專利名稱：：與低氧應激反應有關(guān)的Int6蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)低氧應激反應的Int6蛋白，包含調(diào)節(jié)該蛋白功能或該蛋白表達的物質(zhì)的血管疾病治療劑和抗癌劑，以及用于篩選這些藥劑的方法。
背景技術(shù)：
：生物通過適應各種環(huán)境變化來維持其生命。對于該環(huán)境應激的應答反應不僅發(fā)生在生理水平上，還發(fā)生在細胞水平上，并且分子水平的應激反應機制業(yè)已被闡明。特別是，氧的存在是對所有生活在地球上的生物來說最重要的環(huán)境因素之一。由于氧是對于在生物體內(nèi)維持細胞功能所必需的能量源，缺氧就成為影響生命維持的嚴重問題。生物體處于低氧狀態(tài)的原因包括貧血、心肺功能異常和高原生活。在這些狀態(tài)下，活體內(nèi)的每個細胞改變各種基因的表達方式并設法適應低氧應激。例如，由于細胞低氧應激的應答反應，活化了糖酵解途徑并誘導了血管發(fā)生。與低氧應激反應有關(guān)的一些基因在其上游區(qū)具有低氧反應元件(HRE)。低氧誘導轉(zhuǎn)錄因子(HIF)與HRE結(jié)合并促進轉(zhuǎn)錄。HIF業(yè)已被詳細地分析，并已知其產(chǎn)生對于腫瘤內(nèi)血管發(fā)生所必需的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),并調(diào)節(jié)與線粒體內(nèi)能量代謝有關(guān)的多種糖酵解途徑酶的轉(zhuǎn)錄。在實體瘤(如癌)中，盡管血流豐富，仍處于腫瘤內(nèi)部相當?shù)脱醯臓顟B(tài)，而該狀態(tài)因而會促進血管發(fā)生。除血管發(fā)生外，HIF還在細胞內(nèi)扮演各種角色，并據(jù)報導其與能量代謝途徑、紅細胞生長、鐵代謝、細胞生長、細胞死亡、多巴胺代謝等有關(guān)。例如，促紅細胞生成素基因表達的增強對于低氧下紅細胞的生長是必需的，而VEGF基因的增加的表達對于血管發(fā)生是重要的。已知包括低氧誘導因子la(HIFla)、類HIF1因子(HLF)和GATA-2在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子在這些低氣反應基因的表達的調(diào)節(jié)中扮演重要的角色。HIFla與細胞對低氧的反應密切相關(guān)。其在正常氧濃度(21%)下被遍在蛋白-蛋白酶體體系分解，但在低氧狀態(tài)下其免除了這種分解，并轉(zhuǎn)移到細胞核中以引發(fā)作為轉(zhuǎn)錄因子的各種因子的誘導。pVHL是在正常氧濃度下分解HIFla的因子的一例。pVHL與HIFla結(jié)合并使HIFla遍在蛋白化^f吏其分解。此時，脯氨酸羥化酶(PHD)使HIF1a上的脯氨酸殘基羥化，這使得pVHL可識別該位點。HIF主要被分為三種HIFla、HIF2a和HIF3a。與遍在表達的HIFla不同，HIF2a在血管內(nèi)皮細胞、骨骼肌、心肌等中特異表達，而HIF3a在腦神經(jīng)系中特異表達。已知HIFla與例如腦梗死或心肌梗死的缺血性疾病有關(guān)(見非專利文獻1~4)。HIF2a與低氧應激相關(guān)疾病(特別是癌)中的血管發(fā)生有關(guān)(見非專利文獻5)。盡管已報道了與該HIF2a結(jié)合的幾種因子，但能調(diào)節(jié)其功能的因子尚未被發(fā)現(xiàn)。非專利文獻1:SemenzaG.L.，"HIF-1andmechanismsofhypoxiasensing"Curr.Opin.CellBiol.,2001Apr,Vol.13(2),p.167-71.非專利文獻2:GiacciaA.及其他兩個作者，"HIF-1asatargetfordrugdevelopment"2003Oct,Vol.2(10),p.803-11.非專利文獻3:Jelkmann\V.，"Effectsoferythropoietinonbrainfunction"Curr.Pharm.BiotechnoL,2005Feb,Vol.6(1),p.65-79.非專利文獻4:MartiH.H.,"Erythropoietinandthehypoxicbrain"J.Exp.Biol"2004Aug,Vol.207(Pt18),p.3233-42.非專利文獻5:FavierJ.及其他三個作者，"CoexpressionofendothelialPASprotein1withessentialangiogenicfactorssuggestsitsinvolvementinhumanvasculardevelopment"Dev.Dyn.,2001Nov,Vol.222(3),p.377-88.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于上述情況而作出的。本發(fā)明的一個目的是闡明在低氧應激情況下與血管發(fā)生有關(guān)的基因的表達反應的機制，另一個目的是鑒定調(diào)節(jié)HIF2a功能(特別是能促進誘導血管發(fā)生的低氧應激反應的功能)的因子。更具體地，一個目的是提供調(diào)節(jié)低氧應激反應的藥劑，對血管疾病有療效的藥劑，以及篩選這些藥劑的方法。本發(fā)明的發(fā)明者已進行了深入的研究以達到上述目的，并成功地得到了作為與促進血管發(fā)生的低氧應激反應有關(guān)的因子具有HIF2ct的結(jié)合活性的新鑒定出的Int6。已知低氧應答基因的轉(zhuǎn)錄在低氧應激時由HIF2cc的作用促進。本發(fā)明揭示出，在該狀態(tài)下，HIF2a的轉(zhuǎn)錄功能由Int6調(diào)節(jié)。更具體地，本發(fā)明揭示出，Int6與HIF2a相互作用，以HIF2a來抑制的低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄。抑制Int6基因表達或其功能(如，與HIF2a的結(jié)合活性)的物質(zhì)被期待能通過提高HIF2a的活性以促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄而增加血管發(fā)生的效果。這些物質(zhì)被期待具有明顯的血管發(fā)生效果，并對于各種血管疾病如閉塞性動脈硬化、經(jīng)皮血管舒張治療(PCT)后的再狹窄以及心肌梗死具有療效。此外，本發(fā)明的發(fā)明者準備了實驗動物，它們的Int6基因表達被siRNA抑制，并發(fā)現(xiàn)在這些實驗動物中血管發(fā)生效果確實提高了。因此，本發(fā)明的發(fā)明者已成功地確認，在實驗動物水平上，抑制Int6表達或其功能的物質(zhì)確實有效地提高了血管發(fā)生的效果。特別是，被期待具有對Int6基因表達有特異抑制作用的siRNA通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的抑制，促進了對血管疾病有療效的基因的表達，并被高度期待成為全新概念上的血管疾病治療劑。此外，人們期待提高Int6表達或其功能的物質(zhì)能通過降低HIF2a的活性以促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄而抑制血管發(fā)生的效果。由于在癌組織中血管發(fā)生效果增加了，這些物質(zhì)可成為新的抗癌劑，其機制包括抑制血管發(fā)生。此外，本發(fā)明的發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)，雌性激素抑制Int6的表達。也就是說，雌性激素通過抑制Int6基因表達來提高HIF2a的活性，從而促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄，并被認為結(jié)果促進了血管發(fā)生。因此，雌性激素對于治療例如通過改善血流量而改善病癥的疾病(如閉塞性動脈硬化)是有效的。相反，人們期待雌性激素抑制劑具有通過抑制血管發(fā)生而具有的效果，例如抗癌效果?；诒景l(fā)明的發(fā)明者所獲得的這些發(fā)現(xiàn)，可以篩選出血管疾病治療劑和抗癌劑等。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)低氧應激反應的藥劑，對血管疾病或癌癥有療效的藥劑，以及篩選這些藥劑的方法。更特別的是，本發(fā)明提供[l]一種低氧應激反應促進劑，包含抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)或抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)作為有效成分；[2]根據(jù)[1]的低氧應激反應促進劑，其中抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)是從由以下(a)(c)構(gòu)成的群組中選出的一種化合物(a)Int6基因轉(zhuǎn)錄物或其一部分的反義核酸；(b)具有特異地剪切Int6基因轉(zhuǎn)錄物的核糖核酸酶活性的核酸；和(c)具有利用RNAi效果來抑制Int6基因表達的功能的核酸；[3]根據(jù)[1]的低氧應激反應促進劑，其中抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)是雌性激素、雌性激素分泌促進劑或雌性激素受體激動劑；[4]根據(jù)[1]的低氧應激反應促進劑，其中抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)是從由以下(a)(c)構(gòu)成的群組中選出的一種化合物(a)與Int6蛋白結(jié)合的抗體；(b)與Int6蛋白結(jié)合的低分子量化合物；和(c)抑制Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性的化合物；[5]根據(jù)[1][4]中任一項的低氧應激反應促進劑，其中低氧應激反應的促進是血管發(fā)生的誘導；[6]—種低氧應激反應抑制劑，包含提高Int6蛋白表達的物質(zhì)或提高Int6蛋白功能的物質(zhì)作為有效成分;[7]根據(jù)[6]的低氧應激反應抑制劑，其中提高Int6蛋白表達的物質(zhì)是雌性激素抑制劑；[8]根據(jù)[7]的低氧應激反應抑制劑，其中低氧應激反應的抑制是血管發(fā)生的抑制；[9]一種血管疾病治療劑，含有[1][5]中任一項的低氧應激反應促進劑作為有效成分；[10]根據(jù)[9]的血管疾病治療劑，其中血管疾病是缺血性腦疾病或缺血性心疾病、神經(jīng)變性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、或者肝疾病、月夷&泉疾病、月幾肉疾病或皮月夫疾?。籟ll]一種與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)，包含[6]~[8]中任一項的低氧應激反應抑制劑作為有效成分；[12]根據(jù)[11]的與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑，其中與血管頁發(fā)生有關(guān)的疾病是癌癥；[13]—種Int6基因表達被人為地抑制了的非人類轉(zhuǎn)基因動物；[14]根據(jù)[13]的非人類轉(zhuǎn)基因動物，其中Int6基因表達通過如下(a)(c)中任一種核酸的作用而被抑制(a)Int6基因轉(zhuǎn)錄物或其一部分的反義核酸；(b)具有特異地剪切Int6基因轉(zhuǎn)錄物的核糖核酸酶活性的核酸；和(c)具有利用RNAi效果來抑制Int6基因表達功能的核酸；[15]根據(jù)[13]或[14]的非人類轉(zhuǎn)基因動物，其中血管發(fā)生效果被促進了；[16]—種篩選血管疾病治療劑的方法，其中選擇使Int6基因表達水平或Int6蛋白活性降低的化合物；[17]—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6基因表達細胞接觸；(b)測定所述細胞中Int6基因表達的水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物降低了表達水平；[18]—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與細胞或細胞提取液接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接；(b)測定所述報告基因的表達水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物降低了表達水平；[19]一種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液4妻觸；(b)測定所述蛋白的活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的活性相比，該化合物降低了所述蛋白的活性；[20]—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括對抑制Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性的化合物進行選4奪；[21]—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白和HIF2ot蛋白接觸；(b)測定Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，該化合物降低了所述結(jié)合活性；[22]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括對提高Int6基因表達水平或Int6蛋白活性的化合物進行選擇；[23]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6基因表達細胞接觸；(b)測定所述細胞中Int6基因表達的水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物提高了表達水平；[24]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與細胞或細胞提取液接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接；(b)測定所述報告基因的表達水平；并且(C)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物提高了表達水平；[25]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液接觸；(b)測定所述蛋白的活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的活性相比，該化合物提高了所述蛋白的活性；[26]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括對提高Int6蛋白與HIF2oc蛋白之間的結(jié)合活性的化合物進行選擇；[27]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白和HIF2a蛋白接觸；(b)測定Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，該化合物提高了所述結(jié)合活性；以及[28]—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，包括如下步驟(a)用測試化合物對[13]~[15]中任一項的非人類轉(zhuǎn)基因動物給藥；(b)測定所述非人類轉(zhuǎn)基因動物中的Int6表達水平或活性，或測定所述動物中的血管發(fā)生效果；并且(c)選擇一種化合物，與沒有用所述測試化合物給藥的情況(對照組)相比，該化合物降低了血管發(fā)生效果，或該化合物提高了In16表達水平或活性。此外，本發(fā)明還提供[29]—種血管發(fā)生誘導劑，包含Int6的顯性失活突變體作為有效成分；[30]根據(jù)[29]的血管發(fā)生誘導劑，其中Int6的顯性失活突變體是一種Int6蛋白的C末端PINT區(qū)已缺失的Int6蛋白突變體；[31]—種血管發(fā)生抑制劑(優(yōu)選癌細胞的血管發(fā)生抑制劑)，包含Int6蛋白或Int6蛋白的表達載體作為有效成分；[32]—種載體細胞，其中Int6基因表達已被抑制，并且血管發(fā)生已被誘導；[33]根據(jù)[32]的載體細胞，在其中導入有Int6基因的siRNA;[34]—種血管疾病治療劑，包含[31]的血管發(fā)生抑制劑或者[32]或[33]的載體細胞作為有效成分；[35]—種血管疾病治療劑的生產(chǎn)方法，包括將Int6基因的siRNA導入到分離的載體細胞中的步驟；[36]—種治療血管疾病的方法，包括用有效量的如下(a)(c)中的任一種給藥的步驟(a)本發(fā)明的低氧應激反應促進劑；(b)本發(fā)明的血管發(fā)生誘導劑；和(c)本發(fā)明的載體細胞；[37]—種治療血管疾病的方法，包括如下步驟(a)將Int6基因的siRNA導入到分離的載體細胞中；并且(b)用有效量的步驟(a)中的導入了siRNA的載體細胞給藥；以及[38]—種自體移植療法，包括如下步驟(a)收集載體細胞；(b)將Int6基因的siRNA導入到所收集的載體細胞中；并且(c)用有效量的步驟(a)中的導入了siRNA的載體細胞給藥。圖l示出了抑制Int6基因表達的siRNA表達載體的結(jié)構(gòu)(序列)。圖2示出了Int6對HIF2a轉(zhuǎn)錄活性的抑制效果。圖3示出了指示Int6siRNA對內(nèi)源Int6基因表達的抑制效果的圖和照片。圖4示出了指示Int6siRNA的血管發(fā)生提高效果的照片。圖5是一張圖表，指示了Int6mRNA在MCF-7細胞中表達的定量結(jié)果，所述MCF-7細月包在用雌二醇(E2)、孕酮(Progestin)或雌激素受體抑制劑Tamoxifen(40H-TAM)處理后培養(yǎng)24小時。；晴坐標上示出的標記如下A-l:E2(-);A-2:E2(1nM);A-4:Progestin(1nM);A-5:E2(1nM)+Progestin(1nM);A-8:40H-TAM(1^M);以及A-12:E2(1nM)+40H-TAM(1(iM)。圖6示出了由HIF轉(zhuǎn)錄活性誘導的因子群，以及遍在蛋白介導的調(diào)節(jié)機制。圖7概括了與由酵母雙雜交方法鑒定的新HIF2a結(jié)合因子有關(guān)的事項。圖8示出了MMTV誘導的Int6突變體與HIF2a之間的關(guān)系。圖9示出了使用"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"通過自體移植的新生血管旁路療法的基本概念，所述"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞，，由于導入了合成Int6-siRNA而分泌出血管發(fā)生因子群。圖10是使用siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞的新生血管旁路療法的概念圖。圖11示出了Int6對HIF2a的結(jié)合特性。圖12示出了Int6上的HIF2oc結(jié)合位點。圖13示出了指示在正常氧狀態(tài)和低氧狀態(tài)下，HIFla、HIF2a和HIF3a對于野生型Int6和組成型失活(顯性失活)突變體Int6AC的轉(zhuǎn)錄活性的圖表。圖14是示出了利用Int6-siRNA表達載體的小鼠皮下明顯的血管發(fā)生誘導的結(jié)果的照片。圖15示出了指示通過Int6-siRNA進行的血管發(fā)生的定量分析結(jié)果的圖表。左圖示出了新生血管面積(AREA),右圖示出了新生血管的長度(LENGTH)。圖16示出了指示由于Int6-siRNA而新形成的血管的組織病理圖像的照片。照片中的箭頭指出了新形成的血管。具體實施方式本發(fā)明指出，抑制(阻礙)Int6表達或功能(活性)的物質(zhì)具有通過提高HIF2a轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能而促進低氧應激反應的功能。因此，本發(fā)明提供了低氧應激反應促進劑，其包含作為活性成分的抑制Int6表達的物質(zhì)或抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)。已知本發(fā)明的Int6基因存在于包括人類在內(nèi)的各種生物體中。已知Int6基因是與elF3e/p48相同的基因，后者是翻譯調(diào)節(jié)因子(翻譯起始因子)的組成部分之一，并且已經(jīng)在人類、小鼠、大鼠、蛙等中鑒定出相應于Int6基因的那些基因(同源基因，同系物)。本發(fā)明的Int6蛋白優(yōu)選為人類Int6蛋白，但是產(chǎn)生蛋白的動物種類沒有特別的限制，且其可以是來自非人類動物種類(例如包括猩猩、黑猩猩、狗、小鼠、挪威大鼠(大鼠)在內(nèi)的哺乳動物，包括小雞在內(nèi)的禽類，或者包括異爪蛙在內(nèi)的兩棲動物類)的同系物等。在公共基因數(shù)據(jù)庫GenBank中，人類Int6基因的編號為NM_001568?；驍?shù)據(jù)庫的名稱以及在這些基因數(shù)據(jù)庫中這些非人類動物Int6同系物的編號示出于下(gb表示GenBank,emb表示EMBL,ref表示RefS叫數(shù)據(jù)庫)。猩猩(emb,CR860517.1)，狗(ref,XM—532304.1),挪威大鼠(gb,BC082087.1),小鼠(ref，NM—008388.1),黑猩猩(ref,XM—519906.1),小雞(emb,AJ719829.1;ref,NM—001006349.1),以及異爪蛙(gb,AF162775.1和AF162775)。編碼人類Int6的基因的核苷酸序列表示為SEQIDN0:1。由該核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列表示為SEQIDN0:2。除這些之外，與本發(fā)明的序列表中所示序列具有高度同源性(通常為70%或更高，優(yōu)選80%或更高，更優(yōu)選90%或更高，最優(yōu)選95%或更高)且具有Int6功能(例如，與HIF2a蛋白結(jié)合的功能)的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的Int6之列。'該蛋白質(zhì)例如可以是這樣的蛋白質(zhì)，其包含在SEQIDN0:2的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入有一個或多個氨基酸的氨基酸序列，而通常改變的氨基酸的數(shù)量為30個氨基酸或更少，優(yōu)選10個氨基酸或更少，更優(yōu)選5個氨基酸或更少，最優(yōu)選3個氨基酸或更少。本發(fā)明的"lnt6蛋白"可以是天然來源的蛋白質(zhì)，或者可以利用基因重組技術(shù)作為重組蛋白來制備。天然來源的蛋白質(zhì)例如可以通過使用Int6蛋白的抗體的親和層析方法，由表達Int6蛋白的細胞(組織)的提取液來制備。同時，重組蛋白可以通過對已經(jīng)用Int6蛋白的編碼DNA轉(zhuǎn)化的細胞進行培養(yǎng)來制備。在本發(fā)明中對低氧應激進行應答的試劑特別是指這樣一種藥劑，其具有提高對低氧應激進行應答的基因(在本說明書中，其還被稱為"低氧應激應答基因")的表達的功能。更具體地，本發(fā)明中的低氧應激應答基因是一種其轉(zhuǎn)錄由HIF2a調(diào)控的基因，且它們通常是與血管發(fā)生的誘導有關(guān)的基因。通常，在各種生物體中存在多個低氧應激應答基因。本發(fā)明低氧應激應答基因的例子包括對人類血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促紅細胞生成素、胰島素生長因子(IGF)-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白碳酸酐酶IX和轉(zhuǎn)化生長因子進行編碼的基因。更具體地，本發(fā)明抑制Int6表達或其功能的物質(zhì)例如具有提高這些基因表達的功能。期待用本發(fā)明的低氧應激反應抑制劑具有療效的疾病包括伴有缺血(典型的血流減少)的疾病，其中缺血狀況可通過血管發(fā)生而改善血流量來改善，例如包括血管疾病。更為具體的例子包括缺血性腦疾病，例如閉塞性動脈硬化、經(jīng)皮血管舒張治療后的再狹窄、心肌梗死、腦梗死或腦內(nèi)出血；神經(jīng)變性疾病，例如阿爾茨海默病、帕金森病或脊髓小腦變性；神經(jīng)疾病，包括創(chuàng)傷性腦損傷如脊髓損傷和腦挫傷；肝疾病如肝硬化；以及萎縮性肌肉紊亂。在本發(fā)明中，抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)例如包括抑制Int6的轉(zhuǎn)錄或抑制其由轉(zhuǎn)錄物進行翻譯的物質(zhì)。本發(fā)明這些抑制表達的物質(zhì)的優(yōu)選方案例如包括從由以下(a)(c)構(gòu)成的群組中選出的化合物(核酸)(a)Int6基因轉(zhuǎn)錄物或其一部分的反義核酸；(b)具有特異地剪切Int6基因轉(zhuǎn)錄物的核糖核酸酶活性的核酸；和(c)具有利用RNAi效果來抑制Int6基因表達的功能的核酸(siRNA)。本發(fā)明中的"核酸，，指的是RNA或DNA。此外，化學合成的核酸類似物如所謂的PNA(肽核酸)也包括在本發(fā)明的核酸之列。在PNA中，戊糖磷酸骨架(其是核酸的基本骨架結(jié)構(gòu))被由甘氨酸單元構(gòu)成的聚酰胺骨架取代。PNA具有與核酸非常相似的三維結(jié)構(gòu)。另外，所謂的LNA(鎖定核酸)也包括在本發(fā)明的核酸之列。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說公知的抑制特定內(nèi)源基因表達的方法包括在反義技術(shù)中使用的那些方法。使用反義核酸進行的目標基因的抑制可歸結(jié)為多種因素。這些因素例如包括通過三鏈結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄起始的抑制；通過在由RNA聚合酶形成的局部開環(huán)結(jié)構(gòu)部位用一序列進行雜化物形成而對轉(zhuǎn)錄進行的抑制；使用合成的RNA通過雜化物形成對轉(zhuǎn)錄進行的抑制；通過在內(nèi)含子-外顯子接點用一序列進行雜化物形成而對剪接進行的抑制；通過在剪接體形成部位用一序列進行雜化物形成而對剪接進行的抑制；使用mRNA通過雜化物形成對由細胞核至細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移進行的抑制；通過在加帽部位或聚腺苦酸部位用一序列進行雜化物形成而對剪接進行的抑制；通過在結(jié)合翻譯起始因子的部位用一序列進行雜化物形成而對翻譯起始進行的抑制；通過在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合部位用一序列進行雜化物形成而對翻譯進行的抑制；通過在mRNA的翻譯區(qū)或多核糖體結(jié)合部位用一序列進行雜化物形成而對肽鏈的延伸進行的抑制；以及通過在蛋白質(zhì)與核酸相互作用的部位用一序列進行雜化物形成而對基因表達進行的抑制。因此，通過對例如轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯等多種過程進行抑制，反義核酸承卩制了目沖示基因的表達(Hirashima和Inoue，ShinSeikagakuJikkenKoza2(NewLectureforExperimentalBiochemistry2),KakusanIV(NucleicAcidIV),ReplicationandExpressionofGenes;Ed"JapaneseBiochemicalSociety,TokyoKagakuDozinCo"Ltd.,pp.319-347，1993)。在本發(fā)明中使用的反義核酸可以通過上面描述的任一種作用來抑制Int6基因的表達。在一個實施方案中，設計一種與Int6基因mRNA的5'非翻譯區(qū)互補的反義序列，因此期待該反義序列能有效地抑制該基因的翻譯。與編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)互補的序列也可用于該目的。因此，包含與Int6基因的翻譯區(qū)和非翻譯區(qū)的序列相應的反義序列的核酸也包括在用于本發(fā)明的反義核酸之列。待用的反義核酸在適當?shù)膯幼酉掠芜B接，并優(yōu)選與在3'端包含轉(zhuǎn)錄終止信號的序列連接。如此制備的核酸可被用于通過已知的方法來對所需動物進行轉(zhuǎn)化。反義核酸序列優(yōu)選與轉(zhuǎn)化的動物中內(nèi)源Int6基因的序列或其一部分互補，但是，只要反義核酸能有效地抑制基因表達，就不需要完全互補。轉(zhuǎn)錄的RNA優(yōu)選與目標基因轉(zhuǎn)錄物有90%或更高的互補性，更優(yōu)選有95。/。或更高的互補性。用于有效抑制目標基因(Int6)表達的反義核酸的長度優(yōu)選為至少15個核苷酸或更長，且少于25個核香酸。但是，本發(fā)明的反義核酸不限定為此長度，例如也可以為100個核苷酸或更長，或500個核苷酸或更長。本發(fā)明的反義不作特別限制，但是，其可以基于如由GenBank編號NM—001568獲得的Int6基因的核苷酸序列構(gòu)建而成。In16基因表達還可通過使用核糖核酸酶或核糖核酸酶的編碼DNA來得到抑制。核糖核酸酶指的是具有催化活性的RNA分子。核糖核酸酶具有多種活性，并且對于將核糖核酸酶作為RNA剪切酶使用的研究允許人們設計出以位點特異性方式剪切RNA的核糖核酸酶。核糖核酸酶如I型內(nèi)含子核糖核酸酶和MlRNA(它們是RNaseP核糖核酸酶)的長度為400個核普酸或更長。其他的核糖核酸酶如錘頭核糖核酸酶和發(fā)夾型核糖核酸酶具有包括約40個核苦酸的5舌寸生4立點(Koizumi,M.牙口Otsuka,E.,TanpakushitsuKakusanKoso(Protein,Nucleicacid,andEnzyme),35:2191，1990)。例如，錘頭核糖核酸酶的自溶區(qū)剪切G13U14C15序列的C15的3，端。U14和A9之間的堿基對在此活性中扮演了重要的角色，并且A15或U15也可以代替C15被剪切(Koizumi,M.等，F(xiàn)EBSLett,228:228,1988)。識別目標RNA序列UC、UU或UA的類限制性內(nèi)切酶的RNA剪切核糖核酸酶可通過設計核糖核酸酶，使底物結(jié)合位點與目標位點附近的RNA序列互補而得以制造(Koizumi,M.等，F(xiàn)EBSLett,239:285,1988;Koizumi,M.和Otsuka,E.,TanpakushitsuKakusanKoso(Protein,Nucleicacid,andEnzyme),35:2191,1990;以及Koizumi,M.等，Nucl,AcidsRes.，17:7059,1989)。發(fā)夾型核糖核酸酶也可被用于本發(fā)明的目的。這種核糖核酸酶在例如煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA的負鏈上被發(fā)現(xiàn)(Buzayan,J.M.,Nature,323:349,1986)。目標特異性的RNA剪切核糖核酸酶也可由發(fā)夾型核糖核酸酶來制造(Kikuchi，Y.和Sasaki,N.,Nucl.AcidsRes.，19:6751,1991;Kikuchi，H.,KagakutoSeibutsu(ChemistryandBiology),30:112,1992)。因此，在本發(fā)明中，Int6基因表達可以通過使用核糖核酸酶對In16基因轉(zhuǎn)錄物特異性消化而得到抑制。使用核糖核酸酶的方法曾被作為特異性地抑制基因表達的方法使用(BegerC.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:130-135,2001),而近來RNA干涉(下文中簡稱為"RNAi")作為可更有效地抑制基因表達的方法而備受關(guān)注。由于RNAi效果而具有抑制活性的核酸通常也被稱為siRNA。RNAi是這樣一種現(xiàn)象，其中通過將具有短雙鏈RNA(下文中筒稱為"dsRNA")(由與目標基因的mRNA同源的有義RNA和由其互補序列構(gòu)成的反義RNA構(gòu)成)導入細胞等，誘導目標基因mRNA的破壞，并抑制目標基因的表達。因此，RNAi可抑制目標基因的表達，并因此作為敲除基因的簡單方法受到關(guān)注，其取代了復雜而又低效的同源重組的傳統(tǒng)基因破壞法，并成為基因治療的一種可行方法。用于RNAi的RNA并不需要與Int6基因或該基因的部分區(qū)域完全相同，但是，完全相同是優(yōu)選的。上述(c)中所述的核酸(siRNA)的優(yōu)選方案是對Int6基因具有RNAi效果的雙鏈RNA。更特殊的例子包括這樣的雙鏈RNA,其包含與核苷酸序列SEQIDNO:l的部分序列相應的有義RNA和反義RNA。盡管RNAi機制的詳情仍有部分不清楚，但確信被稱為DICER的酶(RNaseIII核酸酶家族中的一員)與雙鏈RNA接觸，后者被分解為被稱為小干涉RNA(或稱siRNA)的小片段。本發(fā)明具有RNAi效果的雙鏈RNA還包含被DICER分解前的雙鏈RNA。換句話說，由于即使本身不具有RNAi效果的長鏈RNA也會在細胞中分解以形成具有RNAi效果的siRNA,所以本發(fā)明的雙鏈RNA的長度沒有特別的限制。例如，與本發(fā)明的Int6基因的mRNA的全長或接近全長的區(qū)域相應的長雙鏈RNA可以用DICER進行預分解，其分解產(chǎn)物可以作為本發(fā)明的藥劑使用。該分解產(chǎn)物被期待包含具有RNAi效果的雙鏈RNA分子(siRNA)。在該方法中，對于期待具有RNAi效果的mRNA區(qū)域不用特別地進行選擇。因此，對于具有RNAi效果的本發(fā)明的Int6基因的mRNA上的區(qū)域不用特別精確地進行規(guī)定。對于上述RNA分子，在一端上具有封閉結(jié)構(gòu)的分子，如包含發(fā)夾型結(jié)構(gòu)的siRNA(shRNA),也包含在本發(fā)明中。因此，可在分子內(nèi)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)的單鏈RNA分子也包含在本發(fā)明中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于成為雙鏈RNA目標的本發(fā)明Int6基因的核苷酸序列合適地制備本發(fā)明的"通過RNAi效果而得到抑制的雙鏈RNA"。例如，本發(fā)明的雙鏈RNA可基于核苷酸序列SEQIDNO:l來制備。更具體地，本領(lǐng)域的^支術(shù)人員可適宜地選擇mRNA(其為基于核香酸序列SEQIDNO:1的序列的轉(zhuǎn)錄物)的任意連續(xù)RNA區(qū)域，并在通常的實驗范圍內(nèi)相應于該區(qū)域制備雙鏈RNA。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可利用公知的方法/人mRNA序列(其為該序列的轉(zhuǎn)錄物)中適宜地選擇具有較強RNAi效果的siRNA序列。如果所述鏈中的一條(例如，核苷酸序列SEQIDNO:l)被鑒定出，本領(lǐng)域的技術(shù)人員就可以容易地找出另一條鏈(互補鏈)的核苷酸序列。siRNA可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用可商購的核酸合成儀來合適地制備。為合成所需的RNA,可使用常規(guī)的委托合成月良務(contractsynthesisservice)。此外，可表達本發(fā)明RNA的DNA(載體)也包括在能抑制本發(fā)明Int6基因表達的化合物的優(yōu)選方案之列。例如，可表達本發(fā)明雙鏈RNA的DNA(載體)是包含以下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，編碼雙鏈RNA中一條鏈的DNA與編碼雙鏈RNA中另一條鏈的DNA通過啟動子相連，從而它們中的每一個都可以纟皮表達。本發(fā)明的這種DNA可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用常規(guī)的遺傳工程技術(shù)來合適地制備。更具體地，本發(fā)明的表達載體可通過在各種公知表達載體中合適地插入編碼本發(fā)明RNA的DNA來制備。本發(fā)明的抑制表達的物質(zhì)例如包括可通過連接到Int6上的表達調(diào)控區(qū)(例如，啟動子區(qū))來抑制Int6表達的化合物。這種化合物例如可通過一種使用Int6啟動子DNA片段并使用結(jié)合DNA片段的活性作為指標的篩選方法來獲得。此外，所需化合物是否能抑制本發(fā)明Int6的表達可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用公知方法如報告分析法來合適地確定。此外，可表達本發(fā)明RNA的DNA(載體)也包括在能抑制本發(fā)明Int6基因表達的化合物的優(yōu)選方案之列。例如，可表達本發(fā)明雙鏈RNA的DNA(載體)是包含以下結(jié)構(gòu)的DNA，在該結(jié)構(gòu)中，編碼雙鏈RNA中一條鏈的DNA與編碼雙鏈RNA中另一條鏈的DNA通過啟動子相連，從而它們中的每一個都可以被表達。本發(fā)合適地制備。更具體地，本發(fā)明的表達載體可通過在各種公知表達載體中合適地插入編碼本發(fā)明RNA的DNA來制備。本發(fā)明載體的一個優(yōu)選方案包括表達能抑制Int6表達的siRNA的載體。例如，這些載體中表達siRNA區(qū)域的核苷酸序列可包括圖1所示的序列(SEQIDNOs:57)，^旦不限于此。本發(fā)明siRNA的一個優(yōu)選例子是包含如下結(jié)構(gòu)的一種siRNA,在該結(jié)構(gòu)中，圖1所示每一個核苷酸序列中被描述為有義寡核苷酸和反義寡核苷酸的區(qū)域的各自序列被雜交。本發(fā)明的抑制表達的物質(zhì)例如包括可通過連接到Int6上的表達調(diào)控區(qū)(例如，啟動子區(qū))來抑制Int6表達的化合物。這種化合物例如可通過一種使用Int6啟動子DNA片段并使用結(jié)合DNA片段的活性作為指標的篩選方法來獲得。此外，所需化合物是否能抑制本發(fā)明Int6的表達可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用公知方法如報告分析法來合適地確定。本發(fā)明還提供低氧應激反應促進劑，其包含抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)作為有效成分。由于Int6蛋白與HIF2a結(jié)合并具有抑制HIF2a功能的功能，對Int6蛋白功能的抑制就活化了HIF2a的功能，并提高了轉(zhuǎn)錄低氧應激應答基因的功能。因此，抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)被認為作為低氧應激反應促進劑是有用的。本發(fā)明的抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)例如包括如下的化合物(a)與Int6蛋白結(jié)合的抗體；(b)與Int6蛋白結(jié)合的低分子量化合物；以及(c)抑制Int6蛋白與HIF2ot蛋白之間的結(jié)合活性的化合物。與Int6蛋白結(jié)合的抗體(抗Int6抗體)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備。當抗體為多克隆抗體時，它們例如可通過如下方法來制備用天然Int6蛋白，或在微生物如大腸桿菌中與GST表達成為融合蛋白的(重組)Int6蛋白，或其部分肽，對小動物如兔進行免疫，得到抗血清。可使用例如硫酸銨沉淀、A蛋白柱、G蛋白柱、DEAE離子交換層析、固定化有Int6蛋白或其合成肽的親和柱等從血清中純化得到抗體。另外，單克隆抗體可通過如下方法來制備用Int6蛋白或其部分肽對小動物如小鼠進行免疫，摘除脾臟，輕輕地研磨脾臟以分離出細胞，用例如聚乙二醇等試劑將該細胞與骨髓瘤細胞融合，然后篩選融合細胞以選擇能產(chǎn)生與Int6蛋白結(jié)合的抗體的克隆。其后，將這些雜交瘤移植到小鼠的腹膜腔中，然后從同一小鼠中收集腹水。如此制備的單克隆抗體可使用例如硫酸銨沉淀、A蛋白柱、G蛋白柱、DEAE離子交換層析、固定化有Int6蛋白或合成肽的親和柱等進行純化。本發(fā)明的抗體沒有特別限制，只要它們能與本發(fā)明的Int6蛋白結(jié)合，并且，除多克隆抗體和單克隆抗體之外，本發(fā)明的抗體還包括人類抗體、通過基因重組制備的人源化抗體以及它們的抗體片段和改良抗體。作為用來得到抗體的致敏原使用的本發(fā)明的Int6蛋白對得到它們的動物種類沒有限制，但優(yōu)選來源于哺乳動物如小鼠或人類的蛋白質(zhì)，而來源于人類的蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的。來源于人類的基酸序列合適地獲得。在本發(fā)明中作為免疫抗原使用的蛋白質(zhì)可以是全長的蛋白質(zhì)或來源于這些蛋白質(zhì)的部分肽。所述部分蛋白肽例如包括蛋白質(zhì)的氨基(N)末端片段和羧基(C)末端片段。在此使用的"抗體，，指的是與全長蛋白質(zhì)或其片段反應的抗體。生所需抗體并具有蛋白結(jié)合活性的雜交瘤還可通過下述方法體外制備用蛋白質(zhì)、表達蛋白質(zhì)的細胞或這些細胞的溶胞產(chǎn)物來使人類淋巴細胞致敏，如被EB病毒侵染的人類淋巴細胞，然后將這些致敏淋巴細胞與永生化人類淋巴細胞如U266細胞一起融合。本發(fā)明的抗Int6蛋白抗體通過與Int6蛋白結(jié)合來抑制Int6蛋白的功能，并且被期待具有例如改善或治療血管疾病的效果。當所得到的抗體被用于為人類給藥的目的(抗體療法)時，人類抗體或人源化抗體由于其低的免疫原性而是優(yōu)選的。此外，本發(fā)明包括與Int6蛋白結(jié)合的低分子量物質(zhì)作為能抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)。本發(fā)明與Int6蛋白結(jié)合的低分子量物質(zhì)可以是天然化合物或人工化合物。通常，它們是可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制造或得到的化合物。此外，本發(fā)明的化合物還可通過以下將要描述的篩選方法獲得。與Int6蛋白結(jié)合并抑制其功能的上述低分子量化合物(b)的例子包括對Int6具有高親和性的化合物。本發(fā)明抑制Int6功能的物質(zhì)的優(yōu)選方案例如包括抑制HIF2a與Int6之間的結(jié)合(互作)的化合物。這些化合物通過抑制HIF2a與Int6之間的結(jié)合而提高了作為轉(zhuǎn)錄因子的游離HIF2a的量，結(jié)果，認為它們促進了低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明能抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)的例子包括對于Int6蛋白具有顯性失活特性的Int6蛋白突變體(Int6顯性失活蛋白質(zhì))。"對于Int6蛋白具有顯性失活特性的Int6蛋白突變體"指的是具有通過表達編碼蛋白質(zhì)的基因而消除或減少內(nèi)源野生型蛋白質(zhì)的活性的功能的蛋白質(zhì)。更具體地，Int6顯性失活蛋白質(zhì)的例子包括失去了與HIF2a結(jié)合的活性的蛋白質(zhì)。Int6顯性失活蛋白質(zhì)的例子包括這樣一種蛋白質(zhì)，其中Int6蛋白的C末端已經(jīng)缺失(Int6-AC)。具體而言，這種Int6-AC例如是這樣一種Int6蛋白突變體，其中Int6蛋白的C末端區(qū)中的PINT區(qū)域已經(jīng)缺失(見圖2)。本發(fā)明所提供的低氧應激反應促進劑由于其具有誘導(促進)血管發(fā)生的效果而被期待對血管疾病具有療效。因此，本發(fā)明提供血管疾病治療劑(醫(yī)藥組合物)，其包含本發(fā)明的低氧應激反應促進劑作為有效成分。本發(fā)明提高Int6表達或其功能的物質(zhì)被期待具有通過降低HIF2a轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能而減少低氧應激反應的功能。因此，本發(fā)明提供低氧應激反應抑制劑，其包含提高Int6蛋白表達或其功能的物質(zhì)作為有效成分。"蛋白表達的提高"包括基因轉(zhuǎn)錄水平的提高以及由轉(zhuǎn)錄物進行翻譯的水平的提高。這種物質(zhì)的例子包括提高Int6與HIF2a之間的結(jié)合(互作)的物質(zhì)。這些物質(zhì)可通過將Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性作為指標對提高結(jié)合活性的物質(zhì)進行篩選而適宜地得到。由于本發(fā)明所提供的低氧應激反應抑制劑具有抑制(阻礙)血管發(fā)生的效果，期待它們對于與血管發(fā)生有關(guān)的疾病(血管發(fā)生相關(guān)疾病)如癌癥具有療效。期待對其具有療效的癌癥的例子優(yōu)選包括乳癌、結(jié)腸癌、口腔癌、咽癌和喉癌、食道癌、胃癌、肝癌、腎癌、膀胱癌和子宮癌。除癌癥外，由于抑制血管發(fā)生而期待對其具有療效的疾病例如包括視網(wǎng)膜內(nèi)異常血管增加的疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜變性，以及肺動脈高壓。對于HIF2a轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能的抑制不僅抑制(阻礙)了血管發(fā)生，還可對紅細胞增多或糖尿病中的糖代謝異常具有效果。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，雌性激素抑制Int6的表達。更具體地，雌性激素通過對Int6基因表達進行抑制，從而提高了HIF2oc促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄的活性，結(jié)果，認為其促進了血管發(fā)生。因此，雌性激素對于例如治療其病理通過改善血流量而得到改善的疾病(例如，閉塞性動脈硬化)是有效的。雌性激素是在本發(fā)明中抑制Int6表達的優(yōu)選物質(zhì)。更具體地，雌性激素的例子為雌激素、孕酮等。同時，除雌性激素外，提高Int6蛋白表達或其功能的物質(zhì)還包括雌性激素分泌促進劑、雌性激素受體激動劑等。雌性激素抑制劑被期待能通過提高Int6基因的表達來減少血管發(fā)生，并因此降低HIF2a促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄的活性。因此，雌性激素抑制劑對于例如治療其病理通過抑制血管發(fā)生而得到改善的疾病(例如，癌癥)是有用的。本發(fā)明還涉及載體細胞，其Int6基因表達已被抑制，并且血管發(fā)生已被誘導。這種細胞纟皮期待對于血管疾病具有療效。本發(fā)明"載體細胞"的例子包括成纖維細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。Int6基因表達例如可通過使用Int6的siRNA來得到抑制。本發(fā)明提供與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑和抗腫瘤醫(yī)藥組合物)，其包含本發(fā)明的低氧應激反應抑制劑作為有效成分。與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的優(yōu)選方案的例子包括這樣的與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑，其包含雌性激素抑制劑作為有效成分。此外，本發(fā)明提供Int6基因表達被人為地抑制了的非人類轉(zhuǎn)基因動物(在本說明書中，其被描述為"非人類轉(zhuǎn)基因動物"、"基因敲除非人類動物"或單純的"動物")。本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因動物可被有利地用來例如篩選治療需要調(diào)節(jié)低氧應激反應的疾病的藥劑。它們還作為用于闡明這些疾病的機理以及低氧應激反應的研究的實驗模型動物非常有用。本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因動物包括所謂的"基因敲除動物"，其基因表達通過反義RNA或siRNA的作用而被抑制。本發(fā)明中"lnt6基因表達被人為地抑制了的"狀態(tài)的例子包括(1)Int6基因的表達通過遺傳修飾(在基因?qū)χ兄换騼烧咧羞M行核苷酸插入、缺失或取代)的存在而得到抑制的狀態(tài)；以及(2)基因表達通過本發(fā)明核酸(例如反義RNA或siRNA)的作用而得到抑制的狀態(tài)。本發(fā)明中的"抑制"包括Int6基因表達被完全抑制的情況，以及與野生型動物中Int6基因表達水平相比，在本發(fā)明的動物中Int6基因表達水平明顯降低的情況。上述狀態(tài)(l)還包括Int6基因的基因?qū)χ袃H一個基因的表達被抑制的情況。存在基因修飾的區(qū)域在本發(fā)明中不作特別限定，只要它們是抑制基因表達的區(qū)域即可，其例子包括外顯子區(qū)域和啟動子區(qū)域。公知的遺傳工程技術(shù)來制備。例如，可通過如下方法制備基因敲除小鼠。首先，將包含本發(fā)明Int6基因的外顯子區(qū)域的DNA從小鼠中分離，并在此DNA片段中插入合適的標記基因來構(gòu)建目標載體。通過電穿孔法等將此目標載體導入到小鼠ES細胞系中，并選擇已經(jīng)歷同源重組的細胞系。待插入的標記基因優(yōu)選是抗生素抗性基因，例如新霉素抗性基因。在抗生素抗性基因插入后，可通過在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來選擇已經(jīng)歷同源重組的細胞系?；蛘撸瑸楦行У剡x擇，可將胸苷激酶等與目標載體連接。這樣，去除了已經(jīng)歷非同源重組的細胞系。通過PCR或Southernblotting進行同源重組分析，還可有效地獲得這樣的細胞系，其中本發(fā)明基因的基因?qū)χ械囊徽咭咽Щ?。在選擇已發(fā)生同源重組的細胞系時，由于因基因插入而在同源重組位點之外的部位有發(fā)生未知基因破壞的危險，優(yōu)選使用多個克隆以產(chǎn)生嵌合體。嵌合小鼠可通過將所得的ES細胞系注射到小鼠胚盤中獲得。通過使這些嵌合小鼠雜交，可獲得在本發(fā)明Int6基因的基因?qū)χ械囊徽咭咽Щ畹男∈?。此外，通過使這些小鼠雜交，可獲得在本發(fā)明基因的基因?qū)χ械膬烧呔Щ畹男∈?。可使用相似的步驟來對除小鼠之外的ES細胞已建立的動物進行遺傳改良。本發(fā)明的基因敲除動物優(yōu)選是這樣的基因敲除動物，其中通過將本發(fā)明的核酸導入到非人類動物中而使Int6基因表達得到抑制。等)得到表達而構(gòu)建的載體導入到非人類動物中來進行構(gòu)建。列SEQIDNO:5、6或7且表達siRNA的載體頸背皮下注射到非人類動物中來進行制備。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的類型不作特別限定，只要它們是非人類動物即可，但它們通常是哺乳動物，優(yōu)選為靈長類動物。更具體地，本發(fā)明的動物優(yōu)選為小鼠、大鼠、蠅、線蟲(C.五/ega朋)、牛、豬、鳥或羊，更優(yōu)選小鼠。當在植物中存在相應于Int6的基因時，也有可能制備定位該基因的敲除(轉(zhuǎn)基因)植物。在一個優(yōu)選方案中，本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因動物是(但并不限定為)這樣一種動物，其中Int6基因表達通過從以下(a)(c)中選出的任一種核酸的作用而得到抑制(a)Int6基因轉(zhuǎn)錄物或其一部分的反義核酸；(b)具有特異地剪切Int6基因轉(zhuǎn)錄物的核糖核酸酶活性的核酸；和(c)具有利用RNAi效果來抑制Int6基因表達的功能的核酸。由于在本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因動物中Int6基因的表達被抑制且血管發(fā)生被誘導，該動物對于例如篩選抑制血管發(fā)生的物質(zhì)或藥劑(與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑))并分析血管發(fā)生的機制特別有用。此外，本發(fā)明提供利用Int6表達水平或活性作為指標來篩選血管疾病治療劑的方法。減少(抑制)Int6基因的表達水平的化合物被預期作為治療血管疾病的潛在藥劑。反之，增加(提高)Int6基因表達水平的化合物被預期作為治療由血管發(fā)生引起的疾病(如癌癥)的潛在藥劑。本發(fā)明方法的優(yōu)選方案是這樣一種篩選血管疾病治療劑的方法，其包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6基因表達細胞接觸；(b)測定所述細胞中Int6基因表達的水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物降低了表達水平。本發(fā)明方法的其他方案是這樣一種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，其包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6基因表達細胞接觸；(b)測定所述細胞中Int6基因表達的水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物提高了表達水平。在上述方法中，首先將測試化合物與表達Int6基因的細胞接觸。所使用的"細胞，，可以是來源于人類、小鼠、大鼠等的細胞，但不限于來源于它們的細胞，并且還可以使用已經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達Int6的微生物(如大腸桿菌)和酵母的細胞。表達內(nèi)源Int6基因的細胞或者通過導入外源Int6基因來表達該基因的細胞可以作為"表達Int6基因的細胞，，使用。通常，表達外源Int6基因的細胞可以通過將插入有Int6基因的表達載體導入到宿主細胞中來制備。這些表達載體可通過常規(guī)的遺傳工程技術(shù)來制備。本方法中使用的測試化合物并無特別限制，其例如包括單一化合物，如天然化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質(zhì)和肽，以及化學品庫，基因庫的表達產(chǎn)物，細胞提取物，細胞培養(yǎng)的上清液，細菌發(fā)酵產(chǎn)物、海洋生物提取物和植物提取物。通常，但無任何限制的意思，通過將測試化合物加入到表達Int6基因的細胞的培養(yǎng)基中以使該測試化合物與表達Int6基因的細胞接觸。當測試化合物是一種蛋白質(zhì)時，所述接觸可通過將允許蛋白表達的DNA載體導入到細胞中來實現(xiàn)。這些方法的接下來的步驟包括確定Int6基因的表達水平。這里短語"基因表達"指的是轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者?；虮磉_水平可通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來確定。例如，mRNA可通過將該mRNA作為模板用常規(guī)方法從表達Int6基因的細胞中提取出來，基因的轉(zhuǎn)錄水平可通過使用Northern雜交法或RT-PCR來確定?；蛘?，基因的轉(zhuǎn)錄水平可通過從表達Int6基因的細胞中收集蛋白部分來確定，然后Int6蛋白的表達可通過電泳法如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來檢測。此外，基因的翻譯水平可通過使用蛋白質(zhì)的抗體，用Westernblotting分析檢測Int6蛋白的表達來確定。用于Int6蛋白檢測的抗體的類型沒有限制，只要蛋白質(zhì)能被檢測即可。這種抗體例如包括單克隆抗體和多克隆抗體。在本方法接下來的步驟中，與在測試化合物未接觸的情況(對照組)下測定的表達水平相比，提高或降低了表達水平的化合物被選出。降低表達水平的化合物成為血管疾病治療劑，而提高表達水平的化合物成為治療那些以顯示出抑制血管發(fā)生為療效的疾病(如癌癥)的治療劑。本發(fā)明篩選方法的另一個方案是通過使用報告基因的表達作為指標來選擇降低或提高本發(fā)明Int6基因的表達水平的化合物的方法。本發(fā)明上述方法的優(yōu)選方案為包括以下步驟(a)(c)的篩選血管疾病治療劑的方法(a)將測試化合物與細胞或細胞提取液接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA，在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接；(b)測定所述報告基因的表達水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物降低了表達水平。此外，本發(fā)明上述方法的另外的方案為包括以下步驟(a)(c)的篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法(a)將測試化合物與細胞或細胞提取液接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接；(b)測定所述報告基因的表達水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物提高了表達水平。在這些方法中，測試化合物首先與細胞(或細胞提取液)接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接。這里所使用的短語"可操作地進行連接"指的是，Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)與報告基因以這樣一種方式連接，該方式使得當轉(zhuǎn)錄因子與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合時，可誘導報告基因的表達。這樣，即使當報告基因與其他基因連接并因此形成了具有該基因產(chǎn)物的融合蛋白時，所述連接仍可用短語"可操作地進行連接"來表達，只要當轉(zhuǎn)錄因子與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)結(jié)合時融合蛋白的表達被誘導即可。通過使用公知方法并基于Int6基因的cDNA核苷酸序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可從基因組中獲得Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。在這些方法中使用的報告基因的類型沒有限制，只要其表達能被檢測即可。這樣的報告基因例如包括CAT基因、lacZ基因、焚光素酶基因和GFP基因。"包含使報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接的DNA結(jié)構(gòu)的細胞"例如包括導入了插入有該結(jié)構(gòu)的載體的細胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過使用常規(guī)的遺傳工程技術(shù)來制備該載體。這樣的載體可通過使用常規(guī)的方法，例如磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofectamine)法、顯微注射法等導入到細胞中。"包含使報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接的DNA結(jié)構(gòu)的細胞"還包括所述結(jié)構(gòu)已被插入到其染色體中的細胞。該DNA結(jié)構(gòu)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的方法如使用了同源重組的基因轉(zhuǎn)移法來插入到染色體中。"包含使報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接的DNA結(jié)構(gòu)的細胞的提取物"例如包括通過將DNA添加到細胞提取物(包含在市售的體外轉(zhuǎn)錄翻譯試劑盒中)中而制備的混合物，其中，所述添加的DNA具有使報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接的結(jié)構(gòu)。在該方法中，"接觸"可通過將測試化合物添加到"包含使報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接的DNA結(jié)構(gòu)的細胞"的培養(yǎng)基中來實現(xiàn)，或者可通過將測試化合物添加到包含所述DNA的上述市售細胞提取物中來實現(xiàn)。當測試化合物是蛋白質(zhì)時，所述接觸還可通過例如將表達這些蛋白質(zhì)的DNA載體導入到細胞中來實現(xiàn)。這些方法中的接下來的步驟是確定報告基因的表達水平。報告基因的表達水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的取決于報告基因類型的方法來確定。例如，當報告基因是CAT基因時，其表達水平可通過對氯霉素的乙?；?其由CAT基因產(chǎn)物介導)進行檢測來確定。當報告基因是lacZ基因時，表達水平可通過對顯色化合物中的顯色(由lacZ基因表達產(chǎn)物的催化作用介導)進行檢測來確定。當報告基因是熒光素酶基因時，表達水平可通過對熒光化合物的熒光(由熒光素酶基因表達產(chǎn)物的催化作用介導)進行檢測來確定。或者，當報告基因是GFP基因時，表達水平可通過對GFP蛋白的熒光進行檢測來確定。在本方法中，接下來，與在沒有測試化合物存在時測定的表達水平相比，降低(抑制)或增加(提高)了所測定的報告基因表達水平的化合物被選出。降低(抑制)表達水平的化合物成為治療血管疾病的藥劑，而增加(提高)表達水平的化合物成為對抑制血管發(fā)生顯示出療效的疾病(如癌癥)的治療劑。本發(fā)明篩選方法的另外的方案為將Int6蛋白活性作為指標的方法。例如該方法為篩選血管疾病治療劑的方法，其包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液接觸；(b)測定所述蛋白的活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的活性相比，該化合物降低了所述蛋白的活性。本發(fā)明上述方法的另外的方案例如為篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，其包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液接觸；(b)測定所述蛋白的活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的活性相比，該化合物提高了所述蛋白的活性。在本方法中，首先，將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液接觸。接下來，測定Int6蛋白的活性。Int6蛋白的活性的例子包括與HIF2a蛋白的結(jié)合活性(互作活性)。該活性可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用公知方法如免疫沉淀法或酵母雙雜交方法來合適地測定。HIF2a中與Int6蛋白結(jié)合有關(guān)的氨基酸區(qū)域為HIF2a的氨基酸區(qū)域(SEQIDNO:4)的第571700位。因此，舉例來說，結(jié)合活性可通過使用包含HIF2a蛋白的上述氨基酸區(qū)域的多肽片段來測定。HIF2a基因的核苷酸序列表示為SEQIDNO:3，由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列表示為SEQIDNO:4。HIF2a基因在公共基因數(shù)據(jù)庫中的編號為NM—001430。此外，與在沒有測試化合物存在時測定的活性相比，降低(抑制)或增加(提高)了該蛋白活性的化合物被選出。降低(抑制)活性的化合物成為治療血管疾病的藥劑，而增加(提高)活性的化合物成為對抑制血管發(fā)生顯示出療效的疾病(如癌癥)的治療劑。本發(fā)明篩選方法的其他方案的例子包括將Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性作為指標的方法。本發(fā)明的Int6蛋白是具有與HIF2a蛋白結(jié)合(互作)的活性的蛋白質(zhì)。因此，通過將Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性作為指標，對提高該結(jié)合活性的物質(zhì)或降低(抑制)該結(jié)合活性的物質(zhì)進行選擇，使得對治療血管疾病的藥劑或?qū)σ种蒲馨l(fā)生顯示出療效的疾病(如癌癥)的治療劑的篩選成為可能。本發(fā)明的方法例如為篩選血管疾病治療劑的方法，其包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白和HIF2a蛋白接觸；(b)測定Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，該化合物降低了所述結(jié)合活性。本發(fā)明的上述方法例如包括篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑(例如抗癌劑)的方法，其包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白和HIF2a蛋白接觸；(b)測定Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，該化合物提高了所述結(jié)合活性。在本方法中，首先，將測試化合物與Int6蛋白和HIF2a蛋白接觸。接著，測定Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性。通常，Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合(互作)活性可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地進行測定，上述步驟(b)中的結(jié)合活性可通過常規(guī)方法如共免疫沉淀法合適地進行測定。在該方法中使用的Int6蛋白和HIF2a蛋白優(yōu)選是不含突變的野生型蛋白質(zhì)，但只要它們具有互作活性，它們也可以是氨基酸序列中的一部分被取代或缺失的蛋白質(zhì)(多肽)。在上述方法中使用的Int6蛋白優(yōu)選是不含突變的野生型蛋白質(zhì)(全長蛋白質(zhì))，但只要它保持與HIF2a蛋白的結(jié)合活性，它也可以是部分肽片段，或氨基酸序列中的一部分被取代或缺失的蛋白質(zhì)(多肽)。Int6蛋白中與HIF2a蛋白結(jié)合有關(guān)的區(qū)域通常是存在于N末端的被稱為"結(jié)構(gòu)域1(Domainl)"的區(qū)域。因此，在上述方法中橫_用的Int6蛋白可以是包含"結(jié)構(gòu)域1"的蛋白質(zhì)的部分肽片段。"結(jié)構(gòu)域l"是與SEQIDNO:2所示的Int6蛋白的氨基酸序列中第1~80^f立乂于應的區(qū)i或。接下來，上述方法選擇了與沒有測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，降低(抑制)或增加(提高)了結(jié)合活性的化合物。降低(抑制)結(jié)合活性的化合物成為治療血管疾病的藥劑，而增加(提高)結(jié)合活性的化合物成為對抑制血管發(fā)生顯示出療效的疾病(如癌癥)的治療劑。在本發(fā)明的上述非人類轉(zhuǎn)基因動物中，Int6基因表達被抑制，結(jié)果，觀察到了明顯的血管發(fā)生的效果。通過使用這些非人類轉(zhuǎn)基因動物，可有效地對抑制血管發(fā)生的化合物進行篩選。通過該篩選方法獲得的化合物被期待成為與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的潛在治療劑(例如抗癌劑)。本發(fā)明的篩選方法是使用本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因動物的方法，并且使用血管發(fā)生效果或Int6的表達或功能(活性)作為指標。上述方法例如是篩選血管疾病治療劑的方法，其包括如下步驟(a)用測試化合物對本發(fā)明的非人類轉(zhuǎn)基因動物給藥；(b)測定所述非人類轉(zhuǎn)基因動物中的Int6表達水平或活性，或測定所述動物中的血管發(fā)生效果；并且(C)選擇一種化合物，與沒有用所述測試化合物給藥的情況(對照組)相比，該化合物降低了血管發(fā)生效果，或該化合物提高了Int6表達水平或活性。在本方法中，首先，用測試化合物對非人類轉(zhuǎn)基因動物給藥。測試化合物可通過口服或腸外方式給藥，但當測試化合物是肽時，優(yōu)選腸外給藥。更具體地，給藥可包括血管給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)肺給藥和經(jīng)皮給藥。血管給藥的例子包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射和皮下注射，并且給藥方式可以是全身的或局部的。當DNA是測試化合物時，它們可通過病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和仙臺病毒以及非病毒載體如脂質(zhì)體給藥到身體中。給藥方法的例子包括體內(nèi)方法和體外的方法。接下來，測定非人類轉(zhuǎn)基因動物(或源自這些動物的組織或細胞)中Int6的表達水平或活性?；蛘?，觀察這些動物(或源自這些動物的組織)中的血管發(fā)生效果。然后，與沒有用測試物質(zhì)給藥的情況(對照組)相比，降低Int6基因的表達水平或活性的化合物或抑制血管發(fā)生的化合物被選出。本發(fā)明的藥劑可與藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等混合作為醫(yī)藥組合物口服給藥或腸外給藥?？诜┛杀恢瞥深w粒劑、散劑、片劑、膠嚢劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等劑型。腸外用劑可選擇注射劑、滴注劑、外用劑或栓劑等劑型。注射劑可包括皮下注射劑、肌肉注射劑和腹腔內(nèi)注射劑。外用劑可包括經(jīng)鼻給藥劑和軟膏劑。調(diào)配這些劑型以將本發(fā)明的藥劑作為主成分包含在內(nèi)的技術(shù)是公知的。舉例來說，可通過將賦形劑、崩解劑、粘合劑、滑潤劑等添加到本發(fā)明的藥劑中，將它們混合，然后將混合物壓縮成型制備出用于口服給藥的片劑。作為賦形劑，通常使用乳糖、淀粉、甘露醇等。作為崩解劑，通常使用碳酸鈣、羧曱基纖維素鈣等。作為粘合劑，通常使用阿拉伯樹膠、羧曱基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮。作為滑潤劑，滑石、硬脂酸鎂等是公知的。包含本發(fā)明藥劑的片劑可用公知的方法包衣來掩蔽或形成腸溶制劑。作為包衣用劑，可使用乙基纖維素、聚乙二醇等。注射劑可通過將作為主成分的本發(fā)明藥劑與合適的分散劑一起溶解來獲得，或者通過溶解或分散于分散介質(zhì)中來獲得。通過選擇分散介質(zhì)，可制備出水型或油型的劑型。為制備水型劑型，應使用蒸餾水、生理鹽水、林格液等作為分散介質(zhì)。對于油型劑型，可使用各種植物油、丙二醇等作為分散介質(zhì)。如果需要，還可以添加防腐劑，如對羥基苯曱酸酯。在注射劑中，還可添加公知的等滲劑，如氯化鈉、葡萄糖等。此外，還可添加鎮(zhèn)痛劑，如苯扎氯銨或鹽酸普魯卡因。'此外，當本發(fā)明的藥劑被配合到固狀、液狀或半固狀組合物中時，還可作為外用劑使用。固狀或液狀組合物可通過形成與前面描述的類似的組合物而被制成外用劑。半固狀組合物可通過將增稠劑添加到根據(jù)所需的合適溶劑中來制備。作為溶劑，可使用水、乙醇、聚乙二醇等。作為增稠劑，通常使用皂粘土、聚乙烯醇、丙烯酸、曱基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮等。還可在該組合物中添加防腐劑，如苯扎氯銨。此外，栓劑可通過結(jié)合使用油性基材如可可脂或水性膠基如纖維素衍生物作為載體來制備。本發(fā)明的藥劑在被認為是安全的劑量范圍內(nèi)以所需量為包括人類在內(nèi)的哺乳動物給藥。本發(fā)明藥劑的劑量可通過考慮劑型的類型、給藥方式、病人的年齡和體重、病人的癥狀等來合適地進行確定，但最終由醫(yī)師或獸醫(yī)來決定。本發(fā)明中的"治療劑"包括具有預防效果以及治療效果的藥劑。文中提到的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻都并入于此作為參考。實施例以下，將參照實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但不能認為本發(fā)明受限于這些實施例。[實施例1]酵母雙雜交庫篩選通過酵母雙雜交方法(Clontech),用來自于人類心臟或腦的庫(pACT2-cDNA，Takara)篩選1.2x106個基因，以獲得克隆CL263。根據(jù)測序結(jié)果，鑒定出克隆CL263為Int6,這是因為克隆CL263中與HIF2a結(jié)合的區(qū)域的氨基酸序列與Int6的aa3-aal51相匹配。Int6的功能幾乎是未知的。至今，已知Int6包含三個部分。一些證據(jù)表明，正常的Int6功能對于預防小鼠和人的乳腺瘤的發(fā)生是重要的。[實施例2]酵母細胞中Int6與HIFla、HIF2a和HIF3a的特異相互作用通過酵母雙雜交方法評價了Int6與HIF2a之間的結(jié)合(互作)活性。結(jié)果示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>作為結(jié)果，僅發(fā)現(xiàn)HIF2a與Int6的組合具有a-半乳糖苷酶活性和j3-a-半乳糖苦酶活性，這表明HIF2a與Int6相互作用。[實施例3]MCF7、A549和COS7細胞中HIF2a與Int6之間的相互作用將質(zhì)粒pMepHA-Int6wt轉(zhuǎn)染三種細胞MCF7、A549和COS7。之后，發(fā)現(xiàn)Int6主要在細胞的細胞溶膠中表達。盡管由于細胞死亡而很難確認IF,但觀察到已轉(zhuǎn)移到細胞核中的一些Int6與HIF2a的局部化存在。發(fā)現(xiàn)當Int6與HIF2a—起轉(zhuǎn)染時，其抑制HIF2a的表達(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>[實施例4]Int6對HIF2a轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)對MCF7細胞進行實驗，以評價Int6中PINT(PCI)結(jié)構(gòu)域的存在是否影響HIF2a的轉(zhuǎn)錄活性，以及HIF2a的轉(zhuǎn)錄活性是否由Int6來調(diào)節(jié)。將MCF7細胞在正常氧狀態(tài)和低氧狀態(tài)培養(yǎng)4小時或24小時，其中使用了HIF2a、具有Int6PINT(PCI)結(jié)構(gòu)域(Int6wt)的野生型Int6以及通過分子生物方法將Int6PINT(PCI)結(jié)構(gòu)域去除的突變體(Int6-AC)。結(jié)果表明，Int6通過其PINT(PCI)結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)HIF2a的轉(zhuǎn)錄活性(圖2)。當與HIF2a共表達時，Int6-AC在正常氧狀態(tài)和低氧狀態(tài)下均能促進HIF2a的轉(zhuǎn)錄活性。Int6wt造成了MCF7細胞的細胞死亡，并且在正常氧狀態(tài)和低氧狀態(tài)下均能抑制HIF2a的轉(zhuǎn)錄活性(圖2)。[實施例5]Int6siRNA對內(nèi)源Int6基因表達的抑制進行實驗，以評價siRNA是否抑制內(nèi)源Int6。通過使用來自Ambion的pSilence2.1-U6載體，并且設計發(fā)夾型siRNAl(Int6siRNA145)、siRNA2(Int6siRNA219)和siRNA3(Int6siRNA358)的插入片段來制備siRNA表達質(zhì)粒。然后，將siRNA表達質(zhì)粒和Int6-AC轉(zhuǎn)染到MCF7細胞中。在正常氧狀態(tài)和低氧狀態(tài)下確定低氧反應元件(HRE)的熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)siRNA2在正常氧狀態(tài)和低氧狀態(tài)下均表現(xiàn)出對內(nèi)源Int6的最強的抑制(圖3A)。同時，正常氧狀態(tài)下Int6-AC在MCF7細胞中的表達通過免疫染色法來確定，沒有觀察到Int6-AC由于siRNA2的表達(圖3B)。另外發(fā)現(xiàn)，低氧狀態(tài)下HIF2a在MCF7細胞中的表達被siRNA2增強了(圖3C)。siRNA的生物體外抑制效果通過免疫染色法來確定。作為結(jié)果，被siRNAl、siRNA2和siRNA3抑制的Int6-AC表達的百分比分別為50%、100%和70%。所使用的人類Int6寡核苷酸序列如下1.5-Int6RNAi-145:gATCCC/AACATggTAgACTTTgCTA/TTCAAgAgA/TAgCAAAgTCTACCATgTT/TTTTTT/ggAAA(SEQIDNO:8)2.5-Int6RNAi-219:gATCCC/AAgAACCACAgTggTTgCA/TTCAAgAgA/TgCAACCACTgTggTTCTT/TTTTTT/ggAAA(SEQIDNO:5)3.5-Int6RNAi-358:gATCCC/AAgCATggTTTTAggCAgg/TTCAAgAgA/CCTgCCTAAAACCATgCTT/TTTTTT/ggAAA(SEQIDNO:6)這些核苷酸序列的每一個中，下劃線表示"有義寡核苷酸"和"反義寡核苷酸"。在這些區(qū)域中形成雙鏈的RNA分子起siRNA的作用。[實施例6]由siRNA產(chǎn)生的Int6基因表達敲除動物(1)制備封入了HVJ-E的siRNA按如下方式為每只小鼠制備封入了HVJ-E的siRNA:將40nL的1AUHVJ包膜(HVJ隱E):GenomONE隱Neo(IshiharaSangyo)置于微管中；在4°C下以12,000卬m的速度離心分離5分鐘進^f亍沉淀；加入10的0.5mg/mLpSilencer1.0V6小鼠Int6-219,或加入pSilencer1.0V6小鼠GAPDH作為對照，并將其混合；加入lliL的試劑B(封入劑)，并將其混合；在4。C下以12，000rpm的速度離心分離5分鐘進行沉淀；并且加入40pL的PBS，并通過移液20-30次達到懸浮。以上是根據(jù)GenomONE-Neo(IshiharaSangyo)的4吏用手冊進行的。(2)評價siRNA(Int6)對小鼠血管發(fā)生的效果使用IO周齡的雌性BALB/C小鼠(體重約25g)進行實驗。在用Int6載體型siRNA皮下注射兩日前，用脫毛膏對小鼠的頸背部進行處理。在實驗當日，對小鼠施以氟烷麻醉，并使用27GX3/4注射器將50pL的封入了HVJ-E的siRNA皮下注射到頸背部。其后，用普通的祠料和水銅養(yǎng)小鼠五日。接下來，通過扭斷頸部宰殺小鼠，并剝除以siRNA注射部為中心約1.5cm2的皮膚。在對皮膚背面照相后，用福爾馬林固定。與對照siRNA比較的結(jié)果顯示出，血管發(fā)生的促進以Int6siRNAl、Int6siRNA3和Int6siRNA2的次序依次增大。所使用的小鼠Int6寡核苷酸序列如下。每一寡核苷酸序列基于小鼠序列制備。(1)Int6siRNAl-145:5，-AATATggTggACTTTgCTA/TTCAAgAgA/TAgCAAAgTCCACCATATT/TTTTTT(SEQIDNO:9)(2)Int6siRNAi2-219:5，-AAgAACCACAgTTgTTgCg/TTCAAgAgA/CgCAACAACTgTggTTCTT/TTTTTT(SEQIDNO:10)(3)Int6siRNAi3-358:5，-AAACATgggTTTAggCAAg/TTCAAgAgA/CTTgCCTAAACCCATgTTT/TTTTTT(SEQIDNO:11)這些核苷酸序列的每一個中，下劃線表示"有義寡核苷酸"和"反義寡核苷酸"。在這些區(qū)域中形成雙鏈的RNA分子起siRNA的作用。[實施例7]激素處理對Int6mRNA表達的抑制將雌激素(雌二醇，E2)、孕酮(Progestin)或雌激素受體抑制劑三苯氧胺(40H-TAM)加入到乳癌細胞系MCF-7中。培養(yǎng)24小時后，將這些細胞的mRNA提取出來，并通過實時PCR對mRNA的量定量。作為結(jié)果，如圖5所示，發(fā)現(xiàn)用不同種類的雌性激素進行處理抑制了Int6基因的表達。此外，孕酮顯示出較雌二醇(E2)更明顯的抑制效果。[實施例8]Int6通過HIF2a對血管發(fā)生進行調(diào)節(jié)的機制使用酵母雙雜交方法和VEGF啟動子分析的研究結(jié)果表明，與VHL對HIFla的作用類似，Int6直接與HIF2a相互作用(圖11),結(jié)合位點位于HIF2aC末端的571-640aa區(qū)(圖12),并且對于HIF2a介導的低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了強抑制。與野生型正相反，由MMTV突變體產(chǎn)生的組成型失活(顯性失活)的C末端缺失突變體幾乎使HIF2a的表達和轉(zhuǎn)錄活性加倍(圖13)。該結(jié)果表明了癌化的新機制，其中由于HIF2a活性的長期增加，在將MMTV整合到基因組中階段產(chǎn)生的Int6突變導致了細胞生長和血管發(fā)生，引起了癌化。Int6調(diào)節(jié)HIF2a的本質(zhì)被理解為Int6在其C末端具有能與蛋白酶體蓋(蓋部位)結(jié)合的區(qū)域，而與Int6結(jié)合的HIF2a被帶入到蛋白酶體中進行分解。HIF2a與低氧無關(guān)的一方面已經(jīng)有所報道，并且本發(fā)明的發(fā)明者指出，雖然HIFla百分之百與低氧有關(guān)，但HIF2a與低氧無關(guān)的分解由Int6來調(diào)節(jié)。更具體地，認為HIF2a主要由Int6來調(diào)節(jié)。抑制Int6基因表達或其功能(例如，HIF2a結(jié)合活性)的物質(zhì)由于能與低氧無關(guān)地促進HIF2a表達以及HIF2a至細胞核的轉(zhuǎn)移，從而促進低氧應激應答基因群的轉(zhuǎn)錄，因而被期待顯示出血管發(fā)生的效果。該物質(zhì)被期待具有明顯的血管發(fā)生效果和特異性，以及對于包括閉塞性動脈硬化、經(jīng)皮血管舒張治療(PCT)后的再狹窄以及心肌梗死在內(nèi)的血管疾病具有療效。[實施例9]將小鼠的Int6基因的siRNA(Int6-siRNA)經(jīng)皮下導入到小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的正常血管發(fā)生通過使用GenomOne(HVJ-包膜基因?qū)朐噭?，IshiharaSangyo)將siRNA表達載體轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)的皮下基因轉(zhuǎn)移顯示出，導入五日后，可獲得明顯的血管發(fā)生效果(圖14)。使用血管發(fā)生分析軟件(Kurabo),結(jié)果表明，血管面積和血管長度有510倍的明顯增加(圖15)。觀察到這些結(jié)果與載體的導入量是成比例的，并且明顯依賴于所表達的siRNA的效果。此外，使用生物體外血管發(fā)生分析試劑盒(Kurabo)的詳細分析結(jié)果確認了合成siRNA的效果也是與用量有關(guān)的。由于HIF2ct過表達而產(chǎn)生的血管發(fā)生效果也是陽性的，這強烈地暗示出，Int6-siRNA誘導了內(nèi)源HIF2a的表達，并誘導了血管發(fā)生因子群。病理學分析表明，新形成的血管是具有內(nèi)皮和彈性纖維的正常動脈，而見于腫瘤性血管發(fā)生的出血斑并不存在。此外，Int6siRNA表達載體被主要導入到血管內(nèi)皮的成纖維細胞中，這暗示了在這些成纖維細胞中分泌出了血管發(fā)生因子群(圖16)。[實施例11]并未由于Int6-siRNA導入到細胞中而發(fā)生的癌化確認Int6被發(fā)現(xiàn)在乳癌等癌化過程中起腫瘤抑制因子的作用。因此，有當特異的siRNA被導入到細胞中時會引起癌化的顧慮，并且這特別會在臨床應用中產(chǎn)生很大的問題。為詳細地研究該問題，本發(fā)明的發(fā)明者將當導入到細胞中時能組成型表達Int6-siRNA的載體型siRNA導入到細胞中，并且對其進行長期觀察。在癌化細胞系如MCF-7和HeLa細胞中，完全抑制內(nèi)源Int6的載體型siRNA的導入縮短了細胞的存活時間，細胞生長在七周內(nèi)停止，而且誘導了細胞死亡。這可以解釋為，Int6的角色之一是翻譯控制，并且其完全抑制引起了翻譯控制的異常。在使用得自小鼠的原代培養(yǎng)的成纖維細胞的實驗中，以及使用得自Kurabo的用于血管發(fā)生分析的培養(yǎng)細胞的實驗中，十一天的觀察結(jié)果表明，當siRNA表達載體和合成siRNA的導入顯示出有效的血管發(fā)生時，完全觀察不到癌化。工業(yè)實用性在與低氧應激反應有關(guān)的基因中，報道了轉(zhuǎn)錄因子HIF(低氧誘導因子)。已知這些因子可以產(chǎn)生腫瘤血管發(fā)生所必需的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，并能調(diào)節(jié)與線粒體的能量代謝有關(guān)的多種糖酵解途徑酶的轉(zhuǎn)錄。在實體瘤(如癌)中，盡管血流豐富，仍處于腫瘤內(nèi)部相當?shù)脱醯臓顟B(tài)，而該狀態(tài)因而會促進血管發(fā)生。除血管發(fā)生外，HIF還在細胞內(nèi)扮演各種角色，并且，舉例來說，促紅細胞生成素基因表達的增強對于低氧下紅細胞的生長是必需的，而增加的VEGF基因表達對于血管發(fā)生是重要的(圖6)。在正常氧濃度(21%)下，HIFla被遍在蛋白酶體體系分解，但在低氧狀態(tài)下其免除了這種分解，并轉(zhuǎn)移到細胞核中以引發(fā)作為轉(zhuǎn)錄因子的各種因子的誘導。HIF自身主要被分為三種HIFla、HIF2a和HIF3a。與遍在表達的HIFla不同，HIF2a在血管內(nèi)皮、腦膠質(zhì)、成纖維細胞、骨骼肌和心肌中特異表達，而HIF3oc在腦神經(jīng)系中特異表達。已知HIFla與例如腦梗死或心肌梗死的缺血性疾病有關(guān)。HIF2a與低氧應激相關(guān)疾病(特別是癌)中的血管發(fā)生有關(guān)。HIFla在細胞內(nèi)的行為已經(jīng)被闡明。反之，盡管已報道了與HIF2a結(jié)合的幾種因子，能調(diào)節(jié)其功能的因子完全沒有被探清。從HIF2a與血管發(fā)生的緊密關(guān)系，已推測對其細胞內(nèi)行為的調(diào)節(jié)將允許新的血管發(fā)生的誘導，因此本發(fā)明的發(fā)明者分析了HIF2a的新的調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明的發(fā)明者使用酵母雙雜交方法，成功地從人類心臟庫或腦庫中鑒定出六種新的因子作為HIF2a互作因子(圖7)。在這些因子中，In16曾被報道作為小鼠或人類體內(nèi)乳癌的腫瘤抑制因子，但其作用機制完全未知。Int6最初是翻-澤調(diào)節(jié)因子elF3e/p48,并且當小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)侵染小鼠時，其與9個基因座結(jié)合，而該部位的目標基因被破壞。由于其對應于被破壞的基因中的第6個結(jié)合位點，故被命名為Int6。MMTV的侵染致使Int6成為C末端部分缺失的組成型失活(顯性失活)突變體(Int6-AC),并且逐漸形成了乳癌(圖8)。但是，該突變體如何導致乳癌產(chǎn)生的機制尚不清楚。本發(fā)明的發(fā)明者鑒定出了作為與HIF2a結(jié)合的因子的Int6蛋白，并且首次揭示出，通過提高HIF2a的活性，促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄，抑制Int6表達或其功能的物質(zhì)以及Int6的顯性失活突變體(Int6-AC)能提高血管發(fā)生的效果。特別是，具有抑制Int6表達效果的物質(zhì)被期待具有明顯的血管發(fā)生效果，并被期待用于閉塞性動脈硬化、經(jīng)皮血管舒張治療(PCT)后的再狹窄和心肌梗死等的治療。特別地，被期待對Int6表達具有特異的抑制效果的siRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達而促進了具有療效的基因的表達，并被高度期待成為全新概念上的治療劑。此外，本發(fā)明的發(fā)明者表明，通過使用siRNA表達載體來敲除Int6(其通常被報道作為翻譯調(diào)節(jié)因子(elF3e)或乳癌的肺瘤抑制因子)，在使用小鼠的動物實驗中完全有可能形成新的正常動脈而不發(fā)生癌化。此外，本發(fā)明的發(fā)明者表明，siRNA的靶細胞是載體細胞，如成纖維細胞。這強有力地暗示出新動脈通過如下方式形成的可能性培養(yǎng)收集自病人的載體細胞如成纖維細胞并使之生長，從體外導入合成的siRNA,然后將其自體移植到病患處。使用將導入了siRNA的收集自病人的細胞(siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞)返回到病患處的自體移植方法，以免除載體的開發(fā)(其是siRNA藥物開發(fā)中的瓶頸)。治療方法的開發(fā)被預期用于閉塞性動脈硬化、心肌梗死和腦梗死等疾病，而且由于與生活方式有關(guān)的疾病的增加，將來病人數(shù)量也會增長。期待通過構(gòu)建新血管可使這些疾病得到治療。期待新血管的構(gòu)建還能用于使肝硬化的肝實質(zhì)細胞恢復血流，并用于使神經(jīng)肌肉變性疾病的肌肉由于血管發(fā)育而再生。并且在使用胚胎千細胞(ES細胞)和基質(zhì)干細胞的再生醫(yī)療中，血管發(fā)生對于確4呆血液循環(huán)以重構(gòu)組織是必需的。本發(fā)明提供了新生血管旁路療法，其可被用于閉塞性動脈硬化、心肌梗死和腦梗死的治療，并提供了再生醫(yī)療如肝再生，其中載體細胞如病人的成纖維細胞在用Int6的合成siRNA處理后被自體移植(siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞)。作為本發(fā)明新生血管旁路療法的一例，該方法的基本概念示于圖9。如本發(fā)明的實施例所述，本發(fā)明的發(fā)明者論證了抑制Int6表達或其功能的物質(zhì)有效地增加了動脈血管發(fā)生，并在動物實驗水平上確認了該事實。特別地，被期待對Int6基因表達具有特異的抑制效果的siRNA通過抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達促進了對血管疾病有療效的基因的表達，并被高度期待成為全新概念上的血管疾病治療劑。在以血管發(fā)生為目的的傳統(tǒng)基因療法中，只有相關(guān)基因被強制地表達。與之不同，基于本概念的siRNA試劑(誘導血管發(fā)生的siRNA試劑)通過特異性地抑制目標基因的表達，能提高對血管發(fā)生所必需的一群相關(guān)基因的總體表達，從而其被期待能獲得明顯的療效。本發(fā)明動物實驗結(jié)果的詳細評價暗示出成纖維細胞中誘導血管發(fā)生的siRNA有表達效果的可能性。這表明了基于全新概念的"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"的可能應用，其中，成纖維細胞中對Int6基因表達的特異性抑制導致了對血管發(fā)生有效的低氧應激應答基因群的全面表達(圖10)。由于成纖維細胞可獲自病人自身，生長，并易于自體移植，預期在移植"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"時排斥反應等發(fā)生的可能性會降低。至于載體細胞如成纖維細胞的自體移植，其作為人工皮膚的應用早已被證實，并且根據(jù)這些方案制備"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"是可能的。特別是，載體細胞如成纖維細胞是從病毒檢測結(jié)果為陰性的病人皮膚小片中收集的，并大量培養(yǎng)以制備主細胞和工作細胞。在主細胞的病毒檢測被再次確認為陰性后，工作細胞被依次解凍并傳代培養(yǎng)以制備用于"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"的載體細胞。在制備細胞時，還需要進行支原體檢測以及細菌/真菌檢測以確認結(jié)果為陰性。用于制備"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"的載體細胞通過冷凍來保存，以在需要時提供。此外，通過體外的電穿孔法等將血管發(fā)生誘導siRNA導入到源自病人的成纖維細胞中，可獲得高的導入效果。由于該方法使用siRNA暫時性地形成了"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞，，，并且細胞癌化等的可能性由于遺傳修飾而變得很低，因此與使用目的基因表達載體的制備移植用細胞的方法(基因療法)相比，該方法被認為是極度安全的方法。同時，在傳統(tǒng)的siRNA藥物開發(fā)中被認為是問題的特殊輸送系統(tǒng)也是不需要的。此外，對于本發(fā)明的"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"，載體細胞可容易地收集自病人并生長。在髓單核細胞的移植中，預想在血流明顯阻滯之處很難發(fā)揮效果，這是因為主要發(fā)揮血管發(fā)生效果的血管內(nèi)皮前體細胞是通過血流供給的。與之不同，在本實際應用研究中的"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞，，由于可通過直接注射被移植到任何部位，其被期待即使在血流阻滯的部位也能發(fā)揮效果。另外，血流阻滯的部位處于低氧狀態(tài)，而該低氧狀態(tài)被期待能進一步增加內(nèi)源HIF2ot在"siRNA處理的血管發(fā)生誘導細胞"中的活性，因此產(chǎn)生了協(xié)同效應。本發(fā)明揭示了Int6將會成為藥物開發(fā)的合適靶分子。本發(fā)明中獲得的各種發(fā)現(xiàn)對于闡明低氧應激反應的機制同樣是非常有用的學術(shù)信息。權(quán)利要求1.一種低氧應激反應促進劑，包含抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)或抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)作為有效成分。2.權(quán)利要求1所述的低氧應激反應促進劑，其中所述抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)是從由以下(a)(c)構(gòu)成的群組中選出的一種化合物(a)Int6基因轉(zhuǎn)錄物或其一部分的反義核酸；(b)具有特異地剪切Int6基因轉(zhuǎn)錄物的核糖核酸酶活性的核酸；和(c)具有利用RNAi效果來抑制Int6基因表達的功能的核酸。3.權(quán)利要求1所述的低氧應激反應促進劑，其中所述抑制Int6蛋白表達的物質(zhì)是雌性激素、雌性激素分泌促進劑或雌性激素受體激動劑。4.權(quán)利要求1所述的低氧應激反應促進劑，其中所述抑制Int6蛋白功能的物質(zhì)是從由以下(a)(c)構(gòu)成的群組中選出的一種化合物(a)與Int6蛋白結(jié)合的抗體；(b)與Int6蛋白結(jié)合的低分子量化合物；和(c)抑制Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性的化合物。5.權(quán)利要求14中任一項所述的低氧應激反應促進劑，其中所述低氧應激反應的促進是血管發(fā)生的誘導。6.—種低氧應激反應抑制劑，包含提高Int6蛋白表達的物質(zhì)或提高Int6蛋白功能的物質(zhì)作為有效成分。7.權(quán)利要求6所述的低氧應激反應抑制劑，其中所述提高Int6蛋白表達的物質(zhì)是雌性激素抑制劑。8.權(quán)利要求7所述的低氧應激反應抑制劑，其中所述低氧應激反應的抑制是血管發(fā)生的抑制。9.一種血管疾病治療劑，含有權(quán)利要求1~5中任一項所述的低氧應激反應促進劑作為有效成分。10.權(quán)利要求9所述的血管疾病治療劑，其中所述血管疾病是缺血性腦疾病或缺血性心疾病、神經(jīng)變性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、或者肝疾病、胰腺疾病、月幾肉疾病或皮膚疾病。11.一種與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑，包含權(quán)利要求6~8中任一項所述的低氧應激反應抑制劑作為有效成分。12.權(quán)利要求11所述的與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑，其中與所述血管發(fā)生有關(guān)的疾病是癌癥。13.—種Int6基因表達被人為地抑制了的非人類轉(zhuǎn)基因動物。14.權(quán)利要求13所述的非人類轉(zhuǎn)基因動物，其中所述Int6基因表達通過如下(a)(c)中任一種核酸的作用而被抑制(a)Int6基因轉(zhuǎn)錄物或其一部分的反義核酸；(b)具有特異地剪切Int6基因轉(zhuǎn)錄物的核糖核酸酶活性的核酸；和(c)具有利用RNAi效果來抑制Int6基因表達的功能的核酸。15.權(quán)利要求13或14所述的非人類轉(zhuǎn)基因動物，其中血管發(fā)生效果被促進了。16.—種篩選血管疾病治療劑的方法，其中選擇使Int6基因表達水平或Int6蛋白活性降低的化合物。17.—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6基因表達細胞接觸；(b)測定所述細胞中Int6基因表達的水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物降低了表達水平。18.—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與細胞或細胞提取液接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接；(b)測定所述報告基因的表達水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物降低了表達水平。19.一種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液接觸；(b)測定所述蛋白的活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的活性相比，該化合癡降低了所述蛋白的活性。20.—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括對抑制Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性的化合物進行選擇。21.—種篩選血管疾病治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白和HIF2a蛋白接觸；(b)測定Int6蛋白與HIF2oc蛋白之間的結(jié)合活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，該化合物降低了所述結(jié)合活性。22.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括對提高Int6基因表達水平或Int6蛋白活性的化合物進行選擇。23.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6基因表達細胞接觸；(b)測定所述細胞中Int6基因表達的水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物提高了表達水平。24.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與細胞或細胞提取液接觸，所述細胞包含具有如下結(jié)構(gòu)的DNA,在該結(jié)構(gòu)中，報告基因與Int6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地進行連接；(b)測定所述報告基因的表達水平；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的表達水平相比，該化合物提高了表達水平。25.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白或表達該蛋白的細胞或該細胞的提取液接觸；(b)測定所述蛋白的活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的活性相比，該化合物提高了所述蛋白的活性。26.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括對提高Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性的化合物進行選擇。27.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括如下步驟(a)將測試化合物與Int6蛋白和HIF2ot蛋白接觸；(b)測定Int6蛋白與HIF2a蛋白之間的結(jié)合活性；并且(c)選擇一種化合物，與在沒有所述測試化合物存在時測定的結(jié)合活性相比，該化合物提高了所述結(jié)合活性。28.—種篩選與血管發(fā)生有關(guān)的疾病的治療劑的方法，包括如下步驟(a)用測試化合物對權(quán)利要求1315中任一項所述的非人類轉(zhuǎn)基因動物給藥；(b)測定所述非人類轉(zhuǎn)基因動物中的Int6表達水平或活性，或測定所述動物中的血管發(fā)生效果；并且(c)選擇一種化合物，與沒有用所述測試化合物給藥的情況相比，該化合物降低了血管發(fā)生效果，或該化合物提高了Int6表達水平或活性。29.—種血管發(fā)生誘導劑，包含Int6的顯性失活突變體作為有效成分。30.權(quán)利要求29所述的血管發(fā)生誘導劑，其中所述Int6的顯性失活突變體是一種Int6蛋白的C末端PINT區(qū)已缺失的Int6蛋白突變體。31.—種血管發(fā)生抑制劑，包含Int6蛋白或Int6蛋白的表達載體作為有效成分。32.—種載體細胞，其中Int6基因表達已被抑制，并且血管發(fā)生已被J秀導。33.權(quán)利要求32所述的載體細胞，在其中導入有Int6基因的siRNA。34.—種血管疾病治療劑，包含權(quán)利要求31所述的血管發(fā)生抑制劑或者權(quán)利要求32或33所述的載體細胞作為有效成分。35.—種血管疾病治療劑的生產(chǎn)方法，包括將Int6基因的siRNA導入到分離的載體細胞中的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及一種與低氧應激反應有關(guān)的Int6蛋白及其用途。本發(fā)明成功地鑒定出一種HIF2α結(jié)合因子(Int6)，其具有與HIF2α結(jié)合的活性，是一種能促進血管發(fā)生的與低氧應激反應有關(guān)的因子。此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過與HIF2α相互作用，Int6基因能抑制由HIF2α介導的低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄。抑制Int6表達或其功能的物質(zhì)通過提高HIF2α的活性以促進低氧應激應答基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進了血管發(fā)生，并且其被期待對于包括心肌梗死在內(nèi)的各種血管疾病具有療效。文檔編號A61K39/395GK101237884SQ200680025660公開日2008年8月6日申請日期2006年5月16日優(yōu)先權(quán)日2005年5月16日發(fā)明者坂田和彥,芝崎太,鸝陳申請人:財團法人東京都醫(yī)學研究機構(gòu);有限公司照顧技術(shù)