專利名稱：經(jīng)由CD14和ToII樣受體4信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及分子免疫學(xué)和人類疾病的治療。本發(fā)明涉及基于經(jīng) 由CD14和配體進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4 (TLR4)途徑的特性篩選和鑒定 化合物的方法。本發(fā)明還提供了治療哺乳動物受治療者中各種疾病狀態(tài)例如 感染性疾病、炎癥和自身免疫疾病的方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因非人類動物 和用于研發(fā)在CD14基因中含有功能缺失突變(loss-of-fimction mutation)的轉(zhuǎn) 基因非人類動物的方法。
背景技術(shù)：
脂多糖(LPS)負(fù)責(zé)格蘭氏陰性菌的許多致病作用，但它也誘導(dǎo)保護(hù)性的 免疫應(yīng)答。O'Brien等，J /mww"o/. 124: 20-24, 1980; Rosenstreich等，0 CO^. Wev. /mm""o/. 3: 263-330， 1982。 LPS由脂質(zhì)A部分、核心多醣和各種長度(通 常多于50個單糖單位)的0-多糖組成。菌落形態(tài)("光滑"和"粗糙")指示O-多糖的狀態(tài)。具有長O-多糖鏈的微生物突變體形成光滑的菌落；缺少O-多糖鏈的那些形成粗糙的菌落；因此稱為光滑和粗糙LPS。因為根本不具有附加的糖的脂質(zhì)A是LPS的生物活性部分，因此認(rèn)為 糖鏈在內(nèi)毒性中起輔助性的作用，并且沒有宿主區(qū)分光滑和粗糙LPS化學(xué) 型的明顯i正才居。Galanos等,c/owrwa/ o/140: 221-227, 1984; Galanos等，版 /歷0c/2亂148: 1-5， 1985。另夕卜，推想所有的LPS分子由血漿LPS結(jié)合蛋白(LBP)連接并轉(zhuǎn)移至CD14 (---種在單核的吞噬細(xì)胞上大量表達(dá)的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白集中LPS信號的事件。 Tobias等， /所o/. CT^w. 263: 13479-13481, 1988; Tobias等， /所o/. C&肌264: 10867-10781, 1989; Schumann等，5We"ce 249: 1429-1431, 1990; Wright等， 5We"ce248: 1431-1433, 19卯。所有的LPS應(yīng)答也依賴于Toll樣受體4 (TLR4) 和MD-2所形成的跨膜復(fù)合物，通過該復(fù)合物，信號得以傳播。Poltorak等， 5We"ce 282: 2085-2088; Nagai等，/附mw"o/. 3: 667-672, 2002。 TLR4以4 種銜接子(adapter)蛋白的方式進(jìn)行信號傳導(dǎo)，所述銜接子蛋白似乎以功能對 (flinctional pairs) (MyD88和Mal(也稱為TIRAP),以及TRIF和TRAM)形式 起作用。Hoebe等，Atow" 424: 743-748, 2003; Yamamoto等，<SWe"ce 301: 604-643， 2003; Yamamoto等，Ato. /m淤w"o/. 4: 1144-1150， 2003; Beutler， Ato臟430: 257-263, 2004。本領(lǐng)域目前的狀態(tài)表明在患有自身免疫病或感染性疾病的哺乳動物受 治療者中，LPS受體復(fù)合物當(dāng)被激活時利用所有的這些銜接子(MyD88和 Mal(也稱為TIRAP)，以及TRIF和TRAM);并且當(dāng)靜止時，不利用它們。在本領(lǐng)域中存在改進(jìn)"^斷和治療疾病例如自身免疫病和感染性疾病的需要， 包括調(diào)節(jié)或控制哺乳動物受治療者中先天免疫系統(tǒng)的LPS受體復(fù)合物的因 子。發(fā)明內(nèi)容提供了篩選和鑒定化合物的組合物和方法，所述化合物經(jīng)由CD14和配 體調(diào)節(jié)Toll樣受體4 (TLR4)途徑的信號傳導(dǎo)。提供了通過經(jīng)由CD14和配體 調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)途徑的信號傳導(dǎo)，來治療哺乳動物受治療者中各種疾病狀態(tài)例如感染性疾病、炎癥或自身免疫病的方法。提供了用于治療哺乳動物受治療者中纟奉狀病毒感染例如狂犬病感染(rabies infection)或水泡性口 炎病毒感染(vesicular stomatitis virus infections)的方法。提供了用于篩選和鑒 定用于治療棒狀病毒感染例如狂犬病感染或水泡性口炎病毒感染的化合物 的方法。提供了轉(zhuǎn)基因非人類動物和研發(fā)轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法，其中所 述轉(zhuǎn)基因非人類動物在CD14基因中含有功能缺失突變。提供了一種用于治療懷疑患有感染的哺乳動物受治療者中棒狀病毒感 染的方法，所述方法包括以有效減輕或消除棒狀病毒感染或防止其發(fā)生或復(fù) 發(fā)的量，將經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑施用于所述受 治療者。 一方面，所述調(diào)節(jié)劑是經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的 拮抗劑(antagonist)。另一方面，所述調(diào)節(jié)劑是CD14活性或Toll樣受體4信 號傳導(dǎo)活性的抑制劑。所述抑制劑包括但不限于CD14或TLR-4的干擾 RNA、短發(fā)夾RNA、核酶或反義寡核苷酸。在另一方面，所述抑制劑為CD14 或TLR-4的單克隆抗體、多克隆抗體、肽、擬肽或小化學(xué)抑制劑。所述抑 制劑可以為例如CD14的抗體或TLR4的抗體。在一個詳細(xì)的方面中，所述 棒狀病毒是狂犬病病毒或水泡性口炎病毒。4是供了一種用于治療哺乳動物受治療者中自身免疫病的方法，所述方法 包括以有效減輕或消除自身免疫病或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā)的量，將經(jīng)由CD14 的Toll樣受體信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑施用于所述哺乳動物受治療者。 一方 面,所述調(diào)節(jié)劑是經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的拮抗劑。在另 一方面，所述調(diào)節(jié)劑是CD14活性或Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的抑制劑。 所述抑制劑包括但不限于CD14或TLR-4的干擾RNA、短發(fā)夾RNA、核酶 或反義寡核苦酸。在另一方面，所述抑制劑為CD14或TLR-4的單克隆抗體、 多克隆抗體、肽、擬肽或小化學(xué)抑制劑。所述抑制劑可以為例如CD14的抗 體或TLR4的抗體。提供了一種用于治療哺乳動物受治療者炎癥的方法，所述方法包括以有 效減輕或消除炎癥或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā)的量，將經(jīng)由CD14的Toll樣受體4 信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑施用于所述哺乳動物受治療者。 一方面，所述調(diào)節(jié)劑 是經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的拮抗劑。在另一方面，所述調(diào)節(jié)劑是CD14活性或Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的抑制劑。所述抑制劑包括 但不限于CD14或TLR-4的干擾RNA、短發(fā)夾RNA、核酶或反義寡核苷酸。 在另一方面，所述抑制劑為CD14或TLR-4的單克隆抗體、多克隆抗體、肽、 擬肽或小化學(xué)抑制劑。所述抑制劑可以為例如CD14的抗體或TLR4的抗體。提供了 一種用于鑒定化合物的方法，所述化合物經(jīng)由Toll樣受體4途徑 調(diào)節(jié)細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)，所述方法包括將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系 接觸，所述測定體系包括表達(dá)能將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受 體4的細(xì)胞，以選擇的有效激活Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的量向所述測定體系 提供CD14和配體，并檢測在所述測定體系中所述試驗化合物對Toll樣受體 4信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試—瞼化合物的功效指示調(diào)節(jié)。所述用于鑒定 經(jīng)由Toll樣受體4途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中信號傳導(dǎo)的化合物的方法還包括在所述 細(xì)胞中共表達(dá)CD14和Toll樣受體4。在另一方面，所述方法包括向所述測 定體系提供Toll樣受體4,并檢測在所述測定體系中所述試驗化合物對 CD14/To11樣受體4信號傳導(dǎo)的作用，所述測定中所述試驗化合物的功效指 示調(diào)節(jié)。在所述方法的一個實施方案中，所述配體是內(nèi)源性配體或外源性配體。 所述外源性配體包括但不限于脂多糖、脂質(zhì)A、 二?；摹⑷；摹?S-MALP-2、 R-MALP-2、細(xì)菌脂肽、Pam2CSK4、脂磷壁質(zhì)或酵母聚糖A。 在一個詳細(xì)的方面，所述外源性配體是來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌(5Wmo"d/a m/"^oto)的粗糙脂多糖、光滑脂多糖或脂質(zhì)A。所述內(nèi)源性配體包括但不限 于脂質(zhì)。在另一個實施方案中，所述檢測步驟包括測量對細(xì)胞中腫瘤壞死因 子產(chǎn)生的作用，其中在對來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌的粗糙脂多糖的響應(yīng)中TNF 的產(chǎn)生發(fā)生改變，而在對來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌的光滑脂多糖或脂質(zhì)A的 響應(yīng)中TNF的產(chǎn)生不發(fā)生改變。在另一個實施方案中，所述方法包括通過所述化合物實現(xiàn)配體與CD14 結(jié)合的減少的檢測步驟。在所述方法的另 一個實施方案中，所述檢測步驟包括通過所述化合物實 現(xiàn)CD14與Toll樣受體4結(jié)合的減少。 一方面，所述化合物是Toll樣受體4 途徑信號傳導(dǎo)的拮抗劑。另一方面，所述檢測步驟包括在細(xì)胞測定中測量肺瘤壞死因子的減少。在所述方法的另 一個實施方案中，所述檢測步驟包括通過所述化合物實現(xiàn)配體與CD14結(jié)合的增加。鑒定經(jīng)由Toll樣受體4途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中信號傳導(dǎo)的化合物的方法還包 括檢測步驟，所述檢測步驟包括通過所述化合物實現(xiàn)CD14與Toll樣受體4 結(jié)合的增加。 一方面，所述化合物是Toll樣受體4途徑信號傳導(dǎo)的激動劑。 在所述方法的另 一方面，所述檢測步驟還包括在細(xì)胞測定中測量腫瘤壞死因 子的增加。細(xì)胞測定還包括巨噬細(xì)胞。鑒定經(jīng)由Toll樣受體4途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中信號傳導(dǎo)的化合物的方法還包 括檢測步驟，該檢測步驟包括測量與配體結(jié)合的標(biāo)記的CD14或與Toll樣受 體4結(jié)合的標(biāo)記的CD14。標(biāo)記包括但不限于放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。在另 一個實施方案中，提供了鑒定經(jīng)由Toll樣受體4途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中信 號傳導(dǎo)的化合物的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)能將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo) 的TRAM-Trif，所述方法還以選一奪的有效激活TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量向 所述測定體系提供CD14和配體，以及檢測在所述測定體系中所述試驗化合 物對TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。一方面，所述方法還包括在細(xì)胞中共表達(dá)CD14、 Toll樣受體4和 TRAM-Trif。所述方法還包括向所述測定體系提供Toll樣受體4，和檢測在 所述測定體系中所述試驗化合物對CD14/ Toll樣受體4/TRAM-Trif信號傳導(dǎo) 的作用，測定中所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。在所述方法的一方面，所 述檢測步驟還包括通過所述化合物實現(xiàn)配體與Toll樣受體4結(jié)合的減少。 在所述方法的一方面，所述檢測步驟還包括通過所述化合物實現(xiàn)Toll樣受 體4與TRAM-Trif結(jié)合的減少。在所述方法的一方面，所述檢測步驟還包 括通過所述化合物實現(xiàn)配體與CD14結(jié)合的增加。在所述方法的一方面，所 述檢測步驟還包括通過所述化合物實現(xiàn)Toll樣受體4與TRAM-Trif結(jié)合的 增力口。在所述方法的一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途徑信號傳導(dǎo)的激 動劑。在所述方法的另一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途徑信號傳導(dǎo) 的拮抗劑。在另一方面中，所述配體是內(nèi)源性配體或外源性配體。所述外源性配體包括但不限于脂多糖。所述內(nèi)源性配體包括但不限于脂質(zhì)。在所述方法的另一方面中，所述細(xì)胞測定包括巨噬細(xì)胞。在所述方法的另一方面中，所述檢測步驟包括測量與配體結(jié)合的標(biāo)記的CD14或與TLR4 或TRAM-Trif結(jié)合的標(biāo)記的CD14。所述標(biāo)記包括但不限于放射性標(biāo)記或熒 光標(biāo)記。在所述方法的另一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途徑信號傳導(dǎo)的 激動劑。所述方法還包括;險測步驟，所述4全測步驟包括在細(xì)胞測定中測量 IRF-3磷酸化的增加。在另一方面，所述檢測步驟包括在細(xì)胞測定中測量p-干擾素(interferon-p)的增加。在另一方面，所述檢測步驟包括在細(xì)胞測定中 測量對病毒感染的易感性的減少。在所述方法的另一方面中，所述化合物是TRAM-Trif途徑信號傳導(dǎo)的 拮抗劑。所述方法還包括檢測步驟，所述檢測步驟包括在細(xì)胞測定中測量 IRF-3磷酸化的減少。在另一方面，所述檢測步驟包括在細(xì)胞測定中測量卩-干擾素的減少。在另一方面，所述檢測步驟包括在細(xì)胞測定中測量對病毒感 染的易感性的增加。提供了一種含有異源核酸的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中所述核酸和動物顯 示了相對于野生表型的表型，該表型包括抑制巨噬細(xì)胞的激活、對病毒或細(xì) 菌感染的易感性、TNF-a產(chǎn)生的減少的特性，或其任何兩個或多個的組合。 一方面，動物的表型的特征是對脂多糖誘導(dǎo)的IRF-3的磷酸化和二聚化的減 少、對脂多糖誘導(dǎo)的非應(yīng)答IFN-卩的產(chǎn)生或巨噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒或狂 犬病病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解的高敏感性。在另一方面，CD14基因中功能缺失 等位基因是Q284X處的早期終止密碼子(premature stop codon)。在一個詳細(xì) 的方面中，所述動物是小鼠或大鼠。細(xì)胞或細(xì)胞系可以來自含有CD14基因 的功能缺失等位基因的轉(zhuǎn)基因非人類動物。提供了 一種篩選Toll樣受體4或TRAM-Trif信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑的 體外方法，其中所述方法包括將細(xì)胞或細(xì)胞系與試驗化合物接觸，其中所述 細(xì)胞或細(xì)胞系來自轉(zhuǎn)基因非人類動物，并檢測TNF-a產(chǎn)生量、對病毒或細(xì) 菌感染的易感性或Toll樣受體4或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的 增加或減少，由此將所述試一驗化合物鑒定為Toll樣受體4或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的調(diào)節(jié)劑。提供了 一種篩選Toll樣受體4或TRAM-Trif信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑的 體內(nèi)方法，其中所述方法包括將細(xì)胞或細(xì)胞系與試驗化合物接觸，所述細(xì)胞 或細(xì)胞系來自轉(zhuǎn)基因非人類動物，并檢測TNF-a產(chǎn)生量、對病毒或細(xì)菌感 染的易感性，或Toll樣受體4或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的增 加或減少，由此將所述試驗化合物鑒定為Toll樣受體4或TRAM-Trif誘導(dǎo) 的巨噬細(xì)胞激活活性的調(diào)節(jié)劑。提供了 一種用于篩選調(diào)節(jié)自身免疫病的化合物的方法，所述方法包括將 試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系含有表達(dá)能將對配體 的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞，以選擇的能有效激活Toll樣 受體4信號傳導(dǎo)的量向所述測定體系提供CD14和配體，并檢測在所述測定 體系中所述試驗化合物對Toll樣受體4的作用，測定中所述試驗化合物的 功效指示對自身免疫病的調(diào)節(jié)。在另一實施方案中，所述方法包括表達(dá)能將 對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TRAM-Trif的細(xì)胞，以選擇的有效激活 TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量向所述測定體系提供CD14和配體，并檢測在所述 測定體系中所述試驗化合物對TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試 驗化合物的功效指示對自身免疫病的調(diào)節(jié)。在一個詳細(xì)的方面中，所述自身免疫病是胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性 硬化癥、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實驗性自身免疫性關(guān) 節(jié)炎、重癥肌無力、曱狀腺炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎的實驗形式、橋本曱狀腺炎、 原發(fā)性粘液水腫、甲狀&i毒癥、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、艾迪生 病、提前絕經(jīng)、男性不育、兒童糖尿病、古德帕斯丘綜合癥、尋常性天皰瘡、 類天皰瘡、交感性眼炎、水晶體源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)、自身 免疫性溶血性貧血、特發(fā)性白血病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、活動性'隄性肝炎 HBs-ve 、隱原性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、斯約格倫綜合癥、硬皮病、韋格 納肉芽肺病、多發(fā)性皮肌炎/皮肌炎(poly/dermatomyositis)、盤狀紅斑狼瘡 或系統(tǒng)性紅斑狼瘠。提供了一種用于篩選調(diào)節(jié)感染性疾病的化合物的方法，所述方法包括將 試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系含有表達(dá)能將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體的細(xì)胞，以選擇的有效激活Toll樣受體4 信號傳導(dǎo)的量向測定體系提供CD14和配體，并檢測在所述測定體系中所述 試驗化合物對Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試驗化合物的功 效指示對感染性疾病的調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，所述方法包括表達(dá)能將 對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TRAM-Rrif的細(xì)胞，以選擇的有效激活 TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量向所述測定體系提供CD14和配體，并4企測在所述 測定體系中所述試驗化合物對TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試 驗化合物的功效指示對感染性疾病的調(diào)節(jié)。
所述感染性疾病可以是細(xì)菌或病毒疾病。在一個詳細(xì)的方面中，所述感 染性疾病是HIV感染、AIDS、細(xì)胞肥大病毒感染或金黃色葡萄J求菌


圖la、 lb、 lc、 ld、 le、 lf、 lg、 lh、 li、 lj、 lk和11表示Heedless 突變的粗糙LPS和TLR2-6的特異性。
圖2a、 2b、 2c、 2d、 2e、 2f、 2g、 2h、 2i和2j表示Heedless防止LPS 對IFN-p的i秀導(dǎo)。
圖3a、 3b、 3c、 3d、 3e和3f表示Heedless巨噬細(xì)胞對VSV誘導(dǎo)的細(xì) 胞溶解的高敏感性。
圖4表示通過限制性內(nèi)切核酸酶切割檢測的Heedless, Cdl4中的突變。
圖5a、 5b和5c表示通過重組mCD14拯救Cdl4純合突變細(xì)胞中光滑 LPS反應(yīng)性。
圖6a和6b表示通過測序構(gòu)建圖鐠和鑒定的Heedless突變。
圖7表示總結(jié)粗糙和光滑LPS、TLR4/MD-2復(fù)合物和CD14之間相互作 用的示意圖。
圖8a和8b表示推測的機制，由此CD14可允許來自TLR4復(fù)合物的不 依賴于MyD88的信號傳導(dǎo)。詳細(xì)描述提供了鑒定化合物的組合物和方法，所述化合物經(jīng)由Toll樣受體4途徑 調(diào)節(jié)細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)。CD14蛋白在經(jīng)由脂多糖(LPS)傳感 (lipopolysaccharide sensing)的Toll樣受體信號傳導(dǎo)和激活中起作用。在本研 究中，CD14基因中的突變已提出了 LPS傳感的觀點，其是如何發(fā)生的以及 CD14-MD-2-TLR4復(fù)合物的特異性的限制。提供了 一種鑒定化合物的方法， 所述化合物經(jīng)由Toll樣受體4途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)，所述方法包括 將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系含有表達(dá)能將對配 體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞，以選擇的有效激活Toll樣 受體4信號傳導(dǎo)的量為所述測定體系提供CD14和配體，并檢測所述測定體 系中所述試驗化合物對Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試驗化 合物的功效指示調(diào)節(jié)。在鑒定所有負(fù)責(zé)脂多糖傳感的蛋白質(zhì)和了解它們的特異性和相互作用 的努力中，種系突變和篩選的方案，其中用不同的TLR激活劑(包括LPS) 體外刺激來自第三代(G3)突變C57BL/6小鼠的巨噬細(xì)胞。監(jiān)控腫瘤壞死因子 (TNF)的產(chǎn)生，作為表型分析的基本終點。提供了組合物和方法，其中 CD4基因中的突變提出了 LPS傳感的觀點，其如何產(chǎn)生，和 CD14-MD-2-TLR4復(fù)合物的特異性的限制。在第三代(G3)N-乙基N-亞硝基脲突變小鼠中檢測隱性突變"Heedless "， 顯示對微生物誘導(dǎo)物的缺陷應(yīng)答。來自Heedless純合子的巨噬細(xì)胞應(yīng)答粗糙 LPS和脂質(zhì)A而經(jīng)由依賴MyD88的途徑進(jìn)行信號傳導(dǎo)，但不應(yīng)答光滑LPS。 而且，應(yīng)答所有的LPS化學(xué)型，Heedless突變防止依賴于TRAM-TRIF的信 號傳導(dǎo)。Heedless也破壞了巨噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒(VSV)的應(yīng)答，并且 基本上抑制了對Toll樣受體2(TLR2)- TLR 6異型二聚體的特異性配體的應(yīng) 答。Heedless表型從位置上歸于Cdl4中的早期終止密碼子。Ferrero和Goyert， TW^/e/c16: 4173, 1988; NCBI GenBank P08571。我們的數(shù)據(jù)表明 TLR4-MD-2復(fù)合物區(qū)分LPS化學(xué)型，但CD14使此區(qū)分無效。因此， TLR4-MD-2復(fù)合物受體能以兩種單獨的模式起作用；其中一種能發(fā)生完全 的信號傳導(dǎo)， 一種發(fā)生受限于依賴MyD88的信號傳導(dǎo)。應(yīng)理解，本發(fā)明并未限制于具體的方法、試劑、化合物、組合物或生物 體系，當(dāng)然它們可以變化。也應(yīng)理解，本文中所用的術(shù)語僅出于描述具體實 施方案的目的，并非意在限制。如在本說明書和附加的權(quán)利要求中所用的，
除非文中內(nèi)容清晰指明，否則單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指代物(referent)。因此，例 如，提到細(xì)胞(acell)包括兩個或更多個細(xì)胞的組合，等等。
如本文所用的"約"，當(dāng)指測量值如數(shù)量、時間持續(xù)等時，意指包括指定 值的± 20%或± 10%、更優(yōu)選± 5%、甚至更優(yōu)選± 1%、甚至還更優(yōu)選± 0.1% 的變化，只要此類變化適于實施所公開的方法。
除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同的意思。盡管在試驗本發(fā)明的實踐 中，可以使用與本文所描述的那些相似或等同的任何方法或材料，但本文描 述了優(yōu)選的材料和方法。在描述本發(fā)明和主張本發(fā)明的權(quán)利中，將使用下列 術(shù)語。
"自身免疫病"指由免疫系統(tǒng)不能區(qū)分外源分子和自身分子以及對自身 抗原免疫耐受性喪失而引起的疾病，其導(dǎo)致自身分子的破壞。自身免疫病包 括但不限于胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化癥、實驗性自身免疫 性腦脊髓炎(多發(fā)性硬化癥的動物模型)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實驗性自身免疫性 關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、甲狀腺炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎的實驗形式、橋本曱狀腺 炎、原發(fā)性粘液水腫、曱狀腺毒癥、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、艾 迪生病、提前絕經(jīng)、男性不育、兒童糖尿病、古德帕斯丘綜合癥、尋常性天 皰瘡、類天皰掩、交感性眼炎、水晶體源性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧 血、特發(fā)性白血病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、活動性慢性肝炎HBs-ve、隱原 性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、斯約格倫綜合癥、硬皮病、韋格納肉芽腫病、多 發(fā)性皮肌炎/皮肌炎、盤狀紅斑狼癡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
"自身抗原(autoantigen)"指自體抗原(self-antigen),也就是說，通常發(fā)現(xiàn) 于哺乳動物內(nèi)并通常被自身識別的物質(zhì)，由于自身免疫病，被哺乳動物錯誤 地識別為外源物質(zhì)。即，自身抗原不被哺乳動物的淋巴細(xì)胞或抗體認(rèn)為是其 自身的一部分，并錯誤地遭到該哺乳動物免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的攻擊，好像此類自 身抗原是外源物質(zhì)。因此自身抗原充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的分支(arm)的作用，所述分支負(fù)責(zé)引起具體的自身免疫病。如本文所用的，"自身抗原"也指自 身抗原性物質(zhì)，當(dāng)施用于哺乳動物時其誘導(dǎo)具有自身免疫病癥狀的病癥。依 據(jù)本發(fā)明的自身抗原也包括來自自身抗原的表位或表位的組合，所述自身抗原。 — 、；、 " '、 、依據(jù)本發(fā)明的有利的自身抗原包括但不限于與T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫 病抑制有關(guān)的那些自身抗原。自身抗原指激發(fā)免疫應(yīng)答或誘導(dǎo)免疫耐受性狀態(tài)的分子，包括但不限于 單鏈或雙鏈DNA;抗體或其片段，包括相應(yīng)核酸的遺傳信息的合成肽；y 球蛋白或其片段，包括合成肽或相應(yīng)核酸的遺傳信息；移植抗原或其片段， 包括合成肽或相應(yīng)核酸的遺傳信息。依據(jù)本發(fā)明的自身抗原也包括來自所述 自身抗原的表位或表位的組合。"T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病"指自身免疫病，其中，疾病的效應(yīng)由TH1 介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激而誘導(dǎo)。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病 包括但不限于實驗性自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 重癥肌無力、曱狀腺炎、實驗性葡萄膜視網(wǎng)膜炎和adioi disease of the氨酸脫羧酶、胰島素、髓磷脂堿性蛋白、II型膠原質(zhì)、煙堿型乙酰膽堿受體、 曱狀腺球蛋白、曱狀腺過氧化物酶、視紫紅質(zhì)糖蛋白S-抗原、IRBP視網(wǎng)膜 蛋白以及恢復(fù)蛋白(recoverin)。"巨噬細(xì)胞激活的抑制"指應(yīng)答誘導(dǎo)物如脂多糖在巨噬細(xì)胞中TLR4-誘導(dǎo)的共剌激分子(CD14)表達(dá)的抑制。可通過FACS分析在巨噬細(xì)胞上 CD14的表達(dá)。"對病毒或細(xì)菌感染的易感性"指對感染性病毒如小鼠細(xì)胞肥大病毒 (MCMV)或感染性細(xì)菌如單核細(xì)胞增多性李斯特菌(丄/Wen'a mo"oc^oge"^s) 的易感性。將對MCMV感染的易感性作為由MCMV感染導(dǎo)致的小鼠死亡 時間來測量。將對單核細(xì)胞增多性李斯特菌的感染的易感性作為在感染單核 細(xì)胞增多性李斯特菌的小鼠的巨噬細(xì)胞中TNF和IL-12 p40 mRNA的產(chǎn)生來 測量。將對金黃色葡萄球菌感染的易感性作為由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的小鼠死亡時間來測量。
"TNF-a產(chǎn)生的減少"指來自哺乳動物受治療者的巨噬細(xì)胞，其應(yīng)答脂 多糖(TLR4選擇性刺激物)不能產(chǎn)生正常數(shù)量的TNF-a。
"免疫細(xì)胞應(yīng)答"指免疫系統(tǒng)細(xì)胞對外部或內(nèi)部刺激物(例如抗原、細(xì) 胞因子、化學(xué)因子和其他的細(xì)胞)的應(yīng)答，在免疫細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的生物化學(xué)變 化，該變化導(dǎo)致免疫細(xì)胞遷移、殺傷耙細(xì)胞、吞噬作用、產(chǎn)生抗體、其他可 溶的免疫應(yīng)答效應(yīng)物等。
本文可交換使用的"T淋巴細(xì)胞應(yīng)答"和"T淋巴細(xì)胞活性"指依賴T 淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答組成部分(即T淋巴細(xì)胞增殖和/或分化成輔助T淋巴細(xì) 胞、細(xì)胞毒性殺傷T淋巴細(xì)胞或抑制T淋巴細(xì)胞，由輔助T淋巴細(xì)胞向B 淋巴細(xì)胞供應(yīng)信號，引起或防止抗體的產(chǎn)生，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷特 異的靶細(xì)胞，并且釋放調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞功能的可溶的因子如細(xì)胞因子)。
"免疫應(yīng)答"指淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì) 胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補體)的協(xié)調(diào)作用，其 導(dǎo)致選擇性損害、破壞或從人體消除侵入的病原菌、感染病原的細(xì)胞或組織、 癌細(xì)胞，或在自身免疫或病理炎癥的情況下，導(dǎo)致?lián)p害、破壞或從人體消除 正常的人細(xì)胞或組織。
"炎癥"或"炎癥應(yīng)答(inflammatory response)"指當(dāng)組織受到細(xì)菌、損 傷、毒素、熱或任何其他原因傷害時發(fā)生的先天免疫應(yīng)答。受損的組織釋放 化合物，包括組胺、緩激肽和5-羥色胺。炎癥指急性應(yīng)答(即其中炎癥過程 是主動的應(yīng)答)和慢性應(yīng)答(即特征為緩慢的進(jìn)行應(yīng)答并形成新的結(jié)締組織 的反應(yīng))兩者?？赏ㄟ^有關(guān)的細(xì)胞類型區(qū)分急性和慢性炎癥。急性炎癥通常 涉及多型核嗜中性粒細(xì)胞；而慢性炎癥的特征通常是淋巴組織細(xì)胞和/或肉 芽腫性應(yīng)答。炎癥包括特異性和非特異性防御系統(tǒng)兩者的反應(yīng)。特異性防御 系統(tǒng)反應(yīng)是指對抗原(可能包括自身抗原)的特異性免疫系統(tǒng)反應(yīng)的應(yīng)答。非 特異性防御系統(tǒng)反應(yīng)是指由無免疫記憶能力的白細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答。此類 細(xì)胞包括粒細(xì)胞、巨嗟細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。炎癥特異性類型 的實例是彌漫性炎癥、灶性炎癥、格魯布性炎癥、間質(zhì)性炎癥、閉塞性炎癥、 實質(zhì)性炎癥、反應(yīng)性炎癥、特異性炎癥、中毒性炎癥和創(chuàng)傷性炎癥。"患者，，、"受治療者，，或"哺乳動物，，可交換使用并指哺乳動物如人 類患者和非人類靈長類動物，以及實驗性動物如家兔、大鼠和小鼠以及其他 的動物。動物包括所有的脊推動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如綿羊、 犬、牛、雞、兩棲類動物和爬行類動物。"治療"或"療治"包括施用本發(fā)明的組合物、化合物或制劑防止或延 遲疾病的癥狀、并發(fā)癥或生物化學(xué)指征的發(fā)作，減輕或緩解癥狀或阻止或抑 制疾病、病癥或疾患(例如感染性疾病、炎癥或自身免疫病)的進(jìn)一步發(fā)展。"治療"還涉及在治療或緩解或預(yù)防疾病、病癥或疾患(例如感染性疾病、 炎癥或自身免疫病)中任何成功的指征，包括任何客觀或主觀的參數(shù)，如減 輕、緩解、減弱癥狀或使患者能對疾病的狀況具有更好的耐受性、降低惡化 或衰弱的速率或使惡化的終點變得較不衰弱。治療或緩解癥狀可基于客觀或 主觀的參數(shù)，包括醫(yī)師檢查的結(jié)果。因此，術(shù)語"治療"包括施用本發(fā)明的 化合物或制劑防止、延遲、減輕或阻止或抑制與感染性疾病、炎癥或自身免疫病有關(guān)的癥狀的發(fā)展。術(shù)語"治療作用(therapeutic effect)"指減輕、消除 或防止受治療者的疾病、疾病的癥狀或疾病的副作用。使用本發(fā)明的方法的 "治療"或"療治"包括防止處于感染疾病、炎癥或自然免疫病的增加的風(fēng) 險中^f旦還未經(jīng)歷或表現(xiàn)癥狀的受治療者的癥狀的發(fā)作，抑制感染性疾病、炎 癥或自身免疫病的癥狀(減緩或阻止其發(fā)展)，提供感染性疾病、炎癥或自身 免疫病的癥狀或副作用的減輕(包括減輕的治療)，解除感染性疾病、炎癥或 自身免疫病的癥狀(引起衰退)。治療可以是預(yù)防性的(防止或延遲疾病的發(fā) 作，或防止顯示其臨床或亞臨床癥狀)或在顯示疾病或病癥后癥狀的治療抑 制或減輕。提供了一種用于治療懷疑患有感染的哺乳動物受治療者的感染性疾病 的方法，所述方法包括以有效減少或消除棒狀病毒感染或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā) 的量，將經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑施用于受治療者。 一方面，經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的抑制劑可用于治療感染 性病毒疾病，例如棒狀病毒感染性疾病。另外，可用抑制劑治療革蘭氏陽性 和革蘭氏陰性細(xì)菌感染以及真菌感染兩者，所述抑制劑抑制經(jīng)由TLR4(在革 蘭氏陰性疾病的情況下)和TLR2(在革蘭氏陽性或真菌疾病的情況下)的信號傳導(dǎo)。
提供了一種用于治療哺乳動物受治療者自身免疫病或炎癥的方法，所述 方法包括以有效減少或消除自身免疫病或炎癥或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā)的量，將
經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑施用于哺乳動物受治療 者。 一方面，所述調(diào)節(jié)劑是經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的拮抗 劑或抑制劑。最近的研究表明在炎癥過程中產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段刺激TLR4。 這表明用拮抗劑或抑制劑阻抑經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性將削 弱炎癥。Jiang， D.,等，Ato 11: 1173-1179， 2005; Taylorr, KR，等，J所o/ C72ew. 279: 17079-84， 2004; Termeer， C.等，/Exp 195: 99-111, 2002。
細(xì)胞中Toll樣受體的"抑制劑"、"激活劑"和"調(diào)節(jié)劑"分別用于指 抑制性、激活性或調(diào)節(jié)性分子，使用Toll樣受體結(jié)合或信號傳導(dǎo)的體外和 體內(nèi)測定鑒定，所述分子例如配體、激動劑、拮抗劑和它們的同源物和模擬 物(mimetic)。
"調(diào)節(jié)劑"包括抑制劑和激活劑。抑制劑是如與刺激物結(jié)合、部分或完 全阻斷刺激，減少、防止、延遲激活，使Toll樣受體失活、減敏或下調(diào)節(jié) Toll樣受體活性的制劑，如拮抗劑。激活劑為例如結(jié)合、刺激、增加、開放、 激活、促進(jìn)Toll樣受體，增加其激活，增敏或上調(diào)節(jié)其活性的制劑，例如 激動劑。調(diào)節(jié)劑包括這樣一種制劑，即其例如改變Toll樣受體與下列物質(zhì) 的相互作用結(jié)合激活劑或抑制劑的蛋白，受體，包括蛋白、肽、脂質(zhì)、碳 水化合物、多糖或上述的組合，如，脂蛋白、糖蛋白等。調(diào)節(jié)劑包括天然存 在的Toll樣受體配體的基因修飾形式，例如具有改變的活性，以及天然存 在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學(xué)分子等。抑制劑和激活劑的"基 于細(xì)胞的測定，，包括，例如，如本文中所描述的，將假定的調(diào)節(jié)劑化合物應(yīng) 用于表達(dá)Toll樣受體的細(xì)胞，接著測定對Toll樣受體信號傳導(dǎo)的功能作用。 基于細(xì)胞的測定包括但不限于來自哺乳動物受治療者的體內(nèi)組織或細(xì)胞樣 品或體外基于細(xì)胞的測定，包括將用潛在的激活劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的 Toll樣受體與沒有用抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑處理的對照樣品比較，以檢查 抑制的程度?？蓪φ諛悠?未用抑制劑處理)賦予100%的相對Toll樣受體 活性值。當(dāng)Toll樣受體活性值相對于對照是約80%，任選地50%或25-0%時，實現(xiàn)Toll樣受體的抑制。當(dāng)Toll樣受體活性值相對于對照是高110%, 任選地150%，任選地200-500%或1000-3000%時，實現(xiàn)Toll樣受體的激活。
例如，經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的激動劑可驅(qū)動信號傳 導(dǎo)，其將促進(jìn)適應(yīng)性的免疫應(yīng)答，即，對接種有利。激動劑也可提供宿主對 不同感染的抵抗力的短期增加。具有經(jīng)由不依賴MyD88或依賴MyD88途徑 選擇性地進(jìn)行信號傳導(dǎo)的能力能產(chǎn)生特定的作用，例如較低的毒性和不依賴 MyD88的信號傳導(dǎo)的I型干擾素的選擇性誘導(dǎo)，或依賴MyD88的信號傳導(dǎo) 的依賴NF-kB的細(xì)胞因子的選擇性誘導(dǎo)。
作為另一個實例，經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的拮抗劑可抑制 重癥感染(severe infection)的潛在地致命的炎癥作用，并可用于自身免疫病。
提供了一種用于鑒定經(jīng)由Toll樣受體4途徑的細(xì)胞中信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié) 劑的方法，其包括將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系 含有表達(dá)能將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞，以選擇 的有效激活Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的量為所述測定體系提供CD14和配體， 并檢測所述測定體系中所述試驗化合物對Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作用， 測定中所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。
在另一方面，所述方法提供了表達(dá)能將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的 TRAM-Trif的細(xì)胞，以選擇的有效激活TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量為所述測 定體系提供CD14和配體，并檢測所述測定體系中所述試驗化合物對 TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。如上 文對經(jīng)由CD14的TLR4信號傳導(dǎo)所做的描述，TRAM-Trif信號傳導(dǎo)是不依 賴MyD88的信號傳導(dǎo)。TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的激動劑選擇性地導(dǎo)致干擾素 的產(chǎn)生，并比以LPS的方式(刺激兩種途徑)激活受體具有較少的毒性。 TRAM-TRIF信號傳導(dǎo)的激動劑可用于配制佐劑(adjuvant)和抗病毒作用。 TRAM-TRIF信號傳導(dǎo)的拮抗劑可在某些程度上抑制炎癥，而部分保留IL-6、 IL-12和TNF的誘導(dǎo)，這可有助于抵抗感染。
可測定分子與Toll樣受體結(jié)合的能力，例如通過假定的配體與包被在測 定平板上的Toll樣受體免疫粘合素的能力。通過比較與非Toll樣受體的結(jié) 合可測定結(jié)合的特異性。"試驗化合物"指作為CD14或Toll樣受體4的調(diào)節(jié)劑而被試驗的任何 化合物。試驗化合物可是任何小有機分子或生物實體，諸如蛋白質(zhì)，例如抗 體或肽、糖、核苷酸，核酸(例如反義寡核苷酸、iRNA或核酶)，或脂質(zhì)。 可選地，試驗化合物可以是調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑是CD14蛋白或Toll樣受體4 蛋白的基因改變的形式。通常，試驗化合物是小有機分子、肽、脂質(zhì)或脂質(zhì) 類似物。在一實施方案中，可通過固定配體或受體測定與Toll樣受體結(jié)合的抗 體。例如，測定可包括將與His標(biāo)簽融合的Toll樣受體固定于Ni激活的NTA 樹脂珠上。將抗體加入至以既定的溫度溫育了 一段時間的適當(dāng)?shù)木彌_劑和珠 中。在洗滌出去未結(jié)合的物質(zhì)后，可用例如SDS、具有高pH的緩沖液等釋 放結(jié)合的蛋白并進(jìn)行分析。"信號傳導(dǎo)反應(yīng)"指經(jīng)由Toll樣受體例如Toll樣受體4的信號傳導(dǎo)。 將應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)可涉及例如依賴于由Toll樣受體4(TLR4)和MD-2所形 成的跨膜復(fù)合物的LPS應(yīng)答，通過該跨膜復(fù)合物，信號得以傳播。TLR4以 4種銜接子蛋白的方式進(jìn)行信號傳導(dǎo)，所述蛋白似乎以功能對形式(MyD88 和Mal(也稱為TIRAP)與TRIF和TRAM)起作用。可產(chǎn)生在基于細(xì)胞的測 定中用于產(chǎn)生信號的化合物，例如通過與酶或熒光團(tuán)結(jié)合。作為標(biāo)記的感興 趣的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或氧化酶(oxidotase)， 特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素和其衍生物、羅丹明和其衍生物、 丹磺酰、傘形酮等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括熒光素和2，3-二氫酞。秦二酮，如魯 米諾。"檢測試驗化合物對Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作用"可涉及在哺乳動物 受治療者中的治療或預(yù)防作用，如減輕、消除或防止該受治療者中的疾病、 疾病的癥狀或疾病的副作用。"檢測試驗化合物對Toll樣受體4信號傳導(dǎo) 的作用"可涉及在基于細(xì)胞的測定如診斷測定中具有作用的化合物，如通過 LPS信號傳導(dǎo)或脂質(zhì)A信號傳導(dǎo)所測量的，和通過TNF-a表達(dá)所測量的。 CD14基因中功能缺失突變?nèi)鏗eedless突變可影響I型IFN的產(chǎn)生。所述突 變防止了光滑LPS和脂質(zhì)A兩者經(jīng)由不依賴MyD88的途徑進(jìn)行信號傳導(dǎo)。 具體地說，CD14功能缺失突變，Heedless,防止了 I型IFN和IFN-P mRNA的產(chǎn)生，以及誘導(dǎo)可誘導(dǎo)的IFN基因如IFIT1和ISG15。在對脂質(zhì)A的應(yīng)答 中，在Heedless突變細(xì)胞中未能4全測到IRF-3磷酸二聚體的形成。來自CD14 功能缺失突變(Heedless)的轉(zhuǎn)基因動物的巨噬細(xì)胞對于VSV誘導(dǎo)的細(xì)胞溶 解是高敏感性的。"伴隨施用"已知的藥物和本發(fā)明的化合物意指在已知的藥物和化合物 均具有治療或診斷作用的時間上施用所述藥物和化合物。此類伴隨施用可包 括在施用本發(fā)明的化合物的同時(即相同時間)、之前或隨后施用藥物。對于 具體的藥物和本發(fā)明的化合物，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在決定施用的時間、順 序和劑量時沒有困難。通常，短語"良好耐受，，指在健康的狀態(tài)中缺少不利的變化，該變化作 為治療結(jié)果而出現(xiàn)并影響治療決定。作為CD14或Toll樣受體4調(diào)節(jié)劑的抗體合，并能調(diào)節(jié)、激活或抑制對外源性配體例如粗糙LPS或脂質(zhì)A的先天免 疫應(yīng)答，或應(yīng)答細(xì)胞中水泡性口炎病毒(VSV)感染或狂犬病病毒感染，并 不應(yīng)答外源性配體光滑LPS。節(jié)細(xì)胞中信號傳導(dǎo)的化合物。參閱，例如Akashi等，7Tze Jowma/ o/ /畫,/， 164: 3471-3475， 2000; Leturcq等，J C7/w /騰W. 98: 1533-1538, 1996。在一些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段選擇性地與抗原結(jié)合(例如， 竟?fàn)幮缘亟Y(jié)合，或與相同表位例如構(gòu)象或線性表位結(jié)合)，雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn) 生的抗體與該抗原選捧性地結(jié)合。因此，對于由抗體結(jié)合的已知的表位，表位可以是空間上緊密接近或功能上相關(guān)，例如，在線性序列或構(gòu)象空間中重 疊或鄰近的表位。可用肽線性程序(peptide threading program)計算性地鑒定 潛在的表位，并用本領(lǐng)域已知的方法例如通過測定抗體與Toll樣受體4或 CD14的突變體或片段例如Toll樣受體4或CD14結(jié)構(gòu)域的突變體或片段的 結(jié)合來證明。測定本文所述的抗體序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的；例如，可通過 使用已知的技術(shù)分離和鑒定編碼來自雜交瘤細(xì)胞系的抗體的cDNA,來測定 抗體的序列。測定cDNA序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。本文所述的抗體通常具有至少一個或兩個重鏈可變區(qū)(VH)和至少一個或兩個輕鏈可變區(qū)(V。。可將Vh和Vt進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補性 決定區(qū)(CDR)，其與較高度保守的框架區(qū)(FR)散開(interspersed)。這些區(qū)域已 《尋以明確；也闡述(參閱，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242， 1991和Chothia等， / Mo/. 196: 901-907, 1987)。 含有 一個或多個框架區(qū)的抗體或抗體片段也可以用于本發(fā)明。在由脂多糖誘 導(dǎo)的細(xì)胞中，此類片段具有特異性地與Toll樣受體4結(jié)合并激活或抑制 TNF-a活性的能力，或激活或抑制巨噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒或狂犬病病毒 的應(yīng)答。如本文所述的抗體可包括重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)(恒定區(qū)通常介導(dǎo)抗體和 宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成 分(Clq))，并因此可分別形成免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈。例如，抗 體可以是四聚體(兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈，其可通過例 如二疏鍵連接)?？贵w可含有僅僅重鏈恒定區(qū)的一部分(例如，稱為CH1、 CH2 和CH3的三種重鏈結(jié)構(gòu)域中的一種)或輕鏈恒定區(qū)的一部分(例如，稱為CL 區(qū)的一部分)?？乖Y(jié)合片段也包括于本發(fā)明中。此類片段可以是(i)F化片段(即由 VL、 VH、 Cl和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段)；(ii) F(ab，)2片段(即含有通過 二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個Fab片段的雙價片段)；(iii)由VH和ChI結(jié)枸域 組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)dAb 片段(Ward等，Nature 341: 544-546, 1989),其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和/或(vi) 分離的互補性決定區(qū)(CDR)?？衫帽绢I(lǐng)域已知的方法合成抗體片段(包括上文所述的抗原結(jié)合片 段)，例如在自動化的肽合成儀中，或通過在例如大腸桿菌(五.co/z')中表達(dá)全 長的基因或基因片段。可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生FU，)2片段，并可通過還原F(ab，)2片段的二硫鍵產(chǎn)生Fab片段?？蛇x地，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，5We"ce 246: 1275-81， 1989)，以使得較快速地鑒定具有所期望的特異性的單克隆Fab片段。產(chǎn)生其他抗體和抗體片段的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域Vt和VH由單獨的基因編碼，但可用重組的方法或能使它們變成單蛋白鏈的合成的連接體將它們連接，在該蛋白鏈中，Vl和Vh區(qū)配 對形成單價分子(也稱為單鏈Fv(scFv),參閱例如Bird等，5We"ce 242: 423-426， 1988; Huston等，TVoc. 7Va//. ^cad 5W. C/5L4 85: 5879-5883， 1988; Colcher等，j朋.7Vr爿cad 880: 263-80， 1999以及Reiter， C7/". Omcwi as. 2: 245-52, 1996)。產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)也描述于美國專利號4， 946,778和4,704,692中。 此類單鏈抗體包括于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段，，中?？墒褂帽绢I(lǐng)域普通技 術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體，并以與篩選完整抗體相同的方法，篩 選供使用的所述片段。而且，單鏈抗體可形成復(fù)合物或多聚體，并因此成為 具有相同靶蛋白的不同表位的特異性的多價抗體。本文所述的抗體和其部分可是單克隆抗體、從單克隆抗體中產(chǎn)生或通過 本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生?？贵w可重組產(chǎn)生(例如，通過噬菌體展示或通過組 合方法產(chǎn)生，如下列文獻(xiàn)所描述的美國專利號5,223,409; WO 92/18619;WO 91/17271; WO92/20791; WO 92/15679; WO93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02890; Fuchs等，5/。/. rec/z"o/ogy 9: 1370-1372, 1991; Hay 等,//w附Afw爿w&6o辦場Zjr/fifowos 3: 81-85, 1992; Huse等，5"cz'ewce 246: 1275-1281， 1989; Griffiths等，五雄OJ 12: 725-734, 1993; Hawkins等， / Mo/, 所o/. 226: 889-896, 1992; Clackson等，7Va/w" 352: 624-628, 1991; Gram等， A/a".5W. 89: 3576-3580， 1992; Garrad等，所o/ rec/^/ogv 9: 1373-1377， 1991; Hoogenboom等，7Vwc/. Jc/A A仏19: 4133-4137, 1991;和 Barbas等，iVoc. 7V^/.爿ca^. 5W. f/&4 88: 7987-7982， 1991)。作為一個實施例，可通過用TLR4多肽或CD14多肽或其片段(例如衍生 自例如TLR4或CD14的抗原性肽片段(即具有其一部分的序列))免疫動物、11樣受體4抗體或CD14抗體。在一些實施方案中，本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段 可與純化的TLR4或CD14結(jié)合。在一些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片 段可與組織切片、完整細(xì)胞(活的、裂解的或分級分離的)或膜部分中的TLR4 或CD14結(jié)合。可在例如體外體系例如外周血單核細(xì)胞(PBMC)中試驗抗體 在由脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中激活或抑制TNF-a活性的能力，或激活或抑制巨 噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒或狂犬病病毒應(yīng)答的能力。在使用衍生自TLR4或CD14的抗原性肽的情況下，通常包括TLR4或 CD14結(jié)構(gòu)域的至少8(例如10、 15、 20、 30、 50、 100或更多)個連續(xù)的氨基 酸殘基。在一些實施方案中，抗原性肽含有所有的TLR4或CD14的結(jié)構(gòu)域。 產(chǎn)生的抗體可以與天然形式的蛋白(因此具有線性或構(gòu)象表位的抗體也在本 發(fā)明范圍內(nèi))、變性或其他非天然形式或上述兩種形式的蛋白質(zhì)中的一種結(jié) 合?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法例如通過基于計算機的抗原性預(yù)測算法鑒定可 能是抗原性的肽。有時可通過鑒定與天然形式而非變性形式蛋白的結(jié)合的抗 體，鑒定構(gòu)象表位?？捎每乖瓕⑺拗鲃游?例如家兔、小鼠、豚鼠或大鼠)免疫，該抗原可任 選地與載體(即，穩(wěn)定或另外改進(jìn)有關(guān)分子免疫原性的物質(zhì))連接，并任選地 與佐劑一起施用(參閱例如Ausubel等，如上)。示例性的載體是鑰孔蟲戚血 藍(lán)蛋白(KLH)和示例性的佐劑，其通常根據(jù)宿主動物的種類選擇，包括弗氏 佐劑(完全的或不完全的)，佐劑礦物凝膠(例如氬氧化鋁)，表面活性物質(zhì)如 溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyol)、聚陰離子(polyanion)、肽、油乳劑、 二硝基酚、BCG(bacille Calmette-Guerin，卡介苗)，和短小棒狀桿菌 (Cw7"e6ac^7'wm parvw附)。KLH有時也稱為佐劑。在宿主中產(chǎn)生的抗體可 通過例如親和層析法純化，在所述方法中，多肽抗原或其片段固定于樹脂上?？乖噪陌谋砦煌ǔＮ挥诘鞍椎谋砻?例如親水區(qū))或高抗原性區(qū)內(nèi) (可最初根據(jù)含有的許多帶電荷的殘基選擇此類區(qū))。人類蛋白序列的Emini 表面可能性分析(Emini surface probability analysis)可用于指示具有定位于蛋 白表面的特別高的可能性的區(qū)?？贵w可以完全是人類抗體(例如基因改造在小鼠或其他哺乳動物中制備 的抗體以產(chǎn)生來自人類免疫球蛋白序列的抗體，如來自人類免疫球蛋白基因(K、入、ci(IgA!和IgA2)、 Y(IgG!、 IgG2、 IgG3、 IgG4)、 5、 e和p恒定 區(qū)基因或多種免疫球蛋白可變區(qū)基因)?？蛇x地，抗體可以是非人類抗體(例 如嚙齒動物(如小鼠或大鼠)、山羊、家兔或非人類的靈長類動物(如賓吳)抗體。在攜帶人類而非小鼠免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中可產(chǎn)生人類單克 隆抗體。來自這些小鼠(在用目的抗原免疫后)的脾細(xì)胞可用于產(chǎn)生雜交瘤， 其分泌對來自人類蛋白的表位具有特異性親和性的人mAb (參閱，例如WO 91/00906， WO 91/10741; WO 92/03918; WO 92/03917; Lonberg等，Atowre 368: 856-859, 1994; Green等，7Vam" 7: 13-21, 1994; Morrison等，iV^/.Jcad 5W.固81: 6851-6855, 1994; Bruggeman等，/國畫/. 7: 33-40, 1993; Tuaillon等，iVoc. Ato/.5W. 卯3720-3724， 1993;和Bruggeman等， / /畫畫/. 21: 1323-1326, 1991)?？筎LR4抗體或抗CD14抗體可以是這樣一種抗體，即在該抗體中，其可變區(qū)或其可變區(qū)的一部分(如CDR)在非人類生物體(例如大鼠或小鼠)中產(chǎn)生。因此，本發(fā)明包括嵌合的、CDR接枝的和人源化的抗體，以及在非人 類生物體中產(chǎn)生并接著進(jìn)行^修飾(例如在可變的框架區(qū)或恒定區(qū)中)以減少在人類中的免疫原性的抗體?？衫帽绢I(lǐng)域已知的重組技術(shù)產(chǎn)生嵌合抗體 (即其不同部分來自不同的動物物種的抗體，例如鼠mAb的可變區(qū)和人類免 疫球蛋白的恒定區(qū))。例如，可用限制酶消化編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體 分子的Fc恒定區(qū)的基因以除去編碼鼠Fc的區(qū)域，并且因此可替代編碼人類 Fc恒定區(qū)的基因的等同部分(參閱例如，歐洲專利申請?zhí)?25,023; 184, 187; 171,496和173,494;也可參閱WO 86/01533;美國專利號4，816，576; Better 等，5We"ce 240: 1041-1043,1988; Liu等戶rac. Ato/.爿c^/. f/5^ 84: 3439-3443, 1987; Liu等，J！ /畫畫/. 139: 3521-3526, 1987; Sun等，胸/. 」cad 84: 214-218， 1987; Nishimura等，i 饑47: 999-1005，1987; Wood等，A^wre 314: 446-449， 1985; Shaw等， / A^/. 80: 1553-1559, 1988; Morrison等，Ato/.爿cm/. 5W. C75^ 81: 6851， 1984; Neuberger等，312: 604， 1984和Takeda等，A^w" 314: 452， 1984)。在人源化的或CDR接枝的抗體中，用供體CDR (donor CDR)將至少一 種或兩種但通常所有的三種接納體CDR (Recipient CDR)(免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈的)替代(參閱例如美國專利號5,225,539; Jones等，iW /wre 321: 552-525, 1986; Verhoeyan等，5We, 239: 1534， 1988;和Beidler等，J /ww柳o/. 141: 4053-4060, 1988)。供體CDR僅需要取代人源化抗體與Toll 樣受體4或CD14結(jié)合所需的CDR的數(shù)量。供體可以是嚙齒動物抗體，且 接納體可是人類框架或人類共有框架。通常，將提供CDR的免疫球蛋白稱 為"供體"(并且經(jīng)常是嚙齒動物的免疫球蛋白)，將提供框架的免疫球蛋白 稱為"接納體"。接納體框架可以是天然存在(例如人類)的框架，共有框 架或序列，或此外至少85% (例如90%， 95%, 99%)相同的序列。"共 有序列"是從相關(guān)的序列家族中最頻繁存在的氨基酸(或核苷酸)中形成的序 歹'J(參閱例^口 Winnaker， From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft， Weinheim， Germany, 1987)。共有序列中的每一位置由該家族中在該位置最頻繁存在的 氨基酸殘基占據(jù)(對于兩個氨基酸以相同的頻率存在的位置，包括兩者中的 任何一個)。"共有框架，，指共有免疫球蛋白序列中的框架區(qū)?？芍苽銽oll 樣受體4或CD14的人源化抗體，在該抗體中，特異的氨基酸殘基已得以替 代、刪除或加入(例如在框架區(qū)，以改進(jìn)抗原結(jié)合)。例如，人源化的抗體具 有與供體的框架殘基或接納體的氨基酸相同而不是與接納體框架殘基相同 的框架殘基。為了產(chǎn)生此類抗體，通過相應(yīng)的供體氨基酸替代所選的小量的 人源化的免疫球蛋白鏈的接納體框架殘基。替代可在鄰近CDR處或在與 CDR相互作用的區(qū)域中發(fā)生(美國專利號5, 585,089,特別是參閱12-16欄)。 人源化抗體的其他技術(shù)描述于EP 519596 Al中。如上文所述或使用本領(lǐng)域已知的其他方法可將Toll樣受體4抗體或 CD14抗體人源化。例如，通過替代Fv可變區(qū)的序列可產(chǎn)生人源化的抗體， 該可變區(qū)不直接與與來自人類Fv可變區(qū)的等同序列結(jié)合的抗原有關(guān)。產(chǎn)生 人源化抗體的普通方法由Morrison, 5We臟229: 1202-1207， 1985、 Oi等， B涯c/n.m— 4: 214, 1986和Queen等(美國專利號5,585,089; 5,693,761和 5，693,762)提供。這些方法所需的核酸可從產(chǎn)生針對Toll樣受體4或CD14 的抗體或其片段的雜交瘤獲得，所述抗體或其段具有期望的特性，例如在由脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中激活或抑制TNF-a活性或激活或抑制巨噬細(xì)胞對水泡 性口炎病毒或狂犬病病毒應(yīng)答的能力。接著可將編碼人源化抗體或其片^a的 重組DNA克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。在某些實施方案中，抗體具有效應(yīng)子功能并能固定補體，然而在其他的實施方案中，其既不能募集(recruit)效應(yīng)子細(xì)胞也不能固定補體。抗體也可 具有少許結(jié)合Fc受體的能力或不具有該能力。例如，其可以是不能與Fc受 體結(jié)合的同種型、亞型、片段或其他的突變體(例如，抗體可具有突變(例如 刪除)Fc受體結(jié)合區(qū))。缺少Fc區(qū)域的抗體通常不能固定補體，并且因此較 少可能引起它們結(jié)合的細(xì)胞的死亡。在其他的實施方案中，可將抗體偶聯(lián)至異質(zhì)物質(zhì)如治療劑(如抗生素)或 可檢測標(biāo)記?？蓹z測標(biāo)記可包括酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶)、輔基(例如鏈霉親和素/生物素和親和素/生物 素)或熒光、發(fā)光、生物發(fā)光或放射性物質(zhì)(例如傘形酮、熒光素、異硫氰酸 熒光素、羅丹明、二氯三吖嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白(其是熒光)， 魯米諾(其是發(fā)光的)，熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白(其是生物發(fā)光的)， 和"mTc、 188Re、 mIn、 125I、 131I、 35S或311(其是放射性的))。本文所述的抗體(例如單克隆抗體)可用于分離Toll樣受體4或CD14蛋 白或其片段，如與在由脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中激活或抑制TNF-a活性有關(guān)的 或與激活或抑制巨噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒或狂犬病病毒應(yīng)答(通過例如親 和層析或免疫沉淀)有關(guān)的片段，或可用于在例如細(xì)胞溶解產(chǎn)物或上清液(通 過Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定等)或組織切 片中檢測它們(P23)。這些方法允許測定具體蛋白表達(dá)的豐度(abundance)和模 式。該信息可用于做出診斷或用于評價臨床試驗或治療的效力。本發(fā)明也包括編碼上述抗體的核酸、載體和細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞， 如CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)，該細(xì)胞(例如用編碼與Toll樣受體4或CD14特 異性結(jié)合的抗體的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)含有所述核酸。相似地，本發(fā)明包括制 備本發(fā)明抗體的細(xì)胞系(如雜交瘤)和制備那些細(xì)胞系的方法。CD14或Toll樣受體4多肽和其調(diào)節(jié)劑的免疫檢測除了用核酸雜交技術(shù)檢測CD14基因或Toll樣受體4基因和基因表達(dá) 外，也可用免疫測定4全測CD14或Toll樣受體4蛋白。此類測定可用于篩選 CD14或Toll樣受體4的調(diào)節(jié)劑，以及用于治療和i貪斷應(yīng)用。免疫測定可用 于定性或定量分析CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白?？蛇m用技術(shù)的一般的綜述可見于Harlow和Lane, J"fz7)oWes: J Z^0rato7 Maw認(rèn)/， 1988。 A.產(chǎn)生抗體產(chǎn)生與CD14或Toll樣受體4蛋白特異性反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體的 方法對本領(lǐng)域才支術(shù)人員來it是已知的(參閱例如Coligan, Cw〃eW iVotoco/s /" 7m細(xì)wo/ogv， 1991; Harlow和Lane,同上；Goding, Mowoc/owa/爿w"6o&esv iV/""》e^朋d尸ra"/cas，第二版，1986;和Klohler等，M^wre 256: 495-497， 1975)。此類技術(shù)包括通過從噬菌體或類似載體的重組抗體文庫中選擇抗體 來制備抗體，以及通過免疫家兔或小鼠來制備多克隆和單克隆抗體(參閱例 如，Huse等，246: 1275-1281， 1989; Ward等，iVafwre 341: 544-546, 1989)。許多含有CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的部分的免疫原可用于產(chǎn)生特 異性地與CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白反應(yīng)的抗體。例如，如本文所述， 可分離重組的CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白或其抗原性片段。如上所述可 在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，并如上文一般所描述的進(jìn)行純化。重組 蛋白是優(yōu)選的用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體的免疫原。可選地，可將衍生自 本文公開的序列和與載體蛋白綴合的合成肽用作免疫原。也可以純或者不純 的形式使用天然存在的蛋白。接著將產(chǎn)物注射至能產(chǎn)生抗體的動物。可產(chǎn)生 單克隆或多克隆抗體，用于隨后的免疫測定中測量蛋白的用途。產(chǎn)生多克隆抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。使用標(biāo)準(zhǔn)的佐 劑如弗氏佐劑和標(biāo)準(zhǔn)的免疫方法，用蛋白質(zhì)免疫近交品系小鼠(例如BALB/C 小鼠)或家兔。通過采集試-驗血液和測定對p亞單位反應(yīng)性的效價監(jiān)控動物 對免疫原制劑的免疫應(yīng)答。當(dāng)獲得抗體對免疫原的適當(dāng)高的效價時，從動物 中收集血液并制備抗血清。如果需要，可進(jìn)一步分級分離抗血清以富集與蛋 白反應(yīng)的抗體(參閱Harlow和Lane ，如上)。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種技術(shù)獲得單克隆抗體。筒單地說，通 常通過與骨髓瘤細(xì)胞融合，使來自用期望的抗原免疫的動物的脾細(xì)胞無限增 殖(參閱Kohler等，5^Jiw附w"o/. 6:511-519，1976)。無限增殖化的可選方 法包括用EB病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化或本領(lǐng) 域熟知的其他方法。篩選來自單獨無限增殖化的細(xì)胞的克隆用于產(chǎn)生期望的抗原特異性和親和性的抗體，并且可通過各種技術(shù)包括注射入脊推動物宿主的腹膜腔來增加通過此類細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量?？蛇x地，根據(jù)Huse 等S"'^zce 246: 1275-1281, 1989概述的一般方法，可通過篩選來自人類B細(xì) 胞的DNA文庫，分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA。收集單克隆抗體和多克隆血清并在免疫測定例如用固定于固體載體的 免疫原的固相免疫測定中針對免疫原蛋白進(jìn)行滴定。通常，選擇具有104或 更高效價的多克隆抗血清，使用竟?fàn)幮越Y(jié)合免疫測定，測試它們針對非CD14 或Toll樣受體4蛋白的交叉反應(yīng)性。特異性的多克隆抗血清和單克隆抗體 通常以至少約O.lmM、更通常至少約1 ^M、優(yōu)選至少約O.lpM或更好并最 優(yōu)選0.01^iM或更好的Kd結(jié)合。也可通過從物種如非人類哺乳動物中減去其 他的交叉反應(yīng)直向同源物，制備僅對具體的CD14直向同源物或Toll樣受體 4直向同源物如人類CD14或人類Toll樣受體4具有特異性的抗體。如此， 可獲得僅與CD14或Toll樣受體4結(jié)合的抗體。一旦獲得針對CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的特異性抗體，便可通過 多種免疫測定法檢測蛋白質(zhì)。另外，抗體可在治療上用作CD14或Toll樣受 體4的調(diào)節(jié)劑。對于免疫和免疫測定方法的綜述，參閱Basic and Clinical Immunology (Stites和Terr編輯，第7版，1991)。而且，可在任何幾個構(gòu)型 中進(jìn)行本發(fā)明的免疫測定，所述構(gòu)型在酶免疫測定(Enzyme Immunoassay)中 (Maggio編輯，1980)以及Harlow和Lane (同上)中得以廣泛綜述。B.免疫結(jié)合測定使用許多公認(rèn)的免疫結(jié)合測定方法(參閱例如美國專利4，366，241; 4,376,110; 4,517,288和4,837,168)中的任何一種，可檢測和/或定量CD14蛋 白或Toll樣受體4蛋白。對一般的免疫測定的綜述，也可參閱AfeAoA /" Ce〃y4wf/6o(iz'as1 Ce〃 5z'o/ogy，第37巻(Asai編專專,1993); J5os7'c (^"/^///^/1朋0/0^);(8也68和丁6訂編輯，第7版，1991)。免疫結(jié)合測定(或免 疫測定)通常使用與選擇的蛋白或抗原(在此情況下，CD14蛋白或Toll樣受 體4蛋白或其抗原亞序列)特異性結(jié)合的抗體。.可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的許多方式中的任何一種和如上所述產(chǎn)生抗體(例如抗CD14或抗Toll樣受 體4)。免疫測定也經(jīng)常使用標(biāo)記劑(labeling agent)與由抗體和抗原產(chǎn)生的復(fù)合 物特異性結(jié)合和將其標(biāo)記。標(biāo)記劑自身可以是含有抗體/抗原復(fù)合物的部分 (moiety)中的一種。因此標(biāo)記劑可以是標(biāo)記的CD14或標(biāo)記的Toll樣受體4 或標(biāo)記的抗CD14或抗Toll樣受體4抗體?？蛇x地，標(biāo)記劑可以是第三個部 分，如第二抗體，其與抗體/CD14或抗體/Toll樣受體4復(fù)合物(第二抗體通 常對第一抗體來源的物種的抗體具有特異性)特異性地結(jié)合。能特異性結(jié)合 免疫球蛋白恒定區(qū)的其他蛋白如蛋白A或蛋白G可用作標(biāo)記劑。這些蛋白 顯示了與來自多種物種的免疫球蛋白恒定區(qū)的強的非免疫原性的反應(yīng)性(參 閱例如Kronval等，J /mmw"o/. 111: 1401-1406, 1973; Akerstrom等，《/ /www"o/. 135: 2589-2542， 1985)。標(biāo)記劑可用可檢測部分如生物素修H:牟，另 一分子如鏈霉親和素可特異性地與生物素結(jié)合。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說， 多種可檢測部分是熟知的。在整個測定中，在每一試劑組合后要求溫育和/或洗滌步驟。溫育步驟 可從約5秒至幾個小時，任選地從約5分鐘至約24個小時變化。然而，溫 育的時間依賴于測定形式、抗原、溶液體積、濃度等。盡管可在超過溫度范 圍如10°C-40°C時進(jìn)行測定，但通常在環(huán)境溫度下進(jìn)行測定。非竟?fàn)幮詼y定形式檢測樣品中CD14或Toll樣受體4的免疫測定可以 是竟?fàn)幮缘幕蚍蔷範(fàn)幮缘?。非竟?fàn)幮悦庖邷y定是直接測量抗原的量的測定。 在一優(yōu)選的"夾層(sandwich)"測定中，例如，可將抗CD14或Toll樣受體 4抗體直接結(jié)合于固定它們的固體基質(zhì)(substrate)。這些固定的抗體隨后捕獲 存在于試驗樣品中的CD14或Toll樣受體4。然后，因此而固定的CD14蛋 白或Toll樣受體4蛋白由標(biāo)記劑結(jié)合，如帶有標(biāo)記的第二 CD14抗體或Toll 樣受體4抗體。可選地，第二抗體可缺少標(biāo)記，但通過標(biāo)記的第三抗體依次 結(jié)合它，該第三抗體對第二抗體來源的物種的抗體具有特異性。通常用可檢 測部分(moiey)如生物素修飾第二或第三抗體，另一個分子如鏈霉親和素與該 可^r測部分特異性結(jié)合以提供可^r測的部分。竟?fàn)幮詼y定形式在竟?fàn)幮詼y定中，通過測量已知的加入的(外源 的)CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的量間接測定存在于樣品中CD14蛋白或 Toll樣受體4蛋白的量，樣品中未知的CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白從抗CD14抗體或抗Toll樣受體4抗體中置換(竟?fàn)幍?competed away))該已知的 加入的(夕卜源的)CD4蛋白或Toll樣受體4蛋白。在一竟?fàn)幮詼y定中，將已知 量的CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白加入至樣品中，隨后將樣品與特異性地 結(jié)合于CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的抗體接觸。結(jié)合于抗體的外源CD14 蛋白或Toll樣受體4蛋白的量與存在于樣品中的CD14蛋白或Toll樣受體4 蛋白的濃度成反比。在一特別優(yōu)選的實施方案中，將抗體固定于固體基質(zhì)上。 可通過測量存在于CD14蛋白/抗體復(fù)合物或Toll樣受體4蛋白/抗體復(fù)合物 中的CD14或Toll樣受體4的量，或可選地通過測量剩余的未復(fù)合的蛋白的 量，來測定結(jié)合于抗體的CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的量?？赏ㄟ^提供 標(biāo)記的CD14分子或Toll樣受體4分子，檢測CD14蛋白或Toll樣受體4 蛋白的量。半抗原抑制測定是另一種優(yōu)選的竟?fàn)幮詼y定。在這種測定中，將已知的 CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白固定于固體基質(zhì)上。將已知量的抗CD14抗 體或抗Toll樣受體4抗體加至樣品中，隨后將樣品與固定的CD14或Toll 樣受體4接觸。結(jié)合于已知的固定的CD14或Toll樣受體4的抗CD14抗體 或抗Toll樣受體4抗體的量與存在于樣品中的CD14蛋白或Toll樣受體4 蛋白的量成反比?？赏ㄟ^檢測抗體的固定部分(fraction)或抗體保留于溶液的 部分(fraction),再次檢測固定的抗體的量。檢測可以是直接的，其中將抗體 標(biāo)記，或是間接的，通過隨后加入標(biāo)記的部分(moiety)的方式，如上文所述， 該標(biāo)記的部分與抗體特異性地結(jié)合。交叉反應(yīng)性測定竟?fàn)幮越Y(jié)合形式的免疫測定也可用于交叉反應(yīng)性測 定。例如，可將CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白固定至固體載體。將為抗血 清與固定抗原的結(jié)合而竟?fàn)幍牡鞍?如CD14或Toll樣受體4和同源物)加入 至測定中。將加入的蛋白的為抗血清與固定的蛋白結(jié)合而竟?fàn)幍哪芰εc CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白與其自身竟?fàn)幍哪芰M(jìn)行比較。用標(biāo)準(zhǔn)的計 算，計算上述蛋白的交叉反應(yīng)性百分比。選擇并匯集與每一個上文列出的加 入的蛋白具有少于10%交叉反應(yīng)性的那些抗血清。通過免疫吸附，用加入的 經(jīng)思考過的蛋白例如關(guān)系較遠(yuǎn)的同系物，將交叉反應(yīng)抗體從匯集的抗血清中 任選地除去。然后，免疫吸附的和匯集的抗血清可用于如上所述的竟?fàn)幮越Y(jié)合免疫測定中以將第二蛋白與免疫原蛋白比較，該第二蛋白被認(rèn)為可能是CD14蛋白 或Toll樣受體4蛋白的等位基因或多形型突變體。為了進(jìn)行這種比較，以 寬泛的濃度范圍各自測定兩種蛋白，并且測定抑制50%的抗血清與固定的蛋 白的結(jié)合需要的每一種蛋白的量。如果抑制50%結(jié)合所需的第二蛋白的量少 于抑制50%結(jié)合所需的CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的量的10倍，那么 認(rèn)為第二蛋白與針對CD14或Toll樣受體4免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體特異性 地結(jié)合。其他的測定形式Western印跡(免疫印跡)分析用于測定和定量樣品中 CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白的存在。這種技術(shù)通常包括通過基于分子量 的凝膠電泳分離樣品蛋白，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至適宜的固體載體(如硝化纖 維濾紙、尼龍濾紙或衍生的尼龍濾紙(derivatized nylon filter)),用與CD14蛋 白或Toll樣受體4蛋白特異性地結(jié)合的抗體溫育樣品?？笴D14抗體或抗 Toll樣受體4抗體在固體載體上與CD14或Toll樣受體4特異性地結(jié)合。用 與抗CD14抗體或抗Toll樣受體4抗體特異性地結(jié)合的標(biāo)記的抗體(如標(biāo)記 的綿羊抗小鼠抗體)，可將抗體直4妄標(biāo)記或可選地隨后標(biāo)記。其他的測定形式包括脂質(zhì)體免疫測定(liposome immunoassay, LIA),其佳_ 用被設(shè)計為結(jié)合特異性分子(如抗體)的脂質(zhì)體，并釋放包裹的試劑或標(biāo)記。 隨后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(參閱Monroe等，Jww. Wev. 5: 34-41, 1986)檢測釋放的化學(xué)物。減少非特異性結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道將免疫測定中的非特異性結(jié) 合降至最低是經(jīng)常期望的。特別地，在測定包括固定于固體基質(zhì)上的抗原或 抗體的情況下，期望將與基質(zhì)非特異性結(jié)合的量降至最低。減少此類非特異 性結(jié)合的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。通常，這種技術(shù)包括用蛋白 質(zhì)性質(zhì)的組合物包被基質(zhì)。具體而言，廣泛使用蛋白組合物如牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、脫脂奶粉和明膠，奶粉是最優(yōu)選的。標(biāo)記在測定中所用的具體的標(biāo)記或可檢測基團(tuán)并非本發(fā)明關(guān)鍵的方 面，只要其不顯著地干擾測定中所用的抗體的特異性結(jié)合?？蓹z測基團(tuán)可以 是具有可檢測的物理或化學(xué)特性的任何物質(zhì)。此類可檢測標(biāo)記在免疫測定領(lǐng)域已得以很好的開發(fā)，并且通常，可將可用于這些方法的大多數(shù)任何標(biāo)記應(yīng) 用于本發(fā)明。因此，標(biāo)記是可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電、 光或化學(xué)方式4全測的任何組合物。在本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括磁珠(如DYNABEADS )、熒光染料(如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明等)、 放射性標(biāo)記(如311、 125I、 35S、 "C或"P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸 酶和通常用于ELISA中的其他酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和顯色標(biāo)記(colorimetric label),如膠體金或有色玻璃或塑料珠(plastic bead)(如聚苯乙烯、聚丙烯、 膠乳等)。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，可將標(biāo)記直接或間接偶聯(lián)至測定的期望的成 分。如上文所指出的，以依賴于所需的敏感性、與化合物綴合的便利性、所 需的穩(wěn)定性、可利用的儀器和處理規(guī)定選擇標(biāo)記，可使用廣泛類型的標(biāo)記。非方丈射性標(biāo)記經(jīng)常以非直接的方式連接。通常，將配體分子(如生物素) 共價結(jié)合于分子。隨后配體與另一個分子(鏈霉親和素)結(jié)合，該分子或先天 性地可檢測或共價結(jié)合于信號體系如可檢測的酶、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化 合物?？梢砸耘c抗體或第二抗體的任何適宜的組合使用配體和它們的耙標(biāo)， 所述抗體識別CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白，所述第二抗體識別抗CD14 抗體或抗Toll樣受體4抗體。也可將分子直接與產(chǎn)生信號的化合物綴合，如通過與酶或熒光團(tuán)綴合。 作為標(biāo)記的感興趣的酶主要是水解酶，具體而言，磷酸酶、酯酶和糖苦酶， 或氧化酶，具體而言，過氧化物酶。熒光化合物包括焚光素和其衍生物、羅 丹明和其衍生物、丹磺酰、傘形酮等。化學(xué)發(fā)光化合物包括熒光素和2,3-二氫酞嗪二酮，如魯米諾。對于可用的各種標(biāo)記或產(chǎn)生信號的體系的評論， 參閱美國專利號4,391,904。檢測標(biāo)記的方式對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。因此，例如，對于標(biāo) 記是放射性標(biāo)記的情況，檢測的方式包括在放射自顯影中的閃爍計數(shù)器和照 相膠片。對于標(biāo)記是熒光標(biāo)記的情況，其可通過激發(fā)具有適當(dāng)波長的光的熒 光染料并檢測所得的熒光來檢測。通過使用電子檢波器如電荷耦合器件 (charge coupled device, CCD)或光電倍增管等來可視地檢測熒光。類似地， 可通過提供適當(dāng)?shù)拿傅孜锊z測所得的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測酶標(biāo)記。最后，可通過觀察與標(biāo)記有關(guān)的顏色來檢測簡單的顯色標(biāo)記。因此，在各種浸漬片(dipstick)測定中，交聯(lián)金(conjugated gold)經(jīng)常顯示粉紅色，而各種交聯(lián)珠 (conjugated bead)顯示珠的顏色。一些測定形式不要求使用標(biāo)記的成分。例如，可使用凝集測定 (agglutination assay)檢測耙標(biāo)抗體的存在。在此情況下，含有把標(biāo)抗體的樣 品凝集抗原包被的顆粒。在這種形式中，不需要標(biāo)記任何成分，并且通過簡 單的可視>全查，；險測耙標(biāo)抗體的存在。CD14或Toll樣受體4調(diào)節(jié)劑的高通量測定作為CD14或Toll樣受體4調(diào)節(jié)劑試驗的化合物可以是任何小有機分子 或生物實體，諸如蛋白質(zhì)(例如抗體或肽)，糖，核酸(例如反義寡核苦酸、 iRNA或核酶)，或脂質(zhì)。可選地，調(diào)節(jié)劑可以是CD14蛋白或Toll樣受體 4蛋白的基因改變的形式。通常，試驗化合物是小有機分子、肽、脂質(zhì)和脂 質(zhì)類似物?；旧先魏位瘜W(xué)化合物都可用作本發(fā)明測定中的潛在調(diào)節(jié)劑或配體，但 經(jīng)常使用溶解于水或有機溶液(特別是基于DMSO)中的大多數(shù)化合物。將測大的化學(xué)物文庫，其通常是平行運行的(例如在自動測定(robotic assay)中， 在微量滴定板上以微滴形式)。應(yīng)理解有許多化學(xué)化合物的供應(yīng)商，包括 Sigma (St. Louis, MO)、 Aldrich (St. Louis, MO)、 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 、 Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerlangd)等。在一個優(yōu)選的實施方案中，高通量篩選方法包括提供含有大量潛在治療 化合物(潛在的調(diào)節(jié)劑或配體化合物)的組合的小有機分子或肽文庫。然后， 使用本文所述的一種或多種測定來篩選這些"組合的化學(xué)物文庫"或"配體 文庫"，以鑒定那些表現(xiàn)所需特征性活性的文庫成員(特定的化學(xué)物種類或 亞類)。由此所鑒定的化合物可用作傳統(tǒng)的"珠化合物"，或者它們可用作 潛在或?qū)嶋H的治療劑。組合的化學(xué)物文庫是利用組合許多化學(xué)"模塊組分(building block)"如 試劑，通過化學(xué)合成或生物合成產(chǎn)生的不同的化學(xué)化合物的集合(collection)。 例如，對于既定的化合物長度(即多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)，通過以每一種可能的方式組合一套化學(xué)模塊組分(氨基酸)，形成線性組合化學(xué)物文庫如 多肽文庫。通過此類混合化學(xué)模塊組分的組合，可以合成數(shù)以百萬的化學(xué)化 合物。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言制備和篩選組合化學(xué)物文庫是熟知的。此類組合化學(xué)物文庫包括^_不限于肽文庫(參閱例如美國專利號5,010,175, Furka, / 37: 487-493, 1991和Houghton等，A^wre 354: 84-88， 1991)。 也可以使用產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的其他化學(xué)劑。此類化學(xué)劑包括但不限于肽 (例如PCT公布號WO 91/19735)，編碼的肽(例如PCT公布號WO 93/20242)、 隨機生物寡聚物(例如PCT公布號WO 92/00091)、苯二氮卓類 (benzodiazepine)(例如美國專利號5,288,514), diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯二 氮卓類和二肽(Hobbs等，Ato. Jcad 5W. 90: 6909-6913， 1993)、插烯 多肽(Hagihara等，《/114: 6568， 1992)、具有葡萄糖骨架的非 肽的擬肽類(Hirschmann等，J! Jmw. C/zew. 5bc. 114: 9217-9218， 1992)、小化 合物文庫的類似的有機合成體(Chen等，J. Jmw. CTze附.5bc. 116: 2661, 1994)、寡氨基曱酸酯類(Cho等，5Wewce 261: 1303, 1993)，和/或肽基膦酸酯 (Campbell等，J. Org. Chem. 59: 658, 1994)、核酸文庫(參閱Ausubel, Berger 和Sambrook，都如上)，肽核酸文庫(參閱例如，美國專利5,539,083)、抗體文 庫(參閱例如Vaughn等，7Vm^e所0tec/2w /0gy 14: 309-314， 1996和 PCT/US/96/10287)、碳水化合物文庫(參閱例如Liang等，5We"ce 274: 1520-1522,1996和美國專利,593,853)、小有機分子文庫(參閱例如苯二氮卓 類，BaumC和EN，Jan18,第33頁，1993;類異戊二烯，美國專利5,569,588; p塞唑烷酮(thiazolidinone )和間p塞。秦酮(metathiazanone)，美國專利5,549,947; 吡咯烷，美國專利5,525,735和5,519,134;嗎啉代化合物(morpholino compound),美國專利5,506,337;苯二氮卓類，5,288,514等)。制備組合文庫的裝置可以商購獲得(參閱例如357 MPS, 3卯MPS， Advanced Chem Tech, Louisville KY， Symphony, Rainin， Wobum, MA, 433A Appllied Biosystems， Foster City, CA， 9050 Plus, Millipore， Bedford, MA)。另 外，許多組合文庫自身可商購獲得(參閱例如ComGenex， Princeton, N丄, Asinex， Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar， Ltd, Moscow, RU,3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD，等)。候選化合物(candidate compound)可用作鑒定用于治療病癥的藥物的策 略的一部分，所述病癥與經(jīng)由包括Toll樣受體4/CD14相互作用或Toll樣受 體4/CD14/TRAM/Trif相互作用的途徑的TNF-a誘導(dǎo)有關(guān)。認(rèn)為與TLR4、 CD14或TRAM/Trif結(jié)合的試驗化合物是候選化合物。鑒定與TLR4、 CD14或TRAM/Trif結(jié)合或調(diào)節(jié)TLR4、 CD14或 TRAM/Trif蛋白或多肽或其生物學(xué)活性部分的活性的候選或試驗化合物的 篩選測定也包括于本發(fā)明。用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法的許多方法中的任 何一種都能獲得試驗化合物，組合文庫法包括但不限于生物文庫、空間尋址 平行固相或液相文庫、需要去褶合的合成文庫法、"一珠一化合物"文庫法 和使用親和層析選擇的合成文庫法。對于例如肽文庫，可以使用生物文庫法， 然而其他四種方法適用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145， 1997)。合成分子文庫的方法的實例可見于本領(lǐng) 域內(nèi)，例如在下列文獻(xiàn)內(nèi):DeWitt等，尸rac.扁.JcW. 90: 6卯9,1993; Erb等，TVoc. A^/.爿c^/. 5W. t/.S.vl 91: 11422， 1994; Zuckermann等， / MW. C72e肌37: 2678， 1994; Cho等，5We"ce 261: 1303, 1993; Carrell等， C/2， /"A ￡<i33: 2059， 1994; Carell等，C/z艮肌五"g/. 33: 2061, 1994和Gallop等，MW. 37: 1233, 1994。在一些實施方案中，試-驗化合物是TLR4、 CD14或TRAM/Trif的顯性負(fù)相突變體(dominant negative variant》化合物文庫可以存在于溶液中(例如Houghten，萬/o/Tec/zm々"as 13: 412-421, 1992)或珠(Lam, Atow^ 354: 82-84， 1991)、芯片(Fodor, A^wre 364: 555-556, 1993)、細(xì)菌(美國專利號5,223,409)、孢子(美國專利號5,571,698， 5,403,484和5，223，409)、質(zhì)粒(Cull等，尸rac TVa".L/5L4 89: 1865-1869, 1992)上或噬菌體上(Scott等，6Wewce 249: 386-390, 1990; Devlin, 5We打ce 249: 404-406， 1990; Cwirla等，iV^/.爿c"d 87: 6378-6382， 1990和Felici,J. Mo/.艦222: 301-310,1991)。通過例如在存在試驗化合物的情況下監(jiān)控形成Toll樣受體4/CD14復(fù)合物或Toll樣受體4/CD14/TRAM/Trif復(fù)合物的能力，可測定試驗化合物調(diào)節(jié) TLR4、 CD14或TRAM/Trif或其生物學(xué)活性部分的活性的能力。通過監(jiān)控 Toll樣受體4蛋白與CD14結(jié)合的能力，也可測定試驗化合物調(diào)節(jié)Toll樣受 體4或其生物學(xué)活性部分的能力。此類測定可以有TRAM/Trif的存在。結(jié) 合測定可以是基于細(xì)胞的或無細(xì)胞的。通過本文描述或本領(lǐng)域已知的用于測定直接結(jié)合的方法中的一種，可測 定Toll樣受體4蛋白與CD14和/或TRAM/Trif結(jié)合或相互作用的能力。在 一實施方案中，通過監(jiān)控TNF-a的誘導(dǎo)，可測定Toll樣受體4蛋白與CD14 和/或TRAM/Trif結(jié)合或相互作用的能力。檢測TNF-a包括檢測重組TNF-a 的表達(dá)，該重組TNF-a也編碼可檢測的標(biāo)記如FLAG序列或熒光素酶。這 種測定是除了直接結(jié)合測定以外的測定。通常，此類測定用于測定試驗化合 物影響Toll樣受體4蛋白與CD14和/或TRAM/Trif結(jié)合的能力。通常，將試驗化合物與CD14結(jié)合、干擾通過Toll樣受體4但不干擾通 過TRAM/Trif的信號傳導(dǎo)或另外影響TNF-a表達(dá)的誘導(dǎo)的能力與對照比較， 在該對照中，在缺乏試驗化合物的情況下，測定TNF-a表達(dá)的結(jié)合或誘導(dǎo)。 在一些情況下，使用預(yù)先確定的參考值。相對于對照，可測定此類參考值， 在這種情況下，不同于對照的樣品將顯示化合物與目的分子(如Toll樣受體 4)結(jié)合或調(diào)節(jié)表達(dá)(如在脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞中激活或抑制TNF-a的活性，或 激活或抑制巨噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒狂犬病病毒的應(yīng)答)。參考值也可反 映用某標(biāo)準(zhǔn)(如抗體對Toll樣受體4的親和性，或通過脂多糖調(diào)節(jié)TNF-a表 達(dá))觀察的結(jié)合的量或TNF-a表達(dá)的誘導(dǎo)。在此情況下，與對照相似(例如相 同或小于)的試驗化合物將顯示化合物是候選化合物(例如與Toll樣受體4結(jié) 合至與對照抗體相同或比其更大的程度)。本發(fā)明還涉及通過上述篩選測定鑒定的新的制劑和其如本文所述的治 療用途。在一實施方案中，本發(fā)明提供了使用CD14或Toll樣受體4蛋白或天然 存在或重組的表達(dá)CD14或Toll樣受體4蛋白的細(xì)胞或組織的可溶性測定。 在另一實施方案中，本發(fā)明提供了以高通量形式的基于固相的體外測定，其 中CD14或Toll樣受體4蛋白或其配體經(jīng)由共價或非共價相互作用附著于固相基質(zhì)。任一本文所述的測定可適于高通量篩選。在本發(fā)明的可溶或固體狀態(tài)的高通量篩選測定中，在一天內(nèi)篩選最多幾千個不同的調(diào)節(jié)劑或配體是可能的。這種方法可用于體外的CD14或Toll 樣受體4蛋白或含有CD14或Toll樣受體4蛋白的基于細(xì)胞或基于膜的測定。 特別是，微量滴定板的每個孔可用于進(jìn)行單獨的針對選擇的潛在的調(diào)節(jié)劑的 測定，或者，如果要觀察濃度或溫育時間的作用，每5-10個孔可試驗單個 的調(diào)節(jié)劑。因此，單個標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板可測定約100種(如96種)調(diào)節(jié) 劑。如果4吏用1536孔板，那么單個板可容易地測定約100至約1500種不同 的化合物。 一天測定許多個板是可能的，使用本發(fā)明的集成體系(integrated systems),測定篩選最多約6,000、 20,000、 50,000或多于100,000種不同的 化合物是可能的。對于固體狀態(tài)的反應(yīng)，目的蛋白或其片段例如胞外結(jié)構(gòu)域，或含有目的 蛋白或其作為融合蛋白的 一部分的片段的細(xì)胞或膜，可直接或間接地經(jīng)由共 價鍵或非共價鍵例如經(jīng)由標(biāo)簽結(jié)合于固體狀態(tài)成分。標(biāo)簽可以是多種成分中 的任何成分。通常，將結(jié)合標(biāo)簽的分子(標(biāo)簽結(jié)合劑(tag binder))固定于固體 載體，并且通過標(biāo)簽和結(jié)合劑的相互作用，將加了標(biāo)簽的目的分子附著于固 體載體?？苫谖墨I(xiàn)中充分描述的已知的分子相互作用使用許多標(biāo)簽和標(biāo)簽結(jié) 合劑。例如，對于標(biāo)簽具有天然結(jié)合劑如生物素、蛋白A或蛋白G的情況， 其可與適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽結(jié)合劑(親和素、鏈霉親和素、中性親和素(neutravidin)、 免疫球蛋白的Fc區(qū)等)結(jié)合使用。具有天然結(jié)合劑如生物素的分子的抗體也 可廣泛獲得并且是適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽結(jié)合劑(參閱SIGMA Immunochemicals 1998, catalogue SIGMA, St Louis MO)。類似地，可以與適當(dāng)?shù)目贵w組合使用任何半抗原性或抗原性化合物以形 成標(biāo)簽/標(biāo)簽結(jié)合劑對。數(shù)以千計的特定抗體可以商購獲得并且許多其他的 抗體在文獻(xiàn)中有描述。例如，在一個普通的配置(configuration)中，標(biāo)簽是 第 一抗體而標(biāo)簽結(jié)合劑是識別該第一抗體的第二抗體。除抗體-抗原相互作 用外，受體-配體相互作用作為標(biāo)簽和標(biāo)簽結(jié)合劑也是適當(dāng)?shù)?。例如，?xì)胞 膜受體(如細(xì)胞受體-配體相互作用如Toll樣受體、運鐵蛋白、c-盒、病毒受體配體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整合蛋白家族、選擇蛋白家族等；參閱例如Pigott和 Power, The Adhesion Molecule Facts Book I , 1993。類似地，毒素和毒液、病 毒表位、激素(如鴉片劑、類固醇等))、胞內(nèi)受體(如其調(diào)節(jié)各種小配體包括 類固醇、曱狀腺激素、類視黃醇和維生素D;肽)的激動劑和拮抗劑，藥物， 凝集素，糖，核酸(線性和環(huán)式多聚體構(gòu)型兩者)，寡糖，蛋白質(zhì)，磷脂和抗 體都可與各種細(xì)胞受體相互作用。合成的多聚體如聚氨基曱酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙 烯亞胺、聚苯A《醚、聚硅氧烷、聚酰亞胺和聚乙酸酯也可形成適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽或 標(biāo)簽結(jié)合劑。在本文描述的測定體系中，許多其他的標(biāo)簽/標(biāo)簽結(jié)合劑對也 是可用的，如同對通過對本發(fā)明公開內(nèi)容的回顧，對技術(shù)人員是顯而易見的 一樣。普通的連接體如肽、聚酯等也可充當(dāng)標(biāo)簽，并包括多肽序列如約5-200 個氨基酸之間的多Gly序列。此類柔順的連接體對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已 知的。例如，聚乙二醇連接體可/人Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama獲得。這些連接體任選地具有酰胺鍵、硫氬鍵或異功能鍵。使用目前可用的多種方法的任何方法，將標(biāo)簽結(jié)合劑固定于固體基質(zhì)。 固體基質(zhì)通常通過將所有的或部分基質(zhì)暴露于化學(xué)試劑下衍生或功能化，該 化學(xué)試劑將化學(xué)基團(tuán)固定于可與標(biāo)簽結(jié)合劑的一部分反應(yīng)的表面。例如，適 于附著于較長的鏈部分的基團(tuán)包括胺基、羥基、巰基和羧基。氨烷基硅烷和 羥烷基硅烷可用于使多種表面如玻璃表面功能化。構(gòu)建這些固相生物聚合物 的測定詳細(xì)描述于文獻(xiàn)中。參閱例如Merrifield， /爿m. C/zem. 5bc 85: 2149-2154， 1963 (描述了例如肽的固相合成)；Geysen等， / /wmw". Me仇102: 259-274， 1987 (描述了固相成分在針(pin)上的合成)；Frank和Doring, 7^ra/zWra" 44: 6031-6040， 1988 (描述了各種肽序列在纖維素圓盤上的合 成)；Fodor等，5Wewce 251: 767-777， 1991; Sheldon等，C7z'"/ca/ C7^w/W^ 39: 718-719, 1993和Kozal等,7Va/WMM^fe/we2: 753-759， 1996 (都描述了固定于 固體基質(zhì)的生物聚合物的測定)。將標(biāo)簽結(jié)合劑固定于基質(zhì)的非化學(xué)方法包 括其他的普通方法，如熱、通過UV輻射交聯(lián)等。作為CD14和Toll樣受體4調(diào)節(jié)劑的雙特異性化合物一方面，提供了一種鑒定候選或雙特異性化合物的方法，所述化合物減 少了非人類動物血清和/或循環(huán)中因子的濃度。用本發(fā)明的方法選擇或優(yōu)化 的化合物可用于治療受治療者如人類受治療者，其將從施用此類化合物中受 益?？稍诒景l(fā)明方法的實施方案中試驗的候選化合物是雙特異性化合物。如 本文中所用的，"雙特異性化合物，，包括具有兩種不同結(jié)合特異性的化合物。 示例性的雙特異性化合物包括例如雙特異性抗體、雜聚物和基于抗原的雜聚 物?？稍诒景l(fā)明的實施方案中試驗的雙特異性分子優(yōu)選包括對CD14，優(yōu)選 人類CD14具特異性的結(jié)合部分，其交聯(lián)于對靶標(biāo)制劑(例如截然不同的抗 體或抗原)具特異性的第二結(jié)合部分。對Toll樣受體4具特異性的結(jié)合部分 的實例包括但不限于Toll樣受體4配體，例如CD14,或在優(yōu)選的實施方案 中，Toll樣受體4的抗體。在另 一個實施方案中，基于新的Toll樣受體4結(jié)合分子與Toll樣受體4 結(jié)合的能力，可鑒定它們。例如在無細(xì)胞的結(jié)合測定中，可試驗化合物或小 分子文庫。任何數(shù)量的試驗化合物如擬肽類、小分子或其他的藥物可用于試 驗，并且，可使用本領(lǐng)域已知的組合物文庫法的許多方法中的任何一種獲得， 包括生物文庫、空間尋址平行固相或液相文庫、需要去褶合的合成文庫法、 一珠一化合物文庫法和使用親和層析選擇合成的文庫法。生物文庫法限于肽 文庫，而其他的四種方法適用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam, 爿油'ca"cerZ)n^Das. 12: 145, 1997)。在許多試驗調(diào)節(jié)劑和天然提取物文庫的藥物篩選方案中，為了使在一既 定時期內(nèi)測量的調(diào)節(jié)劑的數(shù)量最大化，高通量篩選是值得做的。在無細(xì)胞體 系中進(jìn)行的測定，例如用純化的或半純化的蛋白得到的，經(jīng)常優(yōu)選作為"初 級"篩選，在該初級篩選中，產(chǎn)生它們以允許快速的研發(fā)和相對容易地檢測 由試驗的調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)的分子靶標(biāo)中的改變。而且，試驗調(diào)節(jié)劑的細(xì)胞毒性和 /或生物利用率的作用通常在體外體系中被忽略，非主要集中于藥物對分子 靶標(biāo)的作用的測定，在與上游或下游元件的結(jié)合親和性的改變中是顯而易見的。在另一個實施方案中，本領(lǐng)域已知的噬菌體展示技術(shù)可用于鑒定新的TLR4、 CD14或TRAM/Trif結(jié)合分子。在一實施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選與TLR4、 CD14或TRAM/Trif 或其生物學(xué)活性部分結(jié)合的候選化合物或試驗化合物的測定。鑒定與TLR4、 CD14或TRAM/Trif結(jié)合的分子的基于細(xì)胞的測定可用 于鑒定用于本發(fā)明的雙特異性化合物中的其他制劑。例如，表達(dá)TLR4、 CD14 或TRAM/Trif的細(xì)胞可用于篩選測定。例如，可鑒定在與TLR4、 CD14或 TRAM/Trif的結(jié)合中產(chǎn)生具有統(tǒng)計上顯著變化的化合物。在一實施方案中，測定是無細(xì)胞測定，在該測定中基于Toll樣受體4 結(jié)合分子與TLR4、 CD14或TRAM/Trif體外結(jié)合的能力鑒定Toll樣受體4 結(jié)合分子。可提供TLR4、 CD14或TRAM/Trif結(jié)合分子，并用本領(lǐng)域公認(rèn) 的測定直接結(jié)合的方法試驗蛋白與TLR4、 CD14或TRAM/Trif結(jié)合的能力。 可使用例如實時生物分子相互作用分析(BIA)的技術(shù)實現(xiàn)所述蛋白與靶標(biāo)分 子結(jié)合能力的測定。Sjolander等，^加/. Oze附.63: 2338-2345， 1991和Szabo 等,Cwr. 0/ /". &rw".說o/. 5: 699-705， 1995。如在本文中所用的，"BIA，，是 在未標(biāo)記任何相互作用物(如BIAcore)的情況下實時研究雙特異性相互作用 的技術(shù)。表面等離振子共振(surface plasmon resonace， SPR)的光學(xué)現(xiàn)象中的變 化可用作生物分子間的實時相互作用的指示。本發(fā)明的無細(xì)胞測定服從于蛋白的可溶和/或膜結(jié)合形式兩者的用途。 在使用蛋白的膜結(jié)合形式的無細(xì)胞測定的情況下，可期望使用增溶劑以便將 蛋白的膜結(jié)合形式維持于溶液中。此類增溶劑的實例包括非離子去垢劑如 n-辛基葡萄糖苷、n-十二烷基葡萄糖苷、n-十二烷基麥芽苷、辛?；?N-曱基 葡萄糖胺、癸酰基-N-曱基葡萄糖胺、Triton X-100、 Triton X-114、 Tesit 、 異十三烷基聚(乙二醇醚)n、 3-[(3-膽酰胺丙基)二曱銨基]-l-丙烷磺酸酯 (CHAPS)、 3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-2-羥基-l-丙烷磺酸酯(CHAPSO)或 N-十二烷基-N,N-二甲基-3 -銨基-1 -丙烷 磺酸酯。這些測定可用于鑒定調(diào)節(jié)(如抑制或增加)本發(fā)明的蛋白與靶標(biāo)分子的相互 作用的化合物。測定所述蛋白與靶標(biāo)分子結(jié)合或相互作用的能力可以通過例如直接結(jié) 合實現(xiàn)。在直接結(jié)合測定中，所述蛋白可與放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)，以 便可通過檢測復(fù)合物中標(biāo)記的蛋白來測定所述蛋白與靶標(biāo)分子的結(jié)合。例如可用125I、 35s、 "c或&直接或間接標(biāo)記所述蛋白，并且通過直接計算放射發(fā)射或通過閃爍計數(shù)(scintillationcounting)檢測放射性同位素?？蛇x地，可用 例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶來酶促標(biāo)記分子，并通過測定 適當(dāng)?shù)牡孜锵虍a(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來檢測酶標(biāo)記。通常，期望固定本發(fā)明的蛋白或其結(jié)合蛋白，以利于從一種或兩種蛋白 的未復(fù)合形式中分離復(fù)合物，以及適應(yīng)測定的自動操作。在存在或缺乏候選 制劑的情況下與上游或下游結(jié)合元件的結(jié)合可在適于含有反應(yīng)物的任何容 器中實現(xiàn)。其實例包括微量滴定板、試管和微量離心管。在一實施方案中， 可提供增加結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，該結(jié)構(gòu)域使該蛋白結(jié)合于基質(zhì)(mtrix)。例如， 可將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/CD14 (GST/CD14)融合蛋白吸附于谷胱甘肽瓊脂珠 (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，隨后將其 與細(xì)胞溶解產(chǎn)物(例如"S標(biāo)記的細(xì)胞溶解產(chǎn)物)和試驗調(diào)節(jié)劑結(jié)合，并在 利于復(fù)合物形成的條件下溫育混合物，例如鹽和pH的生理學(xué)條件，但可使 用稍纟效較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件。溫育后，洗滌珠以除去任何未結(jié)合的標(biāo)記，并直接固 定基質(zhì)并測定放射性標(biāo)記(如置于閃爍體中的珠)或在隨后將復(fù)合物解離后， 在上清液中固定基質(zhì)并測定放射性標(biāo)記?？蛇x地，將復(fù)合物從基質(zhì)中解離， 通過SDS-PAGE分離，并且使用標(biāo)準(zhǔn)的電泳技術(shù)，從凝月交中定量發(fā)現(xiàn)于珠 部分中CD14結(jié)合蛋白的量。在基質(zhì)上固定蛋白的其他技術(shù)也可以用于在受治療者測定中的用途。例 如， <吏用本領(lǐng)域熟知的l支術(shù)(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals, Prockford, 111)，可從生物素-NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)中制備生物素化的分 子，并在包被鏈霉親和素的96孔板(Pierce Chemical)的孔中固定。在未標(biāo)記任何相互作用物的情況下，測定化合物調(diào)節(jié)TLR4、 CD14和 TRAM/Trif間相互作用的能力也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在未標(biāo)記所述蛋白或靶標(biāo)分子的情況下，可用微生理計(microphysiometer)檢測本發(fā)明的蛋白 與其耙標(biāo)分子的相互作用。McConnell等，5We"ce 257: 1906-1912。如本文中 所用的，"微生理計"(如細(xì)胞傳感器(cytosensor))是使用光尋址電位傳感器 (LAPS)測量細(xì)胞酸化其環(huán)境的速率的分析裝置。酸化作用速率中的變化可用 作化合物和受體間相互作用的指標(biāo)。可在本發(fā)明中試驗的基于抗原的雜聚物優(yōu)選包括對TLR4、 CD14或 TRAM/Trif，優(yōu)選人類的TLR4、 CD14或TRAM/Trif具特異性的結(jié)合部分， 該結(jié)合部分交聯(lián)于自身抗體識別的抗原。自身抗體識別的抗原的實例包括但 不限于下列中的任何一種因子VllI (與通過替代重組因子Vlfl治療血友病有關(guān) 的抗體)、肌肉乙酰膽堿受體(抗體與重癥肌無力疾病有關(guān))、心磷脂(與狼瘡 疾病有關(guān))、血小板相關(guān)蛋白(與特發(fā)性血小板減少性紫癜疾病有關(guān))、與斯約 格倫綜合癥有關(guān)的多種抗原、與組織移植自身免疫反應(yīng)有關(guān)的抗原、發(fā)現(xiàn)于 心肌上的抗原(與自身免疫性心肌炎疾病有關(guān))、與免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎疾病 有關(guān)的抗原、dsDNA和ssDNA抗原(與狼癡性腎炎有關(guān))、橋粒芯蛋白和橋關(guān)的任何^"他抗原。 <'、'、3、、，、在本發(fā)明試驗的示例性的雜聚物和基于抗原的雜聚物以及制備它們的 方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，示例性的雜聚物論述于下列文獻(xiàn)中WO 03007971 Al;美國20020103343A1;美國專利號5,879,679;美國專利號 5,487,890;美國專利號5，470，570; WO 9522977A1; WO/02075275A3; WO/024608A2或A3; WO/01808831A1; WO/0145669A1; WO9205801A1; Lindorfer等，7mm朋o/. Md/zo(is 248: 125， 2001; Hahn等，/附臓wo/. 166: 1057， 2001; Nardin等，J /畫,M"/zo<is 211: 21， 1998; Kuhn等，/畫畫/. 160: 5088, 1998; Taylor等，C朋cer 7w附wwo/. /w腦wc^/zer 45: 152， 1997; Taylor 等，/mwwm /. 159: 4035， 1997;和Taylor等，Jm附朋o/148: 2462， 1992。另 外，可以制備這些雜聚物的變體形式。例如，在一實施方案中，可使用以不 同的連接化學(xué)劑制備的雙特異性分子的形式?？捎糜诮宦?lián)雙特異性分子成分 的示例性試劑包括聚乙二醇、SATA、 SMCC以及本領(lǐng)域已知的其他化合物， 并且可/人例如Pierce Biotechnology獲得。可試驗的雙特異性分子的示例性幵'夕式描述于2002年9月16日提交的美國專利序列號60/411,731中，其內(nèi)容通 過引用并入本申請。在另 一個實施方案中，可制備雙特異性分子的不同的多聚體形式(例如 二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或更高多聚體形式)。在另一個實施方案 中，可試驗雙特異性分子的純化形式，例如如同2002年5月13日提交的美 國專利序列號60,380,211中所描述的，其內(nèi)容通過引用并入本申請。在另一個實施方案中，當(dāng)雜聚物的一個結(jié)合部分是抗體時，可以使用不 同表型的抗體(例如IgA、 IgD、 IgE、 IgGl、 IgG2(例如IgG2a)、 IgG3、 IgG4 或IgM)。在另一個實施方案中，抗體分子的部分(例如Fab片段)可用作一個 結(jié)合部分。在一優(yōu)選的實施方案中，至少一個結(jié)合部分是含有Fc結(jié)構(gòu)域的 抗體。在一實施方案中，抗體是小鼠抗體。在另一個實施方案中，可試驗修飾對抗體的作用，例如可試驗抗體的去 免疫化的作用，例如如同2003年3月28日提交的美國專利序列號60/458， 869中所描述的。在本發(fā)明提供的方法中，可將一種因子例如致病因子在非人類動物的血 清、循環(huán)和/或組織中的濃度減少例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、 約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。在另一個實施方案中，可間接測量因子在受治療者血清、循環(huán)和/或組 織中的濃度。例如，可測量由存在于血清和/或循環(huán)中的因子導(dǎo)致的病理， 例如通過檢查來自動物的組織樣品。另一個對因子在非人類動物的血清、循 環(huán)和/或組織中的濃度的間接測量是測量因子在非人類動物中引起感染的能 力。例如，可測量雙特異性化合物對臨床征候和感染癥狀的作用。也可試驗 雙特異性化合物抑制感染傳播的能力，例如從一個器官系統(tǒng)到另 一個器官系 統(tǒng)的傳播，或從一個體到另一個體的傳播。在另一個實施方案中，可測量雙特異性化合物與非人類動物中能產(chǎn)生 TLR4、 CD14或TRAM/Trif的細(xì)胞的結(jié)合能力。例如，在一個實施方案中， 使用 一種技術(shù)如實時生物分子相互作用分析(BIA) (Sjolander等，C7^附. 63: 2338-2345, 1991和Szabo等，CWr. C^z". 歷o/. 5: 699-705， 1995),可實現(xiàn)雙特異性分子與TLR4、 CD14或TRAM/Trif靶標(biāo)分子結(jié)合的能力的測定。如本文中所用的，"BIA，，是在未標(biāo)記任何相互作用物(例如BIAcore) 的情況下實時研究雙特異性分子相互作用的技術(shù)?？蓪⒃诒砻娴入x子共振 (SPR)的光學(xué)現(xiàn)象中的變化用作生物分子間實時反應(yīng)的指示。在另一個實施方案中，測量非人類動物細(xì)胞對因子的破壞(例如由巨噬 細(xì)胞殺死)?？蛇x擇減少因子在非人類動物的血清和/或循環(huán)中的濃度(與未接受雙特 異性化合物的非人類動物中觀察的濃度比較)的化合物?？蓮脑S多試驗的化合物中選擇用于受治療者測定中試驗的化合物。在另 一個實施方案中，在本發(fā)明測定中試驗的雙特異性化合物已被鑒定為能結(jié)合 TLR4、 CD14或TRAM/Trif，例如在體外測定中，并且用本發(fā)明的測定能可 對其評價或優(yōu)化。在這種情況下，將一種雙特異性化合物減少血清和/或循 環(huán)中因子濃度的能力與另 一種雙特異性化合物或相同化合物的非優(yōu)化形式 比較，以測定其減少血清和/或循環(huán)中因子濃度的能力。在優(yōu)選的實施方案中，以約l嗎化合物/kg體重至約100嗎化合物/kg 體重的濃度范圍，施用本發(fā)明的雙特異性化合物。如本文中所規(guī)定的，雙特 異性化合物治療上有效的量(即有效劑量)的范圍在約0.01至5000嗎/kg 體重，優(yōu)選約O.l至500嗎/kg體重，更優(yōu)選約2至80iig/kg體重，甚至更 優(yōu)選約5至70嗎/kg、 10至60嗎/kg、 20至50 (ig /kg、 24至41嗎/kg、 25 至40嗎/kg、 26至39嗎/kg、 27至38(ig/kg、 28至37jxg/kg、 29至36 [ig /kg、 30至35嗎/kg、 31至34嗎/kg或32至33嗎/kg體重。技術(shù)人員能理 解某些因素可影響有效治療受治療者所需的劑量，這些因素包括但不限于疾 病或病癥的嚴(yán)重性、以前的治療、受治療者綜合的健康和/或年齡和存在的 其他疾病。而且，用治療上有效量的蛋白、多肽或抗體治療受治療者可包括 單一治療，或優(yōu)選可包括一系列治療。在一優(yōu)選的實施例中，靜脈(iv)注射制劑后，用約1至500嗎/kg體 重的范圍的雙特異性化合物治療動物。也可以理解，用于治療的雙特異性化 合物的有效劑量相對具體治療的療程可增加或減少。由于如本文所述的診斷 測定的結(jié)果，劑量變化可產(chǎn)生或變得顯而易見。施用試驗化合物和/或因子的途徑可以是靜脈(iv )注射至動物的循環(huán)中。其他的施用途徑包括但不限于局部的、胃腸外的、皮下的或通過吸入。術(shù)語 "胃腸外的"包括注射例如通過皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑，也包括局部施用，例如在疾病或損傷的部位。從植入物(implant)持續(xù)釋放化合物在本領(lǐng)域 內(nèi)也是已知的。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員可意識到根據(jù)待治療的病癥的特性，患 者的體重、年齡，和一般的狀況以及施用途徑，適宜的劑量是變化的。可根 據(jù)動物試驗，確定基本的劑量，根據(jù)本領(lǐng)域可接受的實踐進(jìn)行用于人類施用 的劑量比例縮》史?？稍谝粍┝糠秶鷮⒑蜻x化合物和因子施用于動物。當(dāng)將因子也施用于動 物時，候選化合物可在施用因子之前、同時或之后施用?？捎帽景l(fā)明的表達(dá)TLR4、 CD14或TRAM/Trif的轉(zhuǎn)基因動物如小鼠篩 選或評^f介可用于治療人類病癥或疾病的候選化合物，該病癥或疾病與受治療 者血清和/或循環(huán)中不想要的(unwanted)因子的存在有關(guān)，如自身抗體、感染 因子或毒素。包括血源性因子(blood-borne agent),其包括但不限于任何下列血源性因子 病毒、病毒顆粒、毒素、細(xì)菌、聚核苷酸、抗體，如與自身免疫病有關(guān)的抗 體。在一實施方案中，示例性的靶向病毒因子包括但不限于下列任一因子 細(xì)月包月巴大病毒、流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、水泡性口 炎病毒、狂犬病病毒、單純皰滲病毒(herpes simple virus)、肝炎病毒、腺病 毒2、牛病毒性腹瑪病毒(bovine viral diarrhea virus)、人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)、登革熱病毒(dengue virus)、 馬爾堡病 毒(Marburg virus) 、 EB病毒(Epstein-Barr virus)。示例性的細(xì)菌因子包括銅綠假單胞菌(尸"w^ wowos aen^'"om)、熒光 <艮單月包菌(i^e"(sto附o"as ^worascew力、食酸寸艮單月包菌CPsewtfomoMas flc/tfovonms)、 產(chǎn)堿假單胞菌(i^油,"os a/c"/^酒)、惡臭假單胞 / W油)、嗜麥芽窄食單胞菌(5te"o化6ip/2omcwas ,/啤/n7/a)、洋 蔥伯克霍爾德菌(Bw狄oWen'a cepac&)、嗜水氣單胞菌 /7j^/ro/ /n7/a)、 大腸斥干菌co/z')、 弗氏 一寧檬酸斥干菌(Cz>oZ)acter 、鼠傷寒沙門氏菌(5^/wowe〃a妙/z/聽W,)、 傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、副傷寒沙門菌(<Sa/mowe//a para0^/"')、腸炎沙門氏菌 (&z/附o"g〃a g"tenY/fifo)、 痢疾志賀菌(57z/ge〃<3、 弗氏志賀菌 ykx"en')、索氏志賀菌(57z/ge〃a sow"ez〕、陰溝腸桿菌(五"&rak cfer c/oacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(五"feraZ)acfer fi^ogewes)、克雷白氏肺炎菌(X7eZw'e〃a / "ew附o"/ae)、 產(chǎn)酸克雷伯菌(A7e厶57W/a OAytoca)、 粘質(zhì)沙雷氏菌0Sem2打'a 、 土拉熱弗朗西絲氏菌(Frawc&e/A3 fw/arera&)、 摩根氏菌 (7kforga"e〃a加orga"http://)、 奇異變形菌(/Vofews附z'A3Zn7^)、普通變形菌(/Votews vw/gan力、產(chǎn)堿普羅登斯菌(/VovzV5fe""'a a/c^/acz'ms)、雷氏普羅威登斯菌 (7VoW^fe"c/a 、斯氏普羅威登斯菌(/Vov/6fe"c/a WwaW/)、 乙酸4丐不動桿茵(^cZ"eto6acfer ca/coac幼'c—、 溶血不動軒菌(^4"V^o6acter //aemo/少mw"、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Jera/m'fl ewteraco/Z"c")、鼠疫耶爾森菌 (y^s/m'a / eW》、^叚結(jié)核耶爾森菌(Feraz'"/a j^yewc/ofw6e/rw/cw:s)、中間耶爾森 菌(7em'"/a z'她rmWa)、 百曰咳桿菌(萬oniefe〃a/ eW顧/力、副百曰咳博代氏 桿菌; ara/ emAW&)、 支氣管敗血性博 氏菌(Bordetella bronchiseptica)、流感嗜血桿菌(ifaewop/n7ws /"y7we"zae)、 副流感嗜血桿菌 (^/"ae附c^/z//1^ /7"ra/"y M^2zae)、 溶血|1耆血4干菌(//(3^附0/ / 7")51 /zae附ofy"cw^)、 畐'J 溶血嗜血;^干菌(H^附op/n7ws / ara/^e附。/少ricws) 、 ；^土克雷嗜血才干菌(T/ae/wop/n./w* dwcre 、 多殺巴斯德菌(尸ostewre〃fl附w/to"Wa)、溶血巴#Jt德菌(尸osfewre〃a /wemo/yrica)、 卡他布蘭漢菌(萬raw/zame〃(3 cata^r/zafc)、 幽門螺》走桿菌 ;77/0W)、胎兒彎曲菌(Cawp_y/o6acter /e似力、空腸彎曲桿菌 (G3w/7_y/o6acfer 、 大腸彎桿菌(G3W/ 少/o6"cter co//)、 伯氏疏螺》走菌(So7re/Z(3 Zwrg(io^n')、 霍舌L 瓜菌(F/6n》c/zo/erae)、 富'J溶血 瓜菌(T/Z Wo / flra/wewo/j^'cws)、 嗜肺軍團(tuán)菌(Zeg/owe〃" /7wewmop/n7/a)、 單才亥細(xì)月包增生利 斯特菌(Zi他n'a附o"ocjtoge"es)、淋病奈瑟菌(A^'5^n'a go"o/r/zoeae)、腦膜炎 奈瑟菌(7Ve/^er/a附em'"g/"ci&)、陰道力口德納菌(G27Y/wgre〃a vag/""fc)、脆弱類 桿菌(jBflC/cfes加g船)、吉氏擬桿菌(5aC/cfes ^sto謹(jǐn)外擬桿菌屬3425 同源類群、普通擬桿菌(5acferazVfes vw/gam力、橢圓擬桿菌(5a"era/cfes ova/ws)、 多形擬桿菌(^7cfera/^fes Aeto/otoo附/craw)、單形擬桿菌(5acfera/cfes wm/or附/s)、 埃氏擬4干菌(Bflcfera^fes eggerf/z")、 內(nèi)臟扣乂 #干菌(Sac&ro/tfes ■sp/a"c/2"/c2^)、艱難才炎狀芽胞桿菌(C/osW^wm di折c/fe)、結(jié)核分枝桿菌(聊co6acten.ww ft/6ercw/os&)、 鳥分斗支桿菌(聊co6acten.ww av/wm)、 細(xì)胞內(nèi)分 才支軒菌(Afyco6acfer/w附/wfrv2ce〃w/are)、麻風(fēng)分支才干菌(Afyco6"cteWw附/epnae)、 白喉斥干菌(Co^y"e6(2cfen.wm (^》/^/^n.ae)、 潰瘍才奉桿菌(Co y"e6acten.wm w/cenms)、肺炎鏈球菌(5V邵tococcus / we,om'—、無乳鏈球菌(5^; tococci^ aga/a"/ae)、 產(chǎn)膿鏈球菌(5W/ tococcws / 少roge"as)、 糞腸球菌(五她rococcws y^eca/z's)、屎腸球菌(五她racoccus金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 表皮葡萄球菌(5te/ /2少/ococcws epz'cferm/cfe)、 腐生葡萄球菌 (5Va/^/ococcw ra/ ra/ 一/c —、 中間葡萄球菌(S鄉(xiāng)/^/ococcw51 、 豬葡萄球菌豬亞種OSto/ /^/ococcws /^/cws swfe/ . /^/cws)、溶血葡萄球菌 (/SV"/ /z盧co"wj /z"柳o/Wc—、人葡萄球菌(iS鄉(xiāng)/^/ococcws /zomz'"/力、解糖葡 萄球菌(S鄉(xiāng)/i!少/ococcws sacc/zara/Wc w力。在一實施方案中，靶向因子抵抗傳統(tǒng)的治療，例如抵抗抗生素。在另一實施方案中，可由本發(fā)明基于抗原的雜聚物結(jié)合的示例性耙向因子，包括但不限于任一下列因子與通過替代重組因子vn治療血友病有關(guān)的自身抗體；與自身免疫病重癥肌無力、狼瘡、狼瘡性腎炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、斯約格倫綜合癥、心肌炎、天皰瘡和類天皰瘡有關(guān)的自身抗體； 與組織移植自身免疫反應(yīng)有關(guān)的抗體；與免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎疾病有關(guān)的自在其他的實施方案中，可由本發(fā)明的雙特異性化合物結(jié)合的示例性生物 因子包括與生物戰(zhàn)有關(guān)的感染因子和毒素，包括但不限于下述任何一種炭 疽病毒、天花病毒、鼠疫病毒、依波拉(Ebola)病毒以及馬爾堡病毒。在一實施方案中，在進(jìn)行本發(fā)明的測定中，在施用雙特異性化合物之前、 同時或之后，將因子施用于轉(zhuǎn)基因動物?？蒦f務(wù)飾本發(fā)明的雙特異性化合物或其任何部分以增加其半壽期(half life)。在制藥工業(yè)中，肽類似物通常作為與其模板肽具有類似特性的非肽藥 物使用。術(shù)語稱這些類型的非肽藥物為肽模擬物或擬肽類(Fauchere， Adv. Drug Res. 15: 29, 1986; Veber等，TINS第392頁，1985和Evans等，MW. Ozem30: 1229,1987，其通過引用并入本申請)，并且通常借助于計算機化的 分子模擬研發(fā)它們。可用結(jié)構(gòu)上與治療有用的肽相似的肽才莫擬物產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防作用。通常擬肽類與示例多肽(即具有生物或藥理活性的多肽) 如抗原多肽在結(jié)構(gòu)上相似，但具有通過本領(lǐng)域已知的和進(jìn)一步描述于下述文獻(xiàn)中的方法由選自下組的鍵任選地替代的一種或多種肽4定-CH2NH-、 -CH2S-、 -CHrCH2-、 -CI^CH畫(順式和反式)、-COCH2-、 CH(OH)CH2誦和 CH2SO-，所述文獻(xiàn)為Spatola, A.F. in Chemistry and Biochemistry of Amino A cids, Peptides, and Proteins Weinstein, B.編輯,Marcel Dekker， New York,第 267頁，1983; Spatola, A. F.， Vega Data,第1巻，第3期，"Peptide Backone Modifications," 1983; Morley, 7>e"&. i^arw. 5W.第463-468頁，1980; Hudson 等，/"f. J14: 177-185， 1979 (-CH2NH-， -CH2-CH2-); Spatola等, 丄z/e 5W. 38: 1243-1249, 1986 (-CH2-S-); Harm,C/2e附.5bc.尸erh'w. Trara. 1: 307-314, 1982 (-CH國CH-，順式和反式)；Almquist等， / MW. C/2級23: 1392-1398, 1980 (-COCH2-); Jennings-White等，T^ra/^Ao"23: 2533, 1982 (-COCH2-); Szelke等,歐洲專利申請?zhí)朎P45665 CA: 97: 39405, 1982 (-CH(OH)CH2-); Holladay等，T^ra/z^ra".丄欲.24: 4401-4404, 1983 (-C(OH)CH2曙);和Hruby, h/e 5W. 31: 189-199, 1982 (-CH2-S-)，前述每一文獻(xiàn) 通過引用并入本申請。具體優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。此類肽模擬物可顯著 優(yōu)于多肽實施方案，包括，例如更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)、更好的化學(xué)穩(wěn)定性、增加 了藥理特性(如半壽期、吸收、效力、功效等)、改變了特異性(例如生物活性 的寬光鐠、減少了抗原性和其他的優(yōu)勢。標(biāo)記擬肽類通常涉及將一種或多種 標(biāo)記直接或通過間隔基(spacer)(如氨基)共價連接于擬肽類的非干擾位置，該 非干擾位置通過定量構(gòu)效(quantitative structure-activity)數(shù)據(jù)和/或分子才莫擬 預(yù)測。這些非干擾位置通常是與大分子不形成直接接觸的位置，擬肽類與該 大分子結(jié)合產(chǎn)生治療作用。擬肽類的衍生(例如標(biāo)記)基本上不應(yīng)干擾擬肽類 的期望的生物或藥理活性。以相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)地替代氨基酸序列的一個或多個氨基酸(例 如D-賴氨酸替代L-賴氨酸)，可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。另夕卜，通過本領(lǐng)域已 知的方法(Rizo等，i ev.所oc/ze附.61: 387， 1992，其在此引入作為參考)， 可產(chǎn)生約束肽，例如，通過加入能形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二碌^建的內(nèi)半胱氨可在原核或真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生此類^"飾的多肽?？蛇x地，可通過化學(xué) 方法合成此類肽。在重組宿主中表達(dá)異質(zhì)多肽、化學(xué)合成多肽和體外翻譯的方法為本領(lǐng)域公知的，并描述于下列文獻(xiàn)中Maniatis等,Afo/ecw/ar C7om'"g: 爿丄a6orato j M3wwa/，第二版，Cold Spring Harbor, N,Y.， 1989; Berger等， Methods in Enzymology，第152巻，Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego， Calif.; Merrifidd, /爿淤.C7zem. 5bc. 91: 501, 1969; Chaiken, C及C O". 所oc/z謡.11: 255， 1981; Kaiser等，5We腳 243: 187， 1989; Merrifield, 5We聰232: 342， 1986; Kent, j薩.及ev.歷oc/z亂 57: 957， 1988;和Offord， S纖'，歸c iVote一 Wiley Publishing, 1980,前述 文獻(xiàn)通過引用并入本申i奮。通常通過直接的化學(xué)合成產(chǎn)生多肽并將其用作雜聚物的結(jié)合部分。肽可 作為修飾的肽產(chǎn)生，其非肽部分通過共價^t連接于N-末端和/或C末端。在 某些優(yōu)選的實施方案中，將羧基末端或氨基末端或兩者進(jìn)行化學(xué)修飾。末端 氨基和羧基最常見的修飾分別是乙?；王０坊？蓪被┒说男揎椚珲?化(如乙?；?或烷基化(如甲基化)、羧基末端的修飾如酰胺化以及其他的末 端修飾包括環(huán)化并入至試驗化合物的各種實施方案中。某些氨基末端和/或 羧基末端的修飾和/或向核心序列的肽延伸可提供有利的生理、化學(xué)、生物 化學(xué)和藥理特性，如增加的穩(wěn)定性、增加的效力和/或功效、對血清蛋白 酶的抵抗性、合乎需要的藥物動力學(xué)特性，和其他的特性。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物一方面，本發(fā)明提供了一種基因組含有編碼CD14的多核苦酸的動物， 該多核苷酸可操作地連接于啟動子，使得在動物的巨噬細(xì)胞中功能性地表達(dá) 非人類或人類的TLR4、 CD14或TRAM/Trif基因，或在巨噬細(xì)胞中非人類 或人類的CD14是功能缺失突變。本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因非人類動 物的方法，所述轉(zhuǎn)基因非人類動物在其巨噬細(xì)胞中表達(dá)非人類或人類CD14。在本發(fā)明的方法中所用的轉(zhuǎn)基因動物可以是例如哺乳動物、鳥類、爬行 類動物或兩棲類動物?？捎糜诒疚闹兴鲇猛镜倪m宜的哺乳動物包括嚙齒類 動物、反芻動物、有蹄類動物、馴養(yǎng)的哺乳動物和產(chǎn)乳動物。優(yōu)選的動物包 括嚙齒動物、山羊、綿羊、駱駝、母牛、豬、馬、公牛、美洲駝、雞、鵝和火雞。在一優(yōu)選的實施方案中，非人類動物是小鼠。制備轉(zhuǎn)基因動物的各種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參閱例如Watson等， "The Introduction of Foreign Genes Into Mice," in Recombinant DNA, 第二版, W.H. Freeman和Co., New York,第255-272頁，1992; Gordon, 及ev. Qyto/. 115: 171-229, 1989; Jaenisch, 5We"ce 240: 1468-1474, 1989; Rossant, TVewraw 2: 323-334， 1990)。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬的示例性方案可見于White和Yannoutsos， Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology,第88-94 頁；美國專利號5，523，226;美國專利號5，573，933; PCT申請WO 93/25071 和PCT申請WO 95/04744。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大鼠的示例性方案可見于Bader等， C7/m'ca/ awd ￡jc/ en'mewto/尸/2ar,c0/0gv 尸一/o/ogy, 潛W 3: S81-S87, 1996。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因母牛的示例性方案可見于Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, Carl A. Pinkert編輯，Academic Press, Inc。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因綿羊 的示例性方案可見于Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994， Carl A. Pinkert編輯，Academic Press, Inc。在下文更詳細(xì)地論述幾個示例性的方 法。A.注射入前核可通過向卵細(xì)胞中引入依據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。將 所得的卵細(xì)胞移植至供正常胎兒發(fā)育的雌性子宮，隨后將發(fā)育和攜帶轉(zhuǎn)基因 的動物回交，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的雜合子。用各種發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞引入本 發(fā)明的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段，使用不同的方法。引入轉(zhuǎn)基因 的示例性的方法包括但不限于受精卵或接合子的微注射(Brinster等，iVoc. Ato/. Jcad 82: 4438-4442， 1985)和病毒整合(Jaenisch， TVoc. iVa".JcW. 腦73: 1260-1264， 1976; Jahner等，iVoc. Ato/.顛d 腦82: 6927-6931, 1985; Van der Putten等，7V^/. Jcad 5W. 82: 6148-6152, 1985)。胚胎操作和微注射的方法描述于，例如Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1986， 其內(nèi)容通過引用并入本申請)?？墒褂妙愃品椒óa(chǎn)生其他的轉(zhuǎn)基因動物。在一示例性的實施方案中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠使用下列步驟。將來自確定 的近交遺傳背景的雄性小鼠和雌性小鼠交配。事前用妊娠馬血清(PMS)處理交配的雌性小鼠以誘導(dǎo)卵泡的生長，并以人絨毛膜促性腺激素(hCG)處理以 誘導(dǎo)排卵。交配后，處死雌性小鼠并將受精卵從其輸卵管中移除。這時，前 核仍然沒有融合并且可通過使用光學(xué)顯微鏡方法觀察它們。在一可選的方案 中，可在不同的發(fā)育階段收獲胚胎，例如可以收獲胚泡。在改良的Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中恢復(fù)胚胎，并將其維持在補加了 10%胎牛血清的 改良的Dulbecco必需培養(yǎng)基(DMEM)中。隨后將外源DNA或重組構(gòu)建體(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif表達(dá)構(gòu) 建體)微注射入前核中(100-1000個分子/卵)。使用連接于顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)微操 作器可進(jìn)行表達(dá)構(gòu)建體的微注射。例如，當(dāng)進(jìn)行微注射時，通常將胚胎保存 于油下的100微升的DPBS滴中。將DNA溶液注射入雄性前核中。通過前 核的膨脹監(jiān)控成功的注射。其后不久，發(fā)生前核(雌性前核和雄性前核)的融 合，并且在某些情況下，外源DNA插入至(經(jīng)常)受精卵或接合子的一染色 體中。用類似的技術(shù)，可將如下所述的制備的重組ES細(xì)胞注射入胚泡中。B.胚胎干細(xì)胞在另 一個制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法中，可將本發(fā)明的重組DNA分子引入 小鼠的胚胎干(ES)細(xì)胞中。隨后用與上文分段中所述的那些類似的技術(shù)，將 所產(chǎn)生的重組ES細(xì)胞微注射入小鼠胚泡中。ES細(xì)胞可從植入前胚胎中獲得，并在體外培養(yǎng)(Evans等，Atowre 292: 154-156， 1981; Bradley等，iVm^e 309: 255-258, 1984; Gossler等，尸rac. A^f/. 爿cad 5W. 83: 9065-9069, 1986; Robertson等，Atowre 322: 445-448,1986)。能整合至正發(fā)育的胚胎種系中并變成胚胎種系的一部分以便產(chǎn)生靶 向構(gòu)建體的種系傳播的任何ES細(xì)胞都可適用于本文的用途。例如，可用于 產(chǎn)生ES細(xì)胞的小鼠品系是129J品系。優(yōu)選的ES細(xì)胞系是鼠細(xì)胞系D3(美 國典型培養(yǎng)物收藏目錄號CRL 1934)。用本領(lǐng)域已知的和描述于下列文獻(xiàn)中 的方法，可培養(yǎng)ES細(xì)胞并為DNA插7vf故準(zhǔn)備Robertson, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編輯.IRL Press, Washington, D,C.， 1987; Bradley等，Cwrrewf 7bpz.cs Z)eve/. 5fo/. 20: 357-371, 1986和Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold-Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986,前述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用并入本申請?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，將表達(dá)構(gòu)建體引入ES細(xì)胞中，例如，描述 于Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press編輯1989(其內(nèi)容通過引用并入本申請)中的那些方 法。適宜的方法包括但不限于電穿孔、微注射和磷酸鈣處理方法。引入到 ES細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建體(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif)優(yōu)選是線性的。通 過用適宜的限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA可實現(xiàn)線性化，該酶是選擇的僅在 載體序列內(nèi)切割而不在基因(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif基因)內(nèi)切割。引入表達(dá)構(gòu)建體后，篩選存在構(gòu)建體的ES細(xì)胞?？捎枚喾N方法篩選細(xì) 胞。對于構(gòu)建體中使用標(biāo)記基因的情況，可試驗存在標(biāo)記基因的動物細(xì)胞。 例如，對于標(biāo)記基因是抗生素抗性基因的情況，在其他的致死濃度的抗生素 存在下培養(yǎng)細(xì)胞(如選擇neo的G418)。存活的那些細(xì)胞可能整合了轉(zhuǎn)基因構(gòu) 建體。如果標(biāo)記基因是其編碼活性可以檢測的酶(如p-半乳糖香酶)的基因， 可在適宜的條件下將酶底物加入至細(xì)胞，并可分析酶活性?？蛇x地或另外， 可直接檢查ES細(xì)胞基因組DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)的方法可從ES細(xì)胞中提取DNA， 并且可用探針或經(jīng)設(shè)計以與轉(zhuǎn)基因特異性雜交的探針在Southern印跡上探 測該DNA。通過PCR用經(jīng)特異性設(shè)計以擴增特定大小的DNA片段和此類 轉(zhuǎn)基因序列的探針，也擴增基因組DNA,只有含有靶向構(gòu)建體的那些細(xì)胞 產(chǎn)生適當(dāng)大小的DNA片段。將隱含本發(fā)明的重組核酸分子(如TLR4、 CD14或TRAM/Trif)的接合 子植入假孕的雌性小鼠中，該小鼠通過以前與切除輸精管的雄性小鼠交配而 獲得。在一般的方法中，將受體雌性小鼠麻醉，在腰側(cè)部做切割以暴露輸卵 管，并將胚胎轉(zhuǎn)至輸卵管的壺腹區(qū)。將體壁(body wall)縫合并且用創(chuàng)傷夾 (woundclip)將該皮膚關(guān)閉。在整個懷孕期，胚胎發(fā)育，并且代孕母鼠分娩潛 在轉(zhuǎn)基因小鼠。最后，試驗存在有外源或重組DNA的新生小鼠。所有注射 的卵中，平均10%正確發(fā)育并產(chǎn)生小鼠，所有出生的小鼠中，平均4分之一 (25%)是轉(zhuǎn)基因的，總效率為25%。 一旦這些小鼠被繁殖，它們以正常方 式(孟德爾法則)傳遞連接至小鼠染色體的外源基因。D. 篩選轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的存在在出生后可通過標(biāo)準(zhǔn)的方法鑒定轉(zhuǎn)基因動物。篩選存在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的 來自尾組織的DNA，例如用Southern印跡和/或PCR。隨后，如杲i人為顯示 是嵌合體的后代攜帶轉(zhuǎn)基因，將其彼此雜交，以產(chǎn)生純合的動物。如果不清 楚后代是否具有種系傳遞，可將它們與雙親品系或其他的品系雜交，并且篩 選后代的雜合性。通過DNA的southern印跡和/或PCR擴增鑒定雜合子。 隨后可將雜合子彼此雜交以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因后代?？赏ㄟ^來自這種雜交產(chǎn) 物的小鼠以及已知為雜合子的小鼠和野生型小鼠的等量基因組DNA的 Southern印跡來鑒定純合子?？苫谌祟惢蚍侨祟惖腡LR4、 CD14或 TRAM/Trif基因或標(biāo)記基因或兩者來設(shè)計篩選Southern印跡的探針。其他鑒定和表征轉(zhuǎn)基因后代的手段在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，通過用 針對由引入的基因編碼的蛋白(如人類或非人類TLR4、 CD14或TRAM/Trif 蛋白)的抗體或針對標(biāo)記基因(其中這種基因得以表達(dá))產(chǎn)物的抗體探測 westen印跡，可用western印跡評估引入這些后代的各種組織中的基因的表 達(dá)水平?？墒褂眠m宜的抗體進(jìn)行原位分析以尋找轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在或缺失，例如 固定細(xì)胞并用抗體標(biāo)記，和/或FACS (fluorescence activated cell sorting,熒 光激活細(xì)胞分選術(shù))分析來自后代的各種細(xì)胞如紅細(xì)胞。例如，為了證明 TLR4、 CD14或TRAM/Trif在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，可用對人類TLR4、 CD14 或TRAM/Trif Rl具特異性的抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，將該抗體直接綴合或與 綴合熒光團(tuán)的并且識別TLR4、 CD14或TRAM/Trif的抗體的第二抗體結(jié)合 4吏用。在這種分析中，對于TLR4、 CD14或TRAM/Trif的存在，人類紅細(xì) 胞可用作陽性對照，且正常小鼠的紅細(xì)胞可用作陰性對照。E. 含有多種轉(zhuǎn)基因或其他突變的小鼠如本文中所述在其循環(huán)的紅細(xì)胞中表達(dá)TLR4、 CD14或TRAM/Trif的 轉(zhuǎn)基因小鼠可與下列小鼠雜交a)隱含其他的轉(zhuǎn)基因的小鼠，或b)在其他的 基因上含有突變的小鼠。用標(biāo)準(zhǔn)的雜交育種方法，可產(chǎn)生對每一突變是雜合 或純合的小鼠，并將其保持。可與含有CD14基因的小鼠繁殖的小鼠的實例 包括但不限于更有自身免疫病傾向的小鼠品系，如為狼瘡模型的小鼠品系，例如小鼠品系NZB/W、 MRL+或S幾。本發(fā)明還涉及獲自轉(zhuǎn)基因動物的細(xì)胞。因為由于突變或者環(huán)境影響，在 隨后的后代中可發(fā)生一定的修飾，此類后代實際上可與親本細(xì)胞不相同，但 仍然包括于本文所述的術(shù)語范圍內(nèi)。重組核酸技術(shù)用于實施本發(fā)明的核酸，無論是RNA、 iRNA、反義核酸、cDNA、基 因組DNA、載體、病毒或其雜合物(hybrid),可從各種來源分離、基因工程 改造、擴增和/或表達(dá)/重組產(chǎn)生?？蓮倪@些核酸中單獨分離或克隆而產(chǎn)生重 組多肽并試驗其期望的活性?？梢允褂萌魏沃亟M表達(dá)體系，包括細(xì)菌、哺乳 動物、酵母、昆蟲或植物細(xì)胞表達(dá)體系?？蛇x地，這些核酸可通過熟知的化學(xué)合成:J支術(shù)體外合成，例如下列文獻(xiàn) 中所描述的Adams, /爿附.C/ze肌5bc 105: 661, 1983; Bolousov， M/c/e/c ^c/A 25: 3440-3444, 1997; Frenkel， i^Vee i^&c說o/. 19: 373-380,1995; Blommers,歷oc/z謹(jǐn)'勿33: 7886-7896， 1994; Narang, Me仇68: 90, 1979; Brown, Me仇五"，o/' 68: 109, 1979; Beaucage， Wra.丄饑22: 1859， 1981;美國專利號4,458,066。本發(fā)明提供了含有本發(fā)明序列如本發(fā)明示例性序列的亞序列的寡核苷 酸。寡核苷酸可包括例如可化學(xué)合成的單鏈多脫氧核苷酸或雙互補的多脫氧 核香酸鏈。操作核酸的技術(shù)，例如亞克隆、標(biāo)記探針(如使用克列諾(Klenow)聚 合酶、切口平移、擴增進(jìn)行隨機引物標(biāo)記)、測序、雜交等，充分描述于科 學(xué)和專利文獻(xiàn)中，參閱例如Sambrook編輯，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第二版)，1-3巻，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubd編輯，John Wiley和Sons, Inc., New York, 1997; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucletic Acid Probes, Part I . Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen纟扁4尋，Elsevier, N.Y.， 1993 。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多普通方法中的任何手段，可分析并定量核酸、載體、殼體、多肽等。這些手段包括例如分析生物化學(xué)法如NMR、 分光光度法、射線照相術(shù)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄 層層析(TLC)和高擴散層析；各種免疫方法，如流體或凝膠沉淀素反應(yīng)、免 疫擴散、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫 熒光測定、Sourthem分片斤、Northern分析、點印跡分析(dot-blot analysis)、 凝膠電泳(例如SDS-PAGE)、核酸或把標(biāo)或信號擴增法、放射標(biāo)記、閃爍計 數(shù)和親和層析。通過從基因組樣品中克隆，并且如果需要，篩選和再克隆從例如基因組 克隆或cDNA克隆中分離的或擴增的插入片段，可獲得和操作用于實踐本發(fā) 明方法的核酸。用于本發(fā)明方法中的核酸的來源包括包含于例如下組中的基 因組或cDNA文庫哺乳動物人工染色體(MAC),參閱例如美國專利號 5,721,118; 6,025,155;人類人工染色體，參閱例如Rosenfeld, 15: 333-335,1997;酵母人工染色體(YAC);細(xì)菌人工染色體(BAC); Pl人工染 色體，參閱例如Woon， Ge圃^ 50: 306-316, 1998; Pl來源的載體(PAC )， 參閱例如Kern，所o&c/zm々w^ 23: 120-124, 1997;粘粒、重組病毒、噬菌體或 質(zhì)粒。本發(fā)明提供了融合蛋白和編碼它們的核酸?？蓪D14或Toll樣受體4 多肽融合于異質(zhì)的肽或多肽，如給與期望的特性如增加的穩(wěn)定性和簡化的純 化的N-末端鑒定肽。也可將本發(fā)明的肽或多肽合成和表達(dá)成連接有一個或 多個另外的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，用于例如產(chǎn)生更具免疫原性的肽、更易于分 離重組合成的肽、鑒定和分離抗體和表達(dá)抗體的B細(xì)胞等。有利于檢測和 純化的結(jié)構(gòu)域包括例如金屬螯合肽如聚組氨酸束(polyhistidine tract)和允許 在固定的金屬上純化的組氨酸-色氨酸組件、允許在固定的免疫球蛋白上純 化的蛋白A結(jié)構(gòu)域和用于FLAGS延伸/親和純化體系(Immunex Corp， Seattle Wash)中的結(jié)構(gòu)域。在純化結(jié)構(gòu)域和含有基元(motif)的肽或多肽間包括可切 割的連接體序列如Factor Xa或腸激酶(Invitrogen, San Diego Calif.)以促進(jìn) 純化。例如，表達(dá)載體可包括編碼表位的核酸序列，該核酸序列連接于跟隨 著硫氧還蛋白和腸激酶切割位點的6個組氨酸殘基(參閱例如Willianms， 說oc/2em&^v 34: 1787-1797, 1995; Dobeli，尸rate/" Pwri/" 2: 404-414，1998)。組氨酸殘基利于檢測和純化，而腸激酶切割位點提供了用于純化來 自殘余的融合蛋白表位的手段。 一方面，可用指導(dǎo)翻譯的多肽或其片段的分 泌的前導(dǎo)序列，在適當(dāng)?shù)碾A段組裝編碼本發(fā)明的多肽的核酸。涉及編碼融合 蛋白的載體的技術(shù)和融合蛋白的應(yīng)用充分描述于科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，參閱例 如，Kroll， DiVJ Ce〃.所o/. 12: 441-53, 1993。A. 轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可將本發(fā)明的核酸可操作地連接于啟動子。啟動子可是一個基元或一列 指導(dǎo)核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸調(diào)控序列。啟動子可包括轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需的 核酸序列，例如，在II型聚合酶啟動子的情況下，TATA元件。啟動子也任 選地包括遠(yuǎn)端增強子或阻遏子元件，遠(yuǎn)端增強子或阻遏子元件可位于從轉(zhuǎn)錄 起始位點開始的達(dá)幾千個堿基對處。"組成性"啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā) 育條件下起作用的啟動子。"可誘導(dǎo)"啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下的啟動 子。"組織特異性"啟動子是在有機體的一定的組織類型中起作用而在同一 個有機體的其他組織類型中不起作用的啟動子。術(shù)語"可操作地連接"指核 酸表達(dá)調(diào)控序列(如啟動子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點陣列)和另一核酸序列之間的功能^:,其中，表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)對應(yīng)于另一序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。B. 表達(dá)栽體和克隆載體本發(fā)明提供了含有本發(fā)明核酸如編碼本發(fā)明蛋白的序列的表達(dá)載體和 克隆載體。本發(fā)明的表達(dá)載體和克隆載體可含有病毒顆粒、桿狀病毒、噬菌 體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、F粘粒、細(xì)菌人工染色體、病毒DNA(如疫苗、 腺病毒、腐臭痘病毒(foul pox virus)、偽狂犬病病毒和SV40的衍生物)，基 于P1的人工染色體、酵母質(zhì)粒、酵母人工染色體和對目的宿主(如芽胞桿菌 (&c///^)、曲霉(^sper^7to)和酵母)具特異性的任何其他栽體。本發(fā)明的載 體可包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而 言，大量適宜的載體是熟知的，并且可以商購獲得。如果需要，用常規(guī)分子生物學(xué)方法，可將本發(fā)明的核酸克隆至多種載體 中的任何載體，克隆體外擴增的核酸的方法描述于例如美國專利號5,426,039 中。為了促進(jìn)擴增的序列的克隆，可將限制酶位點"構(gòu)建入"PCR引物對。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽和肽的表達(dá)載體文庫?？蓪⑦@些核酸引入細(xì)胞的基因組或細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，并通過充分描述于科學(xué)和專利文獻(xiàn)中的多種常規(guī)技術(shù)表達(dá)，參閱例如Roberts, Atowe 328: 731, 1987; Scheider, /Vofe/"Ex/ r尸wn/" 6435: 10， 1995; Sambrook， Tijssen或Ausubel。載體可從天 然來源中分離、從如ATCC或GenBank文庫的來源中獲得或通過合成或重 組方法制備。例如，可在表達(dá)盒、在細(xì)胞中穩(wěn)定或瞬間表達(dá)的載體或病毒(如 游離基因表達(dá)體系)中表達(dá)本發(fā)明的核酸?？蓪⑦x擇標(biāo)記摻入至表達(dá)盒和載 體中以在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和序列上賦予可選擇的表型。例如，選擇標(biāo)記可編碼游 離基因的維持和復(fù)制，使得不需要整合至宿主基因組。一方面，體內(nèi)施用本發(fā)明的核酸，用于原位表達(dá)本發(fā)明的肽或多肽?？?以以"棵DNA，，(參閱例如美國專利號5,580，859)或以表達(dá)載體如重組病毒 的形式施用核酸?？赏ㄟ^任何途徑施用核酸，包括如下文所述的腫瘤周圍或 腫瘤內(nèi)施用。體內(nèi)施用的載體可獲自病毒基因組，包括重組修飾的有包膜的 或無包膜的DNA和RNA病毒，這些病毒優(yōu)先選自桿狀病毒科 (baculoviridiae)、細(xì)小病毒科(parvoviridiae)、小RNA病毒科(picornoviridiae)、 皰滲病毒科(herpesveridiae)、痘病毒科(poxyiridae)、腺病毒科(adenoviridiae) 或小RNA病毒科(picomanaviridiae)。也可使用嵌合載體，其利用了每一個 親本載體的特性的有利優(yōu)點(參閱例如Feng, Atowe B/0&c/2w0/0gy 15: 866-870,1997)?？赏ㄟ^重組DNA技術(shù)修飾此類病毒基因組，以包括本發(fā)明 的核酸，并可進(jìn)一步改造成復(fù)制缺陷、條件復(fù)制或具有復(fù)制能力。在可選的 方面中，載體獲自腺病毒基因組(如獲自人類腺病毒基因組的無復(fù)制能力的 載體，參閱例如美國專利號6,096,718; 6,110,458; 6,113,913; 5,631,236)、 與腺相關(guān)病毒基因組和反轉(zhuǎn)錄病毒基因組。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可包括基于下列 病毒的那些病毒鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免 疫缺陷病毒(SIV)、人類免疫缺陷病毒(fflV)和其組合；參閱，例如美國專利 號6,1177,681; 6,107,478; 5,658,775; 5,449,614; Buchscher， / Wra/. 66: 2731-2739, 1992; Johann， 《/ Wra/. 66: 1635-1640, 1992?；谙傧嚓P(guān)病毒 (AVV)的載體可用于放射免疫(radioimmun)具有靶標(biāo)核酸的細(xì)胞，例如， 在體外產(chǎn)生核酸和肽中，以及在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)體內(nèi)基因治療步驟中；參閱例 如美國專利號6，110，456; 5,474,935; Okada， GWze 77^. 3: 957-964, 1996。如本文中所用的"表達(dá)盒，，指核苷酸序列，其在與此類序列相容的宿主 中能影響結(jié)構(gòu)基因(如編碼蛋白的序列，如本發(fā)明的多肽)的表達(dá)。表達(dá)盒包 括至少啟動子，該啟動子可操作地連接于編碼多肽的序列，和任選地與其他 序列如轉(zhuǎn)錄終止信號連接。也可以使用影響表達(dá)必需的或有利的其他的因 子，如增強子。當(dāng)核酸置于功能關(guān)系中時，其可操作地連接于另一個核酸序列。例如， 如果啟動子或增強子影響了序列的轉(zhuǎn)錄，可將其可操作地連接于編碼序列。至于轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，可操作地連接意指被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且 在需要連接兩個蛋白編碼區(qū)的情況下，為連續(xù)的并在閱讀框中。對于開關(guān)序 列，可操作地連接表示序列能影響開關(guān)重組。因此，表達(dá)盒也包括質(zhì)粒、表 達(dá)載體、重組病毒、任何形式的重組"棵DNA，，載體等。"載體"意指能轉(zhuǎn)運與其連接的另一個核酸的核酸分子。 一種類型的載 體是"質(zhì)粒"，其是其他的DNA片段可與之連接的環(huán)式雙鏈DNA環(huán)。另 一種類型的載體是病毒載體，其中，可將其他的DNA片段連接至病毒基因 組。某些載體(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體，和附加型哺乳動物載體) 能在引入所述載體的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。通過引入宿主細(xì)胞，可將其他 的載體(如非附加型哺乳動物載體)整合至宿主細(xì)胞基因組中，并據(jù)此與宿 主基因組一起得以復(fù)制。而且，某些載體能指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的 表達(dá)。此類載體在本文中稱為"重組表達(dá)載體"(或簡單地稱為"表達(dá)載體")。 通常，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒形式。在本發(fā)明的說 明書中，可交互使用"質(zhì)粒"和"載體",因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。 然而，本發(fā)明意于包括其他形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷 反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，其具有等同的功能。C.宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其含有本發(fā)明的核酸序列，例如編碼本發(fā) 明多肽的序列，或本發(fā)明的載體。宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的任 何宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞、真核細(xì)胞，如細(xì)箭細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、 哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞。示例性的細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿菌、鏈 霉菌屬、枯草芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和下列各屬中的各種種類假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬。示例性的昆蟲細(xì)胞包括果蠅S2(Drosophila S2) 和夜蛾Sf9 ( Spodoptem Sf9 )。示例性的動物細(xì)胞包括CHO、 COS或Bowes 黑色素瘤或任何小鼠或人類的細(xì)胞系。選擇適當(dāng)?shù)乃拗髟诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員的 能力范圍內(nèi)。使用多種技術(shù)中的任何技術(shù)，可將載體引入宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、 轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒感染、基因槍或Ti介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。具體的方法包括磷酸釣轉(zhuǎn) 染、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。改造的宿主細(xì)胞可培養(yǎng)于修飾的以適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增 本發(fā)明的基因的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中。適宜的宿主菌(host strain)轉(zhuǎn)化和宿主菌 生長至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，可通過適當(dāng)?shù)姆绞?例如溫度變動或化學(xué)誘導(dǎo))誘 導(dǎo)選擇的啟動子，并且可將細(xì)胞另外培養(yǎng)一段時間以使它們產(chǎn)生期望的多肽 或其片段?？赏ㄟ^離心收獲細(xì)胞，通過物理或化學(xué)方式石皮裂細(xì)胞，并且保留所得粗 提物用于進(jìn)一步純化。通過任何便利的方法，可將用于表達(dá)蛋白的微生物細(xì) 胞破裂，包括冷凍融化循環(huán)、超聲處理、機械破裂或使用細(xì)胞溶解劑。此類 方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。通過包括下列方法的方法可從重組細(xì) 胞培養(yǎng)物中回收和純化表達(dá)的多肽或片段硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰 離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、 羥磷灰石層析和凝集素層析。如果需要，在多肽完整構(gòu)型中，可使用蛋白再 折疊步驟。如果需要，高效液相色譜(HPLC)可用于最后的純化步驟。也可使用各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)體系以表達(dá)重組蛋白。哺乳動物表達(dá)體 系的實例包括COS-7系猴腎成纖維細(xì)胞，和能從相容的載體中表達(dá)蛋白的 其他細(xì)胞系，如C127、 3T3、 CHO、 HeLa和BHK細(xì)胞系?？梢砸猿Ｒ?guī)的方式4吏用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體，以產(chǎn)生由重組體序列編碼 的基因產(chǎn)物。根據(jù)重組體產(chǎn)生方法中所用的宿主，可將由含有載體的宿主細(xì) 胞產(chǎn)生的多肽糖基化或不糖基化。本發(fā)明的多肽可包括或也可不包括起始甲碌u氨酸殘基?？墒褂脽o細(xì)胞翻譯體系以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。無細(xì)胞翻譯體系可使用從 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的mRNA,即所述DNA構(gòu)建體含有可才喿作地連接于編碼多肽或其片段的核酸的啟動子。在一些方面中，在指導(dǎo)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前，可將DNA構(gòu)建體線性化。隨后將轉(zhuǎn)錄的mRNA用適當(dāng)?shù)臒o細(xì)胞翻譯提取物如家 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物溫育，以產(chǎn)生期望的多肽或其片段。表達(dá)載體可含有一種或多種可選擇的標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型特性，如二氬葉酸還原酶或真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素抗性，或 如大腸桿菌中四環(huán)素或氨千青霉素抗性。D.核酸擴增在實踐本發(fā)明中，通過例如擴增，可復(fù)制編碼本發(fā)明的多肽的核酸或修^ 飾的核酸。本發(fā)明提供了擴增編碼本發(fā)明多肽的核酸的擴增引物序列對，例 如能擴增含有CD14蛋白或Toll樣受體4序列或其亞序列的核酸序列的引物對。擴增方法包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis編輯，Academic Press,N.Y., 1990和PCR STRATEGIES, 1995， Innis編輯，Academic Press, Inc., N.Y.);連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參閱例如Wu, G^omzh 4: 560, 1989; Landegren, 5We"ce 241: 1077， 1988; Barringer, 89: 117, 19卯)；轉(zhuǎn)錄擴增 (參閱例如，Kwoh,尸rac. Ato/.爿c^/. 86: 1173, 1989);和自動維持序列復(fù)制(參閱例如，Guatelli,尸rac. Ato/.爿cad 5W. 87: 1874, 1990); Q p畫復(fù) 制酶擴增(參閱例如，Smith, / C"". M/craZ>Zo/. 35: 1477-1491, 1997);自動Q-(3 復(fù)制酶擴增測定(參閱例如,Burg， Mo/. CW/. iVc^es 10: 257-271, 1996)和其他 的RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如，NASBA， Cangene, Mississauga, Ontario); 也可參閱Berger， M^zoA ￡"，0/. 152: 307-31.6, 1987; Sambrook; Ausubel; 美國專利號4,683,195和4,683,202; Sooknanan,所otec/z"o/ogy 13: 563-564, 1995。E.核酸雜交本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸序列，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本發(fā)明示例 性的序列雜交，例如CD14序列或Toll樣受體4序列，或其任何互補序列， 或編碼本發(fā)明的多肽的核酸。在可選的方面中，嚴(yán)謹(jǐn)條件是高嚴(yán)謹(jǐn)條件、中 度嚴(yán)謹(jǐn)條件或低嚴(yán)謹(jǐn)條件，如本領(lǐng)域所知的和本文中所述的。這些方法可用于分離本發(fā)明的核酸。在可選的方面中，本發(fā)明的核酸，如通過其在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的能力所定義的，可以是在約5個殘基和全長之間的本發(fā)明的核酸，例如，它們在 長度上可至少是5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 90、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800或更多殘基，或基因或編碼序列如cDNA的全長。也 可包括比全長短的核酸。這些核酸可用作例如雜交探針、標(biāo)記探針、PCR 寡核苷酸探針、iRNA、編碼抗體結(jié)合肽(表位)、基元、活性位點等的反義 或序列。"選擇性地(或特異性地)與……雜交，，指，在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，當(dāng)具 體的核苷酸序列存在于復(fù)合混合物(如總的細(xì)胞或文庫DNA或RNA)中時， 一個分子與該序列結(jié)合、雙螺旋或雜交，其中至少在約IO倍的背景檢測該 具體的核苷酸序列。在一實施方案中，通過其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸雜交的能 力確定其在本發(fā)明的范圍內(nèi)，否則確定其在本發(fā)明的范圍內(nèi)(如本文中所述 的實例性的序列)。"嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件"指這樣的條件，即探針在該條件下與通常以核酸的 復(fù)合混合物形式的靶標(biāo)亞序列雜交，而不與顯著量的其他序列(陽性信號(如 鑒定本發(fā)明的核酸)約10倍背景雜交)雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是依賴序列的并且在 不同的環(huán)境中不同。較長的序列在較高的溫度特異性雜交。對核酸雜交的詳 盡指南見于Sambrook編輯，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (第二版)，第l誦3巻，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編輯，John Wiley和Sons, Inc., New York, 1997; LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLETIC ACID PROBES, PART I . Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen編輯，Elsevier, N.Y.， 1993。通常，對于在確定的離子強度、pH的特定的序列，選擇嚴(yán)謹(jǐn)條件是比 熱熔點I低約5°C-10°C。 Tm是這樣一種溫度(在確定的離子強度、pH和核 酸濃度)在該溫度下，50°/。的與耙標(biāo)互補的探針與靶標(biāo)序列均衡雜交(因為靶標(biāo)序列過量存在，在Tm下，50%的探針被均衡占用)。嚴(yán)謹(jǐn)條件是這樣的 條件，即在該條件下，鹽的濃度少于約l.OM鈉離子，通常在pH7.0-8.3時 約O.Ol-l.OM鈉離子濃度(或其他的鹽)，且溫度對于短的探針(如10-50個核 苷酸)是至少約30 °C,對于長的探:針(如多于50個核苷酸)是至少約60 °C。 加入如Sambrook(下文引用)所述去穩(wěn)定劑如曱酰胺，也可獲得嚴(yán)謹(jǐn)條件。對 于高嚴(yán)謹(jǐn)雜交，陽性信號是至少2倍的背景，優(yōu)選10倍的背景雜交。示例 性的高嚴(yán)謹(jǐn)或嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括50%的曱酰胺、5xSSC和P/。SDS,在42 。C溫育，或5 x SSC和1。/。SDS，在65。C溫育，和在0.2x SSC和0.1%SDS 中在65。C洗滌。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號(如鑒定本發(fā)明的核酸) 是約IO倍的背景雜交。用于鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的嚴(yán)謹(jǐn)條件包括例如， 在含有50%的曱酰胺、5 x SSC和1% SDS的緩沖液中在42。C雜交，或在含 有5 x SSC和1% SDS的緩沖液中在65°C雜交，兩者都以0.2 x SSC和0.1% 的SDS在65°C洗滌。在本發(fā)明中，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下用本文中公開的核酸序列， 可在標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡中鑒定含有本發(fā)明的核酸的基因組DNA或cDNA。 用于這類雜交(以鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸)的其他嚴(yán)謹(jǐn)條件為包括在40°/0 甲酰胺、1MNaCl、 1%SDS中在37。C雜交的那些條件。然而，選擇雜交形式并不關(guān)鍵一_是洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性提出決定核酸是 否在本發(fā)明的范圍內(nèi)的條件。用于鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的洗滌條件包括 例如pH7時約0.02 mol的鹽濃度和至少約50°C或約55°C-60°C的溫度；或 在72°C約0.15MNaCl的鹽濃度約15分鐘；或約0.2 x SSC的鹽濃度，在至 少約50°C或約55°C至約60°C，約15至約20分鐘；或用濃度約2 x SSC的 含有0.1% SDS的鹽，室溫下洗滌兩次，每次15分鐘，隨后用含有0.1% SDS 的的O.l x SSC在68。C洗滌兩次，每次15分鐘；或等同的條件。有關(guān)SSC 緩沖液和等同條件的描述，參閱Sambrook, Tijssen和Ausubel。F.寡核苷酸探針及其使用方法本發(fā)明也提供了用于鑒定編碼一種多肽的核酸的核酸探針，該多肽是 TLR-4信號傳導(dǎo)活性調(diào)節(jié)劑。 一方面，該探針含有至少本發(fā)明核酸的至少 IO個連續(xù)的堿基?？蛇x地，本發(fā)明的探針可以是至少約5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、150,或約10-50、約20-60、約30-70個如本發(fā)明的核酸中所列出的序列的 連續(xù)堿基。探針通過結(jié)合和/或雜交鑒定核酸?？蓪⑻结樣糜诒景l(fā)明的測定， 參閱下文的討-論。本發(fā)明的探針也可用于分離其他的核酸或多肽。G.測定序列同一性程度本發(fā)明提供了與CD14多核苦酸或Toll樣受體4多核苷酸具有至少 90%、 91%、 92°/0、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多序列 同一性的核酸。本發(fā)明提供了與CD14蛋白或Toll樣受體4蛋白具有至少 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多序列 同 一性的多肽。可用序列比較算法通過分析或通過可視的檢查來測定序列的 同一性。使用本領(lǐng)域中已知的多個序列比較算法的任何算法和程序，可評價 蛋白和/或核酸序列的同 一性(同源性)。對于序列的比較，通常一個序列充當(dāng)參考序列，將試驗的序列與該參考 序列比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將試驗序列和參考序列登輸入計算機， 如果需要，指定亞序列坐標(biāo)(coordinate),并指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂?缺省程序參數(shù)，或指定可供選擇的參數(shù)。隨后基于程序參數(shù)，序列比較算法 計算試驗序列相對于參考序列的序列同一百分?jǐn)?shù)。對于核酸和蛋白的序列比 較，可使用下文討論的BLAST和BLAST 2.2.2或FASTA版本3.0t78算法和 缺省參數(shù)。如本文所用的"比較窗(comparison window)"包括參考選自下組的連續(xù) 位置的數(shù)目中的任何一個20-600，通常約50至約200，更通常約100至約 150，其中，在將兩條序列最佳比對后，可將序列與相同數(shù)目的連續(xù)位置的 參考序列比較。比對用于比較的序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的?？筛鶕?jù)下 列方法進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對如Smith和Waterman, 々 p/. Mafc/z. 2: 482, 1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch, / Mo/.所o/. 48: 443， 1970的同源性比對算法；Pearson和Lipman,尸rac. A^/.Sc/. t/.5".A 85: 2444， 1988的研究相似性的方法；計算機化的執(zhí)行這些算法(FASTDB (Intelligenetics)， BLAST (National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA和Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)中的TFASTA;或人工比對和可一見的枱r查(參閱例i口 Ausubel等，(1999 Suppl.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience， N.Y. 1987)。適宜測定同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性的算法的優(yōu)選實例是FASTA算 法，其描述于Pearson和Lipman，Ato/. Jcad 5W. 85: 2444， 1988。也可參閱Pearson, MeAoA五w23;附0/. 266: 227-258， 1996。將用于DNA序列的 FASTA比對中計算同一性百分?jǐn)?shù)的優(yōu)選的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，BL50矩陣(BL50 Matrix)15: -5 ; k誦元組=2 ; 連接罰分(joining penalty" 40 , 優(yōu)化 (optimization)=28;空位罰分(gap penalty)-12，空位長度罰分(gap length penalty)=-2;和寬度(width)- 16。另 一個適宜測定同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性的算法的優(yōu)選實例是 BLAST和BLAST 2.0算法，其分別描述于Altschul等，」V"c. A^y 25: 3389-3402， 1977和Altschul等， / Mo/. 215: 403-410, 1990。利用本文所 述的參數(shù)，使用BLAST和BLAST2.0測定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列同一 性百分?jǐn)?shù)。通過國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information , http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)可公開地獲得進(jìn)行BLAST分析 的軟件。這種算法首先包括通過鑒定咨詢序列(query sequence)中長度W的 短字，鑒定高得分序列對(HSP),當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時， 該咨詢序列匹配或滿足正評價的閾值分T。 T稱為鄰近字得分閾值(Altschul 等，如上)。這些初始的鄰近字的采樣(hit)充當(dāng)啟動搜尋以發(fā)現(xiàn)包含它們的較 長的HSP的種子(seed)。沿著每一個序列在兩個方向上延伸字的采樣，直到 可增加累積的比對分。用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎賞分，總是〉0)和N(錯 配殘基的罰分；總是<0)，計算核香酸序列的累積分。對于氨基酸序列，使 用得分矩陣計算累積分。當(dāng)累積的比對分由于來自其最大獲得值的量X 而降低時；由于累積一個或多個負(fù)得分殘基比對，累積的分變成0或更低時； 或達(dá)到任一序列的末端時，停止字的采樣在每一個方向上的延伸。BLAST 算法參數(shù)W、 T和X決定比對的靈敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸 序列)用字長(W)ll、期望值(E)IO、 M=5、 N^4和兩條鏈的比較作為缺省。 對于氨基酸序列，BLASTP程序用字長3、期望值(E) 10和BLOSUM62得 分矩陣(參閱Kenikoff和Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915，1989)比對(B)50、期望值(E)IO、 M=5、 N=-4和兩條鏈的比較作為缺省。BLAST算法也進(jìn)行兩條序列之間相似性的統(tǒng)計分析(參閱，例如Karlin 和Altschul, iVoc. 7V^/.5W. CZS.A卯5873-5787， 1993)。由BLAST算 法提供的一種相似性測量是最小總數(shù)概率(P(N))，其提供了可能性的指示， 通過該可能性，偶爾發(fā)生兩條核苷酸或氨基酸序列之間的匹配。例如，如果 最小總數(shù)概率在試驗核酸與參考核酸的比較中小于約0.2,更優(yōu)選小于約 0.01和最優(yōu)選小于約0.001，那么iL為該核酸與參考序列相似。有益的算法的另 一實例是PILEUP。用遞增的兩兩比對顯示關(guān)聯(lián)和序列 同一性百分?jǐn)?shù)，PILEP從一組相關(guān)的序列中產(chǎn)生多重序列比對。它也繪出顯 示用于產(chǎn)生比對的簇類關(guān)系的樹或系統(tǒng)樹(dendogram)。 PILEUP使用Feng 和Doolittle J. Mol. Evol. 35: 351-360, 1987的遞增的比對方法的簡化形式。 所用的方法與Higgins和Sharp, G45/OS5: 151-153， 1989描述的方法類似。 該程序可比對達(dá)300條序列，每一個最大長度為5,000個核苦酸或氨基酸。 多比對方法從兩個最相似的序列的兩兩比對開始，產(chǎn)生一簇兩條比對的序 列。隨后將這個簇與下一個最相關(guān)的序列或比對序列的簇進(jìn)行比對。通過兩 個單獨序列的兩兩比對的簡單延伸，比對序列的兩個簇。通過一系列遞增的 兩兩比對，實現(xiàn)最終的比對。通過指定具體的序列和它們的序列比較區(qū)域的 氨基酸和核苷酸坐標(biāo)，以及通過指定程序參數(shù)，來運行該程序。使用PILEUP, 將參考序列與其他的試驗序列比較，以測定序列同一性關(guān)系百分?jǐn)?shù)，使用下 列參數(shù)缺省空位權(quán)數(shù)(3.00),缺省空位長度權(quán)數(shù)(0.10),和加權(quán)的末端空 位?？蓮腉CG序列分析軟件包例如7.0版本(Devereaux等，M/c ^czV/s12: 387-395, 1984)獲得PILEUP。適宜多DNA和氨基酸比對的算法的另 一優(yōu)選的實例是CLUSTALW程 序(Thompson等，M/c爿"'(is22: 4673-4680, 1994)。 CLUSTALW進(jìn)行序列 組(groupsofsequences)間的多種配對比較，并且基于同源性，將它們聚集成 多種比對?？p隙開放和縫隙延伸罰分分別是10和0.05。對于氨基酸比對， 可將BLOSUM算法用作蛋白權(quán)數(shù)矩陣(Henikoff & Henikoff, TVa". 4cad t/.5H 89: 10915-10919, 1992)。"序列同一性"指氨基酸和核苷酸序列間相似性的測量，并且用本領(lǐng)域已知的方法如下文中所述的方法測量。在兩條或多條核酸或多肽序列的關(guān)系中，"相同的"或百分比"同 一性" 指兩條或多條序列或亞序列，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)中比較和比對最大相關(guān)性 時，其是相同的或具有相同氨基酸殘基或核苷酸的指定的百分比數(shù)(即在特定區(qū)內(nèi)60%同一性，優(yōu)選65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 ％、 97%、 98%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%或更多同一 性)，如使用下列序列比對算法或通過手工比對和可視的檢查所測量的。在兩種核酸或多肽中，"基本上相同"指兩條或多條序列或亞序列，當(dāng) 比較和比對最大相關(guān)性時，如使用下列序列比較算法或通過可視檢查所測量 的，其具有至少60°/。、通常至少70%、優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%或 至少95°/。核苷酸或氨基酸殘基同一性。優(yōu)選地，基本上相同存在于長度上是 至少50個堿基或殘基的序列區(qū)中，更優(yōu)選至少約100個堿基或殘基的區(qū)中， 并最優(yōu)選序列超過至少約150個堿基或殘基基本上相同。在最優(yōu)選的實施方 案中，序列遍及所有編碼區(qū)的長度是基本上相同的。兩條或多條核酸或多肽序列中的"同源性"和"同一性"指兩條或多條 序列或亞序列，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)比較和比對最大相關(guān)性時，其是相同的 或具有相同的氨基酸殘基或核苷酸的指定的百分比數(shù)，如使用許多序列比較 算法中的任何算法或通過手工比對和可視檢查所測量的。對于序列的比較， 一條序列可充當(dāng)參考序列(CD14或Toll樣受體4多核苷酸或多肽的實例性序 列)，試驗序列可與其進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將試驗序列和參 考序列登錄入計算機，如果需要，指定亞序列坐標(biāo)，且可指定序列算法程序 參數(shù)?？墒褂萌笔〕绦騾?shù)，或指定可供選擇的參數(shù)。隨后基于程序參數(shù)， 序列比較算法計算試-驗序列相對于參考序列的百分比序列同 一性。如本文中所用的"比較窗"包括涉及許多連續(xù)殘基的任一片段。例如， 在本發(fā)明可選的方面，將無論何處變化范圍從20至本發(fā)明的實例性多肽或 核酸序列如CD14或Toll樣受體4多核香酸或多肽的全長的連續(xù)殘基，與連 續(xù)位置相同數(shù)目的參考序列進(jìn)行比較，在這兩條序列任選地比對后。如果參 考序列與本發(fā)明的示例性多肽或核酸序列具有必不可少的序列同 一 性，如與 CD14或Toll樣受體4多核苷酸或多肽具有至少90%、 91°/。、 92%、 93%、94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多的序列同一性，那么該序列在本 發(fā)明的范圍內(nèi)?；?，其可使用上文程序進(jìn)行檢測，包括編碼亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-tum-helix)基元、糖基化位點、遍在蛋白化位點、a-螺旋構(gòu)型和卩-折疊片的序列；編碼信號肽的信號序列，該信號肽指導(dǎo)所編碼蛋白的分泌； 轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)中涉及的序列如同源框； 一段酸性序列、酶活性位點、底物結(jié)合 位點和酶切割位點。H. 計算機系統(tǒng)和計算機程序結(jié)果(computer systems and computer program products)為了在硅氧烷(silico)中測定和鑒定序列同一性、結(jié)構(gòu)同源性、基元等，在可由計算機閱讀和存取的任何介質(zhì)上，可進(jìn)行本發(fā)明的序列的儲存、記錄 或操作。因此，本發(fā)明提供了計算機、計算機系統(tǒng)、計算機可讀介質(zhì)、計算 機程序結(jié)果等，在那里記錄或儲存本發(fā)明的核酸和多肽序列。如本文中所用 的，單詞"記錄"與"儲存，，指在計算機介質(zhì)上儲存信息的過程。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可容易地采用任何已知的方法在計算機可讀介質(zhì)上記錄信息，以產(chǎn)生 含有本發(fā)明的 一 種或多種核酸和/或多肽序列的產(chǎn)品。本發(fā)明的另一方面是計算機可讀介質(zhì)，其具有在其上記錄的至少一條本 發(fā)明的核酸和/或多肽序列。計算機可讀介質(zhì)包括磁可讀介質(zhì)、光可讀介質(zhì)、 電子可讀介質(zhì)和磁/光介質(zhì)。例如，計算機可讀介質(zhì)可以是硬盤、軟盤、磁帶、CD-ROM、多功能數(shù)碼光盤(Digital Versatile Disk, DVD)、隨機存儲器 (Random Access Memory, RAM)或只讀存4諸器(Read Only Memory, ROM),以 及其他類型的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他介質(zhì)。如本文中所用的，術(shù)語"計算機，，、"計算機程序，，和"處理器"使用 其最廣泛的普通意思，并且合并所有的此類設(shè)備(devices)。抑制多肽和轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)本發(fā)明提供了與本發(fā)明的核酸序列互補的核酸(例如本發(fā)明核酸序列的 反義序列)。反義序列能抑制蛋白編碼基因(如CD14編碼核酸)的轉(zhuǎn)運、 剪接或轉(zhuǎn)錄。通過耙向基因組DNA或信使RNA,可實現(xiàn)抑制。例如，可通過雜交和/或切割來抑制靶標(biāo)核酸的轉(zhuǎn)錄或功能。本發(fā)明提供的 一組抑制劑包括寡核苷酸，其能結(jié)合基因或信息(message)，在任何一種情況下都防止或 抑制蛋白的產(chǎn)生或功能。結(jié)合可通過序列特異性的雜交。另一類有用的抑制 劑包括引起蛋白信息的失活或切割的寡核苷酸。寡核苷酸可具有導(dǎo)致此類切 割的酶活性，如核酶。可將寡核香酸進(jìn)行化學(xué)修飾或與能切割互補核酸的酶 或組合物結(jié)合。技術(shù)人員可針對許多不同的此類寡核苷酸的庫篩選具有所需 活性的那些寡核苷酸。使用反義、核酶技術(shù)和RNAi技術(shù)來調(diào)控基因表達(dá)的常規(guī)方法，或以這 種方式用于表達(dá)外源基因的基因治療方法的常規(guī)方法，在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知 的。這些方法中的每一種都利用了編碼本發(fā)明的磷酸酶多肽的反義或核酶轉(zhuǎn) 錄物的系統(tǒng)，如載體。術(shù)語"RNAi，，表示RNA干擾。該術(shù)語在本領(lǐng)域內(nèi)理 解為包括使用可以沉默基因的RNA分子的技術(shù)。參閱，例如McMans等, A^w陽i^v/ewsGe"幼'(^3: 737,2002。在本申請中，術(shù)語"RNAi，，包括分子 如短干擾RNA (siRNA)、微RNA (mRNA)、小時序RNA (stRNA)。 一般來說， RNA干擾產(chǎn)生于雙鏈RNA與基因的相互作用。.A.反義寡核苷酸本發(fā)明提供了能結(jié)合CD14信使RNA的反義寡核香酸，其通過靶向 mRNA,可抑制多肽的活性。設(shè)計反義寡核苷酸的策略充分描述于科學(xué)和專 利文獻(xiàn)中，使用本發(fā)明的新的試劑，技術(shù)人員可設(shè)計此類寡核苷酸。例如， 篩選有效反義寡核苷酸的基因步移(gene walking)/RAN作圖方法在本領(lǐng)域內(nèi) 是熟知的，參閱，例如Ho，MeAo^五"2jwo/314: 168-183,2000，描述了 RNA 作圖測定，其以標(biāo)準(zhǔn)的分子技術(shù)為基礎(chǔ)，為選擇有效的反義序列提供了便利 可靠的方法。也可參閱Smith, /尸/2^m. 11: 191-198， 2000?？捎锰烊淮嬖诘暮怂嶙鞣戳x寡核苷酸。反義寡核苷酸可以是任何長度， 例如，在可選的方面，反義寡核苷酸約5-100、約10-80、約15-60、約18-40。 通過常規(guī)篩選，可確定最佳長度。反義寡核苷酸可以任何濃度存在。通過常 規(guī)的篩選，可確定最佳濃度。多種合成的非天然存在的核苷酸和核酸類似物 是已知的，其可解決這種潛在的問題。例如可以使用含有非離子骨架(如 N-(2-氨乙基)甘氨酸單元)的肽核酸(PNAs)。也可使用具有硫代磷酸酯鍵的反義寡核苷酸，如下列文獻(xiàn)中所描述的WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, Toxz'co/ 4PpZ戶/zar附aco/. 144: 189-197, 1997;. Antisense Therapeutics, ed. Agrawal, Humanna Press, Totowa, N丄，1996。本發(fā)明提供的具有合成的DN A骨架類似物的反義寡核苷酸也包括二硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基磷酸酯、 烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3，-硫縮醛、亞曱基(甲基亞氨基)、3，-N-氨 基曱酸酯和嗎啉代氨基曱酸酯核酸(morpholino carbamate nucleic acids),如上 文所述。組合化學(xué)法可用于產(chǎn)生大量可快速篩選特異性寡核苷酸的寡核苷酸，該 特異性寡核苷酸對任何粑標(biāo)如本發(fā)明的有義多肽和反義多肽具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力和特異性(參閱，例如Gold, J所o/. C&m. 270: 13581-13584， 1995)。B. siRNA"小干護(hù)匸RNA(siRNA)"指約10-30個核菩酸長的RNA分子，因其通過 RNA干擾(RNAi)特異性地干擾蛋白表達(dá)的能力而命名。優(yōu)選地，siRNA分 子是12-28個核苷酸長，更優(yōu)選15-25個核苷酸長，更優(yōu)選19-23個核苦酸 長，最優(yōu)選21-23個核苷酸長。因此，優(yōu)選的siRNA分子在長度上是12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28或 29個核苷酸。RNAi是雙步機制。Elbashir等，Ge"^s Dev., 15: 188-200,2001。首先，由 已知是切酶的酶將長的dsRNAs切割得21-23核糖核苦酸(nt)片段，該片段稱 為小干擾RNA(siRNA)。隨后，siRNA與核糖核酸酶復(fù)合物(術(shù)語稱為RISC, RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)結(jié)合，該siRNA能將這種復(fù)合物把向于互補的 mRNA, RISC隨后切割在互補的siRNA對面的把標(biāo)mRNA，其使得mRNA 變得對其他的RNA降解途徑敏感。本發(fā)明的siRNA被設(shè)計與靶標(biāo)核糖核苷酸序列相互作用，意味著該 siRNA充分互補于耙標(biāo)序列，以與耙標(biāo)序列結(jié)合。本發(fā)明也包括經(jīng)過化學(xué)修 飾的siRNA分子，所述修飾賦予增強的抗核酸酶降解的穩(wěn)定性，但保留了 與可能存在的靶標(biāo)核酸結(jié)合的能力。C. 抑制性核酶本發(fā)明提供了能結(jié)合信息的核酶，該信息通過靶向mRNA抑制多肽的 活性，例如抑制具有CD14活性(例如TLR4信號傳導(dǎo)活性)的多肽。設(shè)計 核酶和選擇用于靶向的蛋白特異性反義序列的策略充分描述于科學(xué)和專利 文獻(xiàn)中，技術(shù)人員利用本發(fā)明的新的試劑，可設(shè)計此類核酶。核酶通過利用核酶的靼標(biāo)RNA結(jié)合部分與把標(biāo)RNA結(jié)合而起作用，該 結(jié)合部分與切割靶標(biāo)RNA的RNA的酶促部分保持緊密靠近。因此，核酶 通過互補的堿基配對，識別和結(jié)合耙標(biāo)RNA,并且一旦結(jié)合于正確的位點， 則酶促作用以切割和失活革巴標(biāo)RNA。如果切割發(fā)生在編碼區(qū)，以這種方式 切割RNA將破壞其指導(dǎo)所編碼的蛋白的合成的能力。在核酶已結(jié)合和切割 其RNA革巴標(biāo)后，其通常從該RNA中釋》丈，因此可以重復(fù)地結(jié)合和切割新 的靶標(biāo)。在某些情況下，核酶的酶特性優(yōu)于其他技術(shù)如反義技術(shù)(其中核酸分子 簡單地與核酸靶標(biāo)結(jié)合，以阻抑其轉(zhuǎn)錄、翻譯或與另一個分子的結(jié)合)，因 為實現(xiàn)治療所必需的核酶的有效濃度可低于反義寡核苷酸實現(xiàn)治療所必需 的濃度。這種潛在的優(yōu)勢反映了核酶的酶促能力。因此，單個核酶分子能切 割許多靶標(biāo)RNA分子。另外，核酶通常是高特異性抑制劑，抑制的特異性 不但依賴于結(jié)合的堿基配對機制，也依賴于分子抑制與其結(jié)合的RNA的表 達(dá)的機制。即，抑制是由RNA靶標(biāo)的切割引起的，因此將特異性定義為靶 標(biāo)RNA的切割速率與非乾標(biāo)的RNA的切割速率之比。因此，核酶作用的 特異性可以比結(jié)合相同RNA位點的反義寡核苦酸的更大。酶促核酶RNA分子可在垂頭狀模體中形成，但也可在發(fā)夾、丁型肝炎 病毒、I組內(nèi)含子、RNA酶P-樣RNA的模體(與RNA指導(dǎo)序列聯(lián)合)中形 成。此類垂頭4犬才莫體的實例由Rossi,爿/^s i ^searc/z <3"<ii/w 2<3" i ^rov/nw^s 8: 183， 1992描述；發(fā)夾模體由Hampel, Biochemistry 28: 4929, 1989和Hample, Nuc. Acids Res. 18: 299， 1990描述；丁型肝炎病毒才莫體由Perrotta， Biochemistry 31: 16， 1992描述；RNA酶模體由Guerrier-Takada， Cell 35: 849， 1983描述，以及I組內(nèi)含子由Cech美國專利號4,987,071描述。敘述這些 具體的模體并非是進(jìn)行限制；本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，本發(fā)明的酶促RNA分子具有與一個或多個靶標(biāo)基因RNA區(qū)互補的特異性底物結(jié)合位點，并且具有在該底物結(jié)合位點內(nèi)的或圍繞該底物結(jié)合位點的核苷酸序列，該核^列賦予所述分子以RNA切割活性。 治療方法本文中也描述了治療受治療者的預(yù)防和治療方法，該受治療者患有或有 風(fēng)險(或易于)患有與不良的Toll樣受體4表達(dá)或活性有關(guān)的病癥。預(yù)防方法本發(fā)明涉及，通過為受治療者施用調(diào)節(jié)經(jīng)由Toll樣受體4、 Tram/Trif 或CD14的信號傳導(dǎo)的制劑，防止該受治療者與不希望量的Toll樣受體4表 達(dá)或活性有關(guān)的疾病或病狀的方法。通過例如本文中所述的或本領(lǐng)域內(nèi)已知 的診斷或預(yù)示測定的任何組合，可鑒定處于由Toll樣受體4或CD14介導(dǎo)的 信號傳導(dǎo)所引起或促成的疾病或不良癥狀風(fēng)險中的受治療者。通常，此類病 癥涉及先天免疫系統(tǒng)的不良激活，例如細(xì)胞因子(如TNF-a)的不良誘導(dǎo)。 作為預(yù)防劑的物質(zhì)的施用可發(fā)生于癥狀表現(xiàn)之前，與缺乏制劑時候的癥狀比 較，以便防止、延遲或減少癥候。在某些實施方案中，制劑降低了 Toll樣 受體4與CD14和/或TRAM/Trif的結(jié)合。在某些實施方案中，制劑減少了 配體與Toll樣受體4、 CD14和/或TRAM/Trif的結(jié)合?；诒疚闹兴龅暮Y 選測定，可鑒定適當(dāng)?shù)闹苿?。通常，此類制劑特異性地與Toll樣受體4、 CD14 和/或TRAM/Trif結(jié)合。治療方法本發(fā)明的另一方面涉及用于治療目的TLR4、 CD14或TRAM/Trif表達(dá) 或活性的方法。所述方法包括將細(xì)胞與制劑接觸，該制劑調(diào)節(jié)一個或多個與 該細(xì)胞有關(guān)的Toll樣受體4和/或CD活性的活動，例如，特異性地與CD14 結(jié)合并抑制經(jīng)由Toll樣受體4的信號傳導(dǎo)。制劑可以是化合物，所述化合 物特異性地與Toll樣受體4結(jié)合并選擇性地激活或抑制細(xì)胞中被在脂多糖 誘導(dǎo)的TNF-a活性，或激活或抑制巨噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒或狂犬病病 毒的應(yīng)答。制劑可以是抗體或蛋白、Toll樣受體4蛋白的天然存在的同源配 體(cognate ligand)、肽、Toll樣受體4或CD14的擬肽、小的非核酸有4幾分 子或小的無機分子。這些調(diào)節(jié)方法可在體外進(jìn)行(例如通過用制劑培養(yǎng)細(xì) 胞)，或可選地，在體內(nèi)進(jìn)行(例如通過向受治療者施用制劑)。本發(fā)明提供了治療受疾病或病癥侵襲的個體的方法，該疾病或病癥特征為Toll樣受體4蛋白的不良表達(dá)或活性，例如不良的細(xì)胞因子活性，例如 TNF-a。在一實施方案中，所述方法包括施用增加或減少經(jīng)由Toll樣受體4 的信號傳導(dǎo)的制劑(如通過本文所述的篩選測定鑒定的制劑)或制劑的組合。 可由該制劑治療的病狀包括其中受治療者表現(xiàn)出先天免疫系統(tǒng)的不良激活 (如不良的炎癥)的那些疾病?？捎尚碌姆椒ê徒M合物治療的其他病癥包4舌真菌感染、膿血癥(sepsis)、 細(xì)胞肥大病毒感染、肺結(jié)核、骨吸收(如在牙周疾病中)、關(guān)節(jié)炎(如萊姆關(guān) 節(jié)炎有關(guān)的)和病毒性肝炎。干擾經(jīng)由Toll樣受體4的信號傳導(dǎo)(如通過結(jié) 合CD14)的化合物也可用于選擇性控制炎性反應(yīng)中的細(xì)胞因子生成，例如， 應(yīng)答微生物(如分枝桿菌)感染而產(chǎn)生的那些細(xì)胞因子。通過用以抑制CD14與Toll樣受體4的結(jié)合或抑制配體與Toll樣受體4 復(fù)合物的結(jié)合的技術(shù)，可實現(xiàn)對有關(guān)先天免疫系統(tǒng)的不良激活如不良的炎癥 反應(yīng)的病癥的成功治療。例如，證明顯示了負(fù)調(diào)節(jié)活性的化合物(如使用本 文所述的測定法鑒定的制劑，如抗體)可用于防止和/或改善不良的CD14 或Toll樣受體4活性引起的病癥的癥狀。此類分子包括但不限于肽、磷酸 肽、小的有機或無機分子或抗體(包括，例如單克隆抗體、多克隆抗體、人 源化抗體、抗獨特型抗體、嵌合抗體或單鏈抗體和Fab和F(ab，)2表達(dá)文庫 片段、scFV分子和其表位結(jié)合片段)。特別是，特異性地與Toll樣受體4 結(jié)合并可激活或抑制細(xì)胞中由脂多糖誘導(dǎo)的TNF-a活性或者激活或抑制巨 噬細(xì)胞對水泡性口炎病毒或狂犬病病毒的應(yīng)答的抗體和其衍生物(例如，其 抗原結(jié)合片段)。試劑盒本發(fā)明提供了含有組合物例如本發(fā)明核酸、表達(dá)盒、載體、細(xì)胞、多肽 (如CD14多肽或TRAM/Trif信號激活多肽或Toll樣受體4信號激活多肽) 和/或抗體的試劑盒。試劑盒也可含有講授本發(fā)明的方法和用途的非結(jié)構(gòu)性 物質(zhì)，如本文中所述的。治療應(yīng)用此,本發(fā)明提供了治療自身免疫病、感染性疾病、Toll樣受體4信號傳導(dǎo)缺 陷或CD細(xì)胞缺陷的組合物和方法。示例性的自身免疫病是急性特發(fā)性血小板減少性紫癥、慢性特發(fā)性血小 板減少性紫癜、皮肌炎(dermatomycositis)、西德納姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼疳、狼癡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺體綜合 癥、大皰性類天皰瘡、糖尿病、過敏性紫斑(Henoch-Schonlein Purpura)、后 鏈球菌腎炎(post-streptococcalnephritis )、結(jié)節(jié)性紅斑、多發(fā)性大動脈炎 (Takayasu's arteritis),腎上腺皮質(zhì)功能不全、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、 肉樣瘤(sarcoidosis)、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動 脈炎、僵直性脊推炎、肺出血腎炎綜合癥、thromboangitisubiterans、干燥綜 合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎、曱狀腺毒癥、硬皮病、慢性活 動性肝炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、pamphigus vulgaris,韋格納肉 芽腫、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓癆、巨細(xì)胞動脈炎/多肌痛、 pemiciousanemia、急進(jìn)性腎小球腎炎和纖維性肺泡炎。示例性的感染性疾病包括但不限于病毒性疾病或細(xì)菌性疾病。本發(fā)明的 多肽或多核苷酸可用于治療或4全測感染性物質(zhì)。例如，通過增加免疫應(yīng)答， 特別是增加B和/或T細(xì)胞的增殖和分化，可治療感染性疾病。通過提高現(xiàn) 有的免疫應(yīng)答或通過激發(fā)新的免疫應(yīng)答，可增加免疫應(yīng)答。可選地，本發(fā)明 的多肽或多核苷酸也可直接抑制感染性物質(zhì)，而無需引起免疫應(yīng)答。病毒是感染性物質(zhì)的一實例，其可引起可由本發(fā)明的多肽或多核苷酸治 療或檢測的疾病或癥狀。病毒的實例包括但不限于下列DNA和RNA病毒 科蟲Jf某病毒(Arbovirus )、腺病毒科(Adenoviridae)、 沙狀病毒科 (Arenaviridae)、動l^炎病毒(Arterivirus)、雙RNA病毒科(Bimaviridae)、布尼 病毒科(Bunyaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)、圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、 冠^)犬病毒矛牛(Coronaviridae)、黃病毒f牛(Flaviviridae)、肝病毒牙牛(Hepadnaviridae) (肝炎)、皰滲病毒科(Herpesviridae)(如細(xì)胞肥大病毒、單純皰滲(Herpes Simplex)、 帶4犬痕滲(herpes zoster)) 、 (Mononegavirus)( ^口副凈占病毒牙牛 (Paramyxoviridae)、麻滲病毒、^M犬病毒科(Rhabdoviridae))、正粘、液病毒考牛 (Orthomyxoviridae)(如流感病毒)、乳頭瘤狀病^^牛(Papovaviridae)、細(xì)小病毒 科(Parvoviridae)、 小RNA病毒科(Picomaviridae)、 (Poxyiridae)(如天花、牛痘)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)(如輪狀病毒)、反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae) (HTLV-I、 HTLV-II、慢病毒載體(lentivirus))和披蓋病毒科(Togaviridae)(如風(fēng) 疹病毒屬(Rubivirus))。屬于這些科的病毒可引起多種疾病和癥狀，包括但不 限于關(guān)節(jié)炎、細(xì)支氣管炎(bronchiollitis)、腦炎、眼部感染(如流行性急性 結(jié)膜炎、角膜炎)、慢性疲勞綜合癥、肝炎(甲型、乙型、丙型、戊型肝炎， 急慢性肝炎，丁型肝炎)、腦膜炎、機會感染(如AIDS)、肺炎、伯基特淋巴 瘤、水痘(chickenpox)、出血熱、麻滲(Measles)、流行性腮腺炎(Mumps)、副 流感、狂犬病、普通感冒、脊髓灰質(zhì)炎、白血病(leukemia)、風(fēng)疹、性傳播 疾病、皮膚病、卡波西肉瘤(Kaposi's warts)和病毒血癥。本發(fā)明的多肽或多 核苷酸可用于治療任何這些癥狀或疾病。同樣，可引起疾病或癥狀并且可由本發(fā)明的多核苷酸或多肽治療或檢測 的細(xì)菌或真菌物質(zhì)，包括但不限于下列革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性細(xì)菌科和 真菌放線菌目(勿/"om戸to/^s) (e.g.,棒狀桿菌屬(Co，eZ^cten'wm)、 分枝 斥干菌屬(Afyco6acfer/w附)、"i若卡氏菌屬(iVorcaniZ"》、曲霉屬(^5pgrg77/cw&)、芽 胞桿菌科(Bacz7/flceae)(如炭疽(Anthrax),梭菌屬(C/oWn^wm))、擬桿菌科 (丑acterazV/aceae)、 芽生菌C6/ostomyca^)、鮑特氏菌屬(5orcfete〃fl)、螺旋體 屬C8orre//a),布魯氏菌(Brace/ZowS)、 念珠菌病(Caw&Wa^)、 彎曲菌屬 (Camp_y/o6ac—、球霉菌癥(Coccidioidomycosis)、隱球菌病(Cryptococcosis)、 Dermatocycoses 、腸桿菌科(五她ratetehaceae)(克雷伯氏菌屬(^/血!W/o:)、 沙門氏菌屬(5^/附0^//0)，沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia))、丹 毒絲菌屬(Erysipelothrix)、螺i走4干菌屬(//e/z'co^c&r)、軍團(tuán)病(Legionellosis)、 鉤端螺旋體病(Leptospirosis)、 李斯特菌屬(Listeria)、 支原體目 (Mycoplasmatales)、 奈瑟氏5求菌科(Neisseriaceae)(如不動桿菌屬 (Acinetobacter)、淋病(Gonorrhea)、 Menigococcal)、巴斯德菌感染(如放線桿 菌屬(勿/"ote/to)、嗜血桿菌屬(Zfe3,pMw51)、 巴氏桿菌屬(尸a他臟〃a》、 假單胞菌屬(尸"w^ wowoy)、立克次氏體科(Rickettsiaceae)、 衣原體科 (Chlamydiaceae)、 4每毒(Syphilis)和葡萄球菌(Staphylococcal),這些細(xì)菌或真 菌科可引起下列疾病或癥狀，包括但不限于菌血癥、心內(nèi)膜炎、眼部感染 (流行性急性結(jié)膜炎、肺結(jié)核、葡萄膜炎)、齦炎、機會感染(如AIDS相關(guān)的 感染)、甲溝炎(paronychia)、假肢相關(guān)的感染(prosthesis-related infections)、Reiter疾病(Reiter's Disease)、呼吸道感染如百日咳或膿胸(Empyema)、膿血 癥、萊姆病(Lyme Disease)、貓4爪病(Cat-ScratchDisease),痢疾、副傷寒、食 物中毒、傷寒、肺炎、淋病、腦膜炎、衣原體(Chlamydia)、梅毒、白喉、麻 風(fēng)病、副結(jié)核病、肺結(jié)核、狼皰、肉毒桿屬中毒(Botulism)、壞疽、破傷風(fēng)、 膿皰病(impetigo)、風(fēng)濕熱、猩紅熱、性傳播疾病、皮膚病(如蜂窩織炎、 dermatocycoses)、毒血癥、尿道感染、傷口感染。本發(fā)明的多肽或多核苷酸 可用于治療任何這些癥狀或疾病。而且，引起可由本發(fā)明的多核香酸或多肽治療或檢測的疾病或癥狀的寄 生物包括，但不限于下列科阿米巴(Amebiasis)、巴貝蟲(Babesiosis)、球蟲 (Coccidiosis)、隱孑包子蟲(Cryptosporidiosis)、 Dientamoebiasis、媾疫(Dourine)、 Ectoparasitic 、 賈第鞭毛蟲(Giardiasis)、蠕蟲(Helminthiasis)、 利什曼 (Leishmaniasis)、泰勒氏梨漿蟲(Theileriasis)、弓形體(Toxoplasmosis) 、 4,蟲 (Trypanosomiasis)和滴蟲(Trichomonas)。這些寄生蟲可引起多種疾病，包括 但不限于濟(jì)瘡、恙螨病、眼部感染、腸疾病(如痢疾、賈第鞭毛蟲病)、肝 病、肺病、機會感染(如AIDS相關(guān)的)、疾疾、妊娠合并癥和弓形體病。本 發(fā)明的多肽或的核苷酸可用于治療或檢測任何這些癥狀或疾病。優(yōu)選，使用本發(fā)明的多肽或的核苦酸可通過向患者施用有效量的多肽， 或通過從患者移除細(xì)胞、提供細(xì)胞本發(fā)明的多肽并將改造的細(xì)胞返還至患者 (體外治療)。而且，本發(fā)明的多肽或多核苷酸可用作疫苗中的抗原，增加針 對感染性疾病的免疫應(yīng)答。藥物組合物的配置和施用本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的核酸、肽和多肽(包括抗體)的藥物組合物。 如上文中所討-論的，本發(fā)明的核酸、肽和多肽可用于抑制或激活內(nèi)源性CD14 多肽。此類細(xì)胞或非人類動物中的抑制可產(chǎn)生篩選模式(screening modality)， 用于鑒定治療或改善自身免疫病、抗原呈遞細(xì)胞缺陷或CD14細(xì)胞缺陷的化 合物。向受治療者施用本發(fā)明的藥物組合物，用于在受治療者中產(chǎn)生耐受原 'l"生免疫環(huán)境(toleragenic immunological environment)。這可用于4吏受治療者對 抗原耐受。可將本發(fā)明的核酸、肽和多肽與藥學(xué)上可接受的載體(賦形劑)組合，以形成藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體可含有生理上可接受的化合物，例如， 其作用以穩(wěn)定、增加或P條低本發(fā)明的藥物組合物的吸收或清除速率。生理上可接受的化合物可包括例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧 化劑，如抗壞血酸或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白，減少肽或多肽的清 除或水解的組合物，或賦形劑或其他的穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。去垢劑，包括 脂質(zhì)體載體，也可用于穩(wěn)定、增加或降低藥物組合物的吸收。肽和多肽的藥 學(xué)上可接受的載體和制劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且詳細(xì)描述于 科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，參閱例如Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton， Pa. ("RemingtonV')的最l斤版本。其他的藥學(xué)上可接受的化合物包括潤濕劑、乳化劑、分散劑或特別用于 防止微生物的生長或作用的防腐劑。多種防腐劑是熟知的，包括例如酚和抗 壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，選擇藥學(xué)上可接受的載體(包括生理上 可接受的化合物)，依賴于例如本發(fā)明的肽或多肽的給藥途徑和其具體的生 理化學(xué)特性。一方面，將本發(fā)明的核酸、肽或多肽的溶液溶解于藥學(xué)上可接受的載體 中，例如，當(dāng)組合物是水溶性時的水載體?？捎糜谀c內(nèi)、胃腸外或經(jīng)粘膜藥 物送遞的制劑的水溶液的實例包括，例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、Hanks 溶液、林格溶液、葡萄糖/鹽水、葡萄糖溶液等。制劑可含有如接近生理條 件所要求的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑(tonicity adjusting agents)、濕潤劑、去污劑等。添加劑還可包括附加的活性成分，如 殺菌劑或穩(wěn)定劑。例如，溶液可含有醋酸鈉、乳酸納、氯化鈉、氯化鉀、失 水山梨醇月桂酸酯(sorbitan monolaurate)或三乙醇胺油酸酯(triethanolamine oleate)。通過常規(guī)的熟知的滅菌技術(shù)，可將這些化合物滅菌，或可進(jìn)行無菌 過濾。可將所得的水溶液包裝使用，或冷凍干燥，在施用前，將凍干的制劑 與無菌的水溶液組合。在這些制劑中肽的濃度可有;f艮大變化，并且依照所選 的具體給藥模式和患者的需要，基于流體體積、粘度、體重等來選擇肽的濃 度。固體制劑可用于腸內(nèi)(口服的)施用?？蓪⑺鼈兣渲瞥伤幫琛⑵瑒?、粉劑 或膠嚢。對于固體組合物，可使用常規(guī)的無毒固體載體，包括例如藥物級 的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、水楊酸鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對于口服施用，通過混合任何常規(guī)使用的賦形劑(如上文列舉的那些)以及通常10%-95%的活性成分(如肽)，來形成藥學(xué)上可接受的無 毒組合物。非固體制劑也可用于腸內(nèi)施用。載體可從各種油中選擇，包括石 油、動物、植物或合成來源的那些油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油 等。適宜的藥學(xué)上的賦形劑包括如淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗 糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單油酸 甘油酯、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇。本發(fā)明的核酸、肽或多肽，當(dāng)口服施用時，可進(jìn)行保護(hù)以避免消化。這 可通過將本發(fā)明的核酸、肽或多肽與使它們抗酸解和酶解的組合物復(fù)合或通 過將核酸、肽或多肽包裝于適當(dāng)?shù)目剐暂d體如脂質(zhì)體中實現(xiàn)。保護(hù)化合物免 受消化的方式在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，參閱例如Fix，P/2armA仏13: 1760-1764, 1996; Samanen， /尸/^w/aco/. 48: 119-135, 1996;美國專利號5,391,377 描述了用于口服送遞治療劑的脂質(zhì)組合物(脂質(zhì)體送遞在下文中進(jìn)一步詳細(xì) 討論)。全身給藥可通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚的方式。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮膚施用，適 于穿過屏障的滲透劑可用于制劑中。此類滲透劑在本領(lǐng)域內(nèi) 一般是已知的，包括例如，對于經(jīng)粘膜施用，膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。另外，滲透劑科用 于促進(jìn)透過。經(jīng)粘膜施用可經(jīng)由鼻噴霧劑或使用栓劑。參閱例如Sayani， 及ev. T7zer Z>wg O^r/w13: 85-184， 1996。對于局部的經(jīng)皮膚施用，可將 制劑配制成軟膏、乳劑、藥膏(salves)、粉劑和凝膠劑。也可以持續(xù)送遞或持續(xù)釋放機制施用本發(fā)明的核酸、肽或多肽，該機制 可體內(nèi)送遞制劑。例如，能持續(xù)送遞肽的生物可降解微球體或膠嚢或其他的 生物可降解多聚體配置可包括于本發(fā)明的制劑中(參閱例如Putney, 5/ofec/z"o/. 16: 153-157, 1998)。對于吸入，可使用本領(lǐng)域已知的任何體系送遞本發(fā)明的核酸、肽或多肽， 所述體系包括干粉氣溶膠、液體送遞體系、空氣噴射霧化器、推進(jìn)劑體系等。 參閱例力口 Patton, S/o/ec/zm々was 16: 141-143, 1998，例^口 Dura Pharmaceuticals (San Diego， Calif.)， Aradigrn (Hayward， Calif.), Aerogen (Santa Clara， Calif.)， Inhale Therapeutic Systems(San Carlos, Calif.)等的用于多肽大分子的產(chǎn)品和吸入送遞體系。例如，可以氣溶膠或霧劑(mist)的形式施用藥物制劑。對于 氣溶膠施用，可以精細(xì)分離的形式連同表面活性劑和推進(jìn)劑 一起提供制劑。 在另一方面，將制劑送遞至呼吸組織的裝置是吸入器，制劑在該吸入器中蒸 發(fā)。其他的液體送遞體系包括例如空氣噴射霧化器。在制備本發(fā)明的藥物中，可使用和操作多種制劑修飾，以改變藥物動力 學(xué)和生物分布。改變藥物動力學(xué)和生物分布的許多方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員而言是已知的。此類方法的實例包括在由物質(zhì)如蛋白、脂質(zhì)(如脂質(zhì)體， 參閱下文)、碳水化合物或合成聚合物(見上文的討論)中保護(hù)本發(fā)明的組合 物。有關(guān)藥物動力學(xué)的一般討-淪，參閱例如Remington的37-39章。本發(fā)明的核酸、肽或多肽可本領(lǐng)域已知的任何方式單獨或作為藥物組合 物送遞，所述方式如全身地、區(qū)域性地或局部地(如直接進(jìn)入或定位于腫 瘤)；通過動脈內(nèi)的、鞘內(nèi)(IT)、靜脈內(nèi)(IV)、胃腸外、胸膜腔內(nèi)、表面、口 服或局部施用，皮下、氣管內(nèi)(如通過氣溶膠)或經(jīng)粘膜(如口腔、膀胱、陰道、 子宮、直腸、鼻粘膜)。制備可施用組合物的實際方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員 而言是已知的或顯而易見的，并且詳細(xì)描述于科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，參閱，例 如Remington的文獻(xiàn)。對于"區(qū)域作用(regional effect)",例如集中于具體器 官， 一種施用模式包括動脈內(nèi)或鞘內(nèi)(IT)注射，以便例如集中于具體的器官， 如腦和CNS(參閱例如Gurun， X"eW/z爿"a/g. 85: 317-323, 1997)。例如，對于 期望將本發(fā)明的核酸、肽或多肽直接送遞至腦的情況，如果優(yōu)選，則進(jìn)行頸 動脈內(nèi)注射。如果需要高的全身劑量，胃腸外施用是優(yōu)選的送遞途徑。制備 可胃腸外施用的組合物的實際方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的或顯 而易見的，并且詳細(xì)描述于例如Remington的文獻(xiàn)，也可參閱Bai, / A^wra/附ww"o/. 80: 65-75， 1997;『w""， A^"ro/. <SW. 152: 31-38， 1997; Tonegawa, /Md 186: 507-515, 1997。一方面，可將含有本發(fā)明的核酸、肽或多肽的藥物制劑合并至脂單層或 雙層中，例如脂質(zhì)體，參閱例如美國專利號6,110,490; 6，096，716; 5,283,185; 5,279,833。本發(fā)明也提供了將本發(fā)明的核酸、肽或多肽附著于所述單層或雙 層的表面的制劑制劑中，已。例如，可將肽附著于含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂?；?乙醇胺的脂質(zhì)體(參閱例如Zalipsky，CTzew. 6: 705-708, 1995)?？墒褂弥|(zhì)體或任何形式的脂質(zhì)膜，如平面脂質(zhì)膜或完整細(xì)胞(如紅細(xì)胞)的細(xì)胞膜。脂質(zhì)體制劑可用任何方式施用，包括靜脈內(nèi)、經(jīng)皮膚(參閱例如Vulta，J尸/7arw.5W. 85:5-8, 1996)、經(jīng)粘膜或口服施用。本發(fā)明也提 供了將本發(fā)明的核酸、肽和/或多肽合并于微粒(micelles)和/或脂質(zhì)體中藥物 制劑(參閱，例如Suntres， P/zwm.尸/^rmaco/. 46: 23-28, 1994; Woodle， 戶/^m. i 饑9: 260-265， 1992)。脂質(zhì)體和脂質(zhì)體制劑可才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法可制 備，并且在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，參閱例如Remington的文獻(xiàn)，Akimaru, Qvtoh"esMo/ 7Tzer 1: 197-210， 1995; Alving,/wmw"o/.及ev. 145: 5-31， 1995; Szoka，i ev.所qp/7".9: 467, 1980,美國專利號4， 235,871, 4,501,728和4,837,028。在一個實施方案中，用防止化合物從體內(nèi)快速排出的載體制備活性化合 物，如包括植入和微嚢送遞體系的控制釋放制劑。可使用生物可降解的生物 相容性聚合物，如乙烯-醋酸乙烯、聚乙醇酸、膠原、聚正酯(polyorthoesters) 和聚乳酸。制備此類制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的?？蓮?Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.購買才才泮十。也可將月旨質(zhì)體懸浮 液(包括靶向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體和抗病毒抗原的單克隆抗體)用作藥學(xué)上可 接受的載體。可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備這些載體，如描述于 美國專利號522,811中的方法。為便于施用和統(tǒng)一劑量，以劑量單位形式配制口服或胃腸外組合物是有 利的。本文中所用的劑量單位形式指物理上分離的單位，適宜作為待治療的 受治療者的單位劑量；每一單位含有預(yù)定量的活性化合物和所需的藥物載 體，經(jīng)計算，所述預(yù)定量的化合物將產(chǎn)生期望的治療作用。通過標(biāo)準(zhǔn)的藥物方法，可在細(xì)胞培養(yǎng)物或試一驗動物中測定此類化合物的 毒性和治療功效，如測定LD5。(半數(shù)致死劑量)和ED5。(半數(shù)治療有效劑量)。 毒性和治療作用之間的劑量比是治療指數(shù)，并可表達(dá)為LD5o/EDso的比。優(yōu) 選顯示高治療指數(shù)的化合物。雖然可使用顯示了毒性副作用的化合物，但應(yīng) 小心設(shè)計送遞體系，該體系將此類化合物靶向于受感染的組織，以便將對未 感染的細(xì)胞的損害降至最低，從而減少副作用。量范圍。此類化合物的劑量優(yōu)選位于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該循環(huán)濃度包括具有幾乎沒有或沒有毒性的ED5。。根據(jù)使用的劑量形式和采用的施用途徑，劑 量可在此范圍內(nèi)變化。對于用于本發(fā)明的方法中的任何化合物，可根據(jù)細(xì)胞 培養(yǎng)測定，對治療上有效的劑量進(jìn)行最初的估計?？稍诶缪装Y或涉及不期 望的炎癥的病癥的動物模型中配制劑量，以實現(xiàn)循環(huán)血漿濃度范圍，該濃度 范圍包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中所測定的IC5o (即實現(xiàn)癥狀半數(shù)抑制的試驗化合物 的濃度)。此類信息可用于更準(zhǔn)確地確定人類中的可用劑量。例如，可通過 高效液相色譜測定通常為標(biāo)記制劑的血漿濃度?？捎糜谘芯咳缗R床前方案的 動物模型在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如，用于炎癥病癥的動物模型，如 Sonderstrup (Springer, 6"ewi /mmMwo/ aAo/. 25: 35-45, 2003)和Nikula等(/w/za/. 7bx/co/. 4(12): 123-53， 2000)所描述的，以及本領(lǐng)域中所知的那些，例如用于 真菌感染、膿血癥、細(xì)胞肥大病毒、結(jié)核病、病毒肝炎和感染(例如由分枝 桿菌引起)。如本文中所定義的，蛋白或多肽如抗體的治療上有效的量在約0.001-30 mg/kg體重內(nèi)變化，例如約0.01-25 mg/kg體重、約0.1-20 mg/kg體重，或約 1-10 mg/kg體重、2-9 mg/kg體重、3-8 mg/kg體重、4-7 mg/kg體重或5-6 mg/kg 體重?？稍诩s1至10周內(nèi)(例如，2至8周內(nèi)，3至7周內(nèi)，或者約4、 5 或6周)每天一次或幾次或每周一次或幾次施用.蛋白或多肽。在某些情況下， 可在幾個月或更長時間需要劑量。技術(shù)人員可以理解某些因素可影響有效治療受治療者所需要的劑量和周期，所述因素包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重 度、以前的治療、受治療者的總體情況和/或年齡以及存在的其他疾病。而 且，以治療有效量的制劑如蛋白或多肽(包括抗體)治療受傷者可包括單獨治 療，或優(yōu)選包括一系列治療。對于抗體，劑量通常是O.l mg/kg體重(如10 mg/kg-20 mg/kg)。部分人 抗體和完全人抗體通常比其他抗體在人類中具有更長的半衰期。因此，較低 劑量和較少頻率使用通常是可能的。修飾如脂質(zhì)化可用于穩(wěn)定抗體和增加吸 收和組織滲透(例如進(jìn)入腦)。脂質(zhì)化抗體的方法描述于Cruikshank等，《/ Jc《wz>W /附mwwe 6j)Wrawes i/wmaw i 欲ovzWogy, 14: 193，1997。本發(fā)明包括通過調(diào)節(jié)經(jīng)由Toll樣受體4或CD的信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)TNF-a 的表達(dá)或活性的制劑或化合物。制劑可以是例如小分子。此類小分子包括但不限于肽、擬肽類(如類肽)、氨基酸、氨基酸類似物、分子量小于約10,000g/摩爾的非核酸有機化合物或無機化合物(即包括異質(zhì)有機和有機金屬化合物)、分子量小于約5,000 g/摩爾的有機或無機化合物、分子量小于約1000 g/ 摩爾的有機或無機化合物、分子量小于約500g/摩爾的有機或無機化合物和 這些化合物的鹽、酯以及其他藥學(xué)上可接受的形式。示例性的劑量包括毫克或微克量的小分子/千克的患者或樣品重量(如約 l微克/千克至約500微克/千克，約100微克/千克至約5毫克/千克，或約l -微克/千克至約50微克/千克)。還可理解，對于將要調(diào)節(jié)的表達(dá)或活性，小 分子的適當(dāng)劑量依賴于小分子的效價。當(dāng)一種或多種這些小分子施用于動物 (如人類)以便調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽或核酸的表達(dá)或活性時，醫(yī)師、獸醫(yī)或研究 人員可例如首先開相對低劑量的處方，隨后增加劑量，直到獲得適當(dāng)?shù)膽?yīng)答。 另外，可以理解任何特定動物受治療者的具體劑量水平依賴于多種因素，包 括具體施用的化合物的活性，受治療者的年齡、體重、總體健康、性別和飲 食，施用時間，施用途徑，排泄速率，任何藥物組合和將要調(diào)節(jié)的表達(dá)或活 性的程度。可例如共價和/或用連接體將抗體或其片段連接于另 一個治療部分如治 療劑或放射性金屬離子，以形成共輒物。治療劑包括但不限于抗生素(如更 生霉素(過去稱為放線菌素))、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)。本文中所述的共軛物可用于調(diào)節(jié)給定的生物應(yīng)答。例如，結(jié)合至抗體的 部分可是擁有期望的生物活性的蛋白或多肽。此類蛋白包括例如毒素，如 相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假單胞外毒素或白喉毒素；蛋白，如腫瘤壞死 因子、a-干擾素、p-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板^f汙生的生長因子、組織 纖維蛋白溶酶原激活劑；或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物?？蛇x地，可將抗體結(jié)合于第二抗體，以形成如由Segal(美國專利號 4，676,980)所述的抗體異質(zhì)共輒物(antibody heteroconjugate)?？蓪⑺幬锝M合物與施用說明書一起包括于容器、包裝或分配器中。 通常將藥物組合物為配制成無菌的、大致等滲的，并且完全服從美國食 品藥品管理局的良好藥物生產(chǎn)(GMP)規(guī)則。治療方案藥物動力學(xué)根據(jù)施用方法，可以多種單位劑量形式施用本發(fā)明的藥物組合物。通常 的核酸、肽和多肽藥物組合物的劑量對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。此類劑量通常實際上是建議性的，并且^L據(jù)患者的具體治療環(huán)境、患者的耐受性 等而進(jìn)行調(diào)整。足以實現(xiàn)此目的的核酸、肽或多肽的量定義為"治療上有效 的劑量"。有效用于此用途的劑量日程和量，即"劑量方案"將依賴于多種因 素，包括疾病或生理狀況的階段，疾病或生理狀況的嚴(yán)重度，患者健康的總 體狀態(tài)、患者的生理狀態(tài)、年齡、活性制劑的藥物制劑和濃度等。在制定患 者的劑量方案時，也考慮給藥模式。劑量方案也必須考慮藥物動力學(xué)，即藥 物組合物的吸收速率、生物利用率、代謝、清除等。參閱，例如最新的Remigton 的文獻(xiàn)；Egleton， i^/ "cfes 18: 1431-1439， 1997; Langer, 5We"ce 249: 1527-1533， 1990。在治療應(yīng)用中，以足以至少部分治療生理狀況或疾病和/或其并發(fā)癥的 量，將組合物施用于遭受自身免疫病、感染性疾病、抗原呈遞細(xì)胞缺陷或 CD14缺陷的患者。例如， 一方面，可使在幾個小時內(nèi)(通常1、 3或6個小 時)，施用約0.01 mg/hr-約1.0 mg/hr的用于靜脈內(nèi)(IV)施用的可溶性肽藥物 組合物劑量，其可間歇循環(huán)地重復(fù)幾周?？墒褂酶吆芏嗟膭┝?如達(dá)到約10 mg/ml)，特別是將藥物施用于隱蔽的位點而并不進(jìn)入血流時，如進(jìn)入體腔或 進(jìn)入器官的內(nèi)腔，如腦脊髓液(cerebrospinal fluid, CSF)中。僅出于解釋的目的，提供了實施本發(fā)明的具體的實施方案的下列實施 例，這些實施例并無意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在此引用的所有出版物、專利和專利申請的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合入本文。
具體實施方式
實施例1Heedless突變transmissible recessive繁殖Heedless以產(chǎn)生純合原種，Heedless為在G3動物中鑒定的可傳遞 的隱性LPS-高應(yīng)答表型。在應(yīng)答來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌的光滑LPS化學(xué)型 而不是粗糙LPS化學(xué)型或脂質(zhì)時發(fā)生突變，以抑制TNF的產(chǎn)生(圖la-c)。該突變還部分減少了對TLR2-TLR6配體的應(yīng)答(圖ld-h)，所述TLR2-TLR6 配體包括合成的二?；木奘杉?xì)胞激活脂肽-2(MALP-2; R立體異構(gòu)體的減 少>S立體異構(gòu)體)和Pam2CSK4以及高純化的脂磷壁質(zhì)和酵母聚糖A。對 Pam3CSK4 (—種TLR2-TLR1配體)和對其他已知TLR配體如Resiquimod (TLR7)、 polylC(TLR3)和CpG(TLR9)的應(yīng)答是正常的(圖li-l)。因此，該突 變對經(jīng)由TLR4的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生了配體限制的但基本完全的作用，并且對經(jīng) 由TLR2-TLR6復(fù)合物的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生了廣泛但部分的作用。圖1顯示Heedless突變的粗糙LPS和TLR2-6的特異性。將野生型(WT)、 雜合Heedless (Hdl het)、純合Heedless (Hdl homo)或Myd88缺陷的小鼠用 3%的巰基乙酸鹽/酯腹膜內(nèi)注射，以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞侵潤。分離、培養(yǎng)巨噬細(xì) 胞，并對所顯示的每一個具體誘導(dǎo)物進(jìn)行劑量應(yīng)答試驗。在用誘導(dǎo)物37GC 溫育4h后，收集上清液，并使用如以前所述的L929生物測定以雙份形式 測定TNF的濃度。值代表平均值士SEM(r^6只小鼠或更多)。所用的誘導(dǎo)物 是光滑LPS(a)、粗糙LPS(b)、脂質(zhì)A(c)、 S-MALP-2 (d)、 R-MALP-2 (e)、 LTA (f)、酵母聚糖A (g)、 PaHi2CSK4 (h)、 Poly LC (i)、瑞喹莫德(j)、 PaHi3CSK4 (k)和含有CpG的DNA(l)。在三個獨立的試驗中觀察到了相似的結(jié)果。實施例2對不依賴LPS化學(xué)型的休克的抗性(Resistance to shock independent of LPS chemotype)因為Heedless在應(yīng)答光滑LPS時選擇性地防止TNF的產(chǎn)生，因此預(yù)期 突變將僅保護(hù)小鼠免受光滑(但不是粗糙)LPS的致命作用。通過腹膜內(nèi)途徑， 用1 mg LPS (光滑或粗糙化學(xué)型)注射突變的純化小鼠或雜合的CWBL/6同 窩出生小鼠。所有的接受粗糙或光滑LPS的雜合小鼠在36小時內(nèi)死亡。與 預(yù)料的相反，無論施用了粗糙還是光滑的LPS，所有的純合Heedless小鼠都 存活。感覺所有的Heedless純合小鼠都顯示出比對照少得多的對粗^t和光滑 的化學(xué)型的敏感性(圖2a和2b)。盡管粗糙LPS可誘導(dǎo)Heedless巨噬細(xì)胞產(chǎn) 生TNF,但突變必須禁止至少一些方面的LPS應(yīng)答。實施例3Heedless阻抑LPS誘導(dǎo)的I型IFN的產(chǎn)生所有形式的LPS經(jīng)由TLR4至MyD88非依賴性的途徑(涉及適體MyD88 和Mai)和MyD88非依賴性途徑(涉及適體TRIF和TRAM)來傳遞信號。 Poltorak等，5We"ce 282: 2085-2088， 1998; Hoebe等，Atowre 640-643， 2003; Yamamoto等，iV^. /附附m"o/. 4: 1144-1150， 2003; Kawai等，11(1): 115-122， 1999; Yamamoto等，A^w" 420: 324-329, 2002; Horng等，Atowe 420: 329-333,2002。 LPS誘導(dǎo)的IFN-卩的產(chǎn)生完全依賴于TRIF和TRAM,其允許IFN-卩 轉(zhuǎn)錄因子IRF-3的磷酸化和二聚體化。Hoebe等，Atowre 424: 743-748， 2003; Yamamoto等,5Wewce 301: 640-643， 2003; Yamamoto等,Ato. 7m,wo/. 4: 1144-1150， 2003。利用酪氨酸激酶Tyk2和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活劑STAT-1 ， IFN-卩經(jīng)由自擴增回路(autoamplication loops)增加了其自身的合成，并且已 知IFN-卩在LPS毒性中起主要作用。Karaghiosoff等，A^. /附m柳o/. 4: 471-477，2003。 檢查了 Heedless突變對I型IFN的作用，發(fā)現(xiàn)該突變防止了光滑LPS 和脂質(zhì)A經(jīng)由MyD-8非依賴性途徑的信號傳導(dǎo)(圖2c、 d)。具體地說，Heedless 防止了 I型IFN和IFN-P的mRNA的產(chǎn)生，以及防止了 IFN可誘導(dǎo)基因(如 IFITl、 ISG15)的誘導(dǎo)。在應(yīng)答脂質(zhì)A時，在Heedless突變細(xì)胞中未檢測 到IRF- 3磷酸二聚體(phosphodimer)的形成(圖2e)。然而，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 的激活和促分裂原激活的蛋白激酶ERK1和ERK2的磷酸化正常發(fā)生于 Heedless巨喧細(xì)胞中(圖2f)。也檢查了 TNF和I型IFN在注射了粗糙LPS 或光滑LPS的小鼠的體內(nèi)的產(chǎn)生。光滑LPS和粗糙LPS在野生型小鼠的血 清中都誘導(dǎo)了 TNF和I型IFN的大量產(chǎn)生(圖2g-j)，然而光滑LPS未在 Heedless突變小鼠的血清中誘導(dǎo)TNF和I型IFN(圖2g和2i)。粗糙LPS在 Heedless和野生型小鼠中誘導(dǎo)了 TNF的產(chǎn)生J旦未刺激I型IFN在Heedless 小鼠中產(chǎn)生(圖2h， j)。這些結(jié)果符合巨噬細(xì)胞體外的應(yīng)答分析，并且與 Heedless通過體內(nèi)防止LPS誘導(dǎo)的I型IFN產(chǎn)生而抑制致死性的假說一致。 因此，LPS受體復(fù)合物可選擇性地啟動MyD-88依賴性信號傳導(dǎo)或同時啟動 MyD-88依賴性的MyD-88非依賴性的信號傳導(dǎo)。Heedless感染的蛋白控制 MyD88依賴性途徑的可利用性，并且。Heedless蛋白是光滑LPS誘導(dǎo)任何 形式的TLR4信號傳導(dǎo)所必須的。最后，Heedless蛋白是脂質(zhì)A(或粗糙LPS) 誘導(dǎo)經(jīng)由MyD88非依賴性途徑的信號傳導(dǎo)是必須的，但不是脂質(zhì)A(或粗糙LPS)誘導(dǎo)經(jīng)由MyD88依賴性途徑的信號傳導(dǎo)所必須的。圖2顯示Heedless防止LPS對IFN^的誘導(dǎo)。用1 mg來自S. Wom/s 的LPS(光滑LPS) (a)或來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌Re595的LPS(粗糙LPS) (b)， 腹膜內(nèi)注射年齡匹配的雄性Heedless雜合小鼠和純合小鼠(同窩出生的小 鼠)。在三天的時間內(nèi)監(jiān)控存活率，并且將數(shù)據(jù)表示為卡普蘭-邁耶曲線圖 (Kaplan-Meier plot) (PO.OOOl)。 (c)測量來自所述突變小鼠(n-6)的巨噬細(xì)胞 上清液中的I型IFN的活性。用光滑LPS (100 ng/ml)或脂質(zhì)A (100 ng/ml) 將細(xì)胞處理4個小時。誤差條表示確定的SEM。 (d)用PolyIC或脂質(zhì)A將 來自野生型C57BL/6或Heedless小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞處理2個小時。從細(xì) 胞和IFN-卩誘導(dǎo)物中分離總RNA,并通過RT-PCR分析IFNP、 IFN-誘導(dǎo)基 因IFIT1、 ISG15和IL-12(3、 HPRT的誘導(dǎo)。IRF-3激活的免疫印跡分析(e), 或在用脂質(zhì)A處理的(100 ng/ml)野生型和Heedless巨噬細(xì)胞中IkB和ERK (p42/M)的磷酸化(f)。 (g-j)在用LPS注射的小鼠的血清中，TNF和I型干擾 素的產(chǎn)生。用5 mg來自5*. Wwt^ (g, i)的光滑LPS或來自明尼蘇達(dá)沙門氏 菌Re595的粗糙LPS,腹膜內(nèi)注射年齡匹配(8周大)的野生型和Heedless小 鼠(每組4只小鼠)(h，j)。在指示的時間收集血液，并通過如在材料和方法中 所述的TNF或IFN生物測定，分析血清中TNF(g,h)和I型IFN(i,j)的濃度。 在另外的試驗中，獲得了類似的結(jié)果。實施例4經(jīng)由Heedless和TLR4的VSV信號I型干擾素在限制病毒增殖中的關(guān)鍵作用導(dǎo)致在控制體外巨噬細(xì)胞中 的水泡性口炎病毒(VSV)生長中對Heedless需求的檢驗。當(dāng)以范圍為10-50 的MOI暴露于VSV下時，Heedless巨噬細(xì)胞遠(yuǎn)比野生型C57BL/6巨噬細(xì)胞 更易裂解。而且，與來自C3H/HeN小鼠的LPS非應(yīng)答性Tlr^LPs-"^^11巨噬 細(xì)胞相比，來自C3H/HeJ小鼠的LPS應(yīng)答Tlrr4Lps-^Ps-d巨噬細(xì)胞明顯是高易 感的。在Heedless巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了比感染的野生型細(xì)胞至少多1000倍的 病毒，表明來自Heedless小鼠的巨噬細(xì)胞不能含有感染(圖3b)。另外， Heedless巨噬細(xì)月包產(chǎn)生的IFN-a顯著地減少(圖3c)。通過在感染之前用I型干擾素處理細(xì)胞，防止了 VSV對Heedless或Thy^Ps-^Ps-d巨噬細(xì)胞的溶胞作 用。為了排除VSV接種體的LPS污染是導(dǎo)致Heedless和TLR4依賴性的抗 感染性的原因，用與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基，將病毒在Vero單層細(xì)胞 上連續(xù)傳代。通過直接將來自生產(chǎn)系(producer line)的稀釋培養(yǎng)基直接施加于 巨噬單層細(xì)胞，進(jìn)行病毒感染，而無需進(jìn)行病毒純化或濃縮(將模擬感染的 生產(chǎn)細(xì)胞用作對照)，并單獨地檢測病毒滴度。與LPS不同，在感染后8h、 16h、 21h和36h,病毒不能誘導(dǎo)TNF應(yīng)答，并且未4企測到NF-kB激活也未 檢測到ERK磷酸化(圖3e)。盡管來自C57BL/6小鼠的巨噬細(xì)胞的VSV感染 在4小時后誘導(dǎo)了強烈的IRF-3激活應(yīng)答(顯示為遷移的條帶)(圖3f),但來 自Heedless小鼠的巨噬細(xì)胞的感染在10小時后誘導(dǎo)了最小的IRF-3激活。 因此，Heedless-TLR4-IRF-3-IFN-(3軸是對VSV的保護(hù)性應(yīng)答所需要的。在 獲得自TLR-3缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞中未顯示易感性的增加。圖3表示Heedless巨噬細(xì)胞對VSV誘導(dǎo)的溶胞作用是高敏感的。在巰 基乙酸酯引發(fā)的、來自C57BL/6(WT)、 heedless (Hdl)、 C3H/HeN (HeN)和 Tlr4一^PS-d C3H/HeJ (HeJ)小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞中，檢查VSV的溶胞作用。 在感染后48小時，測量細(xì)胞存活率(a)、病毒滴度和培養(yǎng)基中的IFN-a(c)， 所述感染是用每個巨噬細(xì)胞10或50個病毒顆粒的多重性感染(moi)開始的。 在病毒感染前4小時，檢測用IFN-卩預(yù)處理培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活(d)。在用 VSV(50moi)感染指示時間的野生型巨噬細(xì)胞中，IkB、 ERK(p42/44)磷酸化 的免疫印記分析(e)。在用VSV (50 moi)感染至指示時間的野生型和Heedless 巨噬細(xì)胞中IRF-3的免疫印跡分析(f)。在三個獨立的實驗中，觀察到了類似 的結(jié)果。實施例5Heedless對應(yīng)CD14突變Heedless突變定位于中央的小鼠染色體18，從而在24個配子上排除了 〉98.2%的小鼠基因組(圖6)。關(guān)鍵的區(qū)域含有編碼CD14的基因。抗CD14 的cDNA通過RT-PCR擴增并測序時，在Heedless樣品中觀察到了早期終止密碼子(premature stop condon)。 Ferrero and Goyert, M/c/e/c ^4c/(is1及es.， 16: 4173, 1988;NCBIGenBankP08571。因為關(guān)鍵堿基的形態(tài)不尋常，在來自許多純合小鼠的DNA的雙鏈中呈 現(xiàn)了雙峰的現(xiàn)象，因此，通過使用酶BfliA-I的限制性核酸內(nèi)切酶切割，證 實了存在突變，該酶能切割野生型等位基因，但不能切割Heedless等位基因 (圖4)。突變預(yù)示了 83個羧基末端氨基酸的移除，這形成了 366個氨基酸的 CD14多肽鏈的富含亮氨酸的重復(fù)LRR結(jié)構(gòu)域。圖4表示通過限制性核酸內(nèi)切酶切檢測的Heedless,其為CW4中的突 變。使用基因組DNA才莫板，通過PCR,擴增來自野生型小鼠、Heedless純 合小鼠和雜合小鼠的a/W基因的片段，該片段含有hdl突變位點。用限制 酶BfUAI將約0.2微克的每個片段在50QC消化2小時，并在1%的瓊脂糖凝 膠上分離。BfiiAI消化后，未切割的PCR片段是1571bp。預(yù)測野生型(但不 是hdl)序列的消化產(chǎn)生長度為1111 bp的片段和另一個長度為460 bp的片 段。圖6表示通過測序作圖和鑒定的Heedless突變。(a.)F2小鼠表型分類是 基于，使用L929生物測定，測量LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF產(chǎn)生。在24個 配子(meioses)上，實現(xiàn)了將hdl限制于染色體的中央?yún)^(qū)，且峰LOD分大于6。 (b.)突變的Consed顯示，顯示來自hdl/hdl純合小鼠的遠(yuǎn)端編碼區(qū)(頂端脈跡， 雙向測序)和來自正常C57BL/6小鼠(底部脈跡)的序列。在突變系中，AC被 T所替代，但盡管具有純合性，仍作為雙峰出現(xiàn)。因為以前沒有報道CD14在聚集LPS應(yīng)答中運用選擇性，因此決定排除 不相關(guān)的突變可能產(chǎn)生所觀察到的表型的可能性，并且檢查Cdl4T小鼠。來 自這些動物的巨噬細(xì)胞精確顯示了與在Heedless細(xì)胞中所觀察的相同的表 型(圖2c、 3d、 5a和5b)。而且，當(dāng)加入高濃度(大于2 jig/ml)的巨噬細(xì)胞培 養(yǎng)物時，純化的重組可溶性CD14能交叉再活化Heedless表型(圖5c)。因此， Heedless表型是由無功能的CD14等位基因引起的。圖5表示在Cdl4純合突變細(xì)胞中被重組mCD14交叉再活化的光滑LPS 反應(yīng)性。a、 b.用指示量的光滑LPS (a)、脂質(zhì)A (b)或50mg/ml光滑LPS + 指示量的重組mCD14 (c)將來自正?；駽D14敲出小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞處理4小時。在(c)中，顯示了 Cdl4T細(xì)胞應(yīng)答和Hdl突變細(xì)胞應(yīng)答。當(dāng)反應(yīng)終點 時測量TNF的產(chǎn)生。實施例6LPS誘導(dǎo)的TRIF-TRAM途徑激活和VSV應(yīng)答所需要的CD14無偏表型篩選(Unbiased phenotypic screening)和定位克隆表明，CD14具 有與之前歸于其的功能不同的功能。并非簡單地聚集Lps信號，CD14是LPS誘導(dǎo)的TRIF-TRAM途徑的激活所絕對需要的。其對于對VSV的應(yīng)答 也是必須的，這使獨有的TLR4-介導(dǎo)的IRF-3磷酸二聚體形成的激活成為必 需。CD14在較小的程度上也參與經(jīng)由TLR2-TLR6受體復(fù)合物(也已知含有 CD36)的信號傳導(dǎo)。根據(jù)上述陳述，可能猜想CD14能區(qū)分粗糙和光滑LPS化學(xué)型。然而， 數(shù)據(jù)并未得出這樣的結(jié)論。相反，因為在缺乏CD14的情況下，TLR4-MD-2 復(fù)合物區(qū)分了光滑和粗糙LPS，因此是TLR4-MD-2具有識別的能力，而 CD14實現(xiàn)了粗糙和光滑LPS化學(xué)型的特定生物活性。CD14給與在應(yīng)答粗 糙LPS或脂質(zhì)A中激發(fā)MyD88非依賴性信號傳導(dǎo)的能力。相反，CD14給 與在應(yīng)答光滑LPS中的所有TLR4依賴性信號傳導(dǎo)活性。因此，CD14不區(qū) 分粗糙和光滑化學(xué)型，而在經(jīng)由兩者的信號傳導(dǎo)中充當(dāng)必需的因子。LPS受體充當(dāng)具有兩個終止的開關(guān)(switch);根據(jù)CD14和激活配體的存 在或不存在，可發(fā)生受體的"完全激活，，或限制的MyD88依賴性激活。在缺 少CD14時，粗糙LPS或脂質(zhì)A刺激MyD-88依賴性激活，這與脂質(zhì)A分 子經(jīng)歷與TLR4直接接觸以侵/f言號傳導(dǎo)的假說一致。Poltorak等，尸rac. A^/. 爿cad 97: 2163-2167， 2000; Lien等，C7z力./wveW. 105: 497-504,2000。因為一些細(xì)胞表達(dá)TLR4-MD-2，但不表達(dá)CD14,因此當(dāng)動物用產(chǎn)生 粗糙LPS化學(xué)型的有機體感染時，由粗糙LPS發(fā)動的嚴(yán)格地MyD-88依賴 性信號傳導(dǎo)可能發(fā)生，并且是不限制于CD14缺陷小鼠的現(xiàn)象(例如肥大細(xì) 胞和B細(xì)胞不表達(dá)CD14;]VLHuber等，個人通信)。盡管以前認(rèn)為通過TLR7 的方式信號傳導(dǎo)，但在巨噬細(xì)胞中，VSV顯然依賴于CD14-TLR4途徑，并 且引起IRF-3依賴性的IFN-p產(chǎn)生，但不激活MyD88途徑。Lund等，iVoc. A^/.5W. U 101: 5598-5603， 2004。 一種能解釋我們的觀察的假說認(rèn)為，通過對TLR4-MD-2復(fù)合物的超分 子結(jié)構(gòu)的作用(即通過誘導(dǎo)的復(fù)合物靠近)，CD14允許MyD88非依賴性信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)，而MyD88依賴性信號傳導(dǎo)產(chǎn)生于粗糙LPS或脂質(zhì)A對無序 TLR4-MD-2復(fù)合物的直接刺激。在可選的模型中，CD14可能允許 TLR4-MD-2復(fù)合物經(jīng)歷構(gòu)象變化，當(dāng)LPS存在時，該構(gòu)象變化允許MyD88 非依賴性的信號傳導(dǎo)。在任一模型中，可想象，CD14直接接合粗糙和光滑 化學(xué)型LPS分子；TLR4-MD-2僅能接合無輔助的前者。近來，通過X-射線 晶體學(xué)測定的CD14的三維結(jié)構(gòu)已公開了 LPS和其他微生物配體的可能的結(jié) 合位點以及可能與下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的位點，并可能最終有助于解釋在此^艮 道的作用。Kim等，J說o/. 280: 11347-11351,2005。必須注意，a/w無效等位基因與7w/無效等位基因的純合小鼠彼此在表型上可區(qū)別的。在兩種情況下，都不能相應(yīng)LPS并產(chǎn)生IFN-P。然而，7W/ 突變巨噬細(xì)胞也顯示了相當(dāng)嚴(yán)重的脂質(zhì)A誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生的減少，而 巨噬細(xì)胞優(yōu)選能夠應(yīng)答脂質(zhì)A而產(chǎn)生TNF。 Hoebe等，A^w^ 424: 743-748,2003。 這可能是由于TRIF與MyD88依賴性途徑組分(如TRAF-6 )之間功 能上重要的相互作用。Jiang等，尸亂Ato/.5W C7. 5". ^ 101: 3533- 3538，2004。 而且OIM突變影響TLR2-TLR6的感知(sensing)，而7W/突變不影響。 Hoebe等，A^w" 424: 743-748， 2003; Yamamoto等，5Werace 301: 640-643， 2003。在作為TLR2-TLR6的促進(jìn)物(facilitator)和TLR4刺激物(包括LPS和仍 然未知的VSV感染產(chǎn)物)的雙重作用中，CD14傳導(dǎo)來自結(jié)構(gòu)上分離的分子 的信號，并且可推斷TLR2-TLR6復(fù)合物如TLR4-MD-2復(fù)合物那樣與CD14 相互作用。LTA和MALP-2 (但不是酵母聚糖)兩者部分地依賴于CD36以及 CD14，以經(jīng)由TLR2-TLR6異二聚體傳導(dǎo)信號，并且目前正在檢查CD36無 效等位基因(Cd36。w)和Cdl4腿的混合純合子的表型。Hoebe等，A^wre433: 523-527, 2005。在巨噬細(xì)胞對VSV的抗性中，CD14-TLR4信號傳導(dǎo)軸 (signaling axis)的必要功能是未預(yù)料到的，清楚的是至少在巨噬細(xì)胞中，對 于檢測這種微生物，TLR4而非TLR3或TLR7是至關(guān)重要的?？赡懿煌?細(xì)胞類型通過識別特定的病毒產(chǎn)物而經(jīng)由不同的TLRs來感知相同的病毒。在VSV感染過程中激活CD14并允許MyD88非依賴性的TLR4的應(yīng)答的分 子身份尚待確定。圖7表示概括粗糙和光滑LPS (具有不同長度多糖的脂質(zhì)A"圓柱體"(波 浪線))、TLR4/MD-2復(fù)合物(分別為藍(lán)色和黑色的矩形)和CD14(圓形)之間相 互作用的示意圖。CD14允許對光滑和粗糙LPS等量的應(yīng)答。在缺乏CD14 時，粗糙LPS可激活MyD88非依賴性的信號傳導(dǎo)，光滑LPS在缺乏CD14 時沒能激活LPS信號。圖8表示假設(shè)的機制，據(jù)此，CD14可允許來自TLR4復(fù)合物的MyD88 依賴性信號傳導(dǎo)。顯示了光滑和粗糙LPS、 CD14、 TLR4/MD-2和適體蛋白 的俯視圖(細(xì)胞膜是透明的)。A.在缺乏CD14時，粗糙LPS可刺激 MyD88/Mal從單個TLR4/MD-2復(fù)合物募集，但將光滑LPS從相互作用中排 除。B.在存在CD14時，在TLR4/MD-2復(fù)合物間發(fā)生超分子的聚集，并且 作為誘導(dǎo)鄰近的結(jié)果，發(fā)生TRIF/TRAM募集。光滑和粗糙LPS分子可被 CD14接合，并且可合并成組裝復(fù)合物(assembly complex)。實施例7 方法學(xué)小鼠如以前所述，在誘變中使用C57BL/6小鼠。Hoebe等,Atow^ 424: 743-748,2003。在TG注射三天后，收獲巰基乙酸酯(TG)引起的腹膜巨噬細(xì) 胞，并如以前所述^4居對TLR激動劑的應(yīng)答來篩選。Hoebe等，424: 743-748, 2003。 Cdl4卞和C3H/HeJ小鼠從Jackson實驗室獲得。C3H/HeN 小鼠從Charles River獲得。根據(jù)TSRI動物使用委員會(TSRI Animal Use Committee)的規(guī)則進(jìn)行所有的試驗。Heedless的遣傳作圖和定位鑒定將Heedless純合小鼠與C3H/HeN小鼠 遠(yuǎn)交并與Heedless原種回交。以60個信息微衛(wèi)星基因座，將24只小鼠進(jìn)行 基因分型。將突變限定在兩個染色體18標(biāo)記間(通過單交叉乂人相鄰的標(biāo)記中 分離，并且通過多交叉/人遠(yuǎn)端標(biāo)記中分離)。用萸光引物和ABI3100DNA測 序器，通過片段長度分析進(jìn)行基因分型。用這種機器，也進(jìn)行序列分析，并 且所有的情況下使用內(nèi)部引物在未克隆的DNA片段上進(jìn)行。試劑從德國的Alexis獲得明尼蘇達(dá)沙門氏菌Re595 (粗糙)LPS、馬流產(chǎn) 沙門氏菌0Sa/mowe〃" "6w^s equi)(光滑)LPS、.鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)(光滑)LPS、來自Sa/mo"e〃a Af/"wesoto R595(Re)(超純，液體) 的脂質(zhì)A以及Macrophage-Activation Lipopeptide-2 (MALP-2, S和R形式)。 高度純化的脂磷壁質(zhì)由T. Hartung惠贈。由Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) 合成未甲基化的寡核苷酸 5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-S'。 dsRNA從Amersham Pharmacia Biotech 獲得。Resiquimod從3M Corporation獲得。PaHi2CSK4和PaIn3CSK4從EMC 」微生物保藏中心(EMC microcollections， Tubingen, Germany)獲得。 酵母 聚糖A從Sigma獲得。所有的試劑以規(guī)定的濃度使用。重組的可溶性CD14 從CellSciences (Canton, MA)購買。rMuIFN-p和BFN國a ELISA從R&D System 獲得。在序列分析中所用的B/"-/從New England Biolabs獲得。通過使用 來自Invitrogen的ThermoScriptRT-PCR系統(tǒng)，進(jìn)行RT-PCR。從細(xì)胞中分離 總RNA，并且通過RT-PCR分析I型干擾素的誘導(dǎo)，RT-PCR條件是28-30 個循環(huán)940C， 30 s; 58 0C ， 30 s;和68。C, 40 s。用下列引物擴增IFN-卩、ISG15、 IFIT1、 IL畫12卩、HRPT的cDNA:5'-TTCCTGCTGTGCTTCTCCAC畫3' 和5'-AAGGTACCTTTGCACCCTCC-3'用 于 IFN-(3, 5'-TGGGACCTAAAGGTGAAGATGCTG-3' 和5'-TGCTTGATCACTGTGCACTGGG-3' 用 于 ISG15,5'-TCACTTCACATGGAAGCTGCTATTTG-3' 和 5'畫CCATGGCTTGTTTATAATTTCCTCCTC國3' 用 于 IFIT1,5'-CGGGTCTGGTTTGATGATGTCC畫3' 和5'畫GACCCTGACCATCACTGTCAAAGAG-3' 用 于 IL-12卩， 5'-GGACAGGACTGAAAGACTTGCTCG-3' 和5'-TCCAACAAAGTCTGGCCTGTATCC-3'用于HRPT 。 JumpStart RED AccuTaq LA DNA聚合酶從Sigma獲得。針對IRF-3的抗體(用于在天然凝膠 中檢測磷酸二聚體)從Santa Cruz Biotechnology獲得。針對磷酸化的IkB和 ERKl/2 (p42/p44)的抗體從Cell Signaling (Beverly, MA)獲得，針對IRF3和|3-微管蛋白的抗體分別從Zymed (South San Frandsco, CA)和Pharmingen (SanDiego， CA)獲得。生物測定參考重組小鼠IFN-P,使用以干擾素敏感熒光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn) 染的L-929細(xì)胞系，測量I型IFN的活性。參考重組小鼠TNF標(biāo)準(zhǔn)，使用 L-929細(xì)胞溶胞測定，測定通過腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF活性。為了測量 VSV對TG引起的腹膜巨噬細(xì)胞的溶胞作用，以每孔105的密度，將細(xì)胞涂 布在96孔板中，并且每個孔接種病毒，通過噬菌斑形成測定在L-929單層 細(xì)胞上單獨滴定該病毒。將細(xì)胞以MTT染色以評價在規(guī)定的時間間隔后的 存活率。免疫印跡在溶胞緩沖液(0.5。/。 Triton X-100, 20 mM HEPES， pH 7.4， 150 mM NaCl, 12.5 mM 3-磷酸甘油，1.5 mM MgCl2, 10 mM NaF, 2 mM 二硫蘇糖 醇，1 mM原釩酸鈉，2 mM EGTA， 20 牛胰蛋白酶抑制劑，1 mM苯基甲磺 酰氟)中，將在指示的時間內(nèi)用光滑LPS或脂質(zhì)A處理或未處理的腹膜巨噬 細(xì)胞進(jìn)行溶胞作用。通過SDS-PGAGE分離細(xì)胞提取物，轉(zhuǎn)移至穩(wěn)定素-P 膜(Millpore)并使用針對磷酸ERK、磷酸-IicB、 IRF3和P-微管蛋白的抗體通 過免疫印跡進(jìn)行分析。如以前所述的，進(jìn)行IRF-3磷酸二聚體形成的蛋白分 析。Poltorak等，5We"ce 282: 2085-2088， 1998。當(dāng)本文中使用有關(guān)物理特性(如分子量)或化學(xué)特性(如化學(xué)式)的范 圍時，意思是包括范圍的所有的組合或亞組合和其中的具體實施方案。本文中引用的每一專利、專利申請或出版物的公開內(nèi)容通過引用將其整 體結(jié)合入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到可對本發(fā)明的實施方案做許多的變化和調(diào)整， 并且在未偏離本發(fā)明的精神的情況下實現(xiàn)此類變化和調(diào)整。因此，預(yù)期所附 權(quán)利要求涵蓋了落入本發(fā)明的真實的精神和范圍內(nèi)的所有此類等同的變化。
權(quán)利要求
1.一種用于治療懷疑患有感染的哺乳動物受治療者中棒狀病毒感染的方法，所述方法包括以有效減輕或消除棒狀病毒感染或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā)的量，向所述受治療者施用經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是經(jīng)由CD14的Toll樣 受體4信號傳導(dǎo)活性的拮抗劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是CD14活性或Toll樣 受體4信號傳導(dǎo)活性的抑制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述抑制劑是CD14或TLR-4的干 擾RNA、短發(fā)夾RNA、核酶或反義寡核苷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述抑制劑是CD14或TLR-4的單 克隆抗體、多克隆抗體、肽、擬肽或小化學(xué)抑制劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述抑制劑是CD14的抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述抑制劑是TLR-4的抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述棒狀病毒是狂犬病病毒或水泡 性口炎病毒。
9. 一種用于治療哺乳動物受治療者中自身免疫病的方法，所述方法 包括以有效減輕或消除自身免疫病或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā)的量，向所述哺乳 動物受治療者施用經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是經(jīng)由CD14的Toll樣 受體4信號傳導(dǎo)活性的拮抗劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是CD14活性或Toll 樣受體4信號傳導(dǎo)活性的抑制劑。
12. ^f艮據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述抑制劑是CD14或TLR-4的 單克隆抗體、多克隆抗體、肽、擬肽或小化學(xué)抑制劑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述抑制劑是CD14的抗體。自膠凝的藻酸鹽體系及其用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有延遲膠凝過程的藻酸鹽體系，并涉及制備和使用該體系的 組合物、器件和成套工具和方法。發(fā)明背景本申請要求于2004年10月12日提交的標(biāo)題為"自膠凝藻酸鹽體系及其 用途(Self-Gelling Alginate Systems and Uses Thereof)"的美國臨時申 請No. 60/617, 852的優(yōu)先權(quán)，該申請的內(nèi)容參考結(jié)合于本文。藻酸鹽是親水性的海洋生物高分子，具有能在生理相關(guān)的溫度下形成并固 化的熱穩(wěn)定凝膠的獨特性能。藻酸鹽是一類由1-4配糖連接的(3-D-甘露糖醛酸 (M)和oc-L-古洛糖醛酸(G)殘基的非支化的二元共聚物。兩種糖醛酸單體的相對量和它們在聚合物鏈中的順序排列可依據(jù)藻酸鹽的來源而變化。藻酸鹽是在如 Za歷i/7aria力/pei^oi"ea、 i/acrocys^is / /_ri/e_ra、 Ae5^0/2ia /n'gresce刀51禾口 」SCOp/ yW咖/K^OSM7的海洋褐藻中的結(jié)構(gòu)聚合物。藻酸鹽也可以由諸如綠膿 假單胞菌、^zotoZ acter K2V e7a"a^7禾口 /^e〃c/oy/ o/2a51 /7"ore5"cejV751等特定細(xì) 菌所產(chǎn)生(W004011628 Al)。藻酸鹽凝膠可在二價陽離子與來自G殘基的負(fù)電荷基團(tuán)形成離子鍵時產(chǎn) 生，所述G殘基來自不同的兩種藻酸鹽中的每一種，因而使這些兩種聚合物交 聯(lián)。在許多藻酸鹽聚合物中形成多重交聯(lián)鍵而產(chǎn)生為藻酸鹽凝膠結(jié)構(gòu)的基質(zhì)。藻酸鹽凝膠可以是水凝膠，即含有大量水但沒有發(fā)生溶解的交聯(lián)的藻酸鹽 聚合物。生物聚合物凝膠，如藻酸鹽水凝膠，是用于組織工程(tissue engineering applications)和其它生物應(yīng)用的較佳候選物。因為這種性能和 能夠在生理條件條件下形成凝膠，藻酸鹽被廣泛使用并對其用于封裝目的以及 作為生物構(gòu)建材料進(jìn)行了研究。將細(xì)胞截留在藻酸鹽珠中是常用的技術(shù)。藻酸 鹽也顯示是作為其它類型生物結(jié)構(gòu)，包括組織工程應(yīng)用和作為神經(jīng)再生用的骨 架的有用材料。目前有各種制備藻酸鹽水凝膠的方法。最常用的方法是透析/擴散法，該
14. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述抑制劑是TLR-4的抗體。
15. —種用于治療哺乳動物受治療者中炎癥的方法，所述方法包括以 有效減輕或消除炎癥或防止其發(fā)生或復(fù)發(fā)的量，向所述哺乳動物受治療者 施用經(jīng)由CD14的Toll樣受體4信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是經(jīng)由CD14的Toll 樣受體4信號傳導(dǎo)活性的拮抗劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是CD14活性或Toll 樣受體4信號傳導(dǎo)活性的抑制劑。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述抑制劑是CD14或TLR-4的 單克隆抗體、多克隆抗體、肽、擬肽或小化學(xué)抑制劑。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述抑制劑是CD14的抗體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述抑制劑是TLR-4的抗體。
21. —種用于鑒定細(xì)胞中經(jīng)由Toll樣受體4途徑信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑的 方法，所述方法包括將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系包括表達(dá)能 將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞；以選擇的有效激活Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和所述配體；以及檢測在所述測定體系中所述試驗化合物對Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的 作用，測定中所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，所述方法還包括在細(xì)胞中共表達(dá)CD14 和Toll樣受體4。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，所述方法還包括向所述測定體系中提 供Toll樣受體4，并檢測所述試驗化合物對所述測定體系中CD14/Toll樣 受體4信號傳導(dǎo)的作用，測定中的所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述配體是內(nèi)源性配體或外源性 配體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述外源配體是脂多糖、脂質(zhì)A、 二?；?、三酰化脂肽、S-MALP-2、 R-MALP-2、細(xì)菌脂肽、Pam2CSK4、 脂磷壁質(zhì)或酵母聚糖A。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述外源性配體是來自明尼蘇達(dá) 沙門氏菌的粗糙脂多糖、光滑脂多糖或脂質(zhì)A。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述檢測步驟還包括測量對細(xì)胞 中腫瘤壞死因子產(chǎn)生的作用，其中，在對來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌的粗糙脂 多糖的響應(yīng)中TNF的產(chǎn)生發(fā)生改變，而在對來自明尼蘇達(dá)沙門氏菌的光 滑脂多糖或脂質(zhì)A的響應(yīng)中TNF的產(chǎn)生不發(fā)生改變。
28. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述內(nèi)源性配體是脂質(zhì)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)所述配體與CD14結(jié)合的減少。
30. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)CD14與Toll樣受體4結(jié)合的減少。
31. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)所述配體與CD14結(jié)合的增加。
32. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)CD14與Toll樣受體4結(jié)合的增加。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述化合物是Toll樣受體4途徑 信號傳導(dǎo)的拮抗劑。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述化合物是Toll受體4途徑信 號傳導(dǎo)的激動劑。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述^r測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量肺瘤壞死因子的減少。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述檢測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量胂瘤壞死因子的增加。
37. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述細(xì)胞測定還包括巨噬細(xì)胞。
38. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述檢測步驟還包括測量與所述 配體結(jié)合的標(biāo)記的CD14或與Toll樣受體4結(jié)合的標(biāo)記的CD14。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述標(biāo)記是放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
40. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)能將對配體的應(yīng)答 進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TRAM-Trif;以選擇的有效激活TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和所述配體；以及檢測試驗化合物對測定體系中TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中 的所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，所述方法還包括在細(xì)胞中共表達(dá)CD 14、 Toll樣受體4和TRMA-Trif。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，所述方法還包括向所述測定體系中提 供Toll樣受體4,并檢測試驗化合物對測定體系中CD14/ Toll樣受體 4/TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中的所述試驗化合物的功效指示調(diào)節(jié)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)配體與Toll樣受體4結(jié)合的減少。
44. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)Toll樣受體4與TRAM-Trif結(jié)合的減少。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)配體與CD14結(jié)合的增加。
46. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述檢測步驟還包括通過所述化 合物實現(xiàn)Toll樣受體4與TRAM-Trif結(jié)合的增加。
47. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述化合物是TRAM-Trif途徑信號傳導(dǎo)的激動劑。
48. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述化合物是TRAM-Trif途徑信 號傳導(dǎo)的拮抗劑。
49. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述配體是內(nèi)源性配體或外源性 配體。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述外源性配體是脂多糖。
51. 根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述內(nèi)源性配體是脂質(zhì)。
52. 根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述檢測步驟還包括在所述細(xì)胞 測定中測量IRF-3磷酸化的增加。
53. 根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述檢測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量IRF-3磷酸化的減少。
54. 根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述檢測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量p-干擾素的增加。
55. 根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述^r測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量p-干擾素的減少。
56. 根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述檢測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量對病毒感染的易感性的減少。
57. 根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述檢測步驟還包括在細(xì)胞測定 中測量對病毒感染的易感性的增加。
58. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細(xì)胞測定還包括巨噬細(xì)胞。
59. 根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述檢測步驟還包括測量與所述 配體結(jié)合的標(biāo)記的C14或與TLR4或TRAM-Trif結(jié)合的標(biāo)記的CD14。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述標(biāo)記是放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
61. —種用于篩選治療感染性疾病的化合物的方法，所述方法包括將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系包括表達(dá)能 將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞；以選擇的有效激活Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和配體；以及檢測所述試驗化合物對所述測定體系中Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試驗化合物的功效指示對所述感染性疾病的調(diào)節(jié)。
62. 根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)能將對所述配體的 應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TRAM-Trif;以選擇的有效激活TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和所述配體；以及檢測所述試驗化合物對所述測定體系中TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用， 測定中所述試驗化合物的功效指示對感染性疾病的調(diào)節(jié)。
63. 根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述化合物是對所述配體進(jìn)行信 號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的拮抗劑。
64. 根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述化合物是對所述配體進(jìn)行信 號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的拮抗劑。
65. 根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述感染性疾病是細(xì)菌或病毒疾病。
66. 根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述感染性疾病是棒狀病毒感染、 狂犬病病毒感染、水泡性口炎病毒感染、fflV感染、AIDS、細(xì)胞肥大病 毒感染或金黃色葡萄球菌感染。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述化合物是棒狀病毒糖蛋白G 與CD14相互作用的抑制劑。
68. —種用于篩選治療自身免疫病的化合物的方法，所述方法包^":將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定系統(tǒng)接觸，所述測定體系包括表達(dá)能 將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞；以選擇的有效激活Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和配體；以及檢測所述試驗化合物對所述測定體系中Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作 用，測定中的所述試驗化合物的功效指示對自身免疫病的調(diào)節(jié)。
69. 根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)能將對所述配體的 應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TRAM-Trif;以選擇的有效激活TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和所述配體；以及檢測所述試驗化合物對所述測定體系中TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用， 測定中的所述試驗化合物的功效指示對自身免疫病的調(diào)節(jié)。
70. 根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所述化合物是對所述配體進(jìn)行信 號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的拮抗劑。
71. 根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所述自身免疫病是胰島素依賴型 糖尿病、多發(fā)性硬化、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實驗 性自身免疫性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、甲狀腺炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎的實驗形 式、橋本曱狀腺炎、原發(fā)性粘液水胂、曱狀腺毒癥、惡性貧血、自身免疫 性萎縮性胃炎、艾迪生病、提前絕經(jīng)、男性不育、兒童糖尿病、古德帕斯 丘綜合癥、尋常性天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、水晶體源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis )、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性白血病、原發(fā)性 膽汁性肝硬化、活動性慢性肝炎HBs-ve、隱原性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、 斯約格倫綜合癥、硬皮病、韋格納肉芽胂病、多發(fā)性皮肌炎/皮肌炎 (poly/dermatomyositis)、盤一犬紅J寇《良癡或系統(tǒng)性紅斑《良癡。
72. —種用于篩選治療炎癥的化合物的方法，所述方法包括將試驗化合物與基于細(xì)胞的測定體系接觸，所述測定體系包括表達(dá)能 將對配體的應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的細(xì)胞；以選擇的有效激活Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和配體；以及檢測所述試驗化合物對所述測定體系中Toll樣受體4信號傳導(dǎo)的作 用，測定中所述試驗化合物的功效指示對自身免疫病的調(diào)節(jié)。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)能將對所述配體的 應(yīng)答進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TRAM-Trif;以選擇的有效激活TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的量，向所述測定體系提供 CD14和所述配體；以及沖企測所述試驗化合物對所述測定體系中TRAM-Trif信號傳導(dǎo)的作用，測定中所述試驗化合物的功效指示對自身免疫病的調(diào)節(jié)。
74. 根據(jù)權(quán)利要求72的方法，其中所述化合物是對所述配體進(jìn)行信 號傳導(dǎo)的Toll樣受體4的拮抗劑。
75. —種轉(zhuǎn)基因非人類動物，所述動物含有異源核酸，其中所述核酸 含有CD14基因的功能缺失等位基因，所述動物顯示了相對于野生表型的 表型，所述表型包括抑制巨噬細(xì)胞激活、對病毒或細(xì)菌感染的易感性、 TNF-a產(chǎn)生減少的特性，或其任何兩個或多個的組合。
76. 根據(jù)權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中所述CD14突變動物 的表型的特征是對由脂多糖誘導(dǎo)的IRF-3磷酸化和二聚體化的減少、對通 過脂多糖誘導(dǎo)的非應(yīng)答IFN-P的產(chǎn)生或巨噬細(xì)胞對由水泡性口炎病毒或 狂犬病病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解的高敏感性。
77. 根據(jù)權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中所述CD14基因中功 能缺失的等位基因是在Q284X的早期終止密碼子。
78. 根據(jù)權(quán)利要求75的轉(zhuǎn)基因非人類動物，其中所述動物是小鼠或 大鼠。
79. —種細(xì)胞或細(xì)胞系，所述細(xì)胞或細(xì)胞系來自根據(jù)權(quán)利要求75的 轉(zhuǎn)基因非人類動物。
80. —種篩選Toll樣受體4或TRAM-Trif信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑的體 外方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求79的細(xì)胞或細(xì)胞系與試驗化合 物接觸；檢測TNF-a產(chǎn)生量、對病毒或細(xì)菌感染的易感性或Toll樣受體4 或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的增加或減少，由此鑒定所述試 驗化合物為Toll樣受體4或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的調(diào)節(jié) 劑。
81. —種篩選Toll樣受體4或TRAM-Trif信號傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑的體 內(nèi)方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求79的細(xì)胞或細(xì)胞系與試驗化合 物接觸；檢測TNF-a產(chǎn)生量、對病毒或細(xì)菌感染的易感性或Toll樣受體4 或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的增加或減少，由此鑒定所述試 驗化合物為Toll樣受體4或TRAM-Trif誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活活性的調(diào)節(jié) 劑。
全文摘要
提供了用于篩選和鑒定化合物的組合物和方法，所述化合物經(jīng)由CD14和配體而調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)途徑的信號傳導(dǎo)。提供了通過經(jīng)由CD14和配體而調(diào)節(jié)Toll樣受體4(TLR4)途徑的信號傳導(dǎo)來治療哺乳動物受治療者中各種疾病狀態(tài)例如炎癥或自身免疫疾病的方法。提供了轉(zhuǎn)基因非人類動物和研發(fā)轉(zhuǎn)基因非人類動物的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因非人類動物在CD14基因中含有功能缺失突變。
文檔編號A61K39/395GK101227922SQ200680024623
公開日2008年7月23日 申請日期2006年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月6日
發(fā)明者布魯斯·比特勒, 蔣爭凡 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院