專利名稱：：神經(jīng)代謝疾病的基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特別是脊髓的疾病的組合物和方法。本發(fā)明進一歩涉及包括病毒載體如腺相關(guān)病毒(AAV)載體的組合物及其給藥方法。
背景技術(shù)：
：一組稱為溶酶體貯積癥(LSD)的代謝疾病包括超過四十種的遺傳疾病，其中許多涉及各種溶酶體水解酶的遺傳缺陷。代表性的溶酶體貯積癥和相關(guān)的缺陷的酶列于表1中。表l溶酶體貯積癥缺陷的酶天冬氨酰葡糖胺尿癥天冬氨酰氨基葡糖苷酶Fabrya-半乳糖苷酶嬰兒Batten病*(CNL1)棕櫚酰蛋白質(zhì)硫酯酶典型晚期嬰兒Batten病*(CNL2)三肽基肽酶少年Batten病*(CNL3)溶酶體跨膜蛋白Batten,其他形式*(CNL4-CNL8)多重基因產(chǎn)物胱氨酸病(cyctinosis)半胱氨酸運輸子Farber酸性神經(jīng)酰胺酶巖藻糖儲積癥酸性a-L-巖藻糖苷酶Galactosidosialidosis保護蛋白/組織蛋白酶A1，2*和3*型Gaucher酸性卩-葡糖苷酶或葡糖腦苷脂酶G謝神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥酸性卩-半乳糖苷酶Hunter*艾杜糖醛酸酯-2-硫酸酯酶Hurler-Scheie*a-L-艾杜糖苷酸酶Krabbe*半乳糖腦苷脂酶<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>LSD的標(biāo)志性特征是溶酶體中代謝物的異常累積，這導(dǎo)致核周體中大量擴張的溶酶體的形成。治療LSD(與治療肝臟特異性酶病相反)的主要挑戰(zhàn)是需要逆轉(zhuǎn)多個分開組織中的溶酶體貯積病理。一些LSD可以通過靜脈內(nèi)灌輸缺少的酶得到有效的治療，稱為酶替代療法(ERT)。例如，1型Gaucher患者只具有內(nèi)臟疾病并很好地應(yīng)答使用重組葡糖腦苷脂酶(Cerezyme,Genzyme，Corp.)的ERT。然而，患有影響CNS的代謝疾病(例如，2或3型Gaucher疾病)的患者不應(yīng)答靜脈內(nèi)ERT,因為替代的酶被血腦屏障(BBB)阻止進入大腦。此外，通過直接注射將替代酶引入大腦的嘗試己經(jīng)不成功，部分是由于高局部濃度的酶的細(xì)胞毒性(未公開的觀察)和大腦中有限的實質(zhì)擴散速率(Pardridge,PeptideDmgDeliverytotheBrain(肽藥物至大腦的傳送)，RavenPress,1991)。阿爾茨海默氏病(AD)是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的疾病，特征在于由于降低的AP分解代謝的淀粉樣P-肽(AP)累積。隨著AP累積，其聚合成胞外斑，引起突觸功能的損傷和神經(jīng)元的喪失。病理導(dǎo)致癡呆、喪失協(xié)調(diào)和死亡?；蛑委熓怯糜谟绊慍NS的疾病的新興治療形式，影響CNS的疾病包括LSD和阿爾茨海默氏病。在該方法中，通過用攜帶健康形式或修飾形式基因的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)受影響的細(xì)胞來產(chǎn)生正常代謝途徑的恢復(fù)和病理的逆轉(zhuǎn)。通過產(chǎn)生能夠有效感染有絲分裂后的祌經(jīng)元的病毒載體來促進CNS基因治療。對于將基因傳送至CNS的病毒載體的概述，參見Davidson等(2003)NatureRev.，4:353-364。認(rèn)為腺相關(guān)病毒(AAV)載體對于CNS基因治療是最佳的，因為它們具有適當(dāng)?shù)亩拘院兔庖咴蕴卣?，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞并能夠介導(dǎo)CNS中的長期表達(dá)(Kaplitt等(1994)NatGenet.，8:148墨154;Bartlett等(1998)Hum.GeneTher.，9:1181-1186和Passini等(2002)J.Ne畫ci.，22:6437-6446)。治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如，酶，可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞分泌并隨后由其他細(xì)胞吸收，然后它將在其中緩解病理。將這種方法稱為交叉校正(Neufeld等(1970)Science,169:141-146)。然而，病理如LSD范圍中貯積病理的校正，由于注射的載體和分泌的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的有限實質(zhì)擴散，通常限于注射位點緊靠的附近(Taylor等(1997)Nat.Med.，3:771-774;Skompa等(1999)Exp.Neurol.，160:17-27)。因此，影響多個腦區(qū)域的祌經(jīng)病理學(xué)需要廣泛分布的載體傳送，使用多個空間分布的注射，尤其在大的腦中如人腦中注射。這顯著增加了腦損傷的風(fēng)險。此外，一些腦區(qū)域是外科手術(shù)難以接近的。因此，CNS內(nèi)除了擴散以外的其他載體運輸方式將是有益的。在軸突末梢給藥時，一些病毒被納入并沿著軸突逆向運輸至核。一個腦區(qū)域中的神經(jīng)元通過軸^與遠(yuǎn)側(cè)腦區(qū)域互相連接，因此提供了用于載體傳送的運輸系統(tǒng)。使用腺病毒、HSV和偽狂犬病病毒的研究已經(jīng)使用這些病毒將基因傳送至腦內(nèi)遠(yuǎn)側(cè)結(jié)構(gòu)的運輸特征(Soudas等(2001)FASEBJ.，15:2283-2285;Breakefield等(1991)NewBiol.，3:203-218和deFalco等(2001)Science,291:2608-2613)。幾組己經(jīng)報道了通過AVV血清型2(AAV2)的腦轉(zhuǎn)導(dǎo)限于顱內(nèi)注射位點(Kaplitt等(1994)Nat.Genet.，8:148-154;Passini等(2002)J.Neurosci.，22:6437-6446和Chamberlin等(1998)BrainRes.，793:169-175)。一個最近的報道表明AAV2的逆向軸突運輸也可以在正常大鼠腦的選定回路中發(fā)生(Kaspar等(2002)Mol.Ther.，5:50-56)。然而，不知道是什么特定參數(shù)負(fù)責(zé)觀察到的軸突運輸，以及處于細(xì)胞機能障礙狀態(tài)的患病神經(jīng)元是否將產(chǎn)生足量而有效的軸突運輸。實際上，已經(jīng)報道了LSD神經(jīng)元中觀察到的損傷影響軸突運輸乃至阻斷軸突運輸(Walkey(1998)BrainPathol.，8:175-193的綜述)，表明疾病損害的神經(jīng)元不支持AAV沿著軸突的運輸。因此，本領(lǐng)域中存在產(chǎn)生用于治療影響CNS的代謝疾病的新治療方法的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防代謝疾病的方法和組合物，這些疾病如特征在于CNS功能降低的風(fēng)險或與CNS功能降低的風(fēng)險相關(guān)的溶酶體貯積病(LSD)或異常膽固醇貯積功能。本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的疾病的方法和組合物，這些疾病如特征在于CNS功能降低的風(fēng)險或與CNS功能降低的風(fēng)險相關(guān)的阿爾茨海默氏病。本發(fā)明進一歩提供了將轉(zhuǎn)基因最低程度侵害性的靶向傳送至受影響患者腦中選定區(qū)域的方法。本發(fā)明的其他優(yōu)勢將部分列于以下的描述中，部分將從說明書中理解，或可以通過本發(fā)明的實踐得知。酸性祌經(jīng)鞘磷脂酶(ASM)敲除小鼠，Niemann-PickA型疾病的模型，通過單次顱內(nèi)注射進入腦的一個半球給藥攜帶人ASM基因(AAV-ASM)的AAV2載體。本發(fā)明是部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明高滴定度AAV-ASM注射至患病的腦導(dǎo)致AAV-ASM在多個遠(yuǎn)側(cè)部位內(nèi)以與祌經(jīng)支配注射位點的投射祌經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造(topographicalorganization)相符的模式表達(dá)。本發(fā)明進一歩部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明溶酶體貯積病理在AAV-ASM注射位點和運輸?shù)竭_(dá)并在其中表達(dá)ASM的遠(yuǎn)側(cè)部位的廣泛校正。在另一個方面中，本發(fā)明提供了在ASMKO小鼠中深部小腦核內(nèi)單側(cè)或者雙側(cè)注射后的校正膽固醇貯積病理和啟動功能恢復(fù)的方法。進一歩提供的是上述方法，其中在選自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7或AAV2/8血清型的重組AAV載體中傳送轉(zhuǎn)基因。只i了說明的目的，重組載體在小鼠模型中編碼功能性人ASM蛋白質(zhì)。因此，在一方面中，本發(fā)明提供了治療哺乳動物祌經(jīng)代謝疾病的方法。通過本發(fā)明的方法治療的群體包括，但不限于，具有LSD或處于產(chǎn)生LSD風(fēng)險中的患者，如表l中所列的疾病，特別地，如果這樣的疾病是影響CNS的疾病。在說明性的實施方案中，疾病是Niemann-PickA疾病和/或通常與NPA相關(guān)的繼發(fā)性膽固醇貯積病理。在一方面中，公開的方法包括將攜帶編碼治療產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的AVV病毒載體給予受折磨患者的CNS并允許轉(zhuǎn)基因在遠(yuǎn)離給藥位點的CNS內(nèi)以治療水平表達(dá)。此外，載體可以包括編碼有效治療CNS疾病的生物活性分子的多核苷酸。這樣的生物活性分子可以包括肽，包括但不限于，天然或突變形式的全長蛋白質(zhì)、天然或突變形式的蛋白片段、合成的多肽、抗體和抗體片段如Fab'分子。生物活性分子還可以包括核苷酸，包括單鏈或雙鏈DNA多核苷酸和單鏈或雙鏈RNA多核苷酸。對于可以用于在此公開的方法的實踐中的示例核苷酸技術(shù)的綜述，參見Kurreck，(2003)J.，Eur.J.Biochem.270，1628-1644[反義技術(shù)];Yu等(2002)PNAS99(9)，6047-6052[RNA干擾技術(shù)]禾口Elbashir等(2001)GenesDev.，15(2):188-200[siRNA技術(shù)]。在說明性的實施方案中，通過將高滴定度AAV載體溶液直接實質(zhì)內(nèi)注射至患病的腦中來實現(xiàn)給藥。此后以治療水平在給藥位點的遠(yuǎn)側(cè)、對側(cè)或同側(cè)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，離開給藥位點至少2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm。在另一個方面中，本發(fā)明還提供了體內(nèi)傳送重組AAV基因組至疾病損害神經(jīng)元的核的方法。在一些實施方案中，通過神經(jīng)元呈現(xiàn)的細(xì)胞病理是溶酶體貯積病，如表l中所列的疾病。在說明性的實施方案中，疾病是Niemann-PickA疾病。在另一個實施方案中，呈現(xiàn)的細(xì)胞病理為阿爾茨海默氏病的。將重組AAV基因組傳送至疾病損害祌經(jīng)元的核的方法包括將疾病損害的祌經(jīng)元的軸突末梢接觸含有AAV病毒顆粒的組合物，該AAV病毒顆粒含有重組AAV基因組，并使病毒顆粒被內(nèi)吞并沿著軸突逆向胞內(nèi)運輸至祌經(jīng)元的核。組合物中載體的濃度至少為(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl09tu/ml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl01Qiu/ml)。在特定的實施方案中，神經(jīng)元是投射神經(jīng)元和/或軸突末梢至神經(jīng)元核的距離至少為2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm。本發(fā)明提供了將轉(zhuǎn)基因傳送至患者的脊髓和/或腦干部位的方法和組合物，通過將含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)性病毒載體給藥至患者腦的深部小腦核(DCN)部位的至少一個部位。病毒傳送是在脊髓和/或腦干部位中轉(zhuǎn)基因有利表達(dá)的條件下進行。在說明性的實施方案中，疾病是Niemann-PickA疾病。在其他實施方案中，呈現(xiàn)的細(xì)胞病理是阿爾茨海默氏病的。在另一方面中，本發(fā)明提供了將轉(zhuǎn)基因傳送至患者脊髓的方法和組合物，通過將含有轉(zhuǎn)基因的重組向神經(jīng)性病毒載體給藥至患者腦的運動神經(jīng)皮層區(qū)。病毒載體的傳送是在脊髓中轉(zhuǎn)基因有利表達(dá)的條件下進行。給藥于運動神經(jīng)皮層區(qū)的病毒載體通過運動神經(jīng)元通過它們的細(xì)胞體部分納入，且轉(zhuǎn)基因得到表達(dá)。然后表達(dá)的轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷順行運輸至運動神經(jīng)元的軸突末梢部分，其存在于脊髓中。由于運動神經(jīng)皮層區(qū)的性質(zhì)，給藥于該腦部位的病毒載體還可以通過運動神經(jīng)元的軸突末梢納入。病毒載體還可以經(jīng)歷沿著運動神經(jīng)元軸突的逆向運輸并在運動神經(jīng)元的細(xì)胞體中得到表達(dá)。在說明性的實施方案中，疾病是Niemann-PickA疾病。在其他實施方案中，呈現(xiàn)出的細(xì)胞病理是阿爾茨海默氏病的。在另一個方面中，本發(fā)明提供了將治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物傳送至受神經(jīng)代謝疾病例如影響CNS的LSD折磨的哺乳動物中CNS的目標(biāo)細(xì)胞的方法，目標(biāo)細(xì)胞是神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。該方法包括將祌經(jīng)元的軸突末梢接觸含有AAV載體的組合物，該載體攜帶至少部分編碼治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的基因，使病毒得到內(nèi)吞并沿著軸突胞內(nèi)逆向運輸至神經(jīng)元的核；使治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物通過神經(jīng)元表達(dá)并分泌，并使得靶細(xì)胞吸收該治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其中治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物因此減輕目標(biāo)細(xì)胞中的病理。在特定的實施方案中，組合物中載體的濃度至少為(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl09tu/ml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl0l0iu/ml)。在本發(fā)明的方法中，治療性轉(zhuǎn)基因編碼生物活性分子，其在CNS中的表達(dá)導(dǎo)致至少部分祌經(jīng)病理的校正。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是溶酶體水解酶。在說明性的實施方案中，溶酶體水解酶是ASM。在其他實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因是金屬內(nèi)肽酶，例如，腦啡肽酶(neprilysin)?？梢岳斫馇懊娴母攀龊鸵韵碌脑斒鍪鞘纠缘?，只是說明性的而不是所要求的本發(fā)明的限制。圖1A描繪了在2pl高滴定度(9.3xl012gp/ml)AAV-ASM注射至海馬體后5或15周，ASMKO小鼠腦橫截面的圖。通過垂直線顯示注射位點；如通過原位雜交檢測的ASMmRNA表達(dá)是通過較小的圓圈表示；如通過免疫組織化學(xué)染色檢測的ASM蛋白表達(dá)是通過較大的劃上陰影線的圓圈表示。表達(dá)模式導(dǎo)致腦兩個半球中海馬體和皮層部位中大范圍的病理逆轉(zhuǎn)(通過淡陰影表示)。圖IB描繪了如圖1A中所示的高滴定度AAV注射至海馬體后，AAV至小鼠腦遠(yuǎn)側(cè)部位的軸突運輸。注射至海馬體(10)導(dǎo)致病毒載體通過海馬體內(nèi)的回路軸突運輸至對側(cè)海馬體(20)并通過entorhinodentate回路運輸至內(nèi)嗅區(qū)皮層(30)。通過垂直線顯示注射位點。圖1C是顯示了小鼠腦的海馬體內(nèi)和entorhinodentate回路連接的示意圖。注射至海馬體(10)導(dǎo)致位于海馬角(comuammonis)區(qū)域3(CA3)和齒狀回小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞層(G)中的細(xì)胞體的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，注射的AAV載體的亞群感染神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的軸突，經(jīng)歷逆向軸突運輸，并將轉(zhuǎn)基因傳送至海馬體(20)對側(cè)部位中的CA3區(qū)(CA3)和門(H)，和同側(cè)的內(nèi)嗅區(qū)皮層(30)中。圖2A描繪了如圖1A中所述的高滴定度AAV-ASM海馬體內(nèi)注射后5或15周，ASMKO小鼠腦橫截面的圖。如通過原位雜交檢測的ASMmRNA表達(dá)是通過較小的圓圈表示；如通過免疫組織化學(xué)染色檢測的ASM蛋白表達(dá)是通過較大的劃上陰影線的圓圈表示。注射導(dǎo)致在隔膜中檢測到ASMmRNA和蛋白質(zhì)。這種表達(dá)模式導(dǎo)致大范圍的病理逆轉(zhuǎn)(通過淡陰影表示)。圖2B描繪了如圖1A中所示的高滴定度注射至海馬體后，AAV至小鼠腦遠(yuǎn)側(cè)部位的軸突運輸。注射至海馬體(10)導(dǎo)致病毒載體通過隔海馬(septohippocampal)回路從注射位點(通過垂直線表示)軸突運輸至中隔(40)。圖2C是顯示隔海馬回路連接的示意圖。注射至海馬體導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)至位于CA3區(qū)域(11)中的細(xì)胞體。此外，AAV載體的亞群感染神經(jīng)支配注射位點的投射神經(jīng)元的軸突末梢，經(jīng)歷逆向軸突運輸，并將轉(zhuǎn)基因傳送至內(nèi)側(cè)中隔(40)。圖3描繪了高滴定度AAV注射至小鼠腦的紋狀體(50)后，黑質(zhì)紋狀體回路中的AAV軸突運輸。AAV的軸突運輸從注射位點(通過垂直線表示)至黑質(zhì)(60)。圖4描繪了高滴定度AAV-ASM注射至ASMKO小鼠腦的小腦(70)后，延髓小腦(medullocerebeUar)回路中的AAV軸突運輸。AAV2的軸突運輸從注射位點(通過垂直線表示)至延髓(80)。圖5描繪了同側(cè)海馬體(10)中AAV7-ASM高滴定度注射后，海馬體內(nèi)、黑質(zhì)紋狀體和entorhinodentate回路中的AAV的軸突運輸。如通過原位雜交所測定的，檢測同側(cè)海馬體的AAV7-ASM注射后(通過垂直線表示)，沿著對側(cè)海馬體(90)、內(nèi)側(cè)中隔(40)和內(nèi)嗅區(qū)皮層(100)的整個吻-尾軸的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。圖6A至6E顯示了將編碼人ASM的不同AAV血清型載體[(A)2/1、(B)2/2、(C)2/5、(D)2/7禾P(E)2/8]注射至ASMKO小鼠的深部小腦核后，矢狀小腦截面中的人ASM免疫陽性染色。圖7A至7E證明了hASM從深部小腦核運輸至脊髓。在用AAV2/2-ASM、AAV2/5-ASM、AAV2/7-ASM&AAV2/8-ASM處理的小鼠中觀察到的效果(A)hASM10X放大倍數(shù)；(B)hASM40X放大倍數(shù)；(C)共焦hASM;(D)共焦ChAT和(E)共焦hASM&ChAT。圖8顯示了將編碼人ASM的不同AAV血清型載體(2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)注射至深部小腦核(11=5/組)后的小腦組織勻漿水平。沒有通過相同字母連接的組是顯著(p<.oooi)差異ri。圖9A至G顯示了將編碼人ASM的不同AAV血清型載體[(A)2/1、(B)2/2、(C)2/5、(p)2/7和(E)2/8]注射至ASMKO小鼠的深部小腦核中后，矢形小腦截面中的鈣結(jié)合蛋白免疫陽性染色。圖10A和10B顯示了ASMKO(注射AAV-(3gal的)、WT和AAV-ASM處理的ASMKO小鼠(11=8/組)的加速和搖擺旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)(rotarodperformance)(在14周齡時)。沒有通過相同字母連接的組是顯著差異的。注射AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM的小鼠證明了在加速旋轉(zhuǎn)測試中延遲跌倒時間顯著長于注射AAV2/l-卩gal的ASMKO小鼠(p<.0009)。對于搖擺旋轉(zhuǎn)測試，注射AAV2/1-ASM的小鼠證明了延遲跌倒時間顯著長于注射AAV2/l-(3gal的小鼠(p<.0001)。圖11A和11B顯示了ASMKO(n=8)、WT(n=8)和兩側(cè)AAV-ASM(n=5/組)處理的小鼠(20周齡時)的旋轉(zhuǎn)表現(xiàn)。對于加速和搖擺測試，AAV-ASM處理的小鼠表現(xiàn)顯著(p<.001)好于ASMKOAAV2/1-Pgal處理的小鼠。在加速和搖擺測試中，注射AAV2/1-ASM的小鼠的表現(xiàn)與野生型小鼠的是不可區(qū)分的。圖12顯示了兩側(cè)注射AAVl-pgal或編碼hASM的AAV血清型1和2的ASMKO小鼠(20周齡時)的腦神經(jīng)鞘磷脂水平。將腦分成5個頭尾(rostrocaudal)區(qū)(Sh最頭端和85=最尾端)。星號表示數(shù)據(jù)點是與ASMKO小鼠顯著不同的(pO.Ol)。圖13A說明了深部小腦核區(qū)(內(nèi)側(cè)、中間(interposed)、夕卜側(cè))和脊髓部分(頸部、胸部、腰部和骶骨部)之間的連接。圖13B說明了深部小腦核區(qū)(內(nèi)側(cè)、中間(interposed)、外側(cè))和腦干區(qū)(中腦、腦橋、延髓)之間的連接。通過箭頭表示連接，其開始于祌經(jīng)元的細(xì)胞體部分和結(jié)束于神經(jīng)元的軸突末梢部分。例如，DCN的三個區(qū)各自具有神經(jīng)元，該神經(jīng)元帶有發(fā)送終止于脊髓頸部的軸突的細(xì)胞體而脊髓的頸部具有發(fā)送終止于DCN內(nèi)側(cè)或中間區(qū)的軸突的細(xì)胞體。圖14說明了編碼綠色熒光蛋白(GFP)的AAV的DCN傳送后，腦干或上位運動祌經(jīng)元中的綠色熒光蛋白分布。圖15說明了編碼綠色熒光蛋白(GFP)的AAV的DCN傳送后，脊髓部位中的綠色熒光蛋白分布。圖16顯示了表達(dá)GFP的AAV1載體兩側(cè)傳送至深部小腦核(DCN)后，小鼠腦內(nèi)的GFP分布。除了DCN，還在嗅球、大腦皮層、丘腦、腦干、小腦皮層和脊髓中觀察到GFP陽性染色。所有這些區(qū)域接受來自DCN的投射和/或發(fā)送投射至DCN。具體實施方式為了更容易地理解本發(fā)明，首先定義特定的術(shù)語。在整個詳述中列出其他定義。，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"指的是引入細(xì)胞中并能夠在合適條件下得到翻譯和/或表達(dá)并給予將其引入的細(xì)胞所需的特性或另外導(dǎo)致所需治療結(jié)果的多核苷酸。術(shù)語"基因組顆粒(gp)"或"基因組等價物"，當(dāng)關(guān)于病毒滴定度所用時，指的是含有重組AAVDNA基因組的病毒粒子的數(shù)量，與感染力或功能性無關(guān)?？梢酝ㄟ^如在此實施例中所述的或例如在Clark等(1999)Hum.Gene.Ther.，10:1031-1039;Veldwijk等(2002)Mol.Ther.6:272-278中所述的方法來測量特定載體制劑中的基因組顆粒的數(shù)量。術(shù)語"感染單位(iu)"、"感染性顆粒"或"復(fù)制單位"，當(dāng)關(guān)于病毒滴定度所用時，指的是感染性的并能夠復(fù)制的重組AAV載體顆粒的數(shù)量，如通過感染性中心測試(infectiouscenterassay)所測量的，也稱為復(fù)制性中心測試(replicationcenterassay),如描述于McLaughlin等(1988)J.Virol.，62:1963-1973。術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)"，當(dāng)關(guān)于病毒滴定度所用時，指的是導(dǎo)致功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的感染性重組AAV載體顆粒的數(shù)量，如在功能性測試中所測量的，如在此的實施例中所述的，或例如，在Xiao等，(1997)Exp.Neurobiol.，144:113-124;或在Fisher等(1996)J.Virol.，70:520-532(LFU測試)中所述的。術(shù)語"治療的"、"治療有效量"及其同源詞指的是導(dǎo)致患者癥狀的防止或發(fā)作延遲或緩解或獲得所需生物結(jié)果的化合物含量，所需的生物結(jié)果如祌經(jīng)病理的校正，例如，與溶酶體貯積病相關(guān)的細(xì)胞病理，如在此所述的或Walkley(1998)BrainPathol.，8:175-193中所述的。術(shù)語"治療校正"指的是導(dǎo)致患者癥狀的防止或發(fā)作延遲或緩解的校正程度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的和隨后部分中描述的方法來測定有效量。方法和組合物ASMKO小鼠是公認(rèn)的A型和B型Niemann-Pick疾病的模型(Horinouchi等(1995)NatGenetics,10:288-293;Jin等(2002)J.Clin.Invest.,109:1183-1191和Otterbach(1995)Cell,81:1053-1061)。Niemann-Pick疾病(NPD)歸類為溶酶體貯積病并且是遺傳的祌經(jīng)代謝疾病，其特征在于酸性祌經(jīng)鞘磷脂酶(ASM;祌經(jīng)鞘磷脂膽堿磷酸水解酶，EC3丄3.12)的遺傳缺陷。功能性ASM蛋白質(zhì)的缺乏導(dǎo)致整個腦內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的溶酶體內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂底物的累積。這導(dǎo)致核周體中大量擴張的溶酶體的形成，這是A型NPD的標(biāo)志性特征和主要的細(xì)胞表型。擴張的溶酶體的存在與正常細(xì)胞功能的喪失和導(dǎo)致受影響個體幼年死亡的漸進性祌經(jīng)惡化過程相關(guān)(TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDiseases(遺傳疾病的代謝和分子基礎(chǔ))，編輯Scriver等，McGraw-Hill,NewYork,2001，pp.3589-3610)。繼發(fā)性細(xì)胞表型(例如，另外的代謝異常)也與這種疾病相關(guān)，特別是溶酶體細(xì)胞器中膽固醇的高水平累積。神經(jīng)鞘磷脂對膽固醇具有強烈的親和性，其導(dǎo)致ASMKO小鼠和人患者的溶酶體中大量膽固醇的螯合(sequestering)(Leventhal等(2001)J.Biol,Chem.，276:44976-44983;Slotte(1997)Subcell.Biochem.，28:277-293和Viana等(1990)J.Med.Genet.，27:499-504)。本發(fā)明是部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明海馬體內(nèi)注射高滴定度AAV-ASM至ASMKO小鼠的患病腦中導(dǎo)致ASMmRNA和蛋白質(zhì)以與神經(jīng)支配注射位點的投射祌經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造相一致的模式在遠(yuǎn)離注射位點表達(dá)。除了在注射位點的強烈表達(dá)，在同側(cè)(注射的)海馬體外的幾個遠(yuǎn)側(cè)部位中，特別地，在對側(cè)海馬體齒狀回和CA3，和內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層中也檢測到ASMmRNA和蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一歩部分基于以下的發(fā)現(xiàn)和證明遠(yuǎn)側(cè)部位的溶酶體貯積病理的大范圍校正，因此通過較少數(shù)量的注射位點獲得較大體積的校正。因此，在一方面中，本發(fā)明提供了治療哺乳動物神經(jīng)代謝疾病的方法。通過本發(fā)明的方法治療的群體包括但不限于，患有神經(jīng)代謝疾病或處于產(chǎn)生神經(jīng)代謝疾病風(fēng)險中的患者，例如，LSD，如表l中所列的疾病，特別地是如果這樣的疾病影響CNS的疾病。在說明性的實施方案中，疾病是A型Niemann-Pick疾病。在特定的實施方案中，神經(jīng)代謝疾病可以排除阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、TaySachs病、LeschNyan病和克雅(氏)病(Creutzfeldt-Jakob)病。然而，本發(fā)明使用金屬內(nèi)肽酶作為治療轉(zhuǎn)基因的方法，特別用于治療阿爾茨海默氏病和淀粉狀蛋白-相關(guān)疾病。在一些實施方案中，治療神經(jīng)代謝疾病的方法包括給藥高滴定度的攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的AAV載體，使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在CNS內(nèi)遠(yuǎn)離第一個位點的第二個位點以治療水平表達(dá)。在一些實施方案中，組合物的病毒滴定度是至少(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50"loWml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xlO'Qiu/ml)。在更多的實施方案中，通過直接實質(zhì)內(nèi)(intraparenchymal)注射高滴定度AAV載體溶液至患病的腦來實現(xiàn)給藥，此后轉(zhuǎn)基因以治療水平在離給藥位點至少2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm的給藥位點遠(yuǎn)側(cè)、對側(cè)或同側(cè)表達(dá)。第一和第二個位點之間的距離定義為給藥位點(第一個位點)和遠(yuǎn)側(cè)位點(第二個位點)可檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)邊緣之間的最小距離區(qū)域，如使用本領(lǐng)域已知的或?qū)嵤├兴龅姆椒ㄋ鶞y量的，例如，原位雜交。較大哺乳動物CNS中的一些祌經(jīng)元可以通過它們的軸突投射跨越大的距離。例如，在人類中，一些軸突可以跨越1000mm或更長的距離。因此，在本發(fā)明的各種方法中，AAV可以沿著整個軸突長度在這樣的距離上軸突運輸來達(dá)到并轉(zhuǎn)導(dǎo)母體細(xì)胞體?；谒璧纳窠?jīng)病理目標(biāo)部位和所涉及的腦回路的形態(tài)來選擇CNS內(nèi)的載體給藥位點，只要給藥位點和目標(biāo)區(qū)域具有軸突連接即可。例如，可以使用3-D立體定位坐標(biāo)來限定目標(biāo)區(qū)域。在一些實施方案中，選擇給藥位點使得注射載體總量的至少O.l、0.5、1、5或10%在至少1、200、500或1000mm3的目標(biāo)區(qū)域得到遠(yuǎn)側(cè)傳送。給藥位點可以位于連接腦遠(yuǎn)側(cè)區(qū)域的投射祌經(jīng)元支配的區(qū)域內(nèi)。例如，黑質(zhì)和bventraltegmental區(qū)發(fā)送密集的投射至尾和殼核(總稱為紋狀體)?？梢园邢蚝谫|(zhì)和腹側(cè)背蓋區(qū)內(nèi)的祌經(jīng)元用于通過注射至紋狀體后的AAV的逆向運輸?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)。作為另一個實施例，海馬體收到來自腦其他區(qū)域的邊界明確(well-defined)的、可預(yù)測的軸突投射。其他給藥位點可以位于，例如，脊髓、腦干(延髓和腦橋)、中腦、小腦(包括深部小腦核)、間腦(丘腦、下丘腦)、端腦(紋狀體、腦皮層，或，皮層內(nèi)，枕葉、顳葉、頂葉或額葉)或其組合。對于人腦中結(jié)構(gòu)的鑒定，參見，例如，TheHumanBrain:Surface，Three-DimensionalSectionalAnatomyWithMRI，andBloodSupply(人月畝i吏用MRI的表面三維斷層解剖，和供血)，第2版，編輯Deuteron等，SpringerVela，1999;AtlasoftheHumanBrain(人腦圖集)'編輯Mai等，AcademicPress;1997和Co-PlanarSterotaxicAtlasoftheHumanBrain:3-DimensiaonalProportionalSystem:AnApproachtoCerebralImaging(人腦的共面立體定向圖集3-維比例系統(tǒng)腦成像的方法)，編輯Tamarack等，ThymeMedicalPub.，1988。對于小鼠腦中結(jié)構(gòu)的鑒定，參見，例如，TheMouseBraininSterotaxicCoordinate(立體定位坐標(biāo)中的小鼠腦)，第2版，AcademicPress,2000。如果需要，可以將人腦結(jié)構(gòu)與另一種哺乳動物腦中的相似結(jié)構(gòu)相關(guān)連。例如，大部分哺乳動物，包括人和嚙齒動物，顯示出相似的內(nèi)嗅區(qū)-海馬體投射的形態(tài)構(gòu)造，側(cè)向和內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層的側(cè)部中的神經(jīng)元投射至海馬體的背部或中隔極(septalpole)，而至腹側(cè)海馬體的投射主要源自內(nèi)嗅區(qū)皮層內(nèi)側(cè)區(qū)的神經(jīng)元(PrinciplesofNeuralScience(神經(jīng)科學(xué)原理)，第4版，編輯Kandel等，McGraw-Hill,1991;TheRatNervousSystem(大鼠神經(jīng)系統(tǒng))，第2版，編輯:Paxinos，AcademicPress,1995)。此外，內(nèi)嗅區(qū)皮層的II層細(xì)胞投射至齒狀回，且它們終止于齒狀回分子層的外側(cè)三分之二。來自III層細(xì)胞的軸突雙側(cè)投射至海馬體的安蒙氏角區(qū)CA1和CA3，終止于層多孔分子層。第二個(目標(biāo))位點可以位于含有投射至第一個(注射)位點的祌經(jīng)元的CNS任何區(qū)域中，包括腦和脊髓。在一些實施方案中，第二個位點是在選自黑質(zhì)體、延髓或脊髓的CNS區(qū)域中。為了將載體特異性地傳送至中樞祌經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域，尤其是傳送至腦的特定區(qū)域，可以通過立體定向微注射來給藥。例如，在外科手術(shù)的那一天，患者將具有在適當(dāng)位置固定(旋入顱骨中)的立體定向框架基。使用高分辨率MRI將帶有立體定向框架基的腦(具有fiduciary標(biāo)記的與MRI相容的)成像。然后MRI圖像將轉(zhuǎn)移至運行立體定向軟件的計算機。將一組冠狀、矢形和軸向圖像用于測定載體注射的目標(biāo)部位和軌跡。軟件直接將軌跡翻譯成適用于立體定向框架的3-維坐標(biāo)。在進入部位上鉆Burrhole并用定位于立體定向裝置的針植入給定深度。然后注射藥物學(xué)上可接受介質(zhì)中的載體。然后通過直接注射至主要的目標(biāo)部位來給藥AAV載體并通過軸突逆向運輸至遠(yuǎn)側(cè)目標(biāo)位點?？梢允褂闷渌慕o藥途徑，例如，直接觀察下的表面皮層應(yīng)涵，或其他非立體定向應(yīng)用。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員基于基因治療的已知方面來測定待給藥物質(zhì)的總體積，和待給藥的載體顆粒的總量?？梢栽诤线m的動物模型中測試治療有效性和安全性。例如，對于LSDs存在多種公認(rèn)的動物模型，例如，如在此所述的或在Watson等(2001)MethodsMol.Med.，76:383-403或Jeyakumar等(2002)Neuropath.A卯l.Neurobiol.，28:343-357中所述的。在實驗小鼠中，注射的AAV溶液的總體積是例如，l至5pl。對于其他哺乳動物，包括人腦，適當(dāng)衡量體積和傳送速率。例如，己經(jīng)證明了在靈長類腦中可以安全地注射150(^1的體積(Janson等(2002)Hum.Gene.Ther.，13:1391-1412)。治療包括每個注射位點的單次注射，或者如果需要，可以沿著注射道(tract)重復(fù)?？梢允褂枚鄠€注射位點。例如，在一些實施方案中，除了第一個給藥位點，將含有攜帶轉(zhuǎn)基因的AAV的組合物給藥至另一個位點，其可以在第一個給藥位點的對側(cè)或同側(cè)。在另一個方面中，本發(fā)明提供了體內(nèi)傳送重組AAV基因組的方法，通過逆向軸突運輸至受疾病損害的神經(jīng)元的核。在一些實施方案中，神經(jīng)元呈現(xiàn)的細(xì)胞病理是LSD的細(xì)胞病理，如表1中所列的(參見，例如，Walkley(1998)BrainPathol.，8:175-193)。在說明性的實施方案中，疾病是Niemann-PickA疾病。傳送重組AAV基因組至受疾病損害的神經(jīng)元的核的方法包括將疾病損害的神經(jīng)元的軸突末梢接觸含有AAV病毒顆粒的組合物，該病毒顆粒含有重組AAV基因組，并使病毒顆粒被內(nèi)吞且沿著軸突逆向胞內(nèi)運輸至神經(jīng)元的核，其中組合物中AAV基因組的濃度為至少(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl09tu/ml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、]5、20、25或50(xl01()iu/ml)。在特定的實施方案中，祌經(jīng)元是投射祌經(jīng)元和/或軸突末梢至祌經(jīng)元核的距離至少為2、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm。在各種實施方案中，AAV基因組沿著軸突的整個長度運輸，距離根據(jù)軸突長度而改變。在人類中，這些距離可以為1000mm或更長。在另一個方面中，本發(fā)明提供了將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物傳送至患有疾病例如表1中所列LSD的哺乳動物的CNS的目標(biāo)細(xì)胞的方法，目標(biāo)細(xì)胞是祌經(jīng)元或祌經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。該方法包括將神經(jīng)元的軸突末梢接觸含有AAV載體的組合物，該載體攜帶至少部分編碼治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的基因；使病毒顆粒被內(nèi)吞并沿著軸突逆向胞內(nèi)運輸至祌經(jīng)元的核；使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物通過神經(jīng)元表達(dá)和分泌；并使第二個細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物因此緩解第二個細(xì)胞中的病理。在一些實施方案中，組合物中AAV載體的濃度為至少(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl012gp/ml);(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl09tu/ml);或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl010iu/ml)。例如，可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞分泌溶酶體水解酶并隨后通過甘露糖-6-磷酸受體介-^的內(nèi)吞由另一個細(xì)胞吸收，第二個細(xì)胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)的或非轉(zhuǎn)導(dǎo)的(Sando等(1977)Cell,12:619-627;Taylor等(1997)Nat.Med.,3:771-774;Miranda等(2000)GeneThen，7:1768-1776和Jin等(2002)J.Clin.Invest.，109:1183-1191)。在本發(fā)明的方法中，可以使用任何血清型的AAV，只要載體能夠在疾病損害的腦中逆向軸突運輸。本發(fā)明特定實施方案中使用的病毒載體的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7禾BAAV8(參見，例如，Gao等(2002)PNAS，99:11854-11859和ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols(用于基因治療的病毒載體方法和實驗方案)，編輯Machida，HumanaPress,2003)。除了在此所列的那些，可以使用其他血清型。此外，假模標(biāo)本AAV載體也可以用于在此公開的方法中。假模標(biāo)本AAV載體是在第二個AAV血清型的衣殼中含有一個AAV血清型基因組的那些；例如，含有AAV2衣殼和AAV1基因組的AAV載體或含有AAV5衣殼和AAV2基因組的AAV載體。(Auricchio等(2001)Hum.Mol.Genet.，10(26):3075-81)。然而，AAV5可以特異性地排除在本發(fā)明使用金屬內(nèi)肽酶例如腦啡肽酶作為治療性轉(zhuǎn)基因的方法之外。AAV載體源自對哺乳動物非致病的單鏈(ss)DNA細(xì)小病毒(Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129中綜述)。簡而言之，基于AAV的載體具有rep和cap病毒基因，占所除去的病毒基因組的96%，留下兩側(cè)145-堿基對(bp)的末端倒置重復(fù)序列(ITRs)，其用來啟動病毒DNA復(fù)制、包裝和整合。在輔助病毒不存在下，野生型AAV整合至人宿主細(xì)胞基因組中，優(yōu)選在染色體19q13.3具有位點特異性，或其可以保持為表達(dá)的游離基因。單個AAV顆?？梢匀菁{高達(dá)5kb的ssDNA，因此留下約4.5kb用于轉(zhuǎn)基因和調(diào)控元件，這通常足夠了。然而，例如在美國專利No.6,544,785中所述的反式剪接系統(tǒng)幾乎使該極限加倍。在說明性的實施方案中，AAV是AAV2或AAV1。許多血清型的腺相關(guān)病毒，尤其是AAV2，已經(jīng)得到廣泛研究并表征為基因治療載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉基于功能性AAV的基因治療載體的制備。很多關(guān)于用于給藥于人患者的AAV生產(chǎn)、純化和制備的各種方法可以在大量出版文獻(xiàn)的主要部分中找到(參見，例如，ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols(用于基因治療的病毒載體方法和實驗方案)，編輯Machida，HumanaPress,2003)。此夕卜，美國專利No.6,180,613和6,503,888中己經(jīng)描述了靶向CNS細(xì)胞的基于AAV的基因治療。在本發(fā)明的特定方法中，載體包括可操作連接啟動子的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因編碼生物活性分子，其在CNS中的表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)病理的至少部分校正。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因編碼溶酶體水解酶。在說明性的實施方案中，溶酶體水解酶是ASM。人ASM的基因組和功能性cDNA序列已經(jīng)公開(參見，例如，美國專利No.5,773,278和6,541,218)。其他溶酶體水解酶可以用于合適的疾病，例如，如表l中所列的。本發(fā)明進一歩提供了治療哺乳動物包括人的阿爾茨海默氏病的方法。在這樣的方法中，轉(zhuǎn)基因編碼金屬內(nèi)肽酶。例如，金屬內(nèi)肽酶可以是淀粉狀蛋白-P降解酶腦啡肽酶(EC3.4.24.11;序列登錄號，例如，P08473(SWISS-PROT))，胰島素降解酶insulysin(EC3.4.24.56;序列登錄號，例如，P14735(SWISS-PROT))，或thimet寡肽酶(EC3.4.24.15;序列登錄號，例如，P52888(SWISS-PROT))。很大程度上通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒內(nèi)的轉(zhuǎn)錄啟動子來決定真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平。一些實施方案中使用顯示出長期活性并是組織甚至細(xì)胞特異性的啟動子。啟動子的非限制實例包括但不限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(Kaplitt等(1994)Nat.Genet.，8:148-154)、CMV/人卩3-珠蛋白啟動子(Mandel等(1998)J.Neurosci.，18:4271-4284)、GFAP啟動子(Xu等，(2001)GeneTher.，8:1323-1332)、1.8-kb神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Klein等(1998)Exp.Neurol.，150:183-194)、雞(3-肌動蛋白(CBA)啟動子(Miyazaki(1989)Gene,79:269-277)和p-葡糖苷酸酶(GUSB)啟動子(Shipley等(1991)Genetics,10:1009-1018)。為了延長表達(dá)，可以將其他調(diào)控元件另外可操作地連接轉(zhuǎn)基因，例如，土撥鼠肝炎病毒后-調(diào)控元件(WPRE)(Donello等(1998)J.Viro1.，72，5085-5092)或牛生長激素(BGH)多腺苷酸化位點。對于一些CNS基因治療應(yīng)用，需要控制轉(zhuǎn)錄活性。為此，通過包括各種調(diào)控元件和藥物應(yīng)答性啟動子來獲得用AAV載體的基因表達(dá)的藥物學(xué)調(diào)控，例如描述于Habe腿et等(1998)GeneTher.，5:1604-16011和Ye等(1995)Science，283:88-91?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)來生產(chǎn)高滴定度AAV制劑，如美國專利No.5,658,776和ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols(用于基因治療的病毒載體方法和實驗方案)，編輯Machida，HumanaPress，2003中所述的。以下的實施例提供了本發(fā)明的說明性實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以進行各種改進和改變而沒有改變本發(fā)明的精神或范圍。這樣的改進和改變包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例不以任何方式來限制本發(fā)明。實施例重組載體的滴定根據(jù)基因組拷貝數(shù)量(每微升的基因組顆粒)來測量AAV載體滴定度?；蚪M顆粒濃度是基于載體DNA的TaqmanPCR，如之前報道的(Clark等(1999)Hum.GeneTher.，10:1031-1039;Veldwijk等(2002)Mol.Ther.'6:272-278)。簡而言之，用衣殼消化緩沖液(50mMTris-HClpH8.0、l.OmMEDTA、0.5%SDS、l.Omg/ml蛋白酶K)在50。C處理純化的AAV-ASM1小時來釋放載體DNA。將DNA樣品完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用與載體DNA中的特異性序列如啟動子片段、轉(zhuǎn)基因或多A序列退火的引物。然后通過實時Taqman⑧軟件定量PCR結(jié)果，如PerkinElmer-AppliedBiosystems(FosterCity，CA)Prism7700序列檢測系統(tǒng)提供的?？梢允?用感染力測試來滴定攜帶可檢測標(biāo)記基因如卩-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白基因(GFP)的載體。用AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)易感細(xì)胞(例如，HeLa，或COS細(xì)胞)，并進行測試來測定基因表達(dá)，如用X-gal(5-溴-4-氯-3』引哚-p-D-吡喃半乳糖苷)的卩-半乳糖苷酶載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的染色或用于GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測。例如，如下進行測試將4xl04HeLa細(xì)胞涂布于24-孔培養(yǎng)平板的每個孔中,使用通常的生長培養(yǎng)基。附著后，即大約24小時后，用多重性感染(MOI)10的5型Ad感染細(xì)胞并用連續(xù)稀釋的包裝載體轉(zhuǎn)導(dǎo)并在37。C孵育。一至三天后，在觀察大范圍細(xì)胞病理效應(yīng)之前，對細(xì)胞進行適當(dāng)?shù)臏y試(例如，X-gal染色或熒光顯微鏡觀察)。如果使用報告基因如p-半乳糖苷酶，將細(xì)胞固定于2%多聚甲醛、0.5%戊二醛中并使用X-gal對P-半乳糖苷酶活性染色。計數(shù)獲得很好分離的細(xì)胞的載體稀釋度。每個陽性細(xì)胞表示載體的1個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)。小鼠腦中LSD病理的校正十周齡的ASMKO小鼠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含有顯著的NPD病理。通過PCR證實純合子隱性突變的鑒定。用異氟垸將十六只10周齡的ASMKO小鼠麻醉并安放在立體定向框架上，形成切口來暴露底下的顱骨，在每只小鼠的一個半球上形成單個鉆孔。將兩微升高滴定度(9.3xlOl2gp/ml)AAV2-CMV-ASM(TargetedGenetics,Seattle,WA)注射至海馬體中，最終立體定位坐標(biāo)為前卣點吻端2.0mm、中線右側(cè)1.5mm和軟膜表面腹側(cè)2.0mm。該海馬體坐標(biāo)確保了AAV2載體暴露于齒狀回和安蒙氏角區(qū)3(CA3)的神經(jīng)元，以及暴露于對側(cè)海馬體、內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層的投射神經(jīng)元的軸突末梢。以0.2pl/分鐘的速率進行注射，總的1.86xl01Q基因組顆粒給藥至每個腦中。使用本領(lǐng)域己知的和Sleat等(2004)J.Neurosd.24:9117-9126中再現(xiàn)的方法，通過Smartrod(AccuScan)上的加速和搖擺旋轉(zhuǎn)來測試小鼠的運動功能。圖10A/B和圖11A/B用圖表顯示了作為運動功能恢復(fù)的測量的旋轉(zhuǎn)測試的結(jié)果。然后在注射(pi)后5(n=8)或15(n=8)周時將小鼠處死。分析八個腦(在pi后5和15周，各自n=4)的ASMmRNA和蛋白質(zhì)分布，以及溶酶體中膽固醇的超生理(sup鄰hysidogic)水平的降低。處理剩余的8個腦(在pi后5和15周，各自11=4)用于組織病理學(xué)來分析累積的和擴張的溶酶體的校正，這是測定LSDs的貯積病理逆轉(zhuǎn)的最直接和最精確的方法。在pi后5和15周，注射(同頂ij)的海馬體中檢測到強烈的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過AAV2載體大范圍地轉(zhuǎn)導(dǎo)了齒狀回的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞層和門臍以及CA3的錐體細(xì)胞和oriens細(xì)胞層。這種給人深刻印象的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式延仲至同側(cè)海馬體的其他部位，如海馬下托區(qū)(subiculum)和安蒙氏角區(qū)l(CA1)和2(CA2)。使用抗人ASM單克隆抗體的免疫熒光證實了許多細(xì)胞中ASM蛋白的存在。整體的蛋白模式與mRNA模式相似，并具有一些其他定位分布的蛋白質(zhì)。，還在兩個時間點的同側(cè)海馬體外側(cè)區(qū)域檢^ij到人ASMmRNA和蛋白質(zhì)。對側(cè)齒狀回和CA3，和內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層對于原位雜交和免疫熒光是陽性的(圖1A和2A)。在這些遠(yuǎn)側(cè)位點的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式與神經(jīng)支配注射位點的投射祌經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造相一致(圖1B和2B)。這證明了AAV2經(jīng)歷了ASMKO腦的內(nèi)海馬體、隔海馬和entorhinodentate回路中的逆向軸突運輸，以及運輸至軸突上后病毒載體靶向核(圖1C和2C)。轉(zhuǎn)導(dǎo)模式不支持實質(zhì)擴散，因為AAV2運輸至這些遠(yuǎn)側(cè)位點的原因。如果這樣的擴散已經(jīng)發(fā)生，注射和遠(yuǎn)側(cè)位點之間的結(jié)構(gòu)將已經(jīng)暴露于遷移中的病毒。但是這些中間結(jié)構(gòu)對于原位雜交是陰性的。例如紋狀體，其對于AAV2具有強烈的向性，盡管在海馬體和內(nèi)側(cè)中隔之間的直接通路中，而對于基因轉(zhuǎn)移是陰性的。因此，基因轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)側(cè)位點必須通過逆向軸突運輸引起，這表明受影響的投射神經(jīng)元可以作為有效的高速運輸系統(tǒng)，用于通過患病腦的AAV2移動。另外研究了ASM逆轉(zhuǎn)ASMKO腦中膽固醇異常的能力。菲律賓菌素是從菲律賓鏈霉菌(Streptomycesfilipinensis)中分離的結(jié)合膽固醇復(fù)合物的自體熒光分子(Leventhal等(2001)J.Biol.Chem.，276:44976-44983和Sarna等(2001)Eur.J.Neurosci.，13:1-9)。由于這些大量的膽固醇復(fù)合物，未注射的ASMKO腦具有高水平的菲律賓菌素染色，而正常的小鼠腦沒有產(chǎn)生菲律賓菌素染色。AAV2-CMV-ASM的注射導(dǎo)致pi后5和15周的ASMKO小鼠在整個同側(cè)和對側(cè)海馬體、中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層中完全失去菲律賓染色(圖1A和2A)。這與未注射的年齡相適的ASMKO對照完全相反，在對照中這些相同結(jié)構(gòu)中檢測到高水平的菲律賓菌素染色。AAV2-注射的腦中菲律賓菌素染色的失去證明校正了ASM疾病的繼發(fā)性細(xì)胞表型(例如，代謝缺陷)。這強烈表明了ASM蛋白質(zhì)靶向溶酶體并與祌經(jīng)鞘磷脂-膽固醇復(fù)合物相互作用。這種相互作用很可能導(dǎo)致膽固醇從神經(jīng)鞘磷脂釋放出來，隨后膽固醇進入其正常的生物途徑(如降解或轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜(Leventhal等(2001)J.Biol.Chem.，276:44976-44983))。在內(nèi)海馬體、隔海馬和entorhinodentate回路的所有細(xì)胞層和亞區(qū)中觀察到菲律賓菌素染色的失去。膽固醇校正的區(qū)域比ASM蛋白質(zhì)模式大得多且范圍更大。這表明AAV2的逆向軸突運輸后，投射祌經(jīng)元可以作為"酶泵"并將ASM蛋白質(zhì)分泌至周圍組織中。重要地，只需要少量ASM即可對ASMKO-影響的細(xì)胞內(nèi)的膽固醇累積具有治療效果，含量低于免疫熒光方法的檢測極限。還評價了AAV2-ASM載體的軸突運輸是否導(dǎo)致了NPD原發(fā)細(xì)胞表型的校正。一微米厚的組織病理學(xué)腦切片證明了pi后5周時AAV2-CMV-ASM注射的腦中累積的和擴張的溶酶體病理的顯著降低(表2)。導(dǎo)致部分或全部.m常細(xì)胞構(gòu)造恢復(fù)的病理逆轉(zhuǎn)發(fā)生在同側(cè)和對側(cè)海馬體半球的所有區(qū)域中。內(nèi)側(cè)中隔和內(nèi)嗅區(qū)皮層也顯示出貯積損傷的實質(zhì)性減輕。與菲律賓菌素數(shù)據(jù)相似，校正的細(xì)胞數(shù)量比ASM蛋白模式的大且更廣泛。病理的逆轉(zhuǎn)在已知投射至海馬體的區(qū)域內(nèi)是明顯的，包括內(nèi)海馬體、隔海馬和entorhinodentate回路?？傊Ｕ捏w積在對側(cè)海馬體中為30-35mn^或更多，在同側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層中為5-8mm3或更多，對側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層中'為l-2mm3或更多，內(nèi)側(cè)中隔中為2-3mm3或更多。這進一歩支持病毒載體的軸突運輸引起了這種治療效果，因為如果只是通過擴散介導(dǎo)病毒分布，附近的結(jié)構(gòu)(沒有參與這些回路)己經(jīng)應(yīng)該得到校IE(參見，表2中的"同側(cè)紋狀體"和"對側(cè)紋狀體")。為了證明病理的逆轉(zhuǎn)是ASM特異性的，將另一組ASMKO小鼠注射攜帶報告基因AAV2-CMV-(3-gal的對照載體(在pi后的5和15周各自rv=2)，并處理用于組織病理學(xué)。在所有四個腦中，細(xì)胞保持被擴張的溶酶體淹沒，并含有其他異常，如細(xì)胞質(zhì)腫脹和紊亂的細(xì)胞層。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>對側(cè)海馬體+++++CA1區(qū)+++++CA3區(qū)+++++齒狀回細(xì)胞層門+++++同側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層++++++對側(cè)內(nèi)嗅區(qū)皮層+++++++同側(cè)內(nèi)側(cè)中隔++++++纖體高++++++同側(cè)紋狀體++++++++對側(cè)紋狀體十十++++++++++實際上所有細(xì)胞中高水平的病理+++許多細(xì)胞中的病理，一些細(xì)胞中觀察到校正++—些細(xì)胞中的病理，許多細(xì)胞中觀察到校正+大部分細(xì)胞中很少或沒有病理，實際上每個細(xì)胞得到校正因此，根據(jù)本發(fā)明，單次注射高滴定度AAV2載體足以將ASM基因轉(zhuǎn)移至支配ASMKO影響的海馬體的結(jié)構(gòu)。對AAV2載體陽性的結(jié)構(gòu)的數(shù)量大于正常大鼠海馬體中最近研究證明的，其顯示了軸突運輸只在entorhinodentate回路中(Kaspar等(2002)Mol.Ther.，5:50-56)。在此描述的結(jié)果證明了軸突運輸可以發(fā)生在受貯積病理侵害的投射神經(jīng)元中，并且這種運輸模式導(dǎo)致鄰近結(jié)構(gòu)和注射位點遠(yuǎn)側(cè)的多個區(qū)域中JC積病理的清除。我們還證明了軸突運輸不限于只有那些與海馬體相連的回路。逆向軸突運輸發(fā)生在黑質(zhì)紋狀體(圖3)和延髓小腦(圖4)回路中。這證明了疾病損害的神經(jīng)元中AAV2的軸突運輸是病毒載體的一般特性。用l-4xl013gp/ml濃度的AAV1-ASM和8.4xlOl2gp/ml濃度的AAV7-ASM進行了相似的研究。盡管AAV1沒有呈現(xiàn)出可檢測的逆向軸突運輸，AAV7經(jīng)歷了逆向軸突運輸，與AAV2相似，并在遠(yuǎn)側(cè)區(qū)域中產(chǎn)生LSD病理的校正(參見圖5)。注射AAV至小腦用異氟烷麻醉ASMKO小鼠并安置于立體定向框架上。定位前囟點作為參照點來測定注射至小腦的深部小腦核區(qū)域的鉆孔位置。一旦定位，形成切口來暴露底下的顱骨，并在顱骨中形成單個鉆孔而沒有刺穿腦表面。將漢密爾頓注射器通過孔放在腦中并將AAV2-CMV-ASM以0.5微升每秒的速率注射至深部小腦核中。對于lxl(^基因組顆粒的總劑量注射三微升。在注射后7周將小鼠處死。評價腦和脊髓的ASMmRNA表達(dá)、ASM蛋白表達(dá)、菲律賓菌素染色和鈣結(jié)合蛋白染色。菲律賓菌素是結(jié)合膽固醇復(fù)合物的自體熒光分子。山于大量膽固醇復(fù)合物，其作為疾病的結(jié)果而累積，未治療的ASMKO小鼠具有高水平的菲律賓菌素染色。相反，正常小鼠腦沒有呈現(xiàn)菲律賓菌素染色。鈣結(jié)合蛋白是浦肯野細(xì)胞的標(biāo)記，其在小腦中找到并涉及協(xié)同移動。在ASMKO小鼠中，浦肯野細(xì)胞隨著小鼠的年老而在這些小鼠中相繼死亡，導(dǎo)致降低的協(xié)同移動行為。在TF.常小鼠中沒有觀察到這種浦肯野細(xì)胞的失去和協(xié)同移動行為的相關(guān)丟失。AAV2注射至深部小腦核后，小腦對ASMmRNA、ASM蛋白質(zhì)和鈣結(jié)合蛋白染色是陽性的。這些結(jié)果證明了注射至深部小腦核后AAV2轉(zhuǎn)導(dǎo)小腦的能力。此外，小腦轉(zhuǎn)導(dǎo)和所得到的ASM表達(dá)防止浦肯野細(xì)胞死亡，如通過治療過的小鼠中鈣結(jié)合蛋白染色的存在所證明的。在AAV-ASM治療的小鼠中，還在整個腦干、丘腦和mescencephalon觀察到hASM蛋白的表達(dá)。這些區(qū)域中的hASM蛋白表達(dá)與菲律賓菌素/膽固醇染色的清除的區(qū)域相重疊?？傊?，在小腦中，在ASM蛋白水平、菲律賓菌素清'除和浦肯野細(xì)胞存活之間存在正向關(guān)系。還在小腦外側(cè)檢測到ASMmRNA和ASM蛋白。特別地，脊髓對ASMmRNA表達(dá)是陽性的，如通過原位雜交所證明的。脊髓對ASM蛋白也是陽性的，如通過ASM-特異性免疫熒光所證明的。這些結(jié)果表明AAV載體遠(yuǎn)側(cè)注射至深部小腦核后脊髓得到轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)模式與支配深部小腦核區(qū)域的投射神經(jīng)元的形態(tài)構(gòu)造相一致。這些結(jié)果表明遠(yuǎn)側(cè)脊髓細(xì)胞通過吸收AAV2載體并對其進行表達(dá)。阿爾茨海默氏病的治療阿爾茨海默氏病(AD)是神經(jīng)退化疾病，特征在于由于降低的A卩分解代謝而導(dǎo)致的淀粉狀蛋白{3-肽(A(3)的累積。隨著A卩累積，其聚集成胞外斑，弓l起突觸功能的損傷和神經(jīng)元的丟失。該病理導(dǎo)致癡呆、失去協(xié)調(diào)和死亡。腦啡肽酶是97KD膜結(jié)合鋅金屬內(nèi)肽酶，是A(3正常降解中的限速酶。腦啡肽酶的引入通過在A(3聚集之前除去A卩集合而減緩了疾病的進展。實際上，腦啡肽酶顯示出降解A卩的寡聚形式，因此除去AD動物模型中存在的斑(Kanemitsu等(2003)Neurosci.Lett.，350:113-116)。腦啡肽酶敲除小鼠呈現(xiàn)出高水平的Ap(Iwata等(2001)J.Neurosci.，24:991-998)。腦啡肽酶抑制劑，如thiorphan和磷酸阿米酮(phosphoramidon)，提高小鼠腦中的Ap水平(Iwata等(2000)Nat.Med.，6:143-150)。此外，在人腦的高淀粉狀蛋白斑塊負(fù)荷區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)降低的腦啡肽酶mRNA水平，進一步證明了腦啡肽酶和AD之間的連接(Yasojima等(2001)Neurosci.Lett.，297:97-100)。腦的區(qū)域受AD影響最大的是海馬體、皮層、小腦、紋狀體和丘腦(參見，例如，Iwata等(2001)上文；Yasojima等(2001)上文)。這些是顯示出使用AAV的有效逆向軸突運輸?shù)南嗤哪X區(qū)域。因此，通過直接注射和隨后病毒通過腦回路運輸至我們的目標(biāo)部位，AAV可以用于傳送治療性轉(zhuǎn)基因至高斑塊負(fù)荷的區(qū)域。病毒載體介導(dǎo)的腦啡肽酶基因轉(zhuǎn)移在AD小鼠模型的治療中是有效的(Marr等(2003)J.N畫sci.，23:1992-1996;Marr等(2004)J.Mol.Ne腦sci.，22:5-11;Iwata等(2004)J.Ne畫ci.，24:991-998)。最近的報道表明AAV5-腦啡肽酶從腦啡肽酶缺陷小鼠的海馬體突觸前末端除去A卩，減緩?fù)挥|的斑形成(Iwata等(2004)上文)。在這篇報道中，在對側(cè)海馬體中發(fā)現(xiàn)腦啡肽酶，但這是歸功于病毒的逆向運輸或是表達(dá)的蛋白質(zhì)的順行運輸仍然是未知的。膽固醇貯積病理的校正以下的實施例，在被單側(cè)注射到深部小腦核后，評價了編碼人ASM(hASM)的重組AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8血清型載體來表達(dá)hASM蛋白質(zhì)、校正膽固醇貯積病理、經(jīng)受運輸、拯救浦肯野細(xì)胞并啟動ASMKO小鼠中功能恢復(fù)的相對能力。另一組ASMKO小鼠接受了&側(cè)注射至DCN，以便評定增加轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)分布/表達(dá)是否將提高行為功能性恢復(fù)。從雜合子交配(+/-)繁殖六十六只雄性純合(-/-)酸性神經(jīng)鞘磷脂酶敲除(ASMKO)小鼠和十六只雄性野生型同窩出生的對照小鼠。按照Gal等(1975)NEnglJMed:293:632-636中所述的程序通過PCR測定小鼠的基因型。將來自最初克隆的小鼠回交C57/BI6株系。將動物在12:12小時亮:暗周期下飼養(yǎng)并無限制的提供食物和水。所有程序在實驗動物管理委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批準(zhǔn)的實驗方案下進行。用異氟垸麻醉后，使用以下的AAV血清型載體之一單側(cè)注射小鼠(~7周齡)至深部小腦核中(DCN)(A-P:離前囟點-5.75，M畫L:離前囟點-1.8，D-V:離硬腦脊膜(dura)-2.6，門齒桿(incisorbar):0.0)，(!1=8/載體):AAVl-CMV-卩gal、AAV1-CMV-ASM、AAV2-CMV-ASM、AAV5-CMV-ASM、AAV7-CMV-ASM和AAV8-CMV-ASM。用安置于注射泵上的10fil漢密爾頓注射器以0.5(xl/分鐘的速率傳送載體，用于每個腦總量為1.86xl(T基因組顆粒。每個載體最終注射的體積是4nl。外科手術(shù)一小時之前和二十四小時之后，給予小鼠酮洛芬(5mg/kg;SC)，用于痛覺喪失。注射后7周(14周齡時)將小鼠處死。在處死時，給予小鼠過量euthasol(150mg/kg;IP)并快速斷頭(n-5/組)或頸動脈灌注(11=3/組)?？焖偃〕鰜碜詳囝^小鼠的腦，在液氮中快速冷凍，分成3個部分(右大腦半球，左大腦半球，和小腦)，勻漿并通過ELISA分析hASM。將來自灌注小鼠的腦和脊髓處理，用于50nm震動(vibratone)切片上的人ASM蛋白質(zhì)表達(dá)，通過菲律賓菌素染色所檢測的膽固醇累積，和使用鈣結(jié)合蛋白染色的浦肯野細(xì)胞存活。使用相似的實驗方案，將ASMKO小鼠(~7周齡)兩側(cè)注射AAV2/l-(3gal(n=8)，AAV2/1-ASM(n=5)和AAV2/2-ASM(n=5)并在20周齡時經(jīng)歷旋轉(zhuǎn)測試后處死。將腦在液氮中快速冷凍，在中線切分，然后使用小鼠腦基質(zhì)(ASIInstruments,Inc，MI)分成5個切片(Sl、S2、S3、S4和S5)。切片1-4大約間隔2mm，Sl為最頭端和S4為最尾端。切片5只含有小腦。右半球用于定量腦髓鞘磷脂水平和剩余的(left)hASM水平。在具有SV40多腺苷酸化序列和雜交內(nèi)含子的人巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動子控制下，將全長人ASMcDNA克隆至含有來自AAV血清型2的ITRs(AAV2ITR)的質(zhì)粒中。Jin等(2002)JClinInvest.109:1183-1191。使用一系列除了AAV2型復(fù)制基因以外含有血清型特異性衣殼編碼結(jié)構(gòu)域的輔助質(zhì)粒通過三重轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生雜交載體。該策略使AAV2ITR載體包裝至每個血清型特異性病毒粒子中，Rabi薩itz等(2002)JVirol.76:791-801。使用該方法，hASM重組基因組用來產(chǎn)生包括AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7禾nAAV2/8各種血清型的系列rAAV-hASM載體。通過離子交換色譜(血清型2/l、2/2和2/5)(O，Riordan等(2000)JGeneMed2:444-54)或CsCl離心(血清型2/8和2/7)(Rabi薩itz等(2002)J.Urrol.76:791-801)來純化重組AAV載體。通過CMV序列的TaqManPCR測定AAV-ASM病毒粒子的最終滴定度(DNAse-抵抗顆粒)。Clark等(1999)Hum.GeneTherapy10:1031-1039。人ASM抗體是人特異性的并且不與小鼠ASM交叉反應(yīng)。將稀釋于50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中的單克隆重組人ASM(rhASM)抗體(2嗎/ml)Coster(Corning,NY)包被9018平板(腳l/孔)，并在2-8。C孵育過夜。除去過量包被抗體并加入阻斷稀釋劑(KPL，Inc.,MD)在37。C孵育lh。用微量培養(yǎng)板洗滌器(MolecularDevices,CA)將平板洗滌兩個循環(huán)。吸取雙份稀釋于標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液(PBS，0.05%吐溫，1%HP-BSA)中的標(biāo)準(zhǔn)、對照和樣品并使其在37。C孵育lh。如上所述將平板洗滌。將一百微升生物素化的重組人ASM(rhASM)抗體(稀釋1:20K于標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液中)加入每個孔中，使其在37。C孵育lh，然后用微量培養(yǎng)板洗滌器除去。然后加入稀釋1:10K的抗生蛋白鏈菌素-HRP(PierceBiotechnology,Inc.,IL)(10(Vl/孔)并使其在室溫孵育30分鐘。如上所述將平板洗滌，然后用SureBlueTMB(KPL，Inc.,MD)在36-38。C孵育15分鐘。用停止溶液(KPL，Inc.,MD)使反應(yīng)停止，然后用SpectraMax340平板閱讀器在450腿閱讀吸收值(MolecularDevices,CA)。使用SoftmaxPro4.3軟件(MolecularDevices,CA)完成數(shù)據(jù)分析。用BCA蛋白質(zhì)測試試劑盒(PierceBiotechnology,Inc.,IL)測定每個樣品的蛋白質(zhì)濃度，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。將小鼠經(jīng)頸動脈(transcardially)灌注在pH6.5的0.1M醋酸鈉緩沖液中含有2%多聚甲醛、0.03%戊二醛、0.002。/。CaCl2的固定劑，接著用pH8.5的相同固定劑灌注。切丌小鼠腦和脊髓并在pH8.5的無戊二醛的固定劑中4"C后固定過夜。將組織在pH7.4的0.1M磷酸鉀緩沖液中洗滌，包埋于3.5%的瓊脂中并用振動切片機切成50(im矢形切片。以50pm的間隔將腦和脊髓用振動切片機切成矢形切片。用抗人ASM的一抗(1:200)處理切片，用于免疫熒光。將切片孵育于含有10%驢血清、0.3%曲通X-100的PBS中1小時，接著用在含有2%驢血清、0.2%曲通X-100的PBS中的生物素化小鼠抗-人ASM孵育72小時。洗滌后，使用Tyramide信號擴大試劑盒(PerkinElmer，BostonMA)擴大信號。用Nikon熒光顯微鏡觀察人ASM蛋白質(zhì)，并用SPOT相機和AdobePhotoshop軟件捕獲圖像。首先將菲律賓菌素復(fù)合物(Sigma,St.Louis,MO)稀釋于100%甲醇中，用作lmg/ml的儲備濃度。儲液在-2(TC可穩(wěn)定4周。用PBS洗滌后，將切片在用PBS新鮮制得的含有l(wèi)Opg/ml菲律賓菌素溶液中在黑暗中孵育三小時。然后用PBS將切片洗滌三次。在熒光顯微鏡上的紫外線濾鏡下觀察膽固醇沉積。使用抗鈣結(jié)合蛋白(鈣結(jié)合蛋白)的一抗處理腦，用于免疫熒光。用磷酸鉀緩沖液(KPB)洗滌切片，然后用磷酸鉀緩沖鹽水(KPBS)漂洗。然后將切片在含有_5%驢血清、0.25%曲通X-100的KPBS中封閉切片高達(dá)3小時，然后在含有5%驢血清、0.2%曲通X-100和小鼠抗-鈣結(jié)合蛋白(1:2500，Sigma，St.Louis,MO)的KPBS中孵育。在fC72小時后，用含有0.1%曲通X-100的KPBS將切片漂洗三次。在KPBS+0.r/。曲通X-100中加入二抗驢抗小鼠CY3(1:333，JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove，PA)，然后與切片室溫孵育90分鐘。用KPB將切片洗滌，然后安置于凝膠包被的載玻片上。在落射熒光顯微鏡(epifluorescence)下觀察鈣結(jié)合蛋白陽性細(xì)胞。為了定量小腦的浦肯野細(xì)胞，從每個動物選擇四個全斷面(full-faced)的內(nèi)側(cè)小腦切片。在熒光顯微鏡下觀察鈣結(jié)合蛋白免疫陽性浦肯野細(xì)胞并在20X的放大倍數(shù)計數(shù)細(xì)胞體。將每個葉分開計數(shù)。每個葉計數(shù)兩個分開的焦平面。只計數(shù)清晰的細(xì)胞來確保沒有細(xì)胞被計數(shù)兩次。如上所述，首先用抗人ASM的抗體處理五十(50)震動切片機的切片以用于免疫熒光。然后將切片在PBS中洗滌并用以上對于鈣結(jié)合蛋白概述的實驗方案對膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶染色(ChAT;兔多克隆，h500，ChemiconInternational,Temecula,CA)。然而，不使用CY3二抗以外，而使用驢-抗-兔子FITC(1:200，JacksonImmunoresearchLaboratories，AVestGrave,PA)。首先在.落身寸熒光顯斗放專竟下觀察染色，然后用共焦顯微鏡獲得圖像。如下定量菲律賓菌素染色。使用裝備SPOT數(shù)碼相機的NikonE600全視野立式落射熒光顯微鏡捕獲曝光正確的圖像。首先成像AAV2/l-P-gal組，并用曝光來獲取所有其他圖像。每個分析的圖像表示通過每半個腦長度的內(nèi)側(cè)矢形面。用Matamorph軟件(UniversalImagingCorporation)進行形態(tài)測量分析。AAV2/l-p-gal圖像作為閾值；一旦建立，在所有的圖像中使用相同的閾值。通過使用者親自選擇以下的區(qū)域并分開分析小腦、腦橋、延髓、中腦、腦皮層、海馬體、丘腦、下丘腦和紋狀體。在每個區(qū)域中測量綜合強度，將來自給定組動物的所有測量值(!1=3/組)用于產(chǎn)生平均值。然后，在經(jīng)治療動物中的膽固醇減少以同敲除e-gal的注射鼠相比較的整體強度的百分比減少進行計算。在深部小腦核內(nèi)單側(cè)注射AAV-ASM后在整個小腦(圖6，表3)、腦橋、延髓和脊髓(圖7)中觀察陽性hASM免疫染色。表3作為AAV血清型函數(shù)的陽性hASM染色的面積。*表示陽性hASM低于檢測極限，但是膽固醇病理的校正仍然發(fā)生。結(jié)構(gòu)AAV1AAV2AAV5AAV7AAV8深部小腦核++++++++++++++++小腦小葉++++++++十+++++++腦橋+++++++++延髓+++++++++脊髓+++++++++丘腦*下丘腦*氺海馬體承*氺承紋狀體承氺承氺腦皮層*承氺在小腦內(nèi)用AAV2/1-ASM處理小鼠，并具有最廣泛(即，在相同矢形面內(nèi)的小葉之間分布)水平的hASM表達(dá)，而用AAV2/2-ASM處理的小鼠具有最有限水平的人ASM蛋白質(zhì)表達(dá)。用AAV2/5-ASM、AAV2/7-ASM和AAV2/8-ASM處理小鼠中的人ASM蛋白表達(dá)在這兩個組中間。在用血清型l&8處理的小鼠中矢形面之間的內(nèi)側(cè)-側(cè)面分布最大，而在用血清型2注射的小鼠中最小。血清型5&7啟動的內(nèi)側(cè)-側(cè)面分布模式在血清型1和2之間。用每種AAV血清型轉(zhuǎn)導(dǎo)小腦的每層(即，分子，浦肯野細(xì)胞和小祌經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)；然而，對于分子層提高的親和性對于所有血清型是明顯的。浦肯野細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)在血清型1和5治療的小鼠中是最大的。注射血清型7的小鼠具有最少數(shù)目的轉(zhuǎn)導(dǎo)浦肯野細(xì)胞。與血清型l、2、5&7相比較時，用血清型8處理的小鼠也具有少數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的浦肯野細(xì)胞，但在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞層內(nèi)具有較低的ASM表達(dá)。用ASM轉(zhuǎn)導(dǎo)的浦肯野細(xì)胞似乎具有健康的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。小腦組織勻漿中通過ELISA的AAV介導(dǎo)的hASM蛋白質(zhì)表達(dá)的定量分析支持我們的免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)。與所有其他小鼠比較時，注射血清型1和8的小鼠證明了顯著(p<.0001)高的小腦hASM蛋白質(zhì)水平(圖8)。來自注射血清型2、5&7小鼠的小腦hASM水平?jīng)]有高于WT水平(即，背景)。如所預(yù)期的，在野生型小鼠中沒有檢測到人ASM—ELISA中所用的hASM抗體是人特異性的。功能性ASM蛋白的不存在導(dǎo)致神經(jīng)鞘磷脂的溶酶體累積和隨后的繼發(fā)性代謝缺陷，如異常膽固醇運輸。Sarna等Eur..T.Neurosci.13:1873-1880和Leventhal等(2001)J.Biol.Chem.276:44976-4498。使用菲律賓菌素觀察ASMKO小鼠腦中的游離膽固醇累積，菲律賓菌素是一種從菲律賓鏈霉菌中分離的自體熒光分子。野生型小鼠腦對于菲律賓菌素沒有陽性染色。在所有AAV處理的小鼠(除了AAV2/l-卩gal)中，菲律賓菌素染色的清除區(qū)域與hASM免疫染色陽性的區(qū)域重疊(表4)，表明每種血清型載體能夠產(chǎn)生功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。表4小腦內(nèi)注射編碼人ASM的不同AAV血清型(!1=3/血清型;2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)至ASMKO小鼠的深部小腦核后，選定腦區(qū)域中與AAV-pgal處理的ASMKO小鼠相比較的菲律賓菌素(即，膽固醇)清除的百分比降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如之前通過(Passini等(2003)在"SocietyforNeuroscience"NewOrleans'LA)所證明的，在解剖學(xué)上與注射位點連接但對hASM沒有陽性染色的部位中也產(chǎn)生了菲律賓菌素清除。MetaMorph分析表明菲律賓菌素染色降低發(fā)生在整個吻尾(rostralcaudal)軸中。在小腦和腦干中，在用AAV2/1-ASM和AAV2/8-ASM處理的小鼠中菲律賓菌素得到最大降低，而在間腦和大腦皮層中，注射AAV2/8-ASM的小鼠具有最全面水平的菲律賓菌素清除(表4)。盡管如此，這些結(jié)果表明校正是ASMKO小鼠CNS的膽固醇貯積病理需要的hASM水平是最小的(即，低于檢測的hASM免疫熒光極限)。表5組織學(xué)研究表明ASMKO小鼠小腦經(jīng)歷快速退化。更具體地，浦肯野細(xì)胞在8至20周年齡之間逐漸相繼而亡(Sarna等(2001)Eur.J.Ne畫ci.13:1813-1880和Stewart等(2002)在"SocietyforNeuroscience"Orland，F(xiàn)L中)。鈣結(jié)合蛋白是廣泛受影響的浦肯野細(xì)胞標(biāo)記。AAV-ASM處理小鼠中的陽性鈣結(jié)合蛋白染色將表明AAV介導(dǎo)的hASM表達(dá)是治療性的?？傮w上我們的結(jié)果表明了小腦中AAV介導(dǎo)的hASM表達(dá)防止了ASMKO小鼠中的浦肯野細(xì)胞死亡(表5，圖9)。如所預(yù)期的，在小葉I-III中沒有發(fā)生浦肯野細(xì)胞存活；在7周齡時給小鼠注射，在8周之前，這些細(xì)胞的大部分已經(jīng)相繼而亡。在血清型l治療小鼠中，小葉IV/V中的浦肯野細(xì)胞存活最大。在小葉VI屮，在AAV處理的小鼠中沒有觀察到顯著的浦肯野細(xì)胞存活。在小葉VII中，只有用血清型5處理的小鼠顯示出顯著的浦肯野細(xì)胞存活。再在小葉VIII中，用血清型5以及血清型2處理的小鼠顯示出顯著的浦肯野細(xì)胞存活。在小葉IX和X中，在WT和KO小鼠(或AAV處理的小鼠之間)之間的浦肯野細(xì)胞計數(shù)不存在顯著差異。這是預(yù)期的，因為在14周齡時(即，處死時)，這些小葉中的浦肯野細(xì)胞在ASMKO小鼠中仍然是活的?？缭剿行∪~，浦肯野細(xì)胞存活在用血清型1、2&5處理的小鼠中最大，在用血清型7&8處理的小鼠中最小。在注射血清型1的小鼠中，小腦前葉中的浦肯野細(xì)胞存活(基于鈣結(jié)合蛋白染色)最大。小腦內(nèi)注射編碼人ASM的不同AAV血清型(!1=3/血清型;2/1、2/2、2/5、2/7和2/8)至ASMKO小鼠的深部小腦核后，WT和ASMKO小鼠中小腦小葉I-X中的浦肯野細(xì)胞計數(shù)。粗斜體顯示的數(shù)字是顯著不同于KO小鼠的(即，用AAV2/l-(3gal處理的小鼠)pSOl。2/12Z22/52/72/8KOWTI/II7.42±9.804.5±10.589.40±11.5912.33±10.581±9.165.8±11.59113±10.58III12.42±10.3211.33±11.1426.80±12.2115.33±11.149.8±12.212±9.65147.50±11.14IV/V60.57±17.2836.5±18.6727.80±20.4529.66±18.676.8±20.48±16.16220.66±1867VI61.14±11.2127.5±12.1172.20±13.2631.16±12.113.8±13.2668.5±10.48121.16±12.11VII17.42±4.137.66±4.4940.60±4.915.33±4.49.2±4.9517.37±3.887.16±4.49VIII44.14±10.7548.66±11.6282.80±12.7311,33±11.6218.40±12.7335.12±10.06103.33±11.62IX126.28±19,17102.66±20.71136.40±22.6860.16±20.7184.40±22.68108.0±17.93144±20.71X89.85±12.5476.83±13.5593.80士14.8448.16±135564.80士14.8487±11.7386.66±13.55在加速旋轉(zhuǎn)測試時，單側(cè)注射AAV2Z1-ASM和AAV2/8-ASM的小鼠證明了延遲跌倒時間顯著(p<.0009)長于注射AAV2/l-pgal的ASMKO小鼠(圖10)。注射血清型AA2/1-ASM的小鼠沒有顯著不問于野生型小鼠。注射AAV2/2-ASM和AAV2Z5-ASM的小鼠顯示出延遲跌倒時間長于注射AAV2/l-pgal的ASMKO小鼠的趨勢；而注射AAV2/7-ASM的小鼠沒有。對于搖擺旋轉(zhuǎn)測試，只有注射AA2/1-ASM的小鼠顯示了延遲跌倒時問顯著(p<.(3001)長于注射AAV2/1-Pgal的ASMKO小鼠。在這種情況中，野生型小鼠表現(xiàn)顯著好于注射AA2/1-ASM的小鼠(圖10)。對于加速和搖擺測試，接受兩側(cè)注射AAV2/1-ASM或AAV2/2-ASM的ASMKO小鼠表現(xiàn)顯著(p〈細(xì))好于ASMKOAAV2/l-(3gal處理的小鼠(圖ll)。對于兩個測試，兩側(cè)注射AAV2/1-ASM的小鼠的表現(xiàn)與野生型小鼠相當(dāng)。測定AAV產(chǎn)生的hASM在ASMKOCNS內(nèi)是否功能上活性的一種方式是測定其對膽固醇貯積病理(NPA疾病的繼發(fā)性代謝缺陷)的影響。在所有AAV處理的小鼠(除了AAV2/l-[3gal)中，膽固醇貯積病理的校正與hASM免疫染色陽性的區(qū)域重疊，表明每種血潔型載體能夠產(chǎn)生功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。如之前所證明的，在解剖學(xué)上與注射位點相連的區(qū)域中，而且在對hASM沒有陽性染色的區(qū)域中，也發(fā)生了異常膽固醇代謝的校正，表明膽固醇貯積病理校正需要的hASM水平是最小的。與我們的hASM組織化學(xué)和生化結(jié)果相一致，ffl血清型1和8處理的小鼠證明了膽固醇貯積病理的顯著降低。用血清型2、5&7處理的小鼠還顯示出膽固醇貯積病理的降低，但是沒有降至與血清型1&S處理的小鼠相同的程度。盡管膽固醇貯積病理改變是說明性的，hASM酶活性的更直接測量是通過神經(jīng)鞘磷脂水平的分析，神經(jīng)鞘磷脂是患有Niemann-Pick疾病的哺乳動物組織中累積的主要底物。測定接受兩側(cè)注射AAV血清型1和2小鼠腦組織的祌經(jīng)鞘磷脂(SPM)水平(用于測定SPM的組織均質(zhì)的方法與hASM的檢測不相容)。在血清型1和2處理的小鼠屮觀察到小腦屮SPM組織含量的顯著降低(pO.Ol)(圖12)。在注射血清型1的小鼠中的切片2、3和4(每個切片相互隔開2mm)中的SPM組織含量水平也是顯著降低的，但是在注射血清型2的小鼠中沒有。接受兩側(cè)小腦內(nèi)注射編碼hASM的AAV血清型1和2的ASMKO小鼠顯示出小腦內(nèi)祌經(jīng)鞘磷脂貯積的顯著降低。如用膽固醇貯積累積所觀察的，在AAV1兩側(cè)處理的ASMKO小鼠中的小腦外側(cè)區(qū)域中也產(chǎn)生了神經(jīng)鞘磷脂貯積病理的顯著降低?？傊?，這些結(jié)果表明在啟動酶表達(dá)、校正腦中的貯積病理、防止祌經(jīng)退化(例如，通過防止浦肯野細(xì)胞死亡)和提高運動功能結(jié)果的相對能力中，相對于血清型2、5、7禾fl8優(yōu)選AAVl。此外，可以開發(fā)DCN作為注射位點來最大化在整個CNS中的酶表達(dá)。為了評價AVV載體注射至DCN后轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分布，將G93AS0D1(S0D1G93A突變小鼠，在此稱為SODl小鼠)注射編碼綠色熒光蛋白(GFP)的重組AAV載體。一組小鼠注射編碼綠色熒光蛋白的AAV血清型1(AAV1-GFP)，而另一組注射編碼綠色熒光蛋白的AAV血清型2(AAV2-GFP)。使用上述那些相似的方法將AAV重組載體兩側(cè)注射至小鼠DC.N中。劑量大約為每個位點注射2.0-10gc/ml(2.0el0gc/ml)。在出生后約IIO天將小鼠處死，并將它們的腦和脊髓用于GFP染色。編碼綠色熒光蛋白(GFP)的AAV的DCN傳送后，在腦干(參見圖14)和脊髓區(qū)域(參見圖15)中觀察到綠色熒光蛋白分布。還在DCN以及嗅球、大腦皮層、丘腦、腦干、小腦皮層和脊髓中觀察到GFP染色。所有這些區(qū)域接受來自DCN的投射和/或?qū)⑼渡浒l(fā)送至DCN(參見圖16)。根據(jù)說明書內(nèi)引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)來最徹底地理解說明書。說明書內(nèi)的實施方案提供了本發(fā)明實施方案的說明并不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識到本發(fā)明包括許多其他實施方案。本公開中引用的所有出版物、專利和生物序列以其整體引入作為參考。對于引入作為參考的材料與本發(fā)明相抵觸或不一致的程度，本發(fā)明說明書將取代任何這樣的材料。在此任何參考文獻(xiàn)的引用不容許這樣的參考文—^是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。除非另外指出，說明-1^包括權(quán)利要求中所用的表達(dá)成分?jǐn)?shù)量、細(xì)胞培養(yǎng)物、處理條件等的所有數(shù)字理解為通過術(shù)語"約"在所有情況中是待改變的。因此，除非另外指出與此相反，數(shù)字參數(shù)是近似值并可以根據(jù)本發(fā)明探尋待獲得的所需特征而改變。除非另外指出，一系列要素前的術(shù)語"至少"理解為表示系列中的每個要素。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不超過常規(guī)的實驗將認(rèn)識到或者能夠確定在此所述的本發(fā)明特定實施方案的許多等價物。確定以下的權(quán)利要求包括這樣的等價物。權(quán)利要求1.一種方法，包括在使得所述的被注射的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中遠(yuǎn)側(cè)位點的細(xì)胞且所述的編碼的生物活性分子得到翻譯的條件下，將含有編碼生物活性分子的AAV載體的組合物給藥于哺乳動物疾病損害的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的位點。2.權(quán)利要求1的方法，其中翻譯的生物活性分子然后得到表達(dá)。3.權(quán)利要求l的方法，其中哺乳動物患有溶酶體貯積病或異常膽固醇代謝。4.權(quán)利要求3的方法，其中溶酶體貯積病是NiemannPickA疾病。5.權(quán)利要求l的方法，其中哺乳動物是人。6.權(quán)利要求l的方法，其中該遠(yuǎn)側(cè)位點在給藥位點的對側(cè)。7.權(quán)利要求l的方法，其中該給藥位點在選自脊髓、腦干、海馬體、紋狀體、延髓、腦橋、中腦、小腦、丘腦、下丘腦、大腦皮層、枕葉、顳葉、頂葉或額葉的CNS區(qū)域中。8.權(quán)利要求l的方法，其中給藥位點在海馬體中且遠(yuǎn)側(cè)位點在選自對側(cè)齒狀回、對側(cè)CA3、內(nèi).側(cè)中隔或內(nèi)嗅區(qū)皮層的腦區(qū)域中。9.權(quán)利要求l的方法，其中給藥位點在選自紋狀體或小腦的腦區(qū)域中，且遠(yuǎn)側(cè)位點在選自黑質(zhì)或延髓的腦區(qū)域中。10.權(quán)利要求9的方法，其中給藥位點在小腦的深部小腦核中。11.權(quán)利要求1的方法，其中AAV載體具有AAV血清型1衣殼。12.權(quán)利要求3或4的方法，其中AAV載體具有AAV血清型1衣殼。13.權(quán)利要求10的方法，其中AAV載體具有AAV血清型1衣殼。14.權(quán)利要求1的方法，其中AAV載體是AAV1或AAV2/1。15.權(quán)利要求3或4的方法，其中AAV載體是AAV1或AAV2/1。16.權(quán)利要求10的方法，其中AAV載體是AVV1或AAV2/1。17.權(quán)利要求l的方法，進一步包括將組合物給藥于哺乳動物CNS中的第二個位點，其中組合物包括含有編碼生物活性分子產(chǎn)物的多核苷酸的AAV載體。18.權(quán)利要求17的方法，其中第二個給藥位點是在第一個給藥位點的對側(cè)。19.權(quán)利要求2的方法，其中生物活性分子是溶酶體水解酶。20.權(quán)利要求19的方法，其中溶酶體水解酶是表1中所列的溶酶體水解酶中的任何一種。21.權(quán)利要求20的方法，其中溶酶體水解酶是酸性祌經(jīng)鞘磷脂酶。22.權(quán)利要求1的方法，其中給藥位點在深部小腦核中且遠(yuǎn)側(cè)位點是脊髓。23.權(quán)利要求l的方法，其中給藥位點和遠(yuǎn)側(cè)位點之間的距離為至少2mm。24.權(quán)利要求1的方法，其中組合物中AAV載體的濃度為至少5x]012gp/ml。25.—種方法，包括在使得所述的被注射的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)位于中樞祌經(jīng)系統(tǒng)中遠(yuǎn)側(cè)位點的細(xì)胞且所述編碼的金屬內(nèi)肽酶得到表達(dá)的條件下，將含有編碼金屬內(nèi)肽酶分子的AAV載體的組合物給藥于患有阿爾茨海默氏病哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的位點。26.權(quán)利要求25的方法，其中金屬內(nèi)肽酶選自腦啡肽酶、insulysin或thimet寡肽酶。27.權(quán)利要求1或25的方法，其中AAV載體選自AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。28.權(quán)利要求25的方法，其中給藥位點和遠(yuǎn)側(cè)位點之間的距離為至少2mm。29.權(quán)利要求25的方法，其中組合物中AAV載體的濃度為至少5xlOl2gp/ml。30.權(quán)利要求29的方法，其中AAV選自AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。31.權(quán)利要求29的方法，其中AAV是重組AAV載體。32.權(quán)利要求29的方法，其中重組AAV載體選自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7或AAV2/8血清型載體。全文摘要本公開涉及用于治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的方法和組合物。這些疾病包括影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)代謝疾病如溶酶體貯積病，例如，Niemann-PickA疾病。它們還包括如阿爾茨海默氏病的疾病。所公開的方法包括將神經(jīng)的軸突末梢接觸含有高滴定度攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的AAV的組合物，使得AAV載體以逆向方式得到軸突運輸且轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在給藥位點的遠(yuǎn)側(cè)得到表達(dá)。文檔編號A61K48/00GK101212988SQ200680023775公開日2008年7月2日申請日期2006年5月2日優(yōu)先權(quán)日2005年5月2日發(fā)明者G·R·斯圖爾特,J·道奇,M·A·帕西尼申請人:建新公司