專利名稱：BRI蛋白對Aβ產(chǎn)生的影響的制作方法
BRI蛋白對A(3產(chǎn)生的影響
關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
國政府在本發(fā)明中具有付費許可證和在有限的情況中要求本專利 所有者按照由國立衛(wèi)生研究院資助的基金AG22024-95264562和AG2利。
背景技術(shù)：
(1)發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及控制阿爾茨海默病中的A(3產(chǎn)生。更具體地，本發(fā) 明是針對使用BRI蛋白來抑制C99的Y -分泌酶剪切和A (3和/或APP胞 內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AID)的釋》丈。
(2)相關(guān)領(lǐng)域的描述
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加工在AD中的致病作用已經(jīng)被這樣的發(fā)現(xiàn)確定APP突變(Goate等， 1991 )和早老素(Y-分泌酶的主要成分)(Sherrington等，1995; Levy-Lahad等，1995a, b; Rogaev等，1995 )導(dǎo)致常染色體顯性家族型 AD形成。因此，由于它的生物學(xué)和病理學(xué)重要性，需要理解APP剪切是 怎樣調(diào)節(jié)的。本發(fā)明解決了這一需要。
發(fā)明概述
據(jù)此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BRI2和BRI3抑制從APP產(chǎn)生A P和APP 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AID)。
因而，在一些實施方案中，本發(fā)明指向減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生 AP和/或AID的方法。該方法包括讓細(xì)胞與有效減少、抑制或防止細(xì)胞 產(chǎn)生AB和或AID的量的BRI2或BRI3或其模擬物接觸。
在其他實施方案中，本發(fā)明指向另外的減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生 AB和或AID的方法。該方法包括讓細(xì)胞與有效減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn) 生AB和或AID的量的弗林蛋白酶(furin)接觸。
另外，本發(fā)明指向治療患有阿爾茨海默病的受試者的方法。該方法 包括給所述受試者施用有效治療該受試者的阿爾茨海默病的量的BRI2 或BRI3或其纟莫擬物。
在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明指向治療患有阿爾茨海默病的受試 者的其它方法。該方法包括給所述受試者施用有效治療該受試者的阿爾 茨海默病的量的弗林蛋白酶。
本發(fā)明還指向確定化合物是否是BRI2或BRI3的模擬物的方法。該 方法包括將化合物與功能性Y-分泌酶和含C99的膜結(jié)合蛋白組合，隨 后測定該化合物是否抑制剪切C99釋放A P和/或AID。在這些實施方案 中，如果化合物抑制Y -分泌酶剪切C99則它是BRI2或BRI3的模擬物。
在另外的實施方案中，本發(fā)明指向包含可藥用賦形劑中的純化的 BRI2或BRI3的組合物。
在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明指向包含可藥用賦形劑中的純化的 弗林蛋白酶的組合物。
本發(fā)明還指向包含可藥用賦形劑中的編碼BRI2或BRI3的載體的組 合物。
在其他實施方案中，本發(fā)明指向包含可藥用賦形劑中的編碼弗林蛋 白酶的載體的組合物。
附圖簡述


圖1是蛋白質(zhì)印跡的圖示和照片，確定了 BRI2是APP的配體。圖a 是所使用的BRI2構(gòu)建體的示意圖。將構(gòu)建體編號為1 (氨基酸1-266， 全長)和2 (氨基酸1-131)。圖b-d顯示了來自HeLa細(xì)胞的抗-FLAG 免疫沉淀物(IPaFLAG)和總?cè)芙猱a(chǎn)物(TL)的蛋白質(zhì)印跡(WB )，所 述的HeLa細(xì)胞表達(dá)顯示BRI2/APP結(jié)合的特異性并作圖相互作用位點的 標(biāo)明的蛋白質(zhì)。pc表示空栽體(pcDM3. 1);數(shù)字l和2表示a中顯示 的BRI2構(gòu)建體；*表示未減少的抗-FLAG抗體；m.表示成熟的、糖基化 形式的APP，而i.表示未成熟的、非糖基化的APP。對于蛋白質(zhì)印跡， ocAPP表示單克隆抗體22C11而ccAPPct是抗APP的C-末端的兔多克隆 抗體。圖e是其中將用APP和BRI2轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的裂解物用兔多克 隆對照(RP)或aAPP-ct沉淀的試驗的蛋白質(zhì)印跡。將免疫沉淀物和總 溶解產(chǎn)物用aAPP單克隆抗體22Cll或aFLAG進(jìn)行印記。將BRI2，以及 17kDa的BRI2 N-末端片段(BRI2nt)和APP —起用otAPPct沉淀。
圖2是蛋白質(zhì)印跡的照片，確定了內(nèi)源性APP和BRI2在成人腦中 相互作用。在圖a中，將來自用FLAG-BRI2轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的溶解產(chǎn) 物用雞對照抗體(泳道3)、可商業(yè)獲得的雞ocBRI2抗體(泳道6)、 單獨的蛋白質(zhì)A/G珠(泳道9)、對照兔多克隆抗體(泳道12)、兔多 克隆EN3 aBRI2抗體(泳道15 )、 一種獨特的兔aBRI2血清(泳道18 ) 和小鼠aBRI2多克隆抗體(泳道21)沉淀。將總?cè)芙猱a(chǎn)物(L)、上清 液(S )和沉淀物(P )進(jìn)行凝膠分離并用aFLAG探測。只有EN3能夠使 BRI2沉淀。~ 17和14 kDa的BRI2nt片段未沉淀，因為由EN3識別的 表位是Brichos結(jié)構(gòu)域的C-末端。在圖b中，將總腦勻漿物用對照兔多 克隆(RP) 、 aAPPct或EN3免疫沉淀。將總腦溶解產(chǎn)物(T. L.)和免 疫沉淀物用aAPP單克隆抗體22C11 (上圖)或aAPPct (下圖)印記。 圖3是蛋白質(zhì)印跡的圖表和照片，確定了 BRI2調(diào)節(jié)通過分泌酶的 APP加工。圖a-c中，BRI2減少了 HeLa、 N2a和HEK293細(xì)胞中的APP-Ga 14-驅(qū)動的螢光素酶活性。將這些細(xì)胞用APP-Gal4與pcDNA3. 1 ( pc )或 FLAG-BRI2、 BRI21-131或BACE—起共轉(zhuǎn)染。數(shù)據(jù)表示為用空栽體轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞中測量的螢光素酶活性的百分比。BRI2、 BACE和pc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 表達(dá)類似水平的APP-Gal4(未顯示)。誤差線表示3次獨立試驗的±SD。 圖d，將細(xì)胞用APP-Gal4、pcDNA3. 1 (pc)或BRI2轉(zhuǎn)染。隨后將用APP-Gal4 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以標(biāo)明的比例與BRI2或pc. DM3. 1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合。在轉(zhuǎn) 染和混合24小時后如上描述的分析樣品的螢光素酶活性。圖e-f， BRI2 抑制AP 40/AP 42的產(chǎn)生。將穩(wěn)定表達(dá)APP的HEK293細(xì)胞(HEK293APP ) 用空載體(pc ) 、 BACE或FLAG-BRI2轉(zhuǎn)染，并且通過ELISA測量培養(yǎng)基 中分泌的A P 40和A P 42。通過所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含 量來標(biāo)準(zhǔn)化測量AP的量。誤差線表示3次獨立試驗的土SD。圖g，轉(zhuǎn) 染的HeLa細(xì)胞的脈沖-追蹤試驗，表示4個獨立的試驗。將HEK293APP 細(xì)胞用空載體(載體)或FLAG-BRI2轉(zhuǎn)染。將經(jīng)代謝標(biāo)記的細(xì)胞的溶解 產(chǎn)物用ccAPPct沉淀。每條泳道上方的數(shù)字表示細(xì)胞被追蹤的時間(c)。 BRI2表達(dá)減少了 C83產(chǎn)生同時顯著增加了 C99的產(chǎn)生。圖h，在標(biāo)記4 小時后收集經(jīng)類似轉(zhuǎn)染的HEK293APP細(xì)胞的條件培養(yǎng)基并用P21或6E10 沉淀。雖然BRI2減少了 sAPPct的量，但總sAPP (sAPPa+sAPPP )沒 有顯示出顯著變化，這表明sAPPP產(chǎn)生增加以及APP從oc分泌酶加工轉(zhuǎn) 變成了 P分泌酶。圖i，將細(xì)胞用APLP2與pc. DNA3.1或BRI2—起轉(zhuǎn)染。 在轉(zhuǎn)染24小時后，通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞的BRI2和APLP2肽。
圖4是蛋白質(zhì)印跡的照片，確定了 BRI2的前102個氨基酸是抑制 C99的有效剪切所必需的，并且確定相同區(qū)域是BRI2結(jié)合至APP的C99 所需要的。左圖顯示來自y30細(xì)胞的總?cè)芙猱a(chǎn)物(TL)的蛋白質(zhì)印跡， 所述y 30細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)APP并用空載體(vec ) 、 myc-標(biāo)簽的全長BRI2 1-266 (BRI2)或多種myc-標(biāo)簽的BRI2 C-末端缺失型構(gòu)建體(通過由 所述構(gòu)建體編碼的氨基酸表示)轉(zhuǎn)染。右圖顯示相應(yīng)溶解產(chǎn)物的抗-myc
免疫沉淀物(rayc IP) 。 HC表示用于免疫沉淀中的myc抗體的重鏈。
圖5是APP-Ga14-驅(qū)動的螢光素酶活性的圖，確定了 BRI2的前102 個氨基酸都是抑制AID產(chǎn)生所需的。將HEK293細(xì)胞用APP-Gal4與空載 體或myc-標(biāo)簽的全長BRI2或多種BRI2 C-末端缺失型構(gòu)建體(通過由 所述構(gòu)建體覆蓋的氨基酸范圍表示)轉(zhuǎn)染。數(shù)據(jù)表示為用空載體轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞中測量的螢光素酶活性的百分比。誤差線表示3次獨立試驗的士SD。 圖6是蛋白質(zhì)印跡的照片，確定了 BRI2抑制sAPPct、 sAPPP的分 泌。將HEK293APP細(xì)胞用空載體(-)或FLAG-BRI2( + )轉(zhuǎn)染。從在Opt i-MEM 中適應(yīng)4小時的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測sAPPa和sAPP P 。APP和BRI2 表達(dá)通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總?cè)芙猱a(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡確定。APP表達(dá)沒有顯著 變化。
發(fā)明詳述
本發(fā)明部分基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)BRI2和BRI3抑制從APP產(chǎn)生A P 。 由于APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AID)是與AP相伴產(chǎn)生，抑制AP的產(chǎn)生也抑制 了AID的產(chǎn)生。不受任何特別的機(jī)制束縳，據(jù)認(rèn)為這種AP產(chǎn)生的抑制 是由于bri2和bri3對P -分泌酶剪切app和y -分泌酶剪切c99的抑制， 抑制了 C99的產(chǎn)生和從C99釋放A卩。參見實施例。
因而，在一些實施方案中，本發(fā)明指向減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生 AB和或AID的方法。該方法包括讓細(xì)胞與足以減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn) 生AB和或AID的量的BRI2或BRI3或其才莫擬物接觸。
在這些實施方案中，BRU和BRI3是脊推動物的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，也 分別稱為"膜內(nèi)在蛋白質(zhì)2B，，和"膜內(nèi)在蛋白質(zhì)2C"。人野生型形式 的這些蛋白質(zhì)分別具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，提 供的cDNA序列為GenBank登記號NM 021999 (BRI2)和NM 030926、 NM 001012516及NM 001012514 (BRI3的三種轉(zhuǎn)錄物變體)。此外，獼猴的 BRI2氨基酸序列和小鼠的BRI3氨基酸序列分別已知為GenBank登記號 Q60HC1和NP071862。有了這些和其他已知的BRI2和BRI3信息，熟練 的技術(shù)人員可以用常規(guī)的方法確定任何脊推動物的BR12和BR13序列。
任何脊推動物的BRI2和BRI3蛋白將期望分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同源的氨基酸序列。
本發(fā)明人還已經(jīng)通過基因合成BRI2蛋白的部分而確定，僅由氨基 酸1-102組成的BRI2蛋白足以減少、抑制或防止AP和/或AID產(chǎn)生。 見實施例1和2。
用于本發(fā)明方法的BRI2或BRI3還可包含擬肽(peptidomimetic)。 如在此使用的，擬肽是能夠模擬蛋白質(zhì)中的天然母體氨基酸的化合物， 這樣用擬肽取代氨基酸不會顯著影響所述蛋白質(zhì)的活性。與天然蛋白質(zhì) 比較，含擬肽的蛋白質(zhì)通常是蛋白酶的差的底物并且可能在體內(nèi)更長時 期內(nèi)是有活性的。許多不可以水解的肽鍵類似物，以及用于合成含這種 鍵的肽的方法是本領(lǐng)域已知的。不可以水解的鍵包括-CH2NH、 -C0CH2、 -CH(CN)NH、 -CH2CH(0H)、 -CH20、 CH2S。而且，含擬肽的肽可以是較少抗 原性的并顯示出總體更高的生物利用度。熟練的技術(shù)人員將了解，含擬 肽的蛋白質(zhì)的設(shè)計和合成應(yīng)該不需要過多的實驗。參見，例如Ripka等， (1998); Kieber-Em隨s等，(1997); Sanderson (1999)。
因此，在這些方法的優(yōu)選實施方案中，讓細(xì)胞與含有這樣的氨基酸 和/或擬肽的BRI2或BRI3接觸所述氨基酸和/或擬肽等價于具有SEQ ID NO: 1的序列的人BRI2蛋白或具有SEQ ID NO: 2的序列的人BRI3 蛋白的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具有與 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同源的氨基酸序列。
在其他優(yōu)選的實施方案中，BRI2或BRI3是天然存在的蛋白質(zhì)。在 一些優(yōu)選實施方案中，BRI2或BRI3與人BRI2或BRI3有大于80 %同源 性的相似。在那些實施方案中，BRI2或BRI3優(yōu)選分別具有與SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: 2的至少部分至少90 %同源的氨基酸序列；更優(yōu)選與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的至少部分至少95 °/。同源的氨基酸序列；并且 甚至更優(yōu)選的，BRI2或BRI3分別具有與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2 的至少部分至少98%同源的氨基酸序列。在最優(yōu)選的實施方案中，BRI2 或BRI3分別與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的至少部分100 %的同源。
由于這些方法中的BRI2或BRI3可以由少至那些蛋白質(zhì)的前102個
氨基酸組成，如在此使用的，"BRI2"或"BRI3"包括小于全長的BRI2 或BRI3蛋白的蛋白質(zhì)，例如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2中提供的蛋 白質(zhì)。因此，該蛋白質(zhì)可少于250、 200、 150或125個氨基酸和/或擬 肽。在其他的優(yōu)選實施方案中，BRI2或BRI3分別含有等價于具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的人BRI2或BRI3的氨基酸1至102的氨 基酸和/或擬肽。
BRI2或BRI3在此還可進(jìn)一步包含另外的有用的部分，例如使得能 緩釋該蛋白質(zhì)或減少該蛋白質(zhì)的降解的部分，如支架(scaffolding) 或PEG,或使得能耙向至特殊細(xì)胞類型的部分如核酸序列。
在這些方法中，可將細(xì)胞與BRI2、 BRI3或BRI2或BRI3的模擬物 接觸。如在此使用的，模擬物指能模擬天然存在的肽(在此為BRI2或 BRI3)的生物作用的任意肽或非肽化合物，通常是由于該模擬物具有模
顯著生物學(xué)特性。所述模擬物可包括，但不限于具有對原型的重大修 飾例如與天然存在的肽無側(cè)鏈相似性的肽(這種修飾，例如可減少它對 降解的敏感性)、抗-獨特型抗體和/或抗-催化抗體或其片段、分離的蛋 白質(zhì)的非蛋白質(zhì)性部分(例如碳水化物結(jié)構(gòu))，或合成的或天然的有機(jī) 分子，包括例如通過組合化學(xué)確定的核酸和藥物。這種模擬物可用本領(lǐng) 域已知的多種方法設(shè)計、選擇和/或確定。多種可用于設(shè)計在本發(fā)明中 有用的模擬物或其他治療用化合物的藥物設(shè)計方法在Maulik等，l"7 中公開，將其在這里通過全文引入作為參考。
這些方法不限于使用任何特殊細(xì)胞，只要所述細(xì)胞能夠產(chǎn)生A P和/ 或AID。這些方法可使用的細(xì)胞的非限制性實例是神經(jīng)元細(xì)胞和基本上 任何其他天然表達(dá)APP或通過基因操作表達(dá)APP的哺乳動物細(xì)胞(見實 施例)。所述細(xì)胞還可以是類似神經(jīng)元細(xì)胞的或者能夠分化成神經(jīng)元細(xì) 胞(例如干細(xì)胞)。在一些優(yōu)選的實施方案中，該細(xì)胞是在活的哺乳動 物內(nèi)。優(yōu)選地，所述哺乳動物是阿爾茨海默病的試驗?zāi)Ｐ突蛉?。在其?的優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是活的哺乳動物，優(yōu)選人體內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞。 在最優(yōu)選的實施方案中，所述的人患有阿爾茨海默病或處于患阿爾茨海
默病的風(fēng)險中，例如具有阿爾茨海默病遺傳傾向的人。
可通過任意的已知方法讓細(xì)胞與BRI2或BRI3或模擬物接觸。實例 包括直接應(yīng)用BRI2或BRI3或模擬物，或施用BRI2或BRI3或模擬物給 含有所述細(xì)胞的哺乳動物，這樣BRI2或BRI3或模擬物將例如通過循環(huán) 系統(tǒng)或通過穿透血腦屏障運送至所迷細(xì)胞。如果所述BRI2或BRI3或才莫 擬物是蛋白質(zhì)(即BRI2或BRI3蛋白)，則可將細(xì)胞與含有編碼至少一 部分BRI2或BRI3蛋白的核酸序列的栽體，例如病毒栽體接觸，其中由 所述核酸編碼的BRI2或BRI3的翻譯實現(xiàn)了接觸。后面的方法是優(yōu)選的 方法，特別是在所述載體能夠進(jìn)入細(xì)胞時(例如，病毒感染細(xì)胞)。
BRI2和BRI3受弗林蛋白酶加工并且產(chǎn)物導(dǎo)致對C99加工的抑制。 因而，細(xì)胞中弗林蛋白酶的增加也減少、抑制或防止A P和/或AID產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明還指向減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生AB和或AID的另 外的方法。該方法包括讓細(xì)胞與足以減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生AB和 或AID的量的弗林蛋白酶接觸。
弗林蛋白酶(或成對堿性氨基酸裂解酶)是細(xì)胞I型跨膜蛋白的前 蛋白轉(zhuǎn)化酶(Thomas, 2002 )。人野生型形式的前原弗林蛋白酶(prepro 弗林蛋白酶)具有氨基酸序列SEQ ID NO: 3，具有GenBank Accession NM002569的cDM序列。成熟蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 3的序列或氨基酸 108-794 。此外，已知小鼠的弗林蛋白酶氨基酸序列為GenBank Accession NP035176。有了關(guān)于脊推動物弗林蛋白酶的這些和其他已知 信息，熟練的技術(shù)人員能用常規(guī)方法確定任何脊推動物的弗林蛋白酶序 列。任何脊推動物的弗林蛋白酶蛋白將期望具有與SEQ ID NO: 3的氨基 酸序列108-794至少80 %同源的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，弗 林蛋白酶含有與具有SEQ ID NO: 3的氨基酸108-794的序列的人弗林蛋 白酶至少95 %—致的氨基酸序列，在最優(yōu)選的實施方案中，所述弗林蛋 白酶是人弗林蛋白酶。
所述弗林蛋白酶在此還可進(jìn)一 步包含另外的有用的部分，例如使得 能緩釋該蛋白質(zhì)或減少該蛋白質(zhì)的降解的部分，如支架或PEG,或使得 能靶向至特殊細(xì)胞類型的部分如核酸序列。
在這些方法中，可將細(xì)胞與增加天然弗林蛋白酶的活性的化合物接 觸，例如將原弗林蛋白酶轉(zhuǎn)化成弗林蛋白酶的肽酶，或增加弗林蛋白酶
運輸至其中存在有BRI蛋白質(zhì)的位點的化合物。然而，在優(yōu)選的實施方 案中，例如通過施用弗林蛋白酶蛋白給含有所述細(xì)胞的哺乳動物，這樣 弗林蛋白酶將例如通過循環(huán)系統(tǒng)或通過穿透血腦屏障運送至所述細(xì)胞 而讓細(xì)胞與弗林蛋白酶蛋白接觸。在更優(yōu)選的實施方案中，弗林蛋白酶 從含有編碼弗林蛋白酶蛋白的氨基酸序列的載體表達(dá)。優(yōu)選地，這些載 體是感染細(xì)胞，因而在原位產(chǎn)生弗林蛋白酶蛋白的病毒載體。
這些方法不限于使用任何特殊細(xì)胞，只要細(xì)胞能夠產(chǎn)生AP和/或
何其他天然表達(dá)APP或通過基因操作表達(dá)APP的哺乳動物細(xì)胞(見實施 例)。所述細(xì)胞還可以是類似神經(jīng)元細(xì)胞的或者能夠分化成神經(jīng)元細(xì)胞 (例如干細(xì)胞)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述的細(xì)胞是在活的哺乳 動物內(nèi)。優(yōu)選地，所述哺乳動物是阿爾茨海默病的試驗?zāi)Ｐ突蛉恕Ｔ谄?他的優(yōu)選實施方案中，該細(xì)胞是活的哺乳動物，優(yōu)選人體內(nèi)的神經(jīng)元細(xì) 胞。在最優(yōu)選的實施方案中，所述的人患有阿爾茨海默病或處于患阿爾 茨海默病的風(fēng)險中，例如具有阿爾茨海默病遺傳傾向的人。
在其他的實施方案中，本發(fā)明指向治療患有阿爾茨海默病的受試者 的方法。該方法包括施用給所述受試者有效治療該受試者的阿爾茨海默 病的量的BRI2或BRI3或其才莫擬物。
在這些方法中，優(yōu)選施用給所述受試者含有等價于具有SEQ ID N0: 1的人BRI2蛋白質(zhì)序列或具有SEQ ID N0:2的人BRI3蛋白質(zhì)序列的氨 基酸1至102的氨基酸和/或擬肽的BRI2或BRI3。在這些實施方案中， BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少 80 %同源的氨基酸序列。在其他的優(yōu)選實施方案中，BRI2或BRI3是天 然存在的蛋白質(zhì)。
在這些方法中，BRI2或BRI3或其模擬物可直接施用至受試者的腦 內(nèi)。備選地，BRI2或BRI3或其模擬物以允許BRU或BRIS或其模擬物 穿透哺乳動物的血腦屏障的方式施用。也可以將BRI2或BRI3或其模擬
物配制成增強(qiáng)BRI2或BRI3或其模擬物穿透受試者血腦屏障的能力的藥 物組合物。
除非另外限制，可以配制在此描述的任何實施方案中的藥物組合物 而不需要過多的試驗，用于施用給哺乳動物，包括人，視情況而定用于 特殊的應(yīng)用。此外，所述組合物的合適劑量可用標(biāo)準(zhǔn)的劑量-反應(yīng)方法 確定而不需要過多試驗。
因此，設(shè)計用于經(jīng)口、經(jīng)舌、舌下、口頰和頰內(nèi)施用的組合物可通 過本領(lǐng)域熟知的手段，例如用惰性稀釋劑或用可食用栽體制備而不需要 過多試驗。組合物可包封于膠嚢中或壓縮成片劑。為經(jīng)口治療施用目的，
可將本發(fā)明的藥物組合物與賦形劑組合并且以片劑、錠劑、膠嚢劑、酏 劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙嚢劑(wafers) 、 口香糖劑(chewing gums )
等形式施用。
片劑、丸劑、膠嚢劑、錠劑等還可包含粘合劑、賦形劑、崩解劑、 潤滑劑、甜味劑和調(diào)味劑。粘合劑的一些實例包括微晶纖維素、黃蓍膠 或明膠。賦形劑的實例包括淀粉或乳糖。崩解劑的一些實例包括褐藻酸、 玉米淀粉等。潤滑劑的實例包括硬脂酸鎂或硬脂酸鉀。助流劑的實例是 膠體二氧化硅。甜味劑的一些實例包括蔗糖、糖精等。調(diào)味劑的實例包 括薄荷、冬青油、橙味香料等。用于制備這些多種組合物的材料應(yīng)該是
藥學(xué)上純的并且使用的量是無毒的。
本發(fā)明的組合物可容易地進(jìn)行腸胃外施用，例如通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 胸內(nèi)或皮下注射。腸胃外施用可通過將本發(fā)明的組合物組合成溶液劑或 混懸劑實現(xiàn)。這種溶液劑或混懸劑還可包含無菌稀釋劑例如注射用水、 鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑。 腸胃外制劑也可包含抗菌劑例如苯甲醇或?qū)αu基苯曱酸甲酯，抗氧化劑 例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉以及螯合劑例如EDTA。也可加入緩沖液例如 醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張度的試劑如氯化鈉或葡萄糖。 腸胃外制劑可以包含于由玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性使用注射器或 倍劑量藥瓶中。
直腸施用包括將藥物組合物施用進(jìn)直腸或大腸內(nèi)。這可用栓劑或灌
腸劑完成。栓劑制劑可以容易地通過本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，栓
劑制劑可這樣制備加熱甘油至約120 °C，將組合物溶解于甘油中，混 合加熱的甘油，之后可加入純凈水，并且將該熱的混合物傾注入栓劑模 中。
經(jīng)皮膚施用包括通過皮膚經(jīng)皮吸收組合物。經(jīng)皮膚制劑包括貼劑 (例如眾所周知的煙堿貼劑)、軟青劑、乳劑、凝膠劑、油骨劑等。
本發(fā)明包括經(jīng)鼻施用給哺乳動物治療有效量的組合物。如在此使用 的，經(jīng)鼻施用或鼻內(nèi)施用包括將組合物施用至患者的鼻道或鼻腔的粘 膜。如在此使用的，用于鼻內(nèi)施用組合物的藥物組合物包含治療有效量 的通過熟知的方法制備的組合物，以例如作為鼻腔噴霧劑、滴鼻劑、混 懸劑、凝膠劑、軟膏劑、乳劑或粉劑施用。該組合物的施用還可用鼻塞 或鼻用海綿進(jìn)行。
在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明指向治療患有阿爾茨海默病的受試 者的其他方法。該方法包括施用給所述受試者有效治療該受試者的阿爾 茨海默病的量的弗林蛋白酶。在這些實施方案中受試者優(yōu)選施用弗林蛋 白酶，所述弗林蛋白酶含有等價于具有SEQ ID NO: 3的氨基酸108-"4 的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸和/或擬肽，其中所述的弗林蛋白酶具 有與SEQ ID NO: 3至少80 %同源的氨基酸序列。在其他的優(yōu)選實施方案 中，弗林蛋白酶是天然存在的蛋白質(zhì)，例如人弗林蛋白酶。
這些實施方案中弗林蛋白酶可直接施用至受試者的腦內(nèi)。備選地， 弗林蛋白酶可以以允許化合物穿透哺乳動物的血腦屏障的方式施用。也
可以將弗林蛋白酶配制成增強(qiáng)所述弗林蛋白酶穿透受試者血腦屏障的 能力的藥物組合物。
使用建立了的用于鑒定模擬物的方法，熟練的技術(shù)人員可通過鑒定 化合物抑制剪切C 9 9釋放出Ap和/或AID來確定BRI2或BRI3的模擬物。 因此，本發(fā)明還指向確定化合物是否是BRI2或BRI3的模擬物的方法。 該方法包括將化合物與功能性Y-分泌酶和含C99的膜結(jié)合蛋白組合， 隨后測定該化合物是否抑制C99被剪切而釋放A P和/或AID。在這些實 施方案中，如果該化合物抑制Y-分泌酶剪切C99則它是BRI2或BRI3
的模擬物。
對剪切C99釋放出A0和/或AID的抑制可通過任何已知的方法測 定，例如實施例中描述的方法。這種方法包括例如用AP和/或AID-特 異性抗體測量A P和/或AID的釋放，其中BRI2或BRI3模擬物將導(dǎo)致A P 和/或AID減少。C99的抑制也可通過測量C99的變化測定，其中模擬物 將導(dǎo)致C99增加(見實施例)。
同樣如實施例中確定的，BRI2或BRI3對C99的剪切的抑制導(dǎo)致C83 和sAPPot的存在減少，而sAPPP的存在增加。因此，BRI2或BRI3^^擬 物應(yīng)該引起C83和sAPPa減少而sAPPP增加。
上述測定可通過任何已知的方法進(jìn)行。優(yōu)選的方法包括ELISA、質(zhì) 譜或蛋白質(zhì)印跡。如本領(lǐng)域已知的，蛋白質(zhì)印跡使得能比ELISA更明確 地鑒定化合物，但它是一種更耗時且麻煩的方法。
這些方法不限于將要評估的任何特殊化合物。例如，可以評估隨機(jī) 化合物的庫。然而優(yōu)選地是，將化合物設(shè)計成模擬BRI2或BRI3蛋白的 部分，所述BRI2或BRI3蛋白的部分含有等價于分別具有SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: 2的序列的人BRI2或BRI3蛋白的氨基酸1至102的氨基 酸。例如，可以設(shè)計這種化合物來模擬BRI2或BRI3蛋白的所述部分的 三維結(jié)構(gòu)和/或電荷。備選地，所述化合物可包含擬肽這樣該化合物可 模擬BRI2或BRI3氨基酸序列。
在優(yōu)選的實施方案中，含C99的膜結(jié)合蛋白是淀粉樣前體蛋白 (APP)，例如將在表達(dá)APP的細(xì)胞中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)。
這些方法可在體外(例如在試管內(nèi))進(jìn)行。然而優(yōu)選地是，功能性 Y-分泌酶和含C99的膜結(jié)合蛋白是在活的細(xì)胞中。這些活細(xì)胞的非限 制性實例是含有基因構(gòu)建體的那些細(xì)胞，所述的基因構(gòu)建體在Y-分泌 酶剪切轉(zhuǎn)基因APP時激活報告基因(例如，螢光素酶)的轉(zhuǎn)錄，如實施 例1中的描述的。在這些實施方案中，所述的轉(zhuǎn)基因APP優(yōu)選進(jìn)一步在 該轉(zhuǎn)基因APP的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上含有Gal4 (見實施例)。
如果所述方法使用活細(xì)胞，則表達(dá)功能性Y-分泌酶和APP的任何 細(xì)胞都可使用。非限制性實例包括神經(jīng)元細(xì)胞或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因APP的細(xì)胞， 例如HEK293細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或N2a細(xì)胞。參見實施例。
在另外的實施方案中，本發(fā)明指向包含可藥用賦形劑中的BRI2或 BRI3的組合物。優(yōu)選地，BRI2或BRI3含有這樣的氨基酸和/或擬肽 所述氨基酸和/或擬肽等價于具有SEQ ID NO: 1的序列的人BRI2蛋白 或具有SEQ ID NO: 2的序列的人BRI3蛋白的氨基酸1至102，其中BRI2 蛋白和BRI3蛋白分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同 源的氨基酸序列。BRI2或BRI3可以包含從全長蛋白質(zhì)下至102個氨基 酸和/或擬肽的任意數(shù)目的氨基酸和/或擬肽，包括，例如少于250個氨 基酸和/或擬肽、少于200個氨基酸和/或擬肽、少于150個氨基酸和/ 或擬肽或少于125個氨基酸和/或擬肽。
在一些實施方案中，可藥用賦形劑增強(qiáng)了 BRI2或BRI3穿透受試者 的血腦屏障的能力。在其他實施方案中，將組合物配制成單位劑量形式 用于治療阿爾茨海默病。
本發(fā)明另外指向包含可藥用賦形劑中的純的弗林蛋白酶的組合物。 優(yōu)選地，所述弗林蛋白酶包含等價于具有SEQ ID NO: 3的氨基酸108_794
的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸和/或擬肽，其中該弗林蛋白酶具有與 SEQ ID N0:3至少80 %同源的氨基酸序列。優(yōu)選地，該弗林蛋白酶是天
然存 在的蛋白質(zhì)。
在一些實施方案中，可藥用賦形劑增強(qiáng)了弗林蛋白酶穿透受試者的 血腦屏障的能力。在其他實施方案中，將組合物配制成單位劑量形式用 于治療阿爾茨海默病。
本發(fā)明還指向包含可藥用賦形劑中的編碼BRI2或BRI3的栽體的組 合物。優(yōu)選地，BRI2或BRI3包含這樣的氨基酸所述氨基酸等價于具 有SEQ ID NO: 1的序列的人BRI2蛋白或具有SEQ ID N0:2的序列的人 BRI3蛋白的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具 有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同源的氨基酸序列。在一 些實施方案中，可藥用賦形劑提高了 BRU或BRI3穿透受試者的血腦屏 障的能力。在其他實施方案中，將組合物配制成單位劑量形式用于治療 阿爾茨海默病。這些實施方案不限于任何特殊載體。然而，在優(yōu)選的實
施方案中，該載體是病毒。
本發(fā)明還指向包含可藥用賦形劑中的編碼弗林蛋白酶的載體的組
合物。優(yōu)選地，所述弗林蛋白酶包含等價于具有SEQ ID NO: 3的氨基酸 108-794的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸,其中該弗林蛋白酶具有與SEQ ID NO: 3至少80 %同源的氨基酸序列。在其他優(yōu)選實施方案中，該弗林 蛋白酶是天然存在的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，可藥用賦形劑提高了 弗林蛋白酶穿透受試者的血腦屏障的能力。在其他實施方案中，將組合 物配制成單位劑量形式用于治療阿爾茨海默病。優(yōu)選地，所述栽體是病毒。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案在下面的實施例中描述。根據(jù)在此公開的本 發(fā)明說明書或?qū)嵺`的描述，在這里權(quán)利要求書范圍內(nèi)的其他實施方案對 本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。旨在說明，所述的說明書與實 施例一起僅作為示例考慮，本發(fā)明的范圍和精神在實施例后面的權(quán)利要 求書中說明。
實施例1.由家族性癡呆BRI2基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合APP并抑制A
P產(chǎn)生
實施例相克述
阿爾茨海默病(AD)是最普遍的老年性癡呆，表征為淀粉樣蛋白斑、 血管淀粉樣蛋白、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和進(jìn)行性神經(jīng)變性。淀粉樣蛋白主要 由AP肽組成，AP肽源自分泌酶對P-淀粉樣前體蛋白(APP)的加工。 與AP—起釋放的APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AID)具有信號傳導(dǎo)功能，因為它調(diào) 節(jié)調(diào)亡和轉(zhuǎn)錄。盡管它在生物學(xué)和病理學(xué)上很重要，調(diào)節(jié)APP加工的機(jī) 制仍缺乏了解。膜結(jié)合蛋白促使Notch受分泌酶剪切并釋放出轉(zhuǎn)錄-活 性的細(xì)胞內(nèi)片段。考慮到APP和Notch信號之間的顯著相似性，我們假 定APP加工受類似調(diào)節(jié)。
這里，我們顯示BRI2 (—種II型膜蛋白)與APP相互作用。有趣 地是，對應(yīng)AP NH2-末端部分的17個氨基酸是這種相互作用所需的。 而且，BRI2表達(dá)調(diào)節(jié)了 APP的加工，導(dǎo)致AP和AID水平降低?？偠?之，這些發(fā)現(xiàn)鑒定了 BRI2-APP相互作用為抑制A0產(chǎn)生的APP加工的調(diào)
節(jié)機(jī)制。值得注意地是，BRI2突變導(dǎo)致臨床上和病理學(xué)上類似于AD的 家族性英國型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD) 。 BRI2病原性突 變改變了 BRI2對APP加工的調(diào)節(jié)功能這一發(fā)現(xiàn)將確定APP剪切的調(diào)節(jié) 失調(diào)為AD、 FDD和FBD共有的致病機(jī)制。
介紹
由于其他Y -分泌酶底物的剪切是通過膜結(jié)合的配體調(diào)節(jié)，我們假 定存在結(jié)合APP并調(diào)節(jié)其加工的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。在這里，我們描述了 BRI2 (Deleersnijder等，1996 )，其為一種實現(xiàn)這種描述的II型膜蛋 白。
試驗步驟
按描述的將Y 30細(xì)胞維持在補(bǔ)充有抗生素和10 %胎牛血清的DMEM
(Kimberly等，2003 )中。
分裂-泛素化酵母雙雜交篩選分裂-泛素化系統(tǒng)提供了 一種有吸引 力的備選方案用以分析膜內(nèi)在蛋白質(zhì)之間的相互作用(Stagljar等， 1998 )。分裂-泛素化系統(tǒng)和人腦文庫可購自Dualsystems Biotech
(Zurich, Switzerland)。篩選依照生產(chǎn)商的方法進(jìn)行。簡而言之， 將人APP (氨基酸1-695 )、人APP (氨基酸1-664; APPNcas)或人APLP2 分別克隆進(jìn)pTMV4、 pAMBV4、 pAMBV4誘斜載體(bait vector)中，以 獲得融合至泛素的C-端部分(Cub)的APP家族誘餌蛋白，之后將報告 片段(LexA， 一種DNA-結(jié)合蛋白，融合至VP16 (—種轉(zhuǎn)錄激活物)) 克隆進(jìn)載體。人腦文庫表達(dá)融合在突變泛素的N-端部分處的蛋白質(zhì)
(NubG)。對于每個文庫，我們篩選約5xl(^個轉(zhuǎn)化體。編碼可以與 APP/APLP2-Cub相互作用的蛋白質(zhì)的克隆將促進(jìn)NubG: Cub相互作用，之 后募集泛素-特異性蛋白酶，剪切APP/APLP2_Cub誘餌蛋白，釋放 LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子并轉(zhuǎn)錄激活兩種報告基因(LacZ和HIS3 )。從HIS3 和LacZ陽性酵母轉(zhuǎn)化體回收文庫質(zhì)粒并克隆進(jìn)具有N-末端FLAG標(biāo)記的 pcDNA3. 1中，并且通過如下面描述的免疫沉淀法直接檢測它與APP相互 作用的能力。對這兩種報告基因的輔激活因子的篩選導(dǎo)致鑒定了已知的
APP/APLP2-結(jié)合蛋白，例如Fe65 (Zambrano等，1997 )。
質(zhì)粒從這兩種雜交克隆PCR-擴(kuò)增全長的BRI2和BRI21—131并克隆進(jìn) pcDNA3. 1-FLAG中(Matsuda等，2001 )。哺乳動物的表達(dá)載體APP、 APPNcas已有描述(Scheinfeld等，2002 )。將myc-標(biāo)簽插入ApoER2 的信號序列后并克隆進(jìn)pEF-B0S中。從小鼠腦cDNA克隆BACE并將其通 過克隆進(jìn)pcDNA3mycHisB (Invitrogen)進(jìn)行C-末端myc標(biāo)記。
抗體4吏用了下面的抗體:ocFLAG(小鼠單克隆M2， Sigma); ocAPP 小鼠單克隆22C11 (Chemicon) 、 6E10 (Signet labs)和p2-l (Biosource); amyc (小鼠單克隆9E10， Santa Cruz Biotechnology); 兔多克隆抗體ocAPPct(ZMD. 316， Zymed) (Scheinfeld等，2002);雞對 照抗體(IgY, Southern Biotechnology); 雞oc BRI2 (IgY ， BMA Biomedicals);兔多克隆對照抗體(IgG， Southern Biotechnology); EN3 (Pickford等，2003)(兔多克隆抗體);兔otBRI2 (Dr. Jorge Ghiso 饋贈)、對抗包含人BRI2的胞質(zhì)尾區(qū)的肽的小鼠多克隆抗體。兔多克隆 抗-APLP1和抗APLP2 C-末端抗體購自Calbiochem/^司。
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染.將HEK293、穩(wěn)定表達(dá)APP的HEK293( HEK293APP )、 HeLa、 N2a細(xì)胞在37 。C下于5 %的C02中維持在Dulbecco氏改良的 Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有青霉素、鏈霉素和10 % 的月臺牛血、清。FuGENE 6 (Roche Applied Science)或Metafectene (Biontex)用于轉(zhuǎn)染。
免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡.除非另外說明，所有的免疫沉淀步驟在4 。C下進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含有10 % (v/v)甘油的緩沖液A[20 mM Hepes/NaOH pH 7.4， 1 mM EDTA， lmM DTT， 150 mM NaCl， 0.5% (w/v) TritonX-100]中溶解30分鐘，并且溶解產(chǎn)物在20, 000 g下離心10分 鐘。對于FLAG免疫沉淀，將澄清的溶解產(chǎn)物與20 " 1的FLAG-M2珠 (Sigma)混合2小時，并用緩沖液A洗滌3次。讓沉淀物在60 pl的 2xSDS樣品緩沖液中沸騰并接受蛋白質(zhì)印跡。對于其他免疫沉淀，將澄 清的溶解產(chǎn)物與抗體一起孵育1小時，并且將其與20^1的蛋白A/G珠 (Pierce)混合，如上描述的洗滌和處理。用Dounce勻漿器將人腦 (Dr. Peter Davies饋贈)在含10 % ( v/v )甘油的緩沖液A中勻漿。 過夜提取蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)濃度為5 mg/ml。將提取的蛋白質(zhì)在20， 000 g 下離心1小時。將上清液與用含l % (w/v) BSA的PBS封閉的指定抗體 和蛋白質(zhì)A/G珠一起孵育。將沉淀物如上描述的洗滌和處理。
代謝標(biāo)記.將用pcDNA3或BRI2轉(zhuǎn)染的HEK293APP細(xì)胞在無甲硫氨 酸和半胱氨酸的DMEM ( Invitrogen)中孵育2小時，所述的DMEM補(bǔ)充 有青霉素、鏈霉素和10%的胎牛血清。隨后通過加入["S]標(biāo)記的甲硫氨 酸和半胱氨酸(ICN)進(jìn)培養(yǎng)基中標(biāo)記細(xì)胞30分鐘。將標(biāo)記的細(xì)胞徹底 洗滌，在補(bǔ)充有青霉素、鏈霉素和IO °/。胎牛血清的DMEM中追蹤指定的 時間。在追蹤后，如上描述的將細(xì)胞溶解并用ctAPPct免疫沉淀。將標(biāo) 記的細(xì)胞通過在20， 000 g下離心10分鐘除去培養(yǎng)基，并隨后用標(biāo)明的 抗體免疫沉淀。
螢光素酶測定法.按所描述的進(jìn)行該測定法(Scheinfeld等，2003 )， 除了將APP-Ga14融合物(Gianni等，2003 )用作Gal4來源。通過共轉(zhuǎn) 染的P -半乳糖苷酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化螢光素酶活性以監(jiān)控轉(zhuǎn)染率。
酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA ).將HEK293APP細(xì)胞用pcDM3或BRI2 轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24小時后，讓細(xì)胞適應(yīng)24小時，并且按照生產(chǎn)商的方法， 用人A0ELISA試劑盒(KMI Diagnostics)測量培養(yǎng)基中的AP40和A 0 42。如上描述的將轉(zhuǎn)染細(xì)胞溶解并澄清，并且將提取的蛋白質(zhì)的量用 于標(biāo)準(zhǔn)化通過ELISA檢測的A P的量。
蛋白質(zhì)測定.蛋白質(zhì)濃度通過Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad)測 定，BSA用作標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果和討論
為了檢驗?zāi)?連接的蛋白質(zhì)是否可調(diào)節(jié)APP加工，我們用分裂-泛素 化系統(tǒng)鑒定膜蛋白質(zhì)之間的相互作用。篩選人腦cDM文庫的與APP家 族蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)導(dǎo)致鑒定了 BRI2(Deleersnijder等，1996 ) 和BRI3 ( Vidal等，2001 )(未顯示)，兩者是含有Brichos結(jié)構(gòu)域的 II型膜蛋白基因家族的成員。雖然BRI蛋白的功能未知，但在患有FBD (Vidal等，1999 )和FDD (Vidal等，2000 )的患者中發(fā)現(xiàn)BRI2突變
體。值得注意地是，F(xiàn)BD和FDD的神經(jīng)-病理檢查所見包括實質(zhì)前-淀粉 樣沉積(FBD和FDD)和斑(FBD)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、嗜剛果紅淀粉樣 血管病(CAA)和神經(jīng)變性，與AD類似。因此，由于BRI2的突變導(dǎo)致 類似AD的家族性癡呆，我們進(jìn)一步研究這種BRI2-APP相互作用的生理 學(xué)相關(guān)性。
為了評估哺乳動物細(xì)胞中的BRI2-APP相互作用，將HeLa細(xì)胞用 BRI2和APP構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染(圖la)。用ctFLAG抗體免疫沉淀細(xì)胞溶解 產(chǎn)物顯示，BRI2與全長的APP(圖lb和d ) 、 C99(圖lb和d )和APPNcas 相互作用，所述APPNcas表示APP的大部分胞內(nèi)區(qū)域的缺失型(圖lc)， 但是不與C83相互作用(圖lb和d ) 。 APP以雙份進(jìn)行操作。較低的APP 帶表示非糖基化的、未成熟的APP;相反上面的形式是由成熟的、糖基 化的APP組成。值得注意的是，只有成熟的、糖基化形式的APP和APPNcas 與BRI2相互作用(圖lb 、 c和d)。還應(yīng)該注意的是，BRI2過表達(dá)顯 著增加了 C99的量(圖lb和ld)。這種發(fā)現(xiàn)的意義將在在后面探究。 大部分BRI2 ecto-結(jié)構(gòu)域的缺失型沒有破壞與APP的結(jié)合 (BRI21131，圖ld)。用aAPP抗體反向免疫沉淀揭示APP免疫沉淀BRI2 (圖le )。此外，在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中檢測到的蛋白水解的~ l化Da BRI2 NH「端片段(BRI2nt，其與BRI21—131的大小相似)也與APP沉淀(圖le)。 這些相互作用的特異性為BRI2不結(jié)合至ApoER2 (另一種I型膜內(nèi)在蛋 白質(zhì))(圖lc)這一證據(jù)進(jìn)一步支持。這些發(fā)現(xiàn)證明，APP的胞漿內(nèi)尾 區(qū)和大部分的APP和BRI2的外功能區(qū)是BRI2/APP相互作用不必要的， 而緊靠跨膜區(qū)并含有NH廣末端A p序列的APP外功能區(qū)內(nèi)的17氨基酸區(qū) 域是這種結(jié)合所必需的。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈暗示，BRI2和APP不是反式相互 作用(即，作為在不同膜上表達(dá)的受體/配體)，而是，在細(xì)胞膜中形 成分子復(fù)合物。
APP和BRI2都在成熟的神經(jīng)組織中表達(dá)。因此，我們尋求確定APP 是否在成人腦中也與BRI2相互作用。首先，我們試驗了四種抗BRI2抗 體以確定它們是否能免疫沉淀人BRI2。對于這些試驗，將HeLa細(xì)胞用 FLAG-BRI2轉(zhuǎn)染并用四種BRI2抗體和對照免疫沉淀。如圖2a中顯示的，
只有EN3抗-BRI2抗體能夠沉淀BRI2。接下來，我們制備人腦的勻漿物 并用aAPPct抗體或EN3進(jìn)行免疫沉淀。如圖2b中顯示的，C99(和更 長的C00H-末端APP片段)與抗-APP及EN3抗體沉淀，而C99不與兔多 克隆IgG沉淀。有趣地是，也在該情形中C83不與BRI2沉淀，盡管它 被aAPPct沉淀。此外，全長的APP也被EN3沉淀，盡管處于較低的水 平?？偠灾@些試驗表明內(nèi)源性APP和BRI2在成人腦中結(jié)合。此 外，它們顯示BRI2優(yōu)先與C99和更長的APP C-末端片段相互作用但不 與C83相互作用。
如圖lb和ld中顯示的，BRI2構(gòu)建體的表達(dá)恒定地導(dǎo)致C99的水平 增加。有可能這種C99水平的顯著增加取決于BRI2對APP加工的影響。 為了直接檢驗該可能性，我們在HeLa、 HEK293和N2a細(xì)胞中表達(dá)了 FLAG-標(biāo)記的BRI2， 一起的還有APP-Gal4、受Gal4啟動子控制的螢光素酶報 告基因和P -半乳糖甘酶構(gòu)建體。APP-Gal4是酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4與APP 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的融合物。y-剪切APP-Gal4從膜釋放出AID-Gal4至核， 隨后激活了螢光素酶轉(zhuǎn)錄(Gianni等，2003 )。如圖3a中顯示的，BRI2 在所有這三種細(xì)胞系中都減少了螢光素酶活性，暗示抑制了 AID的形成。 相反，正如如預(yù)期的，p-分泌酶(BACE)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致AID釋放增加， (圖3b)。仍然與APP相互作用并產(chǎn)生了增加的C99水平的BRI21—131突 變體(圖ld)也抑制了 AID釋放(圖3c)。最后，混合試驗顯示，對 于BRI2抑制AID-Gal4釋放，它必須與APP-Gal4在相同的細(xì)胞中共表 達(dá)。實際上，將表達(dá)BRI2的細(xì)胞與表達(dá)APP-Gal4的細(xì)胞混合不會影響 AID的釋放(圖3d)。這進(jìn)一步表明BRI2和APP是順式相互作用而不 是反式相互作用。
為了進(jìn)一步-驗證該系統(tǒng)，我們已經(jīng)測量了用BRI2轉(zhuǎn)染的HEK293的 條件培養(yǎng)基中的AP ，并且發(fā)現(xiàn)BRI2顯著減少了 AP40和AP42的水平 (圖3b) 。 BACE轉(zhuǎn)染再一次增加了 AP4O和A0 42的分泌(圖3f )。
BRI2對AID和AP產(chǎn)生的抑制表明，BRI2表達(dá)減少了 y-分泌酶對 APP的剪切。然而，還可能是BRI2可調(diào)節(jié)APP的p-和a-剪切。如上面 論述的，APP受P -或a-分泌酶的剪切分別釋放出sAPP P和sAPP a于上
清液中。sAPPoc或sAPPP的量增加表明ct-或剪切增加，而sAPPct 或sAPPI3減少反映oc-或p-剪切減少。因此，為了確定BRI2是否影響 ot-或P-分泌酶，我們測量了 sAPPcc和sAPPP的量。在這些相同的實 驗中，我們還測量了 C99和C83的細(xì)胞內(nèi)水平。將HEK293-APP細(xì)胞用 FLAG-BRI2或載體對照轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用[35S]甲硫氨酸-半胱氨酸脈沖 標(biāo)記30分鐘，然后在37。C下追蹤0、 1、 2和4小時(圖3c)。 將細(xì) 胞溶解產(chǎn)物在每個時間點用aAPP-ct抗體免疫沉淀(圖3c)。為了測 量分泌的APP ( sAPPa和sAPPP )，從標(biāo)記4小時的細(xì)胞收集上清液并 將其用抗-APP抗體P21 (其使sAPPa和sAPPP都沉淀)或6E10 (其僅 使sAPPa沉淀)沉淀(圖3d) 。 BRI2轉(zhuǎn)染導(dǎo)致C83 (圖3c )和sAPPa (圖3d)的量減少。相反，C99 (圖3c)和sAPPP (圖3d )的水平增 加。值得注意地是，BRI2在所有時間點都被otAPP-ct抗體共免疫沉淀。 因此，BRI2表達(dá)減少a-分泌酶剪切APP，同時增加了 P-分泌酶對它的 加工。伴隨的Y-分泌酶的抑制和APP的P-剪切的增加解釋了 C99水平 的顯著增加。
APP是包括APLP1和APLP2的蛋白質(zhì)家族的成員。APLP1和APLP2 也是g-分泌酶底物(Scheinfeld等，2002 )并且，在眾多的y-分泌酶 底物之中，它們是與APP具有更大的序列相似性的那些。因此，為了檢 驗BRI2通常是否影響g-分泌酶或特異性抑制APP的g-剪切，我們用 APLP1或APLP2轉(zhuǎn)染BRI2。使用抗-APLPl或抗-APLP2 C-末端抗體的蛋 白質(zhì)印跡表明，BRI2表達(dá)不會促進(jìn)APLP1 (未顯示)和APLP2 (圖M) 的C-端片段的積聚。該結(jié)果支持這樣的觀點BRI2特異性地對阻斷APP 的y -活性但沒有阻斷對其他y -底物上的y ""活性。
總而言之，這些研究表明BRI2和APP在細(xì)胞膜中形成多分子復(fù)合 物。雖然APP和BRI2在這種復(fù)合物中的化學(xué)計量必須要研究并且BRI2 和APP是否在含有其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)是未知的，但我們的數(shù)據(jù)表 明BRI2作為APP加工的內(nèi)源性調(diào)節(jié)物起作用。更特別地是，我們在這 里發(fā)現(xiàn)BRI2表達(dá)減少了 APP的a和Y兩種的剪切。盡管負(fù)責(zé)這些功能 的詳細(xì)的分子機(jī)制必須直接解決，但BRI2與含有a-和y-切割位點的 APP的區(qū)域相互作用這一發(fā)現(xiàn)暗示BRI2在物理上遮蔽了所述分泌酶的 這兩種靶序列。
目前，BRI2的突變已在FBD ( Vidal等，1999 )和FDD ( Vidal等， 2000 )患者中發(fā)現(xiàn)。野生型和突變型BRI2都受弗林蛋白酶加工(Kim 等，1999 )，這種加工導(dǎo)致C-末端肽的分泌。野生型BRI2的弗林蛋白 酶剪切釋放出17個氨基酸長的肽。在FBD患者中，BRI2的終止密碼子 的點突變導(dǎo)致3，-非翻譯區(qū)的通讀(read-through)并合成在C-端含 有11個額外氨基酸的BRI2分子。這種突變的BRI2的弗林蛋白酶剪切 產(chǎn)生一種更長的肽(ABri肽)，其作為淀粉樣蛋白纖維沉積。在丹麥親 緣族中，在正常的終止子之前一個密碼子的10-nt重復(fù)的存在引起了 BRI2序列的移碼(frame-shift)，產(chǎn)生大于正常的前體蛋白質(zhì)，該蛋 白質(zhì)的淀粉樣蛋白亞基包含最后的34 C-末端氨基酸。ABri和ADan淀 粉樣蛋白的沉積認(rèn)為是這些癡呆的致病原因。然而，BRI2調(diào)節(jié)APP加工 這一發(fā)現(xiàn)是令人感興趣的，并且促使人們推測改變的APP加工也是FBD 和FDD中的致病因素。與這一假設(shè)一致，在FDD患者中檢測到升高的A 卩42沉積水平，并在CAA損傷中檢測到升高水平的ADan。
實施例2. BRI2對APP加工的影響的進(jìn)一步研究
用實施例l中描述的方法，測量由前80、 93、 96、 99、 102、 105、 117和131個氨基酸組成的BRI2缺失型構(gòu)建體的影響。如圖4 (左圖) 中顯示的，僅大于99個氨基酸的截短形式顯示了 C99在總?cè)芙猱a(chǎn)物中 的積聚，這表明抑制了 C99的進(jìn)一步加工。由前96個和99個氨基酸組 成的缺失型構(gòu)建體顯示出弱很多的抑制作用，而由前80個和前93個氨 基酸組成的那些未顯示抑制。BR 12對C 9 9加工的這種抑制作用對應(yīng)于如 圖4 (右圖)中顯示的這些BRI2截斷形式與C99和全長APP的結(jié)合。將 同一組缺失型構(gòu)建體用于測定它們對AID產(chǎn)生的影響。APP-Gal4-驅(qū)動 的螢光素酶活性的結(jié)果(圖5 )進(jìn)一步支持這樣的結(jié)論含有多于前99 個氨基酸的BRI2構(gòu)建體是有效抑制產(chǎn)生AID所必需的。
實施例1確定sAPPoc在存在BRI2時減少，表明BRI2抑制a-分泌 酶。進(jìn)行了另外的實驗用以測定BRI2對sAPPP產(chǎn)生的影響。如圖6中
顯示的，sAPPP產(chǎn)生也在存在BRI2時減少，表明BRI2抑制P-分泌酶。 鑒于上述內(nèi)容，將會發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的幾個優(yōu)勢已實現(xiàn)并且獲得了其
他優(yōu)勢。
范圍，所以意味著上述描述中包含的和附帶的圖中顯示的所有內(nèi)容都應(yīng) 該理解為是說明性的而無限制性意義。
文獻(xiàn)的論述僅旨在概括由作者做出的論斷而不是承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu) 成了當(dāng)前技術(shù)。申請人保留了質(zhì)疑所引用的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和相關(guān)性 的權(quán)利。
SEQ ID NO
SEQ ID NO: 1-人BRI2氨基酸序列GenBank Q9Y287
1 mvkvtfiisal aqkeakkdep ksgeealiip pdavavdckdpddwpvgqr rawcwcmcfg 61 lafinlagvil ggaylykyfa lqpddvyycg ikyikddvil nepsadapaa lyqtieenik 121 ifeeeevefi svpvpefads dpanivhdfo kkltayldln ldkcyvipln tsivmpprnl 181 lellinikag tylpqsylih ehmvitdrie nidhlgffiy rlchdketyk lqrretikgi 241 qkreasncfa irhfenkfav etlics
SEQ ID NO: 2-人BRI 3氨基酸序列GenBank Q9NQX7
1 mvkisfqpav agikgdkadk asasapapas ateilltpar ee聊qhrsk rggsvggvcy 61 lsmgmwllm glvfasvyiy ryfflaqlar dnffrcgvly edsssqvrt qmeleedvki 121 yldenyerin vpvpqfgggd padiihdfqr gltayhdisl dkcyvielnt tivlppmfw 181 ellmnvkrgt ylpqtyiiqe emwtehvsd kealgsfiyh lcngkdtyrl rrratinin 241 krgakncnai rhfentfVve tlicgw
SEQ ID NO: 3-人弗林蛋白酶前蛋白原GenBank NP002560<formula>formula see original document page 33</formula>
權(quán)利要求
1.減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生Aβ和/或AID的方法，所述方法包括將細(xì)胞與有效減少、抑制或防止所述細(xì)胞產(chǎn)生AB和或AID的量的BRI2或BRI3或其模擬物接觸。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中讓所述的細(xì)胞與含有下述的氨基酸和/ 或擬肽的BRI2或BRI3接觸所述氨基酸和/或擬肽等價于具有SEQ ID NO: 1的序列的人BRI2蛋白或具有SEQ ID NO: 2的序列的人BRI3蛋白的氨基 酸1至102, 其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同源的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3是天然存在的蛋白質(zhì)。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3分別具有與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的至少一部分至少90 %同源的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3分別具有與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的至少一部分至少95 °/。同源的氨基酸序列。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3分別具有與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的至少一部分至少98 °/。同源的氨基酸序列。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3分別100 %同源于 SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的至少一部分。
8. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3由少于250個氨基酸和/或擬肽組成。
9. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3由少于200個氨基酸和/或擬肽組成。
10. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的BRI2或BRI3由少于150個氨基 酸和/或擬肽組成。
11. 權(quán)利要求2的方法，其中所述BRI2或BRI3由少于125個氨基酸 和/或擬肽組成。
12. 權(quán)利要求2的方法，其中所述BRI2或BRI3分別含有下迷氨基酸 和/或擬肽所述氨基酸和/或擬肽等價于具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的序列的人BRI2或BRI3蛋白的氨基酸1至102。
13. 權(quán)利要求l的方法，其中將所述細(xì)胞與BRI2接觸。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中將所述細(xì)胞與BRI3接觸。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中將所述細(xì)胞與BRI2或BRI3模擬物接觸。
16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞是類神經(jīng)元細(xì)胞或者能夠分 化成神經(jīng)元細(xì)力包。
18. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的細(xì)胞是在活的哺乳動物體內(nèi)。
19. 權(quán)利要求1的方法，其中所述的細(xì)胞是活的哺乳動物體內(nèi)的神經(jīng) 元細(xì)胞。
20. 權(quán)利要求l的方法，其中所述的細(xì)胞是在活的人體內(nèi)。
21. 權(quán)利要求1的方法，其中讓所述細(xì)胞與包含編碼至少一部分BRI2 或BRI3蛋白的核酸序列的載體接觸。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述載體是感染所迷細(xì)胞的病毒栽體。
23. 減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生AB和或AID的方法，所述方法包括 將所述細(xì)胞與有效減少、抑制或防止細(xì)胞中產(chǎn)生AP和/或AID的量的弗 林蛋白酶接觸。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的弗林蛋白酶含有與具有SEQ ID NO: 3的氨基酸108-794的序列的人弗林蛋白酶至少80 %—致的氨基酸序列。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的弗林蛋白酶含有與具有SEQ ID NO: 3的氨基酸108-794的序列的人弗林蛋白酶至少95 %—致的氨基酸序列。
26. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的弗林蛋白酶是人弗林蛋白酶。
27. 權(quán)利要求23的方法，其中將所述細(xì)胞與弗林蛋白酶蛋白接觸。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述的弗林蛋白酶蛋白由含有編碼弗林蛋白酶蛋白的核酸序列的載體表達(dá)。
29. 權(quán)利要求"的方法，其中所述的栽體是病毒載體。
30. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。
31. 權(quán)利要求"的方法，其中所述的細(xì)胞是類神經(jīng)元細(xì)胞或者能夠 分化成神經(jīng)元細(xì)胞。
32. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的細(xì)胞是在活的哺乳動物體內(nèi)。
33. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的細(xì)胞是活的哺乳動物體內(nèi)的神 經(jīng)元細(xì)月包。
34. 權(quán)利要求23的方法，其中所述的細(xì)胞是在活的人體內(nèi)。
35. 治療患有阿爾茨海默病的受試者的方法，所述方法包括施用給受 試者有效治療該受試者中的阿爾茨海默病的量的BRI2或BRI3或其模擬 物。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中施用給所述受試者含有下述氨基酸和/ 或擬肽的BRI2或BRI3:所述氨基酸和/或擬肽等價于SEQ ID NO: 1的人 BRI2蛋白序列或SEQ ID NO: 2的人BRI3蛋白序列的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同源的氨基酸序列。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述的BRI2或BRI3是天然存在的蛋白質(zhì)。
38. 權(quán)利要求35的方法，其中施用給受試者BRI2。
39. 權(quán)利要求35的方法，其中施用給受試者BRI3。
40. 權(quán)利要求35的方法，其中施用給受試者BRI2或BRI3模擬物。
41. 權(quán)利要求35的方法，其中將所述的BRI2或BRI3或其模擬物直 接施用至受試者的腦。
42. 權(quán)利要求35的方法，其中所述的BRI2或BRI3或其模擬物配制 成增強(qiáng)BRI2或BRI3或其模擬物穿透受試者血腦屏障的能力的藥物組合 物。
43. 權(quán)利要求35的方法，其中所述的BRI2或BRI3或其模擬物以允 許BRI2或BRI3或其才莫擬物穿透哺乳動物血腦屏障的方式施用。
44.治療患有阿爾茨海默病的受試者的方法，所述方法包括施用給受 試者有效治療該受試者中的阿爾茨海默病的量的弗林蛋白酶。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中施用給受試者含有這樣的氨基酸和/ 或擬肽的弗林蛋白酶所述氨基酸和/或擬肽等價于具有SEQ ID N0:3的 氨基酸108-794的序列的人弗林蛋白酶，其中所述弗林蛋白酶具有與SEQ ID NO: 3至少80 %同源的氨基酸序列。
46. 權(quán)利要求44的方法，其中所述的弗林蛋白酶是天然存在的蛋白質(zhì)。
47. 權(quán)利要求44的方法，其中將弗林蛋白酶直接施用至受試者的腦。
48. 權(quán)利要求44的方法，其中所述的弗林蛋白酶配制成增強(qiáng)所述弗 林蛋白酶穿透受試者血腦屏障的能力的藥物組合物。
49. 權(quán)利要求44的方法，其中所述的弗林蛋白酶以允許化合物穿透 哺乳動物血腦屏障的方式施用。
50. 確定化合物是否是BRI2或BRI3的模擬物的方法，所述方法包括 將該化合物與功能性Y-分泌酶和含C99的膜結(jié)合蛋白組合，隨后測定該化合物是否抑制剪切C99從而釋放A P和/或AID，其中如果所述化合物抑制Y-分泌酶剪切C99則它是BRI2或BRI3的 模擬物。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中剪切C99從而釋放出AP和/或AID的 抑制通過測定所述化合物是否抑制A P和/或AID的釋放而測定。
52. 權(quán)利要求50的方法，其中剪切C99從而釋放出AP和/或AID的 抑制通過測定所述化合物是否引起C 9 9存在的增加而測定。
53. 權(quán)利要求50的方法，其中剪切C99從而釋放出AP和/或AID的 抑制通過測定所述化合物是否引起C8 3存在的減少而測定。
54. 權(quán)利要求50的方法，其中剪切C99從而釋放出AP和/或AID的 抑制通過測定所述化合物是否引起sAPPa存在的減少而測定。
55. 權(quán)利要求50的方法，其中剪切C99從而釋放出AP和/或AID的 抑制通過測定所述化合物是否引起sAPP P存在的增加而測定。
56. 權(quán)利要求50的方法，其中所述方法利用ELISA來定量肽。
57. 權(quán)利要求50的方法，其中所述方法利用質(zhì)譜分析法。
58. 權(quán)利要求50的方法，其中所述方法利用蛋白質(zhì)印跡來鑒定和/ 或定量肽。
59. 權(quán)利要求50的方法，其中將所述化合物設(shè)計成模擬BRI2或BRI3 蛋白的部分，所述部分分別含有等價于具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2 的序列的人BRI2或BRI3蛋白的氨基酸1至102的氨基酸。
60. 權(quán)利要求59的方法，其中所述的化合物模擬BRI2或BRI3蛋白 的所述部分的三維結(jié)構(gòu)和/或電荷。
61. 權(quán)利要求59的方法，其中所述的BRI2或BRI3蛋白是BRI2蛋白。
62. 權(quán)利要求59的方法，其中所述的BRI2或BRI3蛋白是BRI3蛋白。
63. 權(quán)利要求50的方法，其中所述包含C99的膜結(jié)合蛋白是淀粉樣 蛋白前體蛋白(APP)。
64. 權(quán)利要求50的方法，其中所述的功能性Y-分泌酶和含C99的膜 結(jié)合蛋白是在活的細(xì)胞中。
65. 權(quán)利要求50的方法，其中所述的活細(xì)胞含有在Y-分泌酶剪切轉(zhuǎn) 基因APP時激活報告基因轉(zhuǎn)錄的基因構(gòu)建體。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中所述的報告基因是螢光素酶。
67. 權(quán)利要求65的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因APP進(jìn)一步在該轉(zhuǎn)基因 APP的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上含有Gal4。
68. 權(quán)利要求64的方法，其中所述的活的哺乳動物細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞。
69. 權(quán)利要求64的方法，其中所述的活的哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因APP。
70. 權(quán)利要求69的方法，其中所述的活的哺乳動物細(xì)胞源自HEK293 細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或N2a細(xì)胞。
71. 組合物，其含有在可藥用賦形劑中的純化的BRI2或BRI3。
72. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3含有下述氨基 酸和/或擬肽，所述氨基酸/擬肽等價于具有SEQ ID NO: 1的序列的人BRI2 蛋白或具有SEQ ID NO: 2的序列的人BRI3蛋白的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80%同源的氨基酸序列。
73. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3是BRI2。
74. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3是BRI3。
75. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3由少于250個 氨基酸和/或擬肽組成。
76. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3由少于200個 氨基酸和/或擬肽組成。
77. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3由少于150個 氨基酸和/或擬肽組成。
78. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的BRI2或BRI3由少于125個 氨基酸和/或擬肽組成。
79. 權(quán)利要求71的組合物，其中所述的可藥用賦形劑增強(qiáng)了 BRI2 或BRI3穿透受試者血腦屏障的能力。
80. 權(quán)利要求71的組合物，其中將所述的組合物配制成單位劑量形 式用于治療阿爾茨海默病。
81. 組合物，其包含在可藥用賦形劑中的純化的弗林蛋白酶。
82. 權(quán)利要求81的組合物，其中所述的弗林蛋白酶含有等價于具有 SEQ ID NO: 3的氨基酸108-794的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸和/或擬 肽，其中所述弗林蛋白酶具有與SEQ ID NO: 3至少80 %同源的氨基酸序列。
83. 權(quán)利要求81的組合物，其中所述的弗林蛋白酶是天然存在的蛋 白質(zhì)。
84. 權(quán)利要求81的組合物，其中所述的可藥用賦形劑增強(qiáng)了弗林蛋 白酶穿透受試者血腦屏障的能力。
85. 權(quán)利要求81的組合物，其中將所述的組合物配制成單位劑量形 式用于治療阿爾茨海默病。
86. 組合物，包含在可藥用賦形劑中的編碼BRI2或BRI3的栽體。
87. 權(quán)利要求86的組合物，其中所述的BRI2或BRI3含有下述氨基 酸，所述氨基酸等價于具有SEQ ID NO: 1的序列的人BRI2蛋白或具有 SEQ ID NO: 2的序列的人BRI3蛋白的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分別具有與SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2至少80 %同源的氨基酸序列。
88. 權(quán)利要求86的組合物，其中所述的可藥用賦形劑增強(qiáng)了 BRI2 或BRI3穿透受試者血腦屏障的能力。
89. 權(quán)利要求86的組合物，其中將所述的組合物配制成單位劑量形 式用于治療阿爾茨海默病。
90. 權(quán)利要求86的組合物，其中所述的載體是病毒。
91. 組合物，其包含在可藥用賦形劑中的編碼弗林蛋白酶的栽體。
92. 權(quán)利要求91的組合物，其中所述的弗林蛋白酶含有下述氨基酸， 所述氨基酸等價于具有SEQ ID NO: 3的氨基酸108-794的序列的人弗林蛋 白酶，其中所述弗林蛋白酶具有與SEQ ID NO: 3至少80 °/。同源的氨基酸序列。
93. 權(quán)利要求91的組合物，其中所述的弗林蛋白酶是天然存在的蛋 白質(zhì)。
94. 權(quán)利要求91的組合物，其中所述的可藥用賦形劑增強(qiáng)了弗林蛋 白酶穿透受試者血腦屏障的能力。
95. 權(quán)利要求91的組合物，其中將所述的組合物配制成單位劑量形式 用于治療阿爾茨海默病。
全文摘要
提供了用于減少、抑制或防止細(xì)胞產(chǎn)生AB和或AID的方法，以及治療患有阿耳茨海默病的受試者的方法。還提供了測定化合物是否是BRI2或BRI3的模擬物的方法。另外提供的是BRI2、BRI3或弗林蛋白酶，或編碼那些蛋白質(zhì)的載體的藥物組合物。
文檔編號A61K38/17GK101365471SQ200680029738
公開日2009年2月11日 申請日期2006年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者L·達(dá)達(dá)米奧, 松田修二 申請人:猶太大學(xué)阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院