專利名稱：：脊髓失調(diào)癥的基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療影響受試者運動功能，特別是受腦部和/或脊髓疾病或損傷影響的運動功能失調(diào)的組合物和治療方法。
背景技術(shù)：
：基因治療是一種新出現(xiàn)的治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的失調(diào)癥的治療模式。CNS基因治療受到了能有效感染分裂期后神經(jīng)元的病毒載體發(fā)展的促進。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由脊髓和大腦組成。脊髓傳導(dǎo)從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到大腦的感覺信息，并傳導(dǎo)從大腦到各種效應(yīng)器的運動信息。關(guān)于用來將基因傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒載體的綜述可參見Davidson等人，(2003)NatureRev.4:353-364的文章。腺相關(guān)病毒(AAV)載體被認為對CNS基因治療有用，因為其擁有有利的毒性和免疫原性特性，能轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元細胞，并能在CNS中介導(dǎo)長期的表達(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8:148-154;Bartlett等人，(1998)Hum.GeneTher.9:1181-1186禾QPassini等人，(2002)丄Neurosci.22:6437-6446)。AAV載體的一個有用的特性依賴于某些AAV載體能忍受在神經(jīng)元細胞內(nèi)的逆向和/或順向運輸?shù)哪芰ΑＴ谝粋€大腦區(qū)域的神經(jīng)元通過軸突相互連接并到達遠端的大腦區(qū)域，因此為載體的傳遞提供了運輸系統(tǒng)。例如，AAV載體可能在或靠近祌經(jīng)元軸突末梢的位置給予。神經(jīng)元納入AAV載體并將其以逆行方式沿著軸突到細胞體的方向進行運輸。腺病毒、HSV和偽狂犬病病毒也顯示出了將基因傳遞到大腦內(nèi)遠端結(jié)構(gòu)的相似特性。(Soudas等人，(2001)FASEB丄15:2283-2285;Breakefield等人，(1991)NewBiol.3:203-218禾口deFalco等人，(2001)Science,291:2608-2613)。幾個小組已經(jīng)報道，用AAV血清型2(AAV2)進行的大腦轉(zhuǎn)導(dǎo)限定于顱內(nèi)注射位點(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8:148-154;Passini等人，(2002)J.Neurosci.22:6437-6446和Chamberlin等人，(1998)BrainRes.793:169-175)。近期的報道顯示，向神經(jīng)的病毒載體的逆向軸突運輸也能發(fā)生在選定的正常小鼠大腦的回路里(Kaspar等人，(2002)Mol.Ther.5:50-56(AAV載體)；Kasper等人，(2003)Science301:839-842(慢病毒載體)禾HAzzouz等人，(2004)Nature429:413-417(慢病毒載體)。Roaul等人，(2005)NatMed.11(4):423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.11(4):429-433報道，肌肉注射表達沉默人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)干擾RNA的慢病毒阻礙了與治療肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amytrophiclateralsclerosis)(ALS)相關(guān)的嚙齒類動物模型的ALS的疾病發(fā)生。被AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞可能表達治療性的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，諸如酶或神經(jīng)元營養(yǎng)因子，來介導(dǎo)有益的胞內(nèi)效應(yīng)。這些細胞也可能分泌這些治療性的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可能隨后被遠端細胞吸收，在這些遠端細胞中其可能介導(dǎo)其的有益效應(yīng)。這個過程己經(jīng)被描述為交叉校正(cross-correction)(Neufeld等人，(1970)Science169:141-146)。然而，治療導(dǎo)致病人運動機能喪失的脊髄異常的組合物和方法的需求仍然存在。本發(fā)明滿足了這個需求并提供了相關(guān)的優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者脊髓和/或腦干區(qū)域的方法和組合物，通過給藥到受試者腦的深部小腦核(DCN)區(qū)域的至少一個區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體可以實現(xiàn)該傳遞。病毒傳遞在有利于轉(zhuǎn)基因在脊髓和/或腦干區(qū)域表達的情況下進行。另一方面，本發(fā)明提供了傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者脊髓的方法和組合物，通過給藥受試者腦運動神經(jīng)皮層區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體可以實現(xiàn)該傳遞。病毒載體的傳遞在有利于轉(zhuǎn)基因在脊髓中表達的情況下進行。給藥到運動神經(jīng)皮層區(qū)域的病毒載體被運動神經(jīng)元通過其細胞體區(qū)域納入，然后轉(zhuǎn)基因得到表達。表達的轉(zhuǎn)基因可能然后經(jīng)歷順向轉(zhuǎn)運到運動神經(jīng)元的軸突終末部分，這個終末部分存在于脊髓中。由于運動神經(jīng)皮層的性質(zhì)，給藥到大腦這個區(qū)域的病毒載體也可能被運動神經(jīng)元的軸突末端納入。病毒載體也可能經(jīng)歷沿著運動神經(jīng)元的軸突的逆向轉(zhuǎn)運并在運動神經(jīng)元的細胞體中表達。進一步提供的是傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者運動神經(jīng)元的方法和組合物，通過給藥受試者腦的深部小腦核區(qū)域的至少一個區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的重組向祌經(jīng)的病毒載體可以實現(xiàn)該傳遞。載體的傳遞在有利于轉(zhuǎn)基因在位于給藥位點遠端的運動神經(jīng)元里表達的情況下進行。也提供的是傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者運動神經(jīng)元的方法和組合物，通過給藥受試者腦運動神經(jīng)皮層區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的向神經(jīng)的病毒載體可以實現(xiàn)該傳遞，并且，在這里，給藥在有利于轉(zhuǎn)基因在位于給藥位點遠端的運動神經(jīng)元里表達的情況下進行。另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者運動神經(jīng)元失調(diào)癥的方法和組合物，通過給藥受試者腦的深部小腦核區(qū)域的至少一個區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體可實現(xiàn)該治療。給藥在有利于治療有效劑量的轉(zhuǎn)基因在脊髓和/或腦干區(qū)域的至少一個分區(qū)里表達的情況下進行。在更進一步的方面，本發(fā)明提供了改善受試者運動神經(jīng)元失調(diào)癥癥狀的組合物和方法，通過給藥受試者腦運動神經(jīng)皮層區(qū)域的含有治療性轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體可實現(xiàn)該改善作用，并且，給藥在有利于治療有效劑量的轉(zhuǎn)基因在脊髓和/或腦干區(qū)域的至少一個分區(qū)里表達的情況下進行。應(yīng)當理解，上述的總體描述和隨后的詳細描述都僅是范例性和解釋性的，都不對本發(fā)明具有限制性。圖1:圖解DCN如何能被用于運輸治療性病毒到脊髓。起源于描畫出DCN輪廓的黑框內(nèi)的線條代表了起源于細胞體(箭頭)的軸突末端，這些細胞體位于脊髓內(nèi)。圖2:再現(xiàn)了通過腦橋延髓接合處和小腦的組織橫切面，顯示了DCN的三個區(qū)域。圖3:沿著小腦頓的界線(矢形切面)截斷然后展平的小腦的示意視圖，及通過脊髓的水平切面和骨骼肌肉系統(tǒng)的圖。其表明了主要的傳入(輸入)途徑。圖4:顯示DCN的主要的傳出路徑(輸出路徑)的圖。圖5:大腦皮層中連接輸入到輸出的神經(jīng)回路的示意圖。爬行纖維在下橄欖體中起始，這些纖維本身即可接受從大腦皮層、脊髓和特異感覺(視覺和聽覺)而來的輸入(信號)。苔狀纖維輸入從所有其他傳入起始，例如前庭傳入、脊柱傳入、肌梭、神經(jīng)腱索、關(guān)節(jié)感受器、皮膚感受器和大腦皮層。在內(nèi)在系統(tǒng)中也有三種抑制器中間神經(jīng)元，包括籃狀細胞、戈爾吉細胞和星狀細胞。這些都涉及到運動神經(jīng)元功能的側(cè)抑制和微調(diào)。圖2至ij圖5者卩是從Williams等人，(2005)TheHumanBrain:Chaper3:TheCerebellum中復(fù)制而來，從網(wǎng)址麗w.vh.orq/adult/providei7anatomy/BrainAnatomy/Ch3Text/Section07.html可以得到這些內(nèi)容。圖6A到圖6E:顯示了在將編碼人ASM的不同AAV血清型載體[(A)2/1，(B)2/2，(C)2/5，(D)2/7和(E)2/8]注射到ASMKO小鼠的深部小腦核后，矢形小腦部分中人酸性神經(jīng)磷脂("hASM")免疫陽性染色。圖7A到7E:顯示了從深部小腦核到脊髓的人酸性神經(jīng)磷脂("hASM")蛋白轉(zhuǎn)運。這個結(jié)果從用AAV2/2-ASM、AAV2/5—ASM、AAV2/7-ASM&AAV2/8-ASM(A)hASM，10倍放大；(B)hASM，40倍放大；(C)激光共聚焦hASM;(D)激光共聚焦ChAT;禾P(E)激光共聚焦hASM&ChAT處理的小鼠中觀察到。圖8:圖示了注射編碼人ASM的不同AAV血清型載體(2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)到深部小腦核后(『5/組)小腦組織勻衆(zhòng)水平。未用相同字母連接的組是顯著不同的(p<.0001)。圖9A到9G:顯示了在注射編碼人ASM的不同AAV血清型載體[(A)2/1、(B)2/2、(C)2/5、(D)2/7禾卩(E)2/8]到ASMKO小鼠的深部小腦核后矢形小腦部分的鈣結(jié)合蛋白免疫陽性染色。'圖10A到10B:顯示了用ASMKO(用AAV-卩gal注射)、WT和AAV-ASM處理的ASMKO小鼠(『8/組)的加速和搖擺旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)(14周齡)。未用相同字母連接的組是顯著不同的。在加速旋轉(zhuǎn)試驗中，用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM注射的小鼠顯示出了比用AAV2/1-egal注射的ASMKO小鼠顯著(p<.0009)更長的延遲跌倒時間。對于搖擺旋轉(zhuǎn)試驗，用AAV2/1-ASM注射的小鼠顯示出了比用AAV2/1-egal注射的小鼠顯著(p<.0001)更長的延遲跌倒時間。圖11A和圖11B:顯示了ASMKO(n=8)、WT(n二8)和雙向AAV-ASM0=5/組)處理的小鼠(20周齡)的旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)。對于加速和搖擺試驗，AAV-ASM處理的小鼠比ASMKOAAV2/1-egal處理的小鼠的表現(xiàn)顯著地更好(p<.001)。在加速和搖擺試驗中，用AAV2/1-ASM注射的小鼠的表現(xiàn)不能同野生型小鼠區(qū)別開來。圖12A:圖解了深部小腦核區(qū)域(內(nèi)側(cè)、中間和外側(cè))和脊髓區(qū)域(頸部、胸部、腰部和骶部)之間的連接。圖12B:圖解了深部小腦核區(qū)域(內(nèi)側(cè)、中間和外側(cè))和腦干區(qū)域(中腦、腦橋和髓質(zhì))之間的連接。這些連接用箭頭表示，這些箭頭起始于神經(jīng)元的細胞體區(qū)域并終結(jié)于神經(jīng)元的軸突終末區(qū)域。例如，DCN的三個區(qū)域每一個均有帶有細胞體的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元傳出軸突并終結(jié)于脊髓的頸部區(qū)域，同時，脊髓的頸部區(qū)域擁有傳出軸突并終結(jié)于DCN的內(nèi)側(cè)或中間區(qū)域的的細胞體。圖13:圖解了編碼綠色熒光蛋白(GFP)的AAV的DCN傳遞后，綠色熒光蛋白在腦干或上部運動神經(jīng)元中的分布。圖14:圖解了編碼綠色熒光蛋白(GFP)的AAV的DCN傳遞后，綠色熒光蛋白在脊髓區(qū)域的分布。圖15:圖解了與編碼GFP的AAV的DCN傳遞后的結(jié)果比較，編碼IGF-1的AAV的DCN傳遞后，腦干中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色的減少。圖16:圖解了與編碼GFP的AAV的DCN傳遞后的結(jié)果作比較，編碼IGF-1的AAV的DCN傳遞后，口部神經(jīng)核中(三叉神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核和面神經(jīng)核)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色的減少。圖17:圖解了與編碼GFP的AAV的DCN傳遞后的結(jié)果作比較，編碼IGF-1的AAV的DCN傳遞后，整個脊髓中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色的減少。圖18:圖解了與編碼GFP的AAV的DCN傳遞后的結(jié)果作比較，編碼IGF-1的AAV的DCN傳遞后，中樞祌經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中IFG-1mRNA的分布。Beta-肌動蛋白用作陽性對照，來比較總mRNA的水平。圖19:圖解了AAV-IGF-1的DCN傳遞促進了運動神經(jīng)元的存活。用編碼IGF-1的AAV處理的小鼠與用編碼GFP的AAV的DCN傳遞處理的小鼠比較，其間的不同是統(tǒng)計學(xué)上顯著的(p值等于0.01)，正如用星號表示的。圖20:圖解了與編碼GFP的AAV的DCN傳遞后的結(jié)果比較，用編碼IGF-1的AAV的DCN傳遞處理的小鼠在旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)、后肢握力和前肢握力上的提升。圖21:圖解了與編碼GFP的AAV的DCN傳遞后的結(jié)果比較，用編碼IGF-1的AAV的DCN傳遞介導(dǎo)的存活率的增加。圖22:顯示了表達GFP的AAV1載體雙向傳遞到深部小腦核(DCN)后，GFP在小鼠大腦的分布。除了DCN外，GFP陽性染色也在嗅球、大腦皮層、丘腦、腦干、小腦皮質(zhì)和脊髓中觀察到。所有的這些區(qū)域均接受從DCN而來的投射(projections)和/或發(fā)出到DCN的投射。，具體實施例方式為了使本發(fā)明更易理解，首先定義某些術(shù)語。其他的定義在整個詳述中進行定義。除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用傳統(tǒng)的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)和重組DNA的技術(shù)，這些均屬于本領(lǐng)域的技能。參見例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch禾卩Maniatis，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,2ndedition(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人編，(1987));METHODSINENZYMOLOGY系歹廿(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M丄MacPherson，B.D.Hames禾口G.R.Taylor編，(1995))，Harlow禾口Lane編，(1988)ANT舊ODIES，ALABORATORYMANUAL禾tlANIMALCELLCULTURE(R丄Freshney編，(1987))。正如在說明書和權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"a""an"和"the"包括復(fù)數(shù)關(guān)系，除非上下文清晰地表明。例如，術(shù)語"一個細胞"包括很多個細胞，包括其的混合物。本文所用的術(shù)語"包括"是指，組合物和方法包括已述的要素，但不排除其他的要素。當用來定義組合物和方法時"基本上山…組成"將意味著排除任何其他的對組合而言是基本顯著的成分的含義。這樣，基本上由在本文中定義的元素組成的組合物將不會排除從分離和純化方法中而來的痕量污染物和藥學(xué)上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖生理鹽水、防腐劑，等等。"由…組成"將意味著排除其他成分和用于給藥本發(fā)明的組合物的基本方法歩驟的超過痕量的成分。被這些過渡術(shù)語的每一個術(shù)語所定義的實施方案都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所有以數(shù)字表示的指定(包括范圍)，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，均是以(+)或(_)0.1增量變動的近似值。應(yīng)當理解，盡管不總是明確的聲明在所有以數(shù)字表示的指定前均加以術(shù)語"大約"。也應(yīng)當理解，盡管不總是明確的聲明在本文中描述的試劑僅是示例性的，以及這些試劑的等價物在本領(lǐng)域中是所共知的。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"是指多核苷酸，其被引入細胞并能被轉(zhuǎn)錄成RNA并能被可選地在適當?shù)那闆r下翻譯和/或進行表達。在一個方面，其能給與其被引入的細胞所希望的特性，或?qū)е滤Ｍ闹委熁蛟\斷結(jié)果。在另一方面，其可能被轉(zhuǎn)錄成介導(dǎo)RNA干擾的分子，例如siRNA。參照病毒滴度所用的術(shù)語"基因組顆粒(gp)"或"基因組同等物"是指含有重組AAVDNA基因組的病毒粒子的數(shù)目，而不管其感染性或功能性。在特定的載體制備物中的基因組顆粒的數(shù)目可以通過諸如在本文的實施例中所描述的或例如，在Clark等人，(1999)Hum.GeneTher，10:1031-1039;Veldwijk等人，(2002)Mol.Ther.，6:272-278文獻中的方法所測量。參照病毒滴度使用的術(shù)語"感染單位(iu)"、"感染顆粒"或"復(fù)制單位"是指感染性的和能復(fù)制的重組AAV載體顆粒的數(shù)目，其可以通過例如在McLaughlin等人，(1988)丄Virol.，62:1963-1973的文章中描述的感染性中心試驗也稱為復(fù)制中心試驗進行測量。參照病毒滴度使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)單元(tu)"是指導(dǎo)致功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物生產(chǎn)的感染性重組AAV載體顆粒的數(shù)目，其可通過諸如在本文實施例中或例如在Xiao等人，(1997)Exp.Neurobiol.，144:113-124;或在Fisher等人，(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU實驗)文章中描述的功能性實驗所測量。術(shù)語"治療的"、"治療有效量"和其的相關(guān)詞指RNA、DNA或DNA和/或RNA的表達產(chǎn)物的量，在受試者中產(chǎn)生保護或發(fā)病延遲或癥狀改善或預(yù)期的生物學(xué)結(jié)果的獲得，諸如神經(jīng)病理學(xué)校正，例如伴隨諸如ALS的運動神經(jīng)元疾病的細胞病理學(xué)。術(shù)語"治療校正"指在受試者中產(chǎn)生保護或發(fā)病延遲或癥狀改善的校正程度。有效量能通過已知的經(jīng)驗方法進行測量。"組合物"也意指包含有效試劑和其他載體的組合，例如，化合物或組合物，無活性的(例如，可檢測的試劑或標記)或有活性的，例如佐劑、稀釋劑、結(jié)合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂溶劑、防腐劑、佐劑或等等。載體也包括藥用輔料和添加劑蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物(例如，糖，包括單糖，二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，例如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖等等和多糖或糖聚合物)，其能單獨或以組合形式存在，由單獨或以組合形式的1-99.99%的重量比或體積比組成。示例性的蛋白質(zhì)輔料包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HAS)、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等等。代表性的氨基酸/抗體組分，其在緩沖液(bufferingcapacity)中也能起作用，包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜緘、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬甜二肽等等。碳水化合物輔料也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其范例包括但不限定于單糖，例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維雙糖等等；多糖，例如棉子糖、松三糖、糊精-麥芽糖合劑、葡聚糖、淀粉等等和醛糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇(maltitol)、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)和肌醇。術(shù)語載體此外還包括緩沖液或pH調(diào)整劑；典型地，緩沖液是從有機酸或堿制備而來的鹽。代表性的緩沖液包括有機酸鹽，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸，或鄰苯二甲酸；Tris,鹽酸氨基丁三醇，或磷酸緩沖液。另外的載體包括多聚物輔料/添加劑，例如聚乙烯吡咯酮、聚蔗糖(一種多聚的糖)、葡聚糖結(jié)合劑(例如環(huán)糊精，例如2-羥丙基-.正交，環(huán)糊精)、聚乙烯乙二醇、調(diào)味劑、抗菌劑、增甜劑、抗氧化劑、拮抗劑、表面活化劑(例如聚山梨酯，例如"吐溫20"和"吐溫80")、脂質(zhì)(例如磷脂，脂肪酸)、類固醇(例如，膽固醇)和鰲合劑(例如，EDTA)。如本文所用的，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何標準的藥用載體，例如磷酸鹽緩沖溶液、水和乳狀液，例如油/水或水/油乳狀液和各種類型的潤濕劑。組合物也能包括穩(wěn)定劑和防腐劑和滿足可用于體內(nèi)的任何上面所提及的載體。載體、穩(wěn)定劑和佐劑的范例可參見MartinREMINGTON'SPHARM.SCI.，15thEd.(MackPubl.Co.，Easton，(1975)和Williams&Williams,(1995)，"PHYSICIAN'SDESKREFERENCE",52nded.，MedicalEconomics,Montvale，N丄(1998)。"受試者"、"個體"或"病人"在此處可替換使用，其指脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。哺乳動物包括，但不限于，小鼠、大鼠、猿猴、人、農(nóng)場動物、運動動物和寵物。"對照"是實驗中用于對照目的的選擇性受試者或樣品。對照可以是"陽性"或"陰性"的。例如，在實驗?zāi)康氖菧y定基因改變的表達水平同特定類型的病理間的相互關(guān)系時(參見ALS，例如，下文)，通常更優(yōu)選使用陽性對照(帶有這樣的改變和表現(xiàn)出那種疾病癥狀特征的受試者或從受試者而來的樣品)，和陰性對照(缺乏改變的表達和那種疾病臨床特征的受試者或從受試者而來的樣品)。當用于基因時，術(shù)語"差異性表達的"指從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的差異性生產(chǎn)。同正?；?qū)φ占毎谋磉_水平相比較，差異性表達的基因可能是過表達或欠表達。一方面，它指比在對照樣品中檢測到的表達水平高或低至少1.5倍，或至少2.5倍，或可選擇的至少5倍，或可選擇的至少10倍的差異。術(shù)語"差異性表達的"也指細胞或組織中的核苷酸序列，這些序列在對照細胞中沉默時表達或在對照細胞中表達時不表達。本文中所使用的，術(shù)語"調(diào)整"指改變效應(yīng)或結(jié)果的數(shù)量或強度，例如增強、擴大、減小或減少。本文中所使用的術(shù)語"改善"同"減輕"是同義的，指減少或減輕。例如，一個人可能通過使疾病或失調(diào)變得更可忍受而改善疾病或失調(diào)的癥狀。在基因傳遞是被DNA病毒載體，例如腺病毒(Ad)或腺相關(guān)病毒(AAV)介導(dǎo)的方面，載體構(gòu)建物指含有一個病毒基因組或其的部分和轉(zhuǎn)基因的多核苷酸。腺病毒(Ads)是一類被相對好地表征的同族病毒，包括超過50個血清型。參見，例如國際PCT申請No.WO95/27071。Ads易于生長，并且不需要整合到宿主細胞的基因組中。重組Ad衍生的載體，特別那些降低了重組和產(chǎn)生野生型病毒可能的載體，也已經(jīng)被構(gòu)建出。參見，國際PCT申請?zhí)朩O95/00655和WO95/11984。野生型AAV具有很高的侵染性和特異地整合到宿主細胞基因組中。參見，Hermonat和Muzyczka，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470和Lebkowski等人，(1988)Mol.Cell.已iol.8:3988-3996。本發(fā)明提供了傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者的脊髓和/或腦干的方法，通過給藥腦的深部小腦核區(qū)域的至少一個區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體可以實現(xiàn)該傳遞，在其中，傳遞在有利于轉(zhuǎn)基因在遠離給藥位點的位點表達的情況下進行。傳遞也可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在給藥位點的表達。除非特別聲明的相反情況，轉(zhuǎn)基因的表達不僅限定于翻譯成多肽或蛋白質(zhì)也包括轉(zhuǎn)基因多核苷酸的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄。另一方面，本發(fā)明提供了傳遞治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到CNS目標細胞的方法，這些目標細胞是經(jīng)受例如ALS或創(chuàng)傷性脊髓傷害等運動神經(jīng)元失調(diào)癥的哺乳動物的神經(jīng)元或祌經(jīng)膠質(zhì)細胞。轉(zhuǎn)基因可以編碼IGF-1。另一方面，本發(fā)明提供了傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者脊髓的方法，通過給藥含有所述轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到腦的運動神經(jīng)皮層區(qū)域可以實現(xiàn)該傳遞，此處所述的傳遞在有利于所述的轉(zhuǎn)基因在遠離所述的給藥位點的位點表達的情況下進行。在另一方面，本發(fā)明的病毒載體被給藥到大腦深部小腦核的至少一個區(qū)域，在這個區(qū)域，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物被表達并傳遞到受試者的脊髓和/或腦千區(qū)域。在另一個實施例中，病毒載體被給藥到互連腦干和脊髓運動神經(jīng)元的大腦深部小腦核的至少一個區(qū)域。這些目標區(qū)域具有同組成運動神經(jīng)元的細胞環(huán)境的細胞(例如中間神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞)的直接聯(lián)系。給藥傳遞轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到運動祌經(jīng)元的細胞環(huán)境，在那里該產(chǎn)物介導(dǎo)組成該細胞環(huán)境的細胞有益的效應(yīng)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者運動神經(jīng)元或調(diào)整轉(zhuǎn)基因在受試者運動祌經(jīng)元中表達的方法，通過給藥到受試者大腦運動神經(jīng)皮層區(qū)域的含有轉(zhuǎn)基因的向神經(jīng)的病毒載體可實現(xiàn)該傳遞，其中轉(zhuǎn)基因在遠離所述的給藥位點的運動神經(jīng)元區(qū)域表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者運動神經(jīng)元失調(diào)癥的方法，通過給藥到受試者大腦深部小腦核的至少一個區(qū)域的含有治療性轉(zhuǎn)基因的向神經(jīng)的病毒載體可實現(xiàn)該治療，在其中轉(zhuǎn)基因在受試者脊髓的至少一個分區(qū)以有效劑量進行表達。這些分區(qū)包括頸部、胸部、腰部或骶部的一個或多個(參見圖1，圖12A)。轉(zhuǎn)基因也可能在腦干，諸如，例如，中腦、腦橋或髓質(zhì)(參見圖12B)的至少一個區(qū)域以治療有效劑量表達。其^可能在受試者腦干的至少一個區(qū)域和受試者脊髓的至少一個分區(qū)以治療有效劑量表達。本發(fā)明也提供了改善受試者運動神經(jīng)元失調(diào)癥癥狀的方法，通過給藥到大腦運動神經(jīng)皮層的含有治療性轉(zhuǎn)基因的向神經(jīng)的病毒載體可實現(xiàn)該改善，在其中所述的轉(zhuǎn)基因在受試者脊髓的至少一個分區(qū)以治療有效劑量表達。這些分區(qū)包括頸部、胸部、腰部或骶部的一個或多個(參見圖1，圖12A)。本發(fā)明的實施的合適向神經(jīng)的病毒載體包括，但不限于腺相關(guān)病毒載體(AAV)，單純皰疹病毒載體(美國專利No.5,672,344)和慢病毒載體。在本發(fā)明的方法中，任何血清型的AAV均能使用。在某些實施方案中，任何血清型的AAV均能使用，只要這些載體能忍受在缺乏疾病抵抗力的大腦中的逆行軸突運輸，或在有抵抗力的大腦中的軸突運輸。在本發(fā)明某些實施方案中使用的病毒載體的血清型選自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5,AAV6，AAV7和AAV8(參見，Gao等人，(2002)PNAS，99:11854-11859和ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols,編者Machida，HumanaPress,2003)。除了此處所列的那些病毒載體外的其他血清型也能使用。此外，假模標本AAV載體也可能用于此處所描述的方法。假模標本AAV載體是在第二個AAV血清型的殼體內(nèi)含有一個AAV血清型的基因組；例如，含有AAV2衣殼和AAV1基因組的AAV載體或含有AAV5衣殼和AAV2基因組的AAV載體(Auricchio等人，(2001)Hum.Mol.Genet，10(26):3075-81)。AAV載體起源于對哺乳動物不致病的單鏈(SS)DNA細小病毒組(在Muzyscka，(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129中進行了綜述)。簡單而言，基于AAV的載體的占(accountfor)去除的病毒基因組的96%功能的r印和cap基因，留下兩段145堿基對(bp)的反向遠端重復(fù)(ITRs)，其用于啟動病毒DNA復(fù)制、包裝和整合。在缺少輔助病毒時，野生型AAV整合到人宿主細胞基因組，其具有在染色體19q13.3的優(yōu)先位點特異性，或其可能保留游離表達。單個的AAV顆粒能容納長達5kb的ssDNA，因此為轉(zhuǎn)基因和調(diào)控元件留下了大約4.5kb的空間，這是典型足夠的。然而，如例如在美國專利No.6,544,785里描述的分子間拼接系統(tǒng)可能將近是這個限制的兩倍。在一個做例證的實施方案中，AAV是AAV2或AAV1。許多血清型的腺相關(guān)病毒，特別是AAV2已經(jīng)被廣泛的研究并被表征成基因治療載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉基于AAV的功能性基因治療載體的制備。關(guān)于用于給藥人類受試者的AAV生產(chǎn)、純化和制備的無數(shù)方法的無數(shù)文獻能在巨大數(shù)量的出版文獻中找到(參見，例如，ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols,編者Machida，HumanaPress,2003)。另外，針對CNS的細胞的基于AAV的基因治療已經(jīng)在美國專利號Nos.6,180,613和6,503,888中進行了描述。另外的示例性AAV載體是編碼人類蛋白的重組AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8血清型載體。在本發(fā)明的某些方法中，載體包括可連接到啟動子的轉(zhuǎn)基因。這個轉(zhuǎn)基因編碼具有生物活性的分子，其在CNS的表達導(dǎo)致神經(jīng)病理學(xué)的至少部分的校正。人ASM的基因組的和功能性的cDNA序列已經(jīng)發(fā)表(參見，例如，美國專利號No.5,773,278禾P6,541,218)。胰島素生長因子-1(IGF-1)基因具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，這是本領(lǐng)域所熟知的。其至少含有兩個從基因轉(zhuǎn)錄本而來的選擇性拼接的mRNA產(chǎn)物。一個是153個氨基酸的肽，通過包括IGF-1A或IGF-1Ea在內(nèi)的多個名字被知曉，一個是195個氨基酸的肽，通過包括IGF-1B或IGF-1Eb在內(nèi)的多個名字被知曉。IGF-1的成熟形式是70個氨基酸的多肽。IGF-1Ea和IGF-1Eb都含有這個70個氨基酸的成熟肽，但在其的羧末端延長的序列和長度上有所區(qū)別。IGF-1Ea和IGF-1Eb的肽序列分別被SEQIDNOS:1和2所表示。人IGF-1的基因組的和功能性的cDNAs，以及其他的關(guān)于IGF-1基因和其的產(chǎn)物的信息，可在Unigene登入號No.NM_00618得到。在真核細胞中轉(zhuǎn)基因表達的水平圭要由在轉(zhuǎn)基因表達框內(nèi)的轉(zhuǎn)錄啟動子決定。顯示出長期的活性并是組織-和甚至細胞-特異的啟動子在某些實施方案中進行了使用。非限制性的啟動子例子包括，但不限于，細胞巨化病毒(CMV)啟動子(Kaplitt等人，(1994)Nat.Genet.8:148-154)，CMV/人e3-珠蛋白啟動子(Mandel等人，(1998)丄Neurosci.18:4271-4284)，GFAP啟動子(Xu等人，(2001)GeneTher.8:1323-1332)，1.8kb特異性神經(jīng)元烯醇酶(NSE)啟動子(Klein等人，(1998)Exp.Neurol.150:183-194)，雞beta-肌動蛋白(CBA)啟動子(Miyazaki，(1989)Gene79:269-277)，e-葡糖苷酸酶(GUSB)啟動子(Shipley等人，(1991)Genetics10:1009-1018)和例如那些從人泛素A、人泛素B和人泛素C分離而來的泛素啟動子，在美國專利No.6,667,174中對此有描述。為了延長表達，其他的調(diào)控元件可能被額外的連接到轉(zhuǎn)基因上，諸如，例如，土撥鼠肝炎病毒后調(diào)控元件(WPRE)(Donello等人，(1998)丄Virol.72:5085-5092)或牛生長激素(BGH)多核苷酸化位點。對于某些CNS基因治療應(yīng)用，控制轉(zhuǎn)錄活性可能是必須的。為了這個目標，用病毒載體進行基因表達的藥理學(xué)調(diào)控能通過包括各種調(diào)控元件和藥物敏感啟動子，例如，在Haberma等人，(1998)GeneTher.5:1604-16011和丫e等人，(1995)Science283:88-91所描述的而獲得。在本發(fā)明的方法中，病毒載體可通過用含有攜帶轉(zhuǎn)基因的病毒載體的組合物接觸神經(jīng)元的終端軸突終末而給藥，允許病毒顆粒被內(nèi)吞并沿著軸突到神經(jīng)元胞體的方向在胞內(nèi)運輸(逆行的)；允許治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物被表達，在其中治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物藉此減輕受試者的病理。效應(yīng)可能在運動神經(jīng)元上，在組成運動神經(jīng)元環(huán)境的細胞(例如中間神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細胞)上，或在二者之上。在某些實施方案中，組合物中載體的濃度至少是(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(x1012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(x109tu/ml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(x101Qiu/ml)。在本發(fā)明另外的方法中，病毒載體能通過用含有攜帶轉(zhuǎn)基因的病毒載體的組合物接觸神經(jīng)元的胞體而給藥，允許病毒顆粒被內(nèi)吞，允許治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物被表達并沿著軸突到神經(jīng)元軸突終末的方向在胞內(nèi)順行運輸，在其中治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物藉此減輕受試者的病理。效應(yīng)可能在運動神經(jīng)元上，在組成運動祌經(jīng)元環(huán)境的細胞(例如中間神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細胞)上或在二者之上。在某些實施方案中，組合物中載體的濃度至少是(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(x1012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(x109tu/ml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(x1010iu/ml)。在一個方面，轉(zhuǎn)基因編碼生物活性分子，該分子在CNS的表達產(chǎn)生至少部分的神經(jīng)病理學(xué)校正。在某些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是抑制受試者SOD表達的RNA分子，藉此減輕和預(yù)防ALS的癥狀。參見Roaul等人，(2005)Nat.Med.11(4):423-428和Ralph等人，(2005)Nat.Med.11(4):429-433。在實施這些方法時的一個方面，轉(zhuǎn)基因表達選自胰島素生長因子-1(IGF-1)、l丐結(jié)合蛋白D28、擬清蛋白、HIF1-alpha、SIRT-2、VEGF、EPO(促紅細胞生成素)、CBP(cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白[CREB]結(jié)合蛋白)、SMN-1、SMN-2和CNTF(睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子)的治療劑量的蛋白。作為選擇地，轉(zhuǎn)基因抑制蛋白的突變形式的表達，例如導(dǎo)致ALS的突變SOD的表達。參見上面的Roaul等人，(2005)和上面的Ralph等人，(2005)。要鑒別人類大腦的結(jié)構(gòu)，參見，例如，TheHumanBrain:Surface,Three-DimensionalSectionalAnatomyWithMRI，andBloodSupply,2nded.，編者Deuteron等人，SpringerVela,1999;AtlasoftheHumanBrain，編者Mai等人，AcademicPress,1997禾tlCo-PlanarSterotaxicAtlasoftheHumanBrain:3-DimensionalProportionalSystem:AnApproachtoCerebralImaging,編者Tamarack等人，ThymeMedicalPub.，1988。要鑒別小鼠大腦的結(jié)構(gòu)，參見，例如，TheMouseBraininSterotaxicCoordinates,2nded.，AcademicPress,2000。圖1概略地顯示了脊髓和其的四個分區(qū)頸部、胸部、腰部和骶部。本發(fā)明提供了調(diào)整、校正或增進經(jīng)受運動神經(jīng)元損傷折磨的受試者的運動功能。僅為了說明的目的，受試者可能遭受肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、脊柱延髓肌萎縮、脊髓性肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調(diào)、原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)或外傷性脊髓損傷中的一種或多種。未局限于理論，伴隨運動神經(jīng)元損傷的病理可能包括運動神經(jīng)元退化、神經(jīng)膠質(zhì)病、神經(jīng)微絲異常、皮質(zhì)脊髓束和前根中有髓鞘神經(jīng)纖維的喪失。例如，兩種類型的發(fā)病己經(jīng)被認識影響上運動神經(jīng)元(皮質(zhì)和腦干運動神經(jīng)元)的延髓發(fā)病影響面部肌肉、語言和吞咽；影響下位運動神經(jīng)元(脊髓運動神經(jīng)元)的四肢發(fā)病被痙攣、全身虛弱、肌萎縮、癱瘓和呼吸衰竭所反射。在ALS中，受試者同時具有延髓和四肢發(fā)病。在PLS中，受試者具有延髓發(fā)病。未局限于理論，本發(fā)明的一個實施方案具有提供治療性分子(例如，蛋白質(zhì)或肽)到脊髓每個分區(qū)的能力。這可能通過注射AAV載體到DCN中而實現(xiàn)。此外，對準每一個脊髓分區(qū)里的個別層狀體可能是重要的。層狀體是大腦和脊髓區(qū)域屮的特定的亞區(qū)域。在某些實施方案中，瞄準在某脊髓分區(qū)里的特定層狀體可能是令人期望的。因為運動神經(jīng)元損傷可能也會在上運動神經(jīng)元里發(fā)生，提供治療性分子(例如，蛋白質(zhì)或肽)到腦干的分區(qū)里也可能是令人期望的。在一個實施方案里，提供治療性分子到脊髓，包括某些或全部亞分區(qū)，及到腦千，包括某些或全部亞分區(qū)里可能是令人期望的。本發(fā)明通過導(dǎo)入一種AAV載體到DCN來實現(xiàn)上面描述的治療性分子到脊髓區(qū)和/或腦干的傳遞。圖12A圖解了深部小腦核區(qū)域和脊髓的聯(lián)接，而圖12B圖解了深部小腦核區(qū)域和腦干間的聯(lián)接。組織并執(zhí)行復(fù)雜的運動動作的能力依賴于從大腦皮層運動區(qū)域，即運動皮層而來的信號。皮質(zhì)運動命令從兩條通道傳下。皮質(zhì)延髓纖維控制腦干里移動面部肌肉的運動核，皮質(zhì)脊髓纖維控制支配軀干和四肢肌肉的脊髓運動神經(jīng)元。大腦皮質(zhì)也通過作用于下行腦干途徑間接地影響脊髓運動活性。初級運動皮質(zhì)位于Broadmann區(qū)的中央前回(4)。投射到脊髓的皮質(zhì)祌經(jīng)元的軸突也在含有大約1百萬根軸突的大量纖維束的皮質(zhì)延髄束里運轉(zhuǎn)。這些軸突的大約1/3起源于額葉的中央前回。另外的1/3起源于區(qū)域6。剩下的起源于軀體感覺皮層的區(qū)域3、2和1并通過背角調(diào)節(jié)向中樞的輸入的傳遞。皮質(zhì)脊髓纖維束通過內(nèi)囊的后肢同皮質(zhì)延髓纖維束共同運轉(zhuǎn)，來到達中腦的腹部。其在腦橋中分離成經(jīng)過腦橋核的小纖維束。其在髓質(zhì)中重組來形成延髓錐體。大約3/4的皮質(zhì)脊髓纖維交叉通過在髓質(zhì)和脊髓的接合處部位的錐體交叉中的正中線。交叉通過的纖維在脊髓側(cè)柱(背外側(cè)束)的背部的部分下行，形成皮質(zhì)延髓側(cè)束。未交叉通過的纖維在腹柱下行成為皮質(zhì)延髓腹側(cè)束。皮質(zhì)脊髓束的側(cè)部和腹部區(qū)域大約在同腦干外側(cè)和中間系統(tǒng)相同的脊髓灰質(zhì)的區(qū)域終結(jié)。外側(cè)皮質(zhì)脊髓束主要投射到腹角的外側(cè)部分里的運動核和中間區(qū)的中間神經(jīng)元。腹部皮質(zhì)脊髓束雙向投射到腹內(nèi)側(cè)細胞柱和含有神經(jīng)支配中軸肌肉的運動神經(jīng)元的中間區(qū)域的毗鄰部分。圖3圖解顯示了主要的向中樞的(傳入)路徑。小腦的深部是定義內(nèi)側(cè)(尖頂?shù)?神經(jīng)核、中間(居間)祌經(jīng)核和外側(cè)(齒狀)神經(jīng)核并稱為深部小腦核的灰質(zhì)。本文中使用的，術(shù)語"深部小腦核"共同地指這三個區(qū)域。圖2圖解顯示了DCN的三個區(qū)域。圖4圖解顯示了從DCN發(fā)出的主要的傳出(輸出)路徑。圖5圖解顯示了大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)回路。圖12A和12B分別圖解顯示了DCN和脊髓或腦干間的聯(lián)接。假如有需要，人類大腦結(jié)構(gòu)能同其他哺乳動物大腦的相似結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來。例如，大多數(shù)的哺乳動物，包括人和嚙齒類動物，顯示了內(nèi)嗅-海馬投射的相似的分區(qū)機體組成，具有在投射到海馬的背部或間隔桿的外側(cè)和內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層的外側(cè)部的神經(jīng)元，然而到腹部海馬的投射主要起源于內(nèi)嗅皮層的內(nèi)側(cè)部分的祌經(jīng)元(PrinciplesofNeuralScience,4thed.，編者一Kandel等人，McGraw-Hill,1991;TheRatNervousSystem,2nded.，編者Paxinos，AcademicPress,1995)。此外，內(nèi)嗅皮層的II層細胞投射到齒狀回，其在齒狀回分子層的外2/3處終結(jié)。從III層細胞而來的軸突雙向投射到海馬的海馬角區(qū)域CA1和CA3，在腔隙層分子層終結(jié)。在一個方面，披露的方法包括將攜帶編碼治療性產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因并允許轉(zhuǎn)基因在給藥位點遠端的CNS中以治療水平表達的向神經(jīng)的病毒載體給藥到受折磨的受試者的CNS的方法。另外，載體可能包含編碼有效治療CNS失調(diào)的生物活性分子的多核苷酸。這樣的生物活性分子可能包含肽，包括但不限于全長蛋白質(zhì)的天然或突變形式，蛋白片段的天然或突變形式，合成多肽，抗體和諸如Fab'分子的抗體片段。生物活性分子也可能包含核苷酸，包括單鏈或雙鏈DNA多核苷酸和單鏈或雙鏈RNA多核苷酸。若需要能應(yīng)用于本文披露的方法的實施的示例性核苷酸技術(shù)的綜述，可參見Kurreck，(2003)J，Eur.丄Biochem.，270，1628-1644[反義技術(shù)];Yu等人，(2002)PNAS，99(9)，6047-6052[RNA千擾技術(shù)]和Elbashir等人，(2001)GenesDev.,15(2):188-200[siRNA技術(shù)]。在一個例證的實施方案中，通過直接注射高滴度載體溶液到受試者或病人的DCN可實現(xiàn)給藥。例如，可以通過直接注射到選自內(nèi)側(cè)(尖頂)區(qū)域、中間(居間)區(qū)域和外側(cè)(齒狀)區(qū)域組成的組中選擇出的一個或多個腦的深部小腦核區(qū)域中而給藥。由于DCN的廣泛的與腦干和脊髓間的傳出和傳入聯(lián)接，DCN是注射的一個吸引人的位點。這些細胞提供了一種有效且最小侵害性的方式來傳遞病毒載體和表達的轉(zhuǎn)基因到脊髓區(qū)域和腦干區(qū)域。未局限于理論，病毒載體可能被軸突末梢吸收并沿著軸突到這些神經(jīng)元胞體的方向逆向運輸，這些神經(jīng)元在整個脊髓區(qū)域和/或腦干投射。具有終止于，例如，脊髓頸部區(qū)域的軸突終端末梢的神經(jīng)元胞體在DCN中也存在。病毒載體被這些胞體吸收或者源于病毒載體的表達出的轉(zhuǎn)基因或二者可能順向運輸?shù)郊顾桀i部區(qū)域的軸突終端末梢。因此，通過使用DCN作為注射位點，僅有小體積的病毒載體被注射，但這在脊髓和/或腦干的遍及一個或多個區(qū)域中介導(dǎo)顯著的轉(zhuǎn)基因表達。在某些實施方案中，方法包含高滴度的攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的向神經(jīng)的載體的給藥方法，以便轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在CNS中遠離第一個位點的第二個位點以治療水平表達。在某些實施方案中，組合物中載體的滴度至少是(a)5，6，7，8，8.4，9，9.3，10，15，20，25或50(x1012gp/ml);(b)5，6，7，8，8.4，9，9.3，10，15，20，25或50(x109tu/ml);或(c)5，6，7，8，8.4,9，9.3，10，15，20，25或50(x101。iu/ml)。在此外的實施方案中，通過直接腦實質(zhì)內(nèi)注射高滴度向神經(jīng)的載體溶液到發(fā)病大腦可完成給藥，此后，轉(zhuǎn)基因在注射位點的遠端、對側(cè)或同側(cè)以治療水平且距離給藥位點至少2，3，5，8，10，15，20，25，30，35，40，45或50毫米的地方表達。第一和第二位點間的距離被定義為給藥位點(第一位點)和遠端位點能檢測到轉(zhuǎn)導(dǎo)的邊界間的最小距離區(qū)域，該距離通過使用本領(lǐng)域已知的操作或在實施例中使用的，例如原位雜交中描述的方法進行測量。更大的哺乳動物CNS中的某些神經(jīng)元可能由于其的軸突投射的原因跨越更大的距離。例如，在人中，某些軸突可能跨越1000毫米的距離或者更大。這樣，在本發(fā)明的多種方法中，載體能以這樣一個距離沿著軸突的整個長度被軸突運輸，來到達并轉(zhuǎn)導(dǎo)母細胞體。CNS中載體給藥的位點以基于所希望的神經(jīng)病理學(xué)的目標區(qū)域和涉及到大腦回路的拓撲學(xué)而選擇，只要給藥位點和目標區(qū)域有軸突聯(lián)接。目標區(qū)域能被定義，例如，通過使用3-D立體定位坐標。在某些實施方案中，給藥位點被選擇以使得注射載體總體積的至少0.1、0.5、1、5、或10%被遠端傳遞在目標區(qū)域至少1、200、500或1000mmS中。一個給藥位點可能會位于被聯(lián)接大腦遠端區(qū)域的投射神經(jīng)元支配的區(qū)域。例如，黑質(zhì)和腹側(cè)節(jié)段區(qū)傳遞致密突起到尾狀體和殼核(共同被稱為紋狀體)。在黑質(zhì)和腹段大腦腳蓋中的神經(jīng)元能通過注射到紋狀體后AAV的逆行運輸用作轉(zhuǎn)導(dǎo)的目標。在另一個實施例中，海馬體接受從大腦的其他區(qū)域而來的清晰的、可預(yù)測的軸突投射。其他的給藥位點可能定位于，例如，脊髓、腦干(髓質(zhì)、中腦和腦橋)、中腦、小腦(包括深部小腦核)、間腦(丘腦、下丘腦)、端腦(紋狀體、大腦皮層或，在皮層中，枕葉、顳葉、頂葉、額葉)或其的組合。第二(目標)位點能位于含有投射到第一(給藥)位點的神經(jīng)元的包括大腦和脊髓的CNS的任何區(qū)域。在某些實施方案中，第二位點在從黑質(zhì)、延髓、腦干或脊髓選出的CNS的區(qū)域。為了明確地傳遞載體到中樞祌經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域，特別是到大腦的特點區(qū)域，可能通過立體定位顯微注射而給藥。例如，在手術(shù)的那一天，病人將擁有固定在位的(以螺絲擰緊到顱骨中)立體定位支架基底。具有腦功能立體定位支架基質(zhì)(適用的帶有可信標記的MRI)的大腦將通過使用高分辨率MRI進行成像。MRI影像然后將被傳遞到運行立體定位軟件的計算機。一系列冠狀、箭頭形和軸的影像將用于確定載體注射的目標位點和軌道。軟件直接將軌道翻譯成同立體定位支架相適的3維坐標。鉆孔打在進入位點之上，含有針的固定的立體定位儀器在給定深度植入。在藥學(xué)上可接受載體中的載體然后將被注射。載體然后通過直接注射到主要的目標位點而給藥，并經(jīng)由軸突逆向運輸?shù)竭h端的目標位點。另外的給藥路線可能會被使用，例如，在直接目視法或其他非-立體定位應(yīng)用時使用的表層皮層用法。另外，由于DCN的每一個區(qū)域都針對CNS的特定區(qū)域(見圖1和圖12A和12B)，因此，能明確地針對CNS的某個區(qū)域，通過預(yù)選擇給藥的DCN區(qū)域轉(zhuǎn)基因能被傳遞至此。明顯的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些技術(shù)，通過變化定位、序列和轉(zhuǎn)基因給藥的數(shù)目，能完成大量的給藥和定向傳遞。給藥物質(zhì)的總體積和給藥載體顆粒的總數(shù)目將基于已知基因治療的方面被本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員決定。治療有效性和安全性能在適當?shù)膭游锬Ｐ椭羞M行檢測。例如，存在大量針對LSDs的被良好表征的動物模型，例如，本文中所描述的或在Watson等人，(2001)MethodsMol.Med.，76:383-403或Jeyakumar等人，(2002)Neuropath.Appl.Neurobiol.，28:343-357和ALS(參見Tu等人，(1996)P.N.A.S.，93:3155-3160;Roaul等人，(2005)Nat.Med.，11(4):423-428禾DRalph等人，(2005)Nat.Med.，11(4):429-433)。在實驗小鼠中，注射的AAV溶液的總體積是，例如，在1到5ul。對于其他哺乳動物，包括人類大腦，體積和傳遞比率被適當界定(scale)。例如，己經(jīng)證明，150ul體積能被安全地注射到靈長類動物的大腦中(Janson等人，(2002)Hum.GeneTher.，13:1391-1412)。治療可能包含每個目標位點單次注射或假如需要，可能沿著注射渠道被重復(fù)進行。多個注射位點能被使用。例如，在某些實施方案中，除了第一次的給藥位點外，含有攜帶轉(zhuǎn)基因的病毒載體的組合物被給藥到第一個給藥位點對側(cè)或同側(cè)的另一個位點。注射能是單次或多次，單側(cè)或雙側(cè)。高滴度AAV制備物能通過使用本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如，在美國專利No.5,658,776禾口ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols,編者Machida，HumanaPress,2003中描述的技術(shù)進行生產(chǎn)。下面的實施例提供了本發(fā)明說明性的實施方案。本領(lǐng)域的一種普通技術(shù)將識別無數(shù)的可能被實施而不改變本發(fā)明的精神或范圍的修改和變化。這樣的修改和變化包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些實施例不是對本發(fā)明的限制。實施例重組載體的滴定AAV載體的滴度根據(jù)基因組拷貝數(shù)目(每毫升中基因組顆粒數(shù))來測量。基因組顆粒濃度基于載體DNA的Taqman⑧PCR，如先前所報道的(Clark等人，(1999)Hum.GeneTher.，10:1031-1039;Veldwijk等人，(2002)Mol.Ther，6:272-278)。簡言之，提純的AAV-ASM用衣殼蛋白消化緩沖液(50mMTris-HCIpH8.0,1.0mMEDTA,0.5%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K)在5CTC處理1小時來釋放載體DNA。DNA樣品同退火到載體DNA特定區(qū)域，諸如啟動子區(qū)、轉(zhuǎn)基因或poly(A)序列的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR結(jié)果然后通過實時Taqman⑧軟件，諸如PerkinElmer-AppliedBiosystems(FosterCity,CA)Prism7700序列檢測系統(tǒng)提供的，進行定量。攜帶能檢測的標記基因，例如e-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白基因(GFP)的載體能通過使用一種侵染性實驗進行滴度測定。易感細胞(例如Hela或COS細胞)用AAV進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后進行諸如用X-gal(5-溴-4氯-3吲哚-P-D-半乳糖苷)進行的e-半乳糖苷酶載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的染色或針對GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的熒光顯微術(shù)的實驗來測定基因表達。例如，實驗可以如下進行4x1(^個HeLa細胞接種在使用正常生長培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板的每一個孔中。在吸附后，即大約24小時后，細胞用Ad5型以感染復(fù)數(shù)(MOI)10進行侵染并用包裝的載體的梯度稀釋物進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后在37。C進行孵育。一到三天后，在廣泛的細胞病變效應(yīng)被觀察到前，恰當?shù)膶嶒炘诩毎线M行(例如，X-gal染色或熒光顯微術(shù))。假如使用了諸如e-半乳糖苷酶的報告基因，細胞在2%多聚甲醛、0.5。/。戊二醛的溶液中固定并用X-gal進行f5-半乳糖苷酶的染色。提供分離良好的細胞的載體稀釋物被進行計數(shù)。每一個陽性細胞代表載體的一個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)。功能性蛋白的表達阻止了治療相關(guān)小鼠模型中的運動損傷。ASMKO小鼠是一種類型A和B尼-皮二氏病的可接受的模型(Horinouchi等人，(1995)Nat,Genetics,10:288-293;Jin等人，(2002)丄Clin,Invest.,109:1183-1191和Otterbach，(1995)Cell,81:1053-1061)。尼-皮二氏病(NPD)被歸類為溶酶體貯存病并是一種遺傳性的神經(jīng)代謝失調(diào)癥，其特征是在酸性鞘磷脂酶中的遺傳缺陷(ASM;神經(jīng)磷脂膽堿磷酸水解酶，EC3.1.3.12)。功能性ASM蛋白的缺乏導(dǎo)致整個大腦的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的溶酶體中神經(jīng)磷脂底物的蓄積。這導(dǎo)致了核周體中大量膨脹溶酶體的形成，這是類型ANPD的標志特點和主要的細胞表現(xiàn)型。膨脹溶酶體的存在同正常細胞功能的喪失和導(dǎo)致受影響個體在幼童時期死亡的進行性神經(jīng)變性過程相互關(guān)聯(lián)(TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDiseases,纟扁者Scriver等人，McGraw-Hill,紐約，2001，3589-3610頁)。第二細胞表現(xiàn)型(例如附加的代謝異常)也同這種疾病相關(guān)聯(lián)，在溶酶體細胞器中顯著高水平的膽固醇蓄積。神經(jīng)磷脂具有對膽固醇的強的親和力，這導(dǎo)致ASMKO小鼠和病人的溶酶體中大量膽固醇的分離(Leventhal等人，(2001)丄Biol.Chem.，276:44976-44983;Slotte，(1997)Subcel1.Biochem.，28:277-293和Viana等人，(1990)丄Med.Genet.,27:499-504)。下面的實驗，評價編碼人ASM(hASM)的重組AAV2/1，AAV2/2,AAV2/5,AAV2/7和AAV2/8血清型載體表達hASM蛋白的相對能力，在深部小腦核的單側(cè)注射后校正膽固醇儲存病理，忍受運輸，拯救浦肯野細胞，和啟動ASMKO小鼠中的功能恢復(fù)。一個附加的ASMKO小鼠組接受了到DCN的雙側(cè)注射來評價增加的轉(zhuǎn)基因蛋白傳播/表達是否將提高行為功能的恢復(fù)。六十六只雄性純合(-/-)酸性祌經(jīng)磷脂酶敲除(ASMKO)小鼠和16只從雜交而來(+/-)的雄性野生型同窩對照鼠被飼養(yǎng)。按照在Gal等人，(1975)NEnglJMed，293:632-636中描述的歩驟用PCR將小鼠進行基因分型。從最初的鼠群而來的小鼠同C57/B16種系進行回交。動物在12:12小時明暗循環(huán)的環(huán)境中飼養(yǎng)并無限制的提供食物和水。所有的操作均在公共機構(gòu)動物關(guān)愛和使用委員會的許可的方法下進行。在用異氟烷麻醉后，小鼠(約7周齡)被用下面的AAV血清型載體(n=8/載體)AAV1-CMV-卩gal、AAV1-CMV-ASM、AAV2-CMV-ASM、AAV5-CMV-ASM、AAV7-CMV-ASM和AAV8-CMV-ASM中的一種進行到深部小腦核(A-P:-5.75從前囟，M-L:-1.8從前囪，D-V:-2.6從硬膜，門牙桿:0.0)的單側(cè)注射。載體用安裝在注射器泵上的10ul哈密爾頓注射器將每個大腦為總共1.86x101()個的基因組顆粒以0.5ul/分鐘的速率進行遞送。每一個載體的最終的注射體積為4ul。手術(shù)的一小時前和24小時后，小鼠被給藥優(yōu)洛芬(5mg/kg;SC)進行止痛。小鼠在注射后的7周進行處死(14周齡)。在處死的時候，小鼠給藥超劑量的戊巴比妥鈉(150mg/kg;IP)并迅速斷頭(n-5/組)或經(jīng)頸動脈灌流(n=3/組)。斷頭小鼠的大腦被迅速移除，在液氮中快速冷凍，切成3個部分(右大腦半球、左大腦半球和小腦)，勻漿，并用ELASA分析hASM。灌流小鼠的大腦和脊髓被檢驗人ASM蛋白的表達、如被菲律賓菌素染色檢測的膽固醇蓄積和用在50um震動(vibratone)切片上的鈣結(jié)合蛋白染色進行的浦肯野細胞存活檢測。接受AAV2/1-卩gal(n=8)、AAV2/1-ASM(n:5)和AAV2/2-ASM(門=5)的雙側(cè)注射(約7周齡)的ASMKO小鼠在經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)試驗后在20周齡進行處死。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，小鼠在Smartrod(AccuScan)被通過加速和搖擺旋轉(zhuǎn)試驗檢測運動功能。示例性的方法在Sleat等人，(2004)丄Neurosci.，24:9117-9126中再現(xiàn)。圖10和11圖解顯示了作為運動功能恢復(fù)檢測手段的旋轉(zhuǎn)試驗的結(jié)果。在人巨細胞病毒立即早期(CMV)啟動子控制下，帶有SV40多腺苷酸序列和雜交內(nèi)含子的全長人ASMcDNA被克隆到一個含有從AAV血清型2而來的ITRs(AAV2ITR)的質(zhì)粒中。Jin等人，(2002)JClinInvest.,109:1183-1191。通過使用一系列含有除AAV類型2復(fù)制基因外的血清型特異的衣殼編碼區(qū)的輔助質(zhì)粒的三重轉(zhuǎn)染，可生產(chǎn)雜交質(zhì)粒。這個策略允許AAV2ITR載體包裝入每一個血清型特異病毒粒子Rabinowitz等人，(2002)JVirol.，76:791-801。用這種方法，hASM重組基因組被用于產(chǎn)生一系列各種血清型包括AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8的rAAV-hASM載體。重組AAV載體通過離子交換色譜進行純化(血清型2/1、2/2和2/5)。O'Riordan等人，(2000)JGeneMed，2:444-54或氯化銫離心法(血清型2/8和2/7)Rabinowitz等人，(2002)丄Urrol.，76:791-801。AAV-ASM病毒顆粒(抗DNA酶的顆粒)的最終滴度通過CMV序列的TaqManPCR進行測定。Clark等人，(1999)Hum.GeneTherapy，10:1031-1039。人ASM抗體是人特異性的并且不能同小鼠ASM交叉反應(yīng)。用稀釋在50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中的單克隆重組人ASM(rhASM)抗體(2ug/ml)包被的(100ul/孔)Coster(Corning,N丫)9018平板在2-80C進行孵育過夜。移除過量的包被抗體，加入封閉稀釋劑(KPL，lnc.，MD)在37℃孵育1小時。平板用微量培養(yǎng)板洗滌器(MolecularDevices,CA)沖洗2個循環(huán)。稀釋在標準稀釋緩沖液(PBS，0.05%吐溫，1%HP-BSA)中的標準、對照和樣品滴入，一式兩份，并被允許在37℃下孵育1小時。平板按上面描述的方法進行沖洗。一百微升生物素化的重組人ASM(rhASM)抗體(在標準稀釋緩沖液中稀釋1:20K)被加入到每一個孔中，并在37℃下孵育1小時，然后用微量培養(yǎng)板洗滌器進行移除。稀釋1:10K的抗生蛋白鏈菌素-HRP(PierceBiotechnology,Inc.,IL)然后被加入(100ul/孔)并在室溫下孵育30分鐘。培養(yǎng)板用上面描述的方法進行清洗，隨后用SureBlueTMB(KPL，lnc.，MD)在36-38QC孵育15分鐘。反應(yīng)用終止溶液(KPL，lnc.，MD)終止，然后用SpectraMax340培養(yǎng)板讀數(shù)器(MolecularDevices,CA)在450nm讀取吸光度的值。通過使用SoftmaxPro4.3軟件(MolecularDevices,CA)完成數(shù)據(jù)分析。每一個樣品的蛋白質(zhì)濃度用使用牛血清白蛋白作為標準的BCA蛋白試驗試齊ij盒(PierceBiotechnology,Inc.,lb)進行測定。小鼠用在pH6.5的0.1M醋酸鈉緩沖液中的含有2%多聚甲醛、0.03%戊二醛、0.002。/。氯化鈣的固定劑進行經(jīng)頸動脈灌流，之后用pH8.5的相同固定劑進行的灌流。小鼠大腦和脊髓被切開并在沒有戊二醛的pH8.5的固定劑中在4。C下進行過夜的后固定。這些組織在pH7.4的0.1M的磷酸鉀緩沖液中被沖洗，被包埋在3.5%的瓊脂并用震動切片機切成50um的矢形切面。大腦和脊髓以50um間距進行矢形振動切片。切片用抗人ASM(1:200)的一抗進行免疫熒光處理。切片在含10%驢血清、0.3。/。TritonX-100的PBS中孵育1小時，然后用生物素化的鼠抗人ASM抗體在含2%驢血清、0.2%TritonX-100的PBS中孵育72小時。在洗滌后，用酪氨信號放大試劑盒(PerkinElmer，Boston,MA)進行信號放大。人ASM蛋白用尼康熒光顯微鏡進行觀察，用SPOT相機和AdobePhotoshop軟件捕捉圖像。菲律賓菌素復(fù)成物(Sigma,St.Louis，MO)首先稀釋到100%甲醇中，用作1mg/ml的儲存濃度。儲存液在-20。C可穩(wěn)定4周。在用PBS^先滌后，切片在新鮮配制在PBS中的10ug/ml菲律賓菌素中于暗處孵育3小時。切片然后用PBS洗滌三次。膽固醇沉著用熒光顯微鏡的紫外濾鏡進行觀察。大腦用直接抗轉(zhuǎn)結(jié)合蛋白的一抗進行免疫熒光處理。切片用磷酸鉀緩沖液(KPB)進行洗滌，然后用磷酸鉀緩沖鹽水(KPBS)進行沖洗。切片然后在含5%的驢血清、0.25%TritonX-100的KPBS中封閉3小時，然后在含5%驢血清、0.2%TritonX-100和鼠抗鈣結(jié)合蛋白抗體(1:2500，sigma，St丄ouis，MO)的KPBS中孵育。在40C孵育72小時后，切片用含0.1%TritonX-100的KPBS沖洗三次。二抗，驢抗鼠CY3抗體(1:333，Jacksonlmm,researchLaboratories,WestGrove,PA)加入到KPBS+0.1%TritonX-100的緩沖液中于室溫孵育90分鐘。切片用KPB洗滌，然后在涂布膠的載玻片上計數(shù)。鈣結(jié)合蛋白陽性細胞在落射熒光顯微鏡(epifluorescence)上觀察。為了定量小腦中的浦肯野細胞，從每一只動物中選擇四片全臉的內(nèi)側(cè)小腦切片。鈣結(jié)合蛋白免疫陽性浦肯野細胞用熒光顯微鏡觀察，細胞體在放大20倍的情況下進行計數(shù)。每一個葉片被分別計數(shù)。在每一個葉片中兩個分離的焦平面被進行計數(shù)。只有在焦點上的細胞被計數(shù)，來確保沒有細胞被計數(shù)兩次。五十(50)ym振動切片首先按上面描述的方法用直接抗人ASM的抗體進行免疫熒光處理。切片然后在PBS中洗滌并用上面描述的針對鈣結(jié)合蛋白的方法進行膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT;兔多克隆，1:500，ChemiconInternational,Temecula，CA)染色。但是是使用驢抗兔FITC抗體(1:200，JacksonlmmunoresearchLaboratories,WestGrove，PA)，而不是用C丫3二抗。首先用落射熒光顯微鏡進行染色觀察，然后用共聚焦顯微鏡獲得圖像。菲律賓菌素染色用下述方法定量。用配備SPOT數(shù)字相機的尼康E600全視野立式落射熒光顯微鏡獲取曝光正確的圖像。首先成像AAV2/1-e-gal組，然后此曝光參數(shù)用于獲取其所有的其它圖像。通過每一個半腦的長度，每一幅分析的圖像代表了一個內(nèi)側(cè)矢狀面。用Metamorph軟件(UniversalImagingCorporation)進行形態(tài)測定分析。AAV2/1-13-gal圖像作為閾值；一旦建立，同樣的閾值用于所有圖像。下面的區(qū)域被使用者手工選取并分別分析小腦、腦橋、髓質(zhì)、中腦、大腦皮層、海馬體、丘腦、下丘腦和紋狀體。每個區(qū)域中的整體強度被測量，并且從動物的給定組而來的所有測量"=3/組)被用于產(chǎn)生平均數(shù)。然后，在經(jīng)治療動物中的膽固醇減少以同敲除0-gal的注射鼠相比較的整體強度的百分比減少進行計算。在深部小腦核中單側(cè)注射AAV-ASM后，陽性hASM免疫染色在整個小腦(表1)、腦橋、髓質(zhì)和脊髓中都被觀察到。表1<table><row><column>結(jié)構(gòu)</column><column>AAV1</column><column>AAV2</column><column>MV5</column><column>MV7</column><column>AAV8</column></row><row><column>深部小腦核</column><column>++++</column><column>++</column><column>+++</column><column>+++</column><column>++++</column></row><row><column>小腦葉</column><column>++++</column><column>++</column><column>+++</column><column>+++</column><column>++++</column></row><row><column>腦橋</column><column>++</column><column>++</column><column>++</column><column>++</column><column>+</column></row><row><column>髓質(zhì)</column><column>+</column><column>++</column><column>++</column><column>+++</column><column>+</column></row><row><column>脊髓</column><column></column><column>+++</column><column>+++</column><column>++</column><column>+</column></row><row><column>丘腦</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column></row><row><column>下丘腦</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column></row><row><column>海馬</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column></row><row><column>紋狀體</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column></row><row><column>大腦皮層</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column><column>*</column></row><table>作為AAV血清型函數(shù)的陽性hASM染色區(qū)域顯示陽性hASM低于檢測限，但膽固醇病理的校正仍然發(fā)生了。小鼠用AAV2/1-ASM在小腦中進行處理并且具有最廣分布的(即在同一個矢形切面里的小葉間分布)hASM表達水平，然而，用AAV2/2-ASM處理的小鼠具有最有限的人ASM蛋白表達水平。用AAV2/5-ASM、AAV2/7-ASM和AAV2/8-ASM處理的小鼠中的人ASM蛋白表達居于這兩組之間。在用血清型1和8處理的小鼠中，矢形切面間的內(nèi)側(cè)-外側(cè)分布是最大的，最小的是注射血清型2的小鼠。開始內(nèi)側(cè)-外側(cè)傳布模式的血清型5和7居于血清型1和2之間。小腦的每一層(即分子、浦肯野和顆粒)用每一種AAV血清型進行轉(zhuǎn)導(dǎo)；然而，對分子層的親和力增加對所有血清型都是明顯的。在用血清型1和5處理的小鼠中，浦肯野細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)是最大的。注射血清型7的小鼠具有最少數(shù)目的轉(zhuǎn)導(dǎo)浦肯野細胞。用血清型8處理的小鼠也幾乎有極少的轉(zhuǎn)導(dǎo)浦肯野細胞，但當同血清型1、2、5和7相比較時，其在顆粒層中具有更少的ASM表達。用ASM轉(zhuǎn)導(dǎo)的浦肯野細胞出現(xiàn)了健康的細胞結(jié)構(gòu)。通過ELISA進行的小腦組織勻漿中AAV介導(dǎo)hASM蛋白表達的的定量分析支持這些免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)。當同所有其它其小鼠比較時，注射血清型1和8的小鼠證明了顯著(p<.0001)更高的小腦hASM蛋白水平。注射血清型2、5和7的小鼠小腦hASM水平不高于WT水平(即背景)。正如所期望的，在野生型小鼠中未檢測到人ASM-在ELISA中使用的hASM抗體是人特異的。功能性ASM蛋白的缺乏導(dǎo)致神經(jīng)磷脂的溶酶體蓄積，隨后導(dǎo)致諸如異常膽固醇運輸?shù)牡诙x缺陷。Sarna等人，Eur.丄Neurosci.，13:1873-1880和Leventhal等人，(2001)丄Biol.Chem.，276:44976-4498。ASMKO小鼠大腦中游離膽固醇蓄積通過使用菲律賓菌素，從菲律賓鏈霉菌中分離而來的自發(fā)熒光分子，進行觀察。野生型小鼠大腦對菲律賓菌素不呈陽性染色。在所有AAV處理的小鼠(AAV2/1-Pgal除外)中，菲律賓菌素染色的清除(表2)同指明每一種血清型載體均能產(chǎn)生功能型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的hASM免疫染色陽性的面積重疊。表2<table></column></row><row><column></column><column>2/1</column><column>2/2</column><column>2/5</column><column>2/7</column><column>2/8</column></row><row><column>小腦</column><column>96.54±2.14</column><column>93.85±1.257</column><column>86.75±9.58</column><column>96.47±1.93</column><column>99.12±.66</column></row><row><column>中腦</column><column>96.72±1.73</column><column>53.08±22.89</column><column>65.88±24.53</column><column>73.39±22.39</column><column>91.10±.105</column></row><row><column>腦橋</column><column>91,31±5,80</column><column>50.07±21.26</column><column>70.96土25.60</column><column>93.15±31.20</column><column>96.72±1.20</column></row><row><column>髓質(zhì)</column><column>93.29±6.22</column><column>88.46±3.04</column><column>81.55±17.31</column><column>80.73±14.99</column><column>97.40±1.60</column></row><row><column>丘月畝</column><column>48.88±25.25</column><column>41.21±27.35</column><column>34.86±16.67</column><column>48.44±28.65</column><column>77.03±12.08</column></row><row><column>下丘腦</column><column>82.81±10.14</column><column>86.96±12.93</column><column>88.46±5.90</column><column>82.95土11.46</column><column>99.68±.31</column></row><row><column>皮層</column><column>27.60±24.75</column><column>73.62±14.9</column><column>55.65±28.8</column><column>76.97土14.27</column><column>98.30±.34</column></row><table>同在選定的大腦區(qū)域中，在小腦內(nèi)注射編碼人ASM的不同AAV血清型(門=3/血清型；2/1,2/2，2/5,2/7，和2/8)到ASMKO小鼠的深部小腦核后用AAV-(3gal處理的ASMKO小鼠相比較的菲律賓菌素(即膽固醇)清除百分比減少。正如先前被(Passini等人，(2003)"SocietyforNeuroscience，，，NewOrleans,LA)證明的，菲律賓菌素的清除也在同注射位點在解剖學(xué)上聯(lián)接的區(qū)域中發(fā)生，但其不對hASM呈陽性染色。Metamorph分析表明，菲律賓菌素染色的減少在整條吻尾軸中發(fā)生。在小腦和腦干中，在用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM處理的小鼠中菲律賓菌素減少最多，然而，在間腦和大腦皮層中，用AAV2/8-ASM注射的小鼠具有菲律賓菌素清除的最好總水平(表2)。雖然如此，這些結(jié)果表明，校正在ASMKO小鼠CNS中的膽固醇蓄積病理所需的hASM水平是最小限量的(即低于hASM免疫熒光檢測限)。組織學(xué)研究表明，ASMKO小鼠小腦經(jīng)歷了快速惡化。更明確地，浦肯野細胞在8和20周齡之間進行性死亡(Sarna等人，(2001)Eur.丄Neurosci.，13:1813-1880禾口Stewart等人，(2002)，"SocietyforNeuroscience"，Orland,FL)。鈣結(jié)合蛋白是一種廣被接受的浦肯野細胞標記。在AAV-ASM處理的小鼠中陽性鈣結(jié)合蛋白染色表明AAV介導(dǎo)的hASM表達是治療性的。全部我們的結(jié)果表明，小腦中AAV介導(dǎo)的hASM表達阻止了ASMKO小鼠中浦肯野細胞的死亡(表3)。正如所希望的，浦肯野細胞存活在小葉l-lll中不發(fā)生；小鼠在7周齡進行注射，8周這些細胞的大多數(shù)已經(jīng)死亡。在小葉IVA/中，浦肯野細胞存活在用血清型1處理的小鼠中是最大的。在小葉VI中，在AAV處理的小鼠中沒有觀察到顯著的浦肯野細胞的存活。在小葉VII中，僅有用血清型5處理的小鼠顯示了顯著的浦肯野細胞存活。在小葉VIII中，用血清型5和血清型2處理的小鼠又顯示了顯著的浦肯野細胞存活。在小葉IX和X中，在WT和KO小鼠間(或在AAV處理的小鼠間)浦肯野細胞計數(shù)沒有顯著的不同。這是被期望的，因為在14周齡(即處死的年齡)，在ASMKO小鼠的這些小葉中的浦肯野細胞仍然是有活力的。在所有的小葉中，在用血清型1、2和5處理的小鼠中的浦肯野細胞存活是最大的，在用血清型7和8處理的小鼠中的浦肯野細胞存活是最低的。表3200680023365.X說明書第25/31頁<table><row><column></column><column></column><column>2/1</column><column>2/2</column><column>2/5</column><column>2/7</column><column>2/8</column><column>KO</column><column>WT</column></row><row><column></column><column>I/II</column><column>7.42±9.80</column><column>4.5±10.58</column><column>9.40±11.59</column><column>12.33±10.58</column><column>1±9.16</column><column>5.8±11.59</column><column>113±10.58</column></row><row><column></column><column>III</column><column>12.42±10.32</column><column>11.33±11.14</column><column>26.80±12.21</column><column>15.33±11.14</column><column>9.8±12.21</column><column>2±9.65</column><column>147.50±11.14</column></row><row><column></column><column>IV/V</column><column>60.57±17.28</column><column>36.5±18.67</column><column>27.80±20.45</column><column>29.66±18.67</column><column>6.8±20.45</column><column>8±16.16</column><column>220.66±18.67</column></row><row><column></column><column>VI</column><column>61.14±11.21</column><column>27.5±12.11</column><column>72.20±13.26</column><column>31.16±12.11</column><column>3.8±13.26</column><column>68.5±10.48</column><column>121.16±12.11</column></row><row><column></column><column>VII</column><column>17.42±4.15</column><column>37.66±4.49</column><column>40.60±4.91</column><column>5.33±4.49</column><column>2±4.95</column><column>17.37±3.88</column><column>37.16±4.49</column></row><row><column></column><column>VIII</column><column>44.14±10.75</column><column>48.66±11.62</column><column>82.80±12.73</column><column>11.33±11.62</column><column>18.40±12.73</column><column>35.12±10.06</column><column>103.33±11.62</column></row><row><column></column><column>IX</column><column>126.28±19.17</column><column>102,66±20.71</column><column>136.40±22.68</column><column>60.16±20.71</column><column>84.40±22.68</column><column>108.0±17.93</column><column>144±20.71</column></row><row><column></column><column>X</column><column>89.85±12.54</column><column>76.83±13.55</column><column>93.80±14.84</column><column>48.16±13.55</column><column>64.80±14.84</column><column>87±11.73</column><column>86.66±13.55</column></row><table>在小腦內(nèi)注射編碼人ASM的不同AAV血清型(n=3/血清型；2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)到ASMKO小鼠的深部小腦核后，在WT和ASMKO小鼠的小腦小葉l-X中的浦肯野細胞計數(shù)。黑斜體數(shù)字同KO小鼠(即用AAV2/1-f3gal處理的小鼠)是顯著不同的p≤.01。在加速旋轉(zhuǎn)試驗中，用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM單側(cè)注射的小鼠證明了比用AAV2/1-βgal注射的ASMKO小鼠顯著(p<.0009)更長的延遲跌倒時間。用血清型AAV2/1-ASM注射的小鼠同野生型小鼠不是顯著不同。用AAV2/2-ASM和AAV2/5-ASM注射的小鼠比用AAV2/1-βgal注射的ASMKO小鼠顯示出了更長延遲跌倒時間的趨勢；然而，用AAV2/7-ASM注射的小鼠并非如此。對于搖擺旋轉(zhuǎn)試驗，只有用AAV2/1-ASM注射的小鼠比用M2/1-βgal注射的小鼠證明了一個顯著(p<.0001)更長的延遲跌倒時間。在這種情況下，野生型小鼠比用AAV2/1-ASM注射的小鼠表現(xiàn)得顯著更好。對于加速和搖擺試驗，接受AAV2/1-ASM或AAV2/2-ASM雙側(cè)注射的ASMKO小鼠比ASMKOAAV2/1-βgal處理的小鼠均表現(xiàn)得顯著(p<.001)更好。對于這兩個試驗，AAV2/1-ASM雙側(cè)注射的小鼠表現(xiàn)能同野生型小鼠相當。測定ASMKOCNS中AAV產(chǎn)生的hASM是否具有功能性活性的一個途徑是評價其對膽固醇蓄積病理-NPA疾病的二級代謝缺陷的影響。在所有AAV處理的小鼠中(除了AAV2/1-egal)，膽固醇蓄積病理的校正同指明每一種血清型載體均能產(chǎn)生功能型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的hASM免疫染色陽性的面積重疊。正如上面證明的，異常膽固醇代謝校正也在同注射位點解剖學(xué)上聯(lián)接的區(qū)域中發(fā)生，但也在hASM染色不呈陽性的區(qū)域發(fā)生，這暗示，校正膽固醇蓄積病理所需的hASM水平是最低限度。同這些hASM組織化學(xué)和生物化學(xué)結(jié)果相一致地，用血清型1和8處理的小鼠證明了膽固醇蓄積病理的顯著降低。用血清型2、5和7處理的小鼠也顯示了膽固醇蓄積病理的降低，但程度同用血清型1和8處理的小鼠不同。肌蔞縮性側(cè)索硬化(ALS)的治療相關(guān)模型肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)是致命的神經(jīng)變性疾病，其特點是皮層、腦干和脊髓中運動神經(jīng)元的選擇性喪失。該病的進展能導(dǎo)致四肢、軸和呼吸肌的肌萎縮。運動神經(jīng)元細胞死亡伴隨著反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤病、神經(jīng)微絲異常和皮質(zhì)脊髓束及腹根1—6中巨大有髓鞘神經(jīng)纖維的顯著損失。盡管對ALS的病原學(xué)所知甚少，積累的證據(jù)表明，散發(fā)的(SALS)和家族性(FALS)ALS具有許多相似的病理特征；這樣，提供了其中一種類型疾病的研究將導(dǎo)致一種共同治療方法的希望7。FALS大約占診斷病例的10%，其20%伴隨Cu/Zn超氧化物歧化酶(S0D1)8的顯性遺傳突變。表達突變?nèi)薙OD1蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠(例如SOD1"sa小鼠)再現(xiàn)了ALS的許多病理特征，是研究ALS的一種有效動物模型9。對于SALS，無數(shù)的病理機制已經(jīng)牽扯到下面的原因，包括谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性中毒、毒素接觸、蛋白酶體異常、線粒體損傷、祌經(jīng)微絲分裂和神經(jīng)營養(yǎng)支持的喪失10'11。截至目前，尚無ALS的有效治療方法。諸如胰島素生長因子1(IGF-1)的神經(jīng)營養(yǎng)因子由于其在ALS治療上的潛在有用性已經(jīng)被廣泛研究。病毒載體到聯(lián)接腦干和脊髓運動神經(jīng)元的CNS區(qū)域的頗內(nèi)傳遞(能進行軸突運輸?shù)?提供了給藥潛在治療藥物，諸如IGF-1，到那些通過在先的技術(shù)方法很難到達的區(qū)域的方法。未局限于理論，這些目標區(qū)域可能不必需要同運動神經(jīng)元的直接聯(lián)接；即，這些目標區(qū)域具有同僅組成運動神經(jīng)元細胞環(huán)境的細胞(例如，中間神經(jīng)元和星形細胞)的直接聯(lián)接就足夠了。這個推想被正常和SOD1突變細胞混合體的嵌合鼠的研究所支持。這些試驗顯示，不表達突變SOD1的非神經(jīng)元細胞延遲了退化并顯著增大了突變表達的運動神經(jīng)元的存活13。此外，另外的試驗已經(jīng)證明，組成運動神經(jīng)元的細胞環(huán)境的細胞(例如星形細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞)是神經(jīng)營養(yǎng)因子的重要來源，這些細胞的損傷(如在ALS中的病理性發(fā)生)已經(jīng)被暗示是造成運動神經(jīng)元退化的潛在因子之一11。可能支持治療性病毒載體和/或表達蛋白到運動神經(jīng)元細胞環(huán)境的運輸?shù)腃NS的區(qū)域是小腦的深部小腦核(DCN)。DCN具有同腦干和脊髓的大量傳入和傳出聯(lián)接(見圖1)14—19。用能進行軸突運輸?shù)牟《据d體靶向患有神經(jīng)代謝疾病的小鼠模型的DCN,在腦干和脊髓中均檢，到了轉(zhuǎn)基因蛋白2、有意思的是，轉(zhuǎn)基因蛋白在那些對膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT')，一個運動神經(jīng)元標記，呈陽性和陰性的細胞中均檢測到。小鼠和大鼠中超氧化物歧化酶-1(S0D1)基因突變的過表達概要重現(xiàn)了人類ALS的臨床和病理學(xué)特點。延緩此模型癥狀的活性化合物已經(jīng)被顯示出對患ALS的病人具有可預(yù)言的臨床有效性，因此是該病的一種治療相關(guān)模型。這樣的小鼠模型先前已經(jīng)在Tu等人，(1996)P.N.A.S.，93:3155-3160;Kaspar等人，(2003)Science,301:839-842;Roaul等人，(2005)Nat.Med.，11(4):423-428禾nRalph等人，(2005)Nat.Med.，11(4):429-433中進行了描述。當前的實驗，因此，試圖來研究AAV-IGF-1的雙側(cè)DCN傳遞對有癥狀的(即90天齡)S0D1G93A小鼠疾病進展的影響。特別地，主要目標是確定AAV-IGF-1的傳遞能否導(dǎo)致(1)到腦干和脊髓的載體和/或蛋白傳遞；(2)在腦千和脊髓中的神經(jīng)病理的減少；(3)運動行為功能的提高和(4)顯著的壽命延長。結(jié)果表明，病毒載體注射到互聯(lián)腦干和脊髓的CNS區(qū)域是傳遞潛在的治療性轉(zhuǎn)基因到腦干和脊髓的一種有效的方法。而且，我們的結(jié)果支持設(shè)計來通過修飾其的分子環(huán)境治療運動祌經(jīng)元退化的治療方法的發(fā)展。兩個研究在G93ASOD1中進行(S〇D1G93A突變小鼠，此處用SOD1小鼠表示)。這個模型接近地模擬了人類ALS。在小鼠的大約90天齡時會出現(xiàn)伴隨后肢運動缺陷的進行性運動神經(jīng)元退化。死亡發(fā)生在大約120-122天時。每一個研究都有四個治療組1)接受編碼IGF-1的AAV血清型1(AAV-IGF-1)的小鼠；2)接受編碼綠色熒光蛋白的AAV血清型1(AAV1-GFP)的小鼠；3)接受編碼IGF-1的AAV血清型2(AAV2-IGF-1)的小鼠和4)接受編碼綠色熒光蛋白的AAV血清型2(AAV2-GFP)的小鼠。未局限于理論，IGF-1由于對不同水平的神經(jīng)軸具有許多好處，因此是治療ASL的治療性蛋白(參見Dore等人，TrendsNeurosci，1997，20:326-331)。在大腦中其被認為能降低神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的編程性死亡，保護神經(jīng)元免受由鐵元素、秋水仙素、鈣失穩(wěn)劑、超氧化物和細胞因子誘發(fā)的毒性。其也被認為能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和谷氨酸的釋放。其也被認為能誘導(dǎo)神經(jīng)微絲、tublin和髓磷脂堿蛋白的表達。在脊髓中IGF-1被認為能調(diào)節(jié)ChAT活性并減弱膽堿能表型的喪失，增強運動祌經(jīng)元萌芽，增加髓鞘形成，抑制脫髓鞘，刺激運動神經(jīng)元從前體細胞的繁殖和分化，并促進神經(jīng)鞘細胞分裂、成熟和生長。在肌肉中IGF-1被認為能誘導(dǎo)神經(jīng)肌肉接點處乙酰膽堿受體聚束形成并增強神經(jīng)肌肉功能和肌肉強度。在本實驗中，使用了該蛋白的IGF-1Ea形式。綠色熒光蛋白用作對照蛋白，其也使被AAV載體注射介導(dǎo)的表達能被觀察。出生后九十天，S0D1小鼠被用AAV重組載體雙側(cè)注射到DCN。在一個研究中，每個位點的劑量大約是2.0e10gc/ml。某些小鼠在出生后大約110天被處死，然后其的大腦和脊髓被分析GFP染色、經(jīng)由免疫組化的IGF-1表達、經(jīng)由ELISA的IGF-1表達、經(jīng)由RT-PCR的IGF-1表達、經(jīng)由免疫組化的ChAT定位、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達、運動神經(jīng)元計數(shù)、如上面描述的在旋轉(zhuǎn)臺上的功能測試(搖擺和加速)、通過使用握力劑量器進行的前后肢握力和存活率。當動物被放在其自己的背上后在30秒內(nèi)再也不能將其自己"正"過來或者動物被動物照看技術(shù)員發(fā)現(xiàn)死亡時，"死亡事件"被輸入進來。"死亡事件"分類在評價的時間被兩個人以動物的組(GFP對IGF-1是盲試的)進行執(zhí)行。在表達GFP的AAV載體被雙側(cè)注射到深部小腦核(DCN)后，在腦千和遍及脊髓的每一個分區(qū)中的GFP被檢測(見圖13和14)。圖22顯示了小鼠大腦中GFP的分布。除DCN外，GFP陽性染色也在嗅球、大腦皮質(zhì)、丘腦、腦干、小腦皮層和脊髓中觀察到。所有這些區(qū)域炮接受從DCN的投射和/或發(fā)送投射到DCN。另外，GFP陽性纖維和/或細胞在接近ChAT陽性細胞的地方也被觀察到。IGF-1mRNA在用AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1處理的小鼠腦干和脊髓的每一個分區(qū)中檢測到，這證明載體經(jīng)歷了逆向運輸(參見圖18)。IGF-1蛋白在用AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1處理的小鼠腦干和脊髓中檢測到。在口神經(jīng)核(oromotornuclei)(例如，運動三叉神經(jīng)核、面神經(jīng)核和舌下神經(jīng)核)和脊髓的每一個分區(qū)中的GFAP染色減少在用AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1處理的小鼠中檢測到(參見圖15-17)。GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)瘤病(其是ALS的病理標志)的標記。AAV1-IGF-1或AAV2-IGF-1的傳遞導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)和握力任務(wù)的顯著功能提升(參見圖20)。AAV1-IGF-1AAV2-IGF-1的傳遞也顯著地延長了S0D1小鼠的壽命(參見圖21，在AAV-IGF-1處理的小鼠中生存中值增加到133.5或134天，與之相比較，在AAV-GFP處理的小鼠中為121或120天)。圖19表明，AAV-IGF-1的DCN傳遞提高了運動神經(jīng)元的存活率。用編碼IGF-1的AAV處理的小鼠和編碼GFP的AAV的DCN傳遞間的不同是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，p值-0.01，用星號表示。不管血清型，AAV-IGF-1處理顯著地提高了運動神經(jīng)元的存活率，提升了旋轉(zhuǎn)和握力實驗的運動表現(xiàn)和顯著延長了壽命。通過使用PCR和ELISA進行檢測，IGF-1表達在整個腦千和脊髓中都檢測到。本說明書按照本說明書中引用的參考文獻的教導(dǎo)可被最徹底地理解。在本說明書中的實施分案提供了本發(fā)明實施分案的一個例證，不應(yīng)當被解釋為對本發(fā)明的范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地得到許多其他的實施分案也被本發(fā)明包括。在本公開中引用的所有出版物、專利和生物序列均以其的全部整體引入作為文獻。假如文獻包括的材料與本申請的說明書相互矛盾或同本說明書不一致，則以本說明書為準。本文中任何文獻的引用并不承認這樣的文獻是本發(fā)明的在先技術(shù)。除非另外指明，在本說明書包括權(quán)利要求中使用的表達成分、細胞培養(yǎng)物、治療情況等等的數(shù)量的所有數(shù)字應(yīng)該被理解為在所有的情況下均被術(shù)語"大約"所修飾。相應(yīng)地，除非另外特別說明，以數(shù)字表示的參數(shù)是近似值并可能非常依賴于本發(fā)明所試圖獲得的期望的性質(zhì)。除非另外表明，在一系列元素前的術(shù)語"至少"應(yīng)該被理解為是指該系列中的每一個元素。僅通過使用例行實驗，那些本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將識別或能確定本發(fā)明中描述的具體實施方案的許多等價物。這樣的同價物也視為包括于下面的權(quán)利要求中。參考文獻1.Leigh，RN.&Swash,M.Cytoskeletalpathologyinmotorneurondiseases.AdvNeurol56,115-24(1991).2.Carpenter,S.ProximalaxonalenlargementinmotorneurondiseaseNeurology18841-51(1968).3.Gonatas,N.K.etal.FragmentationoftheGolgiapparatusofmotorneuronsinamyotrophiclateralsclerosis.AmJPathol140,731-7(1992).4.Hirano,A.etal.Finestructuralstudyofneurofibrniarychangesinafamilywithamyotrophiclateralsclerosis.JNeuropatholExpNeurol43,471-80(1984).5.l_eigh,RN.etal.Ubiquitin-immunoreactiveintraneuronalinclusionsinamyotrophiclateralsclerosis.Morphology,distribution,andspecificity.Brain"4(Pt2),775-88(1991).6.Delisle，M.B.&Carpenter,S.Neurofibrillaryaxonalswellingsandamyotrophiclateralsclerosis.JNeurolSc/63，241-50(1984).7.Hirano，A.NeuropathologyofALS:anoverview.Neurology47，S63-6(1996).8.Rosen,D.R.etal.MutationsinCu/Znsuperoxidedismutasegeneareassociatedwithfamilialamyotrophiclateralsclerosis.Nature362,59-62(1993).9廣3-803(.0^soupcen--P9)LC91SASsnoAJ①ule」①L-1L-j-SAeMLIledlua-9t9J!9L-1pue!9lonuJell9qaso9qJ..「-P600>:(56609寸-寸es-€9￡1p-n9NO-LUOO「.6u!oeJlleuoxe①pe」60J①lueAqp①！prusJeJ9￡u！!9lor-uJell9q9J903L-101sp-9lonu,(0660J.wsl-PSOJn9z.P0H19LUu!ujlnl66eoGn91S!je6ln>snl09seL-d3￡￡!Mp91e4SUOE9pse9￡u！1L-9E96Jelu9leu!AJ①09￡Eo」?、賞nuJell9qa1909￡o一slu①J①tv.工-BEnuj6ex!5-el!L-sns〖e_>-(Z6605-l-ss-卜zelp-idLUOO「-6u!oeJlleuoxe9pe」60J91ueAqP9!pnls;e」u！!3lonuJell9q9J909￡lu①LU①6」elu9leo!AJ909￡EOJIsuo!p①foJd.9-6U0!XM.IAI-el!L-snsle_z\-.91,dE03「.6u!0ejl一euoxe①PEJ60J山lueAqP9!pp-ls"ej9￡u！!9lonuJell9q①J909￡01PJOO0!0eJOL^9Lj一EOJ』suo!p①foJnl.x-om￡5M._A--e;!qsnsle_/\-(6660>0寸IP-n9NdLUOO「6u!oeJlleuoxe9pe」60」slueAqP3一pnls-lej9L-1u！!9lonuJellsqa-9001S一USE69Slepneo-leJCDespueJeqLun一卄S9M01SL-1EO」jsuo!109foJd._A--el!L-snsle_z\-.91.;oIBA一AJnsPU9PSSII90leuo」nauuou3dA}-pl!.le一①._z\-.v.sl-.1①POLUs,lv9snoEeu！一eA!AJnss6UOIOJdTJOIioAJ9Aj一9ple」！AspeJ60J一9y-工」》aT-u!91s￡5d-NleM」94s-.「-open-.M.a」edse乂.寸一,0!L-d0J10Jn9uAJe=!opuesu!L-d040Jn9u9￡ple!〖u910d0!ln9de」9L-l:S9S69S!P61-1908-z!OSOJn9NA①y1mN,sllvu一L-le9pUOJn①uJO一OE3A!10al9s6u!J①L-d!oap(寸003)6寸IS3Z~Z3!oso」n①NA①dnL-uv,sl-vu！uo;eJ9u①6①pUOJr-9uJ01C-LUu！p①AIOAU一SES!ueLP9E9￡6u!l山AeJun,yvva-Puels>9l3必.lA-.l」SI一！1AI"TI--uf!njg「16u山n.S!S0J9PSle」91el0!L-d0J10ALUV.vn-」9P!9UL-SM.d.l-"pue一Moy.o廣eSs9」dx9leL-;90!LUu一U0!le」9u①69pUOJn9u」GH01A1.一e1①.山-AauJnQ.6(ElsevierAcademicPress,SanDiego,2004).權(quán)利要求1.一種方法，包括給藥含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到腦的深部小腦核區(qū)的至少一個區(qū)域，其中所述的給藥在有利于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物傳遞到脊髓和/或腦干的情況下進行。2、一種方法，包括給藥含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到腦的運動神經(jīng)皮層區(qū)域，其中所述的給藥在有利于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物傳遞到脊髓的情況下進行。3、一種傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者運動祌經(jīng)元的方法，包括給藥含有所述的轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到腦的深部小腦核區(qū)的至少一個區(qū)域，其中所述的轉(zhuǎn)基因在遠離所述的給藥位點的運動神經(jīng)元里表達或傳遞到遠離所述的給藥位點的運動神經(jīng)元。4、一種傳遞轉(zhuǎn)基因到受試者運動神經(jīng)元的方法，包括給藥含有所述的轉(zhuǎn)基因的向神經(jīng)的病毒載體到腦的運動祌經(jīng)皮層區(qū)域，其中所述的轉(zhuǎn)基因在遠離所述的給藥位點的運動神經(jīng)元里表達或傳遞到遠離所述的給藥位點的運動神經(jīng)元。5、一種治療受試者運動神經(jīng)元失調(diào)的方法，包含給藥含有治療性轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到腦的深部小腦核區(qū)的至少一個區(qū)域，其中該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物以治療有效劑量傳遞到脊髓的至少一個分區(qū)和/或腦干的至少一個分區(qū)。6、一種改善受試者運動神經(jīng)元失調(diào)癥狀的方法，包括給藥含有治療性轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到腦運動神經(jīng)皮層區(qū)，其中該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物以治療有效劑量傳遞到脊髓的至少一個分區(qū)。7、權(quán)利要求1到6的任何一項的方法，其中所述的向神經(jīng)的病毒載體是腺相關(guān)病毒載體(AAV)。8、權(quán)利要求1到6的任何一項的方法，其中所述的向神經(jīng)的病毒載體是選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8的腺相關(guān)病毒載體。9、權(quán)利要求1、3或5的任何一項的方法，其中所述的腦深部小腦核區(qū)的區(qū)域選自內(nèi)側(cè)區(qū)、中間區(qū)或外側(cè)區(qū)。10、權(quán)利要求1到6的任何一項的方法，其中所述的傳遞是雙側(cè)的。11、權(quán)利要求5或6的方法，其中所述的脊髓分區(qū)選自頸部分區(qū)、胸部分區(qū)、腰部分區(qū)或骶部分區(qū)。12、權(quán)利要求5或6的的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因被傳遞到脊髓的所有分區(qū)。13、權(quán)利要求12的方法，其中所述的多重給藥的至少一種是雙側(cè)的。14、權(quán)利要求1到6的任何一項的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因選自胰島素生長因子-1(IGF-1)、鈣結(jié)合蛋白D28、擬清蛋白、HIF1-alpha、SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2或CNTF(睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子)。15、權(quán)利要求6的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因表達減輕了選自肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)、脊髓性延髓肌萎縮、脊髓性小腦性共濟失調(diào)、脊髓性肌萎縮或外傷性脊髓損傷的運動神經(jīng)元失調(diào)的癥狀。16、權(quán)利要求1到6任何一項的方法，其中所述的受試者是人類患者。17、權(quán)利要求1到6任何一項的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因表達治療量的蛋白選自胰島素生長因子1(IGF-1)、EPO(促紅細胞生成素)、CBP(cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白[CREB]結(jié)合蛋白)、鈣結(jié)合蛋白D28、擬清蛋白、HIF1-alpha、SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2或CNTF(睫狀節(jié)祌經(jīng)細胞營養(yǎng)因子)。全文摘要本申請?zhí)峁┝擞糜谥委熡绊懯茉囌哌\動功能和控制的失調(diào)或損傷的方法和組合物。一方面，本發(fā)明提供通過給藥包括轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體而遞送轉(zhuǎn)基因到受試者脊髓的方法。該病毒載體遞送轉(zhuǎn)基因到腦深部小腦核區(qū)的區(qū)域。本發(fā)明還提供了通過給藥包括轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)的病毒載體到受試者腦的運動神經(jīng)皮層區(qū)而遞送轉(zhuǎn)基因到受試者脊髓的組合物和方法。文檔編號A61K48/00GK101208108SQ200680023365公開日2008年6月25日申請日期2006年5月2日優(yōu)先權(quán)日2005年5月2日發(fā)明者C·R·奧賴爾登,J·道奇,L·謝哈布丁,M·帕西尼,S·程申請人:建新公司