專利名稱：使用脈沖的電磁場(chǎng)治療來調(diào)節(jié)骨軟骨發(fā)育的方法
使用脈沖的電磁場(chǎng)治療來調(diào)節(jié)骨軟骨發(fā)育的方法 相關(guān)申請(qǐng)的交叉應(yīng)用本申請(qǐng)要求2005年6月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng) 60/687,430、 2005年6月23日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/693,490、 2006年3月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/782,462和2006年4月 7日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/790,128的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
與骨和軟骨相關(guān)聯(lián)的疾病和損傷對(duì)人群有很大的影響。單在美國 每年發(fā)生約5百萬次的骨折。這些中的約10%延遲愈合，并且在這些 中，150,000到200,000個(gè)不連合的骨折發(fā)生伴隨有喪失生產(chǎn)力和獨(dú)立 能力。在軟骨的情況下，嚴(yán)重的慢性形式的膝關(guān)節(jié)軟骨損害會(huì)導(dǎo)致關(guān) 節(jié)軟骨的更大的惡化，并且可能最終導(dǎo)致整膝關(guān)節(jié)的更換。每年，進(jìn) 行約200,000個(gè)整膝關(guān)節(jié)更換手術(shù)，人工關(guān)節(jié)一般僅僅維持10-15年， 導(dǎo)致類似的喪失生產(chǎn)力和獨(dú)立能力。而且，就作為對(duì)于約4400萬美國人的主要公共健康威脅的骨質(zhì) 疏松癥的發(fā)生率方面看來，骨折的發(fā)生率也預(yù)期保持較高。今天，在 美國，估計(jì)1000萬個(gè)人已經(jīng)有這種疾病，并且估計(jì)幾乎超過3400萬 人具有低骨量，這使他們具有增加的骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。在超過50 歲的人群中，兩個(gè)女性中就有一人、四個(gè)男性中就有一人在他們的余 生中發(fā)生與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)聯(lián)的骨折。骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致每年超過150 萬的骨折，包括300,000髖部骨折；700,000脊推骨折；250,000腕 骨骨折；以及300,000其它位置的骨折。用于骨質(zhì)疏松的髖部骨折的 估計(jì)全國直接費(fèi)用(醫(yī)院和療養(yǎng)院)在2002年為180億美元(全國 骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)年報(bào)，2002 )。當(dāng)前可以獲得幾種治療方法來治療頑固性骨折，諸如內(nèi)部和外部固定；骨移植或者移植代用品，包括去除礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、血小板提取物和骨基質(zhì)蛋白質(zhì)；以及生物物理刺激，諸如通過外部固定器或者超聲波和電磁場(chǎng)而施加的機(jī)械應(yīng)力。類似地，軟骨損傷的典型治療根據(jù)損傷和癥狀的嚴(yán)重性有休養(yǎng)和 其它的保守治療、用于整理和平滑被損壞的軟骨區(qū)域表面的小型關(guān)節(jié) 內(nèi)窺鏡檢查手術(shù)和其它的外科療法，諸如微裂縫、鉆孔和研磨。所有 這些都可以減輕癥狀，但是其益處通常僅僅是暫時(shí)的，特別是當(dāng)人的 損傷前的活動(dòng)水平保持不變時(shí)。骨和諸如軟骨等其它組織以生理上有益的方式來響應(yīng)電信號(hào)。被應(yīng)用到不連合部分和延遲連合部分的生物電刺激裝置在十九世紀(jì)60 年代首次形成，現(xiàn)在被應(yīng)用到骨和軟骨(Ciombor and Aaron， F卯, 爿rtA:/e C7/". 2005， (4): 579-93 )。當(dāng)前，它們已經(jīng)形成了市場(chǎng)并且在臨 床實(shí)踐中的角色已被全面接受。歸因于生物電刺激的不太公知的結(jié)果 是正的骨密度變化(Tabrah， 1990)和骨質(zhì)疏+》癥的預(yù)防(Chang， 2003 )。近來的報(bào)告提供了附加的證據(jù)用脈沖電磁場(chǎng)(PEMF)的 刺激大大地加速在牽拉骨生成期間形成骨(Fredericks, 2003)。當(dāng)前，用于骨修復(fù)的電療的臨床使用包括直接地植入到修復(fù)位置 的電極或者非侵入性電容或者電感耦合。經(jīng)由放置在骨修復(fù)位置的目 標(biāo)組織中的一個(gè)電極(陰極)和放置在軟組織中的陽極來施加直流 (DC) 。 5-100pA的DC電流足以刺激骨生成。所述電容耦合技術(shù)寸吏 用位于骨折位置的相對(duì)側(cè)上的外部皮膚電極。20-200Hz的正弦波通常 用于在修復(fù)位置中獲得l-100mV/cm的電場(chǎng)。電感耦合(PEMF)技術(shù)通過經(jīng)由一個(gè)或者兩個(gè)電線圏施加時(shí)變 的磁場(chǎng)而獲得時(shí)變的電場(chǎng)。感應(yīng)電場(chǎng)作為觸發(fā)機(jī)構(gòu)，其調(diào)節(jié)由許多生 長因素介導(dǎo)的骨修復(fù)的分子調(diào)節(jié)的正常過程。Bassett等人首先報(bào)告 PEMF信號(hào)可以使犬齒中的骨修復(fù)加速150%。骨修復(fù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@ 示使用直流增強(qiáng)了細(xì)胞增殖、鈣化和提高了機(jī)械強(qiáng)度。這樣的方法也 存在有造成軟骨損傷的可能。受傷的組織相對(duì)于正常組織具有電勢(shì)。在受傷位置測(cè)量的電信號(hào)(被稱為"損傷電勢(shì)"或者"損傷電流")僅僅是DCC(直流)，其隨著 時(shí)間緩慢地改變。骨折修復(fù)和神經(jīng)再生電勢(shì)變化一般在負(fù)電極附近比 通常要快，但是在正電極附近(在一些情況下，可能發(fā)生組織萎縮或 者壞死)比通常要慢。為此，大多數(shù)近來的研究著重于更高的頻率、 更復(fù)雜的信號(hào)(經(jīng)常不具有凈直流分量)。不幸的是，現(xiàn)在可以獲得的大多數(shù)電子治療裝置依賴于直接植入 電極或者整個(gè)電子儀器組件，或者依賴于穿過皮膚的電感耦合，其使 用產(chǎn)生時(shí)變磁場(chǎng)的線圏，由此在身體組織內(nèi)感應(yīng)弱的渦電流，這不能 有效地將所迷信號(hào)提供到組織，因此除了體積大的線閨之外，還需要 較大的信號(hào)發(fā)生器和電池組。在一方面需要手術(shù)和生物相容的材料以 及在另一方面要求過大的電路復(fù)雜性和輸入功率，這已經(jīng)使大多數(shù)這 樣的裝置的價(jià)格較高，并且也將這樣的裝置的使用局限于受過高度訓(xùn) 練的人員。因此，仍然需要通用的、成本低廉的裝置，其可以用于提 供生物電刺激以不同地調(diào)節(jié)骨軟骨組織的生長，以促進(jìn)適當(dāng)?shù)纳L和 愈合。發(fā)明內(nèi)容按照本發(fā)明的主要方面，并且廣義而言，本發(fā)明提供了一種用于 通過對(duì)正在生長的或者受損傷的骨或者軟骨組織施加電信號(hào)來調(diào)節(jié) 例如骨組織或者軟骨的生長或者修復(fù)的方法。本發(fā)明通過實(shí)現(xiàn)生物電信號(hào)的提供而克服了現(xiàn)有技術(shù)裝置和方 法的缺點(diǎn)，所述生物電信號(hào)被優(yōu)化為對(duì)應(yīng)于自然身體信號(hào)的所選特 征，導(dǎo)致加速的且更持久的愈合。在此所述的信號(hào)與自然信號(hào)的所選 特征一致，因此按照本發(fā)明的進(jìn)行電刺激的組織經(jīng)受最小的生理應(yīng) 力。另外，本發(fā)明是非侵入性的且成本低廉的，這使得可以期望對(duì)人 的多個(gè)應(yīng)用和單獨(dú)使用。而且，本方法提供了電刺激，其中，電信號(hào) 接近地模仿自然人體信號(hào)的所選特性。被刺激的組織因此受到最小的 應(yīng)力，大大促進(jìn)了生長和修復(fù)。與傳統(tǒng)的TENS類型的裝置(其旨在阻斷神經(jīng)系統(tǒng)中的疼痛沖動(dòng))相反，用于本發(fā)明方法的裝置以低于正常人的疼痛感覺的閾值電 平的刺激電平來操作，因此，大多數(shù)用戶在用于修復(fù)或者促進(jìn)骨的生 長的治療期間沒有任何感覺。在此所述的技術(shù)使用一類波形，其中一些是新的，其它的有已知 當(dāng)通過感應(yīng)線圏被應(yīng)用時(shí)對(duì)組織具有正生理效應(yīng)的，但是直到如今還 沒有顯示通過電極具有正生理效應(yīng)。雖然對(duì)于骨質(zhì)疏松癥治療當(dāng)前沒有批準(zhǔn)任何商業(yè)的生物電裝置， 但是本發(fā)明提供了一種有前途的候選者。如在此所示，可以有益地在 宏觀的水平(即普通的骨折)以及微觀的水平(即成骨細(xì)胞發(fā)育)上應(yīng)用獨(dú)特的脈沖電磁場(chǎng)(PEMF)波形模式。本發(fā)明的某些實(shí)施方案 將期望的PEMF波形的用途和應(yīng)用最大化例如，脊推骨、髖部和/ 或手腕是骨質(zhì)疏松骨折的最普通的位置，對(duì)于這樣類型的骨折，發(fā)明 人提供了簡單的、自粘的皮膚接觸電極片來作為電治療遞送栽體。這 樣的電極片的使用導(dǎo)致改善了在這樣的關(guān)鍵解剖位置的骨量。在微觀 水平上，本發(fā)明人已經(jīng)識(shí)別了優(yōu)化成骨細(xì)胞發(fā)育的特定PEMF波形和 頻率。如在示例中更詳細(xì)地所述(參見實(shí)施例l)，發(fā)明人證明了 PEMF信號(hào)增強(qiáng)了成骨細(xì)胞礦化和基質(zhì)產(chǎn)生，并且所述信號(hào)也賦予了結(jié)構(gòu)特 征。本發(fā)明人也表明其它的PEMF信號(hào)增強(qiáng)了細(xì)胞增殖和伴隨地增加 了骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)(BMP)。雖然可以在本發(fā)明中使用脈沖段和連 續(xù)的電信號(hào)，但是連續(xù)而不是脈沖段的信號(hào)的施加對(duì)增殖和礦化提供 了更顯著的影響。本發(fā)明的電信號(hào)可以用于促進(jìn)諸如骨和軟骨等結(jié)構(gòu)組織的修復(fù) 和生長。但是，這樣的系統(tǒng)和方法不必被限制為用于完整的有機(jī)體， 因?yàn)殡娮又委煵ㄐ我部梢杂绊懛蛛x的細(xì)胞或者組織培養(yǎng)(已經(jīng)觀察到 適當(dāng)?shù)碾姶碳ふ{(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝、分泌和復(fù)制的速度)。電信號(hào)一般 可應(yīng)用到其它的結(jié)締組織，諸如皮膚、韌帶、腱等。在此所述的電信 號(hào)可以用于刺激其它的組織，以提高組織的修復(fù)并且促進(jìn)組織的生長 以用于移植目的。例如，可以在適當(dāng)?shù)纳L介質(zhì)中使用本發(fā)明的裝置 和波形來治療分離的皮膚細(xì)胞，以提高在制備組織培養(yǎng)的、自生的皮膚移植材料中的細(xì)胞增殖和分化。以類似的方式，這些生物電信號(hào)可 以被直接地施加到受傷的或者有病的皮膚組織以增強(qiáng)愈合。向骨折處外源性地提供生物電信號(hào)和祖細(xì)胞(諸如骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC))可以導(dǎo)致頑固性骨折的愈合和修復(fù)增強(qiáng)。這兩個(gè)因素(生 物電和細(xì)胞募集)事實(shí)上是自然愈合過程的部分。對(duì)于這些應(yīng)用，使 用電治療系統(tǒng)在受傷后立即施加使用在此所述的波形的電刺激。該電 治療系統(tǒng)可以是輕質(zhì)的、小型的、便攜的。可以在受傷后幾天內(nèi)應(yīng)用 電刺激和通常的基于細(xì)胞的治療?？梢栽谑軅蟾L的時(shí)間點(diǎn)增加自 體固有的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了用于誘發(fā)再生自然組織而不是疤痕組 織的骨修復(fù)或發(fā)育的方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于通過對(duì)骨組織施加新的電信 號(hào)而調(diào)節(jié)骨組織的增殖和分化以促進(jìn)骨修復(fù)和發(fā)育的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新的培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括將PEMF用 于骨組織過程。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供結(jié)合電刺激的祖細(xì)胞的新培養(yǎng)系統(tǒng).本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于生長自體固有的和異源的組織 以在其需要時(shí)移植到宿主中的試劑盒。本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供用于在生物體外或者在體內(nèi)電刺激 非定向祖細(xì)胞以誘發(fā)增殖或者分化的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于調(diào)節(jié)軟骨、骨或其它結(jié)締組織的 生長的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于調(diào)節(jié)骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)的表達(dá) 和釋放的方法。通過閱讀下面對(duì)于所公開的實(shí)施方案和所附的權(quán)利要求的詳細(xì) 說明，本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯然。


圖l是用于刺激骨折愈合的波形的示意圖。圖2a提供了示出用于促進(jìn)骨的礦化的、基于感應(yīng)的線圏波形并且適于皮膚施加的脈沖模式的有效電信號(hào)波形的圖示。圖2b提供了示出用于促進(jìn)骨的礦化的連續(xù)模式的有效電信號(hào)波 形的圖示。圖3a提供了示出用于促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖的脈沖模式的有效電信 號(hào)波形的圖示。圖3b提供了示出用于促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖的連續(xù)模式的有效電信號(hào)波形的圖示。圖4提供了示出用于提供電流的實(shí)驗(yàn)室空間的圖示。圖5提供了示出在上清液(左)和膜(右)中的堿性磷酸酶中的改變的條形圖。圖6提供了示出在骨鈣蛋白和鈣沉積物隨著信號(hào)"B"的改變的條形圖；圖7提供了示出在存在和不存在L-NAME的情況下作為PEMF 信號(hào)波形的對(duì)照士標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分比的、由DNA測(cè)量的細(xì)胞數(shù)量上的 提高的條形圖。L-NAME單獨(dú)被作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。圖8提供了使用用于在體外應(yīng)用中的機(jī)械和電子刺激的組合的 設(shè)置的示意圖。本發(fā)明的詳細(xì)描述下面的說明包括執(zhí)行本發(fā)明的最佳的當(dāng)前考慮的方式。這個(gè)說明 用于說明本發(fā)明的一般原理，不應(yīng)當(dāng)當(dāng)作限定。在此所述的參考文獻(xiàn) 的文本通過引用被整體包含在此，其中包括美國臨時(shí)申請(qǐng)60/687,430、 60/693，4卯、60/782,462和60/790,128。應(yīng)當(dāng)理解，在此所述的本發(fā)明的當(dāng)前的體外應(yīng)用也可以被外推到 體內(nèi)應(yīng)用、治療等中。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以理解，使用減少的制 劑和體外模型而開發(fā)的技術(shù)可以最終用于體內(nèi)的應(yīng)用?？梢詮淖泽w外 或者動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)得到的劑量響應(yīng)曲線外推體內(nèi)的電子刺激的 有效值和范圍。本發(fā)明使得能夠提供生物電信號(hào)，所述生物電信號(hào)被優(yōu)化為對(duì)應(yīng)于自然身體信號(hào)的所選擇的特性，產(chǎn)生加速的和更永久的愈合。在此 所述的信號(hào)唯一地符合自然信號(hào)的所選擇的特征，因此，按照本發(fā)明 進(jìn)行電刺激的組織經(jīng)受了最小的生理應(yīng)力。另外，本發(fā)明是非侵入性 的和成本低廉的，使得能夠期望對(duì)于人的多次應(yīng)用和單獨(dú)使用。骨重塑骨是人體的最硬的組織之一。作為人體骨骼的主要成分，其不僅 支持肌肉結(jié)構(gòu)，而且保護(hù)在顱腔和胸腔內(nèi)的重要器官。骨由在細(xì)胞間 的鉤化材料(骨細(xì)胞外基質(zhì))和不同的細(xì)胞類型(成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞 和破骨細(xì)胞)構(gòu)成。細(xì)胞外基質(zhì)由有機(jī)和無機(jī)成分構(gòu)成。所述有才幾成 分包括細(xì)胞、膠原蛋白、蛋白多糖、透明質(zhì)烷和其它蛋白質(zhì)、磷脂和 生長因子。骨的硬度來自礦化的無機(jī)成分，其主要是以羥磷灰石Ca1()(P04)6(OH)2形式結(jié)晶的鈣和磷。膠原蛋白和羥磷灰石的組合使得 骨具有堅(jiān)硬和剛性特性。從間充質(zhì)來源的祖細(xì)胞衍化出成骨細(xì)胞，并且所述成骨細(xì)胞被分 布在正在出現(xiàn)的骨基質(zhì)旁邊的表面上，并且一個(gè)接一個(gè)地排列。成骨 細(xì)胞的主要功能是確立和發(fā)育骨基質(zhì)，并且在基質(zhì)礦化中起作用。當(dāng) 成骨細(xì)胞被嵌入骨基質(zhì)的陷窩中時(shí)，成骨細(xì)胞被稱為骨細(xì)胞，所述成 骨細(xì)胞采用略微不同的形態(tài)，保持與其它骨細(xì)胞的接觸。破骨細(xì)胞是 更大的多核細(xì)胞，其包含降血鈣素和整聯(lián)蛋白的受體和其它特殊的結(jié) 構(gòu)特征。破骨細(xì)胞的主要功能是再吸收鈣化的骨基質(zhì)的無機(jī)和有機(jī)成 分。骨重塑是骨組織的重吸收和形成的基本的和高度綜合的過程，其 導(dǎo)致具有礦化基質(zhì)的更新的精確地平衡的骨質(zhì)。上述可更新的過程能 夠?qū)崿F(xiàn)，而不損害骨骼的整體解剖架構(gòu)。內(nèi)部更新的這個(gè)連續(xù)過程通 過響應(yīng)于應(yīng)力連續(xù)修復(fù)微裂紋和改變而保證骨保持用于真實(shí)再生的 能力和維持骨完整性。成人骨骼的架構(gòu)和構(gòu)成處于永久的動(dòng)態(tài)平衡。 重塑也提供了用于響應(yīng)于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的要求而釋放鈣的手段。影響骨 重塑的條件包括機(jī)械刺激(諸如固定或者失重狀態(tài))、電流或者電磁場(chǎng)(諸如電容耦合的電場(chǎng)或者脈沖的電磁場(chǎng))、激素改變或者響應(yīng)于 特定的炎癥。骨重塑通過一系列配合的活動(dòng)周期而發(fā)生，所述活動(dòng)周期包括激 活、重吸收、逆轉(zhuǎn)、形成和靜止步驟。激活的特征為存在襯細(xì)胞的薄 層。然后，造血系統(tǒng)的循環(huán)的單核細(xì)胞開始遷移到激活區(qū)域，并且結(jié) 合在一起以形成破骨細(xì)胞。激活后是重吸收，其中，激活的破骨細(xì)胞挖開骨性表面。這個(gè)步驟通常持續(xù)約2-4周。逆轉(zhuǎn)在重吸收之后發(fā)生， 并且持續(xù)9天，在此期間，在重吸收凹陷中存在失活的前成骨細(xì)胞。 下一個(gè)步驟是形成，并且需要約3-4月。在這個(gè)階段期間，激活的成 骨細(xì)胞重新填充挖空區(qū)域。骨重塑的最后階段是靜止，其間，不發(fā)生 重塑行為，直到開始下一個(gè)重塑周期。理想地，骨填充的數(shù)量必須等 于重吸收的數(shù)量，并且不丟失骨質(zhì)量。波形本發(fā)明提供了電信號(hào)和波形，所述波形使得能夠在生理組織上進(jìn) 行特定的行為。這樣的波形在體外和體內(nèi)應(yīng)用中都是有效的。在此示 出骨軟骨組織以不同地響應(yīng)于顯著不同的頻率和波形。所特別關(guān)心的是包括交變的矩形或者準(zhǔn)矩形的脈沖的信號(hào)，所述 脈沖具有相反的極性和不同的長度，由此形成矩形、不對(duì)稱的脈沖序列。特定長度的脈沖已經(jīng)被理論化為激活特定的細(xì)胞生化機(jī)制，特別 是將4丐或者其它小的、移動(dòng)的、帶電的物質(zhì)結(jié)合到在細(xì)胞膜上的受體， 或者它們的(通常較慢的)解除結(jié)合。具有相反極性的這樣的序列的 多個(gè)部分可以平衡來獲得大致凈零的電荷，并且所述序列可以或者是 連續(xù)的或者被劃分為由大致零信號(hào)的間隔隔開的多個(gè)脈沖段。以脈沖 段模式施加的刺激具有與作為連續(xù)序列施加的那些類似的作用，但是 它們的行為可能由于在零信號(hào)期間將帶電的物質(zhì)從受體解除結(jié)合的 (理論上)能力而在細(xì)節(jié)上不同，并且所需要的施加時(shí)間表也不同。 圖1示出了對(duì)于刺激骨和軟骨組織有效的基本波形20的示意圖， 其中，線22表示在連續(xù)模式中的波形，線24表示在脈沖段模式中的較長時(shí)標(biāo)上的同一波形。電平26和28表示電壓或者電流的兩個(gè)不同 的特征值，并且間隔30、 32、 34和36表示在特定的轉(zhuǎn)換之間的定時(shí)。 電平26和28通常被選擇使得當(dāng)在波形的全周期上被平均時(shí)，沒有凈 直流(D.c.)分量，雖然如果期望的話可以選擇電平26和28以產(chǎn)生 凈的正或者凈的負(fù)直流分量。在實(shí)際應(yīng)用中，諸如20的波形通常在 下述方面被修改所有的電壓或者電流向在電平26和28之間的某個(gè) 中間電平以指數(shù)衰減，并且衰減時(shí)間常數(shù)優(yōu)選地大于間隔34。結(jié)果被 表示為線38。在此所述的波形一般具有兩個(gè)信號(hào)分量相對(duì)于彼此被 示出為間隔30的較長分量和被示出為間隔32的較短分量。在短和長信號(hào)分量長度中的變化對(duì)被刺激的組織產(chǎn)生特定的效 果。在本發(fā)明中所關(guān)心的脈沖長度可以被定義如下(以長度增加的順 序)長度a:在持續(xù)時(shí)間上在5和75微秒之間，優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí) 間上在10和50微秒之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上在20和35微秒 之間，最優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上為約28微秒。長度P:在持續(xù)時(shí)間上在20和100微秒之間，優(yōu)選的是在持續(xù) 時(shí)間上在40和80之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上在50和，微秒之 間，最優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上為約60微秒。長度y:在持續(xù)時(shí)間上在100和1000微秒之間，優(yōu)選的是在持 續(xù)時(shí)間上在150和800微秒之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上在180和 500微秒之間，最優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上為約200微秒。長度8:在持續(xù)時(shí)間上超過l毫秒，優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上在5 和100毫秒之間，更優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上在10和20毫秒之間，最 優(yōu)選的是在持續(xù)時(shí)間上為約13毫秒。在第一實(shí)施方案中，電信號(hào)具有長度a的較短分量和長度P的較 長分量因此，在最優(yōu)選的每個(gè)類型的脈沖長度(分別是28微秒和 60微秒)下具有約11.4 KHz的頻率。由交替的長度a和長度p的脈 沖構(gòu)成的信號(hào)在此被稱為"類型a"信號(hào)，它們的波形被稱為"類型a" 波形。在圖2a中示出了作為連續(xù)的脈沖序列而施加的"類型a"信號(hào)。諸如此的信號(hào)有益于促進(jìn)組織樣本的增殖或者多種生理或者治療應(yīng) 用的培養(yǎng)。在脈沖段模式中，在約0.5到500毫秒(優(yōu)選的是約50毫秒) 的脈沖段中接通"類型A，，波形，并且所述脈沖段以0.1-10 Hz或者優(yōu) 選約1 Hz重復(fù)。在圖2b中示出了這種類型的波形的一個(gè)示例。在第二實(shí)施方案中，所述電信號(hào)具有長度a的較短分量，和具有 長度y的較長分量因此在最優(yōu)選的每個(gè)類型的脈沖長度(分別是28 微秒和200微秒)下具有約4.4KHz的頻率。由交替的長度a和長度 y的脈沖構(gòu)成的信號(hào)在此被稱為"類型B"信號(hào)，它們的波形被稱為"類 型B"波形。在先前美國專利申請(qǐng)第10/875,801號(hào)(公開第 2004/0267333號(hào))中描述了這樣的波形。在圖3a中示出了作為連續(xù) 的脈沖序列而施加的"類型B，，信號(hào)。諸如此的信號(hào)有益于疼痛緩解和 促進(jìn)骨愈合，并且也刺激體外的成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu)的 發(fā)育，并且應(yīng)用到手術(shù)骨修復(fù)和移植材料的領(lǐng)域。在脈沖段模式中，在約1到50毫秒(優(yōu)選的是約5毫秒)的脈 沖段中接通"類型B，，波形，并且所述脈沖段以5-100 Hz或者優(yōu)選約 15Hz重復(fù)。在圖3b中示出了這種類型的波形的一個(gè)示例。這個(gè)波形 在形狀和幅度上類似于由在不連合的骨刺激產(chǎn)品(例如EBI MEDICA， INC. (Parsippany，紐約州)和ORTHOFIX， INC. (McKinney，德克 薩斯州))普通使用的典型的感應(yīng)(線圏)電磁裝置提供的有效電流。在第三實(shí)施方案中，電信號(hào)具有長度p的較短分量，和具有長度 y的較長分量因此在最優(yōu)選的每個(gè)類型的脈沖長度(分別是60微秒 和200微秒)下具有約3.8KHz的頻率。由交替的長度p和長度y的 脈沖構(gòu)成的信號(hào)在此被稱為"類型C"信號(hào)，它們的波形被稱為"類型 C"波形。諸如此的信號(hào)有益于促進(jìn)骨再生、成熟和鈣化。在脈沖段模式中，在約1到50毫秒(優(yōu)選的是約5毫秒)的脈 沖段中接通"類型C，，波形，并且所述脈沖段以5-100 Hz或者優(yōu)選約 15 Hz重復(fù)，這與"類型B"很相似。這個(gè)波形在形狀和幅度上類似于 由在不連合的骨刺激產(chǎn)品(例如ORTHOFIX，INC^(McKinney，德克薩斯州)、PhysioStim Lite ,被設(shè)計(jì)來促進(jìn)脊柱融合的愈合)普通 使用的其它典型的感應(yīng)(線圏)電磁裝置提供的有效電流。在第四實(shí)施方案中，電信號(hào)具有長度y的較短分量，和長度3 的較長分量因此在最優(yōu)選的每個(gè)類型的脈沖長度(分別是200^:秒 和13微秒)下具有約75 Hz的頻率。由交替的長度Y和長度S的脈 沖構(gòu)成的信號(hào)在此被稱為"類型D"信號(hào)，它們的波形被稱為"類型D" 波形。諸如此的信號(hào)特別有益于促進(jìn)軟骨愈合和骨鈣化，并且治療或 者逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎。雖然在廣義上類似于如通過引用而被 并入在此的美國專利#5，273，033的圖3中所示的由BIONICARE MEDICAL TECHNOLOGIES INC. 810-1000^通過電極提供的信 號(hào)，但是"類型D"信號(hào)在波形形狀上實(shí)質(zhì)不同(其是矩形的而不是指 數(shù)的)，并且其優(yōu)選是電荷平衡的。在脈沖段模式中，在至少100毫秒(優(yōu)選是約1秒)的脈沖段中 接通"類型D，，波形，并且以一秒或者更大的間隔重復(fù)脈沖段。信號(hào)強(qiáng)度也可以不同事實(shí)上，更強(qiáng)的信號(hào)經(jīng)常不比更弱的信號(hào) 有益，并且有時(shí)還更差。對(duì)于典型的信號(hào)(諸如圖l的信號(hào))，峰值 效用通常位于每平方厘米1和10微安(jiA/cm2)之間的某個(gè)位置， 并且交叉點(diǎn)在約這個(gè)值的100倍處。在這個(gè)點(diǎn)之外，所述信號(hào)可以緩 慢愈合或者可能本身引起進(jìn)一步的損傷。以連續(xù)模式而不是脈沖段模式運(yùn)行的電信號(hào)或者波形與本方法 特別相關(guān)。(例如圖2a或者3a)。連續(xù)地運(yùn)行的信號(hào)具有與脈沖段 信號(hào)類似的效果，但是可能需要不同的遞送時(shí)間表來實(shí)現(xiàn)類似的結(jié) 果。對(duì)于用于本發(fā)明的方法的波形，典型的所施加的平均電流密度在 每平方厘米0.1和1000孩i安之間，優(yōu)選地在每平方厘米0.3和300孩走 安之間，更優(yōu)選地在每平方厘米1和100孩i安之間，最優(yōu)選地在每平 方厘米10微安，結(jié)果導(dǎo)致在典型的身體組織中，電壓梯度的范圍分 別在每平方厘米0.01和1000之間、0.03和300之間、0.1和IOO之間、 1和IO微安之間。所述獨(dú)立的接近方波的信號(hào)與長正分段和短負(fù)分段異步，或者反之亦然。所述正負(fù)部分平衡以獲得零凈電荷，或者可選 地可以與在脈沖尾部的均衡脈沖電荷不平衡，以提供在作為整體的波 形上的零凈電荷平衡。由皮膚電極提供的這些波形使用連續(xù)的矩形或 者近似矩形的波形，而不是正弦的或者強(qiáng)指數(shù)衰減的波形。在通過引用而整體被并入在此的、所公開的美國專利申請(qǐng)10/875,801 (公開號(hào) 2004/0267333 )中公開了本發(fā)明的方法中可用的其它波形。如上所述的電信號(hào)可以在需要治療時(shí)在間歇的治療間隔或者在 一天中連續(xù)地施加到細(xì)胞、生物組織或者個(gè)人。治療間隔在此被定義 為以脈沖段或者連續(xù)模式施加波形的時(shí)間間隔。治療間隔可以是在持 續(xù)時(shí)間上為約10分鐘到約4小時(shí)、在持續(xù)時(shí)間上為約30分鐘到約2.5 小時(shí)或者在持續(xù)時(shí)間上為約1小時(shí)。治療間隔可以每天發(fā)生約l到100 次?？梢詫?duì)于每種情況調(diào)整治療間隔的持續(xù)時(shí)間和頻率，以獲得有效 數(shù)量的電刺激來促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、骨生長、發(fā)育或者修復(fù)。 所述參數(shù)被調(diào)整以確定最有效的治療參數(shù)。信號(hào)不必然在治療間隔上要求長的持續(xù)時(shí)間，雖然如果期望的話 可以使用24小時(shí)的施加。通常，為了獲得生物效果，需要30分鐘(一 天重復(fù)幾次)?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)手段(諸如細(xì)胞計(jì)數(shù)、核酸或者蛋白質(zhì) 合成的增加)來測(cè)量體外細(xì)胞增殖。也可以測(cè)量(mRNA和蛋白質(zhì)合 成)基質(zhì)蛋白質(zhì)(膠原蛋白類型I、 III和IV)以及生長因子和細(xì)胞 因子(諸如TGF-B、 VEGF、 SLPI、 FN、 MMP)的上調(diào)和下調(diào)?？?以通過損傷的治愈率或者通過測(cè)量骨質(zhì)密度來確定體內(nèi)效果。用于骨 組織的增殖、分化或者礦化的其它診斷方法對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員 是顯然的。在一個(gè)實(shí)施方案中，依序使用促進(jìn)增殖和促進(jìn)分化的信號(hào)。這種 波形的組合用于提高細(xì)胞數(shù)量，因此促進(jìn)細(xì)胞的分化。作為示例，所 述依序使用增殖和分化信號(hào)可以用于促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，因此促進(jìn) 將成骨細(xì)胞分化為產(chǎn)生礦物質(zhì)的骨細(xì)胞，其促進(jìn)骨的礦化，或者反之 亦然。例如，可以使用一個(gè)治療范例，其中，首先在體外或離體向細(xì) 胞群施加促進(jìn)增殖的A型信號(hào)達(dá)到幾個(gè)小時(shí)、幾天或者幾周，然后將所述促進(jìn)增殖的信號(hào)替換為促進(jìn)礦化的B型信號(hào)達(dá)到幾個(gè)小時(shí)、幾天 或者幾周，直到已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了骨礦化。所產(chǎn)生的組織可以然后被移植以 有益于病人。也可以將兩種信號(hào)同時(shí)施加以同時(shí)促進(jìn)增殖、分化和礦 化。可以通過皮膚電極或者電化學(xué)連接來提供所述電信號(hào)。可以以商 業(yè)方式獲得皮膚電極，其大小諸如l1/〃12、 2x3V4和2x2英寸，其分 別可能有益于施加到脊柱、髖部和臂部。這些可再用的電極是有益的， 因?yàn)樗鼈儾话z乳，并且還沒有顯示大的皮膚刺激。所述可再用電 極可以多次被使用；這也減少病人的費(fèi)用。這樣的電極可以包括電極 #214(l/5，，xl3，，) 、 #220(2，，x2，，)和#230(2"x3/5，，) ( KOALATY PRODUCTS , Tampa ，佛羅里達(dá)州)或者電極弁T2020(2，，x2")和 #T2030(2，，x3.5，，) (VERMED， INC , Bellows Falls,佛蒙特州)。使用皮膚電極來取代電磁線圍具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，皮膚電極更 有效。使用電極，僅僅必須產(chǎn)生將實(shí)際被發(fā)送到身體內(nèi)的信號(hào)，使用 線圈，因?yàn)榕c組織的不良電磁耦合，所置入的信號(hào)必須比在所述組織 中需要的強(qiáng)許多許多倍。這使得所需要的電極產(chǎn)生電路可能比線圏的 產(chǎn)生電路簡單得多，同時(shí)需要更少的功率來操作。其次，皮膚電極更 有利于用戶。皮膚電極具有至多需要提供等同的信號(hào)電平的線圏的重 量和體積的百分之幾。類似地，因?yàn)檩^好的耦合效率，可以使得用于 驅(qū)動(dòng)電極的信號(hào)發(fā)生器比用于線團(tuán)的信號(hào)發(fā)生器小得多和輕得多。在 短時(shí)間后，佩帶者幾乎注意不到它們?cè)谀抢?。第三，皮膚電極更經(jīng)濟(jì)。 不像線圏(其每個(gè)花費(fèi)幾百到幾千美元)那樣，電極是"可丟棄"物品， 通常成本小于l美元。而且，因?yàn)楦蟮男屎透唵?，與用于線圏 的相比較，用于驅(qū)動(dòng)它們的信號(hào)發(fā)生器和電池可以小和制造便宜。第 四，皮膚電極允許更簡單的電池結(jié)構(gòu)和更長的電池使用期限，這便利 了使用所述裝置的容易性和病人的順從性。最后，皮膚電極比電磁線 圏更通用。線圏必須被建立來匹配它們將被使用于的身體部分的幾何 特性，并且每個(gè)必須足夠大來環(huán)繞或者圍住要治療的部分。這表示， 要"覆蓋"身體，必須有許多許多不同的線圏大小和形狀，其中一些特別大。另一方面，利用電極，僅僅通過電極布置來確定電流分布，可 以容易在其間的全部體積來預(yù)測(cè)電流分布，因此，身體可能僅僅被"覆 蓋"幾個(gè)電極類型外加良好地選擇的方位的列表。刺激系統(tǒng)本發(fā)明也考慮包括細(xì)胞和用于向細(xì)胞提供電信號(hào)的刺激器的生 物系統(tǒng)。這樣的細(xì)胞可以包括但是不限于前驅(qū)細(xì)胞，諸如千細(xì)胞、非 定向祖細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、多能祖細(xì)胞、多向性祖細(xì)胞或者在分4匕的 其它階段的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可以是胚胎的、胎兒的或者成人的細(xì)胞， 并且可以從自體固有的或者同種異體的來源采集或者與其分離。在一 個(gè)實(shí)施方案中，使用增殖細(xì)胞，雖然也可以在在此所述的方法中使用 非增殖細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可以在體外，例如在組織培養(yǎng)物中被組合，用。移植的干細(xì)胞可以選擇性地被吸引到受傷或者疾病的位置，然后 被電刺激以增強(qiáng)愈合。按照本發(fā)明的方法和目的的刺激細(xì)胞培養(yǎng)物也需要用于同時(shí)向 許多培養(yǎng)孔提供均勻的波形而不干擾孵育過程或者引起污染的實(shí)用手段。在此提供用于使用用于信號(hào)施加的、特殊設(shè)計(jì)的電容耦合陽極化的電極系統(tǒng)來達(dá)到下述目的的裝置用于在孵育期間電刺激培養(yǎng) 物，所述培養(yǎng)物優(yōu)選地包含6個(gè)組織培養(yǎng)孔，它們被連接為多孔系統(tǒng)。 通過使用帶狀電纜附件，在孵化器的密封上的泄露被最小化，以保持 用于培養(yǎng)物的受控二氧化碳環(huán)境。在圖4中以部分示意的形式示出了典型的設(shè)置。例如在圖4所示的設(shè)置中，互連6個(gè)組織培養(yǎng)孔110a-110f，并 且每個(gè)孔在室端部包括由兩條15毫米和一條7.5毫米的直的導(dǎo)線分段 形成的電極140，所述兩條15毫米和一條7.5毫米的直的導(dǎo)線分段通 過回頭彎而結(jié)合，并且通過直角彎而連接到橋112的中央部分142。 在圖4中示出了 7個(gè)這樣的橋。電極140被定大小以適配Lab-Tek11 滑動(dòng)箱的端壁，所述滑動(dòng)箱測(cè)量尺寸為18x48毫米，其內(nèi)部具有典型的3毫米填充深度。這樣的電極的電容是約0.56微法。橋112a和U2g 不同在具有端孔螺旋144，每個(gè)端孔螺旋包含約15 cm的導(dǎo)線。結(jié)果 產(chǎn)生的在橋?qū)Ь€112a或者112g和對(duì)應(yīng)的銀電極104之間的電容是約 2.3微法。由固態(tài)的較為惰性的金屬形成的橋112a、 112b等在端孔106a 和106b之間電串聯(lián)室110a、 110b等。雖然在此示出了 6個(gè)室110a 到110f和七個(gè)橋112a到112g，但是可以使用任何其它方便的室數(shù)量 "n"和橋的數(shù)量"n+l"。另外，多個(gè)這樣的串聯(lián)的分組(每個(gè)由"n"個(gè) 室、"n+l"個(gè)橋和兩個(gè)端孔構(gòu)成)可以使用信號(hào)分布裝置(諸如電阻 器網(wǎng)絡(luò)以在分組之間分擔(dān)信號(hào)能量)來用于單個(gè)信號(hào)源100，這是電 子信號(hào)傳輸領(lǐng)域中公知的。所示設(shè)置的總的電阻抗(具有所述的12個(gè)室電極端、2個(gè)端孔 螺旋電極106和6個(gè)所述室)主要具有電容0.045微法外加約1萬歐 姆的電阻分量。在信號(hào)源100和端孔106a之間連接的串聯(lián)電阻器(未 示出)可以將所施加的電流調(diào)整到期望的電平，并且也"淹沒，，所迷串 聯(lián)的電抗的電容部分，例如，對(duì)于1M歐姆的電阻器，頻率響應(yīng)從5 Hz到3 Mhz在+/- 3dB內(nèi)是均勻的。如果期望的話，可以這樣用在放大的室110b中所示的探針來測(cè) 量在室中的信號(hào)能量分布。探針120被沉浸在介質(zhì)122中，并且被移 動(dòng)到一連串位置，優(yōu)選標(biāo)注矩形的網(wǎng)格，所述探針120由任何合理的 惰性金屬構(gòu)成，但是優(yōu)選由作為電極104a和104b的99.9%的純銀構(gòu) 成，其除了在它們的尖端之外被絕緣，并且這些尖端以已知和固定的 距離相間。在每個(gè)位置的差動(dòng)電壓被差動(dòng)放大器124 (諸如模擬裝置 AD522 )讀取，并且被發(fā)送到用于顯示或者記錄的示波器或者其它裝 置(一般地被指示為126)。結(jié)果被方便地表示為數(shù)字陣列，用于表 示在每個(gè)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度與整體平均值的比率，如在圖4的底部的放大的室110b再次所示?；蛘?，可以使用其它的手段，諸如彩色編碼或 者三雄圖形。如在圖4中的網(wǎng)格所示，在電極被布置在矩形室的窄端的情況下的信號(hào)分布通常相當(dāng)均勻，除了在緊鄰電極本身的小區(qū)域之外。當(dāng)切 斷的或者破裂的氧化物復(fù)原時(shí)，均勻性也隨著時(shí)間或者在介質(zhì)中或者在普通鹽水中改善。例如在圖4左下的平均值以上的讀數(shù)可能產(chǎn)生自 在切斷的導(dǎo)線端的不完全復(fù)原的氧化物。為了處理方便、最小化介質(zhì)蒸發(fā)和容易保持無菌性，在分組中的 所有的室、橋和端孔可以方便地被組配在硬玻璃板或者其它可以滅菌 的載體上，并且這些板的一個(gè)或多個(gè)一旦被組配則可以被圍在諸如硬 塑料箱之類的外部容器中。本發(fā)明也提供了新的刺激裝置，用于提供電信號(hào)以便促進(jìn)骨生長 或者修復(fù)。具體地，提供了新的無源電極系統(tǒng)，用于提供電信號(hào)。這 些電極系統(tǒng)耦合用于體外或者體內(nèi)應(yīng)用的時(shí)變電信號(hào)；并且替代傳統(tǒng) 的電解液橋技術(shù)(用于通過有利于電容耦合的感應(yīng)來提供PEMF類型 的信號(hào))。所述電極系統(tǒng)可以由諸如但是不限于下述的材料構(gòu)成陽 極化的金屬，諸如鈮、鉭、鈦、鋯、鉬、鎢和釩。鋁和不銹鋼共享這 樣特性，但是程度很低，因?yàn)樗鼈儽话入x子的溶液緩慢地侵蝕。 在可用的頻率(通常在約5Hz和3MHz之間，并且在電路改進(jìn)的情 況下，從小于約1Hz到超過約30MHz)，可忽略DC電流通過。鈮是自我鈍化(由此當(dāng)被暴露到氧氣和濕氣時(shí)形成薄但是很耐久 的表面氧化物層)的幾種金屬之一。這個(gè)過程可以被陽極化控制。一 般地，自我鈍化建立可靠的連接，而其它方法比較困難，但是，本設(shè) 計(jì)獨(dú)特地使用電容耦合來在電極中感應(yīng)電流，由此避免與其它金屬形 成電連接的困難。這種電極系統(tǒng)提供了可忽略的電解，并且沒有生理 上嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，也有益于體內(nèi)應(yīng)用。用于本發(fā)明的電極系統(tǒng)的導(dǎo)線是"自我保護(hù)的"，當(dāng)被暴露到濕氣 或者氧氣時(shí)形成非活性氧化物的薄的但是很耐久和緊密粘著的表面 層。如此形成的氧化物具有高的介電常數(shù)，并且氧化物的厚度大致均 勻，并且可以被密切地控制。保護(hù)性氧化物薄層允許所述金屬作為耦 合電容器，用于向具有均勻分布和可忽略的電解的培養(yǎng)介質(zhì)引入交流 (零凈電荷，或者ZNC)電信號(hào)。一般被指示為100的刺激器或者其它信號(hào)源通過導(dǎo)線、接線或者 通過任何其它方便的裝置102而被連接到一對(duì)較為惰性的金屬電極 104a和104b，它們被浸沒在端孔106a和106b中的導(dǎo)電液體中。這 些裝置提供了信號(hào)對(duì)于其要應(yīng)用到的培養(yǎng)室110a、 110b等的組件的 進(jìn)入點(diǎn)。電極104a和104b優(yōu)選使用純銀(99.9%純)，端孔106a和 106b中的液體優(yōu)選使用鹽(氯化鈉溶液)，因?yàn)樵谑褂弥?，氯?艮薄 層形成在界面上，并且通過可逆的電化學(xué)反應(yīng)便利了電流的通過。但 是，也可以使用其它的金屬和液體。橋112a、 112b等可以由任何較為惰性的金屬形成，只要所迷金 屬不是細(xì)胞毒性的。通常被用作惰性電極以用于生物液體的金屬是 銀、金、鉑和其它柏族金屬。不幸的是，它們成本高，可以允許甚至 催化在它們的表面的一些電化學(xué)反應(yīng)(特別是如果存在小的雜質(zhì)的 話)，并且這樣的反應(yīng)的生成物可能是細(xì)胞毒性的。由于這個(gè)原因，在本發(fā)明中優(yōu)選使用所謂的"自我保護(hù)"金屬的 組，所述金屬與水或者水溶液接觸，形成薄的、連續(xù)的、高度不可溶 解的和生理上惰性的表面氧化物層，其將所述金屬表面密封以免其它 的液體接觸。這個(gè)氧化物形成電信號(hào)傳遞系統(tǒng)和培養(yǎng)介質(zhì)之間的唯一 接觸。這樣的金屬包括鈮、鉭、鈦、鋯、鉬、鎢和釩。鋁和不銹鋼共 享這個(gè)屬性，但是是以較小的程度，因?yàn)樗鼈儽话入x子(幾乎所 有的生物液體都如此)的溶液緩慢地侵蝕。通過陽極化，可以增強(qiáng)在這樣的金屬上的氧化物形成，并且以密 切可控的方式來提高所述氧化物的厚度。均勻的氧化物厚度提供了金 屬表面每單位面積均勻的電容，于是得出在表面上的較為均勻的信號(hào) 強(qiáng)度，而幾乎與其在液體中的形狀無關(guān)。通過切割和形成而引起的在 氧化物中的小裂縫通過與所述液體的進(jìn)一步的反應(yīng)而迅速地愈合。本申請(qǐng)尤其優(yōu)選使用鈮，因?yàn)橛捎谕ㄟ^經(jīng)由陽極化產(chǎn)生的表面氧 化物(Nb205)中的光干涉形成的鮮艷和穩(wěn)定的顏色，它在珠寶中常 見，因此可以以合理的價(jià)格以方便的形式和多種常備的顏色來獲得 它。里奧格蘭德(Rio Grande )珠寶公司例如存儲(chǔ)了 20和22規(guī)格的圓形鈮導(dǎo)線，其被預(yù)先陽極氧化為"紫色"、"桃紅色"、"藍(lán)黑色"、"深 青色"、"綠色"和"金色"，每種顏色表示不同的氧化物厚度。所述導(dǎo)線容易被加工和形成為任何期望的電極形狀。在給出Nb20s的折射率 (ND = 2.30)及其介電常數(shù)Ur-41sJ的情況下，可以從光反射鐠 容易地測(cè)量所述氧化物厚度，并且可以計(jì)算結(jié)果產(chǎn)生的每單位面積的 電容或者導(dǎo)線長度。"紫色"導(dǎo)線具有最薄的氧化物，從420納米的峰 值反射率測(cè)量為48納米，因此對(duì)于22規(guī)格的"紫色"導(dǎo)線(直徑為0.644 厘米，里奧格蘭德目錄編號(hào)638-240)，電容被計(jì)算為每厘米導(dǎo)線長 度0.154微法。直接測(cè)量初始由于氧化物裂縫而給出非常高的讀數(shù)， 但是在鹽水中24小時(shí)后，所測(cè)量的電容穩(wěn)定在每厘米0.158微法，接 近預(yù)測(cè)值。橋112a、 112b等因此非常像傳統(tǒng)的鹽橋那樣電作用，除了不可 能有液體或者離子流通過它們，因此避免了在室之間或者在室和端孔 之間的可能的交叉污染。另外，避免了傳統(tǒng)鹽橋遇到的蒸發(fā)和可能的 泄露的問題以及操作瓊脂或者其它膠凝劑的不方便。因?yàn)樗鼈兪请娙?性的，因此所述橋阻擋直流，因此達(dá)到所述室的信號(hào)在相位之間電荷 平衡，去除了任何直流分量。優(yōu)選的是，與生長介質(zhì)接觸的所有的橋端具有相同的大致尺寸， 并且包含大致相同的導(dǎo)線長度，因此全部具有大致相等的電容，并且 靠著培養(yǎng)室(其本身優(yōu)選是矩形的)的窄端布置，如圖4中的放大的 室110b中所示。與在端孔中的液體接觸的橋端(例如在圖4中的橋 112a和112g的左端)如果期望的話可以被提供不同的形狀，以增加 接觸，降低電容，并且/或者更好地適配端孔(如果這些與培養(yǎng)室不同) 的大小和形狀。例如，當(dāng)使用圓形端孔時(shí)，在它們中浸入的橋端可以 方便地被形成為螺旋144，如圖4中所示。因此總之，本發(fā)明所考慮的生物系統(tǒng)包括下面的元件電子模擬 器、陽極化的金屬電極和細(xì)胞。用于這樣的系統(tǒng)中的適當(dāng)?shù)腜EMF信 號(hào)包括如例如在圖2或者3氧化氮產(chǎn)生。組織工程本發(fā)明的方法也可以用于組織工程應(yīng)用。可以結(jié)合生物相容的支 架使用本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)來培養(yǎng)細(xì)胞，以在體外或離體產(chǎn)生功 能組織，或者所述細(xì)胞被移植以在體內(nèi)形成功能組織。被移植的細(xì)胞 或者宿主細(xì)胞也可以被選擇性地移植或者吸引到受傷或者疾病位置， 然后被使用在此所述的電信號(hào)刺激以增強(qiáng)愈合或者修復(fù)。組織支架可 以由生物相容的自然聚合物、合成聚合物或者其組合被形成為具有大 致開放的架構(gòu)的非織的開放的細(xì)胞化的基質(zhì)，所述基質(zhì)提供了培養(yǎng)系 統(tǒng)內(nèi)的或者體內(nèi)的細(xì)胞浸潤的足夠空間，同時(shí)在將支架集成到宿主體 內(nèi)的目標(biāo)位置中期間，保持足夠的機(jī)械強(qiáng)度來承受由在所述支架內(nèi)的 細(xì)胞生長施加的收縮的、壓縮的或者拉伸的力。組織支架可以是硬結(jié) 構(gòu)，用于產(chǎn)生具有限定形狀的固態(tài)的三維機(jī)構(gòu)，或者，支架可以是半 固態(tài)的基質(zhì)，用于產(chǎn)生柔性組織。本發(fā)明的方法和培養(yǎng)系統(tǒng)包括使用由聚合物單獨(dú)、共聚物或者其 混合物制成的支架。所述聚合物可以是可生物降解的或者生物穩(wěn)定的 或者其組合。在此使用的"可生物降解的"材料是包含可以在生理?xiàng)l 件，包括酶促的或者化學(xué)鍵的水解分裂下被裂解的鍵。適當(dāng)?shù)淖匀痪酆衔锇ǖ遣幌抻诙嗵?，諸如海藻酸鹽、纖維素、右旋糖苷、支鏈淀粉(pullane)、聚透明質(zhì)酸、幾丁質(zhì)、聚(3-羥基 烷酸酯)、聚3-羥基辛酸酯和聚(3-羥基脂肪酸)。在本發(fā)明中也考 慮所述自然聚合物的化學(xué)衍生物，包括化學(xué)基團(tuán)的取代和/或添加(諸 如烷基、烯基、羥基化、氧化)以及本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟悉的其它 修改。也可以從諸如膠原蛋白、玉米蛋白、酪蛋白、明膠、谷蛋白和 血清白蛋白的蛋白質(zhì)中選擇所述自然聚合物。適當(dāng)?shù)暮铣删酆衔锇?但是不限于聚磷腈、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酯酰胺、聚氨基酸、聚酐、 聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚亞烷基、聚亞烷基甘醇、聚亞烷基氧化物、 聚亞烷基對(duì)苯二甲酸鹽、聚原酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卣代乙烯、聚酯、聚交酯、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚已內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、聚氨酯、苯乙烯異丁酯苯乙烯嵌段聚合物(SIBS )和共聚物及其組合。 可生物降解的合成聚合物是優(yōu)選的，并且包括但是不限于聚a-羥基酸，諸如聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(即 聚D,L-乳酸共-乙醇酸(PLGA))以及透明質(zhì)酸。FDA批準(zhǔn)聚a-羥 基酸用于人類臨床應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)注意，某些聚合物(包括多糖和透明質(zhì) 酸)是水溶性的。當(dāng)使用水溶性聚合物時(shí)，重要的是通過化學(xué)修飾(例 如通過使用交聯(lián)劑)使得這些聚合物呈部分地水不溶性的?？缮锝到獾木酆衔锘|(zhì)的優(yōu)點(diǎn)之一是可以將血管生成的和其 它的生物活性的化合物直接地并入所述基質(zhì)中，以便它們?cè)谒龌|(zhì) 在體內(nèi)降解時(shí)緩慢地被釋放。當(dāng)細(xì)胞聚合物結(jié)構(gòu)被血管化并且所述結(jié)構(gòu)降解時(shí)，細(xì)胞將按照它們的固有特性分化。包括營養(yǎng)素、生長因子、 分化或去分化(即，促使分化的細(xì)胞失去分化性能并且獲得例如增殖 等性能以及更多的一般功能)的誘導(dǎo)劑、分泌產(chǎn)物、免疫調(diào)節(jié)劑、炎 癥抑制劑、退化因子、生物活性化合物(可增強(qiáng)或允許淋巴網(wǎng)絡(luò)或神 經(jīng)纖維的向內(nèi)生長)、透明質(zhì)酸、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥物(由 諸:ft口 Collaborative Research, Sigma Chemical Co.等供應(yīng)商提供，并 且在告知有效劑量的情況下可以商購)、血管生長因子(例如血管內(nèi) 皮生長因子(VEGF) )、 EGF和HB-EGF等因子可以被并入基質(zhì)中 或與基質(zhì)組合而被提供。類似地，含有例如附著肽RGD(Arg-Gly-AsP) 的肽的聚合物可以被合成，以用于形成基質(zhì)。 試劑盒在本發(fā)明中還提供了試劑盒，其將電刺激器與生物相容的支架結(jié) 合，以支撐細(xì)胞生長并且將整合到被聯(lián)合的組織中。內(nèi)裝有電極的容 器可以被設(shè)置有試劑盒，電極可以由自鈍化材料或其它傳統(tǒng)的電極材 料制成。這些試劑盒可以可選地包括例如生長介質(zhì)等試劑以及生長因 子，以促進(jìn)細(xì)胞與支架的結(jié)合。包括在試劑盒中的支架可以被設(shè)計(jì)成 具有被固定于其表面的促進(jìn)生長的分子和粘合分子。這種試劑盒.可選 地與關(guān)于適當(dāng)使用和最佳化的使用說明被包裝在一起。直到細(xì)胞可以與試劑盒的其它元素結(jié)合而生成適當(dāng)?shù)慕M織之前， 細(xì)胞可以被設(shè)置在試劑盒中，以保護(hù)材料保存的形式。在一個(gè)具體實(shí) 施方式中，所提供的細(xì)胞是被低溫儲(chǔ)藏在液氮中或者是在諸如海藻酶 糖的存在下干燥的細(xì)胞。細(xì)胞可以是未分化的祖細(xì)胞，包括干細(xì)胞、 多能干細(xì)胞、多向性干細(xì)胞或定向祖細(xì)胞?？蛇x地，最終被分化的細(xì) 胞也可以被用于這些試劑盒。這些試劑盒可以被設(shè)計(jì)為制備用于例 如，但不限于，骨、軟骨、肌肉、腎、肝、神經(jīng)系統(tǒng)、肺、心、血管 系統(tǒng)等中任一器官系統(tǒng)的替換組織。細(xì)胞也可以從需要治療的病人獲取，以便從病人自己的組織基因 工程替換組織。使用病人自己的組織提供了一種生成移植組織的方 法，其減少了與組織排斥相關(guān)的并發(fā)癥。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了單純的電刺激之外，體外的電和機(jī)械刺激的組合可 能對(duì)某些方面有利。機(jī)械刺激可以包括拉伸負(fù)荷、壓縮負(fù)荷或剪切負(fù)荷。典型的裝置如圖8a到圖8e的剖面圖所示。在各種負(fù)荷的情況中，測(cè)試裝置都圍繞本領(lǐng)域所熟悉的任何一種 類型的培養(yǎng)孔或室200而安裝，該培養(yǎng)孔或室內(nèi)裝有介質(zhì)202,細(xì)胞 層204通常附著于底片或膜206，該底片或膜可以是或不是培養(yǎng)孔的 剛性機(jī)械底部208的一部分。電極210可以是如所描述的任意一種可 用的金屬，但優(yōu)選可自保護(hù)的金屬，更優(yōu)選陽極化處理的鈮，該電極 210以在整個(gè)介質(zhì)202中形成相對(duì)均勻的電流分布的方式被設(shè)置在室 200中。對(duì)于拉伸負(fù)荷而言，膜206在如圖8a中所示的培養(yǎng)孔或室200 中形成另外的或者"偽，，底部。膜206可以由任意的適當(dāng)柔性且彈性的 材料制成，細(xì)胞自行粘附于其上，該材料可以是例如經(jīng)過等離子蝕刻 的硅橡膠。管212用外接的泵或其它穩(wěn)定的或波動(dòng)的壓力或真空源216 連接膜206與剛性室底部208之間的空間214。壓力或真空源216的 間歇運(yùn)轉(zhuǎn)促使膜206上下彎曲，在膜中從而在附著于該膜的細(xì)胞層204 中形成間歇張力?？蛇x地，源216可以長期地幾乎不或完全不在膜20( 上施加壓力，這使得細(xì)胞204可以長滿未展開狀態(tài)的膜，然后施加一個(gè)不同的壓力，從而例如在培養(yǎng)生長中的一個(gè)點(diǎn)上拉伸膜206，細(xì)胞 在該點(diǎn)上剛好實(shí)現(xiàn)融合并且建立起縫隙連接的接觸。對(duì)于壓縮負(fù)荷而言，不同的是，培養(yǎng)孔或室200用蓋220密封并 且直接連接于如圖8b所示的壓力源216。源216在介質(zhì)202中形成穩(wěn) 定的或波動(dòng)的液靜壓，從而將該液靜壓直接地施加給細(xì)胞層204。作為用于壓縮負(fù)荷的一個(gè)可選裝置，管212和壓力源216被取消 并且室蓋220采用可移動(dòng)的活塞的形狀，穩(wěn)定的或變動(dòng)的壓力可以通 過該室蓋直接施加給介質(zhì)202，從而施加給細(xì)胞204，如圖8c所示。對(duì)于剪切負(fù)荷而言，不同的是，培養(yǎng)孔200通過兩根管212a和 212b連接于壓力源216，介質(zhì)202通過該兩根管循環(huán)流動(dòng)，如圖8d 所示。該流動(dòng)可以是在一個(gè)單獨(dú)方向上恒定的，間歇的，或是振蕩的。 各管優(yōu)選裝配有隔板220，以獲得如通過箭頭222總體表示的更均勻 的流。隔板220可以與所示電極210分開地制成，或者可選地，電極 可以被穿孔或另外制成不連續(xù)的，以便自身形成隔板。介質(zhì)202的移 動(dòng)和其與細(xì)胞層204的摩擦產(chǎn)生所需的剪切負(fù)荷。作為用于提供剪切負(fù)荷的備選裝置，用移動(dòng)的葉輪230代替管 212a和212b以及壓力源216，該葉輪保持介質(zhì)202相對(duì)于細(xì)胞層204 移動(dòng)(如箭頭232總體表示)。葉輪230可以采用幾種形式中的任何 一種，但是可以有利地采用如圖8e所示的圓柱形，其中室200的剛 性底部208采用大致相同的形狀，并且與葉輪表面保持相對(duì)一致的間 隔。因此僅僅通過保持葉輪230在恒定速度下旋轉(zhuǎn)，使介質(zhì)202以一 穩(wěn)定速度連續(xù)地掃過細(xì)胞204。或者，改變?nèi)~輪230的速度可以改變 流動(dòng)速度，從而改變剪切負(fù)荷的水平。電極210未示出，因?yàn)樗鼈兛?以位于該配置中的多個(gè)位置上。但是，優(yōu)選地，剛性室底208和葉輪 230自身由適當(dāng)?shù)碾姌O金屬制成，更優(yōu)選由自保護(hù)金屬制成，最優(yōu)選 由陽極化的鈮制成，并且它們自身被用作電極。骨生長的分化調(diào)節(jié)如上所述的本發(fā)明的波形在用于促進(jìn)體內(nèi)骨組織生長和修復(fù)的方法中也是有用的。如上所述，具有A類波形的刺激可提高細(xì)胞增殖。 A類波形也導(dǎo)致用于促進(jìn)分化的骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)的增加。在一個(gè)實(shí) 施方案中，使用A類或在更低程度上使用B類電信號(hào)可實(shí)現(xiàn)BMP-2 和BMP-7產(chǎn)量的增加。對(duì)適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)組織愈合或形成組織移植物而 言，該效果是高度有價(jià)值的，它提供了增強(qiáng)生成足夠組織的方法。對(duì) 提供足夠的可滲透入用于組織工程目的的聚合物支架的細(xì)胞量而言， 該信號(hào)也是有價(jià)值的。在另一實(shí)施方案中，如體外試驗(yàn)所示，體內(nèi)刺 激提供了成骨細(xì)胞的增殖和分化，以增加用于礦化的成骨細(xì)胞數(shù)量。 細(xì)胞數(shù)量上的這種增加提供了用于在通過電刺激發(fā)育或再生骨時(shí)填 入間隙或孔的方法。由A類波形誘導(dǎo)的通過增殖生成的細(xì)胞可以^皮立 即使用或利用傳統(tǒng)的細(xì)胞儲(chǔ)存方法進(jìn)行保存直至將來需要時(shí)。用B類波形的刺激在較小程度上促進(jìn)增殖，并且具有不同于A 類波形的作用。由B類波形促進(jìn)的作用包括，但不限于，礦化作用、 細(xì)胞外蛋白質(zhì)生成、以及基質(zhì)機(jī)化。B類波形的作用也是有價(jià)值的， 可提供增強(qiáng)新骨組織的礦化步驟和骨化作用的方法。在一個(gè)實(shí)施方案 中，用B類波形刺激發(fā)育或再生骨組織，以增強(qiáng)礦化作用速率。已經(jīng) 有人提出，B類波形可以通過鈣/鈣調(diào)蛋白途徑并且通過G蛋白質(zhì)偶 連受體或機(jī)械感受器對(duì)骨細(xì)胞的刺激而進(jìn)行作用(Bowler, Front Biosci， 1998，3:d769-780; Baribault et al， Mol Cell Biol， 2006， 26(2):709-717)。這樣，還提供了調(diào)節(jié)鈣/鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的反應(yīng)活性以 及利用電刺激的G蛋白質(zhì)偶連受體或機(jī)械感受器的方法。這些細(xì)胞通 道和受體的調(diào)節(jié)對(duì)促進(jìn)體外或體內(nèi)骨組織的生長和修復(fù)都是有價(jià)值 的。用C類波形的剌激可促進(jìn)骨再生、成熟以及鈣化。這些波形也 是有價(jià)值的，并且提供了增強(qiáng)新骨組織的礦化步驟和骨化作用的方 法。用D類波形的刺激可促進(jìn)軟骨發(fā)育和愈合以及骨鈣化，對(duì)治療 或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎是有用的。這些波形的應(yīng)用包括體內(nèi) 應(yīng)用，例如修復(fù)損壞的軟骨，增加患有骨質(zhì)疏松癥的病人的骨密度；以及例如與軟骨的組織工程相關(guān)的體外應(yīng)用。還提供了組合或順次使用本申請(qǐng)中所述的波形的方法，以開發(fā)可 對(duì)骨軟骨組織的發(fā)育或再生產(chǎn)生具體生物效果的治療方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，患有骨障礙的病人的骨折可以用信號(hào)治療， 以治愈骨折然后加固骨。作為該實(shí)施方案的非限制性實(shí)施例，患骨折的骨質(zhì)疏松病人可以通過首先用A類信號(hào)的刺激進(jìn)行治療，以促進(jìn)生 長因子的增殖和釋放，然后用B類波形，以促進(jìn)在修復(fù)位置上的骨密 度增加，從而增加骨質(zhì)量密度和防止再骨折。在另一實(shí)施方案中，可以將本申請(qǐng)中所述的波形的兩類或多類組 合用于促進(jìn)骨軟骨組織的相繼增殖、分化以及礦化。作為該實(shí)施方案 的一個(gè)非限制性實(shí)施例，在與聚合物基質(zhì)的結(jié)合中或結(jié)合之前，成骨 細(xì)胞的培養(yǎng)物可以在A類信號(hào)的影響下生長。當(dāng)接種聚合物基質(zhì)以 后，將B類信號(hào)施加給細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)作為骨移植而有用的 結(jié)構(gòu)的礦化。在第三實(shí)施方案中，可以同時(shí)施加兩個(gè)或多個(gè)信號(hào)，以促進(jìn)體內(nèi) 或體外骨軟骨組織的伴隨增殖、分化和礦化。不同的信號(hào)也可以被依次施加給骨軟骨組織，以便獲得比單獨(dú)傳輸其任一種信號(hào)更好的效 果。該依次施加的步驟可以根據(jù)需要而重復(fù)，以生成另外的組織(例 如骨)，該方法通過以足夠次數(shù)循環(huán)進(jìn)行該兩步法來獲得所需的生物 效應(yīng)。作為一個(gè)特定的非限制性實(shí)施例，可以首先施加A類信號(hào)，以 首先通過增殖作用生成更多的骨細(xì)胞，然后施加B類信號(hào)，以誘導(dǎo)大 量的骨細(xì)胞而產(chǎn)生更多的骨組織(基質(zhì)、礦物和組織)，然后如果需 要?jiǎng)t進(jìn)行重復(fù)。利用相繼刺激重復(fù)的方案而生成的骨量將大于通過單 獨(dú)或組合的信號(hào)而生成的骨量。祖細(xì)胞刺激本申請(qǐng)所述的方法和波形可以被應(yīng)用于未分化的前體細(xì)胞，以促 進(jìn)增殖和/或分化成定向的譜系。這種祖細(xì)胞可以包括，但不限于，干 細(xì)胞、非定向的祖細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、多能祖細(xì)胞、多向性祖細(xì)胞或其它分化階段的細(xì)胞。具體還包括有成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，用A類信號(hào)體外刺激多能成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞或 骨髓干細(xì)胞)，以促進(jìn)多能成體干細(xì)胞增殖和分化成具體的通道，例 如骨、結(jié)締組織、脂肪等。如前面所述的祖細(xì)胞刺激包括組合或者依 次施加這兩種信號(hào)?；蛘撸旧暾?qǐng)中所述的波形和方法也可以被應(yīng)用于體內(nèi)多能成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞)，以便用A類信號(hào)刺激細(xì)胞， 以促進(jìn)將多能成體干細(xì)胞增殖和分化成具體通道，例如骨、結(jié)締組織、 脂肪等。也可包括這兩種信號(hào)的組合或者依次施加。祖細(xì)胞的電刺激也可以伴隨有已知用于促進(jìn)祖細(xì)胞增殖或分化 的增殖和分化因子。增殖因子包括具有對(duì)細(xì)胞的致有絲分裂作用的任 何化合物。這種增殖因子可以包括，但不限于，bFGF、 EGF、粒細(xì) 胞集落刺激因子、IGF-I，等。分化因子包括具有對(duì)細(xì)胞的分化作用的 任何化合物。這種分化因子可以包括，但不限于，視黃酸、BMP-2、 BMP-7等。本申請(qǐng)所述的電波形提供了對(duì)體外或體內(nèi)骨軟骨組織的生長和 發(fā)育的分化和組合調(diào)節(jié)。在礦化作用之前，用A類信號(hào)增加細(xì)胞的增 殖，增大了骨細(xì)胞的數(shù)量，因此實(shí)現(xiàn)了由用B類信號(hào)刺激完成的隨后 的礦化作用的增加。本發(fā)明的波形也通過釋放一氧化氮和骨形態(tài)形成 蛋白質(zhì)促進(jìn)了祖細(xì)胞增殖和分化。電容耦合用自鈍化金屬的體外和體內(nèi)刺激的制備通常很難，因?yàn)槠浜茈y獲 得金屬間電連接。本發(fā)明提供了可獲得使用自鈍化金屬電極的益處的 方法，而不存在與獲得可靠電連接相關(guān)的問題。這些電極的電容耦合 提供了感應(yīng)直流電流經(jīng)過自鈍化金屬電極的方法，其不需要任何電連 接。在該方法中，將由例如鈮、鉭、鈦、鋯、鉬、鎢和釩等自鈍化金 屬、鋁以及不銹鋼制成的電極滅菌，并設(shè)置在將被刺激的細(xì)胞群的附 近。電路導(dǎo)線被設(shè)置在例如鹽水溶液等導(dǎo)電介質(zhì)中的金屬電極附近，電信號(hào)通過電路導(dǎo)線傳輸從而刺激細(xì)胞群，其中，被電容耦合的電流 從導(dǎo)線經(jīng)過鹽水溶液和氧化物層進(jìn)入自鈍化金屬電極。在一個(gè)實(shí)施方 案中，電容耦合刺激被用于體外應(yīng)用，例如，但不限于，細(xì)胞培養(yǎng)物。 可以使用該方法刺激一個(gè)培養(yǎng)皿，或者可以將幾個(gè)培養(yǎng)皿或孔連接在 一起，以進(jìn)行相同的電刺激。在另一實(shí)施方案中，電容耦合刺激被用于體內(nèi)應(yīng)用，其中無菌陽 極化金屬電極被植入需要治療的病人體內(nèi)，而電路導(dǎo)線與皮膚接觸地 被設(shè)置在病人體外，以便在對(duì)促進(jìn)組織的修復(fù)或生長有效量的時(shí)間內(nèi) 在被植入的金屬電極中感應(yīng)電流。例如，電極的外端可以在緊挨皮膚 的下方形成一個(gè)扁平線圈，信號(hào)可以使用設(shè)置于線圏正上方的皮膚上 的傳統(tǒng)皮膚接觸電極而耦合于該線圏中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，電:的任何絕緣材料覆蓋，從而使信號(hào)損，失和對(duì)不進(jìn)行治療的組織的不 期望刺激最小。在例如骨修復(fù)的具體實(shí)施例中，由自鈍化金屬制成的 無菌陽極化金屬電極被植入需要治療的病人體內(nèi)，并且被刺激。當(dāng)骨 修復(fù)進(jìn)行足夠時(shí)間之后，可以從病人體內(nèi)取出電極。增加BMP表達(dá)本發(fā)明進(jìn)一步包括使用A類和B類波形來促進(jìn)從被刺激的細(xì)胞 表達(dá)和釋放骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)(BMP)的方法和裝置。本申請(qǐng)所述的 電信號(hào)可以被用于促使在足以對(duì)暴露于該信號(hào)的組織產(chǎn)生益處的電 平下釋放BMP。益處可以產(chǎn)生于不是直接地暴露于信號(hào)的組織中。BMP是骨誘導(dǎo)反應(yīng)中所涉及的多肽。除了 BMP-1之外，它們隸 屬于轉(zhuǎn)化生長因子P家族。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究了至少20種BMP, 但是僅BMP 2、 4、 7已經(jīng)可以對(duì)使干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的成熟細(xì) 胞的整個(gè)步驟進(jìn)行體外刺激。目前的研究試圖開發(fā)用于整形外科組織 再生的輸送BMP的方法。(Seeherman， Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Jun;16(3):329-45)。本申請(qǐng)所提供的方法是通過電刺激來誘導(dǎo)用 于整形外科組織再生的體外或體內(nèi)BMP釋放，而不是通過在技術(shù)上嚴(yán)格要求且成本高的輸送方法中的輸送外源性BMP。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用A類以及在較低程度上使用B類波形， 以誘導(dǎo)外源性BMP的表達(dá)和釋放。內(nèi)源性BMP的釋放促進(jìn)目標(biāo)組 織的生長和分化。刺激電極的設(shè)置對(duì)體外制備的局部區(qū)域或在需要增 加BMP表達(dá)的病人體內(nèi)提供了一種耙定BMP表達(dá)的方式。在一個(gè)實(shí) 施方案中，BMP-2或BMP-7或其組合被外源性地釋放，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo) 組織的分化和生長。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，釋放BMP-2和BMP-7 之一或其兩者可以促進(jìn)骨或軟骨組織中的分化、礦化、蛋白質(zhì)生成以 及基質(zhì)機(jī)化。通過一氧化氮刺激骨、軟骨或其它結(jié)締組織細(xì)胞本申請(qǐng)中所述的方法和電信號(hào)也可以被用于促進(jìn)骨、軟骨或其它 結(jié)締組織的修復(fù)和生長。在一個(gè)實(shí)施方案中，B類波形通過釋放一氧 化氮(NO)增加了細(xì)胞的生長。波形可以促使在足以對(duì)暴露于該信 號(hào)的組織產(chǎn)生益處的電平下釋放一氧化氮。益處可以產(chǎn)生于不直接暴 露于該信號(hào)的組織中。通過與電刺激結(jié)合共同施用NO供體可以進(jìn)一 步增加骨、軟骨、或其它結(jié)締組織細(xì)胞生長。NO供體包括，但不限 于，硝普鈉(SNP) 、 SIN-1、 SNAP、 DEA/NO以及SPER/NO。通 過與電刺激結(jié)合共同施用NO合酶抑制劑可以降低骨、軟骨或其它結(jié) 締組織細(xì)胞生長。這種NO合酶抑制劑包括，但不限于，N(G) -硝基-l-精氨酸甲酯(L-NAME) 、 NG-單甲基-L-精氨酸 (L-NMMA)、以及7-硝基吲唑(7-NI)。可以根據(jù)具體要求使 用這些方法來調(diào)節(jié)骨、軟骨或其它結(jié)締組織細(xì)胞生長。本發(fā)明的裝置和方法的應(yīng)用通過使用本申請(qǐng)所述的本發(fā)明的裝置和方法，該裝置和方法對(duì)促 進(jìn)骨軟骨組織的生長、分化、發(fā)育和礦化是有效的?？梢韵嘈?，通過加強(qiáng)將例如在對(duì)不同生理?xiàng)l件的細(xì)胞反應(yīng)中所涉 及的細(xì)胞因子類等化學(xué)因子的釋放，該裝置可以直接在治療位置上操 作。這加劇了血液流動(dòng)并且抑制了在治療位置上的進(jìn)一步發(fā)炎，從而增強(qiáng)了身體的內(nèi)在治療處理。本發(fā)明尤其可用于加速愈合簡單的或復(fù)雜的(多處的或粉碎性 的)骨折，包括，但不限于，在手術(shù)過程中被鋸開的或被斷開的骨。 本發(fā)明可以被用于促進(jìn)脊推融合手術(shù)之后的推骨融合。本發(fā)明可以被用于治療不愈合的骨折；治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏 松癥；治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)減少；治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)骨壞死；延遲 或消除編織骨(骨痂、骨刺)的形成；延遲或逆轉(zhuǎn)長期臥床休息中的 骨鉀質(zhì)流失；延遲或逆轉(zhuǎn)微重力下的骨鈣質(zhì)流失。此外，本發(fā)明可以 被用于加劇局部血液循環(huán)，增加外傷傷口區(qū)域的血液流動(dòng)，增加慢性 皮膚潰瘍區(qū)域的血液流動(dòng)并且調(diào)節(jié)血液凝固。還可以利用本發(fā)明的 一 個(gè)方面是加速愈合^皮損壞的或凈皮撕傷的 軟骨。而且，本發(fā)明可以被用于加速皮膚外傷或潰瘍的愈合(表皮形 成)。本發(fā)明可以被進(jìn)一步用于加速所培養(yǎng)的細(xì)胞或組織的生長，調(diào)節(jié) 細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞循環(huán)進(jìn)度，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子的 表達(dá)，調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨生長因子的表達(dá)，調(diào)節(jié) 胰島素樣生長因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫 瘤壞死因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)白細(xì)胞間介素的表達(dá)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子類的 表達(dá)。本發(fā)明的方法和裝置通過下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明。本 領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本申請(qǐng)的描述之后，在不脫離本發(fā)明的精神和/ 或所附的權(quán)利要求范圍的條件下，可以借助其它各種實(shí)施方案、變形 例、以及它們的等同替換。具體實(shí)施方案 實(shí)施例1PEMF信號(hào)結(jié)構(gòu)對(duì)原始成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的礦化和形態(tài)的影響本研究的目標(biāo)是通過評(píng)價(jià)原始骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的生物化學(xué)和形態(tài)變化來比較用電容耦合輸送的兩種PEMF波形結(jié)構(gòu)。方法成骨細(xì)胞培養(yǎng)物原始的人體成骨細(xì)胞(CAMBREX , Walkersville, MD)被擴(kuò)增到75%融合(confluence)，并且以50000 個(gè)細(xì)胞/ml的密度直接接種在前面所述的LAB-TEKTM (NALGE NUNC INTERNATIONAL1 , Rochester, NY)室中。培養(yǎng)物最初是在 沒有分化因子的條件下用基礎(chǔ)成骨細(xì)胞介質(zhì)支持的。當(dāng)培養(yǎng)物在室內(nèi) 達(dá)到70%融合時(shí)，介質(zhì)被補(bǔ)充有氬化可的松-21 -半琥珀酸鹽 (200mM的最終濃度)、p-甘油磷酸鹽U0mM的最終濃度)和抗 壞血酸。在37。C、 5%C02、 95%空氣下的潮濕空氣中培養(yǎng)成骨細(xì)胞 持續(xù)21天。在試驗(yàn)期間每隔兩天更換一次介質(zhì)并對(duì)每個(gè)室補(bǔ)充4ml。電刺激刺激培養(yǎng)物，每天刺激兩次且每次持續(xù)30分鐘或兩小 時(shí)。將兩種電信號(hào)方案可選擇地施加到細(xì)胞上，其中一種是表示為"信 號(hào)A"的連續(xù)波形(60/28正/負(fù)信號(hào)持續(xù)時(shí)間，以微秒計(jì))，而另一種 是表示為"信號(hào)B，，的連續(xù)波形(200/28正/負(fù)信號(hào)持續(xù)時(shí)間，以微秒 計(jì))。在樣本中測(cè)得的密度為2.4 mV/cm (峰到峰)。未被刺激的成 骨細(xì)胞(NC)以相似的方式以相同的密度(作為對(duì)照例)進(jìn)行接種。 使用具體方法中的步驟測(cè)量以下內(nèi)容堿性磷酸酶、鈣、骨鈣蛋白和 組織結(jié)構(gòu)。將下面圖中的各個(gè)符號(hào)記為"A"信號(hào)和"B"信號(hào)，將30分 鐘持續(xù)時(shí)間記為"l"，將2小時(shí)持續(xù)時(shí)間記為"2"，將NC(或融合) 作為沒有電流(即，Al就是A信號(hào)-30分鐘；B2就是B信號(hào)-2小 時(shí))。本申請(qǐng)所用的電裝置實(shí)現(xiàn)了將連續(xù)波形的電刺激同時(shí)應(yīng)用到多 個(gè)外植體。對(duì)每個(gè)試驗(yàn)而言，六對(duì)外植體被設(shè)置在4ml培養(yǎng)介質(zhì)中的 單個(gè)的孔中。在相同條件下培養(yǎng)對(duì)照樣本，其僅有的不同在于缺乏所 輸送的信號(hào)。本試驗(yàn)的結(jié)構(gòu)包括通過鈮導(dǎo)線的線圏段串聯(lián)連接的六個(gè) 測(cè)試培養(yǎng)孔(17x42mm)。將人體成骨細(xì)胞設(shè)置在LAB-TEKTM II滑孑L (NALGE NUNC INTERNATIONALtm， Rochester, NY )中，該各滑孔具有表面面積為 約lOcm2。通過使其經(jīng)由鈮導(dǎo)線串聯(lián)連接而將信號(hào)同時(shí)施加給幾個(gè)室，其中鈮導(dǎo)線用作耦合電容。該刺激是200/28微秒雙極矩形脈沖以15/ 秒重復(fù)的9毫秒脈沖段、傳輸9mV/cm (類似于標(biāo)準(zhǔn)臨床骨治療信號(hào)) 的指定信號(hào)B;或是60/28微秒基本單極脈沖的48毫秒脈沖段、傳輸 4mV/cm的指定信號(hào)A。培養(yǎng)物每天接受兩次30分鐘或2小時(shí)的刺激。 在7、 14和21天的時(shí)間點(diǎn)上從介質(zhì)中取出樣本并分析堿性磷酸酶、 骨鈣蛋白、基質(zhì)鈣和組織學(xué)。伴隨形態(tài)的礦化已通過VonKossa染色 法得到確認(rèn)。所有的生物化學(xué)分析都是通過傳統(tǒng)的分析方法進(jìn)行的。結(jié)果使用可商購的ELISA試劑盒(R&D SYSTEMS11, Minneapolis MN; INVITROGEN， INC.TM， Carlsbad, CA )來評(píng)價(jià)PGE2生成量。 其結(jié)果以pg/mg組織/24小時(shí)(即，nM/g/24hrs)為單位進(jìn)行表示。堿性磷酸酶(AP):在研究設(shè)計(jì)中所表示的時(shí)間點(diǎn)上，溶解細(xì) 胞(Mammalian-PE， Genotech, St. Louis， MO)并收集上清液。通過在 鎂存在的堿性條件下將對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNPP)裂解為硝基苯 (PNP)，測(cè)量堿性磷酸酶。最終產(chǎn)品PNP的比色度是在405納米處 具有吸收峰。使用0.5M碳酸鹽緩沖液可以獲得pH10.3的堿性條件。 直接分析培養(yǎng)介質(zhì)以獲得ALP活性。用氚核X-100的溶液萃取細(xì)胞 層ALP，并測(cè)量等分試樣的ALP活性。在溶解緩沖萃取之后測(cè)量上 清液和膜中的堿性磷酸酶(圖5)。如在其它研究(Lohman, 2003)中 所預(yù)期那樣，在膜中的堿性磚酸酶表達(dá)在接近7日時(shí)最高。但是，在 "B"刺激下培養(yǎng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)介質(zhì)持續(xù)顯示可測(cè)量的AP增加。骨鈣蛋白骨鈣蛋白(5800道爾頓(dalton ))是成骨細(xì)胞的具體產(chǎn)物。少量的骨鈣蛋白被直接地釋放到循環(huán)中；它主要被沉積在骨基質(zhì)中。研究表明，骨鈣蛋白作為完整的(l-49)蛋白質(zhì)和作為N-末端片段進(jìn)行循環(huán)。主要的N-末端片段是肽(1-43) 。 Mid-Tact Osteocacin Elisa試劑盒因其高特異性而被選擇。該分析是高度敏感的 (0.5ng/ml)并且僅需要25微升的樣本。對(duì)照組與我們的試驗(yàn)組同時(shí) 進(jìn)行，這對(duì)由BTI制造商(BTI， Stoughton， MA)提供的期望值提供了強(qiáng)相關(guān)。在冷卻處理培養(yǎng)物后測(cè)定的并且由基質(zhì)成分確定的骨4丐蛋白 沉積在進(jìn)行"B，，刺激后更加顯著，并且在21日時(shí)達(dá)到最高(圖6)。DNA含量用0.1N氫氧化鈉萃取細(xì)胞層，并且取等分試樣 (aliquot )用CyQuant分析試劑盒(INVITROGEN， INC.TM， Carlsbad CA.)分析DNA含量。對(duì)于用氚核X-100萃取來測(cè)量ALP含量的細(xì)胞 樣本，用l N氫氧化鈉調(diào)節(jié)萃取物至(UN氬氧化鈉。標(biāo)準(zhǔn)曲線包含 匹配的緩沖液。對(duì)于還要求蛋白質(zhì)含量的樣本，采用染色結(jié)合法 (Bradford)取等分試樣測(cè)量蛋白質(zhì)含量。鈣通過Schwarzenbach理論方法用形成紫色絡(luò)合物的鄰曱酚 酞氨縮絡(luò)合劑測(cè)量鉤。通過添加2ml的0.5M醋酸并過夜，4丐被溶解 并且通過在552nm的比色分析而對(duì)照定量測(cè)得其含量(CORE LABORATORY SUPPLIESTM， Canton, MI)。在培養(yǎng)物中的4丐分布也是通過組織學(xué)來評(píng)價(jià)的。將細(xì)胞固定在2%戊二醛中，用卡可酸鹽緩沖液清洗，用PBS清洗，然后再進(jìn)行水合 以如所說明的染色。各時(shí)間段是相繼進(jìn)行的；代表性的形態(tài)持續(xù)顯示 了21天，比較了"A"信號(hào)與"B"信號(hào)，并且將這兩種信號(hào)與對(duì)照組進(jìn) 行了比較(圖6)。對(duì)于信號(hào)B，最顯著的測(cè)定值是具有明顯的優(yōu)選 排列的(我們將其解釋為"假松質(zhì)性"骨)的鈣分布。對(duì)于信號(hào)A，呈 現(xiàn)出比信號(hào)B更高質(zhì)量的細(xì)胞增殖和更少的基質(zhì)生成(但是，信號(hào)A 明顯比對(duì)照物具有更多基質(zhì))。骨測(cè)量法分析是由Croucher方法發(fā)展和變化而來的。在該二維 室系統(tǒng)中，研究了相對(duì)于取樣的柵格樣本的整體面積的平均小梁骨面 積(trabecular area )。在各個(gè)強(qiáng)度下從兩室采用最少20個(gè)視野進(jìn)行 骨形成、類骨質(zhì)寬度以及細(xì)胞數(shù)目的研究。為了直接比較以及去除誤 差，使用隨機(jī)的具體柵格。另外，刺激室和對(duì)照室的成骨細(xì)胞培養(yǎng)物 都是通過Von Kossa法(Mallory， 1961)直接染色而檢查組織學(xué)和 定量測(cè)定鉀在培養(yǎng)物中的分布。結(jié)論在接近10~14天時(shí)升至峰值然后逐漸減退的堿性磷酸酶在由信 號(hào)B刺激的上清液中增加。在冷卻處理培養(yǎng)物之后測(cè)定的并且通過基 質(zhì)成分確定的骨鈣蛋白沉積在僅施加信號(hào)B時(shí)更顯著，并且在21天 時(shí)增大至最高點(diǎn)。所測(cè)定的以mg/dl為單位的基質(zhì)鉀和作為組織培養(yǎng) 皿的面積的函數(shù)的基質(zhì)鉤在僅施加信號(hào)B的情況下為最多。由組織學(xué) 和Von Kossa染色法獲得的礦物分布驗(yàn)證了來自化驗(yàn)分析的生物化學(xué) 數(shù)據(jù)。B刺激獲得了更大量的礦物，而且形成可在三維小梁骨排列中 提供所期望的類似張力動(dòng)力的網(wǎng)狀二維圖形。用信號(hào)A比對(duì)照物更高 質(zhì)量地呈現(xiàn)出細(xì)胞增殖，但是用信號(hào)B的顯著增加的礦化和圖形在 21天時(shí)更為明顯。這兩種信號(hào)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了非常不同的效果，這一事實(shí)可以通過分析 信噪比(SNR)來容易地說明，該分析表明在采用Ca/CaM目標(biāo)時(shí)， 信號(hào)B的可檢測(cè)性比信號(hào)A高10倍。該研究首次表明PEMF具有潛 在的能實(shí)現(xiàn)與組織形態(tài)學(xué)一致的結(jié)構(gòu)變化。幾何圖形在培養(yǎng)21天后 變得明顯，其反映出與松質(zhì)骨一致的小梁骨網(wǎng)狀物，并且與在對(duì)照物 中和在所有評(píng)價(jià)時(shí)間點(diǎn)上暴露于信號(hào)A的培養(yǎng)物中的細(xì)胞的隨機(jī)定 向形成鮮明對(duì)比。這樣的結(jié)果表明優(yōu)選的信號(hào)結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)以前限于 組織水平觀察的結(jié)構(gòu)層次。實(shí)施例2用于體外PEMF刺激的鈮"鹽"橋的使用 引言開發(fā)使用陽極化鈮導(dǎo)線的無源電極系統(tǒng)，以便將時(shí)變的電信號(hào)耦 合到培養(yǎng)室中。該設(shè)計(jì)的目的在于通過代替?zhèn)鹘y(tǒng)的用于傳輸PEMF類 信號(hào)(例如，由EBI重復(fù)脈沖段骨生長刺激器在用于細(xì)胞、組織研究 的體外組織中電容地而不是電感地產(chǎn)生的信號(hào))的電解質(zhì)橋技術(shù)來降 低復(fù)雜性和提高再現(xiàn)性。經(jīng)陽極化處理的鈮導(dǎo)線容易獲得，并且僅要 求筒單的手動(dòng)工具即可形成電極橋。在可利用的頻率下(通常在5Hz到3Hz之間)，可以忽略DC電流的通過。背景
電容耦合的電場(chǎng)通常都已被引入到具有傳統(tǒng)的電解質(zhì)鹽橋的培 養(yǎng)介質(zhì)中，這種鹽橋具有受限的頻率響應(yīng)并且很難在后續(xù)的暴露時(shí)間 中不受污染地進(jìn)行使用。鈮(鈳)是可以自鈍化的若干金屬中的一種， 當(dāng)被暴露于氧氣或濕氣中時(shí)形成薄而很耐久的表面氧化物層。其它金 屬有鉭、鈦、以及在一個(gè)更低程度上有不銹鋼。該步驟可以通過陽極 化處理加速或控制。自鈍化的問題是使得與其它金屬的可靠連接變得 困難。本設(shè)計(jì)避免了這個(gè)難題。
材料和方法
氧化鈮(Nb2Os)是堅(jiān)硬的、透明的、電絕緣的，并且對(duì)水、普 通試劑和寬pH范圍下的生物液體都是惰性的。陽極化鈮形成顯示一 系列鮮艷光千涉色彩的具有均勻厚度的Nb2Os，并且產(chǎn)生穩(wěn)定且可再 現(xiàn)的電容，由于沒有添加染料，該光干涉色彩可用于珠寶。珠寶商的 鈮以標(biāo)準(zhǔn)色彩進(jìn)行出售，每種色彩代表一種不同的氧化物厚度。由于 Nb2Os的介電接觸異常高Ur-41so)并且該層很薄(48~70nm)， 所以它們的電容都格外大。"紫色的"鈮具有最薄的氧化物和最高級(jí)別 的電容(對(duì)于22號(hào)導(dǎo)線(Rio Grande # 638-240 )為0.158>iF /cm )， 接近對(duì)48nM氧化物(420nM峰值反射)的計(jì)算值。在水或生理鹽水 中，在彎曲過程中形成的剪斷線端和小瑕疵很快由氧化物愈合，不需 要再陽極化處理
鈮橋
在本申請(qǐng)中，氧化鈮與介質(zhì)形成唯一的電接觸，并且PEMF類 信號(hào)電容性地經(jīng)過它。在小于幾毫安的信號(hào)電平下，引起人為現(xiàn)象的 電解或pH變化可以忽略。多個(gè)室可以串聯(lián)連接，每個(gè)室均接收相同 的信號(hào)。各鈮橋均被彎曲，以在各末端上形成片狀電極，鈮橋通常的 電容為0.56pF。在矩形室的端部設(shè)置電極橋形成幾乎均勻的電流分布 和在整個(gè)介質(zhì)中的電壓梯度。在培養(yǎng)變換器、電極以及PEMF類信號(hào)
的典型裝置中測(cè)量的梯度如在圖4中預(yù)先示出，并且在其相應(yīng)的文字中已經(jīng)描述，該梯度表明主要在電極附近或介質(zhì)在深度方向上的顯著
變化處的平均變動(dòng)為±3%。 一個(gè)室或幾個(gè)串聯(lián)連接的室通過特定鈮端 的橋而被賦予能量，各橋的外端通過鹽水而電容耦合到形成連接終端 的銀片電極。這消除了將鈮連接于自身或任何其它金屬的必要。電流 通過一串聯(lián)極限電阻(series limiting resistance ) R咖控制。所獲得的 帶通(額定值為土3dB)隨R，im而稍微變化，但是，在5Hz 3MHz之 間運(yùn)行的測(cè)試裝置中，最高頻率通過了試驗(yàn)。因此PEMF類信號(hào)可以 通過電容耦合在體內(nèi)不失真地傳輸。
試驗(yàn)
使用前面所述的B類波形在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物上測(cè)試 鈮電極橋的實(shí)用性。在不存在細(xì)胞的情況下，將該信號(hào)施加在OGMtm 成骨細(xì)胞介質(zhì)(CAMBREX , Walkersville， MD)上，24小時(shí)后測(cè)得的 pH為8.29，而沒有被賦能的對(duì)照物為8.27，這證實(shí)了可以忽略的電 解。使用A類和B類波形兩者的OGMTM在21天中成骨細(xì)胞強(qiáng)力增 殖和分化和多孔性骨類結(jié)構(gòu)的發(fā)育表明不存在生理有效的細(xì)胞毒性。 持續(xù)21天進(jìn)行30分鐘和兩小時(shí)暴露于培養(yǎng)物中的波形，然后，用能 量色散X射線(EDX)分析細(xì)胞和基質(zhì)。沒有檢測(cè)到鈮。在其它研究 中，將B類信號(hào)應(yīng)用到含1 %胎牛血清的培養(yǎng)介質(zhì)中的人體軟骨細(xì)胞 (HCC)持續(xù)96小時(shí)。B類信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增加154。/。，細(xì)胞數(shù)量 是通過測(cè)量細(xì)胞層中的DNA含量而獲得的，該增加再次表明沒有有 效細(xì)胞毒性。直接比較電容耦合的信號(hào)與除了是電磁耦合之外其余相 同的信號(hào)，它們均每天被傳輸30分鐘，持續(xù)四天，通過DNA測(cè)得成 骨細(xì)胞增加，它們的增加都顯著不同于對(duì)照物(鈮157% ， EM耦合 164%)，但相互之間沒有明顯不同。
結(jié)論
已經(jīng)研發(fā)出一種用于將電容耦合的PEMF類信號(hào)施加給培養(yǎng)物 中的細(xì)胞/組織的新鈮電極橋。鈮橋的帶通為5Hz到3MHz，因此例如用于骨和傷口修復(fù)的臨床應(yīng)用的PEMF類信號(hào)可不失真地通過。與 標(biāo)準(zhǔn)電解質(zhì)橋結(jié)構(gòu)不同，鈮橋在培養(yǎng)皿中提供了均勻的電流密度。長 期的PEMF暴露的應(yīng)用表明沒有電解或生理有效的細(xì)胞毒性。
實(shí)施例3
使用電容耦合的PEMF信號(hào)刺激軟骨細(xì)胞 引言
目前正在測(cè)試類似于用于骨修復(fù)的臨床應(yīng)用的PEMF信號(hào)對(duì)減 輕關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)疼痛的能力。所關(guān)心的是該疼痛減輕信號(hào)是否還 可以改善受損軟骨的潛在問題。
背景
與藥物治療和生物制劑相比，基于PEMF的治療方法提供了容 易使用的非侵入性治療，該治療不包含具有潛在副作用的外來試劑， 并且具有零清除時(shí)間。PEMF治療方法的問題包括識(shí)別響應(yīng)細(xì)胞、 說明細(xì)胞上的物理轉(zhuǎn)導(dǎo)位置、以及確定導(dǎo)致細(xì)胞響應(yīng)的反應(yīng)的生物機(jī) 理。本研究的目的在于確定目前正在,皮測(cè)試疼痛減輕的具體PEMF信 號(hào)(MEDRELIEF⑧，Healthonics， Inc， GA)是否可以體外刺激軟骨細(xì)胞 或者反應(yīng)的生物機(jī)理是否可以被解釋。
方法
將正常人體軟骨細(xì)胞(HCC; CAMBREX , Walkersville， MD)以 單層附著在矩形的細(xì)胞室中。PEMF應(yīng)用通過鈮電極橋系統(tǒng)而電容耦 合，該系統(tǒng)允許時(shí)變電流均勻流過室。本申請(qǐng)所描述的脈沖段B類信 號(hào)由不對(duì)稱矩形脈沖的10毫秒脈沖段構(gòu)成，寬度為200/28，以15Hz 重復(fù)。每次治療施加PEMF信號(hào)30分鐘。用細(xì)胞層的DNA含量評(píng) 價(jià)細(xì)胞生長。通過使用由INVITROGEN INC. (Carlsbad， CA)提供 的分析試劑盒的Griess反應(yīng)評(píng)價(jià)培養(yǎng)介質(zhì)的一氧化氮(NO)含量。 其結(jié)果以NO的微摩爾數(shù)除以通過細(xì)胞層的DNA含量確定的細(xì)胞數(shù)量來表達(dá)。 結(jié)果
PEMF信號(hào)在持續(xù)96小時(shí)的期間內(nèi)每12小時(shí)以峰到峰為400 微安施加一次給生長在含1%胎牛血清的培養(yǎng)介質(zhì)中的HCC細(xì)胞， 該信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞生長增加153±22%， p<0.001。所關(guān)心的是，在第一 次PEMF治療之后的24小時(shí)收集的條件培養(yǎng)基顯示NO增加196±14 %， p<0.001，其在96小時(shí)時(shí)下降到非有效水平。在類似條件下，當(dāng) 將SNP ( NO供體——硝普鈉)添加到最終濃度為3微克/ml時(shí)，也 出現(xiàn)在24小時(shí)時(shí)的NO的增加(174±26%， p〈0.001)和在96小時(shí)時(shí)的 細(xì)胞數(shù)目的增加(168士22。/。，p〈0.001)(與未經(jīng)治療的對(duì)照物相比)。 在隨后的試驗(yàn)中，血清濃度降低到0.1% ，每24小時(shí)一次地在40微 安下施加PEMF,并且在72小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量。PEMF治療將條件培 養(yǎng)基中的NO含量增大至154±30% ， <0.01。如圖7所示，PEMF治 療增加了細(xì)胞數(shù)量并且該細(xì)胞響應(yīng)被L-NAME (—氧化氮合酶抑制 劑)減弱。
結(jié)論
這些結(jié)果表明目前正在測(cè)試降低由關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)疼痛的 PEMF信號(hào)也可以對(duì)軟骨提供益處。數(shù)據(jù)表明人體軟骨細(xì)胞可以用增 加的細(xì)胞生長來響應(yīng)這種信號(hào)。而且，用于PEMF刺激的軟骨細(xì)胞生 長的作用的可能的生物機(jī)理是通過釋放NO完成的。軟骨細(xì)胞對(duì)NO 供體的類似響應(yīng)支持該理論。盡管不是結(jié)論性的，但是數(shù)據(jù)證實(shí) PEMF治療后增加的細(xì)胞生長被NO介導(dǎo)，或者說在PEMF引起細(xì)胞 生長增加的機(jī)理中NO是一個(gè)必需的步驟。
實(shí)施例4
在原始成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的BMP生成的PEMF刺激取決于信 號(hào)結(jié)構(gòu)和暴露時(shí)間引言作為在脊推融合手術(shù)和用于治療長骨中的頑固性不愈合的輔助手段，PEMF作為非手術(shù)性療法已被證實(shí)有效。試點(diǎn)研究已經(jīng)證明成 骨細(xì)胞對(duì)信號(hào)結(jié)構(gòu)和時(shí)間會(huì)不同地響應(yīng)。 一個(gè)重要的不同包括用沉積 基質(zhì)代替細(xì)胞增殖的傾向?；贐MP在脊推融合和非愈合中的被證 實(shí)的功效以及基于表明BMP-2和BMP-4 #皮PEMF刺激的嘗試 (Bodamyali， 1998)，我們的研究集中在更好地理解以前的細(xì)胞響應(yīng)是 否可能與BMP調(diào)節(jié)相關(guān)。目標(biāo)本研究比較了用電容耦合傳輸?shù)膬煞NPEMF波形結(jié)構(gòu)，將原始 骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的生物化學(xué)和形態(tài)變化與BMP調(diào)節(jié)相聯(lián)系。方法將正常人體成骨細(xì)胞設(shè)定在10cm2的各培養(yǎng)室中。通過利用作為 耦合電容的鈮導(dǎo)線將幾個(gè)室串聯(lián)連接，可以同時(shí)將多個(gè)信號(hào)施加到若 干室中。刺激由 一連續(xù)系列的60/28微秒矩形雙極性脈沖(被記為"信 號(hào)A")或200/28微秒矩形雙極性脈沖(被記為"信號(hào)B")構(gòu)成，該 刺激將1.2 mV/cm (在A信號(hào)的情況下)或2.4 mV/cm (在B信號(hào)的情 況下)的峰-峰電場(chǎng)均勻地施加給培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物暴露30分鐘(1) 或兩小時(shí)(2)，每天兩次，得到用于比較的組A1、 A2、 B1和B2。 通過ELISA分析法對(duì)先前被用于膜蛋白質(zhì)測(cè)定的等分試樣分析BMP 蛋白質(zhì)，將先前被用于測(cè)定鈣和理解形態(tài)的基質(zhì)用于分離RNA,該 RNA隨后通過使用已知可獲得的用于(18sRNA)BMP-2和BMP-7的 序列引物的兩步逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來進(jìn)行分析。刺 激增殖的信號(hào)和刺激基質(zhì)沉積的信號(hào)都被分析以便于BMP調(diào)節(jié)和蛋 白質(zhì)表達(dá)功能。使用來自7天、14天、21天的時(shí)間點(diǎn)上的樣本，以 確保對(duì)分析的相同比較。結(jié)果該試驗(yàn)的主要的結(jié)果有六個(gè)方面1 ) BMP蛋白質(zhì)和用于BMP 的mRNA響應(yīng)兩種刺激(尤其是"A"信號(hào))而增加；2)每天傳送兩 次的30分鐘刺激與兩小時(shí)治療相比在21天時(shí)提供BMP-2表達(dá)增加 接近40倍，其大部分的增加是在14天到21之間的期間獲得的；3) "A"信號(hào)的30分鐘刺激提供了 BMP-7表達(dá)的15倍增加，同樣也是在 14天到21天之間的分析最為顯著；4 )在"B"信號(hào)的情況中發(fā)現(xiàn)BMP-2 或BMP-7僅適度增加；5)該研究首次證實(shí)BMP-7表達(dá)通過PEMF 刺激而促進(jìn)；6)盡管增殖評(píng)價(jià)是定性的，但BMP沉積的致有絲分裂 性質(zhì)與以前的公開文獻(xiàn)一致。評(píng)價(jià)PEMF短期時(shí)間內(nèi)對(duì)變形的細(xì)胞系 的作用的文獻(xiàn)表明BMP-3和BMP-6都沒有被刺激(Yajima， 1996)。 我們沒有對(duì)我們的模型評(píng)價(jià)這些生長因子。結(jié)論由于大部分研究已經(jīng)表明BMP-2具有形態(tài)形成和致有絲分裂的 性能，所以細(xì)胞響應(yīng)"A"信號(hào)而增殖也就并不奇怪。兩種信號(hào)結(jié)構(gòu)產(chǎn) 生了很不相同的效果，這可以通過SNR分析潛在地進(jìn)行解釋，該SNR 分析表明在設(shè)定Ca/CaM轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的情況下，信號(hào)"B，，的用量可以大 于信號(hào)"A，，的IO倍。盡管由"B，，信號(hào)提供了過大的基質(zhì)沉積，但也許 更未預(yù)料到的是標(biāo)準(zhǔn)化的BMP-2和BMP-7水平。骨形成敏銳地依靠 生長因子和表面微細(xì)結(jié)構(gòu)的平衡。事實(shí)上，平滑表面的存在超越了細(xì) 胞對(duì)BMP-2的響應(yīng)，并且加重了畸形的礦化作用。如果在響應(yīng)"B" 信號(hào)中觀察到高度的基質(zhì)機(jī)化和沉積，BMP自身內(nèi)部和本身的(in and of )轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎不足以發(fā)生骨形成，并且可以提供單獨(dú)通過不同的 目標(biāo)才幾理而發(fā)生。實(shí)施例5個(gè)案研究用PEMF刺激治療骨質(zhì)疏松癥 一個(gè)骨質(zhì)疏松癥病人(女性、年齡50歲、起始的T- - 3.092)使用采用信號(hào)B( 200/30 )的電刺激， 一周使用4~5天，每天使用3~ 5小時(shí)。該病人在一年的時(shí)間內(nèi)持續(xù)相同的藥物治療、營養(yǎng)補(bǔ)充和活 動(dòng)。在6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)進(jìn)行骨密度掃描，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)量密度增加16 %和29 % 。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)骨、軟骨或其它結(jié)締組織的發(fā)育或修復(fù)的方法，包括用電信號(hào)對(duì)正在發(fā)育或再生的組織刺激足以調(diào)節(jié)該組織的發(fā)育或修復(fù)的時(shí)段的步驟，其中，所述電信號(hào)包括A類、B類、C類或D類信號(hào)。
2. 如權(quán)利要求l的方法，還包括用第二電信號(hào)刺激正在發(fā)育的 組織的步驟，其中，所述第二電信號(hào)包括A類、B類、C類或D類信 號(hào)。
3. 如權(quán)利要求2的方法，其中，A類信號(hào)包括具有p長度的長 分量和具有a長度的短分量。
4. 如權(quán)利要求2的方法，其中，A類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約60 微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約28微秒的短分量。
5. 如權(quán)利要求2的方法，其中，B類信號(hào)包括具有Y長度的長 分量和具有a長度的短分量。
6. 如權(quán)利要求2的方法，其中，B類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約200 微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約28微秒的短分量。
7. 如權(quán)利要求2的方法，其中，所述兩種電信號(hào)被同時(shí)或依次 施加，以促進(jìn)所述組織中的細(xì)胞的增殖、分化、或基質(zhì)生成。
8. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述組織包括祖細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述祖細(xì)胞選自干細(xì)胞、未定 向祖細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、多能祖細(xì)胞或多向性祖細(xì)胞。
10. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述電刺激增加了 BMP-2或 BMP-7的生成。
11. 如權(quán)利要求l的方法，其中，所述電刺激調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生。
12. —種用于生成或修復(fù)骨、軟骨或結(jié)締組織的方法，該方法包 括用電信號(hào)刺激正在發(fā)育或再生的組織的步驟，其中，所述電信號(hào)包 括A類、B類、C類或D類電信號(hào)。
13，如權(quán)利要求12的方法，還包括結(jié)合所述電信號(hào)的機(jī)械裝載 的步驟。
14. 如權(quán)利要求12的方法，其中，所述電刺激使用電容耦合電 極來完成。
15. —種用于生成或修復(fù)骨、軟骨或其它結(jié)締組織的方法，包括 如下步驟用第一電信號(hào)刺激所述組織以刺激組織形成細(xì)胞的增殖、 分化或基質(zhì)生成；然后用第二電信號(hào)刺激正在發(fā)育的所述組織以剌激 所述組織形成細(xì)胞的增殖、分化或基質(zhì)/礦物生成。
16. 如權(quán)利要求15的方法，其中，所述第一電信號(hào)包括A類信 號(hào)，所述第二電信號(hào)包括B類信號(hào)。
17. 如權(quán)利要求15的方法，其中，A類信號(hào)包括具有p長度的 長分量和具有a長度的短分量。
18. 如權(quán)利要求15的方法，其中，A類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約 60微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約28微秒的短分量。
19. 如權(quán)利要求15的方法，其中，B類信號(hào)包括具有y長度的 長分量和具有a長度的短分量。
20. 如權(quán)利要求15的方法，其中，B類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約 200微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約28微秒的短分量。
21. —種電容耦合橋電極，包括由陽極化金屬制成的電極。
22. 如權(quán)利要求21的電極，其中，所述陽極化金屬是鈮、鉭、 鈦、鋯、鉬、鵠、釩、鋁或不銹鋼。
23. —種包括細(xì)胞和電刺激器的系統(tǒng)，該電刺激器將A類信號(hào) 或B類信號(hào)傳輸給所述細(xì)胞。
24. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，還包括用于機(jī)械裝載所述細(xì)胞的裝置。
25. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，A類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約 20微秒至100微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約5微秒至95微秒的短分
26. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，A類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約60微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約28微秒的短分量。
27. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，B類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約 100微秒至1000微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約5微秒至75微秒的短 分量。
28. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，B類信號(hào)包括持續(xù)時(shí)間為約 200微秒的長分量和持續(xù)時(shí)間為約28微秒的短分量。
29. 如權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中，所述細(xì)胞選自干細(xì)胞、未定 向祖細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、多能祖細(xì)胞、多向性祖細(xì)胞或處于其它分化 階段的細(xì)胞。
30. 如權(quán)利要求23的培養(yǎng)系統(tǒng)，還包括由陽極化金屬制成的電 容耦合橋電極。
31， 一種用于制備適合于移植的組織的試劑盒，包括細(xì)胞和提供 電刺激波形的電刺激器，其中所述電刺激波形包括A類、B類、C類 或D類信號(hào)；其中所述波形促進(jìn)所述細(xì)胞增殖、分化或基質(zhì)生成為適 于移植的組織。
32. 如權(quán)利要求31的試劑盒，還包括可生物降解的或生物穩(wěn)定 的支架。
33. 如權(quán)利要求32的試劑盒，其中所述支架由選自天然或合成 聚合物的材料制成。
34. 如權(quán)利要求32的試劑盒，其中，所述支架與生長促進(jìn)分子 或粘合促進(jìn)分子相結(jié)合。
35. 如權(quán)利要求31的試劑盒，還包括用于機(jī)械裝載所述細(xì)胞的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)骨、軟骨、或其它結(jié)締組織的生長、發(fā)育和修復(fù)的組合物和方法。還提供了裝置和刺激波形，以不同地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、和其它結(jié)締組織細(xì)胞的行為，從而促進(jìn)體外或體內(nèi)應(yīng)用的增殖、分化、基質(zhì)形成或礦化?？梢允褂镁哂须姾善胶獾男盘?hào)的連續(xù)模式和脈沖段模式的細(xì)胞刺激。骨、軟骨、和其它結(jié)締組織生長通過經(jīng)由電刺激釋放一氧化氮而被部分地刺激，并且可以通過同時(shí)供給NO供體和NO合酶抑制劑來調(diào)節(jié)。骨、軟骨和其它結(jié)締組織生長通過響應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞分化的電刺激釋放BMP-2和BMP-7而被部分地刺激。所述方法和裝置對(duì)促進(jìn)骨折修復(fù)、軟骨和結(jié)締組織修復(fù)、以及對(duì)用于移植的工程組織都是有用的。
文檔編號(hào)A61N1/00GK101237904SQ200680028374
公開日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
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