專利名稱：：重組流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多價(jià)流感病毒疫苗的生產(chǎn)和組裝，所述疫苗利用分離的衍生自人和/或禽流感病毒的同佐劑組合的流感抗原蛋白或蛋白片段并包含含有衍生自真核或原核細(xì)胞的融合到人和/或禽流感病毒抗原肽上的病毒衣殼蛋白的嵌合病毒樣顆粒載體。本發(fā)明也涉及衍生自流感蛋白的新抗原肽，和含有該抗原肽的組合物。
背景技術(shù)：
：注射疫苗是一種最有力和有效的保護(hù)動(dòng)物和人類免于致病媒介感染的方式。通常，疫苗被設(shè)計(jì)通過激發(fā)針對抗原蛋白、肽或其它疫苗中含有的免疫原結(jié)構(gòu)物的宿主免疫反應(yīng)，來提供對致病媒介的保護(hù)性免疫，從而降低宿主暴露于致病媒介時(shí)被感染的可能性。流感病毒是正粘病毒科家族的一員，包括三種亞型，這些亞型通過它們的核心蛋白進(jìn)行分類并分別命名為流感A、B型流感和C型流感。流感A病毒感染范圍為哺乳動(dòng)物和禽類，而類型B和C主要限于人類感染。流感A病毒主要導(dǎo)致每年的流行和偶爾的大流行，而B型流感病毒引起每2-4年一次的暴發(fā)，但通常不伴隨大流行。病毒株根據(jù)衍生的宿主物種、地理地點(diǎn)、分離年份、序列號進(jìn)行分類，以及對流感A而言，通過血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酶的亞型的血清型特征進(jìn)行分流感病毒是基本上包含9種蛋白的分段的反義RNA病毒，這9種蛋白分別是基質(zhì)(Ml);質(zhì)子-離子通道(M2);血細(xì)胞凝集素(HA)，神經(jīng)氨酶(NA);核蛋白(NP);聚合酶堿性蛋白1(PB1);聚合酶堿性蛋白2(PB2);聚合酶酸性蛋白(PA);和非結(jié)構(gòu)蛋白2(NP2)。HA、NA、M1和M2蛋白是膜相關(guān)蛋白，其中HA和NA蛋白分別是負(fù)責(zé)病毒吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞的糖蛋白。分類為H1-H15的15類血細(xì)胞凝集素抗原和分類為Nl-N9的9類神經(jīng)氨酶抗原已經(jīng)在流感A病毒中鑒定出來。HA蛋白通過結(jié)合到含有唾液酸的宿主細(xì)胞表面受體啟動(dòng)病毒到細(xì)胞的吸附。人流感病毒的血細(xì)胞凝集素優(yōu)先地結(jié)合到含有a2,6-半乳糖鍵的唾液酸受體上，而禽流感病毒優(yōu)先地結(jié)合到含有a2，3-半乳糖鍵的細(xì)胞上。這些結(jié)合偏好與唾液酸a2，6-半乳糖鍵在人上皮細(xì)胞上占優(yōu)勢和a2,3-半乳糖鍵在禽腸上皮細(xì)胞上占優(yōu)勢相關(guān)聯(lián)。參見，例如，RogersGN,PaulsonJC,DanielsRS，SkehelJJ,WilsonIA,WileyDC(1983)"Singleaminoacidsubstitutionsininfluenzahaemagglutininchangereceptorbindingspecificity,"Atowre304:76-78;ConnorRJ，KawaokaY，WebsterRG,PaulsonJC(1994)"Receptorspecificityinhuman,avianandequineH2andH3influenzavirusisolates,"Wra/ogy205:17-23;ItoT，SuzukiY,MitnaulL，VinesA，KidaH，KawaokaY(1997)"ReceptorspecificityofinfluenzaAvirusescorrelatewithagglutinationoferythrocytesfromdifferentanimalspecies,"Wra/ow227:492-99。盡管負(fù)責(zé)受體結(jié)合特異性的分子機(jī)制所知甚少，但據(jù)認(rèn)為，禽類衍生的流感血細(xì)胞凝集素必須獲得人類受體結(jié)合特異性來產(chǎn)生能持久地進(jìn)行人際傳播的流感病毒株。參見，例如，StephensonI,KGNicholson,JMWood,MCZambon,andJMKatz(2004)"Confrontingtheavianinfluenzathreat:vaccinedevelopmentforapotentialpandemic,"TheLancetInfectiousDiseases4:499-509。定點(diǎn)突變研究已經(jīng)顯示，該改變僅需要一個(gè)或兩個(gè)氨基酸突變。參見MatrosovichM，TuzikovA,BovinN，etal.(2000)"EarlyalterationsofthereceptorbindingpropertiesoftheHI,H2andH3avianinfluenzavirushemagglutininsaftertheirintroductionintomammals,"JVirol74:8502-12。一旦吸附發(fā)生，NA蛋白就起始受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞和宿主細(xì)胞/病毒膜融合。HA蛋白然后在內(nèi)涵體酸性環(huán)境中經(jīng)歷構(gòu)象變化，及，同M2蛋白共同介導(dǎo)M1蛋白從核殼體相關(guān)的核蛋白(RNPs)上的釋放，然后Ml蛋白被定向到細(xì)胞核用于病毒RNA的合成。M2蛋白是97個(gè)氨基酸的非糖基化跨膜蛋白。LambRA,LaiC-J,ChoppinPW(1981)"SequencesofmRNAsderivedfromgenomeRNAsegment7ofinfluenzavims:collinearandinterruptedmRNAscodeforoverlappingproteins,"PNAS78:4170-4;LambRA,ZebedeeSL,RichardsonCD(1985)"InfluenzavirusM2proteinisanintegralmembraneproteinexpressedontheinfected-cellsurface,"Cell40:627-33。它在病毒顆粒的病毒膜中形成同源四聚體，但是當(dāng)同HA和NA相比時(shí)，它的數(shù)目相當(dāng)?shù)?。然而，它在被感染?xì)胞的質(zhì)膜中高密度的出現(xiàn)。ZebedeeSL，LambRA(1988)"InfluenzaAvimsM2protein:monoclonalantibodyrestrictionofvirusgrowthanddetectionofM2invirions,"JVirol62:2762-72。M2蛋白被認(rèn)為促進(jìn)了RNP復(fù)合物從融合后的病毒膜上的釋放。它顯示出了質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的活性，該活性降低了病毒跨膜蛋白從ER到質(zhì)膜流出時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)小囊泡內(nèi)的pH值，阻止了HA的早發(fā)酸誘導(dǎo)構(gòu)象改變。參見MozdzanowskaKetal(2003)"InductionofinfluenzatypeAvimsspecificresistancebyimmunizationofmicewithasyntheticmultipleantigenicpeptidevaccinethatcontainsectodomainsofmatrixprotein2,"Vaccine21:2616-'2626;SteinhauerDA,WhartonSA,SkehelJJ,WileyDC，HayAJ(1991)"Amantadineselectionofamutantinfluenzaviruscontaininganacid-stablehemagglutininglycoprotein:evidenceforvirus-specificregulationofthepHofglycoproteintransportvesicles,"ProcNatlAcadSci88:11525-9;PintoLH，HolsingerLJ,LambRA(1992)"InfluenzavirusM2proteinhasionchannelactivity,"Cell69:517-28;ZhimovOP(1990)"SolubilizationofmatrixproteinMl/MfromvirionsoccursatdifferentpHfororthomyxo-andparamyxoviruses,"Virology176:274-9。M2蛋白包含在能感染人類的A型流感病毒中高度保守的23個(gè)氨基酸長度的外功能區(qū)(M2e)。實(shí)際上，9個(gè)N末端氨基酸在該病毒感染性人類毒株中是完全保守的，并且在前15個(gè)N末端氨基酸中僅有較小程度的結(jié)構(gòu)差異。ZebedeeSL,LambRA(1988)"InfluenzaAvimsM2protein:monoclonalantibodyrestrictionofvirusgrowthanddetectionofM2invirions,"JVirol62:2762-72;ItoT,GormanOT,KawaokaY,BeanWJ,WebsterRG(1991)"EvolutionaryanalysisoftheinfluenzaAvirusMgenewithcomparisonoftheMlandM2proteins,"J.Virol.65:5481-8。一般的，禽流感病毒不能在人類中有效的復(fù)制。BeareAS,WebsterRG(1991)"Replicationofavianinfluenzavirusesinhumans,"ArchVirol119:37-42。然而，已知禽流感病毒的某些亞型能在人類呼吸道內(nèi)復(fù)制。已經(jīng)有大量確證的禽流感病毒傳播到人的病例。參見StephensonI,KGNicholson,JMWood,MCZambon,andJMKatz(2004)"Confrontingtheavianinfluenzathreat:vaccinedevelopmentforapotentialpandemic,"TheLancetInfectiousDiseases4:499-509;WHOdiseasealert(2004)"ConfirmedhumancasesofavianinfluenzaH5N1,"http:〃www.who.int/csr/disease/avian—influenza/en/;HienTT,LiemNT,DungNT,etal(2004)"Avianinfluenza(H5N1)in10patientsinVietnam,"7V五"g/JA^d350:1179-88。某些型的禽流感病毒感染人類的能力增加了能提供禽類/人類重配株病毒出現(xiàn)環(huán)境的物種庫?？傮w上，存在兩類流感疫苗，滅活全流感病毒疫苗和滅活亞病毒粒子病毒疫苗。全病毒疫苗含有完整的滅活病毒粒，而亞病毒粒子疫苗含有大部分病毒結(jié)構(gòu)蛋白和某些病毒外膜蛋白。這些病毒疫苗每年都被組成預(yù)計(jì)將在給定流感季的人類群體中流通的A型流感和流感類型B毒株的三價(jià)混合物。WHO每半年檢査一次疫扭的組成并根據(jù)流行亞型的情況更新抗原內(nèi)容物以提供抗原良好匹配的疫苗。例如，對于2004-2005流感季，三價(jià)組合物包括A/NewCaledonia/20/99(H1N1);A/Wyoming/03/2003(H3N2)，它是A/Fujian/411/2002-樣病毒；和B/Shanghai/361/2002-樣病毒(即B/Jiangsu/10/2003或B/Jilin/20/2003)。該類疫苗的例子包括Fluzone(Connaught)、弗威靈(Chiron)和Flu-shield(Wyeth-Lederle)。近來，Medlmmune研制了用于鼻內(nèi)給藥的減活流感疫苗FluMist，該疫苗已經(jīng)得到了FDA批準(zhǔn)允許其在美國商業(yè)使用。這些疫苗通常產(chǎn)生病毒株特異的體液免疫，具有降低的抵抗抗原漂移病毒的功效，并且不能有效抵抗不相關(guān)毒株。參見StephensonI,NicholsonKG,WoodJM,ZambonMC，andKatzJM(2004)"Confrontingtheavianinfluenzathreat:vaccinedevelopmentforapotentialpandemic,"TheLancet:InfectiousDiseases4:499-509。在上面描述的免疫接種利用的滅活和減毒病毒在雞胚尿囊腔中生產(chǎn)。這種生產(chǎn)方法是耗時(shí)的，需要花費(fèi)多達(dá)6個(gè)月的時(shí)間來生產(chǎn)并且高度易受污染的影響。2004年，Chiron公司流感病毒生產(chǎn)中的污染導(dǎo)致了流感疫苗高度周知和引起爭論的短處。該污染在2004年8月發(fā)現(xiàn)，對制造商而言，這個(gè)時(shí)間太晚了以至于不能為那個(gè)流感流行季生產(chǎn)新批次的疫苗。另外，當(dāng)前的生產(chǎn)方法需要預(yù)測最可能在流感季期間出現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)特定毒株。這樣一個(gè)必要條件連同當(dāng)前的生產(chǎn)方法限制了修改流感疫苗的生產(chǎn)以針對未預(yù)測到的病毒株的能力。因此，存在對能快速生產(chǎn)并能被容易修改以允許抵抗新出現(xiàn)病毒的免疫接種改良疫苗的需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用作抵抗病毒特別是流感病毒的疫苗的組合物，該組合物包含i)至少一條衍生自流感病毒并融合到至少一條衍生自植物病毒的衣殼蛋白且形成重組衣殼融合肽的肽，其中的重組衣殼融合肽能進(jìn)行組裝來形成病毒或病毒樣顆粒，和ii)至少一條衍生自人或禽流感病毒的分離抗原蛋白或蛋白片段。這樣的策略利用了同抗原蛋白或蛋白片段組合的病毒或病毒樣顆粒的免疫原方面來生產(chǎn)可能會(huì)提供更廣泛的抵抗人和/或禽流感病毒的保護(hù)性免疫的疫苗。在本發(fā)明的一個(gè)方面，衍生自流感病毒并融合到植物衣殼蛋白的肽是保守的流感病毒表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，該保守表位是保守的人流感病毒表位。通過利用保守的流感表位作為病毒或病毒樣顆粒的抗原插入物，組合物的核心成分在每年的基礎(chǔ)上不需要重新工程化。相反的，當(dāng)有新流感病毒株出現(xiàn)時(shí)僅有分離抗原蛋白或蛋白片段需要改變。因?yàn)榭乖鞍谆虻鞍灼文鼙恢亟M生產(chǎn)，因此用作激發(fā)人或動(dòng)物抵抗新出現(xiàn)流感病毒株的免疫反應(yīng)的疫苗的組合物能被快速生成。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，保守的流感肽衍生自M2蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，M2衍生的肽從包含SEQIDNos:1-5和22-24的組中選擇。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了從包含SEQIDNos:3、22、23和24的組中選擇的M2流感蛋白衍生的肽序列。此外，提供了SEQIDNos:3、22、23或24的片段、衍生物和同系物。在其他實(shí)施方案中，保守表位衍生自NP蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，NP肽從包含SEQIDNos:8-10的組中選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，保守表位衍生自HA蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，HA肽從包含SEQIDNos:6和7的組中選擇。在其他實(shí)施方案中，任何衍生自流感病毒并從包含M2、NP或HA的組中選擇的保守流感肽的組合均能被融合到衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，衣殼融合肽包含M2、NP和HA肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，衣殼融合肽包含M2和NP保守肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，衣殼融合肽包含M2和HA肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，衣殼融合肽包含HA和NP保守肽。本發(fā)明利用衍生自植物病毒的衣殼蛋白來構(gòu)建衣殼融合肽。帶有融合流感肽的衣殼蛋白能在體內(nèi)或體外自我組裝來形成病毒或病毒樣顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒不包括宿主細(xì)胞質(zhì)膜蛋白或宿主細(xì)胞壁蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物病毒將從是二十面體(包括正的、等角的、半等角的和成對的或"一胎雙生的"二十面體)、多面體(包括球狀的、卵形的和檸檬形的)、桿狀的(包括桿或子彈形的，和紡錘形或雪茄煙形的)和螺旋狀的(包括棒狀、圓筒狀和絲狀的)的病毒中選擇。在某些實(shí)施方案中，植物病毒能是二十面體植物病毒毒種。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒衣殼蛋白能衍生自豇豆褪綠斑點(diǎn)病毒(CCMV)或豇豆花葉病毒(CPMV)。在另外的實(shí)施方案中，植物病毒從CCMV或CPMV中選擇，并且衣殼包括至少一個(gè)從包含SEQIDNos:3，22，23和24的組中選擇的插入物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，同病毒或病毒樣顆粒組合的分離抗原蛋白或蛋白片段是衍生自新出現(xiàn)的包括人或禽類流感病毒的流感病毒株的流感蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白或蛋白片段衍生自禽流感病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗原蛋白或蛋白片段衍生自從包含基質(zhì)(Ml)、質(zhì)子-離子通道(M2)、血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酶(NA)、核蛋白(NP)、聚合酶堿性蛋白1(PB1)、聚合酶堿性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非結(jié)構(gòu)蛋白2(NP2)的組中選擇的流感病毒蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或蛋白片段衍生自禽流感HA或NA。在某些實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒同多于一個(gè)的分離抗原蛋白或蛋白片段組合。在某些實(shí)施方案中，這些分離抗原肽或肽片段衍生自相同的物種。在其他實(shí)施方案中，這些分離抗原肽或肽片段衍生自不同的物種。在某些實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒同至少一種NA蛋白或蛋白片段和至少一種HA蛋白或蛋白片段組合。在某些實(shí)施方案中，NA和/或HA片段衍生自禽流感病毒。在某些其他實(shí)施方案中，NA和/或HA片段衍生自人流感病毒。在其它實(shí)施方案中，病毒樣顆粒同至少一個(gè)NA蛋白或蛋白片段、至少一個(gè)HA蛋白或蛋白片段和任何從包含M1、M2、NP、PB1、PB2、PA和NP2的組中選擇的禽流感病毒蛋白或蛋白片段的組合相組合。在某些實(shí)施方案中，NA蛋白或蛋白片段衍生自從包含Nl、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的組中選擇的流感NA蛋白的組。在另外的實(shí)施方案中，HA蛋白或蛋白片段衍生自流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14和H15蛋白。在某些實(shí)施方案中，分離抗原肽是和病毒或病毒樣顆粒在一起的混合物中但并不共價(jià)連接到病毒或病毒樣顆粒上。該混合物能包括另外的輔藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一條抗原蛋白片段短于全長蛋白。在某些實(shí)施方案中，抗原蛋白片段衍生自禽或人流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該蛋白片段包含至少IO、15、20、25、50、75、100、150、200或更多個(gè)氨基酸。'在一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自流感病毒的肽、衍生自植物病毒的衣殼蛋白和衍生自流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段能被改變來提供增強(qiáng)的期望的特征。這樣的特征包括增強(qiáng)的抗原性、在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)的重組表達(dá)、更有效的組裝或提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，插入到衣殼蛋白的流感肽通過改變它的氨基酸序列進(jìn)行修改，其中的氨基酸改變不降低該肽的抗原性質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，插入到衣殼蛋白的流感肽通過諸如糖基化、磷酸化或脂修飾等翻譯后修飾進(jìn)行修飾。在另外的實(shí)施方案中，分離抗原蛋白或蛋白片段能通過改變它的氨基酸序列進(jìn)行修改，該氨基酸改變不降低該肽的抗原性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離抗原蛋白或蛋白片段通過翻譯后進(jìn)行修飾。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，至少一條分離蛋白或蛋白片段能被共價(jià)連接到含所述肽的病毒或病毒樣顆粒的表面。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一條由少于所述蛋白整個(gè)氨基酸序列組成的禽或人流感病毒蛋白片段被共價(jià)連接到含所述肽的病毒或病毒樣顆粒的表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，被共價(jià)連接的抗原蛋白片段包括至少10、15、20、25、50、75、100、150、200或更多個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一條衍生自流感病毒的M2、NP或HA肽被融合到衍生自植物病毒的衣殼蛋白并形成第一重組衣殼融合肽，然后該重組衣殼融合肽同至少一條衍生自禽和/或人流感病毒并融合到衍生自植物病毒的衣殼蛋白的肽組合來形成第二重組衣殼融合肽。在這個(gè)實(shí)施方案中，第一重組衣殼融合肽和第二重組衣殼融合肽均能在體內(nèi)或體外組裝來形成病毒或病毒樣顆粒。產(chǎn)生的病毒樣顆粒然后能同衍生自流感病毒的分離抗原蛋白組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二重組衣殼融合肽中包含的肽衍生自從包含M1、M2、hHA、NA、NP、PB1、PB2、PA和NP2的組中選擇的人或禽流感病毒蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在第二重組衣殼融合肽中含有的肽衍生自流感病毒蛋白HA或NP。在其它實(shí)施方案中，包含在第二重組衣殼融合肽中的肽是NP。在其它實(shí)施方案中，包含在第二重組衣殼融合肽中的肽是HA。在某些實(shí)施方案中，HA肽衍生自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、HB、H14和H15蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含病毒或病毒樣顆粒的組合物，其中該病毒或病毒樣顆粒包含衍生自植物病毒的衣殼蛋白，該衣殼蛋白融合到i)至少一條衍生自流感病毒的保守肽和ii)至少一條額外的分離流感病毒肽，其中的衣殼融合肽能在體內(nèi)或體外組裝成病毒或病毒樣顆粒，和iii)衍生自流感病毒的抗原肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含病毒或病毒樣顆?；旌衔锏慕M合物，其中的混合物包含i)含有至少一條衍生自流感病毒的肽的第一病毒或病毒樣顆粒，和ii)至少一種含有至少一條不同于包含在第一病毒或病毒樣顆粒中的流感病毒肽的第二病毒或病毒樣顆粒，和iii)衍生自流感病毒的分離抗原肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感肽被融合到衍生自植物病毒的衣殼蛋白。在本發(fā)明的某些方面，所述組合物能被用于疫苗策略來誘導(dǎo)人類或動(dòng)物的免疫反應(yīng)。為了激發(fā)免疫反應(yīng)，所述組合物能同佐劑組合并以有效劑量給與到人或動(dòng)物。在其他實(shí)施方案中，所述組合物未與佐劑組合而直接給與到人或動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包括諸如CpG序列的免疫刺激核酸。在某個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激核酸能被包裹到病毒樣顆粒中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的組合物能以基本純化的形式，例如基本不含宿主細(xì)胞的形式給與到人或動(dòng)物。在其他實(shí)施方案中，所述組合物能以部分純化的形式，例如以包含可以是植物細(xì)胞蛋白的宿主細(xì)胞蛋白的形式給與到人或動(dòng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)用在人或動(dòng)物流感疫苗中的組合物的方法，該方法包含i)提供編碼連接到流感病毒肽序列的植物病毒衣殼蛋白序列的第一核酸，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)該第一核酸來生產(chǎn)衣殼融合肽；ii)組裝該衣殼融合肽來形成病毒或病毒樣顆粒；iii)提供至少一種編碼至少一條衍生自流感病毒株的抗原蛋白或蛋白片段的第二核酸，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)該第二核酸來生產(chǎn)該抗原蛋白或蛋白片段；iv)分離并純化該抗原蛋白或蛋白片段；和v)組合該病毒或病毒樣顆粒和該分離抗原蛋白或蛋白片段來形成能給與到人或動(dòng)物的組合物。在某些實(shí)施方案中，該病毒或病毒樣顆粒在植物宿主中生產(chǎn)，例如，在完整植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中。在其他實(shí)施方案中，該病毒或病毒樣顆粒在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。在其他實(shí)施方案中，衣殼融合肽在諸如植物或熒光假單胞菌細(xì)胞中表達(dá)并且病毒或病毒樣顆粒在體外進(jìn)行組裝。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原蛋白或蛋白片段能在諸如完整植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物的真核細(xì)胞中生產(chǎn)。在另外的實(shí)施方案中，該抗原蛋白或蛋白片段能在任何原核細(xì)胞中生產(chǎn)，例如，在大腸桿菌或熒光假單胞菌中。在某些實(shí)施方案中，所述衣殼融合肽和抗原蛋白或蛋白片段在同一種真核細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)，而且該衣殼融合肽在體內(nèi)組裝來形成病毒或病毒樣顆粒。在其他實(shí)施方案中，該衣殼融合肽和抗原蛋白或蛋白片段在諸如熒光假單胞菌細(xì)胞的原核細(xì)胞中共表達(dá)，并且，該衣殼融合肽在體內(nèi)組裝來形成病毒樣顆粒。圖1:顯示了所述流感疫苗的示意圖，該疫苗包含展示共價(jià)連接到所述VLP的流感病毒表位和流感病毒蛋白或蛋白片段抗原的病毒或病毒樣顆粒。在顆粒中的免疫剌激核酸序列(CpGs)的衣殼化也被顯示。圖2:顯示了流感病毒蛋白或蛋白片段抗原到病毒或病毒樣顆粒的共價(jià)結(jié)合的示意圖。圖3:顯示了VLP組裝過程中免疫刺激核酸序列(CpGs)在VLP中衣殼化的示意圖。圖4:顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖5:顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同M2e-2流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖6:顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同NP55-69流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖7:顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同NP147-158流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖8:顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同HA91-108流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖9:顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)和純化。圖10:顯示了通過使用抗CCMV和抗M2抗體14B的WesternBlotting檢測到的同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。M2e肽被抗M2抗體所識別。圖11:顯示了通過SDS-PAGE和使用抗CPMV和抗M2抗體14B的WesternBlotting檢測到的同M2e-1流感病毒肽融合的CPMV在植物中的表達(dá)。M2e肽被抗M2抗體所識別。圖12:顯示了來源于H5N1分離毒株的包含信號肽、HA1和HA2、跨膜區(qū)和標(biāo)明胞質(zhì)尾區(qū)的HA蛋白的序列。圖13:顯示了H5N1HA單體的結(jié)構(gòu)。圖14:顯示了用于在植物中表達(dá)流感蛋白或蛋白片段的基于PVX的病毒載體的示意圖。，圖15:顯示了用于在植物中生產(chǎn)流感病毒蛋白的基于植物病毒載體的系統(tǒng)的示意圖。被工程化來表達(dá)流感病毒蛋白或蛋白片段的植物病毒載體能像質(zhì)粒DNA、病毒RNA—樣通過機(jī)械傳播或通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的傳遞被傳遞到植物。具體實(shí)施方式I、衣殼融合肽本發(fā)明利用至少一條衍生自流感病毒并融合到衍生自植物病毒的衣殼蛋白并形成重組衣殼融合肽的肽。該重組衣殼融合肽能組裝形成不含宿主細(xì)胞質(zhì)膜的病毒或病毒樣顆粒。該重組衣殼融合肽能含有流感病毒衍生肽。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，該重組衣殼融合肽含有衍生自流感病毒蛋白的肽。在另外的實(shí)施方案中，該肽衍生自保守肽和它的衍生肽或異型同源肽。該保守肽能衍生自M2、HA或NP蛋白。在某些實(shí)施方案中，衍生自M2、HA或NP的保守肽或它的衍生物或同系物的一條、多條或組合能被融合到衣殼蛋白。衍生物或同系物通常被認(rèn)為是同參考序列具有至少75、80、85、90、95、98或99%同一性的氨基酸序列。g、義,/或建郝齡,在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自人或禽流感病毒的肽同衍生自植物病毒的衣殼蛋白遺傳融合。人和禽流感病毒蛋白序列在本領(lǐng)域中是人所共知的。例如，美國國家生物技術(shù)信息中心維護(hù)了含有從分離的人和禽流感病毒毒株而來的編碼蛋白的核酸序列和氨基酸序列的流感資源數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html。選來插入植物病毒衣殼蛋白的肽能衍生自全長流感病毒蛋白的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，選來插入的肽在長度上包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個(gè)氨基酸殘基。被選擇的肽可以具有抗原肽的至少75、80、85、90、95、98或99%同源性，上述抗原肽包含從它衍生的流感蛋白內(nèi)的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，選來插入的流感肽包含能在人或動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)的表位。表位的確定在本領(lǐng)域內(nèi)是人所共知的。例如，通過給與選定的肽到諸如小鼠、兔、山羊或猴子的動(dòng)物，然后檢驗(yàn)該動(dòng)物的血清中針對該肽的抗體的存在，選來插入植物病毒衣殼蛋白的肽能被進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來測定其能否激發(fā)免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，流感衍生的抗原肽能被改變來提高插入物的特性，諸如但不限定于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性和提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。Z)、魔參2嚴(yán)流感M2蛋白是97個(gè)氨基酸的膜蛋白。該蛋白在N末端有24個(gè)暴露于胞外的氨基酸殘基、19個(gè)跨過脂雙層的氨基酸殘基和54個(gè)位于質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自能感染人或鳥類的流感病毒的97個(gè)氨基酸的序列。該衍生肽能包含整條97個(gè)氨基酸的序列，或能是它的包含從所述97個(gè)氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或97個(gè)氨基酸殘基的亞型。所選擇的該肽能具有同所述的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或97個(gè)氨基酸殘基的M2抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的M2肽衍生自所述的氨基酸胞外區(qū)域。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的M2肽衍生自普遍保守的M2序列的23個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)域序列M2e-1(SEQIDNo:l，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述M2e-1肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)從所述M2e-1肽中選擇的氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:l的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基的M2e-l肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自23個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)域序列M2e-2(SEQIDNo:2，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述M2e-2肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述M2e-2肽選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:2的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基的M2e-2肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自22個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)域序列M2e-3(SEQIDNo:3，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述M2e-3肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述M2e-3肽選擇的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:3的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基的M2e-3肽序列至少75、80、85、卯、95、98或99%的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的23個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)域序列(SEQIDNo:4，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述的衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的M2肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述的衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的M2肽選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:4的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基的衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)的M2肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一個(gè)實(shí):&但方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的23個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)域(SEQIDNo:5，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述的衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的M2肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述的衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的M2肽選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:5的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸殘基的衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)的M2肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自22個(gè)氨基酸殘基的序列M2e-2(W-)(SEQIDNo:22，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述的M2e-2(W-)肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述的M2e-2(W-)肽選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:22的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22個(gè)氨基酸殘基的M2e-2(W-)肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/PR/8/34(HlNl)(W-)的22個(gè)氨基酸殘基序列(SEQIDNo:23，表1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述的M2-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述的A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:23的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23個(gè)氣基酸殘基的A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽衍生自流感病毒株A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)的22個(gè)氨基酸殘基序列(SEQIDNo:24，表l)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的M2肽包含所述的M2-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽的氨基酸序列亞型，該亞型包含從所述的M2-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:24的至少4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基的M2-A/FortMonmouth/1/47(HlNl)(W-)肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他的實(shí)施方案中，插入到植物病毒衣殼蛋白的M2肽能是從包含SEQIDNos:1-5和22-24的組中選擇的整條氨基酸序列，或它的含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選來插入的該肽能具有同所述的包含從由SEQIDNos:1-5和22-24組成的組中選擇的肽的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個(gè)氨基酸殘基的肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他實(shí)施方案中，任何從包含SEQIDNos:1-5和22-24的組或它的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型中選擇的M2肽的組合均能被插入植物病毒衣殼蛋白中。選擇的肽組合能具有同所述的包含從由SEQIDNo:1-5和22-24組成的組中選擇的肽的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個(gè)氨基酸殘基的肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的實(shí)施方案中，M2流感衍生的抗原肽能被改變來提高插入物的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性和提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括，在序列SEQIDNo:1、2、4或5中的色氨酸被移除或被非色氨酸的任何氨基酸取代。表1M2肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>SLLTEVETPTKNEECRCNDSSDM2e-A/FortMonmouth/1/47(H1N1)(W-)SEQIDNo:24本發(fā)明也提供了新的M2衍生的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有SEQIDNo:3的新M2肽M2e-3。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了同SEQIDNo:3的同源性至少為70、75、80、90、95、98或99%的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了衍生自SEQIDNo:3的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基的肽。M2e-3肽衍生自M2e-1肽，其中的色氨酸被移除。色氨酸的移除提供了所述衣殼融合肽增加的組裝而沒有負(fù)面影響該肽的免疫原性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述M2e-3肽被插入到植物病毒的衣殼蛋白。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的M2e-3肽被插入衍生自CCMV或CPMV的衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含SEQIDNo:22的新M2肽M2e-2(W-)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了同SEQIDNo:22至少70、75、80、90、95、98或99%同源性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含衍生自SEQIDNo:22的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基的肽。M2e-2(W-)肽衍生自M2e-2肽，其中的色氨酸已經(jīng)被移除。在一個(gè)實(shí)施方案中，M2e-2(W-)肽被插入到衍生自植物病毒的衣殼蛋白。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的M2e-2(W-)肽被插入到衍生自CCMV或CPMV的衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含SEQIDNo:23的新M2肽M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了同SEQIDNos:23至少70、75、80、90、95、98或99%同源性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含衍生自SEQIDNo:23的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基的肽。M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽衍生自M2e-A/PR/8/34(HlNl)肽，其中的色氨酸己經(jīng)被移除。在一個(gè)實(shí)施方案中，M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自植物病毒的衣殼蛋白。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的M2e-A/PR/8/34(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自CCMV或CPMV的衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含SEQIDNo:24的新M2肽M2e-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了同SEQIDNo:24至少70、75、80、90、95、98或99%同源性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含衍生自SEQIDNo:24的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)氨基酸殘基的肽。該肽衍生自M2e-A/FortMonmouth/1/47(H1N1)肽，其中的色氨酸已經(jīng)被移除。在一個(gè)實(shí)施方案中，M2e-A/FortMonmouth/l/47(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自植物病毒的衣殼蛋白。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的M2e-A/FortMonmouth/1/47(HlNl)(W-)肽被插入到衍生自CCMV或CPMV的衣殼蛋白。也提供了包含衣殼融合肽的新組合物，所述衣殼融合肽包含衍生自包括植物病毒的病毒的衣殼蛋白，該衣殼蛋白被融合到從包含SEQIDNos:3、22、23和24的組中選擇的肽上。6、別歪^流感病毒血凝素(HA)是以帶有多個(gè)折疊域的同源三體形式出現(xiàn)在流感病毒顆粒上的I型跨膜糖蛋白。其單體具有六個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵和七個(gè)在N末端外功能區(qū)內(nèi)的N聯(lián)聚糖、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞溶質(zhì)尾。Wilsonetal.(1981)"Structureofthehaemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirusat3A°resolution,"Nature289:366-373;WileyD.C.andJJ.Skehel(1987)"Thestructureandfbnctionofhemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus,"Annu.Rev.Biochem.56:365-394。蛋白水解活化三體的外功能區(qū)晶體結(jié)構(gòu)揭示了135AG長的三聚突起蛋白，在該突起蛋白中，每一個(gè)亞基具有兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域球狀NH;r末端頂部結(jié)構(gòu)域和形成該突起蛋白頸部的COOH-末端結(jié)構(gòu)域。該頸部結(jié)構(gòu)域含有已知涉及該蛋白膜融合活性的融合肽。Wilsonetal.(1981)"Structureofthehaemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavimsat3A°resolution,"Nature289:366-373;WileyD.C.andJJ.Skehel(1987)"Thestructureandflmctionofhemagglutininmembraneglycoproteinofinfluenzavirus,"Annu.Rev.Biochem.56:365-394。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的HA肽衍生自包含在流感病毒的從包含15類血凝素抗原H1-H15的組中選擇的HA蛋白。該衍生肽能包含整條HA氨基酸序列，或它的包含從所述HA氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同所述的包含從由HA氨基酸序列選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、]70、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多個(gè)氨基酸殘基的流感蛋白HA抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。'本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的HA肽衍生自能感染人或鳥類的流感病毒。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的插入到植物病毒衣殼蛋白的HA肽衍生自H3亞型。在其他實(shí)施方案中，所述HA肽能衍生自流感病毒株A/Texas/1/77(H3N2)的333個(gè)氨基酸長的HA肽(SEQIDNo:6，表2)。CBSmithetal.(2002)"MolecularepidemiologyofinfluenzaA(H3N2)vimsre-infections,"J.Infect.Dis.185(7):980-985。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用來插入植物衣殼蛋白的HA肽能包含SEQIDNo:6的整條HA氨基酸序列，或它的包含從SEQIDNo:6的HA氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同所述的包含SEQIDNo:6的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多個(gè)氨基酸殘基的HA抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的HA肽衍生自18個(gè)氨基酸長的序列HA91-108-A/Texas/l/77(H3N2)(SEQIDNo:7，表2)或它的衍生自流感病毒株A/Texas/1〃7(H3N2)的HA氨基酸91-108的具有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同包含所述18個(gè)氨基酸長的序列HA91-108-A/Texas/1/77(H3N2)的HA抗原肽序列(SEQIDNo:7，表2)或它的衍生自流感病毒株A/Texas/1/77(H3N2)的HA氨基酸91-108的具有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的實(shí)施方案中，插入到植物病毒衣殼蛋白的HA肽能是從包含SEQIDNos:6和7的組中選擇的整條氨基酸序列或它的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。在其他實(shí)施方案中，從包含SEQIDNos:6和7的組中選擇的HA肽或它的包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、l卯、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、331、332或333或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型的任何組合物均能被插入到植物病毒衣殼蛋白。選擇的該肽能具有同從衍生自包含SEQIDNos:6-7的組中選擇的肽的HA抗原肽序列至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的實(shí)施方案中，流感衍生的HA抗原肽能被改變來提高插入物的特征，例如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)，增強(qiáng)的免疫原性和提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。表2HA肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>c,NP蛋白流感病毒核蛋白(NP)是同病毒單鏈RNA基因組緊密相關(guān)的螺旋狀核蛋白。流感NP蛋白富含精氨酸、甘氨酸和絲氨酸殘基并且在中性pH環(huán)境中具有凈正電荷。A型流感NP蛋白通常包含長度為498個(gè)氮基酸的多肽，而B型流感和C型流感病毒中的同源NP多肽的長度通常分別為560個(gè)和565個(gè)氨基酸殘基。參見Londoetal.(1983)"CompletenucleotidesequenceofthenucleoproteingeneofinfluenzaBvirus,"JournalofVirology47:642-648;S.Nakadaetal.(1984)"CompletenucleotidesequenceoftheinfluenzaC/California/78virusnucleoproteingene,"VimsResearch1:433-441。預(yù)測的三種流感病毒類型的NP基因氨基酸序列的比對揭示了這三種蛋白間顯著的相似性，其中A型和B型的NPs顯示了最高程度的保守性。參見PortelaandDigard(2002)"Theinfluenzavirusnucleoprotein:amultiflmctionalRNA-bindingproteinpivotaltovimsreplication2002，"JGV83:723-734。對從不同宿主分離來的病毒株的系統(tǒng)進(jìn)化分析揭示，NP基因相對好地保守，其最大氨基酸差異低于11%。參見Shuetal.(1993)"AnalysisoftheevolutionandvariationofthehumaninfluenzaAvirusnucleoproteingenefrom1933to1990，"JournalofVirology67:2723-2729。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的NP肽衍生自包含在A型流感、B或C病毒中的NP蛋白。該衍生肽能包含整條的NP氨基酸序列，或能是它的包含從所述NP氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同包含從所述NP氨基酸序列選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410'、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多個(gè)氨基酸殘基的流感蛋白NP抗原肽序列至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的NP肽衍生自能感染人或鳥類的流感病毒。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的插入到本發(fā)明利用的植物病毒衣殼蛋白中的NP肽衍生自衍生自一種A型流感病毒的NP蛋白。該NP蛋白衍生自流感病毒株A/Texas/1/77(H3N2)的長498個(gè)氨基酸的NP蛋白(SEQIDNo:8，表3)或能是它的包含從SEQIDNo:8的NP氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同包含從SEQIDNo:8的NP氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、320、325、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、446或更多個(gè)氨基酸殘基的流感蛋白NP抗原肽序列至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。本發(fā)明的另外的實(shí)施方案包括的本發(fā)明利用的NP肽衍生自15個(gè)氨基酸長度的序列NP55-69-A/Texas/l/77(H3N2)(SEQIDNo:9，表3)或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株NP氨基酸55-69的長度至少為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同NP抗原肽序列或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株NP氨基酸55-69的含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸殘基的亞型至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的NP肽衍生自12個(gè)氨基酸長度的序列NP147-158-A/Texas/1/77(H3N2)(SEQIDNO:10，表3)或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株的NP氨基酸147-158的長度至少為4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同所述NP抗原肽序列或它的衍生自流感A/Texas/1/77(H3N2)病毒株的NP氨基酸147-158的具有至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸殘基的亞型至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在另外的實(shí)施方案中，插入到植物病毒衣殼蛋白的NP肽能是從包含SEQIDNos:8-10的組中選擇的整條氨基酸序列或它的長度為至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、320、325、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、4卯、495、498或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該肽能具有同包含從含有SEQIDNos:8-10的組中選擇的NP氨基酸序列中選擇的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、320、325、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多個(gè)氨基酸殘基的流感蛋白NP抗原肽序列至少70、75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其他實(shí)施方案中，從包含SEQIDNOs:8-10的組中選擇的NP肽或它的同含有長度至少為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、135、140、150、160、170、180、190、200、210、225、235、250、260、275、280、290、300、310、320、325、330、350、360、375、380、390、400、410、425、435、445、450、460、470、480、490、495、498或更多個(gè)氨基酸殘基的流感蛋白NP抗原肽序列同源性至少為70、75、80、85、90、95、98或99。/。的衍生于含有SEQIDNOs:8-10的組的亞型的任何組合均能被插入到植物病毒衣殼蛋白中。在另外的實(shí)施方案中，衍生自流感NP的抗原肽能被改變來提高插入物的特征，例如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)，最強(qiáng)的免疫原性和提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。表3:NP氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>d、賴餅本發(fā)明利用了衍生自植物病毒的衣殼蛋白來構(gòu)建衣殼融合肽。使用來自植物病毒的衣殼蛋白的一個(gè)潛在優(yōu)勢是降低了當(dāng)該融合肽給與到人或動(dòng)物時(shí)產(chǎn)生副反應(yīng)的可能性，同時(shí)維持了用來提呈流感表位的病毒顆粒的有利形式。在另外的實(shí)施方案中，該衣殼蛋白將衍生自從對至少一種植物宿主特異的分類群的任何一種的成員中選擇的植物病毒。病毒分類法認(rèn)可殼體化顆粒實(shí)體的下述分類群:群I病毒，即dsDNA病毒；群n病毒，即ssDNA病毒；群m病毒，即dsRNA病毒；群IV病毒，即無DNA階段的正鏈ssRNA病毒；群V病毒，即負(fù)鏈ssRNA病毒；群VI病毒，即RNAretroid病毒，它們是ssRNA反轉(zhuǎn)錄病毒；群VII病毒，g卩DNAretroid病毒，它們是dsDNA反轉(zhuǎn)錄病毒；Deltavimses;類病毒；和衛(wèi)星噬菌體和衛(wèi)星病毒，除衛(wèi)星核酸和蛋白感染素外。這些分類群的成員對本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員而言是被熟知的并在H.V.VanRegenmorteletal.(eds.),VimsTaxonomy:SeventhReportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2000)(AcademicPress/Elsevier，BurlingtonMass.,USA);英國來徹斯特大學(xué)微生物學(xué)&免疫學(xué)系的病毒分類學(xué)網(wǎng)頁http:〃w西micro.msb.le.ac.u固35/Vimsgroups.html;和美國健康與人類服務(wù)部國家健康研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(美國，華盛頓特區(qū))在線分類學(xué)瀏覽器"病毒"和"類病毒"部分http:〃www.ncbi.nhn.nih.gov/Taxonomy/tax.html進(jìn)《亍了纟宗述。所述衣殼的氨基酸序列能從感染植物的任何這些分類群的任何成員的衣殼中選擇。這些分類群成員衣殼的氨基酸序列能從下述來源獲得，包括但不限于，例如在網(wǎng)頁http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi上NCBI提供的在線Pubmed搜索工具"Nucleotide"(Genbank)、"Protein"禾卩"Structure"部分。病毒能被分類到那些具有螺旋對稱或二十面體對稱的群中。通常，能被識別的衣殼形態(tài)包括二十面體(包括正的、對角的、半對角的，和成對的或"一胎雙生的"二十面體)、多面體(包括球狀的、卵形的和檸檬形的)、桿狀的(包括桿-或子彈-形的，和紡錘形或雪茄煙形的)和螺旋狀的(包括棒狀、圓筒狀和絲狀的)；任何具尾的或含有諸如突起或結(jié)的表面突出部分的形態(tài)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述衣殼的氨基酸序列從以具有任何形態(tài)分類的病毒的衣殼中選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述衣殼衍生自桿狀植物病毒。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的衣殼是衍生自從煙草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯病毒X(PVX)中選擇的組的桿狀病毒衣殼。TMV包含被獨(dú)特外殼蛋白(17.5kDa)衣殼化的單鏈正義基因組咖A(6.5kb)，該外殼蛋白導(dǎo)致了桿狀顆粒(300nm)。煙草花葉病毒廣泛的宿主范圍允許使用多種植物品種作為生產(chǎn)和傳遞系統(tǒng)。先前已經(jīng)顯示，插入到這個(gè)載體的外源基因能生產(chǎn)高水平的蛋白。Yusibovetal.(1995)"High-a伍nityRNA-bindingdomainsofalfalfamosaicviruscoatproteinarenotrequiredforcoatprotein-mediatedresistance,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.92:8980-8984。馬鈴薯病毒X是絲狀的、非包膜的；具有清楚模態(tài)的長515nm寬13nm通常彎曲的病毒。該衣殼結(jié)構(gòu)形成了具有3.4nm螺距的基本螺旋。VarmaA,GibbsAJ,WoodsRD,FinchJT(1968)"Someobservationsonthestructureofthefilamentousparticlesofseveralplantviruses,"JGenVirol.2(1):107-14。在其它實(shí)施方式中，該衣殼蛋白衍生自不是TMV的植物病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述衣殼具有二十面體形態(tài)。通常的，二十面體病毒的病毒衣殼包含多個(gè)以二十面體(立方形的)對稱排列的蛋白亞基。例如，用三個(gè)亞基形成衣殼的每一個(gè)三角形面，產(chǎn)生60個(gè)亞基形成完整的衣殼，天然二十面體衣殼能被建立。例如，噬菌體0X174就是這個(gè)小的病毒結(jié)構(gòu)的代表。許多二十面體病毒衣殼含有超過60個(gè)亞基。二十面體病毒的許多衣殼含有逆平行的、八鏈的P-折疊桶折疊的基序。該基序具有在一端帶有四個(gè)P鏈(命名為BIDG)另一端帶有四個(gè)3鏈(命名為CHEF)的楔形區(qū)。該基序也具有兩個(gè)保守a螺旋(命名為A和B)，其中一個(gè)處于PC和eD之間，另一個(gè)位于PE和PF之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述二十面體植物病毒種類將是感染植物的病毒種類，它是或是任何本揚(yáng)病毒科(傷z^awW^^)、呼腸孤病毒科(i^ov/".(ifle)、彈狀病毒禾斗(i/2aMov/W(iag)、大麥黃矮病毒禾斗(丄wteov/廠油e)、7Va腳zW(^、雙組分雙鏈認(rèn)A球狀真菌病毒科(尸ar份/v/r油e)、歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒禾斗(&gw/v/"'t/ae)、53wov/nVibe、(9ww7/"vz>w5、煙草壞死病毒衛(wèi)星(TobaccoNecrosisVirusSatellite)、花禍P菜花口十病毒禾斗(C"M/z'附oWr/(iag)、耳關(guān)體病毒禾斗(G^腿'"/Wn'c/ae)、豇豆花葉病毒禾斗(ComcwWt/ae)、南方菜豆花口十病毒禾斗(5b6e附6)Wn^)、番茄叢矮病毒禾斗(7b附&Msv/n'cfog)，或雀麥花葉病毒禾斗(SrawoWrz.(iae)分類群的一員。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述二十面體植物病毒種類是感染植物的病毒種類，它是或是任何大麥黃矮病毒科、A^zoWrW^、雙組分雙鏈RNA球狀真菌病毒科、歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒科、rjwoWnVfoe、<9'av/n、煙草壞死病毒衛(wèi)星、花椰菜花葉病毒科、聯(lián)體病毒科、豇豆花葉病毒科、南方菜豆花葉病毒科、番茄叢矮病毒科，或雀麥花葉病毒科分類群的一員。在特定的實(shí)施方式中，所述二十面體植物病毒種類是感染植物的病毒種類，它是或是任何花椰菜花葉病毒科、聯(lián)體病毒科、豇豆花葉病毒科、南方菜豆花葉病毒科、番茄叢矮病毒科，或雀麥花葉病毒科的一員。在其它實(shí)施方式中，所述二十面體植物病毒種類將是感染植物的病毒種類，它是或是任何豇豆花葉病毒科、南方菜豆花葉病毒科、番茄叢矮病毒科，或雀麥花葉病毒科的一員。在另外的實(shí)施方式中，所述衣殼衍生自等徑易變病毒屬(//"rvh")或苜蓿花葉病毒屬"http://flmow>^)。在另外的實(shí)施方式中，所述衣殼衍生自煙草線條病毒、苜蓿花葉病毒(AMV)或雀麥花葉病毒(BMV)。在其它實(shí)施方式中，所述二十面體植物病毒種類能是感染植物的病毒種類，它是豇豆花葉病毒科或雀麥花葉病毒科家族的一員。本發(fā)明的實(shí)施方式包括的病毒衣殼衍生自豇豆花葉病毒(CPMV)或豇豆褪綠斑點(diǎn)病毒(CCMV)。本發(fā)明的實(shí)施方式包括的本發(fā)明利用的衣殼蛋白衍生自CCMV衣殼蛋白。更明確地，所述衣殼蛋白衍生自由SEQIDNo:11(表4)所示的CCMV衣殼氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明利用的衣殼蛋白能是CCMV大衣殼蛋白的整條氨基酸序列，或是它的包含從SEQIDNo:11選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該衣殼蛋白能具有同CCMV大衣殼蛋白氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:11選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方式中，所述衣殼蛋白能被改變來提高所述衣殼融合肽的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)或改善的折疊或再組裝。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明利用的衣殼蛋白衍生自CPMV小衣殼蛋白(SCPMVCapsid)。更具體地，該衣殼蛋白衍生自由SEQIDNo:12(表4)所示的SCPMV衣殼氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明利用的衣殼蛋白能是CPMV小衣殼蛋白的整條氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:12選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、213或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該衣殼蛋白能具有同CPMV小衣殼蛋白氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:12選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、213或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方式中，所述衣殼蛋白能被改變來提高所述衣殼融合肽的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)或改善的折疊或再組裝。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明利用的衣殼蛋白衍生自CPMV大衣殼蛋白(LCPMVCapsid)。更具體地，該衣殼蛋白衍生自SEQIDNo:13(表4)表示的LCPMV衣殼氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明利用的衣殼蛋白能是CPMV大衣殼蛋白的整條氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:13選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、225、240、250、265、275、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、374或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的該衣殼蛋白能具有同CPMV大衣殼蛋白氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:13選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、卯、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、225、240、250、265、275、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、374或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方式中，所述衣殼蛋白能被改變來提高所述衣殼融合肽的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)或改善的折疊或再組裝。表4植物病毒衣殼氨基酸和核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>MEQNLFALSLDDTSSVRGSLLDTKFAQTRVLLSKAMAGGDVLLDEYLYDWNGQDFRATVAFLRTHVITGKIKVTATTNISDNSGCCLML細(xì)SGVRGKYSTDVYTICSQDSMTWNPGCKKNFSFTFNPNPCGDSWSAEMISRSRVRMTVICVSGWTLSPTTDVIAKLDWS翻EKCEPTIYHLADCQ麗LPLNRWMGKLTFPQGVTSEVRRMPLSIGGGAGATQAFLA麗PNSWISMWRYFRGELHFEVTKMSSPYIKATVTFLIAFGNLSDAFGFYESFPHRIVQFAEVEEKCTLVFSQQEFVTAWSTQVNPRTTLEADGCPYLYAimDSTTGTISGDFNLGVKLVGKDFCGIGSNPGIDGSRl丄GAIAQ—LCPMVSEQCapsidIDNo:13"賴激激產(chǎn)f編碼衍生自流感病毒的肽的核酸被融合到編碼植物病毒衣殼蛋白的核酸上來產(chǎn)生能以重組融合肽被表達(dá)的構(gòu)建物。本發(fā)明使用的重組衣殼肽能在利用本領(lǐng)域廣泛已知技術(shù)的生物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)。例如，編碼連接到至少一條抗原流感肽的植物病毒衣殼蛋白的融合肽的核酸構(gòu)建物能被引入宿主細(xì)胞并被進(jìn)行表達(dá)。為了在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，所述核酸序列能包括下述元件諸如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列、翻譯增強(qiáng)序列、啟動(dòng)子、包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、激活子、翻譯起始和終止信號、轉(zhuǎn)錄終止子、順反子調(diào)節(jié)子、多順反子調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件，促進(jìn)表達(dá)的重組衣殼蛋白融合肽鑒定、分離、純化或隔離的諸如核苷酸序列"tags"和"tag"肽編碼序列的標(biāo)記序列，包括His-tag、Flag-tag、T7-tag、S-tag、HSV-tag、B-tag、Strep-tag、聚精氨酸、聚半胱氨酸、聚苯丙氨酸、聚天冬氨酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、硫氧還蛋白、P-半乳糖苷、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶、CTP:CMP-3-脫氧-D-甘露-辛酮糖胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonatecytidyltransferase)、trpE或trpLE、卵白素、抗生蛋白鏈菌素、T7基因10、T4gp55、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白G、GST、DHFR、CBP、MBP、半乳糖結(jié)合域、調(diào)鈣蛋白結(jié)合域、KSI、c-myc、ompT、ompA、pe舊、NusA、泛素、六聚組氨酸、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、GFP、YFP、或這樣的熒光蛋白的同系物、抗體分子、hemosylinA、或已知的對純化有用的已知結(jié)合配偶體的抗原或配基。編碼流感肽的核酸能被插入編碼病毒衣殼蛋白的核酸的預(yù)定位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述流感肽被插入衣殼編碼序列以使在病毒或病毒樣顆粒形成時(shí)被表達(dá)為環(huán)。流感肽可能會(huì)在植物衣殼中超過一個(gè)的插入位點(diǎn)被插入。這樣，當(dāng)所述衣殼融合肽重新組裝來形成病毒或病毒樣顆粒時(shí)，流感肽可能會(huì)插入衣殼的超過一個(gè)的表面環(huán)基序。可選擇地，當(dāng)所述衣殼融合肽重新組裝來形成病毒或病毒樣顆粒時(shí)，流感肽也可能會(huì)在給定環(huán)基序內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)插入。而且，流感肽可能會(huì)在面對外部的環(huán)內(nèi)和/或在面對內(nèi)部的環(huán)內(nèi)，即在所述衣殼分別背離或朝向衣殼中心的環(huán)內(nèi)被插入。在衣殼表面環(huán)內(nèi)的任何氨基酸或肽鍵均能作為所述流感肽的插入位點(diǎn)。典型地，所述插入位點(diǎn)能在大約所述環(huán)的中心，即在大約位于距離所述折疊衣殼肽三級結(jié)構(gòu)的中心最遠(yuǎn)的位置被選擇。當(dāng)所述衣殼融合肽進(jìn)行組裝來形成病毒或病毒樣顆粒時(shí)，所述流感肽編碼序列可能會(huì)在所述流感衣殼編碼序列的同所述被選擇的環(huán)的這個(gè)大約中心相對應(yīng)的位置內(nèi)被插入。這包括閱讀框的保留，該閱讀框負(fù)責(zé)在所述肽插入位點(diǎn)下游被合成的衣殼肽序列的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感肽能在所述衣殼的氨末端被插入。所述流感肽能通過一個(gè)或多個(gè)接頭序列被連接到所述衣殼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感肽能在所述衣殼的羧末端被插入。所述流感肽也能通過一個(gè)或多個(gè)能被化學(xué)或酶法水解裂解的接頭被連接到羧末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感肽序列在氨末端和羧末端，或在一個(gè)末端和在至少一個(gè)諸如在所述衣殼的三維構(gòu)象內(nèi)的表面被表達(dá)的位置的內(nèi)部位置被連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述衣殼融合肽被組裝來形成病毒或病毒樣顆粒時(shí)，至少一種流感抗原肽在至少一個(gè)內(nèi)部環(huán)內(nèi)或在至少一個(gè)外部表面環(huán)內(nèi)被表達(dá)。不止一個(gè)所述病毒衣殼的環(huán)能被修飾。當(dāng)被組裝為病毒或病毒樣顆粒時(shí)，本發(fā)明實(shí)施方案包括的流感抗原肽在至少兩個(gè)表面環(huán)上被暴露。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)流感抗原肽被插入到衣殼蛋白并在病毒衣殼、籠、病毒或病毒樣顆粒的至少兩個(gè)表面環(huán)上被暴露。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少三個(gè)流感抗原肽被插入到所述衣殼蛋白并在病毒或病毒樣顆粒的至少三個(gè)表面環(huán)上被暴露。在表面環(huán)內(nèi)的流感肽能具有相同的氨基酸序列。在個(gè)別的實(shí)施方案中，在所述表面環(huán)內(nèi)的流感肽的氨基酸序列能有差別。編碼所述病毒衣殼蛋白的核酸序列能被修改來改變病毒或病毒樣顆粒的形成(參見例如Bmmfleld，etal.(2004)J.Gen.Virol.85:1049—1053)。例如，三類一般的修改被最典型地產(chǎn)生來修改病毒或病毒樣顆粒的組裝。這些修改被設(shè)計(jì)來改變被組裝的蛋白籠內(nèi)的毗連亞基間的內(nèi)部、外部或交界。為了完成這個(gè)目標(biāo)，誘變引物能被用于(i)通過用酸性谷氨酸替換N末端中的堿性氨基酸殘基(例如K、R)來改變病毒核酸結(jié)合區(qū)域的內(nèi)部表面電荷(Douglasetal.，2002b);(ii)從N末端刪除內(nèi)部氨基酸殘基(例如，在CCMV中，通常刪除殘基4-37);(iii)插入編碼11位氨基酸肽細(xì)胞尋耙序列的cDNA(Grafetal.,1987)到表面暴露環(huán)；和(iv)通過改變金屬結(jié)合位點(diǎn)(例如，在CCMV中，殘基81/148突變)修改病毒亞基間的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感抗原肽能被插入到來源于豇豆褪綠斑點(diǎn)病毒(CCMV)的衣殼中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的流感肽能在SEQIDNo:11中的CCMV衣殼蛋白的第129位氨基酸被插入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感肽序列能在SEQIDNO:11中的CCMV衣殼蛋白的第60、61、62或63位氨基酸被插入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感肽能在SEQIDNo:11中的CCMV衣殼蛋白的第129位和第60-63位氨基酸被插入。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含SEQIDNos:3、22、23和24，或它的衍生物或同系物的組中選擇的M2肽被插入到所述CCMV衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感抗原肽能被插入到來源于豇豆花葉病毒(CPMV)的小衣殼中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的流感肽能在SEQIDNo:12中的CPMV小衣殼蛋白(SCPMVCapsid)的第22和23位氨基酸間被插入。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含SEQIDNOs:3、22、23和24，或它的衍生物或同系物的組中選擇的M2肽能被插入到CPMV小衣殼蛋白中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感抗原肽能被插入到來源于豇豆花葉病毒(CPMV)的大衣殼中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的流感肽能被插入到SEQIDNo:13中的CPMV大衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含SEQIDNOs:3、22、23和24，或它的衍生物或同系物的組中選擇的M2肽能被插入到CPMV大衣殼蛋白中。在一個(gè)實(shí)施方案中，毗連目的流感抗原肽的或連接到病毒衣殼蛋白的標(biāo)記序列也可被包括進(jìn)來。在一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)標(biāo)記序列考慮到了所述重組衣殼融合肽的純化。該標(biāo)記序列可以是諸如六聚組氨酸的親和標(biāo)記。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，該親和標(biāo)記能是谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶分子。該標(biāo)記也能是諸如YFP或GFP或這樣的熒光蛋白的同系物的熒光分子。該標(biāo)記也能是部分抗體分子，或有利于純化的已知抗原或已知結(jié)合配偶體的配基。本發(fā)明仔細(xì)考慮了使用合成或任何類型生物表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)包含所述流感肽的重組衣殼肽。當(dāng)前衣殼蛋白表達(dá)的方法包括昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)系統(tǒng)、諸如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母的酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼衣殼融合肽的核酸構(gòu)建物在從包括整株植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物的植物細(xì)胞或熒光假單胞菌細(xì)胞中選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼衣殼融合肽的核酸構(gòu)建物在整株植物中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼衣殼融合肽的核酸構(gòu)建物在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼衣殼融合肽的核酸構(gòu)建物在熒光假單胞菌中表達(dá)。在上述宿主細(xì)胞中表達(dá)衣殼融合肽的技術(shù)在例如美國專利U.S.Pat.5,874,087,美國專利U.S.Pat.5,958,422，美國專利U.S.Pat.6,110,466，美國專利申請U.S.Application11/001,626和美國專利申請U.S.Application11/069,601的文獻(xiàn)中以及下面的實(shí)施例中進(jìn)行了描述。丄嫁毒或諒毒存微腳姿本發(fā)明的衣殼融合肽能從宿主細(xì)胞純化而來并在體外進(jìn)行組裝來形成病毒樣顆?；蚧\結(jié)構(gòu)，其中的病毒樣顆粒不含有宿主細(xì)胞質(zhì)膜。一旦所述重組衣殼融合肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)，它就可以通過在本領(lǐng)域中所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被分離和純化到實(shí)際純度。所述分離和純化技術(shù)能依賴于被利用來生產(chǎn)所述衣殼融合肽的宿主細(xì)胞。這樣的技術(shù)能包括但不限于，PEG濃縮、硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、鎳親和層析、羥基磷灰石層析、反相層析、凝集素層析、制備電泳、去污劑增溶、用如柱層析的物質(zhì)進(jìn)行的選擇性沉淀、免疫純化方法、分子排阻層析、免疫沉淀方法、離心、超離心、密度梯度離心(例如，蔗糖梯度或氯化銫(CsCl)梯度)、通過分子排阻膜的超濾，和本領(lǐng)域已知的任何其它蛋白分離方法。例如，具有確定分子吸附性質(zhì)的衣殼蛋白融合肽能被可逆地結(jié)合到配基。利用適當(dāng)?shù)呐浠職さ鞍兹诤想哪鼙贿x擇性吸附到純化柱，然后以相對純的形式從該柱子上被洗脫下來。通過酶活性，該衣殼蛋白然后被移除。另外，所述衣殼蛋白融合肽能使用免疫親和柱或Ni-NTA柱被純化。綜合的技術(shù)在下述文獻(xiàn)中被進(jìn)一步描述，例如，R.Scopes,PeptidePurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:N.Y.(1982);Deutscher,GuidetoPeptidePurification,AcademicPress(1990);U.S.Pat.No.4，511，503;S.Roe,PeptidePurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag,etal"PeptideMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996);AKPatraetal,，PeptideExprPurif，18(2):p/182-92(2000);andR.Mukhija,etal.，Gene165(2):p.303-6(1995)。也參見例如，Aipibel，etal.(1987andperiodicsupplements);Deutscher(1990)"GuidetoPeptidePurification,"MethodsinEnzymologyvol.182，andothervolumesinthis30series;Coligan,etal.(19%andperiodicSupplements)CurrentProtocolsinPeptideScienceWiley/Greene,NY;和肽純化產(chǎn)品使用的廠商文南犬，例如，Pharmacia,Piscataway,NJ.或Bio-Rad,Richmond,Calif。重組技術(shù)的組合允許融合到適當(dāng)?shù)钠?，例如，融合到FLAG序列或能被經(jīng)由可被蛋白酶移除的序列融合的同等物。也參見例如，Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"PurificationofRecombinantPeptideswithMetalChelateAbsorbent"inSetlow(ed.)GeneticEngineering,PrincipleandMethods12:87-98,PlenumPress,NY;andCrowe,etal.(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&PeptidePurificationSystemQIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif。在其它實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞尤其是細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的衣殼融合肽可能會(huì)形成不可溶的聚集物("包涵體")。幾種方法適用于純化從包涵體而來的肽。例如，通過裂解宿主細(xì)胞，例如通過在含50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgC12、1mMDTT、0.1mMATP和1mMPMSF的緩沖液中孵育，包涵體純化典型地涉及到包涵體的抽提、分離和/或純化。通過使用2-3次法蘭西壓榨器細(xì)胞壓榨，該細(xì)胞懸液被典型地裂解。通過在冰上使用Polytron(Brink腿Instruments)或超聲波破碎，該細(xì)胞懸液也能被均質(zhì)化。另外的裂解細(xì)菌的方法對本領(lǐng)域的那些熟練技術(shù)人員是明顯的(參見例如，前面的Sambrooketal.;前面的A畫beletal.)。假如必需，包涵體能被溶解，并且典型裂解的細(xì)胞懸液能被離心來移除不想要的不溶物。形成包涵體的衣殼融合肽可能會(huì)通過使用合適緩沖液的稀釋或透析被復(fù)性。合適的溶劑包括但不限于尿素(從大約4M到大約8M)、甲酰胺(至少大約80%，體積比)，和鹽酸胍(從大約4M到大約8M)。盡管鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，但這種變性是可逆的并且復(fù)性可能會(huì)在移除(例如通過透析)或稀釋該變性劑后發(fā)生。其它合適的緩沖液對本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員是己知的?？蛇x擇地，從宿主周質(zhì)中純化重組衣殼融合肽、病毒樣顆?；蚧\結(jié)構(gòu)是可能的。在宿主細(xì)胞裂解后，當(dāng)重組肽被輸入到宿主細(xì)胞周質(zhì)時(shí)，細(xì)菌的周質(zhì)部分還能通過除了本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的其它方法外的冷滲透休克進(jìn)行分離。例如，為了從該周質(zhì)中分離重組肽，細(xì)菌細(xì)胞能被離心來形成沉淀。該沉淀能被重懸在含20%蔗糖的緩沖液中。為了裂解這些細(xì)胞，這些細(xì)菌能被離心，產(chǎn)生的沉淀能被重懸在冰冷的含5mMMgS04的緩沖液中并在冰浴槽中放置大約IO分鐘。該細(xì)胞懸液能被離心，產(chǎn)生的上清被輕輕倒出并被保存。通過本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)，存于上清中的重組肽能從宿主肽中分禺出。最初的鹽分級分離能從目的重組衣殼蛋白融合肽中分離出許多不想要的宿主細(xì)胞肽(或衍生自細(xì)胞培養(yǎng)基的肽)。一個(gè)這樣的例子能是硫酸銨。硫酸銨通過有效降低肽混合物中的水的量來沉淀肽。肽然后基于它們的溶解度進(jìn)行沉淀。越疏水的肽越可能在更低的硫酸銨濃度下沉淀出來。典型的流程包括加入飽和硫酸銨到肽溶液以便使產(chǎn)生的硫酸銨濃度介于20-30%。這個(gè)濃度將使絕大多數(shù)疏水肽沉淀。產(chǎn)生的沉淀被丟棄(除非目的肽是疏水性的)，然后加入硫酸銨到上清中使?jié)舛葹橐阎某恋砟康囊職さ鞍兹诤想牡臐舛?。產(chǎn)生的沉淀然后在緩沖液中溶解，假如必需，通過透析或透濾法移除多余的鹽分。其它的諸如冷乙醇沉淀等依賴肽的溶解度的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的并能被用于分級復(fù)雜的衣殼蛋白融合肽混合物。通過使用不同孔徑大小的膜(例如，Amicon或Millipore膜)超濾，重組衣殼蛋白融合肽的分子量能用于將它從具有更大或更小分子量的肽中分離出。作為第一步，所述衣殼蛋白融合肽混合物能通過具有比目的衣殼蛋白融合肽的分子量低的分子量截停的孔尺寸的膜進(jìn)行超濾。超濾的保留物然后通過具有比目的衣殼蛋白融合肽的分子量高的分子量截停的孔尺寸的膜進(jìn)行超濾。重組衣殼蛋白融合肽將通過膜進(jìn)入濾液中。濾液然后能按下面描述的方法進(jìn)行層析。重組衣殼融合肽也能基于它的大小、表面凈電荷、疏水性和對配基的親和性從其它肽中分離出來。此外，已建立的抗該衣殼蛋白的抗體能被結(jié)合到柱基質(zhì)并且該衣殼蛋白能被免疫純化。所有這些方法在本領(lǐng)域中均是廣為人知的。對于一個(gè)技術(shù)人員而言，層析技術(shù)能在任何規(guī)模和使用來源于許多不同廠商(例如PharmaciaBiotech)的設(shè)備時(shí)實(shí)施是明顯的。病毒樣顆粒組裝需要正確折疊的衣殼蛋白。然而，另外的VLP形成和穩(wěn)定所需的顯著因子可能是存在的，這些因子尤其包括pH值、離子強(qiáng)度、二硫鍵、二價(jià)陽離子鍵。參見例如，Bradyetal,(1977)"Dissociationofpolyomavirusbythechelationofcalciumionsfoundassociatedwithpurifiedvirions,"J.Virol.23(3):717-724;Gajardoetal,(1997)"TwoprolineresiduesareessentialinthecalciumbindingactivityofrotavirusVP7outercapsidprotein,"J.Virol"71:2211-2216;Walteretal,(1975)"Intermoleculardisulfidebonds:animportantstructuralfeatureofthepolyomavimscapsid,"ColdSpringHar.Symp.Quant.Biol"39:255-257(1975);Christansenetal,(1977)"Characterizationofcomponentsreleasedbyalkalidisruptionofsimianvirus40，"JVirol"21:1079-1084;Salunkeetal,(1986)"Self-assemblyofpurifiedpolyomaviruscapsidproteinVP1,"Cell46:895-904;Salunkeetal,(1989)"PolymorphismintheassemblyofpolyomaviruscapsidproteinVP,"Biophys.J.,56:887-900;Garceaetal,(1983)"Hostrangetransforminggeneofpolyomavirusplaysaroleinvirusassembly,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:3613-3617;Xietal,(1991)"Baculovirusexpressionofthehumanpapillomavirustype16capsidproteins:detectionofL1-L2proteincomplexes,"J.Gen.Virol.,72:2981-2988。可能會(huì)用于重新組裝的技術(shù)在本領(lǐng)域中是廣為人知的，并且包括但不限于，在實(shí)施例6中公開的技術(shù)。此外，本發(fā)明的衣殼融合肽能在宿主細(xì)胞中表達(dá)并在體內(nèi)組裝為病毒、病毒樣顆粒或籠結(jié)構(gòu)，其中的病毒或病毒樣顆粒不含有宿主細(xì)胞質(zhì)膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒、病毒樣顆粒(VLP)或籠結(jié)構(gòu)在衣殼蛋白表達(dá)時(shí)或表達(dá)后形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒、病毒樣顆?；蚧\在病毒或病毒樣顆粒的表面暴露該流感肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒、病毒樣顆粒或籠結(jié)構(gòu)以重組衣殼融合肽的多體組裝形式組裝，該多體包括從三個(gè)到大約200個(gè)衣殼融合肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒、病毒樣顆粒或籠結(jié)構(gòu)包括至少30個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少90個(gè)或至少120個(gè)衣殼融合肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每一個(gè)病毒、病毒樣顆?；蚧\結(jié)構(gòu)包括至少150個(gè)、至少160個(gè)、至少170個(gè)、至少180個(gè)衣殼融合肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒以二十面體結(jié)構(gòu)被組裝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒樣顆粒或病毒以同衣殼序列衍生的天然病毒相同的幾何形狀進(jìn)行組裝。然而，在個(gè)別的實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒不具有同天然病毒相同的幾何形狀。例如，在其它實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)在由多個(gè)衣殼融合肽形成的但不形成天然型病毒顆粒的顆粒中組裝。例如，具有少至3個(gè)病毒衣殼的籠結(jié)構(gòu)能被形成。在個(gè)別實(shí)施方案中，具有大約6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57或60個(gè)衣殼的籠結(jié)構(gòu)能被形成。在體內(nèi)組裝的植物病毒或植物病毒顆粒的純化先前已經(jīng)被描述。例如，參見Dijkstra，J.andDeJager,C.P"1998;Matthews,R.E.R,1991，PlantVirology,ThirdEdition,AcademicPress,Inc.,HarcourtBraceJovanovich,Publishers,和下面的實(shí)施例。大多數(shù)病毒能通過下述的兩個(gè)或多個(gè)操作的組合被分離高速沉降、密度梯度離心、使用聚乙二醇的沉淀、鹽沉淀、凝膠過濾、層析和透析。一旦含有病毒或病毒樣顆粒的細(xì)胞破碎并且細(xì)胞內(nèi)含物被釋放和混合，病毒或病毒樣顆粒發(fā)現(xiàn)它們自己處于不正常的環(huán)境中。因此，使用設(shè)計(jì)來保護(hù)病毒或病毒樣顆粒在分離的各個(gè)階段保持完整和非聚集狀態(tài)的人造培養(yǎng)基經(jīng)常是必要的。有利于純化病毒或病毒樣顆粒制備物穩(wěn)定性的條件可能是同在粗提取物或部分提純制備物所需的條件不同的。此外，不同因素可能會(huì)在影響病毒穩(wěn)定性的程度上強(qiáng)烈地相互作用。在研制合適的培養(yǎng)基過程中被認(rèn)為是主要因素的因素包括pH值和緩沖體系、金屬離子和離子強(qiáng)度、還原劑和抗紫錐菊多酚的保護(hù)物質(zhì)、消除植物蛋白和核糖體的添加劑、酶和去污劑。許多病毒在一個(gè)相當(dāng)窄的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，并且所述抽提物必須保持在這個(gè)范圍內(nèi)。因此，緩沖液的選擇可能是重要的。磷酸鹽緩沖液經(jīng)常被使用，但這些緩沖液可能對某些病毒或病毒樣顆粒具有有害作用。為了保持結(jié)構(gòu)的完整性，某些病毒或病毒樣顆粒需要二價(jià)金屬離子的存在。離子強(qiáng)度也可能是重要的。還原劑經(jīng)常被加入到抽提介質(zhì)中。這些物質(zhì)協(xié)助容易通過氧化丟失感染性的病毒或病毒樣顆粒的保存。它們也可能會(huì)降低宿主組分對病毒的吸附。酚類物質(zhì)可能會(huì)在病毒或病毒樣顆粒的分離和保存中導(dǎo)致嚴(yán)重的困難。幾種方法已經(jīng)或多或少成功地用于最小化酚在分離過程中對植物病毒或病毒樣顆粒的影響。pH7.4的緩沖液中的0.01M的EDTA鈉鹽導(dǎo)致了大多數(shù)核糖體的破裂，防止了它們與病毒顆粒的共沉淀。這種物質(zhì)能用于穩(wěn)定性不需要二價(jià)金屬離子的病毒。核糖核酸酶、核糖體、19S蛋白和來源于碎片化葉綠體的綠色微粒物質(zhì)能在某種鎂濃度下被皂粘土容易地吸附。木炭可能會(huì)用于吸附和消除宿主物質(zhì)，尤其是色素。為了各種目的，酶類能被加入最初的抽提物中。例如，果膠酶和纖維素酶協(xié)助病毒或病毒樣顆粒的釋放，否則這些病毒或病毒樣顆粒將保留在纖維部分中。這些酶也消化某些物質(zhì)，否則這些物質(zhì)將同病毒或病毒樣顆粒共沉淀。TritonX-100或Tween80有時(shí)能用在最初抽提介質(zhì)中來協(xié)助病毒或病毒樣顆粒從不溶的細(xì)胞成分中釋放。去污劑也可能協(xié)助植物抽提物的最初凈化。非離子去污劑裂解可能會(huì)污染病毒或病毒樣顆粒的細(xì)胞膜。許多種方法能用來破碎或均質(zhì)化含有病毒或病毒樣顆粒的植物組織。這些方法包括(0研杵和研缽，(ii)各種分批型食品攪拌器和榨汁機(jī)，和(ii0軋制機(jī)、膠體磨和能處理數(shù)千克組織的商業(yè)絞肉機(jī)。假如使用了抽提介質(zhì)，確保破碎細(xì)胞同介質(zhì)直接接觸經(jīng)常是必需的。均質(zhì)化的組織通常通過粗布過濾來分離含有病毒的植物體液和破碎的植物組織。在粗提物中，病毒或病毒樣顆粒同各種細(xì)胞成分混合在一起，這些細(xì)胞成分在同病毒或病毒樣顆粒相同寬的尺寸范圍內(nèi)并可能在某些方面具有相似的性質(zhì)。這些顆粒包括核糖體、來源于葉綠體并具有聚集傾向的19S蛋白、植物鐵蛋白、膜碎片和破裂葉綠體的碎片。也存在的是未破碎的細(xì)胞、細(xì)胞的所有更小的可溶蛋白和低分子量溶質(zhì)。病毒分離的第一步通常被設(shè)計(jì)來盡可能多地去除大分子宿主物質(zhì)而留下病毒或病毒樣顆粒在溶液中。抽提介質(zhì)可能被設(shè)計(jì)來沉淀核糖體和其他的高分子量宿主物質(zhì)或來分解它們。抽提物可能被進(jìn)行如加熱、例如氯仿或n-丁醇-氯仿的有機(jī)溶劑抽提等處理。處理過的抽提物然后在相當(dāng)?shù)偷乃俣认逻M(jìn)行離心。該處理沉淀了細(xì)胞碎片和凝固的宿主物質(zhì)。足夠時(shí)間的高速離心將沉淀病毒或病毒樣顆粒。這是一個(gè)非常有用的歩驟，因?yàn)樗?wù)了濃縮病毒顆粒和移除低分子量物質(zhì)這兩個(gè)目的。某些植物病毒優(yōu)先在單相聚乙二醇(PEG)系統(tǒng)中沉淀，盡管某些宿主DNA也可能會(huì)被沉淀。PEG沉淀是用在病毒或病毒樣顆粒分離中的最普通方法之一。沉淀的確切條件依賴于pH值、離子強(qiáng)度和大分子的濃度。它在分離任何特定病毒中的應(yīng)用是經(jīng)驗(yàn)性的。PEG沉淀的主要優(yōu)勢是不需要昂貴的超濾，盡管差異離心經(jīng)常用作純化方法的第二步。許多病毒可能會(huì)形成非常難于重懸的沉淀。密度梯度離心提供了濃縮這樣的病毒或病毒樣顆粒而不形成沉淀的可能并被用于許多病毒的分離方法。離心管被部分地充入具有從離心管底部到頂部的漸減密度的溶液。對于植物病毒，蔗糖被普遍用來形成該梯度，并且病毒溶液被鋪在密度梯度的頂部。伴隨用銫鹽形成的梯度，所述病毒或病毒樣顆粒可能在沉降的開始被分布到整個(gè)溶液中或它們可能被鋪在密度梯度的頂部。密度梯度可能會(huì)以三種途徑被使用(i)等密梯度離心，(ii)速率區(qū)帶沉淀，和(iii)平衡區(qū)帶狀沉淀。離心后，由于病毒帶的光散射性質(zhì)，它們可能會(huì)被直視到。鹽沉淀也被普遍使用。處于高達(dá)大約三分之一飽和度濃度的硫酸銨被最普遍地使用，盡管許多其他鹽將沉淀病毒或病毒樣顆粒。在放置幾個(gè)小時(shí)或幾天后，病毒或病毒樣顆粒在低速離心下被離心下來并重溶在小體積的合適介質(zhì)中。許多蛋白在或靠近它們的等電點(diǎn)處具有低溶解度。等電點(diǎn)沉淀能用于在有關(guān)條件下保持穩(wěn)定的病毒或病毒樣顆粒。通過離心或過濾收集沉淀并重溶在合適介質(zhì)中。通過纖維素薄膜的透析能用來從起始抽提物中移除低分子量物質(zhì)和改變介質(zhì)。更通常地，它被用來在鹽沉淀或結(jié)晶化后，或在鹽或蔗糖溶液密度梯度離心后去除鹽分。通過一步純化和濃縮取得的病毒或病毒樣顆粒制備物將仍然包含某些小分子量宿主物質(zhì)。更多的這些物質(zhì)能通過進(jìn)一步的純化步驟被去除。該方法依賴于病毒或病毒樣顆粒的穩(wěn)定性和制備的規(guī)模。有時(shí)候，高度純化的制備物能通過反復(fù)應(yīng)用相同的方法獲得。例如，制備可能會(huì)經(jīng)歷重復(fù)的PEG沉淀，或可能會(huì)給與多個(gè)循環(huán)的高速和低速沉淀。后面的方法導(dǎo)致宿主大分子的優(yōu)先去除，因?yàn)楫?dāng)來源于高速離心的沉淀被重懸時(shí)這些大分子保持不溶。通常來講，在一個(gè)分離過程中，應(yīng)用至少兩個(gè)依賴于病毒或病毒樣顆粒的不同性質(zhì)的方法是有用的。在去除宿主成分時(shí)，這可能比重復(fù)應(yīng)用同一種方法更有效。進(jìn)一步純化的其中一種最有用的方法，特別是對更不穩(wěn)定的病毒或病毒樣顆粒而言，是密度梯度離心。蔗糖是最普遍使用的制備梯度的物質(zhì)。蔗糖密度梯度離心是經(jīng)常選擇的進(jìn)一歩純化的方法。諸如氯化銫的鹽的強(qiáng)溶液也是充分穩(wěn)定的病毒的有效梯度物質(zhì)。在兩個(gè)不同梯度中的連續(xù)的分級有時(shí)候可能會(huì)給出有用的結(jié)果。瓊脂凝膠過濾或葡聚糖凝膠過濾可能會(huì)為某些病毒或病毒樣顆粒的進(jìn)一步純化提供有用的步驟，這些病毒或病毒粒對高速離心中涉及到的沉淀形成不穩(wěn)定。單克隆抗病毒抗體能被結(jié)合到諸如瓊脂糖的支持基質(zhì)上來形成能特異性結(jié)合通過該柱的溶液中的病毒的柱子。通過降低pH值病毒能被洗脫。層析方法能用來為部分純化的制備物提供有效的純化步驟。例如，在磷酸鹽緩沖液中的磷酸鈣凝膠柱、纖維素柱或快速蛋白液相層析能用來純化各種病毒。在病毒分離的各個(gè)階段，濃縮病毒并去除鹽分或蔗糖是必需的。高速離心被普遍用來濃縮病毒和降低低分子量物質(zhì)的數(shù)量。透析用于去除或調(diào)換鹽類。II、抗原流感全蛋白或蛋白片段本發(fā)明利用同上面公開的包含流感肽的衣殼融合肽組合的至少一種衍生自包括人和/或禽流感病毒的流感病毒的分離抗原蛋白或蛋白片段、它的衍生物或同系物。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離抗原蛋白或蛋白片段、它的衍生物或同系物衍生自新出現(xiàn)的流感病毒株。本發(fā)明利用的流感病毒蛋白或蛋白片段能是衍生自已鑒定的流感病毒株的M1、M2、HA、NA、NP、PB1、PB2、PA或NP2蛋白或它的衍生物或同系物。大量的流感病毒株和對應(yīng)的蛋白序列已經(jīng)被鑒定并且公眾能通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的流感病毒資源站點(diǎn)獲得這些序列，該站點(diǎn)網(wǎng)址為http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，衍生自流感病毒的蛋白或蛋白片段能從包含HA和NA蛋白或蛋白片段的組中選擇。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的NA蛋白或蛋白片段衍生自從包含亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9的組中選擇的流感NA病毒的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流感病毒肽是衍生自人或禽流感NA蛋白的蛋白或蛋白片段。在其它實(shí)施方案中，所述流感病毒抗原蛋白或蛋白片段衍生自流感HA蛋白。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的HA蛋白或蛋白片段衍生自從包含亞型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14和H15的組中選擇的流感HA病毒的組。本發(fā)明實(shí)施方案包括的HA肽衍生自人和/或禽流感HA蛋白的組。在另外的實(shí)施方案中，所述HA肽能衍生自禽流感HA蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，該HA蛋白從亞型H5、H7禾BH9中選擇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分離抗原蛋白或蛋白片段從新出現(xiàn)的流感病毒株中選擇。世界衛(wèi)生組織每年兩次檢査世界流感流行病學(xué)數(shù)據(jù)并周期性地更新新出現(xiàn)的流感病毒株的鑒定。在推導(dǎo)用于本發(fā)明的分離抗原蛋白或蛋白片段中有用的遺傳信息對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是可得的。例如，洛斯阿拉莫斯國家實(shí)驗(yàn)室維護(hù)了含有新出現(xiàn)流感病毒株遺傳信息的流感序列數(shù)據(jù)庫，該網(wǎng)址為http:〃www-flu.lanl.gov/。本發(fā)明的實(shí)施方案也包括的同病毒樣顆粒組合的HA蛋白或蛋白片段衍生自SEQIDNO:15(表5)中的A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的568個(gè)氨基酸殘基的序列，它的被SEQIDNO:16(表5)核苷酸序列編碼的衍生物或同系物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的流感病毒蛋白能是A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的HA蛋白或蛋白片段的整條氨基酸序列，或它的包含從SEQIDNo:15選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565、568或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的流感病毒蛋白能具有同A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的HA蛋白或蛋白片段氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:15選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565、568或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型，或它的包含從SEQIDNo:15選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改變來提高所述蛋白的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)?？蛇x擇地，同病毒樣顆粒組合的HA蛋白或蛋白片段衍生自SEQIDNo:17(表5)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的流感病毒蛋白能是SEQIDNo:17中的HA蛋白或蛋白片段的整條氨基酸序列，或它的包含從SEQIDNo:17選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、530、537或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的流感病毒蛋白能具有同SEQIDNo:17的氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:17選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、530、537或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改變來提高所述蛋白的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，所述HA蛋白片段將是被SEQIDNo:19(表5)核苷酸序列編碼的A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的36kDa大小的HA1片段(SEQIDNo:18，表5)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的流感病毒蛋白能是SEQIDNo:18中的HA蛋白或蛋白片段的整條氨基酸序列，或它的包含從SEQIDNo:18選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、350、352或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的流感病毒蛋白能具有同SEQIDNo:18的氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:18選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、350、352或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改變來提高所述蛋白的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述HA蛋白片段將是被SEQIDNo:21(表5)核苷酸序列編碼的A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株的26kDa大小的HA2片段(SEQIDNo:20，表5)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的流感病毒蛋白能是SEQIDNo:20中的HA蛋白或蛋白片段的整條氨基酸序列，或它的包含從SEQIDNo:20選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。選擇的流感病毒蛋白能具有同SEQIDNo:20的氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:20選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改變來提高所述蛋白的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，同病毒樣顆粒組合的HA蛋白或蛋白片段衍生自SEQIDNO:25(表5)中的A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的565個(gè)氨基酸殘基的序列，它的被SEQIDNO:26-28(表5)核苷酸序列編碼的衍生物或同系物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的流感病毒蛋白能是A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的HA蛋白或蛋白片段的整條氨基酸序列，或它的包含從SEQIDNo:25選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明利用的流感病毒蛋白能是缺少天然N末端信號和C末端跨膜區(qū)域和胞質(zhì)尾的SEQIDNo:29(表5)中的A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的HA蛋白片段。選擇的流感病毒蛋白能具有同A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)病毒株的HA蛋白或蛋白片段氨基酸序列或它的包含從SEQIDNo:25和SEQIDNo:29選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、565或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型，或它的包含從SEQIDNo:25和SEQIDNo:29選擇的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或更多個(gè)氨基酸殘基的亞型至少75、80、85、90、95、98或99%的同源性。在其它實(shí)施方案中，所述流感蛋白或核酸序列能被改變來提高所述蛋白的特征，諸如但不限于，在宿主中提高的表達(dá)、增強(qiáng)的免疫原性、提高的共價(jià)結(jié)合性質(zhì)。表5:HA蛋白和核酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>在一個(gè)實(shí)施方案中，含有流感肽的病毒樣顆粒同至少一個(gè)衍生自包括人或禽流感病毒的流感病毒的NA蛋白或蛋白片段和至少一個(gè)衍生自包括人或禽流感病毒的流感病毒的HA蛋白或蛋白片段進(jìn)行組合。在另外的實(shí)施方案中，含有流感肽的病毒樣顆粒同至少一個(gè)衍生自流感病毒的NA蛋白或蛋白片段和至少一個(gè)衍生自流感病毒的HA蛋白或蛋白片段，和任何包含人和/或禽流感蛋白或蛋白片段的從包含Ml、M2、NP、PB1、PB2、PA禾BNP2以及它的衍生物或同系物的組中選擇的流感病毒蛋白或蛋白片段的組合進(jìn)行組合。fl、條節(jié)或筋/f激姓產(chǎn)本發(fā)明仔細(xì)考慮了使用合成或任何類型生物表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)流感抗原蛋白或蛋白片段。當(dāng)前蛋白表達(dá)的方法包括昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)系統(tǒng)、諸如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母的酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白或蛋白片段在從包括整株植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物的植物細(xì)胞或熒光假單胞菌細(xì)胞中選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包含的蛋白或蛋白片段在完整植物宿主中表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，該蛋白或蛋白片段在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)。在上述宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白或蛋白片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中是廣為人知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物病毒載體被用來在整株植物或植物細(xì)胞中表達(dá)流感蛋白或蛋白片段。本發(fā)明實(shí)施方案包含的PVX載體被用來在煙草植物中表達(dá)HA蛋白或蛋白片段。在另外的實(shí)施方案中，PVX載體被用來在煙草NT1植物細(xì)胞中表達(dá)HA蛋白或蛋白片段。利用病毒載體的技術(shù)在例如美國專利U.S.Pat.4,885,248、U.S.Pat,5,173,410、U.S.Pat.5,500,360、U.S.Pat.5,602,242、U.S.Pat.5,804,439、U.S.Pat.5,627,060、U.S.Pat.5,466,788、U.S.Pat.5,670,353、U.S.Pat.5,633,447和U.SPat.5,846,795以及下面的實(shí)施例14和15中進(jìn)行了描述。在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物被用來表達(dá)HA蛋白或蛋白片段。用來在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中表達(dá)蛋白或蛋白片段的方法在本領(lǐng)域中是廣為人知的。在其它實(shí)施方案和實(shí)施例18和實(shí)施例19中，HA蛋白或蛋白片段在熒光假單胞菌的胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)。能用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的流感蛋白或蛋白片段的分離和純化的方法同那些先前在衣殼融合肽分離和純化的例子中公開的方法相似或相同。III、含有流感肽的VLPs和流感抗原蛋白的組合本發(fā)明提供了用作抗流感病毒疫苗的組合物，該組合物包含i)至少一條衍生自流感病毒并融合到衍生自植物病毒的衣殼蛋白且形成重組衣殼融合肽的肽，其中，重組衣殼融合肽能組裝來形成病毒或病毒樣顆粒，和ii)至少一條衍生自流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原蛋白或蛋白片段不是被化學(xué)地附加或連接到病毒樣顆粒。在其它實(shí)施方案中，所述抗原流感蛋白或蛋白片段被化學(xué)連接到病毒或病毒樣顆粒上。參見例如，圖1和圖2。通過使用任何本領(lǐng)域的結(jié)合方法，本發(fā)明的抗原流感蛋白或蛋白片段和病毒樣顆粒能被結(jié)合。參見例如GillitzerE,WillitsD,YoungM，DouglasT.(2002)"Chemicalmodificationofaviralcageformultivalentpresentation,"ChemCommun(Camb)20:2390-1;WangQ,KaltgradE,LinT,JohnsonJE，F(xiàn)innMG(2002)"Naturalsupramolecularbuildingblocks.Wild-typecowpeamosaicvirus,"ChemBiol.9(7》805-l1;WangQ,LinT3TangL，JohnsonJE，F(xiàn)innMG.(2002)"Icosahedralvimsparticlesasaddressablenanoscalebuildingblocks,"AngewChemIntEdEngl.41(3):459-62;Rajaetal.(2003)"Hybridvirus-polymermaterials.1.SynthesisandpropertiesofPeg-decoratedcowpeamosaicvirus,"Biomacromolecules4:472-476;WangQ,LinT，JohnsonJE,FinnMG.(2002)"Naturalsupramolecularbuildingblocks.Cysteine-addedmutantsofcowpeamosaicvims，"ChemBiol.9(7):813-9。其它用于結(jié)合的方法可能會(huì)包括，例如，通過使用磺基琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽酯(sSMCC)(sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate)，N-[e-馬來酉先亞胺己酰氧基]-磺基琥珀酰亞胺酯(sEMCS)(N-[s-maleimidocaproyloxy]-sulfosuccinimdeester)，N-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)(N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester)，戊二醛，1-乙基-3-(3二甲胺基丙胺)碳二亞胺(EDCI)(l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide)，雙-重氣耳關(guān)苯胺(BDB)(Bis-diazobenzidine)或N-乙酰高半胱氨酸硫內(nèi)酯(NAHT)(N-acetylhomocysteinethiolactone)。在載體馬來酰亞胺激活方法中，通過使用磺基琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸鹽酯(sSMCC)或N-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)可獲得結(jié)合。使用sSMCC的方法被廣泛使用并是高度特異性的(參見例如Meyeretal.2002,J.ofVirol.76，2150-2158)。sSMCC交聯(lián)半胱氨酸殘基的SH-基到病毒樣蛋白上的賴氨酸殘基的氨基。在使用sSMCC的結(jié)合反應(yīng)中，通過結(jié)合sSMCC試劑到病毒或病毒樣顆粒的胺(例如賴氨酸)殘基，病毒樣顆粒被首先活化。在將活化的病毒或病毒樣顆粒從多余的試劑和副產(chǎn)物中分離后，含半胱氨酸的肽被加入并且通過加入SH-基到活化的病毒或病毒樣顆粒的馬來酰亞胺官能團(tuán)上使聯(lián)結(jié)發(fā)生。使用MBS的方法通過相似的機(jī)理結(jié)合肽和病毒或病毒樣顆粒。使用sSMCC的結(jié)合反應(yīng)能對SH-基高度特異。'這樣，在抗原流感蛋白或蛋白片段中的半胱氨酸殘基對溫和結(jié)合是基本的。假如抗原蛋白或蛋白片段不具有半胱氨酸殘基，那么半胱氨酸殘基能被優(yōu)選地在N-末端或C-末端加入到肽上。假如蛋白或蛋白片段中的所希望的表型含有半胱氨酸殘基，結(jié)合應(yīng)該用不使用sSMCC活化的病毒或病毒樣顆粒的方法獲得。假如蛋白或蛋白片段含有多于一個(gè)的半胱氨酸殘基，蛋白或蛋白片段不應(yīng)通過使用sSMCC來結(jié)合到病毒或病毒樣顆粒上，除非多余的半胱氨酸能被取代或修飾。聯(lián)結(jié)不應(yīng)干擾蛋白或蛋白片段中的所希望的表型。半胱氨酸被用具有至少一個(gè)氨基酸的距離作為間隔物來優(yōu)選地同所希望的表型序列隔離。本發(fā)明中另一個(gè)有用的結(jié)合通過使用N-乙酰高半胱氨酸硫內(nèi)酯(NAHT)來獲得。例如，硫代內(nèi)酯能用來引入硫醇官能團(tuán)到病毒或病毒樣顆粒上來允許同馬來酰亞胺化或溴-乙酰化的肽進(jìn)行結(jié)合。(Tolmanetal.Int.J.PeptideProteinRes.41,1993，455-466;Conleyetal.Vaccine]994，12,445-451)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，偶聯(lián)蛋白或蛋白片段到病毒或病毒樣顆粒的結(jié)合反應(yīng)涉及引入和/或使用反應(yīng)物上的內(nèi)在親核基及引入和/或使用在其它反應(yīng)物中的內(nèi)在親電基。一個(gè)活化方案將用來引入親核硫醇基到病毒或病毒樣顆粒并加入親電基(優(yōu)選地是鹵化垸或馬來酰亞胺)到流感蛋白或蛋白片段。產(chǎn)生的結(jié)合物將具有聯(lián)結(jié)蛋白或蛋白片段和病毒或病毒顆粒的硫醇醚鍵。流感蛋白或蛋白片段的親電基(馬來酰亞胺或鹵化烷)和病毒或病毒樣顆粒的內(nèi)在親核基(優(yōu)選地，伯胺和硫醇)間的直接反應(yīng)導(dǎo)致了仲胺聯(lián)結(jié)或硫醇醚鍵。選擇性的設(shè)計(jì)涉及加入馬來酰亞胺基或鹵化烷到病毒或病毒樣顆粒及引入末端半胱氨酸到流感蛋白或蛋白片段和/或再次使用導(dǎo)致硫醇醚鍵的內(nèi)在流感蛋白硫醇。含有硫的氨基酸含有反應(yīng)性的硫基。含有硫的氨基酸的例子包括半胱氨酸和諸如高半胱氨酸的非蛋白氨基酸。此外，在激活和同病毒或病毒樣顆粒反應(yīng)前，反應(yīng)性硫可能會(huì)以二硫化物形式存在。例如，存在于流感蛋白或蛋白片段中的半胱氨酸能用在同病毒或病毒樣顆粒的偶聯(lián)反應(yīng)中，該病毒或病毒樣顆粒被諸如馬來酰亞胺或鹵化烷的親電基激活。通過使用含有反應(yīng)性馬來酰亞胺和活化酯的異雙功能交聯(lián)劑引入馬來酰亞胺基是普遍的。結(jié)合流感蛋白到病毒樣顆粒的共價(jià)連接子在生理?xiàng)l件下可能是穩(wěn)定的。這樣的連接子的例子有非特異的交聯(lián)試劑、單殖間隔物(monogeneticspacers)禾口雙殖間隔物(bigenericspacers)。非特異交聯(lián)試劑和它們的使用在本領(lǐng)域中是廣為人知的。這樣的試劑及它們的使用的例子包括同戊二醛的反應(yīng)；同N乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺的反應(yīng)，同或不同琥珀?；牟《净虿《緲宇w粒的混合物；糖基化取代物的高碘酸氧化，隨后的在存在硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉時(shí)同病毒或病毒樣顆粒的游離氨基的偶聯(lián)反應(yīng)；非?；┒私z氨酸和蘇氨酸殘基的高碘酸氧化能產(chǎn)生末端醛，該醛然后能同胺或肼反應(yīng)，產(chǎn)生能用氰基硼氫化鈉還原到仲胺的希夫堿或腙；芳香氨基的重氮化及隨后的蛋白的酪氨酸殘基上的偶聯(lián)反應(yīng)；同異氰酸鹽的反應(yīng)；或混合酸酐的反應(yīng)。通常參見，Briand,etal.，1985J.Imm.Meth.78:59。單殖間隔物和它們的使用在本領(lǐng)域中是廣為人知的。單殖間隔物是雙功能的并且在結(jié)合發(fā)生前需要僅一個(gè)反應(yīng)對的配偶體的功能化。雙殖間隔物和它們的使用在本領(lǐng)域中是廣為人知的。雙殖間隔物在反應(yīng)對的每一個(gè)配偶體被功能化后形成。當(dāng)每一個(gè)功能化的配偶體同它的相應(yīng)配偶體反應(yīng)來形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵時(shí)結(jié)合發(fā)生。(參見例如，Marburg,etal.,1986J.Am.Chem.Sot.108:5282-5287,andMarburg,etal.,U.S.PatentNo.4，695，624)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能獲得結(jié)合物中流感蛋白同病毒或病毒樣顆粒的各種摩爾比率。這個(gè)在病毒或病毒樣顆粒上的"肽偶聯(lián)載荷"能通過以試驗(yàn)或錯(cuò)誤方式改變結(jié)合方法的方面來獲得具有所希望的性質(zhì)的結(jié)合物的方式被改變。例如，假如使得病毒或病毒樣顆粒上的每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)均被結(jié)合到流感蛋白或蛋白片段的高偶聯(lián)載荷是所期望的，那么人們能估計(jì)病毒或病毒樣顆粒上的反應(yīng)位點(diǎn)并在偶聯(lián)反應(yīng)中包括額外流感蛋白或蛋白片段的大摩爾比率。假如低密度偶聯(lián)載荷是所希望的，人們能算入'病毒或病毒樣顆粒'上每摩爾反應(yīng)位點(diǎn)少于1摩爾流感蛋白的摩爾比率。人們選擇的特定條件將最終被獲得的收率、結(jié)合物的物理性質(zhì)、產(chǎn)生的結(jié)合物的效價(jià)、人們希望給予的患者群體和期望劑量所指導(dǎo)。假如疫苗中的總蛋白不是重點(diǎn)考慮的問題，那么人么就能制定具有不同偶聯(lián)載荷和不同免疫原性的結(jié)合物的劑量配方來傳遞相同的有效劑量。然而，假如總蛋白或總體積是重點(diǎn)考慮的問題，例如，假如結(jié)合物必須用在組合疫苗中，人們可能會(huì)注意結(jié)合物貢獻(xiàn)到最終組合疫苗中的總體積或總蛋白。人們?nèi)缓竽茉u估具有不同偶聯(lián)載荷的幾種結(jié)合物的免疫原性，然后選擇使用具有足夠免疫原性和能被接受的總蛋白或總體積水平的結(jié)合物來加入到組合疫苗中。IV、疫苗本發(fā)明提供了用作抗流感病毒疫苗的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明組分的藥物組合物能以酸性鹽或堿性鹽制備。藥學(xué)上可接受的鹽(水溶或油溶形式或可分散產(chǎn)品)包括傳統(tǒng)的無毒鹽或慣常的形成于例如無機(jī)或有機(jī)酸或堿的銨鹽。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽，例如醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽(cyclopentanepropionate)、葡豐唐酸鹽(digluconate)、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、glucoheptanoate、磷酸甘油、半硫酸鹽(hernisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、氫氯化物、氫溴化物(hydrobromide)氫碘化物、2-羥基乙磺酸鹽(2-hydroxyethanesulfonate)、乳酸鹽馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、煙酸鹽草酸鹽撲酸鹽、果膠(pectinate)、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽(3-phenylpropionate)、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽酒石酸鹽、硫氰酸鹽(thioeyanate)、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽；和堿性鹽，例如，銨鹽、諸如鈉和鉀鹽的堿性金屬鹽、諸如鈣鹽和鎂鹽的堿土金屬鹽、諸如dicycloheylamine鹽的同有機(jī)堿形成的鹽、N-甲基-D-葡萄糖胺和同諸如精氨酸和賴氨酸等氨基酸形成的鹽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在沒有佐劑的情況下被給與到動(dòng)物或患者。在其他實(shí)施方案中，該組合物在有佐劑的情況下被給與?；阡X的佐劑在本領(lǐng)域中普遍使用并且包括磷酸鋁、氫氧化鋁、羥磷酸鋁和羥-硫酸-磷酸鋁(aluminnunhyrdoxy-sulfate-phosphate)。普遍使用的佐劑的商品名包括ADJUPHOS、MERCKALUM和ALHYDROGEL。組合物能如所期望的和對使用的特定佐劑恰當(dāng)?shù)姆绞浇Y(jié)合到佐劑或同佐劑共沉淀。非鋁佐劑也能使用。非鋁佐劑包括QS21、Lipid-A和它的衍生物或變種，福氏(Freund's)完全或非完全佐劑、中性脂質(zhì)體、包含疫苗和細(xì)胞因子或炎癥趨化因子類的脂質(zhì)體。其他的佐劑包括CpG序列的免疫刺激核酸。參見例如，圖3。通過使用本領(lǐng)域當(dāng)前使用的任何技術(shù)，包括，例如，經(jīng)口、經(jīng)粘膜、靜脈給藥、肌肉給藥、鞘內(nèi)給藥、硬膜外給藥、腹膜內(nèi)給藥或皮下給藥，本發(fā)明的組合物能被給與。本發(fā)明的實(shí)施方案包括的組合物通過鼻、口腔或皮膚而經(jīng)粘膜傳遞。本發(fā)明另外的實(shí)施方案包括的組合物經(jīng)鼻內(nèi)傳遞。在其他實(shí)施方案中，所述組合物經(jīng)口腔給藥，通過消化植物宿主細(xì)胞生產(chǎn)組合物。在其他實(shí)施方案中，所述組合物經(jīng)由貼劑而經(jīng)皮給藥。通過把本領(lǐng)域中熟知的包括受治者年齡、體重、性別和醫(yī)療條件、給藥途徑、期望效果和使用的特定組合物(例如，流感蛋白、裝載在病毒或病毒樣考慮上的蛋白，等)等因素考慮進(jìn)去，合適的給藥方案被優(yōu)先確定。該疫苗能以多劑量接種的方式使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量將包括從大約lug到大約l.Omg總蛋白的范圍。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中該范圍從大約0.01mg到l.Omg。然而，人們可能會(huì)更喜歡基于傳遞的肽的數(shù)量來調(diào)整劑量。在其他實(shí)施方案中，這些范圍是指導(dǎo)。更精確的劑量能通過評估生產(chǎn)的結(jié)合物的免疫原性來確定，以便遞送免疫有效的劑量。免疫有效劑量是剌激患者的免疫系統(tǒng)來建立免疫反應(yīng)的劑量。優(yōu)選地，免疫系統(tǒng)刺激的水平將足以產(chǎn)生足能提供長期的抵抗特定流感病毒感染導(dǎo)致的疾病的保護(hù)的免疫記憶。劑量的周期依賴于本領(lǐng)域熟知的因素。在最初的給藥后，一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量可能會(huì)隨后給與來保持抗體滴度。給藥方案的例子將是第一天給一劑，在第1或2個(gè)月給第二劑，在第3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月或大于12個(gè)月時(shí)給與第三劑，和當(dāng)需要時(shí)在遙遠(yuǎn)的時(shí)間給與額外的加強(qiáng)劑量。如此產(chǎn)生的免疫反應(yīng)能徹底或部分抵抗流感病毒感染導(dǎo)致的疾病和虛弱癥狀。VI、生產(chǎn)包含VLPs的流感肽和流感抗原蛋白的組合物的方法在本發(fā)明另外的方面，生產(chǎn)用于人類或動(dòng)物的流感疫苗的組合物的方法被提供，該方法包含i)提供編碼包含融合到流感病毒肽的植物病毒衣殼蛋白的重組衣殼融合肽的第一核酸，所述流感病毒肽從包含M1、M2、HA、NA、NP、PB1、PB2、PA和NP2的組中選擇，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)該第一核酸，其中的宿主細(xì)胞選自植物細(xì)胞或熒光假單胞菌；ii)組裝該衣殼融合肽來形成病毒或病毒樣顆粒，其中的病毒或病毒樣顆粒不含有宿主細(xì)胞的質(zhì)膜或細(xì)胞壁蛋白；iii)提供至少一種編碼至少一條衍生自新出現(xiàn)的流感病毒株的抗原蛋白或蛋白片段的第二核酸，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)該第二核酸，其中的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞或熒光假單胞菌，并且可選地，其中的新出現(xiàn)流感病毒株被世界衛(wèi)生組織所鑒定；和iv)分離并純化該抗原蛋白或蛋白片段；和V)組合該病毒或病毒樣顆粒和該抗原蛋白或蛋白片段來形成能給與到人或動(dòng)物的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒在植物宿主中生產(chǎn)，例如，在完整植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中。在其他實(shí)施方案中，病毒樣顆粒在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原蛋白或蛋白片段在植物宿主中生產(chǎn)，例如，在完整植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中。在其他實(shí)施方案中，抗原蛋白或蛋白片段在熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒或病毒樣顆粒和抗原蛋白或蛋白片段在同一植物或熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中共生產(chǎn)，并且衣殼融合肽在體內(nèi)組裝來形成病毒或病毒樣顆粒?？蛇x地，抗原蛋白和病毒樣顆粒在植物和/或熒光假單胞菌宿主細(xì)胞中生產(chǎn)、分離、和純化，其中的衣殼融合肽在體內(nèi)組裝或在體外重新組裝來形成病毒樣顆粒并同流感抗原蛋白或蛋白片段組合來形成能用于人類或動(dòng)物的組合物。實(shí)施例實(shí)施例1、克隆流感A病毒的M2-e通用表位到豇豆褪綠斑點(diǎn)病毒(CCMV)外殼蛋白(CP)兩條衍生自流感A病毒M2蛋白的23個(gè)氨基酸的肽M2e-1和M2e-2被獨(dú)立地克隆入CCMVCP基因來在CCMV病毒樣顆粒(VLPs)上進(jìn)行表達(dá)。M2e-1肽序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(Seq.ID.No.1)M2e-2肽序列SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(Seq.ID.No.2)所述插入物的每一條均用下面詳述的熱循環(huán)程序被重疊DNA寡核苷酸來合成<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>(來源于，InvitrogenCorp,Carlsbad,CA,USA,下文中稱"Invitrogen")利用的寡核苷酸包括M2e-1F5'CGGGGATCCTGTCACTCTTGACAGAGGTAGAAACACCGATACGTAATGAATGG3，(Seq.ID.No.14)M2e-1R5'CGCAGGATCCCATCTGAAGAATCATTACAACGACAGCCCCATTCATTACGTATC3'(Seq.ID.No.30)M2e-2F5'CGGGGATCCTGTCACTCTTGACAGAGGTAGAAACACCGATACGTAATGAATGG3'(Seq.ID.No.31)M2e-2R5'CGCAGGATCCCATCTGAAGAGCCATTACAACGACATTCCCATTCATTACG3'(Seq.ID.No.32)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用BflwM限制酶消化并亞克隆到用^W7M酶切的穿梭質(zhì)粒pESC-CCMV129中，然后進(jìn)行去磷酸化。嵌合CCMV-CP基因的編碼序列然后被測序來確保插入的肽序列的方向和修飾的CP基因的完整性。嵌合外殼蛋白基因然后在Spel和Ibl位點(diǎn)被切離穿梭質(zhì)粒并被亞克隆到熒光假單胞菌表達(dá)質(zhì)粒pDOW1803的SpeI和A72oI位點(diǎn)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化到電穿孔感受態(tài)熒光假單胞菌MB214中，以15ug/ml的四環(huán)素作為選擇試劑。實(shí)施例2、流感A病毒NP表位克隆入豇豆褪綠斑點(diǎn)病毒(CCMV)外殼蛋白(CP)衍生自流感A病毒NP蛋白的兩個(gè)肽NP55-69和NP147-158被獨(dú)立地克隆入將表達(dá)在CCMV病毒樣顆粒(VLPs)上的CCMVCP基因中。NP55-69肽序列RLIQNSLTIERMVLS(S叫.ID.No.9)NP147-158肽序列TYQRTRALVRTG(Seq.ID.No.10)所述插入物的每一種均用在實(shí)施例1中公開的熱循環(huán)程序通過重疊DNA寡核苷酸合成。這些寡核苷酸包括NP55-69FTGGTGCTGAGCGG3'(Seq.ID.No:33)子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、鎳親和層析、羥基磷灰石層析、反相層析、凝集素層析、制備電泳、去污劑增溶、用如柱層析的物質(zhì)進(jìn)行的選擇性沉淀、免疫純化方法、分子排阻層析、免疫沉淀方法、離心、超離心、密度梯度離心(例如，蔗糖梯度或氯化銫(CsCl)梯度)、通過分子排阻膜的超濾，和本領(lǐng)域已知的任何其它蛋白分離方法。例如，具有確定分子吸附性質(zhì)的衣殼蛋白融合肽能被可逆地結(jié)合到配基。利用適當(dāng)?shù)呐浠職さ鞍兹诤想哪鼙贿x擇性吸附到純化柱，然后以相對純的形式從該柱子上被洗脫下來。通過酶活性，該衣殼蛋白然后被移除。另外，所述衣殼蛋白融合肽能使用免疫親和柱或Ni-NTA柱被純化。綜合的技術(shù)在下述文獻(xiàn)中被進(jìn)一步描述，例如，R.Scopes,PeptidePurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:N.Y.(1982);Deutscher,GuidetoPeptidePurification,AcademicPress(1990);U.S.Pat.No.4，511，503;S.Roe,PeptidePurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag,etal"PeptideMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996);AKPatraetal,，PeptideExprPurif，18(2):p/182-92(2000);andR.Mukhija,etal.，Gene165(2):p.303-6(1995)。也參見例如，Aipibel，etal.(1987andperiodicsupplements);Deutscher(1990)"GuidetoPeptidePurification,"MethodsinEnzymologyvol.182，andothervolumesinthis30series;Coligan,etal.(19%andperiodicSupplements)CurrentProtocolsinPeptideScienceWiley/Greene,NY;和肽純化產(chǎn)品使用的廠商文南犬，例如，Pharmacia,Piscataway,NJ.或Bio-Rad,Richmond,Calif。重組技術(shù)的組合允許融合到適當(dāng)?shù)钠危?，融合到FLAG序列或能被經(jīng)由可被蛋白酶移除的序列融合的同等物。也參見例如，Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"PurificationofRecombinantPeptideswithMetalChelateAbsorbent"inSetlow(ed.)GeneticEngineering,PrincipleandMethods12:87-98,PlenumPress,NY;andCrowe,etal.(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&PeptidePurificationSystemQIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif。在其它實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞尤其是細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的衣殼融合肽可能會(huì)形成不可溶的聚集物("包涵體")。幾種方法適用于純化從包涵體而來的肽。例如，通過裂解宿主細(xì)胞，例如通過在含50mMHA91-108RAGTTGCTGAAAGCCTTGCTCAG3'(Seq.ID.No:38)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用SflwM限制酶消化并亞克隆入用S"w//1酶切的穿梭質(zhì)粒pESC-CCMV129中，然后進(jìn)行去磷酸化。嵌合CCMV-CP基因的編碼序列然后被測序來確保插入的肽序列的方向和修飾的CP基因的完整性。嵌合外殼蛋白基因然后在^el和屈ol位點(diǎn)被切離穿梭質(zhì)粒并被亞克隆到熒光假單胞菌表達(dá)質(zhì)粒pDOW1803的^el和扇o[位點(diǎn)。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)化到電穿孔感受態(tài)熒光假單胞菌MB214中，以15ug/ml的四環(huán)素作為選擇試劑。實(shí)施例4、重組CCMV衣殼融合肽的表達(dá)CCMV129-融合肽表達(dá)質(zhì)粒按下述流程轉(zhuǎn)化入熒光假單胞菌MB214。在玻璃瓶中的宿主細(xì)胞在冰上逐漸地融化。對每一個(gè)轉(zhuǎn)化，1PL純化的表達(dá)質(zhì)粒DNA被加入到宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生的混合物用移液管頭輕輕地旋動(dòng)來混合，然后在冰上孵育30分裝。該混合物被轉(zhuǎn)移到一次性使用的電穿孔杯(伯樂基因脈沖器杯(BioRadGenePulserCuvette)，0.2cm電極距，catno.165-2086)。將該電穿孔杯放到預(yù)設(shè)到2000hrns、25[ifarads、2.25kV條件的伯樂基因脈沖器中。細(xì)胞被短暫地脈沖(大約l-2秒)。迅速加入冷的LB培養(yǎng)基，產(chǎn)生的混懸物在30'C孵育2小時(shí)。然后將細(xì)胞鋪在LBtet15(補(bǔ)充四環(huán)素的LB培養(yǎng)基)瓊脂上并在3(TC生長過夜。從每一個(gè)平板上挑取一個(gè)菌落，挑取的樣品接種到在遮光搖瓶中的50mlLB種子培養(yǎng)物(LBseedculture)中。液體懸浮培養(yǎng)物以250rpm轉(zhuǎn)速在3(TC生長過夜。產(chǎn)生的每一種種子培養(yǎng)物的10ml然后用來接種在1升遮光搖瓶中的200mL搖瓶培養(yǎng)基(即酵母抽提物和含有微量元素的鹽、檸檬酸鈉和甘油，pH值6.8)。為了選擇加入四環(huán)素。接種的培養(yǎng)物以250rpm轉(zhuǎn)速在30。C生長過夜，為了表達(dá)CCMV129-融合肽嵌合外殼蛋白，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。將從每一個(gè)搖瓶培養(yǎng)物中取出的lmL培養(yǎng)物進(jìn)行離心來沉淀細(xì)胞。細(xì)胞沉淀在含有2mMEDTA的pH值8.2的0.75mL冷50mMTris-HCl中重懸。然后加入0.1%體積的10%TritonX-100去污劑，然后加入溶菌酶使終濃度為0.2mg/mL。細(xì)胞然后在冰上孵育2小時(shí)，在那個(gè)時(shí)間清澈粘稠的細(xì)胞裂解物應(yīng)該是明顯的。將1/200體積的1MMgCl2加入裂解物中，然后加入1/200體積的2mg/mLDNaseI，然后在冰上孵育1小時(shí)，在那個(gè)時(shí)間裂解物應(yīng)該已經(jīng)變成粘稠度少得多的液體。處理過的裂解物然后在4。C下在桌面離心機(jī)中以最高速離心30分鐘，然后上清傾入干凈的管中。傾入的上清是"可溶的"蛋白組分。剩下的沉淀然后重懸于0.75mLTE緩沖液中(含lOmMTris-Cl、pH值7.5、含lmMEDTA)。重懸的沉淀是"不可溶的"組分。實(shí)施例5、重組CCMV衣殼融合肽的分析"可溶的"和"不可溶的"組分在NuPAGE4-12%雙-Tris膠(購自Invitrogen，Cat.NP0323)上、具有1.0mmX15個(gè)孔、按照制造商說明書進(jìn)行電泳。5ul每種組分同5ul2X還原性SDS-PAGE上樣緩沖液混合，并在上樣到膠上前煮沸5分鐘。所述膠用簡單藍(lán)安全染色劑(購自Invitrogen，Cat.LC6060)染色并用水過夜脫色。圖4顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同M2e-1流感病毒肽融合CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖5顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同M2e-2流感病毒肽融合CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖6顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同NP55-69流感病毒肽融合CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖7顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同NP147-158流感病毒肽融合CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。圖8顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同HA91-108流感病毒肽融合CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。實(shí)施例6、重組CCMVVLPs的純化用來純化嵌合CCMVVLPs的方法包含下述步驟(1)細(xì)胞裂解，(2)包涵體(IB)洗滌和分離，(3)IB可溶化，(4)熱休克蛋白(HSP)污染物去除，(5)內(nèi)毒素去除，(6)外殼蛋白復(fù)性，(7)澄清，(8)VLP組裝，(9)緩沖液更換到pH7.0的PBS，禾n(10)無菌過濾。下述緩沖液被使用a、裂解緩沖液-100mMNaCl/5mMEDTA/0.1-0.2mMPMSF/50mMTris,pH7.5b、緩沖液AU-低離子強(qiáng)度-8M尿素/lmMDTT/20mMTris，pH7.5c、緩沖液Bw/8M尿素-lMNaCl/8M尿素/lmMDTT/20mMTris,pH7.5d、CIP溶液-0.5NNaOH/2MNaCle、柱制備溶液-100mMTris，pH7.5,f、儲(chǔ)存溶液-20%乙醇g、緩沖液B-lMNaCl/lmMDTT/20mMTris，pH7.5h、MustangE(購自Pall，cat.#MSTG25E3)-過濾的病毒組裝緩沖液-0.1NaOAc，pH4.8，O.lMNaCl，0.0002MPMSF。i、MustangE-過濾的pH7.0PBS。15-20克熒光假單胞菌濕細(xì)胞泥被量入50mL錐形瓶中，加入裂解緩沖液使總體積為40ml。細(xì)胞泥溶液被渦旋和攪拌直至有點(diǎn)均質(zhì)化。通過使用高速齒輪并在1280psi下兩次通過法蘭西壓榨器，細(xì)胞被裂解。裂解物(~33ml)在4。C以IOOOOXG離心IO分鐘。將上清丟棄。產(chǎn)生的沉淀緊密并具有粉狀一致性、色淡并同細(xì)胞糊不同。將4-5ml裂解緩沖液加入到沉淀中，然后該溶液用刮勺渦旋和攪動(dòng)直至沉淀溶解。加入裂解緩沖液至總體積為40ml。渦旋該樣品直至沉淀溶解。該樣品在4°C以10000XG離心10分鐘。該IB洗滌用裂解緩沖液至少重復(fù)一次，最后一次用去離子水進(jìn)行。通過渦旋，IBs溶于4-5ml8M尿素/lmMDTT/20mMTris，pH7.5的溶液中。IB溶液的體積被用8M尿素/lmMDTT/20mMTris,pH7.5調(diào)整到40ml。假如需要，該溶液在冷凍的超聲破碎器槽中超聲破碎15分鐘并在4。C搖動(dòng)過夜，然后進(jìn)行澄清化(通過在4'C下以10000XG離心10分鐘或用0.45umWhatmanGD/X濾紙過濾，cat.#6976-2504)。Q-SepharoseFastFlow(GEHealth)柱用10倍柱體積(CV)的緩沖液AU-低離子強(qiáng)度-8M尿素/lmMDTT/20mMTris-HC1，pH7.5(AU-Low)進(jìn)行平衡。每ml樹脂上8mlIB溶液，收集2ml流出(FT)組分。該柱然后用6CV緩沖液AU-Low洗滌，用5CV含8M尿素的緩沖液B進(jìn)行洗脫。該柱用6CVCIP溶液清洗和再生并儲(chǔ)存于20%乙醇中。在收集的FT組分中發(fā)現(xiàn)了帶有HSP污染物的CCMV外殼蛋白。SartobindQl5X或QIOOX濾膜(Sartorius)用10ml緩沖液AU-Low平衡。IB溶液用該膜過濾且濾液被澄清。過濾的溶液同5X體積的緩沖液B加到管中并立即混合。稀釋的溶液可以在4'C混合幾分鐘，然后在4'C下用3500Da膜過夜透析緩沖液B,同時(shí)緩慢攪拌。緩沖液至少改變一次。在透析后，假如需要，澄清該溶液。復(fù)性的蛋白溶液被透析入病毒組裝緩沖液中12小時(shí)并通過離心或0.2um過濾進(jìn)行澄清。重新組裝的VLP溶液通過過300KDa膜被濃縮在病毒組裝緩沖液中并使用3緩沖液交換法交換到PBS，pH7.0中。用0.2um濾紙進(jìn)行最終的除菌過濾。實(shí)施例7、純化的重組CCMVVLPs分析純化的VLPs在NuPAGE4-12%雙-Tris膠(購自Invitrogen，Cat.NP0323)上、具有1.0mmX15個(gè)孔、按照制造商說明書進(jìn)行電泳。5ul樣品同5ul2X還原性SDS-PAGE上樣緩沖液混合，并在上樣到膠上前煮沸5分鐘。所述膠用簡單藍(lán)安全染色劑(購自Iiwitrogen，Cat.LC6060)染色并用水過夜脫色。Westernblot檢測使用作為第一抗體的抗-CCMVIgG(德國DSMZ登入號.ASOOIO、抗流感AM2蛋白(購自ABR(AffinityBioReagents)的小鼠單克隆IgGlKappa，cat#:MAI-082)，和WESTERNBREEZE試劑盒(購自Invitrogen,Cat.WB7105)，并按制作者的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖9顯示了通過簡單藍(lán)安全染色劑染色(Invitrogen)的SDS-PAGE檢測到的同M2e-1流感病毒肽融合的純化的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)和檢測。圖10顯示了通過使用抗CCMV和抗M2抗體14B的westernblotting檢測到同M2e-1流感病毒肽融合的CCMV129CP在熒光假單胞菌中的表達(dá)。M2e肽被抗M2抗體所識別。實(shí)施例8、流感A病毒M2-e通用表位克隆入豇豆花葉病毒(CPMV)外殼蛋白(CP)衍生自流感A病毒M2蛋白的M2e-3被獨(dú)立地克隆入將表達(dá)在CPMV病毒顆粒上的CPMV小CP基因中。M2e-3肽序列SLLTEVETP麗EGCRCNDSSD(Seq.ID.No.3)所述插入物用在實(shí)施例1中公開的熱循環(huán)程序通過重疊DNA寡核苷酸合成。所述寡核苷酸是M2e-3F5，ATGGATAGCTAGCACTCCTCCTGCTAGTCTGCTGACID.No.39)M2e-3R5TGCCTGTGACGTCTGAAAATGGATCGCTGCTATCGTTGCAGCGGCAGCCTTCGTTGCGAATCGG3'(S叫ID.No.40)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用Jaffl和A%el限制酶(NEB)消化并亞克隆入用Ja/II和JV/zel酶切的質(zhì)粒pDOW2604中，然后進(jìn)行去磷酸化。2ixL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Topl0Oneshot大腸桿菌細(xì)胞(Invkrogen)。細(xì)胞/連接產(chǎn)物混合物在冰上孵育30分鐘，在加入0.5mlLB動(dòng)物無豆水解產(chǎn)物培養(yǎng)基(Teknova)前熱休克45秒。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在鋪到含100ug/ml氨節(jié)西物無豆水解產(chǎn)物培養(yǎng)基瓊脂平板前，在37°C搖1小時(shí)。嵌合CPMV-CP基因的編碼序列(pDOW-M2e-3)然后被測序來確保插入的肽序列的方向和修飾的CP基因的完整性。實(shí)施例9、含流感A病毒M2-e通用表位的重組CPMV在豇豆植物中的生產(chǎn)嵌合CPMV顆粒在植物中的生產(chǎn)購自FerryMorse序號1450的豇豆加利福尼亞#5種子室溫下在濕紙巾中過夜萌芽。萌芽的種子轉(zhuǎn)移到土壤中。萌芽后七天該豆苗用存在研磨劑的CPMVRNAl和嵌合CPMVRNA2進(jìn)行接種。所述CPMVRNA通過體外轉(zhuǎn)錄從用M/wI酶切的pDOW2605質(zhì)粒和用EcoRI酶切的pDOW-M2e-3質(zhì)粒生產(chǎn)而來。線性化的質(zhì)粒DNA用Qiagen凈化柱或類似的凈化試劑盒進(jìn)行柱純化。用含有CAP(40mM)的T7MEGAscript試劑盒(Ambion,catalog#1334)按照制造商說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)量通過在瓊脂糖凝膠上跑11RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析。'在接種后，這些植物在25r、光周期為16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗的情況下生長二到三周。顯示出癥狀的葉子被采集并在純化前凍存于-80°C。嵌合CPMV顆粒的純化40克CPMV感染的葉片組織被凍存于-8(TC。冷凍的葉片組織用手粉碎并倒入序號8011S的Waring高速攪拌器。120ml含PMSF的冷AIEC結(jié)合緩沖液(30mMTris堿pH7.50，0.2mMPMSF)被傾倒在粉碎的葉片上。這些葉片在高速下磨兩次共3秒。獲得的溶液倒入500ml的離心瓶中。攪拌器用30ml冷A正C結(jié)合緩沖液洗滌且該洗滌液也倒入500ml的離心瓶中。獲得的溶液以15000G離心30分鐘來去除植物細(xì)胞殘片。上清倒入刻度量筒中。為了沉淀CPMV病毒，冷PEG6000溶液(20%PEG6000，lMNaCl)被加入到上清中使PEG終濃度為含0.2MNaCl的4。/。PEG6000，并且該溶液被輕輕混合。獲得的溶液在冰上沉淀1小時(shí)。該病毒沉淀溶液然后以15000G離心30分鐘來收集CPMV病毒沉淀。上清被倒掉，然后病毒沉淀被迅速重懸在陰離子交換結(jié)合緩沖液(30mMTris堿pH7.50)中。為了進(jìn)一步純化該病毒樣顆粒，該蛋白混合物，通過使用購自AppliedBiosystems序號1-2559-11的POROS50HQ強(qiáng)陰離子交換樹脂分餾該蛋白混合物。20倍柱體積梯度是從溶液A(30mMTris堿pH6.75)到緩沖液B(含1MNaCl的30mMTris堿pH6.75)。該層析用貝勾自AmershamBiosciences序號18-1112-41的AKTAexplorer進(jìn)行。含有期望病毒樣顆粒的在梯度上的第一個(gè)峰用100KDa截留膜序號UFC910096的Millipore離心濃縮器將緩沖液交換成PBS。獲得的樣品凍存于-8(TC。實(shí)施例10、含流感A病毒M2-e通用表位的重組CPMV的分析小外殼蛋白和大外殼蛋白的穩(wěn)定性用SDS-PAGE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。組裝的嵌合CPMV病毒顆粒的完整性用分子排阻層析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。純化的顆粒在NuPAGE4-120/。雙-Tris膠(購自Invitrogen，Cat.NP0323)上、具有1.0mmX15個(gè)孔、按照制造商說明書進(jìn)行電泳。5ul樣品同5ul2X還原性SDS-PAGE上樣緩沖液混合，并在上樣到膠上前煮沸5分鐘。所述膠用簡單藍(lán)安全染色劑(購自Invitrogen，Cat.LC6060)染色并用水過夜脫色。Westernblot檢測使用作為第一抗體的多克隆抗-CPMV多克隆兔IgGJ16、抗流感AM2蛋白(購自ABR(A伍nityBioReagents)的小鼠單克隆lgGlKappa，cat#:MA1-082)，禾PWESTERNBREEZE試劑盒(購自Invitrogen,Cat.WB7105)，并按制作者的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖11顯示了通過SDS-PAGE和使用抗CPMV和抗M2抗體14B的WesternBlotting檢測到的同M2e-1流感病毒肽融融合的CPMV在植物中的表達(dá)。M2e肽被抗M2抗體所識別。實(shí)施例11、用于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)的HA基因和基因片段編碼SEQIDNO:15中從流感病毒A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5Nl)病毒株中鑒定的流感HA的基因從DNA2.0(DNA2.0，MenloPark,CA94025,USA)訂購合成。合成的HA基因被工程化來支持植物密碼子使用偏好并包含位于該基因兩側(cè)用于克隆目的的在該基因中沒有相同限制性酶切位點(diǎn)的制造好的限制性位點(diǎn)。合成的全長HA基因缺少C末端跨膜區(qū)域和胞質(zhì)尾。參見圖12和圖13。用于在植物細(xì)胞中克隆和表達(dá)的密碼子優(yōu)化的全長HA基因ORF的核苷酸序列在表5，SEQIDNo:16中顯示。從SEQIDNo:16翻譯而來的全長HA蛋白的氨基酸序列在表5，SEQIDNo:17中顯示。該序列缺少C末端跨膜區(qū)域和胞質(zhì)尾并在蛋白的C末端包含His-標(biāo)記。密碼子優(yōu)化的HA蛋白片段的核苷酸序列HAl和HA2在表5，SEQIDNo:19和21中顯示。從SEQIDNO:19和21翻譯而來的HAl和HA2蛋白片段的氨基酸序列在表5，SEQIDNo:18和20中顯示。兩條HA片段均含有天然的信號肽，C末端跨膜區(qū)域和胞質(zhì)尾被移除，并在該蛋白片段的C末端包含His-標(biāo)記。實(shí)施例12、流感全長HA、HAl和HA2克隆入基于pDOW3451PVX的表達(dá)載體通過使用允許將全長HA基因從載體G01129(DNA2.0)中切離的限制酶EcoRV和BspEl來分離全長的HA基因。消化的G01129跑瓊脂糖凝膠來將載體和HA基因分離。HA基因進(jìn)行凝膠純化，然后亞克隆入也用EcoRV和BspEl酶切的載體pDOW3451并使用小牛堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化。參見圖14。成功的新載體pDOW3471克隆通過限制酶切圖譜和篩選HA基因的菌落PCR進(jìn)行確認(rèn)。通過在PCR反應(yīng)中使用G01129作為模板來分離HAl和HA2基因片段。第一個(gè)PCR反應(yīng)用來擴(kuò)增包含EcoRV限制位點(diǎn)、信號肽和ORF起點(diǎn)的HAl基因。反義引物用來在C末端加入6聚組氨酸標(biāo)記和BspEl限制位點(diǎn)。PCR反應(yīng)使用SuperPCRMix(Invitrogen)按照廠商說明書進(jìn)行。用來擴(kuò)增HAl片段的引物是Thai1FHA15'GCGCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTC3'(S叫ID.No.41)Thai3HAlBspEl5'GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTCTCTTCTTACGTC3'(Seq.ID.No.42)第二個(gè)反應(yīng)用來擴(kuò)增HA2片段。使用了下述引物Thai8FHA2EcoRVTCAGTTTGGTCAAATCAGGATTGTTCG3'(Seq.ID.No.43)Thai7HA2BspEl5'GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGGTAGATACC3'(Seq.ID.No.44)PCR反應(yīng)的熱循環(huán)設(shè)置包括1、95。C2分鐘2、94。C30秒3、56。C30秒4、68。Cl:10分鐘5、回到步驟234次6、68。C10分鐘7、4°CPCR后，HA1和HA2片段的產(chǎn)物用五coiV和進(jìn)行消化，跑DNA凝膠，用來克隆入載體pDOW3451的條帶被切下。成功的新載體pDOW3471克隆通過限制酶切圖譜和篩選HA基因的菌落PCR進(jìn)行確認(rèn)。實(shí)施例13、從pDOW3475和pDOW3466制備RNA轉(zhuǎn)錄物pDOW3471和pDOW3466(含有帶有外殼蛋白中的刪除的PVX基因組的幫助者質(zhì)粒)均用限制酶Spel線性化，Quickspin柱凈化(Qiagen)和無核酸酶的水(Ambion)洗脫。通過使用mMessageMachineT7capped試劑盒(Ambion)的成份，體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按下述方法建立。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>反應(yīng)在冰上進(jìn)行建立，然后在37'C孵育2小時(shí)。在體外RNA轉(zhuǎn)錄后，每個(gè)反應(yīng)的少量樣品進(jìn)行跑膠來觀察RNA產(chǎn)物。實(shí)施例14、煙草(7V/cW/Vmtf&wZAtfVma)植物接種和HA蛋白在植物中的生產(chǎn)使用從pDOW3475和pDOW3466體外轉(zhuǎn)錄的RNA接種煙草植物。一片2-3周齡的植物葉子用少量金剛砂進(jìn)行研磨。RNA接種物應(yīng)用在新葉和金剛砂上。使用干凈的手套將所述RNA擦入葉片組織。每一植物接種使用一劑同pDOW3466組合的pDOW3475的接種物(20iiL體外轉(zhuǎn)錄RNA)。觀察植物的癥狀形成。參見圖15.實(shí)施例15、NTl-煙草細(xì)胞接種和HA蛋白在植物細(xì)胞中的生產(chǎn)通過將體外轉(zhuǎn)錄RNA電穿孔到NT1原生質(zhì)體進(jìn)行煙草NT1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。通過使用纖維溶素(cellulysin)和離析酶去除細(xì)胞壁制備用于電穿孔的NT1原生質(zhì)體。在pDOW3475RNA電穿孔入細(xì)胞前五分鐘，5ug含有HcPro基因的質(zhì)粒同細(xì)胞進(jìn)行孵育。HcPro先前已經(jīng)被證明能阻止基因沉默從而增加了病毒復(fù)制的量和活性?；パa(bǔ)(complementation)被推論在植物細(xì)胞培養(yǎng)物繁殖表達(dá)HA基因的病毒RNA中不是必需的。pDOW3466衍生的RNA用作接種物。在緊鄰電穿孔前，5uL體外轉(zhuǎn)錄的RNA被加入到在冰冷的0.4cm電極距電穿孔杯(Biorad)中的lml處理過的植物細(xì)胞中，并快速混勻。細(xì)胞在500ixF和250V下脈沖11-13秒。細(xì)胞鋪到陪替培養(yǎng)皿中的5mlNTl培養(yǎng)基上，用parafilm密封，然后在室溫下生長48小時(shí)。細(xì)胞被進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來檢測成功的轉(zhuǎn)染和HA生產(chǎn)。為了在天然和變性條件下通過Ni-NTA離心柱(Qiagen)純化組氨酸標(biāo)記的HA蛋白，全部的細(xì)胞培養(yǎng)物被沉淀、冷凍、用研杵磨碎、和裂解。樣品然后用使用第一抗體抗-His抗體(Qiagen3packset)和第二抗體抗小鼠AP(WesternBreeze,Invitrogen)的westernblot進(jìn)行檢領(lǐng)!j。實(shí)施例16、HA或HA片段在熒光假單胞菌中的表達(dá)編碼SEQIDNO:25中從流感病毒A/Vietnam/2004(H5N1)病毒株中鑒定的流感HA的基因從DNA2.0(DNA2.0，MenloPark,CA94025，USA)訂購合成。合成的HA基因被工程化來支持熒光假單胞菌密碼子使用偏好并含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)和位于該基因兩側(cè)用于克隆目的的在該基因中沒有相同限制性酶切位點(diǎn)的制造好的限制性位點(diǎn)。用于在熒光假單胞菌細(xì)胞中克隆和表達(dá)的密碼子優(yōu)化的全長HA基因ORF的核苷酸序列在表5，SEQIDNo:26中顯示。HA蛋白基因在Spel和Xhol位點(diǎn)被切離所述質(zhì)粒并取代buibui基因在Spel和Xhol位點(diǎn)被亞克隆入熒光假單胞菌表達(dá)質(zhì)粒pDOW1803。產(chǎn)生的質(zhì)粒通過電穿孔被轉(zhuǎn)化入電穿孔感受態(tài)熒光假單胞菌MB214。在玻璃瓶中的宿主細(xì)胞在冰上逐漸地融化。對每一個(gè)轉(zhuǎn)化，1uL純化的表達(dá)質(zhì)粒DNA被加入到宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生的混合物用移液管頭輕輕地旋動(dòng)來混合，然后在冰上孵育30分裝。該混合物被轉(zhuǎn)移到一次性使用的電穿孔杯(伯樂基因脈沖器杯，0.2cm電極距，catno.165-2086)。將該電穿孔杯放到預(yù)設(shè)到200Ohms、25pfarads、2.25kV條件的伯樂基因脈沖器中。細(xì)胞被短暫地脈沖(大約l-2秒)。迅速加入冷的LB培養(yǎng)基，產(chǎn)生的混懸物在3(TC孵育2小時(shí)。然后將細(xì)胞鋪在LBtetl5(補(bǔ)充15叱/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基)瓊脂上并在3(TC生長過夜。從每一個(gè)平板上挑取一個(gè)菌落，挑取的樣品接種到在遮光搖瓶中的50mlLB種子培養(yǎng)物(LBseedculture)中。液體懸浮培養(yǎng)物以250rpm轉(zhuǎn)速在3(TC生長過夜。10ml產(chǎn)生的每一種種子培養(yǎng)物然后用來接種在1升遮光搖瓶中的200mL搖瓶培養(yǎng)基(即酵母抽提物和含有微量元素的鹽、檸檬酸鈉和甘油，pH值6.8)。為了選擇加入四環(huán)素。接種的培養(yǎng)物以250rpm轉(zhuǎn)速在3(TC生長過夜，為了表達(dá)HA蛋白，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。實(shí)施例17、pbp-HA在熒光假單胞菌DC454周質(zhì)中的克隆和表達(dá)24個(gè)氨基酸殘基的磷酸鹽結(jié)合蛋白分泌(pbp)信號肽被融合到SEQIDNo:29中的修飾的流感病毒A/Vietnam/2004(H5N1)病毒株的不含它的天然分泌信號肽和C末端跨膜區(qū)域的HA蛋白的N端。pbp信號肽用下述引物對從pDOW1113中擴(kuò)增出pbpF-Spel5'(Seq.ID.No.45)pbp-HA-Rev5'GTGATAGCCGATGCAAATCTGGTCGGCCACCGCGTTGGC3'(S叫ID.No.46)在SEQIDNo:26中的修飾的HA蛋白從含有HA基因的穿梭質(zhì)粒中通過PCR用下述弓1物對擴(kuò)增出pbp-HA-For5'GCCAACGCGGTGGCCGACCAGATTTGCATCGGCTATCAC3'(Seq.ID.No.47)HA-XhoI-Rev5，CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC3'(Seq.ID.No.48)融合pbp-HA基因然后用下述引物對進(jìn)行擴(kuò)增pbpF-Spel5'GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG3'(Seq.ID.49)HA-XhoI-Rev5'CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC3'(Seq.ID.No.48)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>步驟1:包含pbp信號的質(zhì)粒用作PCR模板。pbpF-Spel和pbp-HA-Rev引物在反應(yīng)1中使用。pbp-HA-For和HA-XhoI-Rev引物在反應(yīng)2中使用。PCR反應(yīng)按上面公開的熱循環(huán)方法進(jìn)行。步驟2:PCR產(chǎn)物1和2用作這個(gè)反應(yīng)的PCR模板。pbpF-Spel和HA-XhoI-Rev引物用來擴(kuò)增最終的PCR產(chǎn)物。最終的PCR產(chǎn)物然后用^el和lol進(jìn)行消化并克隆入用Spel和屈ol限制酶切的熒光假單胞菌表達(dá)載體pDOW1169并去磷酸化。連接產(chǎn)物在用MicroBio-spin6層析柱(BioRad)純化后通過電穿孔轉(zhuǎn)化入熒光假單胞菌DC454。該轉(zhuǎn)化物在LB培養(yǎng)基中在3(TC搖2小時(shí)后鋪在M9葡萄糖培養(yǎng)基平板(Teknova)上。這些平板在3(TC孵育48小時(shí)。插入物的存在同限制酶消化和測序確定。蛋白表達(dá)單個(gè)的轉(zhuǎn)化子接種到50mlM9葡萄糖培養(yǎng)基中并過夜生長。OD600值3.0-5.0的熒光假單胞菌培養(yǎng)物用來接種搖瓶培養(yǎng)物。搖瓶然后在30"C以300rpm轉(zhuǎn)速孵育過夜。OD600值15.0-20.0的過夜培養(yǎng)物用300uM的異丙基-0-D-半乳糖硫吡楠糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)物在誘導(dǎo)后24小時(shí)收集。實(shí)施例18、HA或HA片段在體外同CCMV病毒或病毒樣顆粒結(jié)合含有流感插入物的嵌合CCMVVLP顆粒按實(shí)施例1-7公開的方法生產(chǎn)，然后被進(jìn)一步處理來結(jié)合HA蛋白、或HA蛋白的片段、或HA蛋白的突變體、或如實(shí)施例11-17中公開的衍生的HA片段的突變體到CCMV外殼蛋白。所述HA蛋白或蛋白片段被聯(lián)結(jié)到CCMV顆粒或它的突變體的表面暴露半胱氨酸殘基。在存在50mM醋酸鈉pH4.8中的lmMCuS04、摩爾比率為93pMCCMV衣殼蛋白對385pMHA的情況下，通過氧化偶聯(lián)CCMV上的半胱氨酸硫醇基到所述蛋白上的游離硫醇基上述聯(lián)結(jié)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)。該反應(yīng)進(jìn)行l(wèi)-4小時(shí)。可選地，通過在Gillitzer,etal.,Chemicalmodificationofaviralcageformultivalentpresentation,Chem.Commun.,2002，2390-2391禾口Chatterjietal"ChemicalconjugationofheterologousproteinsonthesurfaceofCowpeaMosaicVims.BioconjugateChem.,2004,Vol.15，807-813中描述的方法，所述HA蛋白也能聯(lián)結(jié)到CCMVVLP顆粒的表面。通過分子排阻層析將結(jié)合的顆粒同非結(jié)合的顆粒分離開，所述分子排阻層析使用購自GEBioscience的1cmX30cmSuperose6柱并以0.1MNaP04pH7.00的緩沖液為流動(dòng)相?？蛇x地，通過4%PEG0.2MNacl沉淀及隨后的在30mMTrispH7.50緩沖液中重懸也可將結(jié)合的顆粒同游離的HA蛋白或蛋白片段分離。實(shí)施例19、HA或HA片段在體外同CPMV病毒或病毒樣顆粒結(jié)合含有流感插入物的嵌合CPMVVLP顆粒按實(shí)施例8-10公開的方法生產(chǎn)，然后被進(jìn)一步處理來結(jié)合HA蛋白、或HA蛋白的片段、或HA蛋白的突變體、或如實(shí)施例11-17中公開的衍生的HA片段的突變體到CPMV外殼蛋白。所述HA蛋白被聯(lián)結(jié)到CPMV顆粒或它的突變體的表面暴露半胱氨酸殘基。在存在50mM醋酸鈉pH4.8中的lmMCuS04、摩爾比率為93pMCPMV衣殼蛋白對385pMHA的情況下，通過氧化偶聯(lián)CPMV上的半胱氨酸硫醇基到所述蛋白上的游離硫醇基上述聯(lián)結(jié)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)。該反應(yīng)進(jìn)行1-4小時(shí)?？蛇x地，通過在Gillitzer,etal.,Chemicalmodificationofaviralcageformultivalentpresentation,Chem.Commim"2002,2390-2391禾nChatterjietal"ChemicalconjugationofheterologousproteinsonthesurfaceofCowpeaMosaicVims.BioconjugateChem.,2004,Vol.15,807-813中描述的方法，所述HA蛋白也能聯(lián)結(jié)到CPMVVLP顆粒的表面。通過分子排阻層析將結(jié)合的顆粒同非結(jié)合的顆粒分離開，所述分子排阻層析使用購自GEBioscience的1cmX30cmSuperose6柱并以0.1MNaP04pH7.00的緩沖液為流動(dòng)相?？蛇x地，通過4。/。PEG0.2MNacl沉淀及隨后的在30mMTrispH7.50緩沖液中重懸也可將結(jié)合的顆粒同非結(jié)合的HA蛋白或蛋白片段分離。實(shí)施例20、用含有M2e表位的嵌合CCMV和CPMV顆粒免疫小鼠含有流感表位插入物并結(jié)合到HA蛋白的CCMVVLPs按實(shí)施例18中公開的方法生產(chǎn)并給與到雌性Balb/c小鼠。7周齡Balb/c小鼠每三周一次腹腔注射100ug純化的結(jié)合HA的CCMVVLP。對于鼻內(nèi)免疫，100"g結(jié)合的CCMVVLP被給與到麻醉的小鼠。lOOul總體積被給與到兩個(gè)鼻孔中(每個(gè)鼻孔50ixl)。對照小鼠按照相同的劑量日程表被給與攜帶諸如炭疽保護(hù)抗原(PA)的不相關(guān)肽插入物的CCMVVLP?？蛇x地，對照小鼠被給與pH7.0的PBS。在第一次給藥前1天和兩次后續(xù)的給藥的每一次后兩周，獲取血清樣品、鼻內(nèi)和肺沖洗物。免疫小鼠然后在最后一次免疫后2-3周以4000PFU/小鼠的活的小鼠可適合的流感病毒株進(jìn)行攻毒。然后觀察這些小鼠的存活率。為了確定針對CCMV、HA和M2e蛋白的免疫反應(yīng)，所述樣品通過ELISA實(shí)驗(yàn)測定抗體滴度。權(quán)利要求1.生產(chǎn)用于人或動(dòng)物的流感疫苗的組合物的方法，其包含i)提供編碼重組衣殼融合肽的第一核酸，所述衣殼融合肽包含融合到流感病毒肽的植物病毒衣殼蛋白，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述衣殼融合肽；ii)組裝所述衣殼融合肽來形成病毒或病毒樣顆粒；iii)提供至少一種編碼至少一條衍生自流感病毒株的抗原蛋白或蛋白片段的第二核酸，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述抗原蛋白或蛋白片段；iv)分離并純化所述抗原蛋白或蛋白片段；和v)組合所述病毒或病毒樣顆粒和所述抗原蛋白或蛋白片段來形成能給與到人或動(dòng)物的組合物。2、權(quán)利要求l的方法，其中的分離抗原蛋白或蛋白片段偶聯(lián)到病毒或病毒樣顆粒。3、權(quán)利要求l的方法，其中的分離抗原蛋白或蛋白片段衍生自新出現(xiàn)的流感病毒株。4、權(quán)利要求l的方法，其中的衣殼融合肽包含衍生自保守流感病毒肽的流感病毒肽。5、權(quán)利要求4的方法，其中的保守流感病毒肽衍生自流感M2肽。6、權(quán)利要求5的方法，其中的M2肽選自Seq.ID.No.1-5或22-24。7、權(quán)利要求6的方法，其中的M2肽選自S叫.ID.No.3、22、23或24。8、權(quán)利要求1的方法，其中的植物病毒衣殼蛋白衍生自CCMV或CPMV植物病毒。9、權(quán)利要求8的方法，其中的植物病毒衣殼蛋白選自S叫ID.No.11-13。10、權(quán)利要求1的方法，其中的病毒或病毒樣顆粒不含有來源于宿主細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞壁的蛋白。11、一種組合物，該組合物包含i)重組衣殼融合肽，該衣殼融合肽包含融合到流感病毒肽的植物病毒衣殼蛋白，其中的衣殼融合肽進(jìn)行組裝來形成病毒或病毒樣顆粒，禾口ii)至少一條衍生自流感病毒的分離抗原蛋白或蛋白片段。12、權(quán)利要求ll的組合物，其中的分離抗原蛋白或蛋白片段偶聯(lián)到病毒或病毒樣顆粒。13、權(quán)利要求ll的組合物，其中的分離抗原蛋白或蛋白片段衍生自新*出現(xiàn)的流感病毒株。14、權(quán)利要求ll的組合物，其中的衣殼融合肽包含衍生自保守流感病毒肽的流感病毒肽。15、權(quán)利要求14的組合物，其中的保守流感病毒肽衍生自流感M2肽。16、權(quán)利要求15的組合物，其中的M2肽選自Seq.ID.No.1-5或22-24。17、權(quán)利要求16的組合物，其中的M2肽選自Seq.ID.No.3、22、23或24。18、權(quán)利要求11的組合物，其中的植物病毒衣殼蛋白衍生自CCMV或CPMV植物病毒。19、權(quán)利要求18的組合物，其中的植物病毒衣殼蛋白選自Seq.ID.No.11-13。20、權(quán)利要求ll的組合物，其中的病毒或病毒樣顆粒不含有來源于宿主細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞壁的蛋白。21、權(quán)利要求ll的組合物，其中的組合物進(jìn)一步包含免疫刺激分子。22、權(quán)利要求21的組合物，其中的免疫刺激分子包含CpG序列。23、選自Seq.ID.No.3、22、23或24的肽序列。全文摘要本發(fā)明提供了用作抵抗流感病毒的疫苗的組合物，以及生產(chǎn)該組合物的快速方法。所述組合物包括i、至少一條衍生自流感病毒的肽，其中的肽融合到衍生自植物病毒的衣殼蛋白上，形成重組衣殼融合肽和ii、至少一條分離的衍生自人或禽流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段。所述的分離的衍生自人或禽流感病毒的抗原蛋白或蛋白片段能被共價(jià)結(jié)合到重組衣殼融合肽的表面。文檔編號A61K39/145GK101227920SQ200680026505公開日2008年7月23日申請日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日發(fā)明者J·M·拉達(dá)姆,J·P·費(fèi)爾普斯,L·拉索霍娃,N·黨申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司