專利名稱：：組織再生用基材的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組織再生用基材。具體而言，涉及用于將皮膚組織再生于燒傷、外傷等急性皮膚創(chuàng)傷以及褥瘡、潰瘍等慢性皮膚損傷的人工真皮基材等。
背景技術(shù)：
：皮膚缺損延及廣范圍時(shí)，有必要在早期封閉皮膚缺損部位。作為缺損的皮膚的再生方法，有不使用細(xì)胞而將作為模板的膠原海綿體移植于活體，在活體內(nèi)使仿真皮組織再生的方法(人工真皮)。在人工真皮的情況下，真皮樣組織進(jìn)行再生后必須進(jìn)行薄的分層植皮或?qū)⑴囵B(yǎng)表皮進(jìn)行移植，必須要盡早使真皮成分再生。作為人工真皮的制造方法，一般是將膠原海綿體凍干的方法，為了控制在活體內(nèi)的分解吸收速度，多進(jìn)行交聯(lián)。作為促進(jìn)皮膚組織再生的方法，可舉出將某種生長(zhǎng)因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)涂布于皮膚表面。雖然因皮膚吸收而具有效果，但為了維持該效果必須每天涂布。因此，嘗試著通過使生長(zhǎng)因子緩慢釋放，從而通過一次給藥即可使效果持續(xù)的方法。例如，河合等明確了通過將含浸bFGF的明膠微球體注入到人工真皮，可促進(jìn)bFGF的緩釋效果和皮膚組織在活體內(nèi)的構(gòu)建(非專利文獻(xiàn)1)。另外，還明確了，在制備細(xì)胞播種型(cellseeded-type)的培養(yǎng)皮膚時(shí)，通過添加含浸bFGF的明膠微球體可以促進(jìn)組織的構(gòu)建(非專利文獻(xiàn)2)。但是，該方法必須先將bFGF含浸于微球體，進(jìn)而必須有在臨床現(xiàn)場(chǎng)將該含浸bFGF的明膠微球體注入到人工真皮的操作，這很繁瑣。因此，如果能使人工真皮自身具有生長(zhǎng)因子緩釋能力，就可以僅在臨床現(xiàn)場(chǎng)將生長(zhǎng)因子涂布于人工真皮即能使用，可成為筒Y更的方法。現(xiàn)在，臨床上最常使用的細(xì)胞生長(zhǎng)因子是堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。bFGF的等電點(diǎn)為9.6，因電相互作用與例如等電點(diǎn)為5.0的明膠吸附。利用該特性，使bFGF吸附在用酸性明膠(等電點(diǎn)5.0)制成的微球體上，通過使用吸附有bFGF的微球體，可以在活體內(nèi)經(jīng)時(shí)緩釋bFGF(專利文獻(xiàn)l，非專利文獻(xiàn)3)。然而，在該方法中，必須要有下述等的手藝作為,子的微球體一旦吸附bFGF后，就將吸附有bFGF的>體注入于基材，對(duì)于臨床現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用而言，有煩雜而難以使用的一面。另一方面，考慮用易于吸附bFGF的酸性明膠制備人工真皮材料，使bFGF吸附于其上即可成為具有緩釋能力的基材。但是，在活體內(nèi)，明膠與膠原相比在細(xì)胞的浸潤(rùn)等方面差，因而不適于組織的再生。既能適量吸附bFGF，又使周圍的細(xì)胞易于浸潤(rùn)的基材備受期待。在專利文獻(xiàn)2中，有如下記載將明膠和膠原作為構(gòu)成基材的必須成分，經(jīng)紫外線照射而交聯(lián)的醫(yī)用基材被用于細(xì)胞培養(yǎng)載體、培養(yǎng)皮膚等中。專利文獻(xiàn)l:特開2003-325652號(hào)7>才艮專利文獻(xiàn)2:特開平11-47258號(hào)7>才艮非專利文獻(xiàn)1:K.Kawai等，Biomaterials，Vol.21,p.489-499(2000)非專利文獻(xiàn)2:佐生等，日本燒傷學(xué)會(huì)志，第29巻，p.24-30非專利文獻(xiàn)3:Y.Tabata等，J.ControlledRelease,Vol.31，p.189-199(1994)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種組織再生用基材，其具有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋能力，且細(xì)胞易于浸潤(rùn)而適于組織的再生。本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了精心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含膠原和明膠的活體吸收性多孔基材中含有bFGF而得到的基材具有良好的bFGF的緩釋性，且細(xì)胞易于浸潤(rùn)，適于作為用于再生皮膚組織的組織再生用基材。基于該認(rèn)識(shí)，進(jìn)而反復(fù)研究，完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下的組織再生用基材及其制造方法。第1項(xiàng).組織再生用基材，在含膠原及明膠的活體吸收性多孔基材中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子而成。第2項(xiàng).根據(jù)第1項(xiàng)所述的組織再生用基材，活體吸收性多孑L基材的明膠含量為1~70重量％。第3項(xiàng).根據(jù)第1或2項(xiàng)所述的組織再生用基材，細(xì)胞生長(zhǎng)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。第4項(xiàng).根據(jù)第1~3項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的組織再生用基材，將其在37"C的磷酸緩沖鹽7jC(PBS)中浸漬3天后釋放到該P(yáng)BS中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的量，相對(duì)于在組織再生用基材中所含浸的初期的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的總量，為7重量％以下。第5項(xiàng).根據(jù)第1~4項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的組織再生用基材，將其在37匸的磷酸緩沖鹽水(PBS)中浸漬7天后釋放到該P(yáng)BS中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的量，相對(duì)于在組織再生用基材中所含浸的初期的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的總量，為15重量％以下。第6項(xiàng).根據(jù)第1~5項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的組織再生用基材，具有平均孔徑為10~500nm的連續(xù)孔。第7項(xiàng).根據(jù)第1~6項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的組織再生用基材，在活體內(nèi)在3周以內(nèi)3皮分解吸收。第8項(xiàng).組織再生用基材的制造方法，包含下述工序?qū)⒑z原及明膠的水性混合物凍干的工序，將得到的千燥體進(jìn)行交聯(lián)處理的工序，及使得到的交聯(lián)體中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的工序。以下，詳述本發(fā)明。I.組織再生用基材本發(fā)明的組織再生用基材，是在含膠原及明膠的活體吸收性多孔基材中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子而成。本發(fā)明的組織再生用基材是指廣泛用于再生醫(yī)療的基材，例如在皮膚、骨、軟骨、心肌、脂肪等的再生醫(yī)療中使用的基材。特別優(yōu)選用作皮膚(真皮)的組織再生用基材，即人工真皮基材。本發(fā)明的組織再生用基材中使用的活體吸收性多孔基材含有膠原及明膠作為必須成分。作為上述明膠，沒有特別限定，可以使用例如來自于牛、豬、雞、鮭魚等的骨、腱、皮等的明膠。優(yōu)選對(duì)上述明膠進(jìn)行酸處理或堿處理。酸處理過的明膠帶正電荷，堿處理過的明膠帶負(fù)電荷，因而如果利用該電荷，就可以通過靜電結(jié)合將各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子無變性地結(jié)合于含具有正電荷或負(fù)電荷的明膠的活體吸收性多孔基材上。因此，細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如bFGF)就可以良好地緩釋。作為上述膠原，沒有特別限定，可以使用來自于牛、豬等的皮膚、腱等的膠原。從消除抗原性進(jìn)一步提高安全性的角度講，優(yōu)選使用以蛋白水解酶、胃蛋白酶等酶處理膠原以盡可能去除端肽的去端肽膠原(atelocollagen)。去端肽膠原有I~IV型，可以根據(jù)基材的用途進(jìn)行選擇。作為培養(yǎng)皮膚、創(chuàng)傷被覆材料使用時(shí)，優(yōu)選使用與真皮的構(gòu)成成分接近的I型或III型。通過使活體吸收性多孔基材中含有膠原，使細(xì)胞容易浸潤(rùn)該基材?；铙w吸收性多孔基材中所含的明膠含量為1~70重量％左右，優(yōu)選20~60重量％左右，更優(yōu)選30~50重量％左右。如果明膠的含量過多，則周圍的組織難以進(jìn)入活體吸收性多孔基材中，另一方面，如果明膠的含量過少，則由于明膠與細(xì)胞生長(zhǎng)因子的靜電相互作用導(dǎo)致吸附變?nèi)酰忈屝阅芟陆怠Ｒ虼耍绻幱谏鲜龊糠秶瑒t可以有效發(fā)揮出明膠及膠原的效果，得到高治療效果。由于活體吸收性多孔基材成為三維地再生組織的基材，因此優(yōu)選具有多孔結(jié)構(gòu)。特別是優(yōu)選具有許多的連續(xù)孔(連續(xù)的微細(xì)小孔)。通過所述結(jié)構(gòu)，在本發(fā)明的組織再生用基材上播種細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以浸潤(rùn)并粘附于微細(xì)小孔內(nèi)并且可以三維地伸展。另外，即使不播種細(xì)胞而移植時(shí)，周圍的細(xì)胞也可以容易地浸潤(rùn)。進(jìn)而，可以向粘附的細(xì)胞供給充分的營(yíng)養(yǎng)，可以使細(xì)胞正常地增殖及分化。作為活體吸收性多孔基材的微細(xì)小孔的平均孔徑，可以根據(jù)想要再生的組織或器官來選擇最適的值，優(yōu)選10500iLim左右，更優(yōu)選50~300nm左右。如果不足10nm，則細(xì)胞不能浸潤(rùn)到活體吸收性多孔基材的內(nèi)部，有時(shí)細(xì)胞粘附性極端變差，或粘附的細(xì)胞不能三維地伸展。如果超過500pm,則細(xì)胞的密度變低，有不能再生組織或器官的情況。本發(fā)明的組織再生用基材直接反映了上述活體吸收性多孔基材的多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的組織再生用基材，在含膠原及明膠的活體吸收性多孔基材中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子而成。作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子，只要是促進(jìn)血管新生、提高細(xì)胞活性的物質(zhì)就沒有特別限定，例如具有血管新生作用這樣的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具體可舉出堿基性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式為bFGF。本發(fā)明的組織再生用基材中細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量，可以根據(jù)其再生對(duì)象組織等適當(dāng)選擇，沒有特別限定。優(yōu)選對(duì)于lcm2為0.1ng100jig左右，優(yōu)選含有l(wèi)ug~50^1g左右即可。本發(fā)明的組織再生用基材具有可以經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地緩釋細(xì)胞生長(zhǎng)因子的所謂優(yōu)異的緩釋性能。例如，雖然bFGF促進(jìn)血管新生具有提高細(xì)胞活性的作用，但bFGF是活體內(nèi)不穩(wěn)定的物質(zhì)，并且即使在水溶液狀態(tài)下使用，也幾乎看不到所期待的生物效果。但是，通過在上述活體吸收性多孔基材中含浸規(guī)定量的bFGF，可以緩釋bFGF從而穩(wěn)定持續(xù)地發(fā)揮bFGF作用。本發(fā)明的組織再生用基材具有如下特征例如，使其在37C的磷酸緩沖鹽水(PBS)中浸漬3天后釋放到該P(yáng)BS中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的量，相對(duì)于在組織再生用基材中所含浸的初期的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的總量，為7重量％以下(優(yōu)選6重量％以下)。另外，有如下特征使其在37"C的7磷酸緩沖鹽水(PBS)中浸漬7天后釋放到該P(yáng)BS中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的量，相對(duì)于在該基材中所含浸的初期的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的總量，為15重量％以下(優(yōu)選13重量％以下)。特別是細(xì)胞生長(zhǎng)因子為bFGF時(shí)，能再現(xiàn)性良好地發(fā)揮上述的緩釋性能。進(jìn)而，本發(fā)明的組織再生用基材，由于含有含膠原及明膠的活體吸收性基材，因而在活體內(nèi)在3周以內(nèi)被分解吸收。組織再生用基材的含水率優(yōu)選的下限為卯％，優(yōu)選的上限為99.8%?；铙w吸收性多孔基材的含水率對(duì)應(yīng)于該活體吸收性多孔基材的交聯(lián)度，交聯(lián)度越高含水率越低。如果含水率不足卯％，則有得到的組織再生用基材不具有適于移植的柔軟性的情況，如果超過99.8%，則有得到的組織再生用基材不能在培養(yǎng)液、緩沖液中保持強(qiáng)度的情況。更優(yōu)選的下限為95%，更優(yōu)選的上限為98%。另外，含水率按以下計(jì)算式得出。含水率(％)=[(Ws-Wd)/Ws]x100(%)式中，Ws表示將組織再生用基材在25X:下浸漬于磷酸緩沖鹽水中1小時(shí)時(shí)的重量(濕潤(rùn)重量)，Wd表示使用真空干燥機(jī)將抗愈合材料完全干燥時(shí)的重量(干燥重量)。II.組織再生用基材的制法本發(fā)明的組織再生用基材通過含有下述工序的制造方法來制造將含膠原及明膠的水性混合物凍干的工序，將得到的干燥體進(jìn)行交聯(lián)處理的工序，及使得到的交聯(lián)體中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的工序。首先，混合上述的明膠及膠原制成水溶液，將其流延于適當(dāng)?shù)哪Ｐ涂蛑校?40~-8010下凍結(jié)30分鐘~2小時(shí)左右。通過將該凍結(jié)物進(jìn)行凍干，制備海綿狀的活體吸收性多孔基材。接著，將得到的凍干物進(jìn)行交聯(lián)處理制備活體吸收性多孔基材。作為凍干物的交聯(lián)方法，沒有特別限定，可列舉出熱交聯(lián)法、Y射線照射法、紫外線照射法、電子束照射法、X射線照射法、使用交聯(lián)劑的化學(xué)交聯(lián)法等。其中，從可以使基材的整體達(dá)到均勻的交聯(lián)度來進(jìn)行交聯(lián)的角度講，優(yōu)選使用交聯(lián)劑的化學(xué)交聯(lián)法。作為化學(xué)交聯(lián)法，可以進(jìn)行例如在含有戊二醛等交聯(lián)劑的水溶液中浸漬凍干物，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。通過水洗除去剩余的戊二醛，根據(jù)需要進(jìn)行再次凍干，從而得到被交聯(lián)的活體吸收性多孔基材。接著，在得到的被交聯(lián)的基材中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子，作為其方法沒有特別限定，可例示例如，將含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的水溶液滴落于該交聯(lián)體，使含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的水溶液含浸于該交聯(lián)體等。其后，可以根據(jù)需要進(jìn)一步設(shè)置干燥工序。本發(fā)明的組織再生用基材(特別是人工真皮基材)可以穩(wěn)定地緩釋細(xì)胞生長(zhǎng)因子，且細(xì)胞易于浸潤(rùn)，因而可以促進(jìn)創(chuàng)傷治愈，實(shí)現(xiàn)大幅縮短治愈時(shí)間。圖1:顯示試驗(yàn)例1中的bFGF體外緩釋試驗(yàn)結(jié)果的圖。圖2:是將試驗(yàn)例1中的海綿體的明膠含量設(shè)為0重量％時(shí)的組織切片圖像。圖3:是將試驗(yàn)例1中的海綿體的明膠含量設(shè)為10重量％時(shí)的組織切片圖像。圖4:是將試驗(yàn)例1中的海綿體的明膠含量設(shè)為30重量％時(shí)的組織切片圖像。圖5:是將試驗(yàn)例1中的海綿體的明膠含量設(shè)為50重量％時(shí)的組織切片圖像。圖6:是將試驗(yàn)例1中的海綿體的明膠含量設(shè)為100重量％時(shí)的組織切片圖像。具體實(shí)施方式以下，示出實(shí)施例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并非限于此。[試驗(yàn)例1](1)膠原和明膠的混合海綿體的制備將來源于豬腱的I型膠原和來源于豬皮膚的明膠混合制成水溶液。將水溶液裝入模型框中在-4ox:下凍結(jié)i小時(shí)，然后通過凍干制備海綿體。通過將該海綿體在真空中iio'c下處理來進(jìn)行熱交聯(lián)。進(jìn)而，在熱交聯(lián)后，浸漬于0.2%戊二醛、0.05N乙酸水溶液中進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。通過水洗除去剩余的戊二醛，進(jìn)行再次凍干，從而得到交聯(lián)的膠原-明膠海綿體。將該交聯(lián)海綿體用于下面的體外緩釋試驗(yàn)。(2)體外緩釋試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中使用的海綿體是使用明膠含量為0、10、30、50重量％的海綿體。將其制成12mm4)厚3mm的海綿體，將100M1的bFGF水溶液滴落于海綿體，以使其含浸有40ng的bFGF。緩釋試驗(yàn)如下進(jìn)行將海綿體浸潰于371C的PBS中，用ELISA法對(duì)1、3、5、7、9天后釋放到PBS中的bFGF進(jìn)行定量。當(dāng)將含浸后的各海綿體中所含的bFGF的重量設(shè)為100時(shí)，將經(jīng)過天數(shù)的bFGF釋放量的比例，即bFGF溶出比例(％)示于表1及圖1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)驗(yàn)中使用的海綿體，使用明膠含量為0、10、30、50、100重量%的海綿體。將其制成12mmd)厚3mm的海綿體，將100n1的bFGF水溶液滴落于海綿體，以使其含浸有40yg的bFGF。將該海綿體埋植于豚鼠背部全層皮膚缺損層，經(jīng)過2周后的組織切片圖像示于圖2~6中。在明膠100重量％的海綿體中，觀察到周圍組織的細(xì)胞浸潤(rùn)少，而且細(xì)胞潛入到海綿體下的向下生長(zhǎng)物(downgrowth)的圖像。另一方面，隨著膠原含量變高，細(xì)胞浸潤(rùn)增多，組織的再生也良好，但膠原為100重量％的情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋性能降低。因此，為了不妨礙周圍組織的浸潤(rùn)，且發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋功能，有必要以最適的混合比例混合明膠。權(quán)利要求1.組織再生用基材，在含膠原及明膠的活體吸收性多孔基材中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子而成。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織再生用基材，其特征在于，活體吸收性多孔基材的明膠含量為1~70重量％。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織再生用基材，其特征在于，細(xì)胞生長(zhǎng)因子為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織再生用基材，其特征在于，將其在37匸的磷酸緩沖鹽水PBS中浸漬3天后釋放到該P(yáng)BS中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的量，相對(duì)于在組織再生用基材中所含浸的初期的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的總量，為7重量％以下。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織再生用基材，其特征在于，將其在37匸的磷酸緩沖鹽水PBS中浸漬7天后釋放到該P(yáng)BS中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的量，相對(duì)于在組織再生用基材中所含浸的初期的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的總量，為15重量％以下。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織再生用基材，其特征在于，具有平均孔徑為10~500nm的連續(xù)孔。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織再生用基材，其特征在于，在活體內(nèi)在3周以內(nèi)被分解吸收。8.組織再生用基材的制造方法，包含下述工序?qū)⒑z原及明膠的水性混合物凍干的工序，將得到的干燥體進(jìn)行交聯(lián)處理的工序，及使得到的交聯(lián)體中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的工序。全文摘要本發(fā)明提供組織再生用基材，其具有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等細(xì)胞生長(zhǎng)因子的緩釋能力，且細(xì)胞易于浸潤(rùn)，適于組織的再生。具體而言，涉及在含膠原及明膠的活體吸收性多孔基材中含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子而成的組織再生用基材，以及其制造方法。文檔編號(hào)A61L27/00GK101257933SQ20068003261公開日2008年9月3日申請(qǐng)日期2006年9月5日優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日發(fā)明者富畑賢司,平嗣良,筏義人,鈴木茂彥,高橋佳丈申請(qǐng)人:郡是株式會(huì)社