專利名稱：用溶瘤病毒和免疫刺激劑治療以增強(qiáng)體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的識(shí)別的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中使用溶瘤病毒(oncolytic viruses )和免疫
刺激劑治療增殖紊亂的方法。
背景技術(shù)：
僅在美國(guó)每年就有超過(guò)一百萬(wàn)的人被診斷患有癌癥。盡管在醫(yī)學(xué)研 究上有許多進(jìn)展，但是癌癥在美國(guó)仍然是第二位主要的死亡原因。在工 業(yè)化國(guó)家中，大約在五個(gè)人中就有一個(gè)人死于癌癥。在探索新策略的過(guò) 程中，溶瘤病毒療法最近作為一種特異性殺死腫瘤細(xì)胞的可行方法脫穎 而出。與傳統(tǒng)的基因療法不同，該方法使用由于病毒的復(fù)制和伴隨其后 的細(xì)胞溶解能擴(kuò)散到整個(gè)肺瘤組織的可復(fù)制病毒，由此提供一種可供選 擇的癌癥治療方法。對(duì)病毒進(jìn)行基因工程改造以選才奪性地復(fù)制并殺死癌 細(xì)胞。
溶瘤病毒可利用多種作用機(jī)制殺死癌細(xì)胞，所述機(jī)制包括細(xì)胞溶 解、細(xì)胞凋亡、抗血管生成和細(xì)胞壞死。病毒感染腫瘤細(xì)胞然后開始復(fù) 制。病毒繼續(xù)復(fù)制直到最后"溶解，，(裂解)宿主細(xì)胞的膜，肺瘤細(xì)胞 不再能含有病毒。腫瘤細(xì)胞被摧毀并且新產(chǎn)生的病毒擴(kuò)散到鄰近的癌細(xì) 胞繼續(xù)該循環(huán)。值得注意的是所有溶瘤病毒僅在癌細(xì)胞中復(fù)制，其通過(guò) 正常組織時(shí)不導(dǎo)致?lián)p害，這很重要。因此， 一旦根除所有腫瘤細(xì)胞，溶 瘤病毒不再具有復(fù)制的能力并且免疫系統(tǒng)將其從體內(nèi)清除。
在過(guò)去的幾年中，對(duì)病毒細(xì)胞毒性分子機(jī)理的新認(rèn)識(shí)為設(shè)計(jì)更有效 的溶瘤病毒提供了科學(xué)理論。根據(jù)分子生物學(xué)中最近的進(jìn)展設(shè)計(jì)出幾種 遺傳修飾的病毒，如在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞的腺病毒 和單純皰滲病毒。另一方面，具有內(nèi)在溶瘤能力的病毒治療性應(yīng)用也在 評(píng)估之中。盡管通常已在臨床前研究中證明了溶瘤病毒療法的效力，但 是在臨床試驗(yàn)中該治療效力仍不是最佳的。因此，可進(jìn)一步提高條件復(fù) 制病毒的溶瘤潛能的策略仍在探索之中。發(fā)明概述
盡管認(rèn)識(shí)到向患者施用溶瘤病毒可在患者中引起抗病毒免疫反應(yīng)， 但是研究的焦點(diǎn)已經(jīng)集中在如何規(guī)避發(fā)生這種天然反應(yīng)上。本發(fā)明的另 一個(gè)方面涉及利用該天然反應(yīng)提高對(duì)腫瘤的殺傷力。用溶瘤病毒療法治 療后，通過(guò)向患者施用免疫刺激劑，可提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。不僅 腫瘤細(xì)胞易感染溶瘤病毒，而且在其表面表達(dá)病毒抗原的、經(jīng)感染的腫 瘤細(xì)胞也可被經(jīng)過(guò)刺激的免疫系統(tǒng)識(shí)別并做為"外源物質(zhì)"受到攻擊。 此外，已被溶瘤病毒溶解的腫瘤細(xì)胞暴露于免疫系統(tǒng)，因此增加免疫系 統(tǒng)識(shí)別腫瘤抗原的機(jī)會(huì)，在存在免疫刺激劑時(shí)尤其如此。
本發(fā)明的 一 個(gè)方面提供在患腫瘤的哺乳動(dòng)物中治療腫瘤的方法，該 方法包括向哺乳動(dòng)物施用溶瘤病毒和免疫刺激劑。優(yōu)選地，在施用溶瘤 病毒后施用免疫刺激劑，更優(yōu)選地在溶瘤病毒已感染腫瘤細(xì)胞后。最優(yōu) 選地，在所感染的肺瘤細(xì)胞表達(dá)至少一種溶瘤病毒抗原后施用免疫刺激 劑。優(yōu)選地，免疫刺激劑是合成的寡脫氧核苷酸，如胞嘧啶-磷酸鹽-
鳥苷(CpG)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶瘤病毒是呼腸孤病毒，更 優(yōu)選地是天然存在的呼腸孤病毒。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在患腫瘤的哺乳動(dòng)物中提高溶瘤病毒的 抗腫瘤活性的方法，該方法包括除了向哺乳動(dòng)物施用溶瘤病毒外，還施 用免疫刺激劑。優(yōu)選地，在施用溶瘤病毒后施用免疫刺激劑。更優(yōu)選地， 在所感染的胂瘤細(xì)胞表達(dá)至少一種溶瘤病毒抗原后施用免疫刺激劑。在 一種實(shí)施方案中，免疫刺激劑是合成的寡脫氧核苷酸(ODN)，優(yōu)選地 是未曱基化的胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供在患所述腫瘤的哺乳動(dòng)物中提高溶瘤病 毒的抗肺瘤活性的方法，所述方法包括(a)將樹突細(xì)胞與溶瘤病毒接 觸，(b)誘導(dǎo)樹突細(xì)胞呈遞溶瘤病毒的抗原，和(c)激發(fā)對(duì)樹突細(xì)胞 所呈遞的抗原的免疫反應(yīng)，由此在哺乳動(dòng)物中引起對(duì)溶瘤病毒的免疫反 應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在體內(nèi)進(jìn)行步驟(a)。在另一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，先體外后體內(nèi)地進(jìn)行步驟(a)并且在與病毒接觸后向 哺乳動(dòng)物施用樹突細(xì)胞。
本發(fā)明的另 一個(gè)方面提供提高溶瘤病毒療法效力的方法，包括向哺 乳動(dòng)物施用溶瘤病毒并且向所述哺乳動(dòng)物施用免疫刺激劑。優(yōu)選地，在 施用溶瘤病毒后，更優(yōu)選地在溶瘤病毒已感染腫瘤細(xì)胞后施用免疫刺激劑。最優(yōu)選地，在所感染的腫瘤細(xì)胞表達(dá)至少一種溶瘤病毒抗原后施用
免疫刺激劑。優(yōu)選地，免疫刺激劑是合成的寡脫氧核苷酸(ODN)，如 胞嘧咬-磷酸-烏苷(CpG)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶瘤病毒是呼腸 孤病毒，更優(yōu)選地是天然存在的呼腸孤病毒。
本發(fā)明的又 一 個(gè)方面提供增加腫瘤細(xì)胞的免疫識(shí)別的方法，包括 (a)用溶瘤病毒感染胂瘤細(xì)胞和(b)激發(fā)對(duì)溶瘤病毒的抗原的免疫反 應(yīng)，其中對(duì)溶瘤病毒的免疫反應(yīng)是對(duì)被感染的胂瘤細(xì)胞所表達(dá)的溶瘤病 毒抗原的反應(yīng)。優(yōu)選地通過(guò)下列方法引起免疫反應(yīng)，包括(i)將樹突細(xì) 胞與溶瘤病毒接觸，(ii)誘導(dǎo)樹突細(xì)胞呈遞溶瘤病毒抗原和(iii)激 發(fā)對(duì)溶瘤病毒的免疫反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在體內(nèi)。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，接觸為先體外后體內(nèi)、并且在接觸后向哺 乳動(dòng)物施用樹突細(xì)胞。
A.定義
"施用，，意思是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的施用藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn)方法 中的任何一種。實(shí)例包括，但不限于腸內(nèi)、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或者腹 腔內(nèi)施用。向受試者"施用病毒"指以使其接觸靶腫瘤細(xì)胞的方式向受 試者施用病毒的行為。施用病毒的途徑，以及制劑、載體將取決于靶細(xì) 胞的位置以及類型。
細(xì)胞對(duì)病毒感染的"抗性，'表明用該病毒感染細(xì)胞不導(dǎo)致顯著的病 毒產(chǎn)生或產(chǎn)量。"易感"細(xì)胞是表現(xiàn)為誘導(dǎo)為細(xì)胞病變效應(yīng)、病毒蛋白 合成，和/或病毒產(chǎn)生。
"瘤細(xì)胞"、"肺瘤細(xì)胞，，或"增殖紊亂的細(xì)胞"，指異常高速增殖 的細(xì)胞。包括肺瘤細(xì)胞的新生長(zhǎng)是贅生物，也稱作"腫瘤"。腫瘤是一 種異常的組織生長(zhǎng)，通常形成不同的團(tuán)塊，其通過(guò)細(xì)胞增殖比正常組織 生長(zhǎng)更迅速。腫瘤可能顯示部分或完全缺乏組織結(jié)構(gòu)以及與正常組織之 間的功能協(xié)調(diào)。如這里所使用的，腫瘤旨在包括造血腫瘤以及實(shí)體瘤。 腫瘤可能是良性的(良性腫瘤)或惡性的(惡性腫瘤或癌)。可將惡性 腫瘤粗略地分成三種主要類型。將由上皮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的惡性肺瘤稱作癌， 將從結(jié)締組織如肌肉、軟骨、脂肪或骨中產(chǎn)生的惡性腫瘤稱作肉瘤，將 影響包括免疫系統(tǒng)組分的造血結(jié)構(gòu)(屬于形成血細(xì)胞的結(jié)構(gòu))的惡性腫 瘤稱作白血病和淋巴瘤。其它腫瘤包括，但不限于神經(jīng)纖維瘤病。腫瘤細(xì)胞優(yōu)選地位于哺乳動(dòng)物內(nèi)，特別是選自狗、貓、嚙齒類、綿羊、山羊、 牛、馬、豬、人和非人靈長(zhǎng)類的哺乳動(dòng)物。最優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。
"溶瘤病毒"是一種優(yōu)先在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞的病 毒。溶瘤病毒可以是天然存在的病毒或者基因工程改造的病毒。溶瘤病 毒也包括詳細(xì)描述的呼腸孤病毒之類的免疫保護(hù)的和重排列病毒。
"受溶瘤病毒感染"指溶瘤病毒進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。類似地， "腫瘤受溶瘤病毒感染"指溶瘤病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù) 制。
"有效量"是足以導(dǎo)致預(yù)期效果的免疫刺激劑或呼腸孤病毒的量。 對(duì)于用于治療或改善腫瘤的溶瘤病毒來(lái)說(shuō)，有效量是足以減輕或消除腫 瘤癥狀，或者足以減緩胂瘤發(fā)展的溶瘤病毒的量。
"治療或減輕肺瘤"意思是減輕或者消除腫瘤的癥狀，或者減緩肺
瘤的發(fā)展。減輕優(yōu)選地是至少約10%,更優(yōu)選地至少約20%、 30%、 40 % 、 50 % 、 60 % 、 70 % 、 80 %或90 % 。
可交替地使用術(shù)語(yǔ)"核酸，，和"寡核苷酸"以表示包括多個(gè)核苦酸 的分子。如這里所使用的，該術(shù)語(yǔ)指寡核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷 酸。該術(shù)語(yǔ)也將包括多核苷(即，多核苷酸減去磷酸)以及含有任何其 它有機(jī)堿( organic base)的多聚體。核酸包4舌載體,例如，質(zhì)斗立，以及 寡核苷酸?？蓮默F(xiàn)有的核酸來(lái)源中獲得核酸分子，但是優(yōu)選地是合成的 (例如，通過(guò)寡核苦酸合成產(chǎn)生)。
"免疫刺激劑"指實(shí)質(zhì)上提高或加強(qiáng)對(duì)外源抗原的免疫反應(yīng)(抗體 和/或細(xì)胞介導(dǎo)的)的任何物質(zhì)。
如這里所使用的"免疫刺激核酸"是含有誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的免疫刺激 基序或主鏈的任何核酸。免疫反應(yīng)可表征為，但不限于，Thl型免疫反 應(yīng)或者Th2型免疫反應(yīng)。通過(guò)活化的免疫細(xì)胞所激發(fā)的細(xì)胞因子和抗體 產(chǎn)生譜定義這種免疫反應(yīng)。
B..治療腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供在患所述腫瘤的哺乳動(dòng)物中治療腫瘤的方法，所述方法 包括向哺乳動(dòng)物施用溶瘤病毒和免疫刺激劑。以使其能最終接觸靶肺瘤 細(xì)胞的方式施用溶瘤病毒。溶瘤病毒施用的途徑，以及劑型、載體將取 決于耙細(xì)胞的位置以及類型?？墒褂枚喾N施用途徑。例如，對(duì)于容易到達(dá)的實(shí)體瘤，可通過(guò)直接向腫瘤注射途徑施用溶瘤病毒。對(duì)于造血腫瘤， 例如，可通過(guò)靜脈內(nèi)或血管內(nèi)途徑施用溶瘤病毒。對(duì)于在體內(nèi)不容易到 達(dá)的腫瘤，如轉(zhuǎn)移瘤，以可經(jīng)通過(guò)哺乳動(dòng)物身體的全身途徑運(yùn)輸并由此 到達(dá)肺瘤的方式(例如，靜脈內(nèi)或肌內(nèi))施用溶瘤病毒?？蛇x擇地，可 直接地向單個(gè)實(shí)體瘤施用溶瘤病毒，其后通過(guò)身體的全身途徑運(yùn)送到轉(zhuǎn) 移瘤。也可通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)注射(例如，對(duì)于腦肺瘤)、局部 (例如，對(duì)于黑色素瘤)、口服(例如，對(duì)于口腔或食道胂瘤)、直腸 內(nèi)(例如，對(duì)于結(jié)腸直腸肺瘤)、陰道內(nèi)(例如，對(duì)于子宮頸或陰道腫 瘤)、鼻內(nèi)或通過(guò)吸入噴霧(例如，對(duì)于肺部胂瘤)途徑施用溶瘤病毒。 可以單劑量或多劑量(例如， 一個(gè)以上劑量)施用溶瘤病毒?？稍?不同位點(diǎn)或者通過(guò)不同途徑同時(shí)或者連續(xù)(例如，幾天或幾周期間)施 用多劑量。優(yōu)選地在施用免疫抑制劑前施用溶瘤病毒。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中， 一次或多次施用病毒/免疫抑制劑的療程。
溶瘤病毒優(yōu)選地配制成單劑量型，每個(gè)劑量含有約102 pfus-約1013 pfus呼腸孤病毒。術(shù)語(yǔ)"單劑量型"指適合作為用于人受試者和其它哺
乳動(dòng)物的單一劑量在物理上分離的單位，每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生期望 治療效果的預(yù)先確定量的溶瘤病毒，其與適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑聯(lián)合。
本發(fā)明可應(yīng)用于任何動(dòng)物受試者，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物優(yōu)選 地選自犬、貓、嚙齒類、家畜(如綿羊、山羊、牛、馬和豬)、人和非 人靈長(zhǎng)類。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明可結(jié)合其它腫瘤療法如化療、放療、手術(shù)、激素療法和/或免 疫療法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用根據(jù)本申請(qǐng)所公開的任何溶瘤病毒和本領(lǐng) 域的公知技術(shù)實(shí)施本發(fā)明。溶瘤病毒可以是粘病毒科(
長(zhǎng)尾病毒科(，ZwWr油e ) 、 / 。咖v/,油e 、 "c/W,/'(i"e 、 被蓋病毒科 (c'or"covzn'6/"e )、 芽生病毒牙+ ( p/(X mavW(iae )、 月旨毛病毒禾+ (///90f/zr/義vz'nttoe ) 、 ./ks'e〃own'c/fle、 癥病毒，牛(jPoxvzrzc/oe )、 虹壽》病毒
矛牛(z'r/dov/nt/"e )、 條DNA病毒牙斗(/ /zyc。c/"av^7't/"g )、斥干^)夫病毒牙牛 (6acw/oWrz't/"e )、皰滲病毒科(/^rp&vv/Wc/ae )、腺病毒科(ac/ewov^油e )、
乳多g病毒科(/ "/wravz〃't/(2e )、 多 DNA病毒科(/ o(y<i"<2vz>^/"e )、
絲狀病毒科(/wov/n.dae )、 微小病毒科(脂cTOWr/t/ae )、 雙生病毒科 (gewiw/v/n.t/"e )、圓環(huán)病毒考牛(c^covz>/<i(2e )、纟田小病毒牙牛(/ arwWnt/ae )、嗜肝DNA病毒科(/ze戶(i"謂W(iae )、 反轉(zhuǎn)錄病毒科(r"rovzWt/(3e )、 c少"ovz力d"e、。乎腸孑瓜病毒牙+( reov,W(iae )、又又RNA病毒禾+( /^m<rWn<i<2e )、 副殺占病毒矛牛(/ "rawjo:ovz'n'(i(3e )、 彈:犬病毒矛牛(r/z<36t/oWn'Jae )、 線卄犬 病毒科(/z7ovz'r/6/ae )、 正黏病毒科(oW/z謂jaov/W(iag )、 布尼亞病毒 科(6w"7聰nt/(2e )、沙粒病毒科("re憩Wn'6toe )、輕小病毒科(/eWWr油e )、 小RNA病毒科(/7/com"Wnt/ae )、歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒科(,訓(xùn)/r油e )、 紅豆花葉病毒科(ccwov7力't/"e )、 馬鈴薯Y病毒科(/70(yv/〃't/(2e )、 杯 一大病毒牙牛(ca/^:'/vz'n'(i"e )、 星4夫病毒牙牛(o^rov/n'c/ae ) 、 i若達(dá)病毒牙牛 ("。(i謂'n.(iag )、 四病毒科 (/^raW"'tfae )、 番癡叢矮病毒科 (fomZ)wsW廠/(iae )、冠一犬病毒牙牛(con w"Wn'(iae ) 、 g/"WW〃<^2e、才皮月莫病 毒科(/^g"vzWdae )、或者桿狀RNA病毒科(6an^v,'nt/"e )中的成員。 呼腸孤病毒是特別優(yōu)選的溶瘤病毒。呼腸孤病毒是具有雙鏈、節(jié)段 RNA基因組的病毒。病毒體直徑60 - 80 nm并且擁有兩個(gè)同心衣殼，其 中的每一個(gè)都是二十面的?；蚪M由具有10-12個(gè)分離節(jié)段的雙鏈 RNA構(gòu)成，總的基因組大小為16-27kbp。單個(gè)RNA節(jié)段大小不同。 人呼腸孤病毒由三種血清型組成l型(Lang抹或TlL) 、 2型(Jones 抹，T2J)和3型(Dearing林或Abney抹，T3D)。三種血清型根據(jù)中 和以及血凝抑制試驗(yàn)很容易鑒別(見,例如，F(xiàn)ields, B.N.等，1996 )。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，溶瘤病毒是減毒的或修飾的腺病 毒。減毒的或修飾的腺病毒可在具有活化的Ras途徑的細(xì)胞中復(fù)制，但 是不能在不具有活化的Ras途徑的細(xì)胞中復(fù)制。腺病毒是約3.6kb的雙 鏈DNA病毒。在人類中，腺病毒可在眼中、呼吸道、胃腸道和泌尿道 內(nèi)復(fù)制并導(dǎo)致疾病。47種已知的人血清型中有大約三分之一是造成絕大 多數(shù)人類腺病毒疾病的原因。腺病毒編碼幾種對(duì)抗抗病毒宿主防御機(jī)制 的基因產(chǎn)物。腺病毒的病毒相關(guān)RNA ( VAI RNA或VA RN^ )是腺病 毒感染后期在細(xì)胞質(zhì)中高濃度累積的小的、結(jié)構(gòu)RNAs。這些VAIRNA 與PKR的雙鏈RNA (dsRNA)結(jié)合基序結(jié)合并且通過(guò)自體磷酸化阻斷 PKR的dsRNA依賴的活化。因此，PKR不能起作用并且病毒可在細(xì)胞 內(nèi)復(fù)制。病毒體的超量產(chǎn)生最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此處使用的術(shù)語(yǔ)"減毒 的腺病毒，，或"修飾的腺病毒"意思是阻止PKR活化的基因產(chǎn)物缺乏、 被抑制或被突變，結(jié)果PKR活化不被阻斷。優(yōu)選地，VAIRNA的基因 不被轉(zhuǎn)錄。這種減毒的或修飾的腺病毒不能在不具有激活的Ras途徑的正常細(xì)胞中復(fù)制，但是其能感染并在具有激活的Ras途徑的細(xì)胞中復(fù)制。 新城疫病毒(NDV)優(yōu)先在惡性胂瘤細(xì)胞中復(fù)制，并且最常使用的 病毒株是73-T(Reichard等，1992; Zorn等，1994; Bar-Eli等,1996)。 PV701是一種新城疫病毒的減毒的，非重組的溶瘤株，其在干擾素介導(dǎo) 的抗病毒反應(yīng)中根據(jù)肺瘤特異性缺陷，相對(duì)于正常細(xì)胞，選擇性溶解胂 瘤細(xì)胞。
副痘病毒口瘡病毒是一種在包括人在內(nèi)的不同哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)急 性皮膚損害的痘病毒。副痘病毒口瘡病毒編碼在阻斷PKR活性中所涉 及的基因OV20.0L。副痘病毒口瘡病毒不能在不具有激活的Ras途徑的 細(xì)胞中復(fù)制。在本發(fā)明中更優(yōu)選的溶瘤病毒是"減毒的副痘病毒口瘠病 毒"或者"修飾的副痘病毒口瘡病毒"，其中阻止PKR活化的基因產(chǎn) 物缺乏、被抑制或被突變，結(jié)果PKR活化不被阻斷。優(yōu)選地，基因 OV20.0L不被轉(zhuǎn)錄。這種減毒的或修飾的副痘病毒口瘡病毒將不能在不 具有激活的Ras途徑的正常細(xì)胞中復(fù)制，但是能感染并在具有激活的 Ras途徑的細(xì)胞中復(fù)制。
核糖核苷酸還原酶表達(dá)缺陷的單純皰滲病毒1 (HSV-I)突變體 hrR3顯示出在結(jié)腸癌細(xì)胞中復(fù)制但不能在正常肝細(xì)胞中復(fù)制(Yoon等， 2000)。單純皰滲病毒1型(HSV-I)載體特別有用，因?yàn)榭蓪?duì)它們進(jìn) 行基因工程改造以便高度選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制和傳播，并且也可 表達(dá)多種外源轉(zhuǎn)基因。這些載體可在多種胂瘤類型中顯示致細(xì)胞病變效 應(yīng)，而不破壞正常組織，在胂瘤內(nèi)提供擴(kuò)大的基因遞送，并且誘導(dǎo)特異 性抗胂瘤免疫。已在患有腦腫瘤和其它癌癥的患者中檢驗(yàn)了多個(gè)重組 HSV-I載體，其顯示在包括腦的人類器官中安全地施用可復(fù)制HSV-I載 體的可行性。
許多其它溶瘤病毒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，皰疹性口腔炎 病毒(VSV)選擇性殺死腫瘤細(xì)胞。證明腦炎病毒在小鼠肉瘤中具有溶 瘤效應(yīng)，但是可能需要減毒以便降低其在正常細(xì)胞中的感染力。痘苗病 毒，由于其特別是能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，代表了在本發(fā)明中有用的另外 的復(fù)制溶瘤病毒。另外，可增強(qiáng)或者消除特定的病毒功能以提高抗腫瘤 效率并且改善胂瘤細(xì)胞粑向。例如，因病毒的胸苷激酶和痘苗病毒生長(zhǎng) 因子基因的缺失而產(chǎn)生具有提高的腫瘤靶向活性的痘苗病毒突變體。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶瘤病毒是修飾的痘苗病毒，如在美國(guó)專利公開No. 2002/0028195中所述，其中突變E3L或者K3L。盡管復(fù)制和溶解在 正常細(xì)胞中受限，但是麻滲病毒(MV)的疫苗抹容易溶解轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因 此，MV非常適于發(fā)展作為溶瘤劑。已在感染帶狀皰滲、肝炎病毒、流 感、水痘和麻滲病毒的腫瘤患者中描述了腫瘤消退(綜述見Nemunaitis, 1999)?？稍谡?qǐng)求保護(hù)的發(fā)明中使用任何溶瘤病毒。
已知各種溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的能力基于不同的機(jī) 理。呼腸孤病毒，例如，為了復(fù)制并破壞細(xì)胞，需要存在激活的Ras信 號(hào)傳導(dǎo)途徑。在某些其它溶瘤病毒中，通過(guò)將必需病毒基因置于腫瘤特 異性啟動(dòng)子的控制下達(dá)到胂瘤選擇性。在某些病毒中，E1A區(qū)負(fù)責(zé)結(jié)合 細(xì)胞胂瘤抑制基因Rb并且抑制Rb功能，因此允許細(xì)胞增殖機(jī)制，以及 病毒復(fù)制以不受控制的方式進(jìn)行。5 24在Rb結(jié)合區(qū)中具有缺失，并且 不結(jié)合Rb (Fueyo等，2000)。因此，在正常細(xì)胞中通過(guò)Rb抑制突變 體病毒的復(fù)制。然而，如果Rb失活并且細(xì)胞變成腫瘤細(xì)胞，那么524 不再被抑制。因此，突變體病毒有效復(fù)制并且溶解Rb缺陷的肺瘤細(xì)胞。 在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的其它機(jī)制是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明對(duì)于與正 常細(xì)胞相比，溶瘤病毒選擇性在胂瘤細(xì)胞中復(fù)制的機(jī)制沒有限制。
優(yōu)選地，病毒不是用于遞送用于基因治療目的基因的載體。例如， 已將病毒進(jìn)行了改造以便遞送腺病毒E1A基因、p53肺瘤抑制基因、編 碼前體藥物的基因(Chmum等，1999; 2001 )或在輻射誘導(dǎo)的啟動(dòng)子 下的基因。這些病毒，事實(shí)上，通常不優(yōu)先在肺瘤細(xì)胞中復(fù)制并且因此 不被認(rèn)為是溶瘤病毒。
溶瘤病毒可以是天然存在的或者是經(jīng)修飾的。當(dāng)可從天然來(lái)源中分 離并且在實(shí)驗(yàn)室中未被有意修飾時(shí)，溶瘤病毒是"天然存在的"。例如， 溶瘤病毒可來(lái)自"野生來(lái)源"，即，來(lái)自已感染溶瘤病毒的人。
溶瘤病毒可以是重組溶瘤病毒，其由兩個(gè)或多個(gè)遺傳上不同的溶瘤 病毒的基因組節(jié)段的重組/重排所致。溶瘤病毒基因組節(jié)段的重組/重排 實(shí)際上可能在宿主生物體感染至少兩個(gè)遺傳上不同的溶瘤病毒后天然 發(fā)生。也可在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組病毒體，例如，通過(guò)使許可性宿主 細(xì)胞與遺傳上不同的溶瘤病毒的共感染(Nibert等1995 )。本發(fā)明進(jìn)一 步包含使用由兩個(gè)或多個(gè)遺傳上不同的溶瘤病毒的基因組節(jié)段的重排 所產(chǎn)生的重組溶瘤病毒，其中至少一個(gè)親本病毒是遺傳改造的、包括一 個(gè)或多個(gè)化學(xué)合成的基因組節(jié)段、已經(jīng)用化學(xué)或物理誘變劑處理過(guò)、或者其本身是重組事件的結(jié)果.，本發(fā)明還包含使用在存在化學(xué)誘變劑，包 括但不限于硫酸二甲酯和溴化乙錠時(shí)，或者存在物理誘變劑，包括但不 限于紫外光和其它形式的輻射時(shí)，經(jīng)歷重組的重組溶瘤病毒。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用在一個(gè)或多個(gè)基因組節(jié)段中包含缺失或重 復(fù)的重組溶瘤病毒，由于與宿主細(xì)胞基因組的重組包括附加遺傳信息的 重組溶瘤病毒，或者包括合成的基因的重組溶瘤病毒。
可修飾溶瘤病毒并且使其仍然能裂解性感染哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞?？?在將所述溶瘤病毒施用于增殖細(xì)胞前，通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)法預(yù)處理溶 瘤病毒(例如，通過(guò)胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白酶處理)。用蛋白
酶的預(yù)處理可除去病毒的外被(outer coat)或衣殼并且可提高病毒的感 染力。溶瘤病毒可用脂質(zhì)體或微膠粒包被。例如，在形成烷基硫酸去污 劑的濃度的微膠粒存在時(shí)，可用胰凝乳蛋白酶處理病毒體以產(chǎn)生新的感 染性亞病毒體顆粒。
可通過(guò)將突變的外殼蛋白整合到，例如病毒外被內(nèi)以修飾溶瘤病 毒?？赏ㄟ^(guò)取代、插入或缺失對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行突變。取代包括插入不同的 氨基酸替代天然氨基酸。插入包括在一個(gè)或多個(gè)位置將另外的氨基酸殘 基插入到蛋白質(zhì)內(nèi)。缺失包括蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失。 可通過(guò)本領(lǐng)域的已知方法產(chǎn)生這種突變。例如，編碼外殼蛋白質(zhì)之一的 基因的寡核苦酸位點(diǎn)定向誘變可導(dǎo)致產(chǎn)生期望的突變體外殼蛋白。在體 外感染COS 1細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溶瘤病毒中突變蛋白質(zhì)的表達(dá)可 導(dǎo)致突變蛋白整合到溶瘤病毒的病毒體顆粒內(nèi)(Turner和Duncan,1992; Duncan等，1991; Mah等，1990)。
優(yōu)選的 一 類免疫刺激劑包括佐劑。許多佐劑含有經(jīng)設(shè)計(jì)用于防止抗 原快速分解代謝的物質(zhì)，如氪氧化鋁或礦物油，以及免疫反應(yīng)的刺激物， 如月旨質(zhì)A、百日咳桿菌(BoW"t/e〃a/7eWww:s')或結(jié)核桿菌(A^vco6(3"en'wm f^wcw/av"')來(lái)源的蛋白質(zhì)。某些佐劑可通過(guò)商業(yè)途徑買到，例如，弗 氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, Mich. ) ; Merck 佐劑65 ( Merck and Company, Inc., Rahway, N.J. ) ; AS - 2 ( SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.);鋁鹽如明鞏或磷酸鋁；鈣、4失或鋅的鹽； ?；野彼岬牟蝗軕乙?；?；?；陽(yáng)離子或陰離子衍生化的多糖； 聚磷腈；可生物降解的微球；單磷酰酯A、 QS21、氨基烷基氨基葡糖苷 4-磷酸，和quilA。細(xì)胞因子，如GM-CSF、白介素-2、 -7、 -12，和其它相似生長(zhǎng)因子也可用作佐劑。
以便于特定組合物的方式向宿主施用免疫刺激劑，通常作為溶于緩 沖鹽中的單一單位劑量。優(yōu)選地通常在l到幾周后，可通過(guò)腸道或胃腸 外途徑，例如，皮下、皮膚、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、 鼻內(nèi)、口服、心內(nèi)、胰腺內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)等途徑另外遞送強(qiáng)化劑量?？赏ㄟ^(guò) 在耙位點(diǎn)施用達(dá)到免疫刺激劑的初始或強(qiáng)化劑量的局部化，使用本領(lǐng)域 中已知的持續(xù)釋放植入物、以不擴(kuò)散的顆粒的形式遞送等。免疫刺激劑 遞送的劑量和方案將隨所選的特定試劑而改變。通常施用一個(gè)或多個(gè)劑 量。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激劑是多克隆活化劑，其可包
括內(nèi)毒素，例如脂多糖(LPS );和超抗原(外毒素)(見Herman等(1991) Annu Rev Immunol 9:745-72 )。盡管超抗原優(yōu)先活化T細(xì)胞，但是內(nèi)毒 素主要與巨噬細(xì)胞上的CD14受體相互作用。因此觸發(fā)兩種細(xì)胞類型以 釋放促炎細(xì)胞因子。超抗原(SAgs )被II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC ) 呈遞并且與大量表達(dá)特異性T細(xì)胞受體V P結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞相互作用。 可選擇地，可使用免疫刺激核酸。免疫刺激核酸可具有免疫刺激基 序如CpG基序，和聚鳥噤呤(poly-G)基序。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案 中，可在聯(lián)合治療中使用任何核酸以引起免疫反應(yīng)，無(wú)論所述核酸是否 具有可確認(rèn)的基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激核酸含有序列CpG, 優(yōu)選地由分子式5' X^2CGX3X4 3'所表示的共有的促有絲分裂的CpG 基序，其中C和G是未甲基化的，X!、 X2、 X3和X4是核苷酸，在5' 和3'端或者接近5'和3'端處不存在GCG三核苷酸序列(見，于1999年 12月28日授予Krieg等的美國(guó)專利No. 6,00 8,200)。已知CpG免疫刺 激核酸刺激Thl型免疫反應(yīng)。盡管在人類DNA中相對(duì)稀有，但是通常 發(fā)現(xiàn)CpG序列存在于感染生物體如細(xì)菌的DNA中。人類免疫系統(tǒng)似乎 已進(jìn)化到能識(shí)別CpG序列作為感染的早期警戒信號(hào)，并且引起抗入侵病 原體的立即且有力的免疫反應(yīng)，而不引起應(yīng)用其它免疫刺激劑所見到的 有害反應(yīng)。因此依賴這種天然的免疫防御機(jī)制，含有CpG的核酸可利用 唯一的和天然的途徑用于免疫治療。已經(jīng)在美國(guó)專利No. 6,194,388，和 所公開的專利申請(qǐng)，如PCT US95/01570 、 PCT/US97/19791 、 PCT/US98/03678、 PCT/US98/10408、 PCT/US98/04703、 PCT/US99/07335 和PCT/US99/09863中詳盡地描述了 CpG核酸對(duì)免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激核酸是聚鳥。票呤免疫刺激核酸。多
篇參考文獻(xiàn)，包括Pisetsky和Reich, 1993 Mol Biol. Reports, ] 8:217-221; Krieger和Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63: 601- 637; Macaya等， 1993， PNAS， 90: 3745-3749; Wyatt等，1994, PNAS, 91: 1356-1360; Rando和Hogan， 1998,在Applied Antisense oligonucleotide Technology, Krieg和Stein編輯，p. 335-352;以及Kimum等，1994, J. Biochem. 116, 991 -994中描繪了聚鳥噤呤核酸的免疫刺激性質(zhì)。
免疫刺激核酸可以是雙鏈或單鏈。盡管單鏈分子具有增強(qiáng)的免疫活 性，但是通常，雙鏈分子在體內(nèi)更穩(wěn)定。因此，在本發(fā)明的某些方面， 優(yōu)選地核酸是單鏈，在其它方面優(yōu)選地核酸是雙鏈。整個(gè)免疫刺激核酸， 或者其部分可以是非甲基化的，但是至少5'CpG3'的C必需是非曱基化 的。
為了便于攝取到細(xì)胞內(nèi)，免疫刺激核酸優(yōu)選長(zhǎng)度為2 - 100個(gè)堿基。 然而，如果存在足夠的免疫刺激基序，任何多于6個(gè)核苷酸(甚至許多 kb長(zhǎng))大小的核酸都能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，免疫刺激核酸在8和 IOO個(gè)核苦酸之間，并且在某些實(shí)施方案中，大小在8和50或者在8和 30個(gè)核普酸之間。
在本發(fā)明的方法中使用免疫刺激核酸的 一個(gè)特別的優(yōu)勢(shì)是免疫刺 激核酸可發(fā)揮免疫刺激活性，甚至在相對(duì)低的劑量時(shí)發(fā)揮免疫刺激活 性。盡管所使用的劑量將視將要達(dá)到的臨床目的而變化，但是適當(dāng)?shù)膭?量范圍是在單一劑量中提供約lFg-約10,000 Fg,通常至少約l，OOOFg 免疫核酸?？蛇x擇地，免疫刺激核酸的靶劑量導(dǎo)致施用免疫刺激核酸后， 在第一個(gè)24 -48小時(shí)內(nèi)抽出的宿主血液的血量中有約1 - 10飛摩爾免 疫刺激核酸。根據(jù)當(dāng)前的研究認(rèn)為免疫刺激核酸在這些劑量水平上幾乎 沒有或者沒有毒性。
適于本發(fā)明目的的免疫刺激核酸可以是磷酸二酯的形式，或?yàn)榱烁?穩(wěn)定，以硫代磷酸酯或者磷酸二酯/硫代磷酸酯混合物的形式。盡管可使 用源于現(xiàn)有核酸來(lái)源，如基因組DNA或cDNA的寡核苷酸，優(yōu)選的是 使用合成的寡核苷酸。因此，可研發(fā)固體支持物上的寡核苷酸，使用P -氰乙基亞磷酰胺法(Beaucage， S丄.和Caruthers, M.H. Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 ( 1981 ))用于3'-〉5'裝配，然后在不用調(diào)節(jié)pH 的0.3M乙酸鈉(最終0.3M)存在下于乙醇中進(jìn)行沉淀。接下來(lái)，用4體積80%乙醇進(jìn)行沉淀，隨后在溶于純水前干燥沉淀。在含有寡核普酸 的硫代磷酸酯中，用硫原子取代構(gòu)成磷酸基的一個(gè)氧原子?？扇缫郧八?br> 描述的方法進(jìn)行合成，除了用TETD (二硫化四乙基秋蘭姆)溶液替換 在磷酸二酯鍵合成所必需的氧化步驟中使用的碘/水/嘧啶四氫呋喃溶 液，其提供用于產(chǎn)生硫代磷酸基的硫離子。也可設(shè)想磷酸二酯鍵，堿基 或糖的其它修飾，以便修飾所使用的寡核苷酸的特性，特別是用于增加 它們的穩(wěn)定性。
可選擇地，可通過(guò)主鏈修飾達(dá)到核酸穩(wěn)定性。本發(fā)明優(yōu)選的穩(wěn)定的 核酸具有修飾的主鏈。已經(jīng)證明當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)，核酸主鏈的修飾提供增 強(qiáng)的免疫刺激核酸的活性。免疫刺激核酸主鏈包括，但不限于，修飾磷 酸的主鏈，如硫代磷酸酯主鏈。這些免疫刺激序列的用途是本領(lǐng)域已知 的，例如見Bauer等(1999) Immunology 97(4): 699-705; Klinman等(1999) Vaccine 17(1): 19-25; Hasan等(1999) J Immunol Methods 229(1-2): 1-22; 以及其它。這種修飾的一種類型是硫酸主鏈修飾。例如，免疫刺激核酸， 包括寡核苷酸5，端的至少兩個(gè)硫代磷酸酯鍵和3，端(優(yōu)選地5，端) 的多個(gè)硫代磷酸酯鍵，可提供最大活性并且防止核酸受細(xì)胞內(nèi)的外切酶 和內(nèi)切酶的降解。其它修飾磷酸的核酸包括修飾磷酸二酯的核酸，磷酸 二酯和硫代磷酸核酸的組合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯，及其組合。在PCT公開的專利申請(qǐng)PCT/US95/01570和 PCT/US97/19791中更詳細(xì)地討論了免疫刺激核酸中這些組合中的每一 個(gè)和它們對(duì)免疫細(xì)胞的特定效應(yīng)。
引起主要Thl型反應(yīng)的優(yōu)選的免疫刺激劑包括，例如，單磷酰酯A, 優(yōu)選地是3-脫-0-酰基化單磷酰酯A以及鋁鹽的組合。含有CpG的寡核 苷酸(其中CpG 二核苷酸是非甲基化的)也包括主要的Thl反應(yīng)。另 一個(gè)優(yōu)選的免疫刺激劑包括皂苷，如QuilA,或其衍生物，包括QS21 和QS7 ( Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); 七葉素； 毛地黃皂普；或者Gypsophila或昆諾藜(Chenopodium quinoa ) 皂脊。 其它優(yōu)選的制劑包括一種以上的皂甙，例如至少兩個(gè)選自QS21、 QS7、 Quil A、 P七葉素和毛地黃皂苷的成員的組合。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，免疫刺激劑是溶瘤病毒的至少一種 抗原，所述溶瘤病毒通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APCs)向宿主遞送，如樹突細(xì) 胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和可進(jìn)行基因改造成為有效的APCs的其它細(xì)胞?？蓪?duì)這種細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以增加呈遞抗原的能力，以改 善T細(xì)胞反應(yīng)的活化和/或維持但這不是必需的T細(xì)胞反應(yīng)。通?？蓮?br> 多種生物液和器官中的任何一種中分離APC,其包括腫瘤和瘤旁組織， 并且可以是自體的、同種異體的、同種同基因的或異種細(xì)胞。
已經(jīng)證明使用負(fù)載肺瘤相關(guān)抗原的樹突細(xì)胞的癌癥免疫療法產(chǎn)生 腫瘤特異性免疫反應(yīng)和抗腫瘤活性(Campton等2000; Fong和Engelmann 2000 )。在使用肺瘤抗原脈沖的(pulsed)樹突細(xì)胞的體內(nèi)臨床試驗(yàn)中 獲得了很有希望的結(jié)果(Tarte和Klein 1999)。這些研究清楚地證明使 用樹突細(xì)胞產(chǎn)生抗癌癥抗原的免疫反應(yīng)的效力。
本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案使用樹突細(xì)胞或其祖細(xì)胞作為抗原 呈遞細(xì)胞。沖對(duì)突細(xì)胞是高效的APC (Banchereau和Steinman， Nature
免疫的生理學(xué)佐劑4艮有效(見Timmerman和Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529,1999 )。 一般地，樹突細(xì)胞可根據(jù)下述情況進(jìn)行鑒別，即它 們的典型形狀(原位是星形的，體外具有可見的顯著的胞質(zhì)突(樹突))、 它們能高效4聶取、加工和呈遞抗原，并且它們能激活天然T細(xì)胞反應(yīng)。
不存在于樹突細(xì)胞上的特異性細(xì)胞表面受體或者配體，本發(fā)明包括這種 修飾的樹突細(xì)胞?？墒褂秘?fù)載分泌性小泡抗原(secreted vesicles antigen ) 的樹突細(xì)胞(稱作外來(lái)體)作為除了樹突細(xì)胞以外的選擇(見Zitvogel 等，Nature Med. 4:594- 600,1998)。
可從外周血、骨髓、肺瘤浸潤(rùn)的細(xì)胞、瘤周組織浸潤(rùn)的細(xì)胞、淋巴 結(jié)、脾、皮膚、臍帶血或者任何其它適當(dāng)?shù)慕M織或液體中獲得樹突細(xì)胞
GM-CSF、 IL-4、 IL- 13和/或TNFcc之類的細(xì)胞因子的組合先體外后體 內(nèi)地分化樹突細(xì)胞?？蛇x4奪地，可通過(guò)向培養(yǎng)基中添加GM-CSF、 IL-3、 TNFoc、 CD40配體、LPS、 fit3配體和/或誘導(dǎo)樹突細(xì)胞分化、成熟和增 殖的其它化合物的組合，將從外周血、臍帶血或骨髓中收獲的CD34陽(yáng) 性細(xì)胞分化成樹突細(xì)胞。
III. 實(shí)施例 實(shí)施例1在兩個(gè)后脅腹上的兩個(gè)皮下位置向兩組雌性SCID小鼠注射lx106 人乳腺癌MDA-MB468細(xì)胞。在注射后大約2 - 4周可很明顯摸到腫瘤。 將20|til、 l.OxlO7 PFU/ml濃度的、未稀釋的呼腸孤病毒血清型3( Dearing 林)注射到右側(cè)腫瘤塊內(nèi)。連同呼腸孤病毒一起，也向組1的動(dòng)物注射 lOjiig含有CpG的寡核苷酸ODN 1826 (TCC ATG ACG TTCCT GACGTT)。兩周后，再次向這些動(dòng)物注射等量ODN 1826。組2的動(dòng)物 接受與CpG同樣量和同樣頻率的鹽水注射。結(jié)果顯示在兩組中，動(dòng)物左 側(cè)的肺瘤大于動(dòng)物右側(cè)的腫瘤，表明溶瘤病毒療法在治療肺瘤中有效。 此外，組1動(dòng)物中左側(cè)胂瘤小于組2動(dòng)物左側(cè)的胂瘤，表明和溶瘤病'毒 療法一道施用免疫刺激劑的額外的抗肺瘤效應(yīng)。
權(quán)利要求
1、在患腫瘤的哺乳動(dòng)物中治療或減輕所述腫瘤的方法，所述方法包括(a)向哺乳動(dòng)物施用溶瘤病毒；和(b)施用免疫刺激劑。
2、 權(quán)利要求l的方法，其中在施用溶瘤病毒后施用免疫刺激劑。
3、 權(quán)利要求2的方法，其中在溶瘤病毒已感染腫瘤細(xì)胞后施用免 疫刺激劑。
4、 權(quán)利要求3的方法，其中在經(jīng)感染的腫瘤細(xì)胞表達(dá)溶瘤病毒的 至少一種抗原或肺瘤特異性抗原后施用免疫刺激劑。
5、 權(quán)利要求2的方法，其中在施用溶瘤病毒后24小時(shí)施用免疫刺激劑。
6、 權(quán)利要求l的方法，其中溶瘤病毒是呼腸孤病毒。
7、 權(quán)利要求6的方法，其中呼腸孤病毒是天然存在的呼腸孤病毒。
8、 權(quán)利要求1的方法，其中免疫刺激劑是合成的寡脫氧核苷酸 (ODN)。
9、 權(quán)利要求8的方法，其中免疫刺激劑是未曱基化的胞嘧啶-磷 酸-鳥苷(CpG)。
10、 在患腫瘤的哺乳動(dòng)物中提高溶瘤病毒抗肺瘤活性的方法，所述 的方法包括向哺乳動(dòng)物施用免疫刺激劑和溶瘤病毒。
11、 權(quán)利要求10的方法，其中在溶瘤病毒已感染肺瘤細(xì)胞后施用 免疫刺激劑。
12、 權(quán)利要求10的方法，其中在經(jīng)感染細(xì)胞表達(dá)溶瘤病毒的至少 一種抗原或腫瘤特異性抗原后施用免疫刺激劑。
13、 權(quán)利要求11的方法，其中在施用溶瘤病毒后24小時(shí)施用免疫 刺激劑。
14、 權(quán)利要求10的方法，其中溶瘤病毒是呼腸孤病毒。
15、 權(quán)利要求14的方法，其中呼腸孤病毒是天然存在的呼腸孤病毒。
16、 權(quán)利要求10的方法，其中免疫刺激劑是合成的寡脫氧核苷酸 (ODN)。
17、 權(quán)利要求16的方法，其中免疫刺激劑是未曱基化的胞嘧啶-磷酸-鳥普(CpG)。
18、 在患胂瘤的哺乳動(dòng)物中提高溶瘤病毒的抗腫瘤活性的方法，所 述的方法包括(a) 將樹突細(xì)胞與溶瘤病毒接觸；(b) 誘導(dǎo)樹突細(xì)胞呈遞溶瘤病毒的抗原；和(c) 在哺乳動(dòng)物中激發(fā)對(duì)溶瘤病毒的免疫反應(yīng)。
19、 權(quán)利要求18的方法，其中所述接觸以先體外后體內(nèi)方式發(fā)生 并且在接觸后向哺乳動(dòng)物施用樹突細(xì)胞。
20、 提高溶瘤病毒療法效率的方法，包括(a) 向哺乳動(dòng)物施用溶瘤病毒；和(b) 施用免疫刺激劑。
21、 權(quán)利要求20的方法，其中在施用溶瘤病毒后施用免疫刺激劑。
22、 權(quán)利要求21的方法，其中在溶瘤病毒已感染腫瘤細(xì)胞后施用 免疫刺激劑。
23、 權(quán)利要求21的方法，其中在溶瘤病毒療法后24小時(shí)施用免疫 刺激劑。
24、 權(quán)利要求20的方法，其中溶瘤病毒療法是呼腸孤病毒。
25、 權(quán)利要求24的方法，其中呼腸孤病毒是天然存在的呼腸孤病毒。
26、 權(quán)利要求20的方法，其中免疫刺激劑是是合成的寡脫氧核苷 酸(ODN)。
27、 權(quán)利要求26的方法，其中免疫刺激劑是未曱基化的胞嘧啶-磷酸-鳥苷。
28、 增強(qiáng)胂瘤細(xì)胞的免疫識(shí)別的方法，包括(a) 用溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞；(b) 通過(guò)下列方法激發(fā)對(duì)溶瘤病毒抗原的免疫反應(yīng)(i) 將樹突細(xì)胞與溶瘤病毒接觸；(ii) 誘導(dǎo)樹突細(xì)胞呈遞溶瘤病毒的抗原；和(iii) 激發(fā)針對(duì)溶瘤病毒的免疫反應(yīng)；其中對(duì)溶瘤病毒的免疫反應(yīng)是針對(duì)由所感染的腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的 :容瘤病毒抗原的反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物中治療或減輕腫瘤并且通過(guò)使用溶瘤病毒和免疫刺激劑的組合提高溶瘤病毒效率的新方法，包括向宿主施用呼腸病毒并且通過(guò)添加免疫刺激劑如CpG寡脫氧核苷酸或者通過(guò)樹突細(xì)胞向宿主遞送的所述病毒的至少一種抗原提高免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K35/76GK101304761SQ200680031389
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2006年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日
發(fā)明者B·G·湯普遜, M·C·科菲 申請(qǐng)人:昂科利蒂克斯生物科技公司