專(zhuān)利名稱(chēng)：基于使用纖連蛋白eda結(jié)構(gòu)域的試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)栽體，其用于分子轉(zhuǎn)運(yùn)到表達(dá)TLR4受體(Toll 樣受體4)的細(xì)胞，所迷蛋白質(zhì)栽體的制備和它的應(yīng)用，尤其涉及藥物 組合物，尤其免疫治療組合物的制備和用途，用于治療和預(yù)防傳染病和 腫瘤疾病。
背景技術(shù)：
病原體和癌癥仍然是全世界死亡的主要原因。開(kāi)發(fā)用于預(yù)防當(dāng)前還 不存在其疫苗的疾病如AIDS或者瘧疾的疫苗，或者治療慢性感染或癌 癥，以及提高現(xiàn)有疫苗的功效和安全性仍然是優(yōu)先的。在大多數(shù)情況下， 此類(lèi)疫苗的開(kāi)發(fā)需要能夠特異刺激CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)的策略。通過(guò)與MHC I類(lèi)分子結(jié)合的短肽被呈遞給T細(xì)胞受體(TCRs)而激 活CTL。這些肽-MHC I類(lèi)復(fù)合體存在于抗原呈遞細(xì)胞(APC)的表面， 所述APC也能夠提供最佳的CTL活化所需的共刺激信號(hào)。樹(shù)突細(xì)胞(DC)是最有效的APC，其具有與幼稚T淋巴細(xì)胞相互 作用并起始初次免疫反應(yīng)的獨(dú)特能力，從而激活輔助CD4+和細(xì)胞毒性 CD8+ T淋巴纟田胞。Guermo叩rez等人("Antigen presentation and T cell stimulation by DC". /J "w.尺ev. /www o/. 2002， 20:62l-627)綜迷了 DC的 抗原呈遞和T細(xì)胞刺激，將該文獻(xiàn)包括在本文中作為參考。不存在正在進(jìn)行的炎癥和免疫應(yīng)答時(shí)，樹(shù)突細(xì)胞通過(guò)血液、外周組 織、淋巴和次級(jí)淋巴器官巡邏。在外周組織中，樹(shù)突細(xì)胞吸收自身和非 自身抗原。然后被內(nèi)化的抗原被加工成蛋白水解肽，并且這些肽被裝栽 到I和II類(lèi)MHC分子上(分別對(duì)于CD8+或CD4+T淋巴細(xì)胞活化)。 該抗原攝入、降解和裝栽的過(guò)程稱(chēng)作抗原呈遞。然而，不存在刺激時(shí)， 外周樹(shù)突細(xì)胞相當(dāng)?shù)托У爻蔬f抗原。來(lái)自病原體的外源信號(hào)或者內(nèi)源信 號(hào)誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育程序，稱(chēng)作成熟，其將樹(shù)突細(xì)胞轉(zhuǎn)化成APC 和T淋巴細(xì)胞活化劑。細(xì)菌和病毒產(chǎn)物，以及炎性細(xì)胞因子和其他自身 分子通過(guò)與固有的樹(shù)突細(xì)胞表面受體直接相互作用誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟。T淋巴細(xì)胞，通過(guò)CD40依賴性和非依賴性的途徑，和內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)直 接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸有助于樹(shù)突細(xì)胞的最終成熟和細(xì)胞因子分泌。遇到 危險(xiǎn)信號(hào)后不久，抗原攝入的效率、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和降解和MHC分子的 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸受到修飾。肽裝栽以及半泉期和向MHC分子的細(xì)胞表面的 遞送增加。T細(xì)胞共剌激分子的表面表達(dá)也增加。從而，樹(shù)突細(xì)胞變成 最有效的APC，且是唯一能夠激活幼稚T淋巴細(xì)胞和起始適應(yīng)性免疫應(yīng) 答的細(xì)胞。與它們的抗原呈遞能力的修飾相伴隨的是，成熟還誘導(dǎo)樹(shù)突 細(xì)胞大規(guī)模遷移出外周組織。趨化因子受體以及粘附分子的修飾以及細(xì)樹(shù)突細(xì)胞成熟的誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞應(yīng)答兩種類(lèi)型的信號(hào)病原體的直接識(shí)別(通過(guò)特定模式 識(shí)別受體)和感染的間接感知(通過(guò)炎性細(xì)胞因子、內(nèi)部細(xì)胞化合物和 正在進(jìn)行中的特異免疫應(yīng)答)。應(yīng)答這些信號(hào)，樹(shù)突細(xì)胞被激活并且進(jìn) 入成熟程序，其將樹(shù)突細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有效的T細(xì)胞刺激物。已經(jīng)報(bào)道至少 5種類(lèi)型的表面受體觸發(fā)樹(shù)突細(xì)胞成熟(i)Toll樣受體(TLR) , (ii) 細(xì)胞因子受體，(iii) TNF-受體(TNF-R)家族分子，(iv)FcR,和(v) 細(xì)胞死亡的傳感物。 一些最有效的成熟刺激由TLR(TLRl-9)與它們各自 的配體相互作用介導(dǎo)。Kaisho和Akira綜迷了關(guān)于Toll樣受體的知識(shí) ("Toll-like receptors as adjuvant receptors". 5,'oc/zz>mca " S,o/ / 少wc"爿"a， 2002， 1589: 1-13)。 TLR在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞以及其他細(xì)胞如B'淋巴 細(xì)胞上表達(dá)。也已經(jīng)鑒定了幾種TLR的配體。這些配體大多數(shù)來(lái)自病原 體，但是在宿主中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，從而提示TLR對(duì)于感知侵入的微生物是關(guān) 鍵的。TLR的配體識(shí)別通過(guò)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的上 調(diào)引起先天免疫的快速活化。激活的先天免疫隨后導(dǎo)致有效的適應(yīng)性免 疫。關(guān)于TLR4，特異識(shí)別的分子模式是LPS(革蘭氏陰性細(xì)菌)、脂磷壁 酸質(zhì)(革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)、紫杉醇、F蛋白(呼吸道合胞病毒)、熱激蛋 白60和纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域。因此，能夠誘導(dǎo)最佳的T細(xì)胞應(yīng)答的候選疫苗必須滿足幾種條件。 首先，它必須靶定APC以將抗原來(lái)源的T細(xì)胞表位遞送到MHC I和/ 或II類(lèi)分子。從而，靶定DC可以代表設(shè)計(jì)用于疫苗開(kāi)發(fā)的新遞送系統(tǒng) 中的主要目標(biāo)。此外，栽體必須遞送合適的信號(hào)到DC以誘導(dǎo)它們的活化。無(wú)成熟信號(hào)的抗原向DC遞送可以誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞 的耐受而不是活化。此外，它的效率必須不受預(yù)先存在的針對(duì)栽體自身 的免疫的影響。將抗原肽遞送到MHC I和/或II類(lèi)分子的第一種方法是基于合成肽 疫苗，其含有所選的表位，所述表位能夠直接結(jié)合到APC表面上的這 些分子。在一些情況下，這些肽已經(jīng)導(dǎo)致鼠模型中的腫瘤保護(hù)或者病毒 清除，而在其他情況中，它們已經(jīng)導(dǎo)致耐受誘導(dǎo)。用不同類(lèi)型的肽進(jìn)行 的人試驗(yàn)引起對(duì)癌癥的適度的臨床反應(yīng)。多種不同的策略當(dāng)前處于開(kāi)發(fā)中?；旧希梢詫⑺鼈兎殖蓛深?lèi)。 第一類(lèi)是基于抗原的APC合成或者它被主動(dòng)遞送到這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 和利用"經(jīng)典的"MHC I抗原加工途徑。第二類(lèi)利用APC的交叉呈遞能力 并且基于游離的或者細(xì)胞結(jié)合的外源抗原。已經(jīng)依靠細(xì)菌毒素進(jìn)行了抗 原向APC的細(xì)胞質(zhì)的遞送(Mor6n等人，"New tools for antigen delivery to the MHC class I pathway".麗ms /" /畫(huà)畫(huà)/ogy, 2004; 25: 92-97)。作 為實(shí)例，EPU88446A1涉及基于百日咳博德特氏菌(SoWe"〃a pertussis ) 腺苷酸環(huán)化酶毒素的蛋白質(zhì)栽體，用于分子遞送到CDllb表達(dá)細(xì)胞。本發(fā)明涉及纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域A(EDA)——TLR4的可能的天然 配體——作為抗原遞送到TLR4表達(dá)細(xì)胞的理論手段，其可以誘導(dǎo)APC 的合適的選擇和成熟，并最終導(dǎo)致有效的特異的CTL應(yīng)答。纖連蛋白分 子是信號(hào)基因的產(chǎn)物，并且所得蛋白質(zhì)可以以多種形式存在，所述多種 形式由信號(hào)前-mRNA的可變剪接引起(Pankov R和Kenneth MY, "Fibronectin at a glance". Jow"a/ o/Ce〃 Sde"ce, 2002; 1 15:3861-3863)。 在1U型重復(fù)的中心組內(nèi)發(fā)生主要類(lèi)型的剪接。外顯子使用或者跳躍導(dǎo) 致包括或者排除兩種III型重復(fù)之一額外結(jié)構(gòu)域B(也稱(chēng)作EDB,EIIIB 或EDII),和額外結(jié)構(gòu)域A (也稱(chēng)作EDA， EIIIA或EDI)。應(yīng)答組織損傷 產(chǎn)生細(xì)胞纖連蛋白，其含有可變剪接的EDA和EDB。在其他生物學(xué)功 能中，已經(jīng)表明EDA誘導(dǎo)蛋白聚糖釋放，和金屬蛋白酶(MMP 1、 3和 9)和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)(綜述見(jiàn)Saito S等人，"The Fibronectin Extradomain A activates matrix metalloproteinase gene expression by an interleukin-1-dependent mechanism", J. 腸/. CTz昆 1999; 161:3071-3076)。也已經(jīng)描迷EDA能夠活化TLR4，從而誘導(dǎo)LPS樣應(yīng)答(Okanuim Y等人,"The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4",J. 5/o/. CT ew. 2001; 276:10229-10233)。
如以前指出的，用于加強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的策略的開(kāi)發(fā)打開(kāi)了開(kāi) 發(fā)用于治療癌癥或傳染病的疫苗之門(mén)。具體地，在丙型肝炎病毒感染中， 已經(jīng)描迷免疫應(yīng)答在感染的清除中起基本的作用，因此免疫加強(qiáng) (immunostrengthening )策略的使用組成了治療和預(yù)防該感染的備選方 案。
丙型肝炎病毒(HCV)是單鏈RNA病毒，其屬于黃病毒科(Flaviviridae) (Miller RH.和Purcell RH. 1990. PNAS. 87:2057)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到該病毒是 慢性肝炎和肝疾病的主要病原體之一并且估計(jì)它在全世界影響1億7千 萬(wàn)人(世界衛(wèi)生組織(World-Health-Organization). Hepatitis C. Wkly Epidemiol Rec 1997; 72:65)。 HCV感染的一個(gè)主要特征是它高度傾向于 慢性(70%的感染)和發(fā)展肝硬化(20% ),具有發(fā)展肝癌的高風(fēng)險(xiǎn) (Dienstag等人，Gastroenterology 1983; 85:439)。用IFN-a治療是HCV 感染的最常見(jiàn)療法，但是它僅僅在20-30%的所治療的患者中有效 (Camps等人，J Hepatol 1993; 17:390)。 IFN-a和病毒唑的組合改善了這 些結(jié)果(30-40%的患者以持續(xù)方式清除了該病毒)，但是仍然有高百分 比的患者抗治療(Poynard等人，Lancet 1998; 352:1426)。從而，開(kāi)發(fā)用 于治療慢性丙型肝炎的新的治療策略是尤其重要的。
HCV基因組是9.6kb，它在大的可讀框側(cè)翼的5，和3，端含有高度保 守的非編碼區(qū)，所迷可讀框編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(核心、E1和E2)和至 少6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、 NS3、 NS4a、 NS5a和NS5b) (Major, ME和 Feinstone SM. (1997) Hepatology 25， 1527)。
HCV的急性感染后或者用IFN-a治療后的病毒清除與存在對(duì)病毒蛋 白質(zhì)的強(qiáng)烈的細(xì)胞CD4和CD8免疫應(yīng)答有關(guān)。具體地，對(duì)HCV非結(jié)構(gòu) NS3蛋白質(zhì)的CD4應(yīng)答與急性感染后的病毒清除有關(guān)，而該T細(xì)胞應(yīng) 答的不存在涉及病毒持久性和慢性感染的確立(Diepolder等人，Lancet 1995; 346:1006, Pape等人J Viral Hepat 1999; 6 S叩pl 1:26-40)。而且, 許多研究已經(jīng)鑒定了 HCV感染的患者中NS3蛋白質(zhì)內(nèi)的多種細(xì)胞毒性 表位。這些數(shù)據(jù)表明NS3蛋白質(zhì)可以是誘導(dǎo)抗HCV細(xì)胞應(yīng)答的好的靶。
發(fā)明詳迷
一方面，本發(fā)明涉及包含對(duì)應(yīng)于-纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(EDA),或
-所迷EDA結(jié)構(gòu)域的能夠結(jié)合TLR4的片段，或者
-所迷EDA結(jié)構(gòu)域或者片段的變體，其能夠結(jié)合TLR4并且與任何EDA
結(jié)構(gòu)域天然形式或者片段有70 %以上的同源性，
^:本發(fā)明中，該試劑包括纖連蛋白的EDA結(jié)構(gòu)域和需要對(duì)其產(chǎn)生 免疫應(yīng)答的抗原，這些組分作為單獨(dú)的實(shí)體或者共價(jià)結(jié)合存在。
在本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)中，所述c)項(xiàng)中引用的能夠結(jié)合TLR4的EDA 結(jié)構(gòu)域或者片段的變體的特征是它的氨基酸序列通過(guò)a)和b)項(xiàng)中定義 的多肽中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、添加或者缺失得到。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)中，所述c)項(xiàng)的能夠結(jié)合的片段的特征是它 與EDA結(jié)構(gòu)域的任何天然形式或者其對(duì)應(yīng)的片段具有超過(guò)85%程度的 同源性，并且在更優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)中，它與所述纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域的天 然形式或其對(duì)應(yīng)的片段有超過(guò)95 %程度的同源性。
根據(jù)本發(fā)明，在具體實(shí)現(xiàn)中，纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列 是能夠結(jié)合TLR4的任何天然形式的EDA的氨基酸序列。該EDA結(jié)構(gòu) 域可以選自任何動(dòng)物物種，尤其哺乳動(dòng)物，即，嚙齒類(lèi)動(dòng)物(小鼠、大 鼠等等)或者靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(尤其人)中的天然形式的結(jié)構(gòu)域。
在另一具體實(shí)現(xiàn)中，免疫刺激劑包含EDA結(jié)構(gòu)域的部分氨基酸序 列，其特征是它能夠結(jié)合TLR4。
在本發(fā)明的再一個(gè)具體實(shí)現(xiàn)中，EDA結(jié)構(gòu)域是任一所述EDA結(jié)構(gòu) 域天然形式或者片段的經(jīng)修飾的變體，并且特征也是它保留結(jié)合TLR4 的性質(zhì)。在具體實(shí)施方案中，這種變體EDA結(jié)構(gòu)域與任一EDA結(jié)構(gòu)域 天然形式有70%以上的同源性。通過(guò)首先將纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域天然 形式或者其片段的序列與其他候選多肽序列相比較，可以選擇合適的經(jīng) 修飾變體。可以使用任何比對(duì)算法(即，F(xiàn)ASTA, Lip歸n DJ, Pearson WR. Rapid and sensitive protein similarity searches, Science. 1985 Mar 22;227(4693):1435-41)或者計(jì)算機(jī)軟件(即，來(lái)自Ubvelocity Inc.的 Jellifish或者來(lái)自NCBI的Blast軟件)進(jìn)行同源性分析。然后，對(duì)具有 70%以上同源性的候選多肽序列測(cè)試它們的TLR4結(jié)合能力。通過(guò)任何 常規(guī)的結(jié)合測(cè)定，例如，通過(guò)使用如John Wiley & Sons (編者John E, Coligan, Ada M Kruisbeek， David H. Margulies， Ethan M. Shevach，Warren Strober)(定期更新.更新直到2005年5月1日)出版的The
Current Protocols in Immunology和The current protocols in Protein
Science中描述的流式細(xì)胞術(shù)，評(píng)估TLR4結(jié)合性質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，EDA結(jié)構(gòu)域包含選自下面的序列 a )小鼠EDA結(jié)構(gòu)域的全部氨基酸序列(Entrez Protein: NM—010233,
氨基酸1721到1810; SEQ. ID. NO: 2，氨基酸2-91);
b )人EDA結(jié)構(gòu)域的全部氨基酸序列(Entrez Protein NM—002026,氨
基酸1631到1716; SEQ. ID. NO: 4);和
c)序歹寸a)和b)的能夠結(jié)合表達(dá)TLR4的細(xì)胞的片段。 在另一具體實(shí)現(xiàn)中，所述EDA結(jié)構(gòu)域包含選自下面的序列
a) SEQ. ID. NO:6的氨基酸2-57，其對(duì)應(yīng)于小鼠纖連蛋白EDA結(jié) 構(gòu)域的可變剪接形式；
b) SEQ. ID, NO: 8，其是人EDA結(jié)構(gòu)域的可變剪接形式；和
c) 序列a)和b)的能夠結(jié)合表達(dá)TLR4的細(xì)胞的片段。 在一些實(shí)施方案中，免疫刺激劑可以還包括一種或多種目的分子。
當(dāng)存在于免疫刺激劑中時(shí)，目的分子可以以與所迷試刑的其他成分組合 有效產(chǎn)生針對(duì)所述分子的免疫應(yīng)答的量施用。
在優(yōu)選實(shí)現(xiàn)中，EDA結(jié)構(gòu)域(或者其片段或變體)和目的分子在相 同的雜種分子或者蛋白質(zhì)栽體中連接在一起。
在另一方面，本發(fā)明涉及如上述的蛋白質(zhì)栽體，其中所述目的分子 選自多肽、脂肽、寡糖、多糖、核酸、脂質(zhì)和化學(xué)藥品。
在蛋白質(zhì)栽體的具體實(shí)現(xiàn)中，所述目的分子是抗原或者表位。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，偶聯(lián)到栽體的抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原、真 菌抗原或者寄生物抗原。在具體實(shí)現(xiàn)中，所述病毒抗原是來(lái)自丙型肝炎 病毒的病毒抗原，且在優(yōu)選實(shí)現(xiàn)中，所述丙型肝炎病毒抗原是NSS蛋白 或者其抗原片段。NS3蛋白指丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)NS3蛋白，其是67kDa 蛋白質(zhì)，包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域包含從N末端起189個(gè)氨基酸的絲氨酸蛋白 酶，和包含從C末端起442個(gè)氨基酸的解旋酶-核苷三磷酸酯酶。在本 發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體中包括的NS3蛋白質(zhì)序列可以對(duì)應(yīng)于人丙型肝炎病 毒的任何毒林或者分離物。
在另一實(shí)施方案中，所述抗原是腫瘤抗原或者腫瘤抗原決定簇。如 本文所用的，"表位"指結(jié)合MHC I類(lèi)或者II類(lèi)分子并且可以分別被CD8+或CD4+ T細(xì)胞的T細(xì)胞受體分子識(shí)別并且誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的肽序列。
在具體實(shí)現(xiàn)中，所迷目的分子是來(lái)自卵清蛋白的抗原性細(xì)胞毒性T 決定簇(OVA 257-264)或SIINFEKL(SEQ. ID. NO: 2,氨基酸95-102,其 側(cè)翼是表位C-末端和N-末端的3個(gè)額外氨基酸，QLE-SIINFEKL-TEW)。
所述抗原可以是能夠產(chǎn)生Th免疫應(yīng)答、CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答、NK 細(xì)胞應(yīng)答、Y/ST淋巴細(xì)胞應(yīng)答或者抗體應(yīng)答的任何材料。合適的抗原包 括，但不局限于肽、多肽、脂質(zhì)、糖脂、多糖、糖類(lèi)、多核苷酸、朊病 毒、細(xì)菌、病毒或者活的或者滅活的真菌；和來(lái)自細(xì)菌、病毒、真菌、 原生動(dòng)物、腫瘤或者微生物、毒素或者類(lèi)毒素的抗原。
在蛋白質(zhì)栽體的另一具體實(shí)現(xiàn)中，所述目的分子是變應(yīng)原。
這樣，EDA結(jié)構(gòu)域還作為抗原遞送到表達(dá)TLR4的細(xì)胞的栽體起作用。
在本發(fā)明的另一尤其重要的實(shí)現(xiàn)中，所述目的分子是化學(xué)或者遺傳 偶聯(lián)到蛋白質(zhì)栽體的化學(xué)藥品或者藥物。這樣，所述蛋白質(zhì)栽體可用于 靶定表達(dá)TLR4的細(xì)胞的特定藥物。
在具體實(shí)現(xiàn)中，所述蛋白質(zhì)栽體的特征還在于它還包含標(biāo)記序列， 如N-末端組氨酸尾。當(dāng)依靠基因工程方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)栽體時(shí)，這將簡(jiǎn)化 純化方法。作為實(shí)例，序列SEQ. ID. NO: 2和SEQ. ID. NO: 6代表本發(fā) 明的蛋白質(zhì)載體的特定實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明具體的非限制性實(shí)現(xiàn)中，蛋白質(zhì) 栽體包含序列SEQIDNO: 10，其包含NS3蛋白質(zhì)的片段。
摻入蛋白質(zhì)栽體中的EDA結(jié)枸域的特征是它結(jié)合TLR4并且進(jìn)一 步促進(jìn)目的分子運(yùn)輸?shù)奖磉_(dá)TLR4的細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中。
的用途。在具體實(shí)現(xiàn)中，、表達(dá)T ;4的細(xì)胞是任何類(lèi)型的抗原呈遞細(xì)胞 (APC)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類(lèi)APC是樹(shù)突細(xì)胞。
在本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)中，蛋白質(zhì)載體的特征是它促進(jìn)目的抗原或表 位的運(yùn)輸，從而進(jìn)一步促成加工和裝栽到MHC分子上用于抗原呈遞到 T淋巴細(xì)胞。
在另一實(shí)現(xiàn)中，蛋白質(zhì)栽體的特征是它能夠刺激被靶定的APC的 成熟，從而增加MHC分子和共刺激信號(hào)的表達(dá)。在尤其有利的實(shí)施方 案中，蛋白質(zhì)栽體的特征是它能夠同時(shí)誘導(dǎo)抗原呈遞和促進(jìn)APC成熟，從而誘導(dǎo)有效的抗原特異性免疫應(yīng)答。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原
特異性免疫應(yīng)答是CTL應(yīng)答。
通過(guò)重組DNA技術(shù)可以得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體。從而，在另一 方面，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的核酸，其編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體。該核酸 可以從所述蛋白質(zhì)栽體的氨基酸序列容易地推導(dǎo)。
該經(jīng)修飾的核酸可以包含在DNA構(gòu)建體中。從而，本發(fā)明提供了 DNA構(gòu)建體，其包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體的核酸。該DNA構(gòu)建體 可以整合可操作地連接編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體的核酸的控制序列。 "可操作地連接"當(dāng)指核酸時(shí)，指將所述核酸置于與另一核酸序列功能關(guān) 系中。"控制序列"是特定宿主細(xì)胞識(shí)別的表達(dá)信號(hào)，其調(diào)節(jié)具體編碼序 列的功能，如轉(zhuǎn)錄和翻譯(控制序列的實(shí)例是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終 止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、蛋白質(zhì)分泌或者其他亞細(xì)胞定位的信號(hào)肽)。 通過(guò)在方便的限制位點(diǎn)上連接實(shí)現(xiàn)所需序列的連接。如果此類(lèi)位點(diǎn)不存 在，那么根據(jù)常規(guī)方法使用合成的寡核苷酸銜接頭或者接頭。這方面的 優(yōu)點(diǎn)通過(guò)如下事實(shí)代表該DNA構(gòu)建體還包含編碼基序或者表型的標(biāo) 記或者基因，所述基序或者表型允許選擇依靠DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞。本發(fā)明提供的經(jīng)修飾的核酸和DNA構(gòu)建體可以依靠許多實(shí)驗(yàn)室 手冊(cè)中概述的公知的常規(guī)方法得到(例如，"Molecular Cloning: a Laboratory manual." Joseph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001， 3rd ed. Cold Spring Harbor, New York)。
在具體實(shí)現(xiàn)中，本發(fā)明提供的經(jīng)修飾的核酸或者DNA構(gòu)建體包含 SEQ. ID, NO: 1 、 SEQ ID. NO: 5、 SEQ ID NO: 9 (EDA-NS3)或SEQ ID NO: 11 (EDA-OVA)。
可以將本發(fā)明提供的經(jīng)修飾的核酸或者DNA構(gòu)建體插入合適的栽 體中。從而，在另一方面，本發(fā)明涉及栽體，如表達(dá)栽體，其包含所提 到的經(jīng)修飾的核酸或者DNA構(gòu)建體。栽體的選擇將取決于該栽體將插 入的宿主細(xì)胞。例如，核酸插入的栽體可以是質(zhì)?；蛘卟《荆洚?dāng)插入 到細(xì)胞中時(shí)，可以整合或不整合到細(xì)胞基因組中。可以通過(guò)常規(guī)方法得 到載體(Sambrook等人，2001,如上引用)。
在另一方面，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，如轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含本 發(fā)明提供的經(jīng)修飾的核酸或者DNA構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)宿主細(xì) 胞是原核生物，即大腸桿菌(Ew/^n'c/H" co//),或者真核宿主，即酵母(例如，啤酒糖酵母(S"C(^"raW少CM ce"v/i7'"g )、 巴斯德畢赤氏酵 母(尸/c/na尸"Won's ))、昆蟲(chóng)細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)現(xiàn)中，包含編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體的經(jīng)修 飾的核酸或者DNA構(gòu)建體的表達(dá)栽體意在用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移或者療法。 在更具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)栽體是病毒栽體。為此目的的合適的病 毒栽體包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、曱病毒、皰 疹病毒、冠狀病毒衍生的栽體，等等。
在另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體的方法，其包括 在允許表達(dá)所述蛋白質(zhì)栽體的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的核酸 或者DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。最優(yōu)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)的條件將取決于 使用的宿主細(xì)胞的類(lèi)型。如果需要，那么用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體 的方法包括分離和純化所述栽體。
備選地，通過(guò)其他常規(guī)方法可以得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體。此類(lèi)方 法包括，例如，固相化學(xué)合成、用高效液相層析(HPLC)純化，和如 果優(yōu)選，通過(guò)常規(guī)技術(shù)分析，如測(cè)序或者質(zhì)語(yǔ)分析法、氨基酸分析、磁 共振技術(shù)，等等。
在另一實(shí)現(xiàn)中，可以如下得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)栽體將具有對(duì)應(yīng)于 纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(EDA),或者所述EDA結(jié)構(gòu)域的能夠結(jié)合TLR4 的片段，或者所述EDA結(jié)構(gòu)域的變體的氨基酸序列的多肽與目的分子 (例如，多肽、脂肽、寡糖、多糖、核酸、脂質(zhì)或者其他化學(xué)藥品)共 價(jià)連接。這可以使用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中概迷的常規(guī)方法進(jìn)行，所述實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè)諸如John Wiley & Sons出版的〃The current protocols in protein chemistry〃(定期更新。更新直到2005年5月1日)或者"Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia和PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA， 1992。
隨后，根據(jù)本發(fā)明，所迷蛋白質(zhì)載體、或者編碼其的經(jīng)修飾的核酸 和DNA構(gòu)建體，或者整合所迷核酸或者DNA構(gòu)建體的表達(dá)栽體和表達(dá) 宿主細(xì)胞可以用于制備藥物組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如前迷的具有對(duì)應(yīng)于纖連蛋白EDA 結(jié)構(gòu)域(EDA)或者其片段或變體的氨基酸序列的多肽在制備免疫刺激 劑中的用途，其特征是所述免疫刺激劑是藥物組合物。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以用于刺激抗原呈遞細(xì)胞的成熟，或者誘導(dǎo)對(duì)目的分子特異的有效免疫應(yīng)答。在具體實(shí)施方案 中，所述藥物組合物可以用于誘導(dǎo)所迷免疫刺激組合物所施用的受試者
中的Thl免疫應(yīng)答。如本文所用的，"誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答"可以包括其中 免疫刺激組合物誘導(dǎo)混合的Thl/Th2應(yīng)答的情況。然而，在其他情況中， 免疫刺激組合物可以誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，并且有很小的或者基本上不誘 導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答。在具體實(shí)現(xiàn)中，所述藥物組合物可以用于誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。
在一些實(shí)施方案中，免疫刺激組合物可以用作免疫刺激佐劑，例如， 與一種或多種抗原組合，具有或沒(méi)有額外的佐劑。從而，在一些情況中， 所述免疫刺激組合物可以形成疫苗。在其他情況中，所述免疫刺激組合 物可以用作佐劑，其可以連同疫苗使用。
包括所述包含纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(或者其片段或變體)的多肽 的免疫刺激組合物可以增強(qiáng)經(jīng)活化的CD8+ T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)充，產(chǎn)生記 憶CD8+丁細(xì)胞，或者兩者。從而，本發(fā)明的免疫刺激組合物可以在接 受該免疫刺激組合物的受試者中增強(qiáng)抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
在具體實(shí)現(xiàn)中，包含纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(或者其片段或變體) 的免疫刺激組合物用于治療和預(yù)防傳染病、腫瘤疾病或者變應(yīng)性疾病。 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述組合物用于治療和預(yù)防丙型肝炎。
包含纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(或者其片段或變體)的免疫刺激組合 物可以額外含有栽體、賦形劑和其他已知的藥學(xué)上可接受的成分。
方法(例如，經(jīng)口、皮下、經(jīng)鼻、局部)施用于動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物 (人或者非人)、家禽等等。
本發(fā)明還提供了治療和/或預(yù)防方法，其包括對(duì)受試者施用包含纖連 蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(或者其片段或變體)的免疫刺激組合物。
合適的施用途徑包括經(jīng)皮或者跨粘膜吸收、注射(例如，皮下、腹 膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)，等等)、攝食、吸入，等等。
在另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括至少一種可接受的藥 物栽體和有效量的處于至少一種表達(dá)形式或?qū)嵤┓桨钢械牡鞍踪|(zhì)栽體
a) 多肽形式的蛋白質(zhì)載體；
b) 編碼所述蛋白質(zhì)栽體的經(jīng)修飾的核酸；
c) 包含所迷經(jīng)修飾的核酸的表達(dá)栽體；或者d)也包含所迷經(jīng)修飾的核酸的表達(dá)宿主細(xì)胞。
在另一具體實(shí)現(xiàn)中，所迷藥物組合物的特征是它包含有效量的樹(shù)突 細(xì)胞，其中所述樹(shù)突細(xì)胞已經(jīng)在體外與處于至少一種表達(dá)形式或?qū)嵤┓?案中的蛋白質(zhì)栽體溫育。在更具體的實(shí)施方案中，所迷藥物組合物是疫 苗或者免疫治療組合物。
而且，在本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)栽體的一些額外用途。在本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案中，處于其任一表達(dá)形式的蛋白質(zhì)栽體用于制備藥物組合 物，該藥物組合物在體外或體內(nèi)有效誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟。
在另一實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)栽體用于制備藥物組合物，所述藥 物組合物用于誘導(dǎo)特異針對(duì)偶聯(lián)到所述蛋白質(zhì)栽體的目的分子(抗原或 表位)的特異免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答(針對(duì)目的分子的 抗體產(chǎn)生)、丁輔助細(xì)胞應(yīng)答，或者細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。在優(yōu)選實(shí)施 方案中，所述免疫應(yīng)答是CTL應(yīng)答。
在更具體的實(shí)現(xiàn)中，本發(fā)明涉及所迷蛋白質(zhì)栽體在制備用于治療和 預(yù)防傳染病的藥物組合物中的用途。所述傳染病可以是細(xì)菌、病毒、真 菌或者寄生物的傳染病。
在另一具體實(shí)現(xiàn)中，本發(fā)明涉及所述蛋白質(zhì)栽體在制備用于治療和 預(yù)防腫瘤疾病的藥物組合物中的用途。
在再一個(gè)具體實(shí)現(xiàn)中，本發(fā)明涉及所迷蛋白質(zhì)栽體在制備用于治療
和預(yù)防變應(yīng)性疾病的藥物組合物中的用途。許多變應(yīng)性疾病涉及Th2免 疫應(yīng)答的活化。從而，通過(guò)使用攜帶特定變應(yīng)原的蛋白質(zhì)栽體使從Th2 背離或者轉(zhuǎn)換為T(mén)hl應(yīng)答可能對(duì)變應(yīng)性疾病具有保護(hù)性或者治療效果。 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所提出的藥物組合物用于施用于動(dòng)物 或者人宿主。可以使用任一合適的施用途徑。在具體實(shí)現(xiàn)中，通過(guò)腸胃 外途徑(即，靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))、經(jīng)皮途徑或者粘膜途徑施用所迷 藥物組合物。
附圖簡(jiǎn)述


圖1.所產(chǎn)生和純化的EDA和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析。將一等分試樣的EDA和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)裝栽到15%聚丙 烯酰胺凝膠上并進(jìn)行電泳。分子量標(biāo)記(MWM)以KDa表示。觀察到 對(duì)應(yīng)于EDA和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)的推定分子量(13-14 KDa)的帶。圖2.蛋白質(zhì)栽體EDA-SIINFEKL與TLR4的結(jié)合。2A.直接結(jié)合 測(cè)定。將HEK293-LacZ細(xì)胞(HEK293-LacZ)和HEK293-TLR4/MD2/CD14 (HEK293-TLR4)細(xì)胞用1pM EDA畫(huà)SIINFEKL脈沖,用低聚甲醛固定，用 抗-His和抗-EDA抗體標(biāo)記，并用抗小鼠IgG-FITC顯色且通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)分析。2B. EDA抑制抗-TLR4抗體與TLR4表達(dá)性細(xì)胞結(jié)合的能力。 將HEK-TLR4細(xì)胞在500 nM EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)存在或不存在下在 4。C溫育2小時(shí)。洗滌細(xì)胞并與抗TLR4抗體溫育，用FITC染色并通過(guò) 流式細(xì)胞術(shù)分析。2C.依靠使用不同濃度的EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)對(duì)抗 TLR4抗體與TLR4表達(dá)性細(xì)胞結(jié)合的抑制百分比。2D,細(xì)胞粘附測(cè)定。 將用氖標(biāo)記的timidine染色的HEK-hTLR4或HEK-LacZ細(xì)胞分散在以 前用EDA蛋白質(zhì)包被的96孔微量培養(yǎng)板的孔中并在37。C下溫育2小 時(shí)。除去非貼壁的細(xì)胞，而收獲貼壁的細(xì)胞并在Topcount閃爍計(jì)數(shù)器中 測(cè)量摻入的放射性。借助標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔貼壁細(xì)胞數(shù)。
圖3. EDA-SIINFEKL激活TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑。比色法測(cè)量用該 報(bào)道基因轉(zhuǎn)染的HEK293/TLR4-MD2-CD14或HEK293/LacZ表達(dá)細(xì)胞的 培養(yǎng)上清液中人分泌的胚胎堿性磷酸酶基因，所迷報(bào)道基因的表達(dá)受到 NF-kb-誘導(dǎo)型ELAM-1啟動(dòng)子控制。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在不同濃度的LPS、 100 nM EDA-SIINFEKL蛋白(EDA)或事先用蛋白酶K消化的100 nM EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)存在或不存在下溫育細(xì)胞。條表示NF-kB倍數(shù)誘 導(dǎo)(用來(lái)自HEK293/TLR4-MD2-CD14的上清液得到的OD除以用來(lái)自 HEK293/LacZ的上清液得到的OD )。
圖4. EDA-SIINFEKL誘導(dǎo)體外DC的促炎細(xì)胞因子分泌。將骨髄來(lái) 源的DC在LPS (1 pg/ml)、 EDA-SIINFEKL (500 nM)、蛋白酶K消化的 EDA-SIINFEKL (500 nM)或者鹽水溶液存在下培養(yǎng)。24小時(shí)后，通過(guò) ELISA測(cè)量培養(yǎng)上清液中IL-12 (A)和TNF-a(B)的存在。
圖5. EDA-SIINFEKL誘導(dǎo)體內(nèi)CDlleDC成熟。樹(shù)突細(xì)胞的成熟是 T細(xì)胞應(yīng)答的最佳刺激所必需的。當(dāng)發(fā)生成熟時(shí)，APC增加表面分子如 I類(lèi)(我們的模型中H2K"和II類(lèi)MHC (我們的模型中IAb) 、 CD40、 CD80和CD86分子的表達(dá)。因此，我們分析EDA-SIINFEKL是否將在 體內(nèi)誘導(dǎo)CDllc表達(dá)性細(xì)胞的成熟。將C57BL/6 wt小鼠用25 EDA-SIINFEKL、用蛋白酶K消化的25 EDA-SIINFEKL、 25 LPS 或者僅僅PBS靜脈內(nèi)(i.v.)免疫。同樣，將C57BL/6 TLR4 KO小鼠用25EDA-SIINFEKL或者僅僅用PBS免疫。15小時(shí)后，處死小鼠并通過(guò) autoMACS純化CD1 lc細(xì)胞。將細(xì)胞標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析H-2Kb、 I-Ab、 CD40、 CD80和CD86分子的表達(dá)。
圖6: EDA-SIINFEKL被樹(shù)突細(xì)胞有效呈遞到對(duì)SIINFEKL表位特異 的T細(xì)胞。我們表征了 EDA-SIINFEKL被APC捕獲以將經(jīng)加工的CTL 表位SHNFEKL呈遞給來(lái)自0T-1轉(zhuǎn)基因小鼠的對(duì)該表位特異的T細(xì)胞 的能力。(A)來(lái)自0T-1轉(zhuǎn)基因小鼠的非貼壁細(xì)胞的IFN-y產(chǎn)生。在僅 僅培養(yǎng)基、不同濃度的合成SIINFEKL肽、SIINFEKL和EDA、 EDA-SIINFEKL (融合蛋白)或者僅僅EDA的存在下培養(yǎng)骨髄來(lái)源的 DC。 24小時(shí)后，收獲DC并用作105非貼壁0T-1細(xì)胞存在下的APC。 再過(guò)24小時(shí)后，回收上清液并測(cè)量分泌的1FN-y。(B) TLR4分子依賴性。 在來(lái)自C57BL/6 wt小鼠的脾細(xì)胞存在下或者與TLR4分子(l()S細(xì)胞/孔) 敲除小鼠的脾細(xì)胞一起和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)(IOO nM)溫育B3Z雜交 瘤細(xì)胞(105細(xì)胞/孔)。(C)將來(lái)自C57BL76wt小鼠脾的細(xì)胞與B3Z雜 交瘤細(xì)胞和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)在存在或不存在抗TLR4抗體下共培 養(yǎng)。(B和C)通過(guò)基于使用CTLL細(xì)胞系的生物測(cè)定測(cè)量分泌到培養(yǎng) 上清液的IL-2的量。(D)氯喹、莫能菌素(monensine)、布雷菲德菌素 (brefeldine)或者環(huán)己酰亞胺對(duì)融合蛋白EDA-SIINFEKL的抗原呈遞的作 用。在不存在或存在30mM氯喹、布雷菲德菌素、莫能菌素或4pg/ml 環(huán)己酰亞胺下，溫育骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞1小時(shí)，然后加入 EDA-SIINFEKL或合成肽SIINFEKL(白色條)。培養(yǎng)10小時(shí)后，將所述 DC在戊二醛中固定，并用作與非貼壁0T-1小鼠細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/孔)的 共培養(yǎng)物中的抗原呈遞細(xì)胞(APC) (104個(gè)細(xì)胞/孔)。24小時(shí)后，通過(guò)商 業(yè)ELISA測(cè)量分泌的IFN-y的量。
為了研究APC上的TLR4表達(dá)是否可以促成呈遞過(guò)程，我們?cè)趤?lái)自 C57BL/6 wt小鼠或者來(lái)自TLR4 KO小鼠的脾細(xì)胞和不同濃度的 EDA-SIINFEKL (nM)存在下培養(yǎng)B3Z雜交瘤細(xì)胞(對(duì)SIINFEKL表位特 異)。通過(guò)基于CTLL的生物測(cè)定測(cè)量釋放到培養(yǎng)上清液中的IL-2的量 (圖6E)。
圖7.用EDA-SIINFEKL免疫小鼠誘導(dǎo)對(duì)SIINFEKL表位特異的細(xì)胞 應(yīng)答。前面的結(jié)果證明EDA-SIINFEKL重組蛋白質(zhì)是生物活性的并且特 異性活化APC。在體內(nèi)特異的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)對(duì)于疫苗的開(kāi)發(fā)是關(guān)鍵的。從而，我們測(cè)試了用EDA-SIINFEKL融合蛋白免疫的小鼠是否 發(fā)展了針對(duì)該表位的特異細(xì)胞應(yīng)答。(A)產(chǎn)生IFN-y的細(xì)胞的誘導(dǎo)。在 第0和10天，將C57BL/6小鼠用1.5nmolEDA-SIINFEKL或用1.5畫(huà)l SIINFEKL肽免疫。在第20天，在SIINFEKL存在或不存在下將脾細(xì)胞 溫育48小時(shí)，并通過(guò)ELISA測(cè)量分泌的IFN-y的量。(B) SIINFEKL-特 異性CTL應(yīng)答分析的誘導(dǎo)。在SIINFEKL肽存在下5天期間再次刺激來(lái) 自用EDA-SIINFEKL或用SIINFEKL免疫的小鼠的脾細(xì)胞。該溫育后， 在SIINFEKL肽不存在或存在下，通過(guò)常規(guī)鉻51釋放測(cè)定測(cè)量針對(duì)EL-4 靶細(xì)胞的CTL活性。數(shù)據(jù)表示來(lái)自 一式三份樣品的凈特異裂解值的平均 百分比(用SIINFEKL脈沖的靶細(xì)胞的％裂解減去非脈沖的靶細(xì)胞的％ 裂解)》
圖8. EDA-SIINFEKL保護(hù)免于EG7 OVA表達(dá)性細(xì)胞的腫瘤攻擊。 為了研究EDA-SIINFEKL融合蛋白保護(hù)小鼠抗EG70VA腫瘤細(xì)胞注射 的能力，在第0和IO天用3nmolEDA-SIINFEKL、 SIINFEKL或者用鹽 水溶液皮下(s.c.)免疫小鼠。第二次免疫后20天，用105個(gè)EG70VA 細(xì)胞皮下攻擊小鼠。用卡尺監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)并使用式V = (Lx w2)/2以立方 毫米表達(dá)，其中L為長(zhǎng)度，w為寬度。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到大于8 cn^的體 積時(shí)處死小鼠。
圖9, EDA作為用OVA蛋白免疫后誘導(dǎo)細(xì)胞毒性應(yīng)答中的佐劑。存 在這樣的可能性如果EDA能夠在體內(nèi)促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞成熟，那么它可 以作為用含有細(xì)胞毒性表位的蛋白質(zhì)免疫后的佐劑，但是不能自身激活 細(xì)胞毒性應(yīng)答。為了測(cè)試該可能性，我們用50 pg EDA與500 pg OVA 蛋白質(zhì)(A)免疫一組小鼠，并用500 pgOVA(B)免疫另一組小鼠，不使用 任何其他類(lèi)型的佐劑。免疫后一周，處死小鼠并在SIINFEKL合成肽存 在下培養(yǎng)脾細(xì)胞。培養(yǎng)5天后，在常規(guī)Cr"釋放測(cè)定中，測(cè)量對(duì)用 SIINFEKL肽脈沖的EL-4靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答。
圖10. EDA可以作為更大抗原的栽體。在以前的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證明
CTL應(yīng)答的 秀導(dǎo)。在以后的步驟中，我們想研究EDA是否能夠轉(zhuǎn)運(yùn)更 大的抗原和促進(jìn)誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的細(xì)胞應(yīng)答。為此目的，我們構(gòu)建了 融合蛋白EDA-OVA并在體外和體內(nèi)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。(A)重組 EDA-OVA蛋白的SDS-PAGE分析。在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白EDA-OVA,通過(guò)親和層析純化，脫鹽，解毒，濃縮并通過(guò)SDS-PAGE 分析。觀察到約55kDa的帶，其對(duì)應(yīng)于所述蛋白質(zhì)的推定的分子量。(B) 抗原呈遞實(shí)驗(yàn)。在OVA、EDA-OVA (融合蛋白)EDA加OVA或僅僅EDA 存在下或不存在下培養(yǎng)骨髓來(lái)源的DC。 24小時(shí)后，在來(lái)自O(shè)T-l小鼠 的105非貼壁細(xì)胞存在下，將DC用作抗原呈遞細(xì)胞。通過(guò)商業(yè)ELISA 定量在DC存在下，來(lái)自O(shè)T-l小鼠的非貼壁細(xì)胞的IFN-y產(chǎn)量。(C) EDA-OVA蛋白在體內(nèi)誘導(dǎo)OVA特異的CTL。將C57BL/6小鼠用nmol EDA-OVA或用lnmolOVA免疫。免疫后7天，在SIINFEKL肽存在下 5天期間在體外再次刺激來(lái)自經(jīng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞。之后，在常規(guī)Cr51 釋放測(cè)定中測(cè)量針對(duì)不存在或存在SIINFEKL時(shí)溫育的EL-4細(xì)胞的特異 CTL活性。數(shù)據(jù)代表來(lái)自一式三份樣品的凈特異裂解值的平均百分比
(用SIINFEKL脈沖的靶細(xì)胞的％裂解減去非脈沖的耙細(xì)胞的％裂解)。 圖11. EDA-NS3蛋白質(zhì)產(chǎn)生針對(duì)NS3丙型肝炎病毒蛋白質(zhì)的特異 性CTL應(yīng)答。已經(jīng)觀察到EDA蛋白質(zhì)可以作為大抗原的栽體后，分析 了 EDA誘導(dǎo)對(duì)丙型肝炎病毒NS3蛋白質(zhì)(來(lái)自NS3蛋白質(zhì)的蛋白酶區(qū) 的氨基酸1 - 196)的抗病毒應(yīng)答的能力，作為針對(duì)所述病毒感染的接種 策略。(A)重組EDA-NS3 (l-196)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。構(gòu)建了重 組融合蛋白EDA-NS3并在大腸桿菌中表達(dá)，并通過(guò)SDS-PAGE分析。 (B) EDA-OVA蛋白質(zhì)在體內(nèi)誘導(dǎo)OVA特異性CTL。用溶解在鹽水溶液 中的100 pg/小鼠EDA-NS3蛋白質(zhì)通過(guò)靜脈內(nèi)途徑免疫HHD小鼠
(HLA-A2.1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)基因的) 免疫后一周，用NS3 1073肽(其含有 來(lái)自NS3蛋白質(zhì)的免疫顯性細(xì)胞毒性T決定簇用于HLA-A2限制)體外 再次刺激脾細(xì)胞。培養(yǎng)5天后，使用常規(guī)Cr"釋放測(cè)定，測(cè)量針對(duì)與肽 1073(V)(SEQIDNO:20, CVNGVCWTV),或與所述肽的1073(L)變體 (SEQ ID NO: 21, CLNGVCWTV)或者不存在所述肽時(shí)溫育的T2靶細(xì)胞 的細(xì)胞毒性活性。(C)EDA-NS3蛋白質(zhì)誘導(dǎo)針對(duì)來(lái)自NS3蛋白質(zhì)的不同 表位的多表位應(yīng)答。在肽1038-1046、 NS3 1073-1081或NS3 1169-1177
(其含有NS3蛋白質(zhì)的片段1 - 196內(nèi)的用于HLA-A2限制的三個(gè)細(xì)胞 毒性決定簇)的存在下或用重組NS3蛋白質(zhì)(Mikrogen)體外再次刺激從 用EDA-NS3免疫的小鼠得到的脾細(xì)胞48小時(shí)。通過(guò)商業(yè)ELISA測(cè)量分 泌到上清液中的IFN-y的量。(D) EDA-NS3蛋白質(zhì)誘導(dǎo)持久細(xì)胞毒性應(yīng) 答。用溶于鹽水溶液中的100ing/小鼠的EDA-NS3蛋白質(zhì)通過(guò)靜脈內(nèi)途徑免疫HHD小鼠。免疫后60天，處死小鼠并用常規(guī)的鉻51釋放測(cè)定， 用在不存在或存在NS3 1073肽溫育的T2靶細(xì)胞測(cè)量對(duì)肽NS3 1073特 異的CTL的存在。(E)與EDA-NS3溫育的DC免疫C57BL/6小鼠保護(hù)小 鼠，于受表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白質(zhì)的重組痘苗病毒vHCV(l-3011)的感 染。將小鼠用以前與EDA-NS3蛋白質(zhì)溫育的1(^個(gè)DC免疫，并在7天 后，它們接受通過(guò)腹膜內(nèi)途徑的5xl()6個(gè)痘苗病毒vHCV(l-3011)攻擊。 感染后三天，處死小鼠并依靠BSC-1細(xì)胞感染測(cè)定，定量病毒負(fù)荷/mg 卵巢組織。
實(shí)施例
實(shí)施例.來(lái)自纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域A與TLR4相互作用并激活TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)途徑
1.1材料和方法
1丄1 EDA和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)栽體重組蛋白的表達(dá) 重組蛋白質(zhì)栽體的制備
使用特異引物和來(lái)自用伴刀豆球蛋白A處理以誘導(dǎo)肝損害的小鼠 得到的RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域(EDA) [Lasarte 等人，Hepatology. 2003; 37(2):461-70.]。將肝組織切片勻漿并在Ultraspec (Biotecx， Houston, TX, USA)中使用Ultraturrax Driver T.25 (J汰nke & Kimkel， Ika-Labortechnik,德國(guó))裂解。根椐Chomczynski和Sacchi的方
/9S7; M2.' /56-/59)分離RNA。在補(bǔ)加了 5mM 二硫蘇糖醇(DDT), 0.5mM 脫氧核苷三磷酸(Boehringer Mannheim, Mannheim,德國(guó))，25U核糖核 酸酶抑制劑(Promega Corporation, Madison, WI, USA)和200ng隨機(jī)六聚 體(Boehringer Mannheim)的20 ^L體積的5xRT緩沖液(250mM Tris-HCl Ph 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)中用200U的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶 (Gibco-BRL)反轉(zhuǎn)錄RNA (37°C, 60分鐘)。加熱(95。C， 1分鐘)并在冰 上快速冷卻后，0.3 cDNA庫(kù)用于在含有0.08mM dNTP，上游和下游 引物(每種40ng)， 1.5mM MgCl2和2U 7b《DNA聚合酶(Promega Corpomtion)的20 pi lOx緩沖液(lOOmM Tns-HCl pH9.3， 500mM KCl, 1%Triton X-100)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物是(SEQ. ID. NO: 13)
(加下劃線的堿基加到引物中以導(dǎo)入限制酶Ndel識(shí)別的序列，而斜 體序列對(duì)應(yīng)于EDA的開(kāi)始)
和下游引物是(SEQ. ID. NO: 14)
5'AGCGGCCGCCCATTCAGTCAgTTTTTCAAAGTTGATTATACTCTCAAGCTGrGrG
(加下劃線的堿基加到引物中以導(dǎo)入限制酶Notl識(shí)別的序列，粗體 序列對(duì)應(yīng)于編碼兩端側(cè)翼是三個(gè)氨基酸的OVA CTL表位(SIINFEKL) QLESHNFEKLTEV的序列，而斜體序列對(duì)應(yīng)于EDA的結(jié)束)。
使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)在 pCR2.1-TOPO中克隆PCR擴(kuò)增的片段。將該質(zhì)粒用NdeI和NotI消化并 將得到的DNA片段亞克隆到Ndel/Notl消化的質(zhì)粒pET20b (Novagen)， 其使得能夠表達(dá)在羧基末端攜帶六個(gè)組氨酸殘基(6xHis標(biāo)記)的融合蛋 白。
將所得的表達(dá)融合蛋白EDA-SIINFEKL-6xHis的質(zhì)粒pET20b2-26 轉(zhuǎn)染到BL21(DE3)細(xì)胞中用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)栽體。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在1/ LB中在37。C下生長(zhǎng)直到OD600達(dá)到0.5-1。向培養(yǎng)物中加入IPTG至終 濃度0.4 mM并在室溫?fù)u動(dòng)下溫育過(guò)夜。通過(guò)離心收集細(xì)胞，將其重懸 浮在0.1M Tris-HCl pH=7，2中，用溶菌酶處理，并使用弗氏壓碎器(20.000 pst下兩次通過(guò))破碎，通過(guò)離心澄清和過(guò)濾。使用FPLC平臺(tái)(AKTA， Pharmacia),通過(guò)親和層析(Histrap, Pharmacia)純化可溶級(jí)分中存在的融 合蛋白。將洗脫的蛋白質(zhì)用Hitr叩脫鹽柱(Pharmacia)脫鹽，并用Amicon Ultra 4-5000 MWCO離心過(guò)濾裝置(M""pore CarrighwahUl,愛(ài)爾蘭)濃 縮。通過(guò)使用Endotrap柱(Profos Ag, Regensburg，德國(guó))從內(nèi)毒素純化重 組的蛋白質(zhì)栽體直到內(nèi)毒素水平低于0.2EU/ng蛋白質(zhì)(通過(guò)LAL測(cè)定 評(píng)估，Cambrex)。
為了得到 EDA 蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒，使用引物 CCATATG>MC4 rCGCCC7VU/1 GCM(SEQ ID NO: 13)和
似于為EDA-S1INFEKL質(zhì)粒所描迷的克隆策略進(jìn)行PCR,從而得到質(zhì)粒 pET20bEDA1.2。向15°/。 SDS-丙烯酰胺凝膠中的每種樣品加入20 蛋白質(zhì)，接著用考馬斯藍(lán)染色。觀察到對(duì)應(yīng)于推定的分子量(13kDa)的帶。
5"Z^隱57/A7^XiL與7X/^ W潛合。^4'勿/《^和輪餘,/;t。 為了測(cè)試重組的EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)是否能夠結(jié)合TLR-4表達(dá)性 細(xì)胞，我們使用表達(dá)人TLR4-MD2-CD14 293的HEK293 (來(lái)自 Invivogen)。我們還使用用LacZ (Invivogen)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞作為陰 性對(duì)照。將細(xì)胞在4。C用1 mM EDA-SIINFEKL脈沖1小時(shí)，用PBS洗 滌并用溶于PBS中的4%低聚甲醛固定IO分鐘。3次洗滌后，將細(xì)胞用 1/100抗-His抗體(Qiagen)和1/200抗-CD16 (FcBlock，來(lái)自Becton Dickinson)標(biāo)記1小時(shí)30分鐘。三次洗涂后，將細(xì)胞與用焚光素標(biāo)記的 抗小鼠IgG的1/100稀釋液溫育30分鐘并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。
備選地，測(cè)量EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)抑制FITC染色的抗人TLR4 抗體結(jié)合HEK-hTLR4細(xì)胞的能力。為此，在不同劑量的EDA-SIINFEKL 存在或不存在下，4°C2小時(shí)期間溫育HEKTLR4細(xì)胞。之后，洗涂細(xì)胞 并將其與抗-TLR4抗體溫育并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。為不同測(cè)定濃度 的EDA-S1INFEKL計(jì)算抑制百分比。還進(jìn)行細(xì)胞粘附測(cè)定。HEK LacZ 或HEK hTLR4細(xì)胞以前用氚標(biāo)記的胸苷染色并分散在事先用EDA蛋白 質(zhì)包被的96孔板中。在37。C溫育2小時(shí)后，取出非貼壁細(xì)胞而收獲貼 壁細(xì)胞并用Topcount閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量摻入的放射性。在使用不同濃度的 染色細(xì)胞得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線幫助下計(jì)算每孔貼壁細(xì)胞數(shù)。
1丄3. 7YJ^《矛傳爭(zhēng)途徑的戚活
根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(Invivogen)，用攜帶人分泌的胚胎堿性磷酸酶 基因(SEAP)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293/hTLR4-MD2-CD14或HEK293/LacZ表 達(dá)細(xì)胞。通過(guò)NF-KB-誘導(dǎo)型ELAM-1啟動(dòng)子(pNiFty-SEAP (Invivogen)) 控制SEAP表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在不同濃度的LPS、 100 nM EDA-SIINFEKL蛋白或者事先用蛋白酶K消化的100 nM EDA-SIINFEKL 存在下或不存在下溫育細(xì)胞。24小時(shí)后，通過(guò)比色測(cè)定(Invivogen)測(cè) 量培養(yǎng)上清液中報(bào)道基因的表達(dá)。在圖3中，條代表倍數(shù)NF-KB誘導(dǎo)因 子(從來(lái)自HEK293/TLR4-MD2-CD14的上清液得到的OD除以從來(lái)自 HEK293/LacZ的上清液得到的OD)。該測(cè)定中EDA制刑中內(nèi)毒素污染 物的量低于0.0003 ^tg/ml。1.2結(jié)果
1.2.1. EDA和EDA-SIINFEKL重組融合蛋白的表達(dá)
重組EDA-SIINFEKL蛋白在大腸桿菌中作為6xHis融合蛋白(SEQ. ID. N0:2)表達(dá)，通過(guò)親和層析純化，脫鹽，并從內(nèi)毒素純化，如方法部 分中描迷的。通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡使用抗-his抗體分析所得 的蛋白質(zhì)(圖1 )。觀察到每種蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于推定的分子量(13 kDa)的帶。
1.2.2. EDA-SIINFEKL融合蛋白結(jié)合TLR4 已經(jīng)描迷纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域A激活Toll樣受體4(Okamura等人,
JBC, 2001; 276:10229-10233)。然而，沒(méi)有EDA與TLR4的物理結(jié)合的 直接證據(jù)。我們首先分析了 EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)是否能夠結(jié)合表達(dá) TLR4的細(xì)胞。將表達(dá)人TLR4-MD2-CD14的HEK293或者用LacZ (Invivogen)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞用1 |xM EDA-SIINFEKL蛋白脈沖，用抗 -His抗體和熒光素標(biāo)記的抗-小鼠IgG標(biāo)記(見(jiàn)方法)并通過(guò)流式細(xì) 胞術(shù)分析。發(fā)現(xiàn)表達(dá)人TLR4-MD2-CD14的HEK 293的細(xì)胞比表達(dá)LacZ 的HEK 293細(xì)胞呈現(xiàn)出稍高的熒光強(qiáng)度(圖2A )。還測(cè)量了 EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)抑制熒光素染色的抗體結(jié)合人TLR4的能力。結(jié) 果表明事先與500mM EDA-SIINFEKL蛋白溫育HEK-hTLR4細(xì)胞抑制了 約50 %的所述抗體結(jié)合(圖2B )。圖2C顯示了不同刑量的 EDA-SIINFEKL對(duì)所迷抗體結(jié)合的抑制作用。另一方面，我們測(cè)量了 HEK hTLR4和對(duì)照HEK LacZ對(duì)照細(xì)胞在粘附測(cè)定中結(jié)合事先用EDA 蛋白質(zhì)包被的塑料孔的能力。表明HEK hTLR4細(xì)胞能夠特異結(jié)合含有 EDA的孔。所有這些實(shí)驗(yàn)都表明EDA和EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)能夠結(jié) 合TXR4。
1.2.3. EDA-SIINFEKL融合蛋白激活TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑 TLR4信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致NF-kb運(yùn)輸，NF-kB是一種轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)合
多種基因的啟動(dòng)子內(nèi)的共有元件。為了確定重組EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì) 是否能夠激活TLR4,我們使用用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293/hTLR4-MD2-CD 14 或HEK293/LacZ細(xì)胞，所述質(zhì)粒攜帶處于NF《B-誘導(dǎo)型ELAM-1啟動(dòng) 子(pNiFty-SEAP (Invivogen))控制下的人分泌的胚胎堿性磷酸酶基因(SEAP)。 我們發(fā)現(xiàn) EDA-SIINFEKL 蛋白質(zhì)能夠僅在 HEK293/hTLR4-MD2-CDM轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中刺激SEAP的表達(dá)，從而達(dá)到 7的倍數(shù)NF-kB誘導(dǎo)因子，類(lèi)似于當(dāng)細(xì)胞與0.01 pg LPS溫育時(shí)發(fā)現(xiàn)的倍 數(shù)NF-KB誘導(dǎo)因子(圖3)。如果將EDA-SIINFEKL蛋白質(zhì)事先用蛋白 酶K消化，那么該刺激NF-kb核運(yùn)輸?shù)哪芰Ρ煌耆?圖3),從而 提示TLR4的EDA活化不能通過(guò)重組蛋白質(zhì)制刑中潛在的LPS污染來(lái)
我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET20b2-26 ,其允許重組融合蛋白 EDA-SIINFEKL 6xHis在大腸桿菌中的表達(dá)。6組氨酸的存在促進(jìn)檢測(cè)和 純化融合蛋白。從而，我們能夠從大腸桿菌培養(yǎng)物的細(xì)胞質(zhì)級(jí)分純化相 當(dāng)大量的融合蛋白。對(duì)TLR4表達(dá)性細(xì)胞進(jìn)行的結(jié)合測(cè)定提示 EDA-SIINFEKL蛋白能夠特異結(jié)合TLR4 。此外，我們?cè)谶@里表明 EDA-SIINFEKL能夠激活TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑。該激活與該蛋白質(zhì)的潛 在LPS污染無(wú)關(guān)，因?yàn)橛玫鞍酌窴事先消化完全消除了刺激NF-kB核 運(yùn)輸?shù)哪芰?。此外，該測(cè)定中EDA制劑中內(nèi)毒素污染物的量低于0.0003 Hg/mK如通過(guò)LAL測(cè)定評(píng)估的)，其不能夠在該體外測(cè)定中激活TLR-4 信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這些結(jié)果提示EDA蛋白質(zhì)可以用作蛋白質(zhì)栽體以將抗 原耙向TLR4表達(dá)性細(xì)胞。已知樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)toll樣受體，且尤其是 TLR4。還已知DC的一些最有效的成熟刺激來(lái)自TLR受體與它們各自 配體的相互作用。從而，含有EDA的融合蛋白與某種抗原的相互作用
的快速活化。此外，該融合蛋白向DC表面的靶定可以增加DC對(duì)該抗 原的捕獲和胞吞并因此增強(qiáng)針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例2.含有EDA的融合蛋白在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟和允許 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)
2.1材沖牛和方法
2丄1.骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生
樹(shù)突細(xì)胞從骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)而來(lái)。用ACK裂解緩沖液裂解紅細(xì)胞后，
3討論洗滌細(xì)胞并隨后通過(guò)與抗CD4(GK1; ATCC， Manassas, VA)、 CD8 (53.6.72; ATCC) 、 Ly-6G/Grl (BD-Pharmingen; San Diego CA)和 CD"R/B220 (BD-Pharmingen)的抗體混合物接著與兔補(bǔ)體溫育耗盡淋 巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。剩余的細(xì)胞以1(^個(gè)細(xì)胞/ml生長(zhǎng)在12孔板中的完全 培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)加了 20 ng/ml mGM-CSF和20 ng/ml mlL-4 (均來(lái) 自Peprotech; London, UK)。每隔一天，將培養(yǎng)基用含有細(xì)胞因子的新鮮 培養(yǎng)基更換。在第7天收獲非貼壁的樹(shù)突細(xì)胞并在1 pg/ml或15 ng/ml LPS (Sigma), EDA-SIINFEKL (500 nM)或SIINFEKL (10 pM)存在或不存 在下在37'C和5%(302下培養(yǎng)。在一些實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)物加入多粘菌素 (10 pg/ml)以抑制內(nèi)毒素污染物的作用。24小時(shí)培養(yǎng)后，收獲上清液并 通過(guò)ELISA (BD-Pharmingen)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量IL-12和TNF-a。
2.1.2用EDA-SIINFEKL免疫后測(cè)量CDUc細(xì)胞的體內(nèi)成熟。用蛋白 酶K消化的作用。
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量各種表面標(biāo)記的表達(dá)，在體外評(píng)估DC的成熟。 用25 pgEDA-SIINFEKL、用蛋白酶消化的25 pg EDA-SIINFEKL、 25 ^ig LPS或者僅用PBS靜脈內(nèi)注射C57BL6小鼠。通過(guò)使用瓊脂糖蛋白酶 K(Sigma, StLouis)進(jìn)行用蛋白酶K消化EDA-SIINFEKL。簡(jiǎn)言之，用在 洗滌緩沖液(20 mM Tds-HCl, pH 7.2, 1 mM EDTA， lmM ClCa2)洗滌的5 mg/ml蛋白酶瓊脂糖珠在3(TC消化EDA-SIINFEKL蛋白或者LPS 20分 鐘。通過(guò)離心除去瓊脂糖-蛋白酶K珠。免疫后15小時(shí)，處死小鼠并 通過(guò)autoMACS純化CDllc細(xì)胞。標(biāo)記細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。
2丄3.用于分析抗原呈遞能力的體外研究
我們表征了 EDA-SIINFEKL被APC捕獲以將經(jīng)加工的CTL表位 SIINFEKL呈遞到來(lái)自O(shè)T-l轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞，或呈遞到丁雜交瘤 B3Z的能力，所迷T細(xì)胞和T雜交瘤B3Z都對(duì)該表位特異。在不同濃 度的EDA-SIINFEKL、EDA和SIINFEKL (未共價(jià)結(jié)合)或SIINFEKL存在 下培養(yǎng)骨髓來(lái)源的DC。 24小時(shí)培養(yǎng)后，收集上清液并通過(guò)ELISA測(cè)量 IFN-y產(chǎn)生。備選地，起始培養(yǎng)后12小時(shí)，收集DC，用0.05%戊二醛 固定并在不同量的來(lái)自O(shè)T-l的非貼壁細(xì)胞存在下或者在B3Z雜交瘤T 細(xì)胞系存在下用作APC。在一些實(shí)驗(yàn)中，在氯喹(3pM)、莫能菌素(lplGolgystop, Pharmingen)、布雷菲德菌素(1 pi Golgyplug， Pharmingen)、 環(huán)己酰亞胺(4 pg/ml)存在或不存在下溫育DC,然后在EDA-SIINFEKL 或SIINFEKL肽存在下溫育。在一些情況下，將抗-丁LR4抗體加入到培 養(yǎng)物中。
通過(guò)測(cè)量IL-2產(chǎn)生進(jìn)行經(jīng)處理的APC存在下B3Z細(xì)胞的激活。將 B3Z雜交瘤細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/孔)在完全培養(yǎng)基(補(bǔ)加了 10% FCS, 2 mM谷 氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 pg/ml鏈霉素和5xl(T5M 2-巰基乙醇的 RPMI 1640)中在來(lái)自C57BL/6 wt小鼠或者來(lái)自TLR4 KO小鼠的脾細(xì)胞 (105個(gè)細(xì)胞/孔)和不同濃度的EDA-SIINFEKL存在下培養(yǎng)8小時(shí)。通過(guò) 如前述的基于CTLL的生物測(cè)定測(cè)量釋放到培養(yǎng)上清液的IL-2的量。
2丄4.免疫后測(cè)量細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和產(chǎn)生IFN-y的細(xì)胞的體外 誘導(dǎo)
將C57BL6小鼠用50 pg EDA-SIINFEKL或用SIINFEKL在第0和 第10天靜脈內(nèi)免疫。在第20天時(shí)，處死小鼠用于分析針對(duì)SIINFEKL 的CTL應(yīng)答。在完全培養(yǎng)基中，0.1 pg/ml SIINFEKL存在下以5 x 106 個(gè)細(xì)胞/ml(10ml)培養(yǎng)來(lái)自經(jīng)免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞5天。在第5天，收獲細(xì) 胞用于鉻釋放測(cè)定。通過(guò)將不同數(shù)目的效應(yīng)細(xì)胞與事先裝栽"Cr并且裝 栽或沒(méi)有裝栽SIINFEKL的lx 1(^EL-4靶細(xì)胞溫育4小時(shí)，測(cè)量裂解活 性。根椐下面的公式計(jì)算特異裂解百分比(cpm實(shí)驗(yàn)的-cpm自發(fā) 的)/(cpm最大值-cpm自發(fā)的)x100，其中自發(fā)裂解對(duì)應(yīng)于不存在效應(yīng) 細(xì)胞時(shí)溫育的靶細(xì)胞，且通過(guò)將靶細(xì)胞與5% Triton xlOO溫育得到最大 裂解。
為了測(cè)量應(yīng)答SIINFEKL的IFN-y產(chǎn)生，將來(lái)自經(jīng)免疫小鼠的脾細(xì) 胞以8xl05個(gè)細(xì)胞/孔平板鋪平板在％-孔板上，所迷孔僅僅具有完全培 養(yǎng)基或者具有30 )iM肽，終體積為0.25 ml。 48小時(shí)后取出上清液(50 |til) 并通過(guò)ELISA(Pharmingen， San Diego, CA)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量
在另一組實(shí)驗(yàn)中，證明了 EDA蛋白質(zhì)作為蛋白質(zhì)混合物中佐刑的 能力。在該情況下，將一組C57BL/6小鼠用50 EDA-SIINFEKL在溶 于PBS中的500 pgOVA蛋白質(zhì)存在下靜脈內(nèi)免疫，而另一組僅用溶于 PBS中的500 OVA蛋白質(zhì)免疫。 一周后，處死小鼠以確定兩組中針對(duì)SIINFEKL的CTL應(yīng)答，如上迷。
2丄5.針對(duì)EG70VA腫瘤細(xì)胞攻擊的保護(hù)
在第0和IO天用3 nmol EDA-SIINFEKL或SIINFEKL皮下免疫小 鼠。第二次免疫后20天，用105個(gè)EG70VA細(xì)胞皮下攻擊小鼠。用卡 尺控制腫瘤生長(zhǎng)并使用公式V-(Lxw2)/2以mir^表示，其中L是長(zhǎng)度； w是寬度。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到大于8cr^的體積時(shí)處死小鼠。
2.2.結(jié)果
2.2丄EDA-SIINFEKL融合蛋白刺激骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(BMDC)產(chǎn)生 IL-12和TNF-a
我們檢查了 EDA-SIINFEKL重組蛋白是否能夠刺激BMDC以產(chǎn)生 促炎細(xì)胞因子如或TNF-a。從而，將BMDC與SIINFEKL (10 |liM)、 LPS (1 |ng/ml和15 ng/ml)或EDA-SHNFEKL-6xHis (500nM)培養(yǎng)。24小 時(shí)后，通過(guò)ELISA測(cè)量培養(yǎng)上清液中的IL-12或TNF-a。發(fā)現(xiàn) EDA-SIINFEKL能夠刺激BMDC產(chǎn)生非常高水平的IL-12或TNF-a (圖 4)。當(dāng)事先用蛋白酶K處理該蛋白質(zhì)時(shí)，免疫刺激能力消失，從而表 明該活性不時(shí)由于蛋白質(zhì)樣品中可能痕量的內(nèi)毒素。
2.2.2. EDA-SIINFEKL誘導(dǎo)表達(dá)CDllc的DC的TLR4依賴性體內(nèi)成熟
樹(shù)突細(xì)胞(DC)是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，具有刺激幼稚T細(xì)胞 和針對(duì)抗原的次級(jí)應(yīng)答的獨(dú)特能力。DC能夠捕獲抗原，將它們加工成 肽并將與MHC I或II類(lèi)分子結(jié)合的所述肽分別呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (CTL)或者T輔助細(xì)胞。不成熟DC可以捕獲抗原但是它們必須分化 或者成熟而變得能夠剌激幼稚T細(xì)胞。從而，樹(shù)突細(xì)胞的成熟是T細(xì)胞 應(yīng)答的最佳刺激所必需的。當(dāng)發(fā)生成熟時(shí)，APC增加表面分子如I類(lèi)和 II類(lèi)MHC、 CD40、 CD80和CD86分子的表達(dá)。因此，我們分析了 EDA-SIINFEKL是否可以誘導(dǎo)表達(dá)CD 11 c的細(xì)胞在體內(nèi)成熟。將C57BL6 小鼠用25 EDA-SIINFEKL、用蛋白酶K消化的25 EDA-SIINFEKL、 25 LPS或者僅用PBS在靜脈內(nèi)免疫。15小時(shí)后處死小鼠并通過(guò) autoMACS純化CDllc細(xì)胞、抗體標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。我們發(fā) 現(xiàn)用EDA-SIINFEKL免疫能夠誘導(dǎo)MHC I類(lèi)和II類(lèi)分子，CD40和CD86的表達(dá)。當(dāng)將EDA-SIINFEKL在免疫前用蛋白酶K消化時(shí)，該蛋白質(zhì)的 能力被完全消除(圖5)。用蛋白酶K消化LPS對(duì)LPS誘導(dǎo)這些成熟標(biāo) 記表達(dá)的能力沒(méi)有任何抑制作用(未顯示)。我們測(cè)試了 EDA-SIINFEKL 誘導(dǎo)來(lái)自C57BL/6 TLR4 KO小鼠的CDlle細(xì)胞成熟的能力并且我們發(fā) 現(xiàn)EDA-SIINFEKL不能誘導(dǎo)在C57BL/6 wt小鼠上發(fā)現(xiàn)的成熟標(biāo)記的超 表達(dá)(圖5)。
2.2.3 EDA-SIINFEKL被樹(shù)突細(xì)胞有效呈遞給對(duì)SIINFEKL表位特異的T
細(xì)胞
我們表征了 EDA-SIINFEKL被APC捕獲以將經(jīng)加工的CTL表位 SIINFEKL呈遞給來(lái)自0T-1轉(zhuǎn)基因小鼠的對(duì)該表位特異的T細(xì)胞的能 力。將骨髓來(lái)源的DC (105個(gè)細(xì)胞/孔)在不同濃度的EDA-SIINFEKL、 EDA+SIINFEKL、 EDA或SIINFEKL肽存在下培養(yǎng)。48小時(shí)后，加入 105個(gè)非貼壁的OT-1細(xì)胞。測(cè)量OT-1非貼壁細(xì)胞的IFN-y生產(chǎn)(圖6A)。 如通過(guò)IFN-丫生產(chǎn)所證明的，SIINFEKL肽被有效呈遞到來(lái)自O(shè)T-1小鼠 的T細(xì)胞。EDA-SIINFEKL也誘導(dǎo)高水平的IFN-y，盡管必須高劑量的 該蛋白質(zhì)來(lái)得到相似水平或者甚至更高的IFN-y,從而清楚地表明EDA 蛋白將該SIINFEKL表位攜帶到MHCI類(lèi)分子。向與SIINFEKL肽溫育 的DC力o入EDA蛋白質(zhì)不增加來(lái)自O(shè)T-1小鼠的T細(xì)胞的IFN-y生產(chǎn)。 如所預(yù)期的，僅僅與EDA溫育的DC不激活來(lái)自O(shè)T-1小鼠的T細(xì)胞。 為了分析DC中的TLR4分子表達(dá)是否可以增強(qiáng)EDA-SIINFEKL呈遞， 將SIINFEKL特異的B3Z細(xì)胞與不同濃度的EDA-SIINFEKL在來(lái)自 C57BL/6 wt或TLR4KO小鼠的脾細(xì)胞存在下溫育。在表達(dá)TLR4的抗 原呈遞細(xì)胞存在下，EDA-SIINFEKL向B3Z細(xì)胞的呈遞是更有效的(圖 6B )。同樣，通過(guò)加入抗-TLR4抗體完全阻斷了 EDA-SIINFEKL向B3Z 細(xì)胞的呈遞(圖6C ),從而提示TLR4涉及EDA-SIINFEKL捕獲。之后， 我們研究了不同的藥物對(duì)EDA-SIINFEKL的加工的作用并且我們發(fā)現(xiàn) 該呈遞受到莫能菌素、布雷菲德菌素或環(huán)己酰亞胺的完全抑制，但是不 被氯喹完全抑制，氯喹是內(nèi)體和晚期溶酶體中酸化的已知的抑制劑(圖 6D)。如所預(yù)期的，這些藥物不影響SIINFEKL合成肽的呈遞。這些數(shù) 椐提示大胞飲不介導(dǎo)EDA-SIINFEKL的內(nèi)化，并且證明EDA-SIINFEKL 通過(guò)I類(lèi)胞質(zhì)溶M^加工途徑加工。2.2.4. EDA-SIINFEKX在體內(nèi)誘導(dǎo)SIINFEKL特異性CTL 前面的結(jié)果證明EDA-SIINFEKL重組蛋白是生物活性的并且特異
活化APC。在體內(nèi)特異T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)對(duì)于疫苗的開(kāi)發(fā)是關(guān) 鍵的。從而，我們測(cè)試了用EDA-SIINFEKL融合蛋白免疫的小鼠是否產(chǎn) 生了針對(duì)用SIINFEKL表位脈沖的靶細(xì)胞的特異CTL應(yīng)答。將C57BL6 小鼠用溶于PBS中的50 pg EDA-SIINFEKL或者SIINFEKL在第0和10 天靜脈內(nèi)免疫。在第20天，處死小鼠用于分析針對(duì)SIINFEKL的CTL 應(yīng)答。發(fā)現(xiàn)EDA-SIINFEKL能夠誘導(dǎo)針對(duì)用SIINFEKL脈沖的EL-4靶細(xì) 胞的CTL。另一方面，當(dāng)僅用SIINFEKL免疫小鼠時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CTL活性 (圖7)。由于EDA在體內(nèi)誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞成熟的能力，所以還分析了當(dāng) 用OVA蛋白質(zhì)免疫時(shí)EDA作為佐劑的能力。在該實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到 免疫混合物中存在EDA具有免疫刺激作用并且能夠增強(qiáng)OVA蛋白誘導(dǎo) 的針對(duì)SIINFEKX的CTL應(yīng)答誘導(dǎo)(比較圖9的圖A和B之間的裂解 活性)。
2.2.5. EDA-SIINFEKL保護(hù)小鼠免于表達(dá)OVA蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞的攻擊 為了研究EDA-SIINFEKL融合蛋白保護(hù)小鼠抵抗EG70VA腫瘤細(xì)
胞注射的能力，將小鼠用3nmo1 EDA-SIINFEKL、 SIINFEKL或用鹽水 皮下免疫。第二次免疫后20天，用105個(gè)EG70VA細(xì)胞皮下攻擊小鼠。 我們發(fā)現(xiàn)EDA-SIINFEKL免疫保護(hù)小鼠免于腫瘤生長(zhǎng)。用SIINFEKL或 鹽水免疫的所有小鼠都發(fā)展了腫瘤，而用EDA-SIINFEKL免疫的小鼠中 40%保持無(wú)腫瘤并且剩余的60%經(jīng)歷了腫瘤生長(zhǎng)減速(圖8)。
2.3.討論
在當(dāng)前的研究中，使用重組EDA蛋白質(zhì)作為表位遞送栽體，我們 確立了免疫策略，其在體內(nèi)起動(dòng)CTL應(yīng)答，從而回避了對(duì)佐劑的需要。 我們鑒定了有助于含有EDA的融合蛋白作為將抗原遞送到表達(dá)TLR-4 的細(xì)胞和誘導(dǎo)針對(duì)抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答的栽體的功效的機(jī)理。
首先，我們發(fā)現(xiàn)用EDA體外刺激BMDC能夠刺激產(chǎn)生促炎細(xì)胞因 子，如IL-12和TNF-a。已知這些細(xì)胞因子是起始針對(duì)抗原的強(qiáng)烈免疫 應(yīng)答關(guān)健的。此外，發(fā)現(xiàn)用EDA體內(nèi)免疫能夠誘導(dǎo)DC成熟和增加DC表面上共刺激分子的表達(dá)。這些共刺激分子的表達(dá)對(duì)于有效誘導(dǎo)針對(duì)抗
原的免疫應(yīng)答是極為重要的。發(fā)現(xiàn)該作用依賴于TLR4的存在，因?yàn)閬?lái) 自事先用EDA免疫的C57BL/6 TLR4 KO小鼠的體內(nèi)分離的CD 11 c細(xì)胞 與在未免疫的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的相比對(duì)于它的成熟狀態(tài)不顯示出任何改善。
我們發(fā)現(xiàn)與EDA-SIINFEKL融合蛋白溫育后，APC上TLR4分子的 存在提高了抗原呈遞，并且該呈遞不受到抑制內(nèi)溶酶體(endolysosomal) 蛋白酶解的氯喹的影響。這些數(shù)據(jù)表明EDA-SIINFEKL的內(nèi)化不受到大 胞飲的介導(dǎo)，并且證明重組EDA-SIINFEKL蛋白被作為胞質(zhì)溶膠抗原加 工，并且暗示必須將該融合蛋白通過(guò)APC質(zhì)膜遞送到胞質(zhì)溶膠。
并且最重要的是，我們發(fā)現(xiàn)用重組融合蛋白EDA-SIINFEKL免疫小 鼠能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)特異針對(duì)SIINFEKL表位的CTL應(yīng)答。此外，用 EDA-SIINFEKL免疫能夠保護(hù)小鼠免于EG70VA腫瘤細(xì)胞的攻擊。所有 這些數(shù)據(jù)表明含有EDA的該蛋白質(zhì)栽體能夠(i)將抗原靶向表達(dá)TLR4 的細(xì)胞，且尤其是專(zhuān)職APC; (ii)將載體化抗原遞送到經(jīng)典的I類(lèi)抗 原加工途徑；(iii)誘導(dǎo)體內(nèi)和體外樹(shù)突細(xì)胞成熟；和(iv)不存在佐 劑時(shí)，起動(dòng)針對(duì)栽體化抗原的體內(nèi)C丁L,且從而可以用于抗傳染物或者 抗癌癥的接種策略中。同樣，這些含有EDA的融合蛋白可以用于藥學(xué) 上相關(guān)的分子向表達(dá)TLR4的細(xì)胞的胞質(zhì)遞送。此外，EDA在體內(nèi)誘導(dǎo) 樹(shù)突細(xì)胞成熟的能力允許它用作含有抗原的制劑中的佐劑，其中人力']希 望產(chǎn)生針對(duì)所迷抗原的免疫原性應(yīng)答，從而打開(kāi)了在疫苗開(kāi)發(fā)中使用 EDA的可能性的領(lǐng)域。
實(shí)施例3. EDA蛋白可以用作栽體以轉(zhuǎn)運(yùn)具有至少390個(gè)氨基酸的抗原 3.1材料和方法
3.1.1 EDA-OVA和EDA-NS3重組蛋白的表達(dá)
為了構(gòu)建EDA-OVA表達(dá)質(zhì)粒，從表達(dá)OVA蛋白的EG70VA腫瘤 細(xì)胞提取 mRNA 。 逆轉(zhuǎn)錄和通過(guò) PCR 用引物 GCGGCCGCA/J 7TOGC7m4 7TOGCGC4 (SEQ ID NO: 16)和 GCGGCCGC4GGGCM/^C4C4 7tT (SEQ ID NO: 17)(加入加下劃線的堿 基以引入限制酶Notl識(shí)別的序列，而斜體序列屬于卵清蛋白的開(kāi)始和結(jié) 束)擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物用TOPO TA試劑盒(Invitrogen)克隆在pCR2.1-TOPO中，用Notl消化并用事先用Notl消化的質(zhì)粒pET20EDA 1.2 (其表達(dá)EDA蛋白質(zhì))中亞克隆。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的正確方向。 誘導(dǎo)用質(zhì)粒培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌后，使用FPLC平臺(tái)(AKTA， Pharmacia) 通過(guò)親和層析(Histrap， Pharmacia)純化可溶級(jí)分中存在的融合蛋白。將 蛋白質(zhì)用脫鹽Hitrap柱(Pharmacia)脫鹽，并用濾器裝置通過(guò)離心Amicon Ultra 4-5000 MWCO (Millipore Carrighwahill，愛(ài)爾蘭)濃縮。用Endotrap 內(nèi)毒素柱(Profos Ag, Regensburg，德國(guó))純化重組蛋白質(zhì)栽體，直到內(nèi)毒 素水平低于0.2 EU/pg蛋白質(zhì)(通過(guò)LAL測(cè)定測(cè)量，Cambrex)。對(duì)于 EDA-NS3蛋白質(zhì)構(gòu)建，按照相似的策略，其中使用引物 A( CGG"COFCAGCCACCATGGCGCCTATCACGGCCTATTC (SEQ ID NO: 18)和 AGCGt CO CTTGCGGTACGGCCGGAGGGGATGAGTT (SEQ ID NO: 19)，其允許NS3蛋白質(zhì)的氨基末端片段(氨基酸 1026-1221 )的表達(dá)。與從大腸桿菌級(jí)分的可溶級(jí)分提取的EDA-OVA蛋 白質(zhì)相對(duì)照，在EDA-NS3蛋白質(zhì)的情況下，從事先溶解在8M尿素的 內(nèi)含體純化蛋白質(zhì)。使用Histrap柱進(jìn)行親和層析后，進(jìn)行離子交換層 析(DEAE-瓊脂糖)。按照再折疊規(guī)程在G25柱中再折疊從該第二次層析 純化的級(jí)分。 一旦再折疊，就對(duì)EDA-NS3柱脫鹽并使用Endotrap柱 (Profos,德國(guó))純化內(nèi)毒素。
通過(guò)SDS-PAGE分析這樣純化的蛋白質(zhì)。
3丄2用于評(píng)估抗原呈遞能力的體外研究
評(píng)估了 EDA-OVA被APC捕獲并隨后將CTL表位加工的SIINFEKL 呈遞給來(lái)自O(shè)T-l轉(zhuǎn)基因小鼠的T淋巴細(xì)胞的能力。在不同濃度的 EDA-OVA、 EDA + OVA (非共價(jià)結(jié)合的)、OVA或EDA存在下培養(yǎng)骨 髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/孔)。12小時(shí)后加入105細(xì)胞/孔的來(lái)自 OT-l轉(zhuǎn)基因小鼠的非貼壁細(xì)胞。從培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)，提取上清液用于 通過(guò)商業(yè)ELISA測(cè)定定量分泌的IFN-y。
3丄3免疫后測(cè)量體內(nèi)T細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)和產(chǎn)生IFN-y 的細(xì)胞
分別在第0和10天用50 pg EDA-OVA或EDA-NS3靜脈內(nèi)免疫 C57BL6或HHD (對(duì)于HLA-A2.1分子轉(zhuǎn)基因的)小鼠。在第20天，處死小鼠以確定針對(duì)SIINFEKL或者針對(duì)NS3 1073肽的CTL應(yīng)答。來(lái)自 經(jīng)免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中0.1 pg/ml SIINFEKL或1 pg/ml NS3 1073存在下以5 x 106個(gè)細(xì)胞/ml (10 ml)培養(yǎng)5天。在第5天，收 獲細(xì)胞用于鉻釋放分析。將不同量的效應(yīng)細(xì)胞與事先裝栽"Cr、有或者 沒(méi)有肽的lx104個(gè)EL-4靶細(xì)胞溫育4小時(shí)，測(cè)量裂解活性。根椐下面 公式計(jì)算特異裂解百分比(實(shí)驗(yàn)cpm-自發(fā)cpm) /(最大cpm -自發(fā) cprn) x 100，其中自發(fā)裂解對(duì)應(yīng)于不存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)溫育的靶細(xì)胞，且 通過(guò)溫育把細(xì)胞與5% Triton xlOO得到最大裂解。
為了測(cè)量應(yīng)答不同肽的IFN-y產(chǎn)生，將來(lái)自經(jīng)免疫小鼠的脾細(xì)胞分 散在96孔板中，8xl()S個(gè)細(xì)胞/孔，所述孔僅僅具有完全培養(yǎng)基，或者 具有30幽肽NS3 1038-1046 (SEQ ID NO: 23)、 1073-1081 (SEQ ID NO: 20， CVNGVCWTV)、 1169-U77 (SEQ ID NO: 22)，或具有1 |tig/ml重組 NS3 ,終體積為0.25 ml。 48小時(shí)后回收上清液(50 iul)并通過(guò) ELISA(Pharmingen， San Diego， CA)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量IFN卞
3丄4抗表達(dá)丙型肝炎病毒多蛋白的vHCV 1-1031痘苗病毒感染的保護(hù) 在第1和IO天用1 x 106個(gè)以EDA-NS3蛋白脈沖的骨髄來(lái)源的樹(shù)突 細(xì)胞免疫C57BL/6。第二次免疫后10天> 用5 x 106 pfu的重組vHCV 1-1031痘苗病毒腹膜內(nèi)感染小鼠。感染后3天，處死動(dòng)物并通過(guò)基于使 用BSC-1細(xì)胞系的噬斑形成單位定量測(cè)定定量病毒負(fù)荷/mg卵巢組織。
3.2結(jié)果
3.2.1 EDA-OVA和EDA-NS3蛋白的表達(dá)和純化 如材料和方法部分中指出的，對(duì)于EDA-OVA的情況使用可溶級(jí)分
從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌提取物純化EDA-OVA或EDA-NS3，且對(duì)于EDA-NS3 的情況，從內(nèi)含體純化。在圖10A和11A中，顯示了兩種蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE結(jié)果。得到了對(duì)應(yīng)于55 kDa和32 kDa大小蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單帶， 其分別對(duì)應(yīng)于這些蛋白質(zhì)每一種的預(yù)期大小。
3.2.2 EDA與OVA蛋白質(zhì)的結(jié)合增強(qiáng)IVA向來(lái)自O(shè)丁-l轉(zhuǎn)基因小鼠的T 淋巴細(xì)胞的抗原呈遞
我們分析了 EDA結(jié)合OVA蛋白質(zhì)以增強(qiáng)SIINFEKL表位向?qū)υ摫砦惶禺惖腡細(xì)胞的抗原呈遞的能力。我們觀察到在EDA-OVA存在下培 養(yǎng)的骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞刺激非貼壁OT-l小鼠細(xì)胞的IFN-y產(chǎn)生比僅 僅等分子量OVA蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的更強(qiáng)(圖9B)。我們觀察到當(dāng)與僅僅 OVA蛋白質(zhì)比較時(shí)，在含有EDA蛋白質(zhì)和OVA蛋白質(zhì)的共培養(yǎng)物中 的IFN-y產(chǎn)生被增強(qiáng)，從而提示EDA誘導(dǎo)的DC成熟可以增強(qiáng)T細(xì)胞活 化。
3.2.3. EDA與OVA蛋白質(zhì)或者與NS3蛋白質(zhì)的結(jié)合增強(qiáng)體內(nèi)特異細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)
分析了 EDA-OVA和EDA-NS3分別誘導(dǎo)針對(duì)SIINFEKL表位或針對(duì) NS3 1073表位的CTL應(yīng)答。對(duì)于EDA-OVA蛋白質(zhì)，我們觀察到用溶 解在鹽水溶液中的該蛋白質(zhì)免疫能夠誘導(dǎo)針對(duì)與SIINFEKL肽溫育的靶 細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答，僅僅用OVA蛋白質(zhì)免疫不能誘導(dǎo)(圖9C)。以 相同的方式，用EDA-NS3蛋白質(zhì)免疫HHD小鼠(對(duì)于HLA-A2.1轉(zhuǎn)基 因的)誘導(dǎo)針對(duì)以前與肽NS3 1073 (V) (SEQ ID NO: 20， CVNGNCWTV) 或與該肽的變體1073 (L) (SEQ ID NO: 21, CLNGVCWTV)溫育的靶細(xì)胞 的有效細(xì)胞毒性應(yīng)答圖11B。我們還觀察到用EDA-NS3蛋白免疫HHD 小鼠誘導(dǎo)對(duì)肽NS3 1038 (SEQ ID NO: 23)、 1073 (SEQ ID NO: 20， CVNGVCWTV)和1169 (SEQ ID NO: 22)特異的產(chǎn)生IFN-y的細(xì)胞的活 化(圖UC)。此外，用EDA-NS3蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)了特異針對(duì)NS3 1073 肽的持久細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答。實(shí)際上，當(dāng)用EDA-NS3蛋白免疫的小鼠 在免疫后60天被處死時(shí)，我們檢測(cè)到對(duì)該肽特異的CTL的存在(圖 11D)。
3.2,4用與EDA陽(yáng)NS3蛋白質(zhì)溫育的樹(shù)突細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠保護(hù)小 鼠抵抗表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白的痘苗病毒的感染
我們想研究用與EDA-NS3蛋白體外溫育的樹(shù)突細(xì)胞免疫是否能夠 誘導(dǎo)能夠保護(hù)小鼠抵抗表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白的重組病毒攻擊的細(xì)胞 應(yīng)答。為此，我們用與EDA-NS3蛋白溫育的骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞或者 以前還沒(méi)有與任何抗原溫育的樹(shù)突細(xì)胞免疫C57/BL6小鼠。第二次免疫 后10天，小鼠用5 x 106 pfu重組vHCV 1-3011痘苗病毒(Dr Rice, Washington University School of Medicine, St Louis， MO友情贈(zèng)送，并且由Grakoui A,等人，J Virol, 1993; 67:1385描迷)感染。3天后,測(cè)量?jī)?組小鼠中的病毒負(fù)荷。在該實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到用與EDA-NS3蛋白溫 育的DC免疫能夠保護(hù)6%的小鼠抵抗重組痘苗病毒的感染。
3.3.討論
如已經(jīng)在前面的結(jié)果中顯示的，EDA蛋白質(zhì)可以用作有用的栽體以 將來(lái)自O(shè)VA蛋白質(zhì)的SIINFEKL表位靶向表達(dá)TLR4分子的細(xì)胞并增強(qiáng) 它們的免疫原性。為了評(píng)估EDA增加較大蛋白質(zhì)的免疫原性的能力， 我們構(gòu)建了含有完整OVA (397個(gè)氨基酸)的EDA-OVA融合重組蛋白和 含有具有來(lái)自丙型肝炎病毒的NS3蛋白質(zhì)的蛋白酶活性的片段的 EDA-NS3蛋白。
這些結(jié)果證明EDA蛋白質(zhì)可以作為靶定較大抗原的非常有效的栽 體。從而，我們發(fā)現(xiàn)在抗原呈遞測(cè)定中，OVA與EDA的結(jié)合增強(qiáng)抗原 呈遞細(xì)胞的抗原捕獲，從而增加特異性T細(xì)胞活化。而且，我們觀察到 用這些融合蛋白(EDA-OVA和EDA-NS3)免疫允許誘導(dǎo)抗這些抗原的特 異細(xì)胞毒性應(yīng)答。這些誘導(dǎo)的應(yīng)答是持久的。最后，我們觀察到施用 EDA-NS3蛋白與樹(shù)突細(xì)胞允許誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞應(yīng)答，其抵抗表達(dá)丙型肝 炎病毒蛋白的痘苗病毒的感染。
這些數(shù)據(jù)表明EDA蛋白質(zhì)可以是誘導(dǎo)針對(duì)目的抗原的細(xì)胞應(yīng)答的 非常足夠的蛋白質(zhì)栽體。基于EDA蛋白質(zhì)的融合蛋白的構(gòu)建是針對(duì)腫 瘤疾病或者傳染物引起的疾病的接種規(guī)程中的合適策略。
權(quán)利要求
1.包含選自-纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(EDA)，或-所述EDA結(jié)構(gòu)域的能夠結(jié)合TLR4的片段，或-所述EDA結(jié)構(gòu)域或者片段的變體，其能夠結(jié)合TLR4并且與任何EDA結(jié)構(gòu)域天然形式或者片段有70％以上的同源性，的氨基酸序列的多肽在生產(chǎn)針對(duì)抗原的的細(xì)胞免疫應(yīng)答刺激劑中的用途。
2. 權(quán)利要求l的多肽的用途，其特征是所迷對(duì)應(yīng)于EDA結(jié)構(gòu)域的 片段包含選自如下的序列a) SEQ. ID. NO: 2的氨基酸2 - 91;b) SEQ, ID. NO: 4;和c) 序列a)和b)的能夠結(jié)合TLR4表達(dá)性細(xì)胞的片段。
3. 權(quán)利要求1的多肽的用途，其特征是所迷對(duì)應(yīng)于EDA結(jié)構(gòu)域的 片段包含選自如下的序列a ) SEQ. ID. NO: 6的氨基酸2-57; b ) SEQ. ID. NO: 8;和c)序列a)和b)的能夠結(jié)合TLR4表達(dá)性細(xì)胞的片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的多肽的用途，其特征是所迷免疫刺 激劑還包含一種或多種目的分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的多肽的用途，其特征是所述免疫刺 激劑是蛋白質(zhì)栽體，其中所迷多肽連接到所述目的分子。
6. 蛋白質(zhì)栽體，其特征是它包含多肽，所迷多肽的氨基酸序列選自a) 纖連蛋白EDA結(jié)構(gòu)域(EDA),b) 所述EDA結(jié)構(gòu)域的能夠結(jié)合TLR4的片段，或c) 所迷EDA結(jié)構(gòu)域或者片段的變體，其能夠結(jié)合TLR4并且與所 述EDA結(jié)構(gòu)域的任何天然形式或者片段有70 %以上的同源性； 所述多肽結(jié)合到選自多肽、脂肽、寡糖、多糖、核酸、脂質(zhì)和化學(xué)藥 品的目的分子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所述目的分子選自抗原和表位。
8. 根椐權(quán)利要求6或7任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所述目的分 子選自病毒抗原、細(xì)菌抗原和寄生物抗原。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6到8任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所述目的分 子是丙型肝炎病毒的病毒抗原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所迷丙型肝炎病毒抗 原是NS3蛋白或所述蛋白質(zhì)的抗原片段。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所述氨基酸序列是 SEQ ID NO: 10。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6或7任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所迷目的 分子選自腫瘤抗原和腫瘤抗原決定簇。
13. 根椐權(quán)利要求12的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所迷目的分子是來(lái)自 卯清蛋白的抗原性細(xì)胞毒性T決定簇(OVA 257-264)或SIINFEKL。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)栽體，其特征是它包含選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所述目的分子是變應(yīng)原。
16. 根椐權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)栽體，其特征是所迷目的分子是化學(xué) 或者遺傳偶聯(lián)到EDA結(jié)構(gòu)域的藥物。
17. 權(quán)利要求6到16中定義的蛋白質(zhì)栽體將所述目的分子特異靶定 和運(yùn)輸?shù)絋LR4表達(dá)性細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的用途。
18. 權(quán)利要求17的蛋白質(zhì)栽體的用途，其特征是所述TLR4表達(dá)性 細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)栽體的用途，其特征是所述抗原呈遞細(xì)胞 是樹(shù)突細(xì)胞。
20. 經(jīng)修飾的核酸，其特征是它編碼權(quán)利要求6到16任一項(xiàng)定義的 蛋白質(zhì)栽體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的經(jīng)修飾的核酸，其特征是它還包含調(diào)節(jié)所述 蛋白質(zhì)栽體表達(dá)的可操作地連接的控制序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21的經(jīng)修飾的核酸，其特征是它包含SEQ. ID. N。 1或SEQ ID. NO: 5。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20或2的經(jīng)修飾的核酸，其特征是它包含SEQ. ID. NO. 9。
24. 用于權(quán)利要求6- 16任一項(xiàng)中定義的蛋白質(zhì)栽體的基因表達(dá)的表達(dá)栽體，其特征是所述表達(dá)栽體包含權(quán)利要求20到23任一項(xiàng)中定義的經(jīng)^修飾的核酸。
25. 權(quán)利要求24的表達(dá)栽體，其特征是所述栽體是病毒栽體。
26. 表達(dá)宿主細(xì)胞，其特征是它包含權(quán)利要求20到23任一項(xiàng)中定 義的經(jīng)修飾的核酸，或者權(quán)利要求24或25定義的表達(dá)栽體。
27. 根椐權(quán)利要求26的表達(dá)宿主細(xì)胞，其特征是所述宿主表達(dá)細(xì)胞 是大腸桿菌。
28. 產(chǎn)生權(quán)利要求6到6任一項(xiàng)中定義的蛋白質(zhì)載體的方法，其特中定義的宿主表達(dá)細(xì)胞并回收所述蛋白質(zhì)栽體。。 ' ,
29. 權(quán)利要求20到23任一項(xiàng)定義的經(jīng)修飾的核酸、權(quán)利要求24或 25的定義的表達(dá)栽體或者權(quán)利要求26或27定義的宿主細(xì)胞在制備藥物 組合物中的用途。
30. 權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的多肽的用途，其特征是所述細(xì)胞免疫 應(yīng)答刺激劑是藥物組合物。
31. 權(quán)利要求30的多肽的用途，其特征是所述藥物組合物刺激抗原 呈遞細(xì)胞的成熟。
32. 權(quán)利要求30或31的多肽的用途，其特征是所迷藥物組合物誘 導(dǎo)針對(duì)目的分子的有效免疫應(yīng)答。
33. 權(quán)利要求32的多肽的用途，其特征是所述免疫應(yīng)答是CTL應(yīng)答。
34. 權(quán)利要求30到33任一項(xiàng)的多肽的用途，其特征是所迷藥物組 合物用于治療和預(yù)防傳染病。
35. 權(quán)利要求34的多肽的用途，其特征是所述藥物組合物用于治療 和預(yù)防丙型肝炎。
36. 權(quán)利要求34的多肽的用途，其特征是所述藥物組合物用于治療 和預(yù)防腫瘤疾病。
37. 權(quán)利要求30到33任一項(xiàng)的多肽的用途，其特征是所述藥物組 合物用于治療和預(yù)防變應(yīng)性疾病。
38. 藥物組合物，其特征是它包含至少一種可接受的藥物栽體和至 少一種下面的組分i) 權(quán)利要求6到16任一項(xiàng)中定義的蛋白質(zhì)載體；ii) 權(quán)利要求20到23任一項(xiàng)定義的經(jīng)修飾的核酸；iii )權(quán)利要求24或25中定義的包含所迷經(jīng)修飾的核酸的表達(dá)栽體；或iv)權(quán)利要求26或27中定義的也包含所迷經(jīng)修飾的核酸的表達(dá)宿 主細(xì)胞。
39. 藥物組合物，其特征是它包含一定量的樹(shù)突細(xì)胞，其中所迷樹(shù) 突細(xì)胞已經(jīng)在體外與至少一種下面的組分溫育i) 權(quán)利要求6到16任一項(xiàng)中定義的蛋白質(zhì)栽體；ii) 權(quán)利要求20到23任一項(xiàng)定義的核酸；或iii) 權(quán)利要求24或25中定義的包含所述經(jīng)修飾的核酸的表達(dá)載體。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38或39的藥物組合物，其特征是所述組合物是 疫苗或者免疫治療組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽在產(chǎn)生免疫刺激劑中的用途，所述多肽包含對(duì)應(yīng)于纖連蛋白的EDA結(jié)構(gòu)域的序列，EDA結(jié)構(gòu)域的可以結(jié)合TLR4的片段，或者所述EDA結(jié)構(gòu)域或者片段的變體，其可以結(jié)合TLR4并且與EDA結(jié)構(gòu)域的任何形式或者天然片段有70％以上的同源性。本發(fā)明還涉及所述試劑的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/39GK101287487SQ200680029324
公開(kāi)日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2006年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日
發(fā)明者C·萊勒克, J·J·拉薩特薩加斯蒂貝爾扎, J·普里托瓦爾圖納, M·格雷茨阿亞拉 申請(qǐng)人:西馬生物醫(yī)學(xué)計(jì)劃公司