之間的同一性程度這樣計(jì)算將兩個(gè)序列的比對中完全匹配的氨基酸數(shù)目，除以"發(fā)明序列"的長度或"外源序列"的長度中較短的一個(gè)。結(jié)果以百分比同一性表示。當(dāng)"發(fā)明序列"和"外源序列"在重疊中的同樣位置具有同一的氨基酸殘基時(shí)(在下述比對實(shí)例中用T表示)，則發(fā)生完全匹配。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQIDNO:2的長度是274)。在下述完全假設(shè)的比對實(shí)例中，重疊是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL";或序列2的氨基酸序列"HGWGEDANL"。在所述實(shí)例中，缺口用"-"表示。假設(shè)的比對實(shí)例序歹'J1:ACMSHTWGER—NL序歹寸2:HGWGEDANLAMNPS因此，序列1對序列2的同一性百分比是6/12=0.5,對應(yīng)于50%。在具體實(shí)施方案中，多肽的氨基酸序列與(w池)，或?qū)τ?to),SEQIDNO:2的氨基酸1-274的同一性百分比用如下方法確定i)使用Needle程序比對兩個(gè)氨基S吏序列，使用BLOSUM62置換矩陣，缺口開放罰分為10，并且缺口延伸罰分為0.5;ii)計(jì)算比對中完全匹配的數(shù)目；iii)將完全匹配的數(shù)目除以兩個(gè)氨基酸序列中最短序列的長度，和iv)將iii)中除法的結(jié)果轉(zhuǎn)換成百分比?；蛘?，兩個(gè)氨基酸序列的同一性程度可以用程序"比對，，確定，所述程序"比對"為Needleman-Wunsch比對(即全局比對)。將序列通過所述程序比對，使用默認(rèn)的記分矩陣BLOSUM50。缺口的第一個(gè)殘基的罰分是12,對于缺口其它殘基的罰分是2。Needleman-Wunsch算法在Needleman，S.B.andWunsch,C.D.,(1970),JournalofMolecularBiology,48:443-453中有描述，并且所述比對程序由Myers和W.Miller在"OptimalAlignmentsinLinearSpace"CABIOS(computerapplicationsinthebiosciences)(1988)4:11-17中描述。"比對"是FASTA軟件包v20u6版的一部分(參見W.R.PearsonandD.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448,和W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA"MetodsinEnzymology183:63-98)。本發(fā)明的任何酶的樣品序列或測試序列，與指定序列之間的同一性程度可以按照如下方法確定使用程序"比對，，來比對所述兩個(gè)序列。確定比對中完美匹配的數(shù)目("N-完美-匹配")(完美匹配指比對中相同位置上為相同的氨基酸殘基)。也確定兩個(gè)進(jìn)行比對的序列的共有長度(commonlength),即比對(重疊)中氨基酸的總數(shù)，包括比對產(chǎn)生的拖尾和前導(dǎo)缺口，如果存在任何這樣的缺口("N-重疊")。將同一性程度作為"N-完美-匹配"和"N-重疊，，之間的比率計(jì)算(如果要轉(zhuǎn)換成同一性百分比，則乘以100)。樣品序列或測試序列與特定序列之間的同一性程度可以按照如下方法確定使用軟件"比對"來比對所述序列。確定比對中完美匹配的lt目("N-完美-匹配")(完美匹配指比對中的相同位置上是相同的氨基酸殘基)。確定樣品序列的長度(氨基酸殘基數(shù))("N-樣品")。將同一性程度作為"N-完美-匹配"和"N-樣品，，之間的比率計(jì)算(如果要轉(zhuǎn)換成同一性百分比，則乘以100)。樣品序列或測試序列與特定序列之間的同一性程度也可以按照如下方法確定使用軟件"比對"來比對所述序列。確定比對序列中完美匹配的數(shù)目("N-完美-匹配")(完美匹配指比對中的相同位置上是相同的氨基酸殘基)。確定指定序列的長度(氨基酸殘基數(shù))("N-指定")。將同一性程度作為"N-完美-匹配"和"N-指定，，之間的比率計(jì)算(如果要轉(zhuǎn)換成同一性百分比，則乘以100)。優(yōu)選地，重疊是指定序列的至少20。/。("N-重疊"如上所定義，除以指定序列中氨基酸的數(shù)目("N-指定，，)，乘以100),更優(yōu)選為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%。這表示當(dāng)將樣品序列與指定序列比對時(shí)，指定序列的氨基酸的至少20%(優(yōu)選25-95%)最終包括于重疊中。或者，重疊是指定序列的至少20。/。("N-重疊"如上所定義，除以如上所定義的"N-樣品"，乘以100)，更優(yōu)選為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%。這表示當(dāng)與指定序列比對時(shí)，樣品序列的氨基酸的至少20°/。(優(yōu)選25-95°/。)最終包括于重疊中。本發(fā)明的酶的活性能夠使用任何合適的試驗(yàn)方法測定。通常，可使試驗(yàn)-pH和試-瞼-溫度適合于所述酶。試-瞼-pH值的實(shí)例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。試驗(yàn)-溫度的實(shí)例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95。C。優(yōu)選的pH值和溫度是在生理范圍，如pH值4、5、6、7或8，和溫度30、35、37或40。C。例如，蛋白酶活性能夠使用任何試驗(yàn)測定，其中使用底物，所述底物包括相應(yīng)于所迷蛋白酶的特異性的肽鍵。實(shí)驗(yàn)部分包括了合適的酶試驗(yàn)方法的實(shí)例，具體參見實(shí)施例2。其它實(shí)例是用于脂肪酶和淀粉酶活性的FIP或Ph.Eur.試驗(yàn)。藥物在本文的上下文中，術(shù)語"藥物"指化合物，或化合物的混合物，其治療、預(yù)防和/或減輕疾病的癥狀，優(yōu)選治療和/或減輕疾病的癥狀。藥物可以由醫(yī)師開出處方，或者可以是非處方(over-the-counter)產(chǎn)品。藥物組合物本發(fā)明的酶的分離、純化和濃縮可以通過常規(guī)方法進(jìn)行。例如，它們可以通過常規(guī)方法從發(fā)酵培養(yǎng)液中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于，離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，并用本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)一步純化，所述方法包括但不限于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和尺寸排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(參見，例如，ProteinPurification,J.畫CJansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發(fā)明的純蛋白酶的制備在本文的實(shí)施例1中描述。在這個(gè)實(shí)例中，從地衣芽孢桿菌生產(chǎn)菌抹中，用定點(diǎn)誘變?nèi)笔Ь幋a所謂組分C蛋白酶(SEQIDNO:4,由SEQIDNO:3編碼)的基因，如本領(lǐng)域所知。缺失這個(gè)基因的另一種方法可以是，例如，傳統(tǒng)突變(classicalmutation),例如美國專利號4,266,031所述，優(yōu)選與現(xiàn)有技術(shù)的高通量篩選方法組合使用。在實(shí)施例1中，表達(dá)SEQIDN0:2的蛋白酶的細(xì)胞源自地衣芽孢桿菌的野生型菌抹，即菌抹ATCC14580，其可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC(AmericanTypeCultureCollection)公開獲得。可以優(yōu)選地將編碼本發(fā)明的蛋白酶的基因的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝插入該細(xì)胞中，所述基因例如編碼SEQIDNO:2的氨基酸1-274的基因。這可以例如按WO02/00907所述，使用例如WO99/43835中公開的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。在具體實(shí)施方案中，將每個(gè)酶的濃縮固體或液體制備物單獨(dú)制備。這些濃縮物也可以，至少部分地，單獨(dú)進(jìn)行配制，如下所詳細(xì)解釋的。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，將酶以固體濃縮物形式包括于本發(fā)明的藥物組合物中。酶能夠通過本領(lǐng)域已知的各種方法形成固態(tài)。例如，固態(tài)可以是結(jié)晶，其中酶分子以高度有序的形式排列；或者是沉淀物，其中酶分子排列形式有序性較低，或者是無序形式。結(jié)晶可以例如在接近酶的pi的pH和低電導(dǎo)率實(shí)現(xiàn)，所述電導(dǎo)率例如10mS/cm或更低，如EP691982所述。各種沉淀方法在本領(lǐng)域已知，包括用鹽沉淀，如硫酸銨，和/或硫酸鈉；用有機(jī)溶劑沉淀，如乙醇，和/或異丙醇；或者用聚合物，如PEG(聚乙二醇)。或者，酶能夠用本領(lǐng)域已知的各種方法通過去除溶劑(通常為水)而從溶液沉淀，所述方法例如凍干、蒸發(fā)(例如在減少的壓力下)，和/或噴霧干燥。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，酶的固體濃縮物中活性酶蛋白的含量為固體濃縮物中總蛋白含量的至少50%(重量/重量)。在還進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，活性酶蛋白的含量相對于固體濃縮物的總蛋白含量是至少55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%(重量/重量)。蛋白含量能夠如本領(lǐng)域已知的進(jìn)行測量，例如通過密度計(jì)掃描考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠；通過使用商業(yè)試劑盒，如ProteinAssayESL,定購號1767003,其可從Roche以商業(yè)方法獲得；或根據(jù)WO01/58276的實(shí)施例8所述的方法。優(yōu)選地，用密度計(jì)掃描考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行測定時(shí)，蛋白酶酶蛋白組成根據(jù)本發(fā)明使用的固體蛋白酶濃縮物的至少50%，更優(yōu)選至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96或至少97%。本發(fā)明的藥物組合物包含酶，所述酶優(yōu)選以濃縮酶制備物的形式，更優(yōu)選以固體濃縮物的形式，并有至少一種可藥用的輔助材料或補(bǔ)充(subsidiary)材料，如(i)至少一種載體和/或賦型劑；或(ii)至少一種載體、賦型劑、稀釋劑，和/或佐劑。任選的其它組分的非限定性實(shí)例(全部為可藥用的)是崩散劑(disintegrator)、潤滑劑、緩沖劑、增濕劑、防腐劑、增香劑、溶劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、推進(jìn)劑和媒介物(vehicle)。通常，根據(jù)所述醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥，可以針對本領(lǐng)域已知的所有施用方式來設(shè)計(jì)本發(fā)明的組合物，優(yōu)選包括腸內(nèi)施用(通過消化道)。因此，組合物可以為固體、半固體、液體或氣體形式，如片劑、膠嚢、粉劑、顆粒劑(granule)、微球(microsphere)、軟膏、乳膏(cream)、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、洗劑(lotion)和氣溶膠。醫(yī)務(wù)工作者將了解選擇最合適的施用途徑，并理所應(yīng)當(dāng)?shù)乇苊鉂撛诘奈ｋU(xiǎn)或不利的施用途徑。下述方法和輔助材料因此也僅作為示例性而絕非用以限制。對于固體口服制備物，所述酶能夠單獨(dú)使用或與合適的添加劑組合使用，以制成小丸(pellet)、微丸(micropdlet)、片劑、微片劑、粉劑、顆粒劑或膠嚢，例如，與常規(guī)載體組合使用，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與賦型劑或粘合劑組合使用，如結(jié)晶狀或微結(jié)晶狀纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與崩散劑組合使用，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或欺曱基纖維素鈉；與潤滑劑組合使用，如巴西棕櫚蠟、白蠟、蟲膠、無水膠狀硅石(waterlesscolloidsilica)、從1500到20000的聚乙二醇(PEG，也稱作macrogol)，特別是PEG4000、PEG6000、PEG8000，聚維酮，滑石，monolein或硬脂酸鎂；并且如果需要，與稀釋劑、佐劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑如對羥基苯曱酸曱酯(E218)、著色劑如二氧化鈦(E171),和增香劑如蔗糖、糖精、橙油、檸檬油和香蘭素組合使用?？诜苽湮锸怯糜谥委烶EI的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的優(yōu)選制備物的實(shí)例。還能夠?qū)⑺雒阜浅３Ｒ?guī)地配制成液體口服制備物,通過將它們?nèi)芙?、懸浮或乳化在水溶劑如水中，或非水溶劑中，如植物性或其它類似的油、合成的脂肪族酸甘油酯、高級脂肪族酸的酯、丙二醇、聚乙二醇如PEG4000，或低級醇，如直鏈或支鏈C1-C4醇，例如2-丙醇；并且如果需要，與常規(guī)補(bǔ)充材料或添加劑組合使用，如增溶劑、佐劑、稀釋劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。此外，所述酶可通過與各種基底(bases)例如乳化基底(emulsifyingbase)或水溶性基底(water-solublebase)混合制成栓劑用于直腸施用。所述栓劑可包括在體溫熔化而在室溫固化的媒介物如可可豆油、碳蠟和聚乙二醇。使用脂質(zhì)體作為遞送媒介物也是一種通?？赡芨信d趣的方法。脂質(zhì)可以是已知的脂質(zhì)體形成脂質(zhì)的任何有用組合，包括陽離子或兩性離子的脂質(zhì)，例如磷脂酰膽堿。剩余的脂質(zhì)通常將是中性或酸性脂質(zhì)，例如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。對于制備脂質(zhì)體，可以使用Kato等(1991)J.Biol.Chem.266:3361所述的方法?？梢蕴峁┯糜诳诜蛑蹦c施用的單位劑型如漿、酏劑、粉劑和懸浮劑，其中每劑量單位，例如，一茶匙、一大湯匙、膠嚢、片劑或栓劑，包含預(yù)先定量的酶。相似地，用于注射的單位劑型可將酶包含在作為無菌水、生理鹽水或其它可藥用載體的溶液的組合物中。術(shù)語"單位劑型"用于本文指適合作為人和動(dòng)物受試者單元?jiǎng)┝?unitarydosage)的物理上的離散單位(physicallydiscreteunit),每單位含有預(yù)先定量的酶，所計(jì)算的量足以產(chǎn)生期望效果。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用于腸內(nèi)施用，優(yōu)選口服施用。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，口服組合物是(i)包含酶晶體的液體組合物；(ii)(高度)純化酶的沉淀的液體懸浮液；(iii)包含固體或溶解的酶的凝膠；(iv)固定化酶或吸附于顆粒上的酶等的液體懸浮劑；或(v)以含酶粉劑、小丸、顆粒劑或微球形式存在的固體組合物，如果需要，以片劑、膠嚢等形式存在的固體組合物，可任選地將所述固體組合物包覆，例如用酸穩(wěn)定的包覆物。在組合物的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，對酶進(jìn)行區(qū)分(compartmentalize),即彼此分離，例如通過分離包覆的方法。在組合物的還進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，將蛋白酶與組合物的其它酶組分分隔，所述其它酶組分如脂肪酶和/或淀粉酶。酶的劑量變化很大，其依賴于所施用的特定的酶、施用頻率、施用方式、癥狀的嚴(yán)重性和受試者對副作用的易感性等。一些特定的酶可能比其它的酶更有效。本發(fā)明的酶的固體口服制備物的實(shí)例包含(i)本發(fā)明的蛋白酶，其包含與SEQIDNO:2的氨基酸1-274具有至少50%同一性的氨基酸序列；(ii)脂肪酶，其與具有SEQIDNO:15的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%同一性；和(iii)淀粉酶，其與選自下組的淀粉酶具有至少70。/。同一性a)具有SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶；其中優(yōu)選地，(i)、(ii)和(iii)的酶的預(yù)期每日臨床劑量如下(全部以mg酶蛋白每kg體重(bw)表示)對于(i)的蛋白酶0.005-500、0.01-250、0.05-100或0.1-50mg/kgbw;對于(ii)的脂肪酶0.01-1000、0.05-500、0.1-250或0.5-100mg/kgbw;對于(iii)的淀粉酶0.001-250、0.005-100、0.01-50或0.05-10mg/kgbw。本發(fā)明的酶的固體口服制備物的優(yōu)選實(shí)例包含(i)包含，優(yōu)選具有，SEQIDNO:2的氨基酸1-274的蛋白酶；(ii)包含SEQIDNO:15的氨基酸2-269的脂肪酶，和/或(iii)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶。(i)、(ii)和(iii)的酶的預(yù)期每日臨床劑量的實(shí)例如下(全部以mg酶蛋白每kg體重(bw)表示)對于(i)的蛋白酶0.05-100、0.1-50或0.5-25mg/kgbw;對于(ii)的脂肪酶0.1-250、0.5-100或1-50mg/kgbw;對于(iii)的淀粉酶0.01-50、0.05-10或0.1-5mg/kgbw。為了口服施用時(shí)更好的穩(wěn)定性，可對酰胺(肽)鍵以及氨基和羧基末端進(jìn)行修飾。例如，可將羧基末端酰胺化。本發(fā)明的藥物組合物的具體實(shí)施方案，其適合于治療消化性病癥、PEI、胰腺炎、嚢性纖維化、i型糖尿病和/或n型糖尿病，可通過將本發(fā)明的酶并入小丸中來制備。所述小丸通常可包含10-90%(重量/重量，相對于所得小丸的干重)生理上可以接受的有機(jī)聚合物，10-90%(重量/重量，相對于所得小丸的干重)的纖維素或纖維素衍生物，和80-20%(重量/重量，相對于所得小丸的干重)的酶，每種情況下，使有機(jī)聚合物、纖維素或纖維素衍生物和酶的總量滿足100%。生理上可以接受的有機(jī)聚合物可選自下組聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、羥丙基曱基纖維素、聚氧化乙烯(polyoxyethylen)、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物(copolymersofpolyoxyethylene-polyoxypropylen)和所述有機(jī)聚合物的混合物。聚乙二醇4000優(yōu)選作為生理上可以接受的有機(jī)聚合物。纖維素或纖維素衍生物可以例如選自纖維素、乙酸纖維素、纖維素脂肪酸酯、硝酸纖維素、纖維素醚、羧曱基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、曱基纖維素、曱基乙基纖維素和甲基羥丙基纖維素。纖維素，特別是微晶纖維素優(yōu)選作為纖維素或纖維素衍生物。所得小丸可以用合適的腸溶衣包覆，用其它非功能性包覆物包覆或不進(jìn)行這種包覆地直接使用。此外，可將所得小丸填充入膠嚢如硬明膠膠嚢或不含明膠的膠嚢，所述膠嚢的大小適合治療上文詳細(xì)描述的病癥或疾病。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，產(chǎn)生自不同酶類型，特別是產(chǎn)生自脂肪酶、蛋白酶和/或淀粉酶的小丸，可以填充入所述膠嚢。當(dāng)用不同酶類型填充膠嚢時(shí)，通過向膠嚢添加指定量的脂肪酶、蛋白酶和/淀粉酶中的任一種，可使單一酶類型(即脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的定量適合于某種適應(yīng)癥組或某種患者亞組的特定需要，即可產(chǎn)生其中脂肪酶蛋白酶淀粉酶的特定比例不同的膠嚢。本發(fā)明的脂肪酶的優(yōu)選藥物組合物在WO2005/092370中描述，特別是包含本文提到的優(yōu)選賦形劑的制劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物包含單、二和三?；视王ズ途垡叶?PEG)C6-C22脂肪族羧酸的單和二酯的聚乙二醇甘油酯(macrogolglyceride)混合物，并且也可能包含小部分的甘油和游離聚乙二醇。包含于聚乙二醇甘油酯混合物中的聚乙二醇(PEG)優(yōu)選為平均每分子有6個(gè)到最多40個(gè)環(huán)氧乙烷單元的PEG,或優(yōu)選為分子量在200-2000的PEG。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供本發(fā)明的酶的藥物組合物，其包含由表面活性劑、共表面活性劑(co-surfactant)和親脂相組成的體系，所述體系具有大于或等于10的HLB(親水-親脂平衡，Hydrophilic-LipophilicBalance)和高于或等于30。C的熔點(diǎn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述體系具有10-16的HLB,優(yōu)選12-15，和30-60(TC的熔點(diǎn)，優(yōu)選在40-50(TC。具體而言，通過HLB值和熔點(diǎn)表征的體系是單、二和三酰基甘油酯與聚乙二醇(PEG)和脂肪族羧酸的單和雙酯的混合物，所述脂肪族羧酸具有8-20個(gè)碳原子，優(yōu)選8-18個(gè)，而聚乙二醇優(yōu)選每分子具有大約6至大約32個(gè)環(huán)氧乙烷單元，并且所述體系任選地包含游離甘油和/或游離聚乙二醇。這種體系的HLB值優(yōu)選用PEG的鏈長調(diào)控。這種體系的熔點(diǎn)通過脂肪酸的鏈長、PEG的鏈長和脂肪酸鏈的飽和度調(diào)控，并且因此受到制備聚乙二醇甘油酯混合物的起始油(startingoil)的調(diào)控。"C8-C18脂肪族羧酸"指混合物，其中將辛酸(C8)、癸酸(CIO)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、椋櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)以重要而可變的比例包含在內(nèi)，如果這些酸是飽和的，則還包括相應(yīng)的不飽和C8-C18羧酸。這些脂肪酸的比例可以根據(jù)起始油而變化。這樣的單、二和三?；视王ズ途垡叶?PEG)與脂肪族羧酸的單和二酯的混合物，其中所述脂肪族羧酸帶有8-18個(gè)碳原子，所述混合物可以例如用聚乙二醇和起始油的反應(yīng)獲得，其中聚乙二醇的分子量在200-1500,并且所述起始油由帶有脂肪酸的甘油三酸酯混合物組成，所述脂肪酸選自包含以下脂肪酸的組辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞麻酸，單獨(dú)存在或者作為混合物。任選地，這種反應(yīng)的產(chǎn)物也可包含小比例的甘油和游離聚乙二醇。這些混合物可以商業(yè)方法獲得，例如以商品名Gelucire⑧。本發(fā)明的一個(gè)有優(yōu)勢的實(shí)施方案提供商品名為Gelucire⑧的商品，特別是"Gelucire⑧50/13"和/或"Gelucire⑧44/14",所述商品代表適合用于根據(jù)本發(fā)明的藥物制備物中的混合物。Gelucire50/13是混合物，包含單、二和三?；视王ズ途垡叶嫉膯魏投ィ謩e具有40%-50。/。的棕櫚酸(C16)和48。/。-58。/。的硬脂酸(C18),組成結(jié)合脂肪酸(boundfattyacid)的主要部分。在每種情況下辛酸(C8)和癸酸(C10)的比例少于3%，并且在每種情況下月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)的比例少于5%。Gelucire44/14是混合物，包含單、二和三酰基甘油酯和聚乙二醇的單和二酯，各比例為棕櫚酸(C16)4-25。/。，硬脂酸(C18)5-35%，辛酸(C8)少于15%，癸酸(C10)少于12%,月桂酸(C12)30-50。/。和肉豆蔻酸(C14)5-25%。Gelucire44/14能夠例如通過使用棕櫚仁油和聚乙二醇1500的醇解/酯化反應(yīng)制備。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案提供本發(fā)明的酶的藥物組合物，其包含的體系含有單、二和三?；视王ヅcC8-C18脂肪族羧酸的聚乙二醇單和二酯的混合物，并還可能含有小比例的甘油和游離聚乙二醇，所述體系具有在40。C-55。C的熔點(diǎn)和在12—15的HLB值。更優(yōu)選地，所述體系具有在44。C-50。C的熔點(diǎn)和在13-14的HLB值?；蛘撸鲶w系具有大約44。C的熔點(diǎn)和14的HLB值，或所述體系具有大約5(TC的熔點(diǎn)和13的HLB值。處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的蛋白酶，任選地與脂肪酶和/或淀粉酶(本發(fā)明的酶)組合，在對動(dòng)物中各種疾病或病癥的治療處理和/或預(yù)防處理中是有用的。術(shù)語"動(dòng)物"包括所有動(dòng)物，特別是人類。動(dòng)物的實(shí)例是非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物，如綿羊、山羊和牛，例如肉牛(cattlebeef)和奶牛。在具體實(shí)施方案中，動(dòng)物是非反芻動(dòng)物。非反芻動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，例如馬、豬(包括但不限于，小豬、正在生長的豬(growingpigs)和母豬(sow));家禽，如火雞、鴨和小雞(chickens)(包括:但不限于雛雞(broilerchick)、蛋雞(layer));牛犢(youngcalves);寵物如貓和狗；和魚(包括但不限于鮭魚(salmon)、鱒魚(trout)、羅非魚(tilapia)、鯰魚(catfish)和鯉魚(carp));和曱殼類動(dòng)物(包括但不限于河奸(shrimp)和對蟲下(prawn))。在具體實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更具體為人類。例如，所述酶對于消化性病癥如消化不良或胃弱(dyspepsia)等的治療有用，所述消化性病癥經(jīng)常由消化酶的產(chǎn)生不足和/或向胃腸道的分泌不足引起，所述消化酶通常分泌自胃和胰腺。此外，所述酶對PEI的治療特別有用。PEI能夠4吏用Borgstr6m測試(JOP.JPancreas(Online)2002;3(5):116-125)驗(yàn)證，并且它可能由以下疾病和癥狀導(dǎo)致如胰腺癌、胰腺和/或胃的外科手術(shù)，例如胰腺的全部或部分切除術(shù)、胃切P余術(shù)、后胃腸分-危術(shù)(postgastrointestinalbypasssurgery)(侈'H口BillrothII式胃腸造口吻合術(shù))；慢性胰腺炎；施-戴綜合征(ShwachmanDiamondSyndrome);胰腺或總膽管的管梗阻(例如來自腫瘤)；和/或嚢性纖維化(遺傳性疾病，其中厚粘液阻塞胰腺管)。所述酶也可以對急性胰^^炎的治療有用。所述酶對消化性病癥的作用效果可以如EP0600868中概括描述的測定；其中實(shí)施例2描述用于測定在胃條件下的脂肪酶穩(wěn)定性測試的體外消化測試，而實(shí)施例3描述用于測定在存在膽汁鹽時(shí)脂肪酶活性的體外消化測試?？梢葬槍Φ鞍酌负偷矸勖附⑾鄳?yīng)的測試。WO02/060474也公開了合適的測試，例如(l)用于測定豬的測試飼料中脂質(zhì)消化的體外測試，和(2)用胰腺機(jī)能不全的豬進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)，測定其中脂肪、蛋白和淀粉的消化性。在具體實(shí)施方案中，使用實(shí)施例3中用于蛋白酶效能的體內(nèi)篩選測試測定本發(fā)明的蛋白酶的效能。作為另一個(gè)實(shí)例，酶對I型和/或II型糖尿病(D/Wefesme/^w)的治療有用，以逐漸減少晚期并發(fā)癥為目的。可以用WO00/54799所述的一個(gè)或多個(gè)方法來確定酶對糖尿病的效果，例如通過控制糖基化血紅蛋白的水平，血糖水平，低血糖發(fā)作(hypoglycaemicattack),脂溶性維生素如維生素A、D和E的狀態(tài)，胰島素的必需每日劑量，體重指標(biāo)和高血糖期。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶不用作清創(chuàng)劑，和/或不用在傷口康復(fù)中。本文描述和提出權(quán)利要求的發(fā)明不限于本文公開的特定實(shí)施方案范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在說明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何相當(dāng)?shù)膶?shí)施方案應(yīng)包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，除了本文所示和所述之外對本發(fā)明的各種修飾，根據(jù)前面的描述，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。這些修飾也應(yīng)包含于所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在發(fā)生沖突的情況下，按照包括定義在內(nèi)的本
發(fā)明內(nèi)容為準(zhǔn)。本文引用的各種文獻(xiàn)，所述文獻(xiàn)的公開通過引用完全并入本文。實(shí)施例實(shí)施例l:純化的地衣芽孢桿菌蛋白酶的制備如下制備SEQIDNO:1的氨基酸1-274的地衣芽孢桿菌蛋白酶的純制備物材壽+和方法TY培養(yǎng)液胰蛋白胨20g/1,酵母提取物5g/l，F(xiàn)eCl2'4H207mg/1,MnCl2-4H201mg/l，MgS04-7H2015mg/1,pH7.3。PS-1培養(yǎng)液蔗糖100g，大豆粉(Soybeanmeal)40g，Na2HPCV12H20(Merck6579)10g，CaC035g,PluronicPE6100(BASF)0.1ml,力口自來K(tapwater)至1000ml。發(fā)酵通過缺失編碼另一個(gè)蛋白酶的基因(SEQIDNO:3)得到源自地衣芽孢桿菌ATCC14580的菌抹，將所述菌株在TY瓊脂培養(yǎng)基(用2%瓊脂固化的TY培養(yǎng)液)上37。C過夜增殖，接種到包含100mlPS-l培養(yǎng)液的搖瓶中。將搖瓶以225rpm的搖動(dòng)速度于"。C溫育卯小時(shí)。純化絮凝發(fā)酵液，將細(xì)胞通過離心從含酶的液體中分離。對上清的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，有相對分子量大約為31kDa的強(qiáng)條帶，其對應(yīng)于期望的蛋白酶。在pH7和9,在P/。脫脂乳瓊脂平板上出現(xiàn)大的澄清區(qū)(dearingzone),也確認(rèn)上清中存在強(qiáng)蛋白酶活性。作為下一步，將離心得到的液體進(jìn)行精細(xì)過濾(polishfilter)以除去殘余的懸浮固體，然后使用適當(dāng)?shù)哪ねㄟ^超濾進(jìn)行濃縮，即膜的截留值(cut-offvalue)在蛋白酶的大小以下。最后將濃縮物過濾除菌(germ-filter)。用100mMH3B03,10mM琥珀酸/NaOH,2mMCaCl2,pH7.0將100ml過濾除菌的液體濃縮物稀釋10倍。所得蛋白酶溶液的pH為7.0。將其中120ml施加于100ml桿菌肽-瓊脂糖柱(UpFrontChromatography,目錄號600-0100),所述柱用100mMH3B03，10mM琥珀酸/NaOH,2mMCaCl2，pH7.0平4軒。在用平衡緩沖液徹底清洗柱后，將柱用lOOmMH3B03,10mM琥珀酸/NaOH,2mMCaCl2,1MNaCl，pH7.0，25%(體積/體積)異丙醇分步洗脫(step-elute)。將桿菌肽-硅石步驟重復(fù)7次(共8次)。合并所有洗出液(420ml)，用脫礦質(zhì)水將洗出液稀釋至15L。將稀釋的蛋白酶的pH用20%CH3COOH調(diào)至pH6.0，并施加于400mlSP-sepharoseFF柱，該柱用50mMH3B03，5mM琥珀酸/NaOH,lmMCaCl2，pH6.0平衡。將柱用平衡緩沖液徹底清洗，用超過3倍柱容積的線性NaCl梯度(O-0.5M)洗脫柱。通過在1.4LG"sephadex柱上的緩沖液交換，將洗脫的蛋白酶峰(200ml)轉(zhuǎn)移至20rnMHEPES/NaOH,100mMNaCl,lmMCaCl2,pH7.0(HEPES是4-(2-羥乙基)-l-(哌。秦乙磺酸))。將緩沖液交換后的蛋白酶(340ml)在0.22n過濾單元(如Coming，目錄號431097)上過濾。實(shí)施例2:酶試驗(yàn)蛋白酶Suc-AAPF-pNA試驗(yàn)底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)。試-驗(yàn)纟爰沖液100mM琥珀酸、100mMHEPES(SigmaH畫3375)、100mMCHES(SigmaC-2885)、100mMCABS(SigmaC-5580)、lmMCaCl2、150mMKCl、0.01%TritonX-IOO，用HC1或NaOH調(diào)至pH9.0。試驗(yàn)溫度25°C。將300^稀釋的蛋白酶樣品與1.5ml試驗(yàn)緩沖液混合，通過加入1.5mlpNA底物(50mg溶于l.OmlDMSO中，并用0.01%TritonX-100進(jìn)一步稀釋45x)開始活性反應(yīng)，在混合后，用分光光度計(jì)監(jiān)控A柳的增加作為對蛋白酶活性的測量。在活性測量之前稀釋蛋白酶樣品，以確保所有活性測量結(jié)果都在試驗(yàn)的劑量-應(yīng)答曲線的線性部分中。蛋白酶FIP試驗(yàn)也可以4吏用FIP^式馬全(F6d6rationInternationalePharmaceutique)測定蛋白酶活性，1FIP-單位=1Ph.Eur,單位(歐洲藥典)。該試'瞼和其它FIP試驗(yàn)一起，在F6d6rationInternationalePharmaceutique,ScientificSection:InternationalCommissionforthestandardisationofpharmaceuticalenzymes,a)"PharmaceuticalEnzymes,"Editors:R.Ruyssen,口A.Lauwers,E.StoryScientia,Ghent,Belgium(1978),b)EuropeanPharmacopoeia中描述。也可參見DeemesteretalinLauwersA，Scharp6S(eds):PharmaceuticalEnzymes,NewYork,MarcelDekker,1997,p.343-385。該試驗(yàn)可以用來確定胰酶制劑(p肌creatin)中的蛋白酶活性。為了確定微生物蛋白酶的FIP活性，可以省略通過添加腸激酶的激活步驟。原理在pH7.5和35。C的溫度用蛋白酶水解底物酪蛋白。通過加入三氯乙酸使反應(yīng)停止，將不降解的酪蛋白過濾去除。通過在275nm處的分光光度法測量確定溶液中殘余的肽的量?；钚缘亩x將蛋白酶的活性根據(jù)未由三氯乙酸的5.0%(重量/體積，即5.0g/100ml)溶液沉淀的肽的量來確定，參考FIP活性已知的胰腺參照粉末(蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn))。材料和方法酪蛋白;容液將1.25g酪蛋白(干物質(zhì))，例如Calbiochem號218680,懸浮于水中，直至得到實(shí)際上澄清的溶液。將pH調(diào)至8.0,用水稀釋溶液至100ml的終體積。在此處和下文中，水指去離子水。硼酸鹽緩沖液pH7.5:將2.5g氯化鈉、2.85g四硼酸二鈉和10.5g硼酸溶于卯Oml水中，將pH調(diào)至pH7.5+/-0.1，并用水稀釋至1000ml。濾纟氏折制的濾器具有125mm直徑，例如Schleicher&Schuell號1574%。濾紙測試通過濾器過濾5ml5.0%三氯乙酸。濾液在275nm處的吸光度應(yīng)該小于0.04,使用未過濾的三氯乙酸溶液作為空白。蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶(月夷&%)可/人InternationalCommissiononPharmaceuticalEnzymes,CentreforStandards,Harelbekestraat72，B-9000Ghent,Belgium以商業(yè)方法獲得。標(biāo)準(zhǔn)品具有以FIP/Ph.Eur.-單位/g表示的標(biāo)記活性(A)。準(zhǔn)確稱重相當(dāng)于大約130蛋白酶-FIP/Ph.Eur,單位的量。加入一抹刀尖(aspatulatipof)的海沙，用幾滴冰冷的0.02M氯化4丐(pH6.0-6.2)潤濕，全部用平端的玻璃棒碾碎。用大約90ml相同的冰冷氯化釣溶液稀釋，并在水浴中攪拌懸浮液15至30分鐘。將pH調(diào)至6.1,用相同的氯化鈣溶液將體積調(diào)至lOOml。用pH7.5的硼酸鹽緩沖液將5.0ml的這種懸浮液稀釋至100ml。對于活性測試，將1.0、2.0和3.0ml的這種溶液用作參照(下文中稱作Sl、S2和S3，S表示標(biāo)準(zhǔn))。測試懸浮液如上所述制備蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)的方法制備樣品懸浮液，使用的樣品量相當(dāng)于大約260FIP/Ph.Eur.-單位。將pH調(diào)至6.1，加水至100ml。將5.0ml這種溶液與5ml氯化4丐溶液混合。將5ml這樣的稀釋液進(jìn)一步用硼酸鹽緩沖液稀釋至100ml。將2.0ml這種溶液用于試驗(yàn)(下文中樣品稱作Un,未知活性的樣品，數(shù)目用n表示)。試驗(yàn)步驟(活性測試)針對三種參照懸浮液(S1、S2、S3)和樣品懸浮液(Un)進(jìn)行試驗(yàn)，全部進(jìn)行三次重復(fù)測定。每種樣品一個(gè)空白是足夠的(分別稱作Slb、S2b、S3b和Unb)。制備不加樣品/標(biāo)準(zhǔn)品的盲樣品(blind)(B),作為分光光度計(jì)的補(bǔ)償液體。如下將硼酸鹽緩沖液加入試管中盲樣品(B)3.0ml;樣品(Un)1.0ml;標(biāo)準(zhǔn)品(S1、S2和S3)分別為2.0、1.0和0ml。向Sl、S2和S3中分別加入1.0、2.0和3.0ml蛋白酶參照標(biāo)準(zhǔn)品。向樣品(Un)試管加入2.0ml測試懸浮液。向所有盲樣品(Slb、S2b、S3b、Unb和B)中加入5ml三氯乙酸，然后立即混合。所有試管用玻璃塞封口，與底物溶液一起置于恒溫(35+A0.5。C)水浴中。當(dāng)溫度達(dá)到平衡時(shí)，在時(shí)間零點(diǎn)，向試管S1、S2、S3和Un中加入2.0ml酪蛋白溶液，然后立即混合。恰好30分鐘后，向Sl、S2、S3和Un的每個(gè)試管中加入5.0ml三氯乙酸，然后立即混合。從水浴中取出試管，于室溫放置20分鐘，使蛋白質(zhì)完全沉淀。每個(gè)試管中的內(nèi)容物用相同的濾器過濾兩次，使用來自試管B的濾液作為補(bǔ)償液體測量275nm處濾液的吸收(abso卬tion)。相對于標(biāo)準(zhǔn)品(S1、S2、S3)的已知標(biāo)記活性(A)計(jì)算以FIP單位表示的樣品(Un)的活性。吸收值減去相應(yīng)的盲樣品值(例如Sl的吸光度減去Slb的吸光度)應(yīng)該在0.15-0.60的區(qū)間內(nèi)。蛋白質(zhì)AU試驗(yàn)變性的血紅蛋白(0.65%(重量/重量)于含脲的6.7mMKH2PCVNaOH緩沖液中，pH7.50)在25。C用蛋白酶降解IO分鐘，用三氯乙酸(TCA)將不降解的血紅蛋白沉淀，并過濾去除。用Folin&Ciocalteu的苯酚試劑(將1體積Folin-CiocalteuPhenolReagentMerck9001.0500加入2體積脫礦質(zhì)水)確定濾液中TCA可溶的血紅蛋白降解產(chǎn)物，所述苯酚試劑與幾種氨基酸一起得到藍(lán)色(在750nm測定)?；钚詥挝?AU)參照標(biāo)準(zhǔn)品測定和定義。變性的血紅蛋白底物可以如下制備將1154g脲(Hamstoff，Merck8487)溶于1000ml脫礦質(zhì)水中，加入240.3gNaOH,然后緩慢地加入63.45g血紅蛋白(Merck4300)，接著加入315.6gKH2P04，并且加脫礦質(zhì)水至3260g。將pH調(diào)至7.63。更多細(xì)節(jié)和合適的Alcalase標(biāo)準(zhǔn)品可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark(試驗(yàn)號EB-SM-0349.0l)請求獲得。脂肪酶pNP試驗(yàn)底物對硝基苯基(pNP)戊酸試驗(yàn)pH:7.7試驗(yàn)溫度40°C反應(yīng)時(shí)間25分鐘帶有黃色的消化產(chǎn)物在405nm有特征吸收。用分光光度法確定它的量。一個(gè)脂肪酶單位是在給定試驗(yàn)條件下，每分鐘釋放1微摩爾可滴定的丁酸的酶量。更詳細(xì)的試驗(yàn)描述AF95/6-GB可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd,Denmark請求獲得。脂肪酶LU試驗(yàn)在這個(gè)試-瞼中，0.16M三丁酸甘油酯(tributyrin)(甘油三丁酸酯，Merck1.01958.000)在pH7.00和30。C(+/-1°。)的脂肪酶催化降解,通過用0.025M脫氣的(de-gassed)、不含C02的氬氧化鈉(Sodiumhydroxidetitrisol,Merck9956)對釋》丈的丁酸進(jìn)行恒-pH滴定(pH-stattitration)來跟蹤。將滴定劑的消耗作為時(shí)間的函數(shù)記錄。將底物用0.6%w/v阿拉伯樹膠乳化劑乳化(20.0g阿拉伯樹膠、89.5gNaCl、2.05gKH2PO4、加水至1.51，放置直至全部溶解，加入2700ml甘油，調(diào)節(jié)pH至4.5。將90ml三丁酸甘油酯與300ml阿拉伯樹膠乳化劑和1410ml脫礦質(zhì)水(demineralisedwater)混合，并且4吏用例如Silverson乳化劑L4RT于7000rpm均質(zhì)化3分鐘，然后調(diào)節(jié)至pH4.75)。脂肪酶樣品首先在0.1M甘氨酸緩沖液(glycinbuffer)pH10.8中稀釋，然后在脫礦質(zhì)水中稀釋，使活性水平為1.5-4.0LU/ml。將15ml乳化的底物溶液倒入滴定容器。加入1.0ml樣品溶液，并且在滴定過程中將pH保持在7.0。測定為維持恒定的pH每分鐘加入的滴定劑的量。活性計(jì)算基于滴定曲線線性范圍的平均斜率?？梢允褂靡阎钚缘臉?biāo)準(zhǔn)品作為校驗(yàn)水平(levelcheck)。1LU(脂肪酶單位)是在上述給定試驗(yàn)條件下，每分鐘釋放1微摩爾可滴定的丁酸的酶量。1kLU(千脂肪酶單位)-IOOOLU。更詳細(xì)試-驗(yàn)說明EB-SM-0095.02可向NovozymesA/S,Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd,Denmark請求獲得。脂肪酶恒定pH試驗(yàn)試驗(yàn)基于在0.65mM膽汁鹽存在下從橄欖油乳劑中由脂肪酶催化釋放脂肪酸。將底物用作為乳化劑的阿拉伯樹膠乳化(將175g橄欖油用630ml阿拉伯樹膠溶液(4000ml水中的474.6g阿拉伯樹膠、64g氯化鈣)在攪拌器中乳化15分鐘；冷卻至室溫后，使用4MNaOH將pH調(diào)節(jié)至pH6.8-7.0)。為了測定，將19ml乳劑和10ml膽汁鹽溶液(將492mg膽汁鹽溶于水中，并補(bǔ)充至500ml)在反應(yīng)容器中混合并加熱至36.9°C至37.5°C。通過加入1.0ml酶溶液開始反應(yīng)。釋放的酸通過加入0.1M氫氧化鈉自動(dòng)于pH7.0滴定，共進(jìn)行5分鐘。從第一分鐘和第五分鐘之間滴定曲線的斜率計(jì)算活性。為了校準(zhǔn)，在三種不同活性水平測定標(biāo)準(zhǔn)品。淀粉酶底物Phadebas片劑(PharmaciaDiagnostics;交聯(lián)、不溶、藍(lán)色的淀4分聚合物，將其與牛血清白蛋白和緩沖物質(zhì)混合，并制成片劑)。試-險(xiǎn)溫度37°C試驗(yàn)pH:4.3(或7.0,如果需要)反應(yīng)時(shí)間20分4中在懸浮于水中后，將淀粉用a-淀粉酶水解，得到可溶的藍(lán)色片段。所得藍(lán)色溶液于620nm測得的吸光度是a-淀粉酶活性的函數(shù)。一個(gè)真菌a-淀粉酶單位(lFAU)是在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件每小時(shí)分解5.26g淀粉(Merck,AmylumsolubileErg.B.6,批號9947275)的酶量。更詳細(xì)的試驗(yàn)說明APTSMYQI-3207可向NovozymesA/S，Krogshoejvej36,DK-2880Bagsvaerd，Denmark請求獲^曰付。實(shí)施例3:地衣芽孢桿菌蛋白酶的體內(nèi)篩選測試在雌性G6ttingen迷你豬(Ellegaard)中測試實(shí)施例1的純化的地衣芽孢桿菌蛋白酶，以胰酶制劑作為基準(zhǔn)(benchmark)。通過結(jié)扎胰管誘導(dǎo)迷你豬的胰腺外分泌機(jī)能不全(PEI)，并且配以回盲折返插管(ileo-caecalre-entrantcannula),上述全部在氟烷麻醉下進(jìn)行，體重為大約25kg,如Tabelingetal.，J.1999，Studiesonnutrientdigestibilities(pre-caecalandtotal)inpancreaticduct-ligatedpigsandtheeffectsofenzymesubstitution,J.Anim,Physiol.A.Anim.Nutr.82:251-263(下文中稱為"Tabeling1999")和Gregoryetal.,J.1999.Growthanddigestioninpancreaticductligatedpigs,Effectofenzymesupplementationin"BiologyofthePancreasinGrowingAnimals"(SGPierzynowski&R.Zabielskieds),ElsevierScienceBV,Amsterdam,pp381-393(下文中稱為"Gregoryetal1999，，)中所述。在研究開始之前，允許用至少4周的時(shí)間從外科手術(shù)中恢復(fù)。在研究開始前，通過糞便胰凝乳蛋白酶測試(可從ImmundiagnostikAGWiesenstrasse4，D-64625Bensheim，Germany以商業(yè)方法獲得，目錄號為K6990)確定每頭豬的PEI狀態(tài)。在研究過程中，將豬圈養(yǎng)在改良的代謝籠(modifiedmetabolismcage)中'采用12:12小時(shí)的明-暗循環(huán)，而且允許自由飲水，并每日喂食兩餐。為了評估蛋白酶效能，將喂食豬的250g測試餐與1升水和0.625gCr203(三氧化二鉻標(biāo)記)混合，并在喂食前即刻混合入不同量的蛋白酶(O、1000、2500、6000FIPU蛋白酶/餐(蛋白酶FIP單位，參見實(shí)施例2))。測試餐包含21.4%蛋白質(zhì)、51.9%淀粉和2.6%脂肪，并具有下述組合物(g/100g干物質(zhì))魚粉3.5、家禽肉粉10.2、小麥粉29.5、帶殼/脫殼稻(shelledrice)14、馬鈴薯淀粉ll、玉米淀粉14、酪蛋白5.9、纖維素粉4.3、維生素、礦物質(zhì)和痕量元素7.6(按照豬的營養(yǎng)需要，參見例如，WO01/58276的表A)。在回腸中第一次出現(xiàn)食物標(biāo)記(綠色食糜)后，收集回腸食糜并置于冰上，持續(xù)進(jìn)行8小時(shí)，在分析前于-2(TC儲(chǔ)存。在單獨(dú)的測定之間允許有至少一天的沖洗(washout)。筒而言之，將冷凍樣品冷凍干燥，并分析干物質(zhì)(DM)和粗蛋白。在103°C溫育8小時(shí)后凍干，然后才艮據(jù)重量估計(jì)DM。根據(jù)氮(N)乘以因子6.25計(jì)算粗蛋白，即斗且蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25,如AnimalNutrition,4thedition,Chapter13(Eds.P.McDonald,R.A.EdwardsandJ.F.D.Greenhalgh,LongmanScientificandTechnical,1988，ISBN0-582-40903-9)中所述。通過Kjeldahl方法(NaumannandBassler，1993,DiechemischeUntersuchungvonFuttermitteln.3editionVDLUFA-Verlag,Darmstadt,Germany(VDLUFA=VerbandDeutscherLandwirtschaftlicherUntersuchungs-undForschungsanstalten))石角定含氮量。根據(jù)下述公式計(jì)算表觀盲腸前(pre-caecal)蛋白質(zhì)消化性<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage39</formula>其中Cr203和蛋白質(zhì)用g/100g干物質(zhì)表示。0203的量可以用本領(lǐng)域已知的方法確定，優(yōu)選通過氧化成#^酸鹽并測定其在365nm處的消光來確定。如Petry和Rapp在ZeitungfiirTierphysiologie(1970),vol.27，p.181-189中所述。本研究的結(jié)果在表l中描述。表l:酶補(bǔ)充對表觀蛋白質(zhì)消化性的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>數(shù)值是平均值士SD。從表1中的結(jié)果顯而易見的是，根據(jù)本發(fā)明的SEQIDNO:2的蛋白酶與已知胰酶制劑制備物表現(xiàn)出相同的活性。本發(fā)明的蛋白酶引起在蛋白質(zhì)消化性上大的且依賴于劑量的改進(jìn)，其在測試的最低劑量已顯示出高效的改進(jìn)。實(shí)施例4:蛋白酶的體外測試在體外測試各種蛋白酶在才莫擬消化條件下降解蛋白質(zhì)的能力。蛋白酶測試下述本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶SEQIDNO:1的氨基酸1-274的地衣芽孢桿菌蛋白酶；SEQIDNO:10的氨基酸1-275的解淀粉芽孢桿菌蛋白酶，和SEQIDNO:11的氨基酸1-269的遲緩芽孢桿菌蛋白酶的變體99aE(在SEQIDNO:11的氨基酸1-269中，在第99個(gè)氨基酸殘基S(Ser)后插入一個(gè)E(Glu))。這些蛋白酶均與SEQIDNO:1的氨基酸1-274具有50%以上的百分比同一性。為了比較，也將一些本發(fā)明之外的枯草桿菌蛋白酶包括在內(nèi)，即來自BacillushalmapalusNCIB12513的蛋白酶(在WO88/01293和WO98/012005(SEQIDNO:42，芽孢桿菌屬菌種JP170)中都有描述)，和來自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40339的蛋白酶(在WO92/017577中作為芽孢桿菌屬菌種TY145描述)。這些蛋白酶均與SEQIDNO:1的氨基酸1-274具有50%以下的百分比同一性。此外，將WO2005/115445中描述的非枯草桿菌蛋白酶擬諾卡氏菌屬蛋白酶(其中的SEQIDNO:1的氨基酸l-188)包括在內(nèi)以作比較。該蛋白酶與SEQIDNO:1的氨基酸l-274也具有50%以下的同一性。最后，將胰酶制劑包括在內(nèi)作為陽性對照。蛋白酶在酶蛋白^出上均以相等劑量施用，即72、36、18和9mg酶蛋白(EP)每餐(250g)。蛋白酶酶蛋白的量根據(jù)A，的值和氨基酸序列(氨基酸組成)來計(jì)算，使用S.C.Gill&RH.vonHippel,AnalyticalBiochemistry182,319-326,(1989)中列出的原理。材料和方法膽汁鹽(即?；悄懰徕c(sodiumtaurocholate)BRP，lot2,來自Ph.Eur或FIP,也可由例如LGCpromochem以商業(yè)方法獲得，500g/mol)、胃蛋白酶(Merck,VL317492437(1.07192))、胰酶制劑(來自SolvayPharmaceuticals)。蛋白酶餐51.9%淀粉、21.3%蛋白質(zhì)和2.6%脂肪/脂質(zhì)。體外模型將蛋白酶飲食(proteasediet)溶于0.1MHC1中至0.2g飲食/mL的濃度。將pH調(diào)至pH3.0(模擬胃的條件)。在微孔板(MTP)的每孔中加入100^L飲食漿、20jiL胃蛋白酶(在脫礦質(zhì)水(Milli-Q)中的終濃度為70mg/L)和30pL蛋白酶(或在無酶對照中加入Milli-Q)。于37。C、700rpm溫育1小時(shí)。在1小時(shí)溫育結(jié)束時(shí)，測得pH為3.4。為了將pH提高至6.0(模擬腸的條件)，每孔中加入25nL混合的pH5/9緩沖液(0.8MMES、0.8M咪唑、0.8M醋酸鈉，pH5.0或pH9.0;40%pH5和60%pH9緩沖液)。此外，加入25(iL膽汁鹽(終濃度為5mM),于37°C、700rpm溫育2小時(shí)。在體外培育后，將MTP于2700rpm(1500g)、4。C離心10分鐘，收集上清用于進(jìn)一步研究。確定游離氨基(OPA)通過與OPA(0-酞二醛(0-phthaldialdehyde》的反應(yīng)來測定游萬氨基，從而分析體外消化的上清。OPA測定的步驟如下將20)iL稀釋的體外上清轉(zhuǎn)移至新的MTP，并加入200OPA試劑(將80mgOPA溶于2ml96%乙醇中；3.8g十水合四硼酸二鈉、1ml10%SDS、88mgDTT和所述OPA-乙醇溶液，用Milli-Q水加至100mL)。測定340nm的吸光度。測定試驗(yàn)中包括一ff絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(0.5mg/mL-0.0078mg/mL)。下面的表2以水解的mM氨基表示結(jié)果。結(jié)果為兩次重復(fù)測定的平均值，也示出了標(biāo)準(zhǔn)偏差(s.d.)。只給出了每餐72mg酶蛋白的結(jié)果，因?yàn)樵谠摐y試中，用較低酶劑量的結(jié)果無法在酶之間進(jìn)行適當(dāng)?shù)貐^(qū)別。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2的結(jié)果顯示本發(fā)明的蛋白酶(SEQ1、SEQIO)在此體外模型中性能非常好。對于不是本發(fā)明的一部分的蛋白酶JP170和TY145則不是這樣。事實(shí)上，不考慮擬諾卡氏菌屬蛋白酶，其是完全不同類型的蛋白酶并且不包括在本發(fā)明中，顯示出與本發(fā)明的SEQIDNO:1的百分比同一性和在此模型中的性能之間存在關(guān)聯(lián)(％同一性越高，性能越好)。在如上所述進(jìn)行的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，我們測試了本發(fā)明的遲緩芽孢桿菌蛋白酶變體(SEQ11變體)的體外性能，其中也將擬諾卡氏菌屬蛋白酶包含在內(nèi)用于比較。劑量-應(yīng)答結(jié)果顯示于下面的表3中。表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>首先，這些結(jié)果表明良好的劑量-應(yīng)答關(guān)系。其次，需要注意的是本發(fā)明的蛋白酶(SEQ11變體)也表現(xiàn)非常好，特別是在劑量為72mgEP/餐時(shí)。SEQ11變體甚至表現(xiàn)得非常符合上述與SEQIDNO:1的百分比同一性和性能之間的關(guān)聯(lián)(相對于擬諾卡氏菌屬蛋白酶，其也包括在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中)。實(shí)施例5:藥用蛋白酶組合物(A)高強(qiáng)度小丸按照如實(shí)施例1所述制備SEQIDNO:1的氨基酸1-274的蛋白酶過濾除菌的液體濃縮物，并噴霧干燥。測得的噴霧干燥的蛋白酶粉中蛋白酶蛋白質(zhì)含量為58.5%。將粉末狀的1125g噴霧干燥的蛋白酶與微晶纖維素(450g)和聚乙二醇4000(Macrogol4000;675g)在商業(yè)上可獲得的混合器中進(jìn)行干式預(yù)混合。加入異丙醇(460g;100%)，所得濕物質(zhì)繼續(xù)于室溫完全混合。然后將均質(zhì)化的物質(zhì)在商業(yè)上可獲得的擠壓機(jī)中擠壓以形成圓柱型小丸，所述擠壓機(jī)裝有沖孔模(piercingdie),所述沖孔模的孔直徑為0.8mm。在擠壓時(shí)小珠溫度(beadtemperature)不超過50。C。產(chǎn)生的擠壓物用商業(yè)上可獲得的制粒機(jī)(spheronizer),通過加入必要量的異丙醇100%(54.5g)滾圓成球形小丸。將小丸在大約40。C的產(chǎn)品溫度在商業(yè)上可獲得的真空干燥機(jī)(來自Voetsch)中干燥。產(chǎn)品溫度不超過45°C。然后通過使用帶有0.7和1.4mm篩的機(jī)械篩選機(jī)分離干燥的小丸。收集20.7mm并且S1.4mm的篩選級分，并且以每份200mg小丸填入尺寸2的膠嚢中。所得干燥小丸的酶蛋白濃度為大約29.3%(w/w)。(B)較低強(qiáng)度小丸與(A)中提供的實(shí)例近似，以2250g的批次大小如下制備具有較低蛋白酶含量的小丸作為藥物使用562.5g粉末形式的噴霧干燥的蛋白酶(測得的蛋白酶蛋白質(zhì)含量為58.5%)、微晶纖維素(1125g)、聚乙二醇4000(562.5g)、用于潤濕的異丙醇(700g)和用于滾圓的異丙醇(61.2g)。所得干燥小丸的蛋白酶濃度為大約14.6%(w/w)。通過應(yīng)用用于來自胰腺粉末的蛋白酶的FIP方法來測定由實(shí)例(A)和(B)所得小丸的蛋白水解活性，其中對所述方法進(jìn)行修飾，即省略活化步驟。相對于起始的粉狀蛋白酶材料，每種情況下小丸中的蛋白水解活性均不存在損失。然后才艮氺居Pharm.Eur.2.9.1(Section"Disintegrationoftabletsandcapsules")測試由實(shí)例(A)和(B)所得小丸的崩散性(測試溶液水-500mL，37°C)。來自實(shí)例(A)的小丸在3分鐘內(nèi)完成崩散。來自實(shí)例(B)的小丸在11分鐘內(nèi)完成崩散。實(shí)施例6:蛋白酶和淀粉酶的藥物組合物如下制備包含淀粉酶和蛋白酶的高強(qiáng)度小丸如DK200500931所述制備淀粉酶的液體濃縮物(過濾除菌的超濾液)，所述淀粉酶具有SEQIDNO:16的氨基酸1-486。將所述液體濃縮物噴霧干燥。噴霧干燥的淀粉酶粉末中測得的淀粉酶蛋白含量為37%。將粉末形式的噴霧干燥的淀粉酶(398.5g)連同實(shí)施例5中制備的噴霧干燥的蛋白酶粉末(746.5g;測得的蛋白酶蛋白含量為58.5%)、微晶纖維素(458g)和聚乙二醇4000(Macrogol4000;687g)在商業(yè)上可獲得的攪拌器中進(jìn)行干式預(yù)混合。加入異丙醇100%(460g)，將所得濕物質(zhì)繼續(xù)在室溫徹底混合。然后將均質(zhì)化的物質(zhì)在商業(yè)上可獲得的擠壓機(jī)中擠壓形成圓柱型小丸，所述擠壓機(jī)裝有沖孔模，所述沖孔模的孔直徑為0.8mm。擠壓時(shí)小珠溫度不超過50。C。產(chǎn)生的擠壓物用商業(yè)上可獲得的制粒機(jī)(spheronizer)通過加入必要量的異丙醇100%(58g)滾圓成球形小丸。使用大約40。C的供給溫度在商業(yè)上可獲得的真空干燥機(jī)(來自Voetsch)中干燥小丸。產(chǎn)品溫度不超過45。C。然后使用具有0.7和1.4mm篩的機(jī)械篩選機(jī)分離干燥的小丸。收集S0.7mm和^1.4mm的篩級分，并且可以每份200mg填充到尺寸2的膠嚢中。所得干燥小丸的蛋白酶濃度為大約19.1%(w/w)，并且所得干燥小丸的淀粉酶濃度為大約6.4%(w/w)。根據(jù)上述方法測試所得小丸的蛋白水解和淀粉分解活性。在每種情況下，分別相對于起始的粉狀蛋白酶或淀粉酶材料，在蛋白水解或淀粉分解活性中均不存在損失。實(shí)施例7:在蛋白酶存在下脂肪酶的體內(nèi)穩(wěn)定性和效能如下測試在存在本發(fā)明蛋白酶(所述蛋白酶具有SEQIDNO:1的氨基酸l-274)的條件下，SEQIDNO:15的疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶變體的穩(wěn)定性和效能在體內(nèi)試驗(yàn)中測試純化的脂肪酶，如要求丹麥申請?zhí)?00500929的優(yōu)先權(quán)的PCT申請的實(shí)施例2中所述，但劑量根據(jù)胰腺FIP試驗(yàn)中估計(jì)的脂肪酶單位而定，所述FIP試—驗(yàn)也在此參考文獻(xiàn)中有描述。也如該參考專利申請中所述來估計(jì)消化性值(脂肪吸收系數(shù)；CFA)。將脂肪酶單獨(dú)測試，并且以各種劑量組合與蛋白酶組合進(jìn)行測試。通過使用胰腺FIP試驗(yàn)確定蛋白酶活性(參見實(shí)施例1)。結(jié)果顯示于下表4中，給出的是平均CFA(%)值，并示出了標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。表4<table>complextableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>對于測試的兩種脂肪酶劑量中的每一種，不加蛋白酶和加入兩種不同劑量的蛋白酶的結(jié)果之間不存在顯著差異。因此能夠得出結(jié)論，蛋白酶對體內(nèi)的脂肪酶無反作用。權(quán)利要求1.與SEQIDNO2的氨基酸1-274具有至少50％同一性的蛋白酶，所述蛋白酶用作藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶，其中a)所述蛋白酶包含選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或b)所述蛋白酶是選自下組的氨基酸序列的變體SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQNO:13的氨基酸1-268,其中所述變體與相應(yīng)的氨基S拼列的差異不多于25個(gè)氨基酸，并且其中(i)和相應(yīng)的氨基酸序列比較，所述變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入中至少一種；和/或(ii)和相應(yīng)的氨基S交序列比較，所述變體包含至少一個(gè)小缺失；和/或(iii)和相應(yīng)的氨基酸序列比較，所述變體包含至少一個(gè)小的N-或C-末端延伸；和/或c)所述蛋白酶是具有選自下組的氨基酸的蛋白酶的等位變體SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268;和/或d)所述蛋白酶是具有選自下組的氨基酸的蛋白酶的片段SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。3.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有選自下組的氨基酸序列SEQIDNO:2的氨基酸1-274、SEQIDNO:5的氨基酸1-274、SEQIDNO:6的氨基酸1-275、SEQIDNO:7的氨基酸1-275、SEQIDNO:8的氨基酸1-275、SEQIDNO:9的氨基酸1-275、SEQIDNO:10的氨基酸1-275、SEQIDNO:11的氨基酸1-269、SEQIDNO:12的氨基酸1-269和SEQIDNO:13的氨基酸1-268。4.權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的蛋白酶，與脂肪酶或淀粉酶組合，用作藥物。5.權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的蛋白酶，與脂肪酶和淀粉酶組合，用作藥物。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的與脂肪酶和/或淀粉酶組合的蛋白酶，其中(i)所述脂肪酶與具有SEQIDNO:15的氨基酸1-269的脂肪酶有至少70%的同一性；并且(ii)所述淀粉酶與選自下組的淀粉酶有至少70%的同一性a)具有SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。7.根據(jù)權(quán)利要求4或5的與脂肪酶和/或淀粉酶組合的蛋白酶，其中(i)所述蛋白酶具有SEQIDNO:2的氨基酸1-274;(ii)所述脂肪酶包含SEQIDNO:l5的氨基酸2~269;并且(iii)所述淀粉酶是選自下組的淀粉酶a)包含SEQIDNO:16的氨基酸1-481的淀粉酶，b)具有SEQIDNO:17的氨基酸1-481的淀粉酶，和c)具有SEQIDNO:18的氨基酸1-483的淀粉酶。8.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所定義的蛋白酶用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、嚢性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。9.權(quán)利要求8的用途，還包含脂肪酶或淀粉酶的用途。10.權(quán)利要求8的用途，還包含脂肪酶和淀粉酶的用途。11.權(quán)利要求9或10的用途，其中所述脂肪酶和/或淀粉酶如權(quán)利要求6或7所定義。12.藥物組合物，其包含權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)定義的蛋白酶，連同至少一種可藥用的輔助材料。13.權(quán)利要求12的組合物，其還包含脂肪酶或淀粉酶。14.權(quán)利要求12的組合物，其還包含脂肪酶和淀粉酶。15.權(quán)利要求13或14的組合物，其中所述脂肪酶和/或淀粉酶如權(quán)利要求6或7所定義。16.用于治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全、胰腺炎、嚢性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法，所述方法通過施用治療上有效量的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所定義的蛋白酶進(jìn)行。17.權(quán)利要求16的方法，其還包括施用治療上有效量的脂肪酶或淀粉酶。18.權(quán)利要求16的方法，其還包括施用治療上有效量的脂肪酶和淀粉酶。19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述脂肪酶和/或淀粉酶如權(quán)利要求6或7所定義。全文摘要涉及SEQIDNO2的氨基酸1-274的蛋白酶，即源自地衣芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶的藥物用途，所述蛋白酶也稱作枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，在所述用途中將該蛋白酶任選地與脂肪酶和/或淀粉酶組合。醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的實(shí)例是治療消化性病癥、胰腺外分泌機(jī)能不全(PEI)、胰腺炎、囊性纖維化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。文檔編號A61K38/48GK101203238SQ200680022643公開日2008年6月18日申請日期2006年6月16日優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日發(fā)明者克勞斯·C·富格爾桑格,彼得·C·格雷戈里,艾倫·斯文德森申請人:諾維信公司;索爾維醫(yī)藥有限責(zé)任公司