專利名稱：：儲存納米顆粒制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及儲存納米顆粒的方法。更具體地，本發(fā)明涉及儲存具有提高的穩(wěn)定性和儲存特性的脂質(zhì)體的方法。背景資料幾種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已用于脂質(zhì)體和納米顆粒的儲存，如冷藏、冷凍/千燥(或凍干)，和脫水。在凍干方法中，可以使用保存填料(防凍劑)如糖和糖衍生物來增強儲存。這些保存填料有助于但不總是充分地克服冷凍和解凍方法中脂質(zhì)體的穩(wěn)定性或損傷問題。在目前方法的經(jīng)濟和工業(yè)效率方面也有局限，因為摻入這種保存填料會導(dǎo)致在冷藏或冷凍條件下有限的貨架壽命。而且，在與凍干相關(guān)的冷凍、解凍和/或干燥方法或脫水方法中，會出現(xiàn)對包封的活性試劑的生物、化學(xué)和/或物理性質(zhì)的有害改變。目前的凍干方法(冷凍和干燥循環(huán))也可能是很慢和耗時的。一個重要的關(guān)注是，如果凍千進(jìn)行得太快或者在未控制的溫度下進(jìn)行，則它可能導(dǎo)致脂質(zhì)體膜的生物、化學(xué)和/或物理性質(zhì)的改變，從而導(dǎo)致儲存不穩(wěn)定性。最終，這也可能有害地影響包封的活性試劑的性質(zhì)。于冰晶形成的脂質(zhì)體嚢泡膜形成的高壓的機械應(yīng)力或者在冷凍、解凍和/或脫水過程中脂質(zhì)體內(nèi)溶質(zhì)的膨脹和收縮，可能引起損傷。冷凍循環(huán)過程中脂質(zhì)體膜的膨脹可引起脂質(zhì)體膜中的弱點以及瘺管和裂紋的形成，這又導(dǎo)致完整性和穩(wěn)定性的損失，引起泄漏問題。此外，單個的脂質(zhì)體通常相互緊密地成束，使得在常規(guī)的冷凍過程中，一個脂質(zhì)體的膨脹可能引起壓力，導(dǎo)致對相鄰脂質(zhì)體完整性的不利后果。通常，現(xiàn)有技術(shù)在以下方面具有其局限性脂質(zhì)體的貨架壽命，儲存、處理和包埋性質(zhì)，以及保持(i)脂質(zhì)體或納米顆粒組合物；和(ii)活性試劑的完整性的能力。此外，許多技術(shù)由于完成工藝所需的時間的長度和由此導(dǎo)致的加工生產(chǎn)批料的大小而具有額外的局限，這增加了總的成本。發(fā)明概述本發(fā)明是一種儲存脂質(zhì)體或納米顆粒制劑的方法，該脂質(zhì)體或納米顆粒制劑是通過組合至少一種磷脂、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物而形成的。該方法包括冷凍這種制劑并將其儲存至少三天的時間。附圖簡述圖1顯示根據(jù)本發(fā)明冷凍和解凍后的脂質(zhì)體制劑。發(fā)明描述本發(fā)明的實施方案討論如下。在描述實施方案中，為了清楚目的，使用具體的術(shù)語。但是，本發(fā)明不限于如此選擇的具體術(shù)語。盡管討論了具體的示例性的實施方案，但應(yīng)當(dāng)理解的是，這樣做僅僅是為了說明的目的。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以使用其它的組分和結(jié)構(gòu)，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。所有引用的參考文獻(xiàn)正如其每一篇被單獨引入那樣引入本文作為參考。如本文所使用的，納米顆?？梢远x為一般的球形嚢泡，其具有由兩親物即具有親水部分和疏水部分的組分形成的外層或膜，該外層或膜圍繞內(nèi)核。一般地，納米顆粒的尺寸小于約1000nm。本發(fā)明特別關(guān)心的是可以用于或用作藥物輸送體系的納米顆粒。例如，用于本發(fā)明的納米顆?？梢杂糜诎廨斔椭辽锵到y(tǒng)的化合物，該化合物包括但不限于(i)生物活性化合物如藥物；或(ii)非生物活性化合物如顯象劑。脂質(zhì)體是示例類型的可以用于本發(fā)明的納米顆粒。脂質(zhì)體是嚢泡，其包括圍繞含水核的脂質(zhì)雙層，其也能夠包封生物活性和非生物活性化合物。本發(fā)明增強和保護納米顆粒或脂質(zhì)體膜的完整性，使其免受各種應(yīng)力如冷凍、解凍和攪拌引起的損傷。因此，本發(fā)明提高了納米顆粒如脂質(zhì)體的穩(wěn)定性、儲存和/或貨架壽命特性。如本文所使用的，冷凍可以處于任何溫度下，一般小于(TC,其提供固態(tài)，例如約-20。C或以下、約-78。C或以下(即干水溫度)，或約-196。C或以下(即液氮溫度)。盡管在具有脂質(zhì)體作為代表性納米顆粒的實施方案方面一般地描述了本發(fā)明，但是這不是限制性的，本發(fā)明還適用于其它的納米顆粒。各種脂質(zhì)體和其它納米顆粒制劑的組合物在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并在工業(yè)上用于醫(yī)學(xué)、化妝品和其它目的。脂質(zhì)體制劑是不同摩爾比的各種脂質(zhì)以及其它成分包括但不限于靶部分和生物活性物質(zhì)的組合。脂質(zhì)體制備方法一般是已知的。脂質(zhì)體可以制備成各種尺寸，例如直徑小于20nm-大于500rnn，并且可以是單層或多層嚢泡。它們可以用于包封各種用于醫(yī)學(xué)和非醫(yī)學(xué)目的的物質(zhì)。脂質(zhì)體可以用于包埋活性試劑如藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品、非生物學(xué)活性產(chǎn)品如顯象劑，及其混合物，并且將這些試劑輸送到具體的部位。但是，脂質(zhì)體制劑的一個主要問題是將其儲存用于研究或商業(yè)目的而沒有脂質(zhì)降解和/或活性試劑釋放的能力(即貨架壽命)。因此，在隨時間推移脂質(zhì)體泄漏和降解方面的嚢泡穩(wěn)定性是主要問題。本發(fā)明的實施方案涉及儲存納米顆粒制劑如脂質(zhì)體制劑，但可以適用于其它類型的由兩親物如脂質(zhì)構(gòu)成的納米顆粒。適用于本發(fā)明的制劑包括具有膜組分的納米顆粒，其包括至少一種兩親物、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物。親水性聚合物可以是未改性的；通過加成官能團與納米顆粒膜結(jié)合來改性；或者化學(xué)鍵合至兩親物、表面活性劑或納米顆粒膜的其它組分。改性以使親水性聚合物與納米顆粒膜結(jié)合的實例可以包括加成極性或形成電荷的官能團以產(chǎn)生與成膜的兩親物或表面活性劑的極性基團更強的締合。可供選擇地，親水性聚合物可以共價鍵合至成膜的兩親物或表面活性劑，從而其存在于納米顆?；蛑|(zhì)體的表面，以保護和保持其完整性，或者其可以摻入脂質(zhì)體或納米顆粒制劑的內(nèi)脂質(zhì)層。親水性聚合物可以通過可生物降解的或可水解的鍵如酰胺或酯鍵或通過更穩(wěn)定的鍵如胺或醚鍵而鍵合至兩親物或表面活性劑。不受理論限制，相信親水性聚合物在冷凍、冷藏、凍干、脫水和/或再水化方法中對脂質(zhì)體或納米顆粒膜的完整性提供了保護。保護納米顆粒和脂質(zhì)體膜的完整性保存了納米顆粒和脂質(zhì)體制劑的物理、化學(xué)和生物性質(zhì)，也保持了納米顆?；蛑|(zhì)體內(nèi)包埋或包封的任何化合物的性質(zhì)。因此，脂質(zhì)體或納米顆粒制劑保存了包埋的用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和非醫(yī)學(xué)用途如但不限于生物技術(shù)、電子學(xué)、防御和農(nóng)業(yè)技術(shù)的包封物，并且允許脂質(zhì)體制劑以冷凍狀態(tài)-賭存和運輸。兩親物與表面活性劑的比例是可變的，其可以是任何適合納米顆?；蛑|(zhì)體預(yù)期用途的比例。認(rèn)識到，兩親物和表面活性劑兩者均可具有兩親和表面活性性質(zhì)；然而，當(dāng)兩種組分具有類似性質(zhì)時，對本i兌明書而言，兩親物可以被認(rèn)為是主要的膜組分，而表面活性劑是次要組分。因此，兩親物與表面活性劑的比例是至少約51:49,可以大至99:1。在示例性實施方案中，兩親物與表面活性劑的比例是至少約70:30，可以是約80:20或者90:10。如本領(lǐng)域所已知的，加入表面活性劑會引起納米顆?；蛑|(zhì)體物理或化學(xué)性質(zhì)的變化，以實現(xiàn)某些期望的性質(zhì)如相變溫度或膜通透性的降低。納米顆粒組合物的這種變化在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。親水性聚合物可以以各種量存在于納米顆?；蛑|(zhì)體的膜中，該量基于兩親物和表面活性劑的總量計是約0.1-約25摩爾百分?jǐn)?shù)。在親水性聚合物鍵合至形成脂質(zhì)體的磷脂的實施方案中，含有約75-90重量％的親水性聚合物和25-10重量％的脂質(zhì)，這對應(yīng)于約0.11-約33摩爾百分?jǐn)?shù)的親水性聚合物改性的磷脂。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，將摩爾百分?jǐn)?shù)的親水性聚合物轉(zhuǎn)化成摩爾百分?jǐn)?shù)的改性的兩親物將取決于未改性兩親物的分子量和親水性聚合物的分子量。比例的計算是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。本發(fā)明的實施方案可包括約3-20摩爾百分?jǐn)?shù)的親水性聚合物(例如約3-約27摩爾百分?jǐn)?shù)的改性兩親物)或3-IO摩爾百分?jǐn)?shù)的親水性聚合物(例如約3-約13摩爾百分?jǐn)?shù)的改性兩親物)。本發(fā)明的某些實施方案是由約4-約5摩爾百分?jǐn)?shù)的改性兩親物制備的，從而提供約2.5-約4.5摩爾百分?jǐn)?shù)的親水性聚合物。親水性聚合物的最佳量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例行實驗容易地確定。本發(fā)明的組合物和方法對于由各種組合物制備的納米顆粒和脂質(zhì)體是有效的，所述組合物包括但不限于磷脂、大豆脂質(zhì)、磷酸乙醇胺、膽甾醇、溶脂菌素(lysolipids)、表面活性劑及其混合物與至少一種親水性聚合物如聚乙二醇、聚丙烯酰嗎啉、聚-2-乙基-2-噁唑啉、聚乙烯吡咯烷酮、曱氧基聚乙二醇(mPEG)及其衍生物和混合物的組合。本發(fā)明磷脂的實例包括但不限于磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙磷脂、溶脂菌素、膽汁酸、肉豆蔻酰表面活性劑、棕i酰表面活性劑、硬脂酰表面活性劑、甘油單油酸酯、神經(jīng)酰胺、PEG-神經(jīng)酰胺、C18-醚連接的溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇-聚乙烯共聚物、嵌段共聚物、脂肪酸及其混合物。用于本發(fā)明的溶脂菌素的實例包括但不限于單棕櫚酰磷脂酰膽堿(MPPC)、單月桂酰磷脂酰膽堿(MLPC)、單肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(MMPC)、單石更脂酰磷脂酰膽堿(MSPC)及其混合物。用于本發(fā)明的代表性親水性聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚丙烯酰嗎啉、聚-2-乙基-2-噁唑啉、聚乙烯吡咯烷酮、曱氧基聚乙二醇(mPEG)及其混合物。用于本發(fā)明的活性試劑的實例包括但不限于藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品、非生物學(xué)活性產(chǎn)品如顯象劑，及其混合物。示例類型的活性試劑包括例如麻醉藥、抗組胺藥、抗肺瘤藥、抗?jié)兯帯⒖拱l(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。示例性的抗腫瘤藥包括但不限于蒽環(huán)類藥如阿霉素(doxorubicin)禾口表柔p比星(epirubicin);taxanes，如紫杉醇和taxotere;禾口^白類藥(platins)3口列頁4白、卡名白和奧沙利柏。本發(fā)明的一個實施方案使用包含磷脂DPPC、溶脂菌素MSPC和被官能化以包括親水性聚合物如DSPE-mPEG-200Q和/或DSPE-mPEG-5000的磷脂如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)的脂質(zhì)體制劑，其中親水性聚合物通過酰胺鍵連接至脂質(zhì)。包含摩爾比低至90:10:1的磷脂溶脂菌素親水性聚合物官能化的磷脂的脂質(zhì)體組合物在冷凍和儲存方法中被證明是有效的。因此，本發(fā)明具有基礎(chǔ)廣泛的應(yīng)用，其可以用于為工業(yè)脂質(zhì)體產(chǎn)品增加效率和降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明可以用于任何納米顆粒或脂質(zhì)體制劑以保護脂質(zhì)體在冷凍、冷藏、脫水和凍干過程中的完整性。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種儲存具有提高的性能如穩(wěn)定性、儲存、包埋或釋放特性的納米顆粒制劑如脂質(zhì)體制劑的方法。已發(fā)現(xiàn)，將親水性聚合物摻入納米顆粒如脂質(zhì)體的膜，增強了這種嚢泡的穩(wěn)定性、儲存、包埋和釋放特性。在納米顆粒和脂質(zhì)體制劑中包含親水性聚合物限制了冷凍、冷藏、解凍、凍干、脫水或其它用于輔助所述制劑儲存、穩(wěn)定性和處理的方法所引起的納米顆?；蛑|(zhì)體膜的生物學(xué)、化學(xué)和物理性質(zhì)的有害改變。因此，與納米顆?；蛑|(zhì)體制劑結(jié)合的親水性聚合物的存在保護、保持和/或增強了原始膜的完整性。過去，不可能為了儲存脂質(zhì)體而有效地單獨使用冷凍。大多數(shù)脂質(zhì)體產(chǎn)品具有警告標(biāo)簽，寫道"請勿冷凍"。這樣的實例可見于商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品如Doxil、AmBisome、DepoCyt和幾種化妝品脂質(zhì)體的標(biāo)簽上。用于本發(fā)明的制劑可提供一種組合物，其中脂質(zhì)體和納米顆粒可以被冷凍，而不損傷膜完整性或包封的內(nèi)容物。因此，使用本發(fā)明的制劑將允許單一小瓶和多瓶組合產(chǎn)品被冷凍和儲存以用于分配目的。即，本發(fā)明的特殊優(yōu)點在于，脂質(zhì)體制劑可以以單一容器被冷凍和運輸，其可以是單位劑量形式，而不是以分開的容器被運輸，那樣需要在即刻使用前再配制。本發(fā)明還包括配制和儲存納米顆?；蛑|(zhì)體制劑的方法，該方法包括將適合形成納米顆?；蛑|(zhì)體組合物的兩親物或脂質(zhì)與親水性聚合物混合，冷凍并儲存。這種納米顆粒和脂質(zhì)體可以使用本領(lǐng)域通常已知的方法形成，例如通過將兩親組分與水溶液在適當(dāng)?shù)臈l件下混合。適當(dāng)?shù)姆椒▽τ诒绢I(lǐng)域^支術(shù)人員而言是眾所周知的。見例如Needham的美國專利No.6，200,598和6,726,925;0gawa的美國專利No.5,094,854，它們引入本文作為參考。納米顆粒和脂質(zhì)體組合物可以儲存短的時間如數(shù)分鐘或數(shù)小時和更長的時間如數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。而且，所描述的方法允許納米顆粒和脂質(zhì)體制劑在冷凍和儲存之前或之后以多個或單個小瓶分配成單位劑量。本發(fā)明的納米顆粒和脂質(zhì)體制劑可以包封下列物質(zhì)中的至少一種細(xì)胞毒和非細(xì)胞毒藥物、基因產(chǎn)品、或生物學(xué)試劑，以及非生物學(xué)試劑如顯象劑，其可以立即使用或冷凍包裝成試劑盒。在人和/或動物中使用納米顆粒和脂質(zhì)體組合物的過程中的另一個關(guān)心是，該組合物可以被自然的身體防御如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)識別和除去，限制了它們的有效循環(huán)時間和治療用途。已檢驗了幾種方法，如最優(yōu)化納米顆粒和脂質(zhì)體組合物的尺寸或者通過向組合物膜中加入某些成分以保護或"隱藏，，它們免受自然的生物學(xué)去除過程來制備"隱身(stealth)"組合物。在儲存過程中，納米顆粒和脂質(zhì)體傾向于尺寸增加，導(dǎo)致膜完整性和穩(wěn)定性的損失。作為特別加入單獨的成分以產(chǎn)生這種"隱身"特性的替代方案，開發(fā)一種保持期望的納米顆粒和脂質(zhì)體尺寸和均勻性的方法，可有助于增加和保存在受試者中有效的循環(huán)時間。由此原因，在冷凍、冷藏、脫水或凍干過程中保護納米顆?；蛑|(zhì)體的尺寸，對它們的完整性和性能會是非常重要的。因此，提高納米顆?；蛑|(zhì)體穩(wěn)定性的制劑可以在儲存過程中保持顆粒大小恒定，保持了其治療有效性。在一個示例性實施方案中，使用已知方法，將兩親物、表面活性劑和有效量的親水性聚合物(或被改性以包含親水性聚合物的兩親物)結(jié)合，形成納米顆粒。例如，可以將兩親物、表面活性劑和親水性聚合物(或被改性以包含親水性聚合物的兩親物)在有機溶劑中結(jié)合，除去溶劑，然后加入水溶液。然后可以將活性試劑使用已知技術(shù)例如利用pH梯度裝載入納米顆粒的內(nèi)部空間?？梢允褂靡阎夹g(shù)例如通過適當(dāng)?shù)木厶妓狨ミ^濾器擠出來篩分納米顆粒。篩分可以在用活性試劑裝載納米顆粒之前或之后進(jìn)行。最終的納米顆粒尺寸可以小于約1000nm或為約10-約500nm,約25-約500nm,約50-約200nm或約80-約125nm。親水性聚合物的有效量可以通過如下方法確定制備納米顆粒，在期望的溫度下冷凍，儲存適當(dāng)長的時間，解凍該制劑并測量表示為穩(wěn)定性的納米顆粒的特性。測量的特性可以是例如顆粒大小或活性試劑的泄漏。然后，初始制劑中親水性聚合物的量可以改變以實現(xiàn)期望程度的穩(wěn)定性。在制備納米顆并立后，制劑可以以固態(tài)在例如約-20。C或以下、約-78。C或以下或約-196。C或以下的溫度下冷凍和儲存。在示例性的實施方案中，納米顆?？梢砸岳鋬鰻顟B(tài)儲存約三天或更多天，而在解凍時沒有顯著的物理性質(zhì)改變。在其它實施方案中，納米顆粒制劑可以儲存約七天或更多天，約一個月或更長，約三個月或更長，或約24個月，或甚至更長的時間。該制劑可以儲存為大量溶液，或者在冷凍前，可以分成單位劑量以用于分配。除了儲存之外，冷凍的納米顆粒制劑可以被運輸至其將被使用的位點。例如，制劑可以在生產(chǎn)設(shè)備中制備，分成單位劑量，冷凍并運輸至其將被使用的位置。這提供了優(yōu)于現(xiàn)有制劑和分配方法的優(yōu)點。使用傳統(tǒng)方法，納米顆粒制劑經(jīng)常為了運輸被分成組分部分，以便防止穩(wěn)定性損失。例如，脂質(zhì)體制劑經(jīng)常以多個小瓶運輸，其中脂質(zhì)體在一個容器中，活性試劑的溶液在另一個容器中。在使用前，兩個單獨的容器必須以確保活性試劑在給藥前裝載的方式結(jié)合。制備該最終溶液中的錯誤可能導(dǎo)致缺乏有效性。利用本發(fā)明，免去了該結(jié)合步驟。因此，在使用位點，制劑解凍，可以直接使用或給藥。這有助于組合物的使用，并確保組合物為了有效的給藥而正確制備。因此，本發(fā)明提供了儲存、運輸和給藥納米顆?；蛑|(zhì)體制劑的方法。根據(jù)本發(fā)明儲存和/或運輸?shù)闹苿┛梢砸匀魏斡糜谠撎厥庵苿┑姆绞浇o藥。給藥方法包括口服、直腸、腹膜、靜脈和頰給藥，但根據(jù)活性試劑及其活性位點可以使用任何期望的給藥途徑。該制劑可以單獨給藥；即如所制備的，或者在使用前與其它治療試劑或賦形劑結(jié)合。賦形劑可包括其它的固體或液體賦形劑如水溶液、混懸液、乳液、固體賦形劑、分散劑等。如果納米顆粒制劑在制備后直接使用，即在儲存和運輸前使用，則最終應(yīng)用與納米顆粒制劑的用途一致。由以下代表性實施例將進(jìn)一步理解本發(fā)明的這些和其它特征和優(yōu)點，所述代表性實施例不意圖限制本發(fā)明的范圍。代表性實施例1將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1-硬脂?；?2-溶血磷脂酰膽堿(MSPC)和N-(羰基-曱氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-mPEG-2000)以摩爾比90:10:4溶解于二氯曱烷中。然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑。將混合物然后用300mM檸檬酸緩沖液在pH4下水合，獲得約100mg/ml的最終脂質(zhì)濃度。形成的混懸液然后通過兩個聚碳酸酯膜過濾器擠出(Hope,M.J.等，Productionoflargeunilamellarvesiclesbyarapidextrusionprocedure,characterizationofsize,trappedvolumeandabilitytomaintainamembranepotential.Biochim.Biophys.Acta.812:55—65,1985)。該實施例中的最終脂質(zhì)體制劑的初始平均粒度為98-122nm。(一般地，本發(fā)明脂質(zhì)體的粒度根據(jù)擠出方法將為50-500rnn。)通過將脂質(zhì)體與碳酸鈉溶液和藥物混合而將藥物阿霉素裝載入脂質(zhì)體中。簡而言之，將1.6ml的阿霉素溶液(5.8mg/ml)和1.2ml的0.5mM碳酸鈉加入1.9ml的脂質(zhì)體混合物中，于35。C平衡60分鐘。然后將裝載藥物的脂質(zhì)體以及空的脂質(zhì)體于-2(TC儲存。監(jiān)測粒度的變化。通過相同的方法制備沒有加入mPEG的脂質(zhì)體組合物。表1說明，隨著mPEG的加入，脂質(zhì)體粒度在冷凍和解凍后保持相同，并且由標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體完整性和穩(wěn)定性試驗測得，脂質(zhì)體穩(wěn)定最長達(dá)24個月。相夂匕之下，缺乏親水性聚合物mPEG的脂質(zhì)體在冷凍和解凍后不穩(wěn)定。這種不穩(wěn)定性的證據(jù)是，粒度在冷凍后增加。圖l顯示了冷凍/解凍后的脂質(zhì)體制劑。在冷凍/解凍前后，視覺外觀和粒度沒有顯著的區(qū)別。表l冷凍和解凍后的脂質(zhì)體粒度變化<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>代表性實施例2如代表性實施例l所述，制備另一種含有阿霉素的脂質(zhì)體制劑。將樣品在-20。C下冷凍1周、l個月和3個月。在每一個時間點，測定阿霉素含量、1.2^im下的。/?；厥?、％包封、脂質(zhì)體濃度、pH和嚢泡尺寸。在初始時間點(t=0),在有或沒有冷凍下測試三個樣品，以確定冷凍對脂質(zhì)體制劑的影響。此外，將一個樣品暴露于三次冷凍-解凍循環(huán)，以確定多次冷凍-解凍循環(huán)是否會有害。由下表可以看出，在t二O時，脂質(zhì)體制劑在環(huán)境或冷凍條件下具有類似的特性。甚至三次冷凍-解凍循環(huán)也不影響膜完整性。制劑在-20。C經(jīng)過3個月的儲存期仍穩(wěn)定。在該時間范圍內(nèi)沒有觀察到嚢泡尺寸、阿霉素含量、包封或脂質(zhì)含量的顯著變化。盡管測得的樣品的外部pH在不同的時間點有輕纟敖改變，但是觀察到在碳酸鹽緩沖液中制備的脂質(zhì)體的pH測量值隨著C02氣體從瓶中跑出而隨時間改變。但是，如表2所示，pH的變化不影響膜穩(wěn)定性，因為3個月的pH數(shù)據(jù)與一周時的數(shù)據(jù)類似。表2在重復(fù)的冷凍和解凍后的脂質(zhì)體穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本說明書中例舉和討i侖的實施方案僅僅意在教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員本發(fā)明人已知的制備和使用本發(fā)明的最佳方式。本說明書中的任何地方均不應(yīng)認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。給出的所有實施例均是代表性的和非限定性的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，鑒于上述教導(dǎo)，在不脫離本發(fā)明的情況下，本發(fā)明上述實施方案可以進(jìn)行修飾或改變。因此，應(yīng)理解，在權(quán)利要求書和它們的等同物的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以以所具體描述的方式之外的方式進(jìn)4于實施。權(quán)利要求1.一種儲存納米顆粒制劑的方法，該納米顆粒制劑具有至少一種兩親物、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物，該方法包括冷凍所述制劑和儲存至少三天的時間。2.權(quán)利要求1的方法，其還包括運輸所述冷凍的脂質(zhì)體制劑和在另一個位置解凍所述制劑。3.權(quán)利要求l的方法，其中，所述納米顆粒是脂質(zhì)體。4.權(quán)利要求3的方法，其中，所述兩親物包括至少一種磷脂。5.權(quán)利要求4的方法，其中a.所述至少一種磷脂選自磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)鞘磷脂及其混合物；b.所述至少一種表面活性劑選自雙鏈磷脂、溶脂菌素、膽汁酸、肉豆蔻酰表面活性劑、棕櫚酰表面活性劑、硬脂酰表面活性劑、甘油單油酸酯、神經(jīng)酰胺、PEG-神經(jīng)酰胺、C18-醚連接的溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇-聚乙烯共聚物、嵌段共聚物、脂肪酸及其混合物；和c.所述至少一種親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙烯酰嗎啉、聚-2-乙基-2-噁哇啉、聚乙烯吡咯烷酮、曱氧基聚乙二醇(mPEG)及其混合物。6.權(quán)利要求5的方法，其中，所述親水性聚合物通過可水解的鍵與磷脂結(jié)合。7.—種儲存脂質(zhì)體制劑的方法，該脂質(zhì)體制劑具有至少一種磷脂、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物，其中，所述磷脂是至少一種磷脂酰膽堿；所述表面活性劑是至少一種溶脂菌素；和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物，該方法包括冷凍所述制劑和儲存至少三天。8.權(quán)利要求7的方法，其還包括運輸所述冷凍的脂質(zhì)體制劑和在另一個位置解凍所述制劑。9.權(quán)利要求7的方法，其中，所述磷脂是至少一種磷脂酰膽堿；所述表面活性劑是至少一種選自單棕櫚酰磷脂酰膽堿(MPPC)、單月桂酰磷脂酰膽堿(MLPC)、單肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(MMPC)、單硬脂酰磷脂酰膽堿(MSPC)及其混合物的表面活性劑；和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物。10.權(quán)利要求9的方法，其中，所述-粦脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC);所述表面活性劑是單椋櫚酰磷脂酰膽堿(MPPC);和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物。11.權(quán)利要求9的方法，其中，所述磷脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC);所述表面活性劑是單硬脂酰磷脂酰膽堿(MSPC);和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物。12.權(quán)利要求10的方法，其中，DPPC:MPPC:DSPE-mPEG的摩爾比是約90:10:4。13.權(quán)利要求11的方法，其中，DPPC:MSPC:DSPE-mPEG的摩爾比是約90:10:4。14.權(quán)利要求l的方法，其中，所述納米顆粒制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。15.權(quán)利要求14的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯帯⒖拱l(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。16.權(quán)利要求15的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。17.權(quán)利要求16的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。18.權(quán)利要求3的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。19.權(quán)利要求18的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯帯⒖拱l(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。20.權(quán)利要求19的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。21.權(quán)利要求20的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。22.權(quán)利要求4的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。23.權(quán)利要求22的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗肺瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌*>劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。24.權(quán)利要求23的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。25.權(quán)利要求24的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。26.權(quán)利要求5的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。27.權(quán)利要求26的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。28.權(quán)利要求27的方法，其中，所迷活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。29.權(quán)利要求28的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。30.權(quán)利要求6的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。31.權(quán)利要求30的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。32.權(quán)利要求31的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。33.權(quán)利要求32的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。34.權(quán)利要求7的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。35.權(quán)利要求34的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。36.權(quán)利要求35的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。37.權(quán)利要求36的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。38.權(quán)利要求9的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。39.權(quán)利要求38的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯帯⒖拱l(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。40.權(quán)利要求39的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。41.權(quán)利要求40的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。42.權(quán)利要求10的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。43.權(quán)利要求42的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗胂瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。44.權(quán)利要求43的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。45.權(quán)利要求44的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。46.權(quán)利要求11的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。47.權(quán)利要求46的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。48.權(quán)利要求47的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。49.權(quán)利要求48的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。50.權(quán)利要求12的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。51.權(quán)利要求50的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)V藥、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。52.權(quán)利要求51的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。53.權(quán)利要求52的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。54.權(quán)利要求13的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。55.權(quán)利要求54的方法，其中，所述活性試劑選自麻醉藥、抗組胺藥、抗腫瘤藥、抗?jié)兯?、抗發(fā)作藥、肌松劑、免疫抑制劑、抗感染藥、非甾體抗炎藥、顯象劑、營養(yǎng)劑及其混合物。56.權(quán)利要求55的方法，其中，所述活性試劑是至少一種抗腫瘤藥。57.權(quán)利要求56的方法，其中，所述活性試劑是阿霉素。58.權(quán)利要求3的方法，其中，所述親水性聚合物通過非水解的鍵與磷脂結(jié)合。59.權(quán)利要求58的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。60.權(quán)利要求l的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。61.權(quán)利要求60的方法，其中，所述納米顆粒制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。62.權(quán)利要求3的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。63.權(quán)利要求62的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。64.權(quán)利要求4的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。65.權(quán)利要求64的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。66.權(quán)利要求5的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。67.權(quán)利要求66的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。68.權(quán)利要求7的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。69.權(quán)利要求68的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。70.權(quán)利要求9的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。71.權(quán)利要求70的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。72.權(quán)利要求10的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。73.權(quán)利要求72的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。74.權(quán)利要求ll的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。75.權(quán)利要求74的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。76.權(quán)利要求12的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。77.權(quán)利要求76的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。78.權(quán)利要求13的方法，其中，所述冷凍步驟是凍干方法的部分。79.權(quán)利要求78的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。80.—種儲存納米顆粒制劑的方法，該納米顆粒制劑具有至少一種兩親物、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物，該方法包括使所述制劑脫水和儲存至少三天的時間。81.權(quán)利要求80的方法，其還包括運輸所述脫水的脂質(zhì)體制劑和在另一個位置再水化所述制劑。82.權(quán)利要求80的方法，其中，所述納米顆粒是脂質(zhì)體。83.權(quán)利要求82的方法，其中，所述兩親物包括至少一種磷脂。84.權(quán)利要求83的方法，其中a.所述至少一種磷脂選自磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)鞘磷脂及其混合物；b.所述至少一種表面活性劑選自雙鏈磷脂、溶脂菌素、膽汁酸、肉豆蔻酰表面活性劑、棕櫚酰表面活性劑、硬脂酰表面活性劑、甘油單油酸酯、神經(jīng)酰胺、PEG-神經(jīng)酰胺、C18-醚連接的溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇-聚乙烯共聚物、嵌段共聚物、脂肪酸及其混合物；和c.所述至少一種親水性聚合物選自聚乙二醇、聚丙烯酰嗎啉、聚-2-乙基-2-噁哇啉、聚乙烯吡咯烷酮、曱氧基聚乙二醇(mPEG)及其混合物。85.權(quán)利要求84的方法，其中，所述親水性聚合物通過可水解的鍵與磷脂結(jié)合。86.—種儲存脂質(zhì)體制劑的方法，該脂質(zhì)體制劑具有至少一種磷脂、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物，其中，所述磷脂是至少一種磷脂酰膽堿；所述表面活性劑是至少一種溶脂菌素；和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物，該方法包括使所述制劑脫水和儲存至少三天。87.權(quán)利要求86的方法，其還包括運輸所述脂質(zhì)體制劑和在另一個位置水合所述制劑。88.權(quán)利要求87的方法，其中，所述磷脂是至少一種磷脂酰膽堿；所述表面活性劑是至少一種選自單棕櫚酰磷脂酰膽堿(MPPC)、單月桂酰磷脂酰膽堿(MLPC)、單肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(MMPC)、單硬脂酰磷脂酰膽堿(MSPC)及其混合物的表面活性劑；和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物。89.權(quán)利要求88的方法，其中，所述磷脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC);所述表面活性劑是單棕櫚酰磷脂酰膽堿(MPPC);和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物。90.權(quán)利要求88的方法，其中，所述磷脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC);所述表面活性劑是單硬脂酰磷脂酰膽堿(MSPC);和所述親水性聚合物選自DSPE-mPEG-2000、DSPE-mPEG-5000及其混合物。91.權(quán)利要求89的方法，其中，DPPC:MPPC:DSPE-mPEG的摩爾比是約90:10:4。92.權(quán)利要求90的方法，其中，DPPC:MSPC:DSPE-mPEG的摩爾比是約90:10:4。93.權(quán)利要求80的方法，其中，所述納米顆粒制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。94.權(quán)利要求82的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。95.權(quán)利要求83的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。96.權(quán)利要求84的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。97.權(quán)利要求86的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。98.權(quán)利要求88的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。99.權(quán)利要求89的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。100.權(quán)利要求90的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。101.權(quán)利要求91的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。102.權(quán)利要求92的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。103.權(quán)利要求62的方法，其中，所述親水性聚合物通過非水解的鍵與磷脂結(jié)合。104.權(quán)利要求103的方法，其中，所述脂質(zhì)體制劑還包括活性試劑，該活性試劑選自藥理學(xué)活性試劑、香味劑、診斷試劑、營養(yǎng)劑、基因產(chǎn)品及其混合物。全文摘要本發(fā)明是一種儲存脂質(zhì)體或納米顆粒制劑的方法，該脂質(zhì)體或納米顆粒制劑是通過組合至少一種磷脂、至少一種表面活性劑和至少一種親水性聚合物而形成的。該方法包括冷凍這種制劑并將其儲存至少三天的時間。文檔編號A61K9/127GK101282715SQ200680031229公開日2008年10月8日申請日期2006年8月23日優(yōu)先權(quán)日2005年8月23日發(fā)明者J·蒙,W·于申請人:效思因公司