專利名稱：：具有抗炎癥、抗過敏和抗哮喘作用的包括黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有抗炎癥、抗過敏和抗哮喘作用的包括黃水枝(77are//a^/>^/^//")提取物和從其分離的黃水枝酸(tiarellicacid)的組合物。
背景技術(shù)：
：哮喘已被認(rèn)作是一種在氣道中出現(xiàn)的復(fù)雜綜合病癥，其表出為諸如氣流阻塞、急性或慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性(AHR)和結(jié)構(gòu)重建等各種紊舌L(KumarR.K.尸/^rmaco/.7T^r"91,pp93-104，2001)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，氣道中出現(xiàn)的過敏性炎癥在哮喘發(fā)展中起關(guān)鍵作用，并且過敏性哮喘病患者人數(shù)近期已增至約占世界人口的10%。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在美國患者人數(shù)已達(dá)到1700萬人，而且過敏性哮喘藥物在美國的市場規(guī)模至今已擴(kuò)大至6,400億美元。哮喘可分為兩種類型，即外源性哮喘和內(nèi)源性哮喘。因接觸諸如作為主要抗原的室內(nèi)微塵螨、花粉、動(dòng)物上皮、真菌等抗原而引起的外源性哮喘在皮膚試驗(yàn)或支氣管刺激試驗(yàn)中對抗原顯示陽性反應(yīng)，而且通常發(fā)生在年輕人中。上呼吸感染、鍛煉、情緒不穩(wěn)定、寒冷天氣、濕度變化引起的內(nèi)源性哮喘發(fā)生在成年病人中。根據(jù)病理生理學(xué)觀點(diǎn)，哮喘已被認(rèn)作是按如下過程發(fā)生的慢性炎癥炎性細(xì)胞增生擴(kuò)散、分化并被輔助性T2免疫細(xì)胞中再生的細(xì)胞因子激活，然后移動(dòng)到氣道或其鄰近組織。諸如嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等活化的炎性細(xì)胞釋放各種炎性介體，如細(xì)胞因子、趨化因子、信號分子、粘附分子和生長因子，并且氣道中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞參與哮喘的各階段(EliasJA等，JC//"/m^/.，111,pp291-7,2003)。在使用敲除小鼠模型的各種研究和臨床研究中，哮喘的關(guān)鍵觀察可能分成幾個(gè)特征參數(shù)，如免疫應(yīng)答、嗜曙紅細(xì)胞增多、AHR和結(jié)構(gòu)重建(MoffattJD./^armaco/77er,107，pp343-57,2005;SpinaD等，7Ve涵尸/z謹(jǐn),"c/,23,pp311-5,2002)。每個(gè)參數(shù)彼此之間似乎無直接相關(guān)性，但是，IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和嗜曙紅細(xì)胞增多是過敏性哮喘氣道中的突出癥狀(BochnerB.S.等，/扁謹(jǐn)/.,12，pp295-335,1994;BousquetJ等，W.五wg/.Med.,323，pp1033-9,1990)，而且在過敏過程中產(chǎn)生的諸如IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子在AHR發(fā)展和氣道重建中也起重要作用(Riffo-VasquezY等，尸/zarmaco/.r/z^:，94，pp185-211,2002)。實(shí)際上，哮喘是編配的炎癥事件的結(jié)果，其中許多事件涉及到作用于哮喘途徑的特定抑制劑，例如組胺Hl拮抗劑、血漿血栓素拮抗劑、血小板活化因子拮抗劑、環(huán)氧化酶抑制劑、氮單加氧酶抑制劑和前列腺素抑制劑，并且已進(jìn)行過試驗(yàn)，但在臨床實(shí)驗(yàn)中失敗(MoffattJ.D.,P/zwmaco/.7Tz^:，107,pp343-57,2005)。相比而言，通過廣泛抑制細(xì)胞因子的合成以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫細(xì)胞存活而將炎性細(xì)胞的起源水平抑制到基線的糖皮質(zhì)激素，在至今30多年來已被用于控制哮喘患者的癥狀(BaatjesA丄等，尸/2^maco/,7Tza,95，pp63-72，2002)。這些報(bào)告表明，控制哮喘的治療方法應(yīng)集中于恢復(fù)哮喘參數(shù)的平衡，而不是尋找特定哮喘過程途徑的有效抑制劑。黃水枝(虎耳草，Saxifragaceae)是屬于韓國該屬的一個(gè)種。它生長于中國西南部，但只生長在韓國郁陵島(Ullunglsland)的最高處。在此之前，使用科羅索酸(corosolicacid)、委陵菜酸(tormenticacid)等已分離出黃水枝酸(Park等，Ac/z尸/z畫ie&,25,pp57-60，2002)，并且其他人報(bào)道了其對紫外線照射的皮膚纖維原細(xì)胞中的MMP-1和型1原骨膠原表達(dá)的抑制作用(Moon等，J五化"op/z"rmaco/.，98，pp185-189,2005)。然而，在任何以上所引用的文獻(xiàn)中均沒有報(bào)道或公開黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸對炎性、過敏性和哮喘性疾病的抑制作用，本文引入這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容作為參考。因此，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸顯示出黃水枝酸對體外LTQ釋放的抑制作用，以及在OVA誘發(fā)的哮喘小鼠中對IgE水平和細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的產(chǎn)生、氣道高反應(yīng)性和白細(xì)胞浸潤的抑制作用，預(yù)期它們可用于控制哮喘。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此，迄今為止，仍需要發(fā)現(xiàn)對治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病更有效的無毒性藥物。技術(shù)方案因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的組合物，其包括黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物作為活性成分。本文公開的術(shù)語"粗提物"包括通過使用水、Q-C4低級醇如甲醇、乙醇、優(yōu)選甲醇等或其混合物提取植物材料而制備的提取物。本文公開的術(shù)語"有機(jī)溶劑可溶性提取物"可以通過使用有機(jī)溶劑(如丁醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或正己烷，優(yōu)選丁醇)提取上述粗提物而制備。本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括從黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物分離得到的由如下化學(xué)式(I)代表的黃水枝酸或其藥物可接受的鹽作為活性成分，所述活性成分的量可有效地治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>依照本發(fā)明的另一方面，還提供了黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或從其分離的黃水枝酸用于制備用來治療或預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的藥物的用途。'依照本發(fā)明的另一方面，還提供了一種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的炎性、過敏性和哮喘性疾病的方法，其中所述方法包括將治療有效量的黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或從其分離的黃水枝酸給予至患有炎性、過敏性和哮喘性疾病的哺乳動(dòng)物。根據(jù)如下優(yōu)選的實(shí)施方案可以制備從黃水枝分離得到的本發(fā)明提取物和從其分離的黃水枝酸。下面將詳細(xì)地描述本發(fā)明。對于本發(fā)明，例如，將干黃水枝全植物切成小片，并將小片與220倍體積、優(yōu)選510倍體積的極性溶劑如水、d-C4低級醇(如甲醇、乙醇、丁醇或其混合物，優(yōu)選甲醇)混合；并在20~100°C、優(yōu)選2050°C的溫度下加熱1048小時(shí)，優(yōu)選2030小時(shí)，使用熱水回流提取、冷水提取、超聲波或常規(guī)提取，優(yōu)選使用冷水提??；將殘余物過濾，然后干燥濾液，得到其極性溶劑可溶性提取物。將使用上述步驟制備的上述粗提物懸浮于水中，然后與1~100倍體積、優(yōu)選1~5倍體積的有機(jī)溶劑如丁醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲垸或己垸、優(yōu)選丁醇混合，得到本發(fā)明的有機(jī)溶劑可溶性提取物。將上述有機(jī)溶劑可溶性提取物進(jìn)一步用硅膠填充的硅膠柱(70-230目，8.5x65cm)進(jìn)行色譜層析，使用正己烷乙酸乙酯(10-20%乙酸乙酯，分步梯度)和氯仿甲醇(0-100。/。甲醇，分步梯度)的混合溶劑洗脫，獲得9個(gè)組分。在這些組分中，使用正相硅膠柱對組分6重復(fù)進(jìn)行硅膠柱層析(硅膠，230-400目，6.0x60cm，氯仿-甲醇混合物，5-50%甲醇，分步梯度)，獲得本發(fā)明的黃水枝酸。使用之前報(bào)道的那些方法(Park等，尸/mr附25，pp57-60,2002)，通過NMR(&，13C,DEPT,HMQC，HMBC)、EI-MS和旋光度測定其結(jié)構(gòu)，使用HPLC系統(tǒng)(帶有SPD-M10AvpPDA檢測器的ShimadzuSCL-10A，柱PhenomenexSynergi4FusionRP-80,4.6x150nm,洗脫蒸餾水(DW)中的ACN/0.1%TFA，4/1，v/v)分析其純度，純度高于99.5%。依照本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的藥物組合物，其包括使用上述制備方法制備的黃水枝粗提物和其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或從其分離的黃水枝酸作為活性成分。依照本發(fā)明的另一方面，還提供了使用上述制備方法制備的黃水枝粗提物和其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或從其分離的黃水枝酸用于制備用來治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的藥物的用途。依照本發(fā)明的另一方面，還提供了一種治療或預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的方法，其中所述方法包括給予治療有效量的使用上述制備方法制備的黃水枝粗提取物和其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或從其分離的黃水枝酸。通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法可將化學(xué)式(I)代表的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為其藥物可接受的鹽和溶劑化物。對于所述鹽，由其藥物可接受的游離酸形成的其酸加成鹽是有用的，并且可用常規(guī)方法制備。例如，在用過量酸溶液溶解化合物后，通過與水混溶的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈使所述鹽析出，以制備其酸加成鹽，然后進(jìn)一步可以加熱當(dāng)量化合物和稀釋酸及水或醇如乙二醇單甲醚的混合物，隨后蒸發(fā)干燥或減壓過濾，得到其干燥鹽形式。作為上述方法的游離酸，可使用有機(jī)酸或無機(jī)酸。例如，本發(fā)明中可使用的有機(jī)酸例如是甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡萄糖醛酸、天冬氨酸、抗壞血酸、碳?；?carbonylicacid)、香草酸、氫碘酸等，可使用的無機(jī)酸例如是鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等。此外，使用堿可以制備本發(fā)明化合物的藥物可接受的金屬鹽形式。通過常規(guī)方法可制備其堿金屬或堿土金屬鹽，例如，用過量的堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物溶液溶解所述化合物后，過濾不溶鹽并將剩余濾液進(jìn)行蒸發(fā)和干燥，得到其金屬鹽。作為本發(fā)明的金屬鹽，鈉、鉀或鈣鹽是藥物可用的，并且通過堿金屬鹽或堿土金屬鹽與適合的銀鹽如硝酸銀反應(yīng)可以制備相應(yīng)的銀鹽。如果本文沒有明確指出，本發(fā)明化合物的藥物可接受的鹽包括可以化合物形式存在的所有酸式或堿式鹽。例如，本發(fā)明的藥物可接受的鹽包括羥基鹽，如其鈉、鈣和鉀鹽；氨基鹽，如溴化氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、扁桃酸鹽、甲基磺酸鹽(甲磺酸鹽)和對甲苯磺酸鹽等，這些可以使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備。用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的本發(fā)明組合物可包括占所述組合物總重0.1-50重量％的上述提取物或化合物。本發(fā)明的組合物可以是含有藥物可接受的載體、輔劑或稀釋劑的藥物組合物，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、凝膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基-羥基苯甲酸鹽、丙基-羥基苯甲酸鹽、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。這些制劑還可以包括填料、抗凝集劑、潤滑劑、增濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。使用本領(lǐng)域公知的任何過程，可以將本發(fā)明的組合物配制成使得在患者給藥后能快速、持續(xù)或延遲地釋放活性成分。例如，本發(fā)明的組合物可溶于油、丙二醇或常用于生產(chǎn)注射劑的其他溶劑。所述載體的適合例子包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸異丙酯等，但不限于此。對于局部給藥，本發(fā)明的提取物可配制成油膏和乳膏形式。含有本發(fā)明組合物的藥物制劑可以制備成任何形式，如口服劑型(粉末、片劑、膠囊、軟膠囊、水狀藥物、糖漿、酏劑、丸劑、香粉、顆粒)，或者局部制劑(乳膏、油膏、洗液、凝膠、香膏、貼劑、糊狀劑、噴灑溶液、氣霧劑等)，或者注射制劑(溶液、混懸液、乳液)。本發(fā)明組合物的藥劑形式可以其藥物可接受的鹽的形式使用，也可以單獨(dú)或以適當(dāng)?shù)穆?lián)合形式使用，還可與其他藥物活性化合物結(jié)合使用。本發(fā)明提取物或化合物的所需劑量隨受試者的病癥和體重、嚴(yán)重程度、劑型、給藥途徑和時(shí)間而異，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。然而，為了獲得所需效果，通常推薦本發(fā)明提取物的給予量為0.0001100mg/kg體重/天，優(yōu)選0.00110mg/kg體重/天。這種劑量可單獨(dú)給藥或每天分幾次給藥。本發(fā)明的藥物組合物可通過各種途徑對受試動(dòng)物如哺乳動(dòng)物(大鼠、小鼠、家畜或人類)給藥?？梢灶A(yù)期到所有的給藥方式，例如，可以口服給藥、直腸給藥或通過靜脈、肌肉、皮下、皮內(nèi)、膜內(nèi)、硬腦膜或腦室內(nèi)注射給藥。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于預(yù)防和緩解炎性、過敏性和哮喘性疾病的功能性健康食品，其包括黃水枝提取物或從其分離的化合物及飲食可接受的添加劑。為研制功能性健康食品，包括本發(fā)明的上述提取物或化合物的可添加的食品的例子是各種食品、飲料、香口膠、維生素復(fù)合物、改善健康的食品等等，它們可用作粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料等。本發(fā)明的上述組合物可加入到食品、添加劑或飲料中，其中，食品或飲料中上述提取物或化合物的量通常占健康食品組合物的食品總重的約0.01~80w/w%，優(yōu)選0.01~15w/w%，并且按100ml健康飲料組合物計(jì)，為0.02~5g，優(yōu)選0.3~1g。只要本發(fā)明的健康飲料組合物含有所示比率的上述提取物或化合物作為必需成分，那么對其他液體成分無特殊限制，其中其他成分可以是除臭劑或天然碳水化合物等，如常規(guī)飲料。上述天然碳水化合物的例子是單糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麥芽糖、蔗糖等；常規(guī)食用糖，如糊精、環(huán)糊精；和糖醇，如木糖醇、赤藻糖醇等。作為除上述之外的其他除臭劑，可以很好地使用天然除臭劑，如甜味蛋白、甜菊糖提取物如levaudiosideA、甘草甜素等，以及合成除臭劑，如糖精、阿斯巴甜(aspartame)等。上述天然碳水化合物的用量按100ml本發(fā)明的飲料組合物計(jì)通常為約l20g，優(yōu)選512g。除前述組合物之外的其他成分是各種營養(yǎng)物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)或電解質(zhì)、合成調(diào)味劑、奶酪巧克力等中的著色劑和改善劑、果膠酸及其鹽、褐藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠質(zhì)粘合劑、pH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、丙三醇、醇、用于碳酸飲料的碳酸化劑等。除前述之外的其他成分可以是用于制備天然果汁的果汁、果汁飲料或蔬菜飲料，其中所述成分可以單獨(dú)或組合使用。各成分的比例不很重要，但通常在每100w/wn/。本發(fā)明組合物中為約020w/w。/。。包括本發(fā)明前述提取物的可添加的食品的例子是各種食品、飲料、香口膠、維生素復(fù)合物、改善健康的食品等等。本發(fā)明的提取物沒有毒性和負(fù)面作用，因此可安全使用。以下實(shí)施例更具體地解釋了本發(fā)明。然而，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不以任何方式受限于這些實(shí)施例。有益效果本發(fā)明提供一種包括黃水枝提取物或從其分離的黃水枝酸作為活性成分的藥物組合物和健康食品，所述活性成分的量可有效地治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病。結(jié)合附圖，從以下的詳細(xì)說明中可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特征以及其他優(yōu)點(diǎn)，在附圖中圖1顯示通過使用支氣管肺泡灌洗的組織檢査，黃水枝提取物和黃水枝酸對肺組織細(xì)胞的作用(A:正常對照組小鼠，B:PBS處理的小鼠，C:黃水枝提取物處理的小鼠，D:黃水枝酸處理的小鼠)，圖2顯示黃水枝提取物和黃水枝酸對肺組織中OVA誘發(fā)的炎癥的抑制作用。具體實(shí)施方式本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以在本發(fā)明的精神或范圍內(nèi)對本發(fā)明的組合物、用途和制備進(jìn)行各種修改和改變。以下實(shí)施例更具體地解釋了本發(fā)明。然而，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明不以任何方式受限于這些實(shí)施例。實(shí)施例以下的參考例、實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例用以進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1黃水枝粗提物的制備于2003年8月在韓國郁陵島采集黃水枝，其憑證標(biāo)本(PEB3068)由位于韓國大田市(Daejeon，Korea)的韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院(KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology,KRIBB)的植物提取物庫保藏。將1.1kg干黃水枝切成小片，與5L甲醇混合，在室溫下攪拌混合物24小時(shí)，用冷水提取三次。用濾紙過濾提取物以除去殘?jiān)?。收集濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在5565。C下減壓濃縮，并用冷凍干燥機(jī)干燥，得到100.5g干燥的黃水枝粗提物。實(shí)施例2丁醇可溶性組分的制備向?qū)嵤├?獲得的100.5g粗提物中加入1L蒸餾水，置于分液漏斗中，加入1L丁醇，并劇烈震蕩，使其分為丁醇可溶性層和水溶性層。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮上述丁醇可溶性層，并用冷凍干燥機(jī)干燥，得到丁醇可溶性提取物，最終獲得80.0g丁醇可溶性提取物和水溶性提取物，在下述實(shí)驗(yàn)中用作樣品。實(shí)施例3由黃水枝提取物制備黃水枝酸在室溫下用甲醇(IOL)提取3.29kg干燥的黃水枝全植物兩次，得到352g提取物。將該提取物懸浮于1L水中，并用等體積的正己烷進(jìn)行相分離。然后將65.1g正己烷可溶性組分進(jìn)行硅膠柱層析(70-230目，8.5x65cm)，并相繼用正己垸-乙酸乙酯混合物(10-20%乙酸乙酯，分步梯度)和氯仿-甲醇混合物(0-100%甲醇，分步梯度)洗脫，獲得9個(gè)組分(Fr.l-Fr.9)。使用正相硅膠柱對7.4g組分6(氯仿-甲醇9/1-7/3，v/v之間)進(jìn)行柱層析(硅膠，230-400目，6.0x60cm，氯仿-甲醇混合物，5-50%甲醇，分步梯度)，獲得400mg黃水枝酸。使用之前報(bào)道的那些方法(Park等，尸/zarm25,pp57-60,2002)，通過NMR('H，13C,DEPT,HMQC,HMBC)、EI-MS和旋光度測定其結(jié)構(gòu)，使用HPLC系統(tǒng)(帶有SPD-M10AvpPDA檢測器的ShimadzuSCL-10A，柱PhenomenexSynergi4FusionRP-80,4.6x50mm,洗脫蒸餾水(DW)中的ACN/0.1%TFA,4/1，v/v)分析其純度，純度高于99.5%。黃水枝酸針狀(MeOH);mp254-256°C;[a]D23+94(嘧啶，c0.14);IR(KBr,cm-1):3491(OH)，1689(CO),1645(C=C)，1450,1388,1262,1222,1044;HRMSm/z472.3552(M+，對于C3()H4804計(jì)算值472.3553);EIMS(rel.int.)m/z:472[M]+(61),454[M-H20]+(34),436[M-2H20]+(62)，424(42)，396(26)，205(75),187(71),175(87),173(100);13C-NMR(150MHz,嘧啶曙^):13.0(C-24)，17.4(C-25),17.5(C-26),18.7(C-6)，18.8(C-28),19,4(C-30),21.3(C-ll)，25.8(C-15),26.7(C-12),27.9(C-2),30.1(C-21),37.7(C-10),38.2(C-7)，38.3(C-16),39.2(C-l),39.6(C-13),40.4(C-22),40.8(C-8),42.9CC-4),43.0CC-17),48.1(C-19)，49.2(C-5),51.4(C-18),51.6(C-9),60.4(C-14),68.2(C-23),73.6(C-3),110.2(C-29),150.9(C-20),178.3(C-27);丄H誦腹R(600MHz,嘧啶^/5):1.05,1,71(2H,m,每個(gè)氫，H-l)，1.82，1.91(2H，m,每個(gè)氫，H-2),4.02(1H,dd,/=4.7,11.6Hz，H-3),1.51(1H,dd，■/=1.5,12.0Hz,H-5),1.48,1.65(2H,m,每個(gè)氫，H-6),1,87,2.06(2H，m,每個(gè)氫，H-7)，2.02(1H，dd，■/=1.7，12.7Hz,H-9),1.32，1.64(2H,m,每個(gè)氫，H-ll)，1.87,2.60(2H,m,每個(gè)氫，H-12),1.88(1H，m，H-13)，1.67,2.28(2H,m,每個(gè)氫，H-15)，1.70,1.78(2H,m,每個(gè)氫，H-16),1.81(1H，m，H-18)，2.60(1H,m,H-19),1.36,1.97(2H，m,每個(gè)氫，H-21),1.16，1.40(2H,m，每個(gè)氫，H-22),3.57,4.07(2H,d,J=10.4,每個(gè)氫，H-23)，1.04(3H,s,H-24),1.01(3H，s,H-25),1.21(3H，s，H-26),0.90(1H，s,H-28).4.76,4.96(2H,s,每個(gè)氫，H-29),1.86(3H,d,/=6.4Hz,H-30)。實(shí)驗(yàn)例1動(dòng)物致敏和氣道激發(fā)對幾組小鼠(n-5-6)進(jìn)行研究；它們受到了如下處理(l)使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;ipNeb)的假敏感和激發(fā)；(2)使用OVA(卵清蛋白:SigmaA5503;Sigma,St.Louis,MO)(ipNeb)的敏感和激發(fā)；(3)使用OVA(ip)的致敏以及使用OVA(Neb)和樣品(黃水枝酸或齊留通，po)的激發(fā)。簡言之，在第0和11天通過腹膜注射20OVA致敏小鼠，其中OVA用100piPBS緩沖溶液(pH7.4)中的2mg氫氧化鋁乳化。在初始致敏后的第19、20、21和25天使用超聲波噴霧器用OVA(1。/。，PBS中)對小鼠通過氣道激發(fā)20min。在最后激發(fā)后(第27天)的48小時(shí)處死小鼠，測定黃水枝提取物和黃水枝酸對過敏性哮喘氣道的抑制作用。實(shí)驗(yàn)例2MTT分析為研究本發(fā)明的黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸的細(xì)胞毒性作用，按如下過程進(jìn)行溴化(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鹽(MTT)分析(WangZ等，尸/z麵.扁.,24,pp159-162,2001)。在無NGF的條件下將早幼粒細(xì)胞HL-60細(xì)胞(HL-18103,5xl()S個(gè)細(xì)胞/ml)接種于96孔板上。培養(yǎng)24小時(shí)后，用溶于10^1DMSO和10^1MTT溶液(5mg/ml)的樣品混合物處理細(xì)胞，在相似條件下培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后，去除MTT并將100plDMSO滴入每個(gè)孔中以溶解晶體。在570nm下用微孔讀取器(BIO-RAD,U.S.A.)測量紫外線吸光度來計(jì)算細(xì)胞存活率。如表1所示，經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明的提取物或化合物沒有顯示出細(xì)胞毒性。[表1]黃水枝提取物和由其分離的化合物對HL-60細(xì)胞的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)驗(yàn)例3骨髄衍生的肥大細(xì)胞(BMMC)的制備和活化由雄性Balb/c小鼠獲得BMMC，并在用含有IL-3(Sigma14144,2ng/ml)(MurakamiM等，/.版C/zem.,39,pp22653-22656,1995)的10%胎牛血清補(bǔ)充的50。/。富集培養(yǎng)基(RPMI，含有2mML-谷氨酸、25mMHEPES緩沖液、2mg/ml碳酸氫鈉、100單位/ml青霉素G、100pg/ml硫酸鏈霉素、0.25pg/ml兩性霉素B)中培養(yǎng)至4周。培養(yǎng)3周后，通過甲苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中有高于98%的BMMC。將BMMC以"106個(gè)細(xì)胞/11的細(xì)胞密度懸浮在富集培養(yǎng)基中，然后于37。C下在DMSO(DMSO終濃度小于0.5%)中、在有或沒有樣品的情況下在濕度為5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。在用干細(xì)胞因子(SCF,SigmaS9915,100ng/ml)刺激20min后，按廠商說明使用酶免疫測定試劑盒(CaymanChemical,AnnArbor,MI,U.S.A.)測定上清液中LTC4的釋放。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，并通過計(jì)算相對于對照組LTC4釋放的減少百分率來測定LTC4釋放的抑制(LeeSH等，5/o/.尸/z謹(jǐn).5w〃"27,pp786-788,2004)。實(shí)驗(yàn)例4黃水枝提取物和黃水枝酸對LTC4釋放的作用如實(shí)驗(yàn)例3所述，使用LTC4單克隆抗體ELISA方法測定黃水枝提取物和黃水枝酸對BMMB中半胱氨酰白三烯釋放的抑制作用。結(jié)果證明黃水枝酸的IC5o顯著，但低于被稱作5-脂肪氧化酶抑制劑的齊留通(zileuton)(參見表2)。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)驗(yàn)例5黃水枝提取物和黃水枝酸對氣道高反應(yīng)性(AHR)的作用使用全身體積描記儀(OCP3000;Allmedicus,Korea)(HamelmannE等，J及e印^O"CweMW.,156,pp766-775,1997)測定最后氣霧劑激發(fā)后24小時(shí)的AHR。將每只小鼠置于生物測量體積描記箱中，并用氣霧狀PBS激發(fā)，隨后增加氣霧狀乙酰甲膽堿的濃度(12.5、25和50mg/ml)3分鐘。在每個(gè)濃度下，將支氣管收縮再記錄5min。在每個(gè)乙酰甲膽堿激發(fā)中得到每個(gè)樣品的最高Penh值，并響應(yīng)于對照(PBS)激發(fā)，表示為基本Penh值的百分?jǐn)?shù)。如表3所示，在乙酰甲膽堿的5-20mg/ml的任意濃度下，OVA-處理組的Penh值顯著高于PBS對照組的值(p<0.05)。在黃水枝酸+OVA激發(fā)組中，與OVA-處理組相比，其Penh值顯著降低(p〈0.05)。被研發(fā)作為抗哮喘藥物的齊留通陽性對照組顯示出AHR降低，但低于黃水枝酸(參見如圖2)。[表3]黃水枝提取物和黃水枝酸對氣道高反應(yīng)性(AHR)的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*與OVA處理組的顯著差異，p<0.05實(shí)驗(yàn)例6黃水枝酸對OVA-特異性IgE的作用最后激發(fā)后48小時(shí)，用過量的戊巴比妥(SigmaP3761)處死小鼠，進(jìn)行氣管切開術(shù)。將冰冷的PBS(0.5ml)注入肺中，通過氣管插管吸氣三次得到支氣管肺泡灌洗液(BALF)(總量1.5ml)。離心BALF并收集上清液，使用前在-7(TC下儲存。根據(jù)廠商說明使用特定的小鼠ELISA試劑盒(R&DSystems;Minneapolis,MN)測定BALF中的IL-4、IL-5和IL-13的量。試驗(yàn)的檢測限是250pg/ml。氣管切開術(shù)后通過心臟穿刺獲得血漿。用于小鼠IgE抗體的互補(bǔ)捕獲和檢測抗體對購自BDOptEIA(SanDiego,CA)，并根據(jù)廠商說明進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)。將兩個(gè)血漿樣品按l:IOO稀釋，在450nm下測定光密度讀數(shù)獲得每個(gè)樣品中的IgE水平，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算OVA特異性IgE濃度，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線用重組IgE(5-2,000ng/ml)生成。如表4所示，黃水枝酸處理小鼠的IgE水平顯著降低，而齊留通顯示出與黃水枝酸相似的抑制作用。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*與OVA處理組的顯著差異，p<0.05實(shí)驗(yàn)例7黃水枝提取物和黃水枝酸對細(xì)胞因子水平的作用為測定黃水枝提取物和黃水枝酸對OVA誘發(fā)哮喘小鼠中細(xì)胞因子釋放的影響，最后激發(fā)后48小時(shí)，使用ELISA方法測定BALF中細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的水平。如表5所示，黃水枝酸處理組中的細(xì)胞因子受到顯著抑制；在IL-4、IL-5和IL-13中比在OVA激發(fā)組中分別減少90.5±4.0%、54.6±23.0%和43.7士28.2。/o以上(p<0.05)。齊留通也顯示出比對照組更大的降低作用，但仍遠(yuǎn)低于黃水枝酸。這些結(jié)果證明黃水枝酸顯著降低了哮喘模型的BALF中的IL-4、IL-5和IL-13的濃度。表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*與OVA處理組的顯著差異，p<0.01**與OVA處理組的顯著差異，p<0.05實(shí)驗(yàn)例8黃水枝提取物和黃水枝酸對肺組織中OVA誘發(fā)炎癥的作用將肺組織用10%中性的緩沖福爾馬林固定24小時(shí)，用石蠟包埋后，將組織切成4卞m厚的片段，然后用H&E溶液(蘇木素，SigmaMHS-16和曙紅，SigmaHT110-l-32)染色。隨后，用Dako-封固劑(Dakocytomation;DenmarkCarpinteriaCA)固定染色的組織并蓋上蓋玻片。由兩個(gè)獨(dú)立的研究人員進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)，對氣道中的細(xì)胞浸潤程度評分(MyouS等，丄MW.,198，ppl573-1582，2003)。使用特定標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)細(xì)支氣管周炎和血管周炎，即分值為0-3，其中O，無細(xì)胞；1，少數(shù)細(xì)胞；2,深度為15個(gè)細(xì)胞層的細(xì)胞環(huán)；3，深度大于5個(gè)細(xì)胞層的厚細(xì)胞環(huán)。為評價(jià)黃水枝提取物和黃水枝酸對白細(xì)胞浸潤的抑制作用，通過在最后激發(fā)后48小時(shí)，在肺組織中進(jìn)行定量分析對炎癥程度評分(參見圖2)。如圖1所示，黃水枝酸對OVA誘發(fā)小鼠的肺組織中的炎癥有最有效的抑制作用，然后是黃水枝提取物和齊留通。在肺組織的H&E染色中，OVA處理小鼠的白細(xì)胞大量地浸潤到正常小鼠的細(xì)支氣管周和血管周的連接組織中。在黃水枝提取物或黃水枝酸處理的小鼠中，富嗜曙紅細(xì)胞的白細(xì)胞的浸潤與OVA處理的小鼠相比顯著削弱。實(shí)驗(yàn)例9黃水枝提取物和黃水枝酸對角叉菜膠誘發(fā)的鼠爪水腫的作用按上述實(shí)施例制備的黃水枝提取物和黃水枝酸對ICR小鼠中水腫形成的抑制作用的測定如下。將小鼠分為三組，每組由6只小鼠構(gòu)成，gp，分別是作為陰性對照組只用溶劑處理的Tl、用50mg/kg的黃水枝提取物處理的T2、用50mg/kg的阿斯匹林處理的T3。處理1小時(shí)后，將1%角叉菜膠溶液注入鼠踝內(nèi)以誘發(fā)水腫，并使用Vernier測徑器測量踝厚，從而測定水腫程度。按如下數(shù)學(xué)式1計(jì)算測定的厚度。[數(shù)學(xué)式1]踝厚度比率(％)=[(鼠爪水腫的最大厚度)-(處理前鼠爪水腫的厚度)/(處理前鼠爪水腫的厚度)]x100如表6所示，處理4小時(shí)后水腫達(dá)到最大值。因此，經(jīng)證實(shí)，黃水枝提取物和黃水枝酸對鼠爪水腫顯示出有效的抑制作用。[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>Tl:對照T2:50mg/kg黃水枝提取物T3:50mg/kg阿斯匹林在下文中將描述配制方法和各種賦形劑，但本發(fā)明不限于此。代表性制備例如下。注射劑的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸偏亞硫酸氰鈉對羥基苯甲酸甲酯對羥基苯甲酸丙酯注射用蒸餾水100mg3.0mg0.8mgO.lmg通過溶解活性成分、控制pH至約7.5、然后將所有組分填充至2ml安瓿中并用常規(guī)注射劑制備法滅菌而制備注射劑型。粉劑的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸玉米淀粉乳糖滑石粉500mg100mg100mg10mg通過混合上述組分并填充入密封包裝而制備粉劑片劑的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸200mg玉米淀粉lOOmg乳糖lOOmg硬脂酸鎂適量通過混合上述組分并壓片而制備片劑。膠囊劑的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸lOOmg乳糖50mg玉米淀粉50mg滑石粉2mg硬脂酸鎂適量通過混合上述組分并用常規(guī)凝膠制備法填充凝膠膠囊而制備膠囊劑。液體劑的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸糖多糖檸檬香料lOOOmg20g20g20g通過溶解活性成分、然后將所有組分填充至1000ml安瓿中并用常規(guī)液體劑制備法滅菌而制備液體劑型。健康食品的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸lOOOmg維生素混合物適量維生素A醋酸酯70pg維生素El.Omg維生素Bi0.13mg維生素B20.15mg維生素B60.5mg維生素Bu0.2ng維生素C10mg生物素?zé)熕狨０?.7mg葉酸50pg泛酸鈣0.5mg礦物質(zhì)的混合物適量硫酸亞鐵1.75mg氧化鋅0.82mg碳酸鎂25.3mg磷酸二氫鉀15mg磷酸氫鈣55mg檸檬酸鉀90mg碳酸鈣lOOmg氯化鎂24.8mg上述維生素和礦物質(zhì)的混合物可以多種方式變化。這些變化不被認(rèn)為脫離了本發(fā)明的精神和范圍。健康飲料的制備實(shí)施例1的干粉或黃水枝酸lOOOmg擰檬酸1000mg低聚糖100g杏濃縮物2g?；撬醠g蒸餾水900ml通過溶解活性成分、混合、在85。C下攪拌1小時(shí)、過濾、然后將所有組分填充至1000ml安瓿中并用常規(guī)健康飲料制備法滅菌而制備健康飲料。盡管如此描述了本發(fā)明，但是很明顯可以多種方式改變本發(fā)明。這些變化不被認(rèn)為是脫離了本發(fā)明的精神和范圍，而且在本領(lǐng)域技術(shù)人員看來明顯的所有改變都意圖包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。工業(yè)實(shí)用性如本發(fā)明所述，黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸顯示出對體外LTC4釋放的抑制作用，以及在OVA誘發(fā)的哮喘鼠中對IgE水平和細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的產(chǎn)生、氣道高反應(yīng)性和白細(xì)胞浸潤的抑制作用。因此，它們可作為用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的治療劑或功能性健康食品。權(quán)利要求1.一種用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物作為活性成分。2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物是使用選自水、低級醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲垸、正己垸或其混合物的溶劑提取得到的。3.—種用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括通式(I)代表的黃水枝酸或其藥物可接受的鹽作為活性成分。(I)4.黃水枝粗提取物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物或如權(quán)利要求3所述的黃水枝酸用于制備用來治療或預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的藥物的用途。5.—種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物的炎性、過敏性和哮喘性疾病的方法，其中所述方法包括將治療有效量的黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或如權(quán)利要求3所述的黃水枝酸給予至患有炎性、過敏性和哮喘性疾病的哺乳動(dòng)物。6.—種用于預(yù)防和改善炎性、過敏性和哮喘性疾病的功能性健康食品，所述功能性健康食品包括黃水枝粗提物或其有機(jī)溶劑可溶性提取物、或如權(quán)利要求3所述的黃水枝酸及飲食可接受的添加劑。7.如權(quán)利要求6所述的功能性健康食品，其中所述健康食品可以是丸劑、粉末、顆粒、片劑、咀嚼片、膠囊或飲料的形式。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有抗炎癥、抗過敏和抗哮喘作用的包括黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸的組合物。黃水枝提取物和從其分離的黃水枝酸顯示出對體外LTC₄釋放的抑制作用，以及在OVA誘發(fā)的哮喘鼠中對IgE水平和細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)產(chǎn)生、氣道高反應(yīng)性和白細(xì)胞浸潤的抑制作用。因此，它們可作為用于治療和預(yù)防炎性、過敏性和哮喘性疾病的治療劑或功能性健康食品。文檔編號A61K36/185GK101222930SQ200680026318公開日2008年7月16日申請日期2006年7月18日優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日發(fā)明者全桂花,吳世湸,安璄燮,崔順子,樸惠英,樸普映,權(quán)玉京,李烔圭,李相龜,李重求,沈光海,金健哲,金斗英,金柱憲,金正姬,金素英,金美真,金銀娥,閔炳善,韓均熙申請人:韓國生命工學(xué)研究院