專利名稱：：降低含油佐劑和含表面活性劑抗原之間的干擾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)含佐劑疫苗的領(lǐng)域。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及在生產(chǎn)基于含表面活性劑抗原的疫苗的過(guò)程中使用脂肪族佐劑。
背景技術(shù)：
：采用佐劑能提高對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答是眾所周知的(參見(jiàn)例如參考文獻(xiàn)1和2)。許多年以來(lái)，批準(zhǔn)人用的唯一佐劑是鋁鹽，但許多國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)了含有MF59佐劑和RC-529佐劑的疫苗，包括意大利(在希龍公司(Chiron)的FLUADTM產(chǎn)品中)和阿根廷(在伯納生物科技公司(BemaBiotech)的SUPERVAXTM產(chǎn)品中)。處于后期人用實(shí)驗(yàn)階段的其它佐劑包括膽固醇和皂苷、ISCOM、MPL、AS04、病毒顆粒、SBA4等的混合物。一些鋁鹽替代物的共有特征是存在脂肪族組分。例如，MF59佐劑包含鯊烯(油)，MPLTM包含帶有多個(gè)脂肪酸鏈連接于二葡糖胺主鏈的脫酰基化形式的單磷?；|(zhì)A。本發(fā)明涉及避免這些脂肪族佐劑和含有表面活性劑組分的抗原之間可能發(fā)生的干擾。發(fā)明概述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，疫苗組合物中的脂肪族佐劑可能與含有表面活性劑組分的抗原不相容。然而，在許多情況下，仍然需要合并脂肪族佐劑和抗原/表面活性劑混合物，本發(fā)明的目的之一是提供避免這樣做的過(guò)程中可能產(chǎn)生的困難的方式。另一目的是提供合并佐劑和抗原的方法，該方法可以避免不相容。為了避免使用一般采用表面活性劑純化的抗原時(shí)的這些不相容問(wèn)題，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種制備免疫原性組合物的方法，其中(a)該組合物含有抗原和脂肪族佐劑；和(b)在不存在表面活性劑的情況下基本純化該抗原。采用避免使用表面活性劑的替代方法來(lái)純化抗原，可解決對(duì)脂肪族佐劑的任何不相容性問(wèn)題。然而，出于臨床、歷史或法規(guī)原因，可能無(wú)法在不采用表面活性劑的情況下純化抗原，或者完全去除疫苗中的表面活性劑。在這種情況下，本發(fā)明通過(guò)降低組合物中油與表面活性劑的比例避免了干擾。典型MF59/HBsAg疫苗所含的油量遠(yuǎn)高于表面活性劑，油與表面活性劑的比例超過(guò)4000:1(重量比)。本發(fā)明的目標(biāo)是最大程度減少組合物中脂肪族佐劑的含量，在第二方面，本發(fā)明采用的油量為至多重量過(guò)量1000倍。因此，本發(fā)明提供了一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括合并(i)含有表面活性劑的抗原組分和(ii)脂肪族佐劑組分的步驟，以得到所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于1000:1的組合物。相似地，本發(fā)明提供了免疫原性組合物，其中(a)所述組合物含有抗原組分和脂肪族佐劑組分；(b)所述抗原組分含有表面活性劑；和(c)所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于1000:1。微微浙本發(fā)明的第一和第二方面都使用了脂肪族佐劑，即含有脂肪族分子的佐劑組分。典型的脂肪族佐劑含有可代謝油、脂肪酸和/或含有脂肪酸部分的分子。兩種優(yōu)選脂肪族佐劑是稱為'MF59'和'MPL'的佐劑。'MF59'是脂肪族佐劑，因?yàn)槠浜凶鳛榭纱x油的鯊烯。'MPL'是脂肪族佐劑，因?yàn)樗杏枚鄠€(gè)脂肪酸鏈取代的二糖。除MF59以外，還可采用其它水包油乳劑佐劑。因此，本發(fā)明優(yōu)選組合物包含(a)水包油乳劑，如含有鯊烯和聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(任選為山梨聚糖三油酸酯)的亞微米水包油乳劑；和/或(b)3-0-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A。聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯也稱為聚山梨酯80。除'MF59'和'MPL'以外，可用于本發(fā)明的其它脂肪族佐劑包括但不限于氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物；N-?；?假二肽；來(lái)源于大腸桿菌(￡^^/^/"^//)脂質(zhì)厶的可溶性佐劑'OM-174';含有連接于含磷酸無(wú)環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物；和無(wú)環(huán)合成脂質(zhì)A類似物。采用如MF59等水包油乳劑佐劑時(shí)，一般加入等體積的水性抗原組合物，以使該乳劑占組合物總體積的50%。采用3D-MPL佐劑時(shí)，劑量一般為25ng/ml-200pg/ml，如50-150嗎/ml、75-125pg/ml、90-110|ig/ml或約100嗎/ml。通常每個(gè)劑量施用25-75嗎的3D-MPL，如45-55(ag，或每劑量約50嗎3D-MPL。如MF59等乳劑佐劑一般與抗原分開(kāi)，在獨(dú)立的容器中提供，在使用時(shí)臨時(shí)混合；或者可以與抗原混合的狀態(tài)提供乳劑佐劑。3D-MPL佐劑一般在銷售給最終使用者之前就已經(jīng)與抗原混合。MF59'Mp59'佐劑是由鯊烯、吐溫80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)和Span85(山梨聚糖三油酸酯)形成的水包油乳劑。使該乳劑微流化，以得到具有亞微米液滴尺寸的乳劑。MF59的制備最初報(bào)道于參考文獻(xiàn)3，希龍公司生產(chǎn)和出售該產(chǎn)品。其它細(xì)節(jié)可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)2的第10章、參考文獻(xiàn)1的第12章和參考文獻(xiàn)4-6。MF59的體積組成為5%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.5%Span85。以重量計(jì)，這些比值變?yōu)?.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%Span85。在本發(fā)明第二個(gè)方面，計(jì)算油:表面活性劑的比例時(shí)不計(jì)入MF59自身的表面活性劑含量，因?yàn)樵摫戎祷诳乖谋砻婊钚詣┖?。MP59乳劑宜含有檸檬酸根離子，如lOmM檸檬酸鈉緩沖液。其它水包油乳劑作為MF59佐劑的替代物，可采用其它水包油乳劑。佐劑乳劑一般含有至少一種油和至少一種表面活性劑，所述油和表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中油滴的直徑通常小于5pm，一般為亞微米直徑?？刹捎梦⒘骰矊?shí)現(xiàn)小液滴尺寸，以提供穩(wěn)定的乳劑。優(yōu)選小于220nm的液滴，因?yàn)榭蓪?duì)它們進(jìn)行過(guò)濾除菌。乳劑可包括油，如來(lái)自動(dòng)物(如魚(yú))或植物的油，而非礦物油。植物油的來(lái)源包括堅(jiān)果、種子和谷粒。堅(jiān)果油中，最常見(jiàn)的例子是花生油、大豆油、椰油和橄欖油。例如，也可采用獲自霍霍巴豆的霍霍巴油。種子油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油最常見(jiàn)，但也可采用其它谷粒如小麥、燕麥、大麥、水稻、畫(huà)眉草、黑小麥等的油。雖然天然情況下種子油中不存在甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，但能以堅(jiān)果油和種子油為原料，通過(guò)對(duì)其中適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)進(jìn)行水解、分離和酯化來(lái)制備。來(lái)自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油是可代謝的，因此可用于實(shí)施本發(fā)明。由動(dòng)物來(lái)源獲得純凈的油所必需的分離、純化、皂化和其它步驟是本領(lǐng)域眾所周知的。大多數(shù)魚(yú)含有易于回收的可代謝油。例如，鱈魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肝油和如鯨蠟等鯨油是可用于本發(fā)明的幾種魚(yú)油。以5-碳異戊二烯單元生化合成許多支鏈油，它們總稱為類萜。鯊魚(yú)肝油含有支鏈不飽和類萜，稱為鯊烯、2，6，10,15，19,23-六甲基-2，6，10,14，18,22-二十四己烯，它是本文尤其優(yōu)選的類砲。鯊烯的飽和類似物鯊?fù)橐彩莾?yōu)選油。魚(yú)油，包括鯊烯和鯊?fù)椋少?gòu)自商業(yè)來(lái)源，或者通過(guò)本領(lǐng)域已知方法獲得。其它優(yōu)選油是生育酚(見(jiàn)下)。可采用油的混合物?？赏ㄟ^(guò)'HLB'(親水/親脂平衡)對(duì)表面活性劑進(jìn)行分類。本發(fā)明優(yōu)選表面活性劑的HLB為至少10、優(yōu)選至少15、更優(yōu)選至少16?？捎糜诒景l(fā)明的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑(通常稱作吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80;環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁垸(BO)的共聚物，商品名為DOWFAXtm，如直鏈EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚糖，其中重復(fù)的乙氧基(氧-l，2-乙垸二基)數(shù)量可以變化，特別感興趣的是辛苯聚糖-9(TritonX-IOO，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);如磷脂酰膽堿(卵磷脂)等磷脂；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(Brij30);和山梨聚糖酯(通常稱作SPAN)，如山梨聚糖三油酸酯(Span85)和山梨聚糖單月桂酸酯。乳劑中包含的表面活性劑優(yōu)選為吐溫80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)、Span85(山梨聚糖三油酸酯)、卵磷脂和TritonX-IOO。表面活性劑混合物可采用(例如)吐溫80/Span85混合物，或吐溫80/Triton-X100混合物。用于本發(fā)明的水包油乳劑佐劑包括但不限于鯊烯、生育酚和吐溫80的乳劑。該乳劑可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它還可包含Span85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳劑可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯與生育酚的重量比優(yōu)選g，因?yàn)檫@能提供更穩(wěn)定的乳劑?？蓪⑼聹?0溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml這種溶液與(5gDL-a-生育酚和5ml鯊烯)的混合物混合，然后微流化該混合物，從而制備一種這類乳劑。得到的乳劑可含有亞微米油滴，例如平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的油滴。鯊烯、生育酚和Triton去污劑(如TritonX-100)的乳劑。鯊?fù)?、聚山梨?0和泊洛沙姆401("普朗尼克tmL121")的乳劑。可用磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4配制該乳劑。這種乳劑是可用于胞壁酰二肽的遞送載體，已經(jīng)在"SAF-r佐劑[7](0.05-P/。Thr-MDP、5%鯊垸、2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酯80)中與蘇氨?；?MDP聯(lián)用。還可采用不含Thr-MDP的佐劑，如"AF"佐劑[8](5。/。鯊垸，1.25%普朗尼克！^121和0.2%聚山梨酯80)。優(yōu)選微流化。含有0.5陽(yáng)50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子型表面活性劑的乳劑。如參考文獻(xiàn)9所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴大小。不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或Span80)的亞微米水包油乳劑?？砂砑觿鏠uilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂偶聯(lián)物(如通過(guò)葡糖醛酸的羧基將脂肪族胺加到脫?；碥丈袭a(chǎn)生的GPI-OIOO，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)10)、二甲基二(十八烷基)溴化銨和/或N,N-二(十八垸基)^^-雙(2-羥乙基)丙二胺。皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)聯(lián)結(jié)成螺旋膠束的乳劑[11]。優(yōu)選在臨用前、遞送時(shí)混合乳劑與抗原。因此，在包裝或銷售的疫苗中，一般將佐劑和抗原分開(kāi)保存，在使用時(shí)配制成最終制劑。該抗原通常為水性形式，以便通過(guò)混合兩種液體最終制備該疫苗。用于混合的兩種液體的體積比可變(如5:1-1:5)，但通常約為1:1。當(dāng)組合物含有生育酚時(shí)，可采用a、|3、Y、S、s或《生育酚中的任一種，但優(yōu)選a-生育酚。生育酚可以取數(shù)種形式，如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽，如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等?？刹捎肈-a-生育酚和DL-a-生育酚。優(yōu)選的a-生育酚是DL-a-生育酚，此生育酚的優(yōu)選鹽是琥珀酸鹽。3D-MPL3-0-脫?；膯瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL;也被稱為3脫-O-酰基化的單磷?；|(zhì)A或3-0-脫?；?4'-單磷酰基脂質(zhì)A),它是已知佐劑。該名稱表明，單磷?；|(zhì)A中的還原端葡糖胺的3位被脫?；?。3D-MPL可由明尼蘇達(dá)沙門(mén)菌(>^^0朋//0^'""^0^)的無(wú)庚糖突變體制備，在化學(xué)上類似于脂質(zhì)A，但缺少對(duì)酸敏感的磷?；蛯?duì)堿敏感的?；?。它能激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞，并刺激釋放幾種細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-12、TNF-a和GM-CSF。最初在參考文獻(xiàn)12中描述了3D-MPL的制備，該產(chǎn)品由科雷薩公司(CorixaCorporation)以商品名MPL生產(chǎn)并出售。其它詳情可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)13-16。3D-MPL可以取?；煌南嚓P(guān)分子(如具有3、4、5或6個(gè)?；?，它們的長(zhǎng)度可以不同)的混合物的形式。兩個(gè)葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-?；?，3'位上也有0-?；?。連接于碳2的基團(tuán)化學(xué)式為-NH-CO-CHrCJ^R^連接于碳2'的基團(tuán)化學(xué)式為-NH-CO-CHrCR2R2'。連接于碳3'的基團(tuán)化學(xué)式為-0-CO-CH2-CR3R3'。代表性結(jié)構(gòu)是基團(tuán)R1、R2和R3各自獨(dú)立地是-(CH2)n-CH3。n值優(yōu)選為8-16，更優(yōu)選為9-12，最優(yōu)選為10?；鶊F(tuán)R1.、112'和113可以各自為(a)陽(yáng)H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值優(yōu)選為8-16，更優(yōu)選為10、12或14。在2位上，m優(yōu)選為14。在2'位上，m優(yōu)選為10。在3'位上，m優(yōu)選為12。因此基團(tuán)R、R"和R3'優(yōu)選為來(lái)自十二烷酸、十四烷酸或十六垸酸的-O-酰基。R、R"和R'均為-H時(shí)，3D-MPL僅含有3條?；?2、2'和3'位置上各有一條)。R、R"和RS'中僅有兩個(gè)是-H時(shí)，3D-MPL可含有4條?；?。R1',R"和！13'中僅有一個(gè)是-H時(shí)，3D-MPL可含有5條?；?。R、W和R3'中沒(méi)有一個(gè)是-H時(shí)，3D-MPL可含有6條酰基鏈。本發(fā)明所用的3D-MPL佐劑可以是含有3-6條酰基鏈的這些形式的混合物，但混合物中優(yōu)選包含具有6條酰基鏈的3D-MPL，具體說(shuō)，保證6條酰基鏈的形式占3D-MPL總重的至少10%，例如^20%、230%、$40%、^50%或更多。發(fā)現(xiàn)具有6條?；湹?D-MPL是佐劑活性最高的形式。因此，本發(fā)明組合物包含的3D-MPL的最優(yōu)選形式是以混合物形式使用3D-MPL時(shí)，本發(fā)明組合物中3D-MPL的含量或濃度指混合物中合并的各種3D-MPL物質(zhì)的總量或總濃度。在水性條件下，3D-MPL可形成大小不同的膠束聚集體或顆粒，如直徑〈150nm或〉500nm。本發(fā)明可以采用其中的一種或兩種一起采用，可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)選擇較好的顆粒。本發(fā)明優(yōu)選采用較小顆粒(如小到足夠產(chǎn)生澄清的3D-MPL水懸液)，因?yàn)槠浠钚愿遊17]。優(yōu)選顆粒的平均直徑小于220nm，更優(yōu)選小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直徑甚至可小于100nm。然而，在大多數(shù)情況下，平均直徑不小于50nm。這些顆粒小到足夠適應(yīng)過(guò)濾除菌。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射的常規(guī)技術(shù)評(píng)估顆粒直徑，該技術(shù)能揭示平均顆粒直徑。稱某顆粒的直徑為xnm時(shí)，通常該顆粒在此平均值附近分布，但至少50%數(shù)量(例如>60%、>70%、>80%、>90%或更多)的顆粒直徑在x士25c/。的范圍內(nèi)。3D-MPL可單獨(dú)用作佐劑，或者與一種或多種其它佐劑化合物聯(lián)用。例如，已知將3D-MPL與QS21皂苷[18];與QS21和水包油乳劑[19];與磷酸鋁[20];與氫氧化鋁[21];或與皂苷和白介素-12[22]聯(lián)用。優(yōu)選的佐劑混合物(特別是與HBsAg—起使用時(shí))包括3D-MPL和鋁鹽的混合物，鋁鹽優(yōu)選為磷酸鋁。3D-MPL宜吸附于鋁鹽上。優(yōu)選地，至少50%(以重量計(jì))的3D-MPL吸附，例如〉60%、>70%、〉80%、>90%、>95%、〉98%或更多。目前使用的鋁佐劑一般稱為"氫氧化鋁"或"磷酸鋁"佐劑。然而，它們只是為了稱呼方便，并不是對(duì)實(shí)際存在的化合物的準(zhǔn)確描述(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)2的第9章)。為了與如3D-MPL等脂肪族佐劑聯(lián)用，本發(fā)明可使用通常用作佐劑的"氫氧化物"或"磷酸鹽"中的任何一種。稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽，通常它至少部分為結(jié)晶。羥基氧化鋁(化學(xué)式為A10(0H))，通過(guò)紅外(IR)光譜，可將其與如氫氧化鋁A1(0H)3等其它鋁化合物區(qū)別開(kāi)來(lái)，尤其是出現(xiàn)1070cm"處的吸收帶和3090-3100cm"處的強(qiáng)肩(參考文獻(xiàn)2的第9章)。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽?？赏ㄟ^(guò)沉淀獲得它們，沉淀過(guò)程中的反應(yīng)條件和濃度會(huì)影響磷酸取代該鹽的羥基的程度。羥基磷酸鹽的P04/A1摩爾比通常為0.3-0.99。由于存在羥基，可以將羥基磷酸鹽與標(biāo)準(zhǔn)的A1P04區(qū)分開(kāi)。例如，3164cm"處的IR譜帶(例如加熱到20(TC)表明存在結(jié)構(gòu)羥基(參考文獻(xiàn)2的第9章)。磷酸鋁佐劑的P(VA產(chǎn)摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選0.8-1.2，更優(yōu)選0.95±0.1。磷酸鋁通常為無(wú)定形，特別是羥基磷酸鹽。典型佐劑是P04/A1摩爾比為0.84-0.92的無(wú)定形的羥基磷酸鋁，包含0.6mgAl3+/ml。磷酸鋁通常為顆粒?？乖胶箢w粒的一般直徑為0.5-20|Lim(如約5-10pm)。磷酸鋁的PZC與磷酸根取代羥基的程度逆相關(guān)，這種取代程度可能取決于通過(guò)沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度。還可通過(guò)改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=酸性更強(qiáng)的PZC)，或加入如組氨酸緩沖液等緩沖液(使PZC堿性更強(qiáng))，來(lái)改變PZC。用于本發(fā)明的磷酸鋁的PZC通常為4.0-7.0，更優(yōu)選為5.0-6.5，如約5.7。用于制備本發(fā)明組合物的磷酸鋁溶液可含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)，但也不一定。磷酸鋁溶液優(yōu)選為無(wú)菌和無(wú)熱原的。磷酸鋁溶液可包括游離的水性磷酸根離子，例如濃度為1.0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM的磷酸根離子。磷酸鋁溶液還可含有氯化鈉。氯化鈉濃度優(yōu)選為0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml、l-20mg/ml、2-10mg/ml)，更優(yōu)選為約3±1mg/ml。NaCl的存在有助于在抗原吸附前正確測(cè)定pH。優(yōu)選以水溶液形式使用磷酸鋁，向溶液中加入3D-MPL(任選地，和抗原)(NB:通常將水性磷酸鋁稱為"溶液"，但從嚴(yán)格的物理化學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，該鹽不可溶，形成的是懸液)。優(yōu)選將磷酸鋁稀釋至所需濃度，并保證在加入3D-MPL和/或抗原前為均一溶液。N-?；?假二肽N-?；?假二肽佐劑優(yōu)選包含被中性或帶電形式的酸基團(tuán)酯化的羥基。?；x予假二肽脂肪族特征。該佐劑優(yōu)選化學(xué)式為(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中-R:是衍生自含有2-24個(gè)碳原子的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈羧酸的?；?，所述羧酸未取代或用一種或多種選自下組的取代基取代羥基、垸基、烷氧基、酰氧基、氨基、?；被ⅤＡ蚧?(cl24)烷基)硫基；-R2是衍生自含有2-24個(gè)碳原子的飽和或不飽和的、直鏈或支鏈羧酸的酰基，所述羧酸未取代或用一種或多種選自下組的取代基取代羥基、垸基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰基氨基、酷硫基和((Cl24)院基)硫基；-X是氫原子或者中性或帶電形式的酸基團(tuán)；-Y是氫原子或者中性或帶電形式的酸基團(tuán)；-A是氧原子、硫原子或亞氨基-NH-;-B是氧原子、硫原子或亞氨基-NH-;-m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;-n是O、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;-p是l、2、3、4、5、6、7、8、9或10;禾口-q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，限制條件是取代基X或Y中至少一種為中性或離子形式的酸基團(tuán)。佐劑可以酸或鹽形式，與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿聯(lián)用?？捎糜谥委煈?yīng)用的成鹽堿主要包括堿金屬堿，如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰、銨鹽；堿土金屬堿，如氫氧化鈣或氫氧化鍶和鎂鹽；鐵金屬鹽等；有機(jī)堿，如衍生自如甲胺、二乙胺、單乙醇胺、二乙醇胺、芐胺、N-甲基芐胺、藜蘆基胺、三甲氧基芐胺等伯、仲、叔胺的有機(jī)堿；堿性氨基酸，如賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸或氨基糖。不可用于治療應(yīng)用的堿的例子是二甲馬錢(qián)子堿、馬錢(qián)子堿、鯡精胺、龍是肌堿、葡糖胺、N-甲基葡糖胺或N-甲基嗎啉。優(yōu)選取代基X和Y選自-羧基[(Cw烷基]-CH-[(CH2)rCOOH][(CH2)sCOOH]，其中r是0、1、2、3、4或5;s是0、1、2、3、4或5-膦?；鵞(CL5)垸基]-二羥基磷酰氧基[(Cw)烷基]-二甲氧基磷酰基-膦?；?羥基磺酰基-羥基磺?；鵞(C!-5)烷基]-羥基磺酰氧基[(Cw)烷基〗取代基X和/或Y為中性形式的酸基團(tuán)時(shí)，指游離的羧酸、磺酸或磷酸形式。酸基團(tuán)是帶電形式時(shí)，指羧酸、磺酸或磷酸鹽形式，即通過(guò)加入有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的鹽，所述堿優(yōu)選為用于治療應(yīng)用的堿。當(dāng)X和/或Y為羧基垸基、烯基雙羧基、羥基磺?；⒘u基磺?；榛⒘u基磺?；?烷氧基、膦?；榛蛄柞；?烷氧基時(shí)，情況相似。當(dāng)111=1和11=0時(shí)，所述佐劑衍生自絲氨酸。當(dāng)111=2和11=0時(shí)，所述佐劑衍生自高絲氨酸。如果111=3且11=0，指五-高絲氨酸化合物。如果！!1=4和11=0，指六-高絲氨酸化合物。當(dāng)p=3和q=l時(shí)，感興趣的產(chǎn)物可以是瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸或精氨酸化合物。當(dāng)p=4和q-l時(shí)，指高精氨酸或賴氨酸化合物。R,和R2包括鏈長(zhǎng)度不同、特性不同或相同的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈?；苌铮鼈兛梢院羞x自下組的一個(gè)或多個(gè)取代基烷基、氨基、?；被⒘u基、垸氧基、酰氧基、酰硫基和烷硫基。這類酰基化取代衍生物的例子有蓖麻油?；?、1,2-羥基硬脂?；?-羥基-3-甲基丁?；?、3-羥基-2-氨基戊?；?、棕櫚?；?、反油?；⒂陀仓；?eleostearyl)、花生酰基、花生四烯?；㈨?-二十碳烯?；⑸綅ｕ；⑵皟翰嘶?-甲基癸酰基、9-甲基癸?；?、二十二碳六烯?；蚨嘉逑；?yōu)選佐劑化學(xué)式為(Ia)，其中A和B都是氧原子X(jué)剩CH2〗蹈掘-(CH^-③垂〖OH^GH媽)g-0-Y在化學(xué)式(Ia)中，X和Y優(yōu)選為氫原子或膦?；?。合適的佐劑化學(xué)式(Ia)包括-3-(3-十二酰氧基十四?；被?9-(3-羥基十四?；被?4-氧代-5-氮雜癸烷-l,lO-二醇1和/或10-二氫磷酸酯，以及其與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的加成鹽，-3-(3-十二酰氧基-十四?；被?9-(3-羥基十四酰基氨基)4-氧代-5-氮雜癸烷-l,lO-二醇1，10-雙(二氫磷酸)酯，以及其與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的加成鹽，-3-(3-羥基十四酰基氨基)9-(3-十二酰氧基十四?；被?4-氧代-5-氮雜癸烷-l,lO-二醇1,10-雙(二氫磷酸)酯，以及其與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的加成鹽，-3-(3-十二酰氧基十四酰基氨基)9-(3-羥基十四?；被?4-氧代-5-氮雜癸烷-l,lO-二醇1-二氫磷酸酯，以及其與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的加成鹽，-3-(3-羥基十四?；被?9-(3-十二酰氧基十四?；被?4-氧代-5-氮雜癸烷-l,lO-二醇1-二氫磷酸酯，以及其與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的加成鹽，-3-(3-羥基十四酰基氨基)9-(3-十二酰氧基十四?；被?4-氧代-5-氮雜癸烷-l,lO-二醇10-二氫磷酸酯，以及其與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿形成的加成鹽。參考文獻(xiàn)23詳細(xì)公開(kāi)了合成化學(xué)式(I)的佐劑的方法，該方法包括以下步驟分別通過(guò)易于進(jìn)行酸解和氫解(hydrogolysis)的封端試劑保護(hù)二氨基酸(q+l)位和co位的胺官能團(tuán)；使游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的醇；使(q+l)位的胺官能團(tuán)去保護(hù)，然后通過(guò)與化學(xué)式R2OH的羧酸官能衍生物的反應(yīng)?；又ㄟ^(guò)氫解釋放游離的末端胺官能團(tuán)，得到通式II的二氨基醇,仰在惰性溶劑中肽縮合劑存在的情況下，將該氨基醇與通式III的(0-羥基、0>氨基或CO-硫代氨基酸化合物一起縮合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(in)以提供化學(xué)式(IV)的二肽化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(IV)如果有必要，其末端游離的醇官能團(tuán)可以被保護(hù)(例如通過(guò)烷基或?；蛉魏纹渌线m的保護(hù)基)，或在偶聯(lián)劑的存在下被取代(如果需要)?？蓪?duì)保護(hù)的醇進(jìn)行催化氫化或其它脫保護(hù)處理，以獲得通式I的衍生物。參考文獻(xiàn)23還詳細(xì)公開(kāi)了合成化學(xué)式(II)佐劑的方法，該方法包括以下步驟分別通過(guò)易于進(jìn)行酸解和氫解的保護(hù)試劑保護(hù)化學(xué)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q+1COOH的二氨基酸(q+l)和co位的胺官能團(tuán)；使游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的醇；使(q+l)位的胺官能團(tuán)去保護(hù)，然后通過(guò)與化學(xué)式R2OH的羧酸官能衍生物的反應(yīng)酰基化，接著通過(guò)氫解使末端胺官能團(tuán)去保護(hù)，以獲得通式II的氨基醇；在惰性溶劑中肽縮合劑存在的情況下，將該氨基醇與通式Ilia的co-羥基氨基酸官能衍生物一起縮合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中X是化學(xué)式(RO)2P-0的二垸氧基-或二芳氧基-磷?；缘玫交瘜W(xué)式IVa的肽樣化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>當(dāng)R是易于進(jìn)行氫解的基團(tuán)時(shí)，如果需要，其中另一個(gè)醇官能團(tuán)可以在偶聯(lián)劑存在下用磷酸化試劑磷酸化。一方面可對(duì)保護(hù)的醇進(jìn)行催化氫化，以使?；鵕2上任選存在的醇官能團(tuán)去保護(hù)，另一方面，釋放磷酸官能團(tuán)，然后通過(guò)氫解使第二個(gè)任選存在的磷酸官能團(tuán)去保護(hù)，以獲得通式V的衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>任選地進(jìn)行下一步驟，與有機(jī)或無(wú)機(jī)堿反應(yīng)形成鹽。最初使用的氨基酸構(gòu)型決定了?；被氖中灾行牡牧Ⅲw化學(xué)，而?；被牧Ⅲw化學(xué)取決于最初使用的脂肪酸構(gòu)型。一個(gè)可以從具有L或D構(gòu)型或者外消旋特性的二氨基酸開(kāi)始。一個(gè)可以從L,D構(gòu)型的羥化氨基酸或外消旋混合物開(kāi)始。所有這類立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。特別優(yōu)選的佐劑，尤其是單和雙磷酸化的化合物，是稱作"OM-294-MP"(化學(xué)式VI)和"OM-294-DP"(化學(xué)式VII)的化合物[23]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>可通過(guò)化學(xué)合成獲得OM-174,它保留了來(lái)自脂質(zhì)A的三?；Y(jié)構(gòu)單元。參考文獻(xiàn)24-26更詳細(xì)地進(jìn)行了描述。參考文獻(xiàn)26給出了OM-1745的化學(xué)式\(V瓜)因此，和天然脂質(zhì)A—樣，OM-174具有1,4'-二磷酸化的P(l—6)-連接的二葡糖胺主鏈，。OM-174可以與膠束HI結(jié)構(gòu)形成聚集體形式，即其中脂質(zhì)分子包裝時(shí)主鏈位于圓柱體表面上，而?；溝騼?nèi)，圓柱體本身包裝成六角形。可能不存在立體相。還可能不存在Hn相。氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物由于存在酰基鏈，氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)衍生物(如RC-529[27，28])是脂肪族佐劑。通常，這些衍生物可以為下述化學(xué)式[29]:其中-X代表軸向位置或徑向位置的氧或硫原子；-Y代表氧原子或NH基團(tuán)；-"n"、"m"、"p"和"q"相同或不同，為0-6的整數(shù)；-R,、R2和R3，其可以相同或不同，是含有l(wèi)-約20個(gè)碳原子的脂肪?；鶜埢渲?amp;、R2或R3之一任選為氫；-114和115相同或不同，是氫或甲基；-116和R7相同或不同，是氫、羥基、烷氧基、膦?；㈧ⅤＱ趸?、磺基、磺氧基、氨基、巰基、氰基、硝基、甲酰基或羧基以及它們的酯和酰胺；-118和119相同或不同，是膦?；驓?，優(yōu)選R8和/或R9中至少一個(gè)是膦?；＿B接于正常脂肪?；鶜埢?'立體發(fā)生中心的構(gòu)型是R或S，但優(yōu)選R。R4或R5連接的碳原子的立體化學(xué)可以是R或S。所有立體異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體，以及它們的混合物，都落入本發(fā)明范圍中。合適佐劑包括這些化合物的鹽。優(yōu)選的AGP化合物是'RC-529'，可如參考文獻(xiàn)30所述進(jìn)行制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>ER-112022各單體單元含有3個(gè)間接結(jié)合于磷酸二酯的不同脂肪族基團(tuán)。脂肪族基團(tuán)包含10碳醚鏈，結(jié)合于醚鏈的不飽和12碳酰氧基鏈，和與磷酸二酯連接得較近的14-碳|3-氧代-酰胺鏈。因此，與來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的天然產(chǎn)生的脂質(zhì)A相比，該化合物具有3個(gè)獨(dú)特特征(i)ER-112022不含環(huán)狀糖主鏈；(ii)其次，磷酸酯是摻入結(jié)構(gòu)主鏈界限內(nèi)的磷酸二酯，與大腸桿菌脂質(zhì)A上的磷酸酯不同；和(iii)結(jié)構(gòu)對(duì)稱(非糖主鏈上六個(gè)對(duì)稱分布的脂肪酸)。相似的有用化合物包括具有化學(xué)式XIV、XV或XVI的化合物，或其鹽XIVXVXVI如參考文獻(xiàn)32的定義，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、ER804058'、ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，例如鵬04057(XVI1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(XVIII)含有連接于含磷酸無(wú)環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物也可用作佐劑，如TLR4拮抗劑E5564[33,34]:表臓飾本發(fā)明的第一個(gè)方面基本避免了在抗原純化過(guò)程中采用表面活性劑，使得在本發(fā)明采用的抗原組分中未發(fā)現(xiàn)表面活性劑。然而，在第二個(gè)方面，采用表面活性劑，但相對(duì)于脂肪族佐劑其水平受到控制。表面活性劑一般是非離子型表面活性劑，特別是已用于疫苗制劑的表面活性劑。優(yōu)選有機(jī)表面活性劑。它們一般是環(huán)氧烷(如環(huán)氧乙垸)與脂肪醇、脂肪酸、垸基酚、烷基胺或含有至少一個(gè)活性氫原子的其它合適化合物的反應(yīng)產(chǎn)物。在大多數(shù)表面活性劑中，最常見(jiàn)的醇、胺和酸的碳鏈長(zhǎng)度為C8-C18。最常見(jiàn)的烷基酚是壬基酚和辛基酚。特別優(yōu)選含有聚(氧乙烯)殘基的表面活性劑。例如，可用于本發(fā)明的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，尤其是聚山梨酯20和聚山梨酯80;環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，商品名為DOWFAXTM，如直鏈EO/PO嵌段共聚物；辛苯聚糖，其中重復(fù)的乙氧基(氧-l,2-乙垸二基)數(shù)量可變，特別感興趣的是辛苯聚糖-9(TritonX-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，如三甘醇單月桂基醚(Brij30);和山梨聚糖酯(總稱為SPAN)，如山梨聚糖三油酸酯(Span85)和山梨聚糖單月桂酸酯。感興趣的兩種特定表面活性劑是TritonX-100和聚山梨酯20。因此，具體說(shuō)，本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式基本避免了采用這兩種非離子型表面活性劑，優(yōu)選基本避免采用任何非離子型表面活性劑。相似地，本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式采用了含有這兩種非離子型表面活性劑之一的抗原組分。本發(fā)明特別適合采用聚山梨酯20。已經(jīng)確定，這種表面活性劑能夠安全地施用于人，包括在疫苗中的應(yīng)用?？赏ㄟ^(guò)'HLB'(親水凍脂平衡)對(duì)表面活性劑進(jìn)行分類。本發(fā)明表面活性劑的HLB優(yōu)選為至少10、優(yōu)選至少15、更優(yōu)選至少16。在本發(fā)明的第二方面，為了避免將大劑量的表面活性劑施用于患者，該組合物中表面活性劑的濃度優(yōu)選應(yīng)不大于50嗎/ml，例如《0嗎/ml、^35昭/ml、$30嗎/ml、S25嗎/ml、S20嗎/ml、^15嗎/ml、^10嗎/ml、S5iig/ml等。優(yōu)選^20嗎/ml的濃度。綠本發(fā)明包括采用抗原。本發(fā)明特別適合使用通常采用表面活性劑純化的抗原。這些抗原一般為親脂性抗原。它們通常包含至少一個(gè)跨膜區(qū)，在體內(nèi)該跨膜區(qū)有將抗原定位于脂質(zhì)雙分子層中的功能，例如在病原體表面上。本發(fā)明特別適合采用病毒表面抗原。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，該抗原組分包含表面活性劑?？乖捅砻婊钚詣﹥?yōu)選為復(fù)合物形式，而非簡(jiǎn)單的抗原和表面活性劑混合物。抗原/表面活性劑復(fù)合物包含含抗原的表面活性劑-穩(wěn)定化的脂質(zhì)體和非離子體(niosome),它是由合成的非離子型兩性化合物形成的囊泡。優(yōu)選的抗原/表面活性劑復(fù)合物是在表面活性劑存在下純化的顆粒型乙型肝炎表面抗原。參考文獻(xiàn)35描述了重組HBsAg顆粒如何保留在其純化過(guò)程中采用的吐溫20(每100嗎HBsAg至多25嗎吐溫20)。因此，本發(fā)明第二方面采用的最優(yōu)選的抗原是乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原，它是基本呈球形顆粒的形式(平均直徑約為20nm)，包括含有磷脂和如聚山梨酯20等非離子型表面活性劑的脂質(zhì)基質(zhì)。在純化過(guò)程中可將非離子型表面活性劑摻入顆粒中。然而，在本發(fā)明的第一個(gè)方面，優(yōu)選的HBsAg形式是不用非離子型表面活性劑純化HBsAg的形式，以使HBsAg顆粒不摻入任何表面活性劑，從而避免了脂肪族佐劑的干擾。乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的已知物質(zhì)之一。HBV病毒顆粒由外部蛋白質(zhì)外殼或衣殼包圍的內(nèi)部核心組成，病毒核心含有病毒DNA基因組。衣殼的主要組分是稱為HBV表面抗原的蛋白質(zhì)，或者更常稱為是'HBsAg'，它一般是226個(gè)氨基酸的多肽，分子量為24kDa?，F(xiàn)有的所有乙型肝炎疫苗均含有HBsAg，當(dāng)這種抗原施用于正常疫苗接種者時(shí)，它能刺激產(chǎn)生抗HBsAg抗體，從而保護(hù)不受HBV感染。在疫苗生產(chǎn)中，可用兩種方式制備HBsAg。第一種方法包括由慢性乙型肝炎攜帶者血漿純化顆粒形式的抗原，因?yàn)樵贖BV感染過(guò)程中肝臟中合成了大量HBsAg并釋放至血流中。第二種方式包括通過(guò)重組DNA方法表達(dá)蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法中采用的HBsAg是在酵母細(xì)胞中重組表達(dá)的。合適的酵母包括酵母(&cc/zflra^ce力(如釀酒酵母(Xcewv&'ae))、畢赤酵母(尸/c/z/a)(如巴斯德畢赤酵母(/！pa^oW力)或漢遜酵母(/^"emw/a)(如多形漢遜酵母(/f.;o/;;mo^/^))宿主?；蛘撸梢杂弥亟M哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、Bu3細(xì)胞等)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(如采用桿狀病毒載體)或植物細(xì)胞表達(dá)該抗原。然而，通常采用酵母表達(dá)。酵母表達(dá)的HBsAg優(yōu)選為非糖基化的。與天然HBsAg(即血漿純化產(chǎn)物中的HBsAg)不同，酵母表達(dá)的HBsAg通常為非糖基化的，這是用于本發(fā)明的最優(yōu)選的HBsAg形式，因?yàn)樗哂懈呙庖咴?，還可以在沒(méi)有血液制品污染的風(fēng)險(xiǎn)的情況下制備。酵母表達(dá)的HBsAg顆?？砂字＜〈迹@在天然HBV病毒體中是沒(méi)有的。該顆粒還可包含無(wú)毒劑量的LPS，以刺激免疫系統(tǒng)[36]。純化HBsAg的許多方法是本領(lǐng)域所熟知的(例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)37-62)。在這些方法中，本發(fā)明的第一個(gè)方面采用了未使用非離子型表面活性劑的方法。相反，本發(fā)明的第二個(gè)方面在純化中采用了非離子型表面活性劑，以使表面活性劑摻入最終顆粒HBsAg產(chǎn)物中。在純化開(kāi)始時(shí)破壞重組酵母細(xì)胞的過(guò)程中，優(yōu)選采用聚山梨酯20，以將表面活性劑引入HBsAg顆粒。在破壞細(xì)胞后，優(yōu)選的HBsAg純化方法包括超濾；大小排阻色譜；陰離子交換色譜；超速離心；脫鹽；和過(guò)濾除菌。破壞細(xì)胞(例如用聚乙二醇破壞)后可沉淀裂解物，將HBsAg留在溶液中，準(zhǔn)備進(jìn)行超濾。在過(guò)濾除菌之前或之后，可能通過(guò)甲醛處理穩(wěn)定HBsAg顆粒。隨后可通過(guò)超濾或?qū)游鋈コ嘤嗟募兹?。還可采用過(guò)濾除菌。HBsAg優(yōu)選來(lái)自HBV亞型adw2。除'S'序列以外，表面抗原可包含所有或一部分前-S序列，如所有或一部分前-Sl和/或前-S2序列?？捎糜诒景l(fā)明的其它病毒表面抗原通常是來(lái)自包膜病毒的包膜糖蛋白。用于本發(fā)明的病毒表面抗原可包括但不限于-逆轉(zhuǎn)錄病毒科蛋白。逆轉(zhuǎn)錄病毒科包括慢病毒屬和泡沫病毒屬。感興趣的病毒包括HTLV-I、HTLV-II、貓免疫缺陷病毒(FFV)、人體免疫缺陷病毒(HIV，包括HIV-I和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、黑猩猩泡沫病毒和人泡沬病毒。-副粘病毒科蛋白，如F蛋白。副粘病毒科包括(a)副粘病毒亞科，其包括副粘病毒屬、腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬，以及(b)肺炎病毒亞科，其包括肺炎病毒屬。感興趣的病毒包括副流感病毒(PIV)、人副粘病毒、牛瘟病毒、小反芻獸疫病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、立百病毒、亨得拉病毒、馬麻疹病毒(EMV)、狂犬病病毒和梅那格病毒(Menanglevirus)。-線狀病毒科蛋白。線狀病毒科包括馬爾堡病毒屬和埃博拉病毒屬。-冠狀病毒科的突起糖蛋白。冠狀病毒科包括冠狀病毒屬和環(huán)狀病毒屬。感興趣的病毒包括人冠狀病毒(包括SARS冠狀病毒)、禽傳染性支氣管炎病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、鼠肝炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬紅細(xì)胞凝集型腦脊髓炎病毒、豬傳染性腸胃炎病毒和皮蠅病毒。-桿狀病毒科蛋白，如G蛋白。桿狀病毒科包括桿狀病毒屬、水泡病毒屬、狂犬病病毒屬、短時(shí)熱病毒屬、質(zhì)型彈狀病毒屬和核型彈狀病毒屬。感興趣的病毒包括水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、莫科拉病毒、牛一日熱病毒。-披膜病毒科蛋白。披膜病毒科包括a病毒和風(fēng)疹病毒。感興趣的病毒包括辛德畢斯病毒、東方和西方腦炎病毒、塞姆利基森林病毒、風(fēng)疹病毒、奧拉病毒、巴伴克病毒(Babankivirus)、巴馬(Barmah)森林病毒avis-A、貝巴魯病毒、巴基克里克病毒(BuggyCreekvirus)、基孔肯雅病毒、沼澤地病毒、摩根堡病毒、格塔病毒、高地J病毒、科茲拉病毒(Kyzylagachvims)、馬亞羅病毒、米德?tīng)柋げ《?、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奧科伯病毒(Ockelbovirus)、奧絨絨病毒、皮春納病毒、羅斯河病毒、鷺山病毒、烏納病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒和沃達(dá)羅河病毒。-黃病毒科的包膜('E')糖蛋白。黃病毒科包括黃病毒屬、鼠疫病毒屬和丙型肝炎病毒屬。感興趣的病毒包括登革熱病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒、圣路易斯腦炎病毒、牛腹瀉病毒和蜱媒腦炎(TBE)病毒。-本揚(yáng)病毒科蛋白。本揚(yáng)病毒科包括本揚(yáng)病毒屬、內(nèi)羅病毒屬、白蛉病毒屬、漢他病毒屬和番茄斑萎病毒屬(Tospovims)。感興趣的病毒包括本揚(yáng)病毒、布尼亞病毒、加州腦炎病毒、拉克錫病毒(LaCrossvirus)、漢坦病毒、辛諾柏病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、白蛉熱西西里島病毒和裂谷熱病毒。-沙粒病毒科蛋白。沙粒病毒科包括；淋巴細(xì)胞性絨毛膜腦膜炎病毒、伊派病毒和拉沙病毒。-肝脫氧核糖核酸病毒科蛋白(包括HBsAg)。肝脫氧核糖核酸病毒科包括正肝脫氧核糖核酸病毒屬和鳥(niǎo)類肝脫氧核糖核酸病毒屬。除人乙型肝炎病毒外，此病毒科還包括地松鼠乙型肝炎病毒屬、旱獺乙型肝炎病毒屬、毛猴乙型肝炎病毒屬、北極松鼠肝炎病毒屬、鴨乙型肝炎病毒屬、蒼鷺乙型肝炎病毒屬和羅斯鵝乙型肝炎病毒屬。-皰疹病毒科蛋白。皰疹病毒科包括單純皰疹病毒屬、水痘病毒屬、玫瑰疹病毒屬、巨細(xì)胞病毒屬、鼠巨細(xì)胞病毒屬、淋巴隱病毒屬和拉地諾病毒屬(Rhadinovirus)。感興趣的病毒包括如單純皰疹病毒(HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6(HHV6)、人皰疹病毒7(HHV7)和人皰疹病毒8(HHV8)等人皰疹病毒。合適的抗原可選自gB、gC、gD和gH糖蛋白(如HSV中的糖蛋白)。特別優(yōu)選HSVgD2。-正粘病毒科蛋白。正粘病毒科包括流感病毒屬和索戈托病毒屬。優(yōu)選來(lái)自流感病毒屬(A、B或C型流感病毒)的抗原，包括表面抗原血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)。一般用表面活性劑純化這些病毒表面抗原，因此抗原組分可包含表面活性劑，特別是如果以含脂質(zhì)的顆粒形式存在時(shí)。本發(fā)明也可采用基于含有病毒表面抗原和異源抗原的雜交或融合蛋白的顆?？乖?。例如，已知將HBsAg序列與異源抗原融合，以便利用HBsAg的能力組裝成顆粒。例如，參考文獻(xiàn)63報(bào)道了HIV-1gpl20與HBsAg的融合物，以得到自發(fā)組裝成顆粒狀的蛋白質(zhì)，其顆粒大小和密度與天然HBsAg顆粒類似，其中脂質(zhì)組成約占25%且每個(gè)顆粒含有約100個(gè)gpl20。gpl20能夠在融合物中折疊成其天然構(gòu)象，并保持其生物學(xué)活性。相似地，通過(guò)與HBsAg形成內(nèi)部融合物可改進(jìn)HIVgp41表位，融合蛋白在酵母中自身組裝成22nm脂蛋白顆粒[64]。還可將此方法用于瘧疾疫苗。參考文獻(xiàn)65報(bào)道，將來(lái)自瘧疾gpl90抗原的至多61aa的表位插入HBsAg序列中，表達(dá)的雜交顆?？稍趧?dòng)物中引發(fā)抗-gp190的免疫應(yīng)答。參考文獻(xiàn)66報(bào)道了一種蛋白質(zhì)，該蛋白中含有16個(gè)重復(fù)的環(huán)孢子體蛋白的4單元序列與HBsAg—起作為融合蛋白表達(dá)。參考文獻(xiàn)67報(bào)道，在酵母中產(chǎn)生由Pfs16與HBsAg融合組成的病毒樣顆粒。參考文獻(xiàn)68公開(kāi)了環(huán)孢子體蛋白融合于HBsAg的雜交抗原。參考文獻(xiàn)69公開(kāi)了間日瘧原蟲(chóng)(/>v/wx)的裂殖子表面1蛋白的C末端區(qū)域的融合物，它形成了20-45nm大小的免疫原性顆粒。因此，以自身組裝顆粒形式用HBsAg遞呈瘧疾抗原，是本領(lǐng)域所熟知的。因此，本發(fā)明可采用含有病毒表面抗原和異源抗原的雜交抗原。異源抗原可以插入病毒表面抗原序列中，或者可融合于病毒表面抗原序列的N末端或C末端。如果天然病毒表面抗原可裝配成顆粒(如HBsAg)，那么插入或融合都不會(huì)阻礙這種裝配。在這些雜交蛋白中，異源抗原可來(lái)自細(xì)菌、真菌、寄生物、病毒(但限定異源抗原不是HBsAg)等。雜交蛋白中可包含完整的異源抗原，但更常見(jiàn)是包含該抗原的抗原性片段。具體說(shuō)，當(dāng)病毒表面抗原是HBsAg時(shí)，異源抗原可來(lái)自HIV、惡性瘧原蟲(chóng)(尸/oswotZ/ww/a/c^fln/m)、間曰培原蟲(chóng)(尸/asmod/wmv/vax)、三曰癥原蟲(chóng)(尸/au7^od/wwwfl/an'fle)或卵形瘧原蟲(chóng)(尸/aymo&wmova/e)。適用于制備HBsAg雜交體的HIV抗原包括包膜糖蛋白gpl20或其抗原性片段[63]。適用于制備HBsAg雜交體的惡性瘧原蟲(chóng)抗原可基于環(huán)孢子體表面抗原("CSP")的亞基，例如它們可包含3-20個(gè)重復(fù)的NANP基序(SEQIDNO:2)，和/或它們可包含CSP的C-末端區(qū)域(但一般不含C末端的最后12個(gè)氨基酸)。例如，本發(fā)明可采用稱為"RTS"的抗原，該抗原含有來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的NF54或7G8分離物的CSP的大部分C末端(氨基酸210-398，其包含19個(gè)NANP重復(fù)序列和氨基酸367-390處的T細(xì)胞表位區(qū))，它通過(guò)HBsAg前S2部分的四個(gè)氨基酸與HBsAg的N末端融合。在酵母中表達(dá)時(shí)，RTS形成除蛋白質(zhì)外還含有脂質(zhì)(主要是磷脂)的顆粒。因此，RTS的序列可含有:(i)N末端甲硫氨酸殘基；(ii)Met-Ala-Pro;(iii)對(duì)應(yīng)于惡性瘧原蟲(chóng)7G8的CS蛋白的氨基酸210-398或惡性瘧原蟲(chóng)NF54的CS蛋白的氨基酸207-395的189個(gè)氨基酸；(iv)Arg或GIy;(v)來(lái)自乙型肝炎前-S2蛋白的Pro-Val-Thr-Asn;和(vi)HBsAg。來(lái)自7G8分離物的全長(zhǎng)RTS的序列如參考文獻(xiàn)70的SEQIDNO:1所示(也參見(jiàn)參考文獻(xiàn)71的圖5):MKAPDPNAM隨NP隱P睡PNA固ANP織NPNANP,P,P麵P關(guān)PMANP畫(huà)P麵P國(guó)PNA,ANPNANP麵NQGNGQG酬P(guān)NDPNRIWDEN,NAV,NNEEPS,IEQYL隨陽(yáng)ISTEWSPCSVTCG隨Q額KPGSA,K亂DYE咖E眼CKMEKCSSVF,隨PVT,E陽(yáng)SGFlJ3PLLAflLQAGFFLLTRILTIPQSLOSWWTSLNFLGGSPVCXGQNSQSFrS,PTSCPPICPCiY咖MCLR固肌FILXlXU:FU^LLDYQG亂PVCPLIPGSTTTNTCPCKTCTTPAQGWSMFPSCCCTKPTDGNCTClPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVqWFvglsptvwlsa應(yīng)mwywgpslysivspfipllpi:ffclwvyif卿膨"該雜交蛋白可以采用編碼SEQIDNO:l的序列在酵母中表達(dá)。優(yōu)選雜交蛋白與正常HBsAg在酵母中共同表達(dá)。以前，這種方法過(guò)去已經(jīng)用于RTS，共同表達(dá)的產(chǎn)物稱為"RTS,S"?？梢圆捎肦TS:S比例為約1:4。優(yōu)選在釀酒酵母(51.cem^'ae)中表達(dá)，所用質(zhì)粒含有編碼所述雜交蛋白的序列，并包含(1)來(lái)自甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的上游啟動(dòng)子，用于控制編碼序列的表達(dá)；和(2)該編碼序列下游的ARG3轉(zhuǎn)錄終止子。該質(zhì)粒一般還包含(3)LEU2選擇性標(biāo)記物；(4)2p質(zhì)粒序列；和(5)在大腸桿菌(」&cAer/c/z/flco//)中有功能的復(fù)制起點(diǎn)。RTS，S可與如血小板反應(yīng)蛋白-相關(guān)性無(wú)名蛋白(TRAP)等其它瘧疾抗原聯(lián)用。與RTS,S聯(lián)用的優(yōu)選脂肪族佐劑包括水包油乳劑、3d-MPL和QS-21皂苷。微縦鄉(xiāng)表臓絲微激在本發(fā)明的第二方面，組合物中脂肪族佐劑與抗原的表面活性劑的重量比小于1000:1。在MF59佐劑中，該重量比基于鯊烯含量。在抗原組分中含有0.1pg/ml表面活性劑的組合物中，鯊烯濃度小于100jig/ml。在抗原組分中含有l(wèi)pg/ml表面活性劑的組合物中，鯊烯濃度小于1mg/ml。在抗原組分中含有10pg/ml表面活性劑的組合物中，鯊烯濃度小于10mg/ml，而在以MF59為佐劑的典型組合物中鯊烯濃度應(yīng)為43mg/ml(即4300:1)。在3D-MPL佐劑中，重量比基于3D-MPL的總量，即包括可能存在的所有不同的?；问?。在抗原組分中含有O.l^ig/ml表面活性劑的組合物中，3D-MPL總濃度小于100pg/ml。在抗原組分中含有1pg/ml表面活性劑的組合物中，3D-MPL總濃度小于1mg/ml。1000:1的比值為最大值。為了進(jìn)一步降低佐劑中油和抗原中表面活性劑之間干擾的可能性，可降低該比值。因此，該比值可《00:1、，0:1、$300:1、《00:1、，0:1、《0:1，或者甚至《5:1。比值^100:1時(shí)，抗原組分中含有10pg/ml表面活性劑的組合物中，油含量(如鯊烯或3D-MPL含量)可以^1mg/ml。比值^25:1時(shí)，抗原組分中含有10pg/ml表面活性劑的組合物中，油含量(如鯊烯或3D-MPL含量)可以250pg/ml;相反，含有100ng/ml3D-MPL的組合物中，其抗原部分含有不小于4pg/ml的表面活性劑。該比例優(yōu)選大于1.5:1，例如S:1、22.5:1、^3:1、24:1、$5:1或更高。在3D-MPL中，優(yōu)選比例為2.5:1-25:1，更優(yōu)選為2.5:1-10:1，進(jìn)一步更優(yōu)選為2.5:1-5:1。因此，抗原組分中含有10嗎/ml表面活性劑的組合物中，3D-MPL含量應(yīng)該為25嗎/ml-250嗎/ml，優(yōu)選為25嗎/ml-100嗎/ml，更優(yōu)選為25嗎/ml-50(ig/ml;相反，含有100嗎/ml3D-MPL的組合物中，抗原中表面活性劑含量應(yīng)該為4嗎/ml-40|ig/ml，優(yōu)選為10|ig/ml-40pg/ml，更優(yōu)選為20pg/ml-40pg/ml。棘嚴(yán)微會(huì)激除了含有抗原和脂肪族佐劑(在第二個(gè)方面，低水平的表面活性劑)外，本發(fā)明組合物可含有載體、佐劑、賦形劑、緩沖液等，如下面進(jìn)一步詳述。這些非抗原性組分可以有各種來(lái)源。例如，它們可存在于生產(chǎn)過(guò)程中使用的抗原或佐劑材料之一中，或者可與這些組分分開(kāi)加入。優(yōu)選的本發(fā)明組合物包含一種或多種藥學(xué)載體和/或賦形劑。為了控制張力，優(yōu)選含有生理鹽，如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其濃度可以是1-20mg/ml。組合物的滲透壓通常為200mOsm/kg-400mOsm/kg，優(yōu)選為240-360mOsm/kg，更優(yōu)選屬于280-320mOsm/kg的范圍。以前報(bào)道，滲透壓不會(huì)影響疫苗接種引起的疼痛[72]，但仍然優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。本發(fā)明組合物可包含一種或多種緩沖液。典型的緩沖液包含磷酸鹽緩沖液；Tris緩沖液；硼酸鹽緩沖液；琥珀酸鹽緩沖液；組氨酸緩沖液；或檸檬酸鹽緩沖液。緩沖液一般為5-50mM，優(yōu)選5-20mM。本發(fā)明組合物的pH通常為5.0-7.5，更一般為5.0-6.0以達(dá)到最佳穩(wěn)定性，或者為6.0-7.0。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝到制劑容器之前調(diào)整散裝疫苗的pH的步驟。含有白喉和破傷風(fēng)類毒素的疫苗的pH優(yōu)選^6，以避免類毒素(尤其是白喉類毒素)毒性逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，因此含有類毒素和HBsAg抗原的疫苗的pH優(yōu)選為6.0-7.0。對(duì)包含單價(jià)HBsAg的其它疫苗而言，可以接受pIK6。本發(fā)明組合物優(yōu)選為無(wú)菌組合物。本發(fā)明組合物優(yōu)選為無(wú)熱原組合物，例如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)衡量)，優(yōu)選每劑量O.IEU。本發(fā)明組合物優(yōu)選為無(wú)谷蛋白的組合物。如采用吸附的HBsAg時(shí)，最終的疫苗產(chǎn)品可能是外觀混濁的懸液。這種外觀意味著，不容易觀察到微生物污染，因此，所述疫苗優(yōu)選含有抗微生物劑。當(dāng)疫苗包裝到多劑量容器中這特別重要。優(yōu)選包含的防腐劑是2-苯氧基乙醇和/或硫柳汞。然而，在本發(fā)明方法中推薦不采用含汞防腐劑，盡管在許多現(xiàn)有HBV疫苗中都有硫柳汞。然而，出于安全性考慮，優(yōu)選最終組合物含有小于約25ng/ml汞。更優(yōu)選地，最終疫苗產(chǎn)品不能檢測(cè)到含有硫柳汞。本發(fā)明方法中，通常在將抗原制劑加入之前去除抗原制劑中的含汞防腐劑，或在制備用于生產(chǎn)該組合物的組分的過(guò)程中避免采用硫柳汞，從而實(shí)現(xiàn)上述目的?？蓪?duì)HBsAg進(jìn)行透析(例如含有半胱氨酸)，以去除可能在HBsAg制備過(guò)程中采用的如硫柳汞等任何含汞防腐劑[73，74]。在生產(chǎn)過(guò)程中，通常用WFI(注射用水)將組分稀釋到所需最終濃度。本發(fā)明組合物中任何磷酸鋁的濃度(以A產(chǎn)的形式表示)優(yōu)選小于5mg/ml，例如$4mg/ml、$3mg/ml、$2mg/ml、$1mg/ml等。本發(fā)明組合物中HBsAg的濃度優(yōu)選小于100嗎/ml，例如^90嗎/ml、$80pg/ml、S70嗎/ml、鄰嗎/ml、，fig/ml、S55jig/ml、^50fxg/ml、鄰pg/ml、，pg/ml等。一般約40)ig/ml或約20昭/ml的濃度。本發(fā)明組合物優(yōu)選以0.5ml劑量施用于患者。應(yīng)理解，0.5ml劑量包括正常差異，例女B0.5ml±0.05ml。本發(fā)明可提供適合包裝成單獨(dú)劑量的散裝材料，所述單獨(dú)劑量可銷售給患者使用。上述濃度是通常最終包裝劑量中的濃度，因此散裝疫苗中的濃度可能更高(例如，可通過(guò)稀釋降低到終濃度)。本發(fā)明組合物通常為水性形式。包裝本發(fā)明組合物混合所述抗原和佐劑后，本發(fā)明方法可包括取出0.5ml混合物樣品并包裝到容器中的步驟。在多劑量情況下，取出多個(gè)劑量并包裝到單個(gè)容器中。如上所述，在另一種安排下，所述抗原和佐劑分開(kāi)包裝，在臨用前臨時(shí)混合。本發(fā)明方法可包括將疫苗包裝到容器中待用的額外步驟。合適容器包括藥瓶和一次性注射器(優(yōu)選無(wú)菌注射器)。當(dāng)本發(fā)明組合物包裝到藥瓶中時(shí)，它們優(yōu)選由玻璃或塑料制成。優(yōu)選在加入所述無(wú)菌組合物之前對(duì)所述藥瓶進(jìn)行無(wú)菌處理。為了避免乳膠-敏感型患者的問(wèn)題，優(yōu)選用無(wú)乳膠塞密封所述藥瓶。藥瓶可包含單個(gè)劑量的疫苗，或者可包含一個(gè)以上劑量('多劑量'藥瓶)，例如10個(gè)劑量。采用多劑量藥瓶時(shí)，應(yīng)在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下用無(wú)菌針頭和注射器抽出各個(gè)劑量，小心避免污染藥瓶?jī)?nèi)容物。優(yōu)選藥瓶由無(wú)色玻璃制成。藥瓶可以有配合的帽(如針頭鎖接(Luerlock))，以便將預(yù)填充的注射器插入帽中，可將注射器內(nèi)容物注入藥瓶中，，然后將藥瓶?jī)?nèi)容物抽回注射器中。從藥瓶上取下注射器后，連接針頭，將該組合物施用于患者。帽優(yōu)選位于某密封物或覆蓋物內(nèi)，使得在進(jìn)入該帽前，必須去除該密封物或覆蓋物。優(yōu)選將組合物包裝到注射器中，注射器通常不連有針頭，但也可提供單獨(dú)的針頭，以便與注射器組裝和一起使用。優(yōu)選安全針頭。一般是l-英寸23-號(hào)、1-英寸25-號(hào)和5/8-英寸25-號(hào)針頭。注射器可裝有剝離型標(biāo)簽紙，上面打印著內(nèi)容物的批號(hào)和過(guò)期日期，以幫助保存記錄。注射器的活塞優(yōu)選帶有抑止裝置，以防止該塞子在抽吸過(guò)程中意外脫落。優(yōu)選丁基橡膠活塞抑止裝置。該注射器可帶有乳膠橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。該注射器通常帶有尖端帽，以便在連接針頭之前密封尖端，尖端帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果分開(kāi)包裝注射器和針頭，那么該針頭優(yōu)選裝入丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選灰色丁基橡膠。優(yōu)選的注射器是商品名為"Tip-Lok"TM的注射器。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用硼硅玻璃而非鈉鈣玻璃制成的容器。將組合物包裝到容器中后，將該容器封裝到如紙板箱等箱子內(nèi)進(jìn)行銷售，該箱子標(biāo)有疫苗的詳情，如商品名、疫苗中抗原的列表(例如'乙型肝炎重組物'等)、容器說(shuō)明(例如'一次性預(yù)填充替普錄克(Tip-Lok)注射器'或'lOx0.5ml單劑量藥瓶')、其劑量(例如'各自含有一個(gè)0.5ml劑量')、警告(例如'僅限成年人使用'或'僅限兒童使用')、過(guò)期日期、適應(yīng)癥(例如'對(duì)年齡大于15歲的腎功能不全(包括血液透析前和血液透析)患者對(duì)所有已知亞型引起的乙型肝炎病毒(HBV)感染產(chǎn)生主動(dòng)免疫'等)、專利號(hào)等。各箱子可含有一個(gè)以上的包裝疫苗，例如五個(gè)或十個(gè)包裝疫苗(具體是藥瓶)。如果疫苗包含在注射器中，那么該箱子可顯示注射器的圖片。該疫苗可與宣傳單一起銷售(例如在同一個(gè)箱子中)，所述宣傳單包括疫苗詳情，例如給藥說(shuō)明書(shū)、疫苗內(nèi)的抗原詳情等。說(shuō)明書(shū)還可含有警告，例如準(zhǔn)備腎上腺素溶液，以預(yù)防注射疫苗后的過(guò)敏反應(yīng)等。包裝疫苗優(yōu)選儲(chǔ)存于2'C-8T:。不應(yīng)冷凍。潛伊微艦赫灘本發(fā)明組合物適合施用于人類患者，本發(fā)明提供了引起患者免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將本發(fā)明組合物施用于患者的步驟。本發(fā)明還提供了用于藥物的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供了(i)在不存在表面活性劑的情況下基本純化的抗原和(ii)脂肪族佐劑，在生產(chǎn)施用于患者的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了(i)包含表面活性劑的抗原組分和(ii)脂肪族佐劑在生產(chǎn)施用于患者的藥物中的應(yīng)用，其中(ii)中所述脂肪族佐劑與(i)中所述表面活性劑的重量比小于1000:1。本發(fā)明免疫原性組合物優(yōu)選為疫苗，例如用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎病毒感染的疫苗。在第一次免疫6周后測(cè)定，接受本發(fā)明組合物的患者的血清抗-HBsAgGM效價(jià)優(yōu)選2500mlU/ml。更優(yōu)選地，12個(gè)月后測(cè)定時(shí)，該效價(jià)SOOmlU/ml。該組合物特別適用于現(xiàn)有含佐劑疫苗(如ENGERIXBTM產(chǎn)品)無(wú)效的患者，以保護(hù)其免于感染乙型肝炎病毒和/或治療其乙型肝炎病毒感染。該組合物特別適合的患者亞群包括免疫削弱患者；血液透析患者；血液透析前患者；腎功能不全患者；腎衰竭患者；需要血液透析之前的早期腎衰竭患者；等待肝移植(例如在排隊(duì)名單中)的患者；末期腎衰竭患者；己接受器官移植(特別是肝移植)的患者，例如第一次施用本發(fā)明疫苗之前6個(gè)月接受器官移植的患者；正在接受(或已接受，例如在第一次施用本發(fā)明疫苗前6個(gè)月)乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)治療的患者；HLADQ2單體型患者[75];HLADR3單體型患者[75];HLADR7單體型患者[75];具有HLA等位基因DQB1*0202的患者[76];感染HIV的患者；慢性HBV攜帶者；最近接受輸血的患者；接受免疫抑制藥物的患者；AIDS患者；有腹水的患者；硬化癥患者；腦病患者；接受干擾素特別是ifn-a治療的患者；吸煙患者；吸雪茄煙的患者；體重指數(shù)^30kg/m2的患者；和接受HBsAg疫苗但沒(méi)有發(fā)生血清轉(zhuǎn)變的患者(例如，標(biāo)準(zhǔn)的初步給藥方案，如施用3劑ENGERIXBTM后他們的血清抗-HBsAg效價(jià)<10mlU/ml)。這些患者肌酸酐清除率可能小于30ml/min(正常健康范圍是男性100-140ml/min，女性90-130ml/min)。患者優(yōu)選至少15歲，例如15-40歲、15-60歲、40-60歲、或者甚至超過(guò)60歲。年齡超過(guò)55歲的患者無(wú)論存在任何疾病，均可有用地治療。本發(fā)明組合物可通過(guò)肌肉內(nèi)注射來(lái)施用，例如三角肌內(nèi)注射。當(dāng)本發(fā)明組合物包含鋁基佐劑時(shí)，組分可能在儲(chǔ)存期間沉淀下來(lái)。因此，在施用于患者前，應(yīng)將該組合物搖勻。搖勻的組合物是混濁的白色懸液。本發(fā)剪汰選灘艦欺制備免疫原性組合物的優(yōu)選方法包括以下步驟混合(i)包含聚山梨酯20的HBsAg組分和(ii)含有吸附于磷酸鋁的3D-MPL的佐劑組分，得到3D-MPL與聚山梨酯20的重量比小于1000:1的組合物。優(yōu)選的免疫原性組合物是滿足以下條件的組合物(a)該組合物包含HBsAg、聚山梨酯20、3D-MPL和磷酸鋁佐劑；和(b)3D-MPL與聚山梨酯20的重量比小于1000:1。3D-MPL和HBsAg優(yōu)選吸附于磷酸鋁。HBsAg濃度為約40|iig/ml。3D-MPL濃度為約100Hg/ml。A產(chǎn)濃度為約1mg/ml。本發(fā)明的另一種優(yōu)選組合物包含(i)由釀酒酵母(S.cerev&ae)純化的HBsAg，禾叩i)含有磷酸鋁和3D-MPL的混合物的佐劑。HBsAg濃度為約40pg/ml。3D-MPL濃度為約100pg/ml。A產(chǎn)濃度為約1mg/ml。HBsAg包含聚山梨酯20，油:表面活性劑重量比(即3D-MPL:聚山梨酯20重量比)為2.5:1-100:1，即聚山梨酯20的濃度為1嗎/ml-40嗎/ml(即每100嗎HBsAg含有2.5昭-100嗎聚山梨酯20)。該比例優(yōu)選為2.5:1-25:1，即聚山梨酯20的濃度為4pg/ml-40嗎/ml。3D-MPL和HBsAg均吸附于磷酸鋁。撒遂術(shù)語(yǔ)"含有"包括"包含"以及"由…組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。術(shù)語(yǔ)"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。必要時(shí)，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語(yǔ)"基本上"。術(shù)語(yǔ)"約"與數(shù)值x平均值相關(guān)，例如x土ioy。。除非另有說(shuō)明，包括混合兩種或多種組分的步驟的方法不需要任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時(shí)，兩種組分可以先相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。如上所述，各組分可以在生產(chǎn)過(guò)程中混合，或臨用前混合。將抗原描述為"吸附"于佐劑時(shí)，優(yōu)選至少50%(重量比)的該抗原被吸附，例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或更多。優(yōu)選的是，HBsAg完全吸附，即上清液中檢測(cè)不到。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)中使用動(dòng)物源(特別是牛)材料時(shí)，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)、特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來(lái)源。丁基橡膠包括氯丁基橡膠和溴丁基橡膠。應(yīng)理解，可離子化基團(tuán)可以本文化學(xué)式中所示的中性形式存在，或者可以帶電形式存在，這取決于pH。因此，磷酸基團(tuán)可以寫(xiě)作-P-0-(OH)2，此化學(xué)式僅代表中性磷酸基團(tuán)，本發(fā)明還包括其它帶電形式。相似地，糖環(huán)可以開(kāi)放或閉合的形式存在，雖然本文結(jié)構(gòu)式中顯示了閉合形式，但本發(fā)明還包括開(kāi)放形式。本發(fā)明的實(shí)施方式研究了三種不同HBsAg制劑在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)、用非離子型表面活性劑純化的HBsAg。在漢遜酵母(Z/fl"e"w/a)細(xì)胞中表達(dá)，用非離子型表面活性劑純化的HBsAg。在CHO細(xì)胞中表達(dá)、含前S2序列、不用表面活性劑純化的HBsAg。研究了兩種不同佐劑氫氧化鋁(lmg/ml)用檸檬酸鹽緩沖液配制的MF59(13mM)制備六種制劑，各自含有20pg/mlHBsAg，0.15MNaCl和0.01%硫柳滎(merthiolate):<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>已報(bào)道，MF59能提高靈長(zhǎng)動(dòng)物對(duì)重組HBsAg的抗體應(yīng)答[77]。用制劑A-D免疫非洲綠猴。每組6只猴子在第0天和第28天接受肌肉內(nèi)免疫。在時(shí)間0點(diǎn)采血，然后每2周采血一次，直到第8周，用ELISA測(cè)定抗-HBsAg效價(jià)(GMT)。將各組第M天的效價(jià)值標(biāo)準(zhǔn)化至l.O，標(biāo)準(zhǔn)化后的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>觀察第42天和第56天效價(jià)，這些數(shù)據(jù)顯示，對(duì)CHO-表達(dá)抗原，MF59佐劑能比鋁佐劑更顯著地提高了效價(jià)(第42天分別提高160倍與20倍)，但漢遜酵母表達(dá)抗原的情況正好相反(第42天分別提高85倍與110倍)。采用制劑B、E和F以狒狒進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)。在第一次注射14天后測(cè)定相對(duì)于F組值的GMT值，如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>對(duì)F組數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的結(jié)果如下因此，與小鼠相反，對(duì)釀酒酵母-表達(dá)的HBsAg而言，在靈長(zhǎng)動(dòng)物中用MF59作為佐劑導(dǎo)致GMT值和應(yīng)答者水平顯著下降。最終，在血清陽(yáng)性反應(yīng)的非洲綠猴中檢測(cè)用制劑E和F加強(qiáng)免疫接種產(chǎn)生的GMT提高。在加強(qiáng)免疫前和加強(qiáng)免疫28天后測(cè)定效價(jià)，效價(jià)提高如下<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>除了比氫氧化鋁佐劑引起的提高倍數(shù)低以外，施用加強(qiáng)免疫劑量28天后，MF59產(chǎn)生的GMT值也較低。因此，總體來(lái)看，與氫氧化鋁相比，在靈長(zhǎng)動(dòng)物中對(duì)酵母表達(dá)的HBsAg而言MF59似乎是較差的佐劑，但對(duì)CHO-表達(dá)的HBsAg而言是較佳的佐劑。這些結(jié)果可解釋為(a)由酵母純化的HBsAg中殘留的表面活性劑和(b)MF59佐劑中的過(guò)量鯊烯油之間的相互作用。作為油，鯊烯在水性條件下與表面活性劑相作用，反之亦然，建議抗原中的表面活性劑與佐劑中的油不相容?？稍诓挥萌ノ蹌┑那闆r下純化HBsAg(例如，在CHO-表達(dá)材料中)，或保證油的過(guò)量程度不至于干擾抗原中的表面活性劑，從而解決這種不相容性。在以MF59為佐劑的HBsAg組合物中，將一體積的MF59與一體積的抗原溶液混合。因此，在100ml體積中，含有50mlMF59和50mlHBsAg溶液。此100ml含有2.15g來(lái)自MF59的鯊烯，HBsAg濃度為40嗎/ml，它含有2mgHBsAg。每100嗎HBsAg中聚山梨酯20濃度為25嗎[35]時(shí)，這100ml含有0.5mg聚山梨酯20。以MF59為佐劑的疫苗中油:表面活性劑比例一般是4300:1。通過(guò)將過(guò)量的油減少到小于1000:1，可大大降低佐劑中油和抗原中表面活性劑的相互作用，從而減少干擾。應(yīng)理解，僅以舉例方式描述了本發(fā)明，可以在不超出本發(fā)明范圍和構(gòu)思的情況下進(jìn)行修改。參考文獻(xiàn)(將其內(nèi)容納入本文作參考)[1]VaccineAdjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols(疫苗佐齊U:制備方法和研究方案)(MethodsinMolecularMedicineseries(分子藥物叢書(shū))第42巻)。ISBN:1-59259-083-7。O'Hagan編輯。[2]VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach(疫苗設(shè)計(jì)亞基禾口佐齊U方法)(Powell和Newman編)PlenumPress(普蘭出版社)1995(ISBN0-306-44867-X)。[3]WO90/14837。[4]Podda和DelGiudice(2003)ExpertRevVaccine2:197-203。[5]美國(guó)專利第6,299,884號(hào)。[6]美國(guó)專利第6,451,325號(hào)。[7]Allison和Byars(1992)ResImmunol143:519-25。[8]Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9。[9]WO95/11700。[10]美國(guó)專利第6,080,725號(hào)。11]WO2005/097181。12]英國(guó)專利申請(qǐng)第GB-A-2220211號(hào)。13]Myers等(1990)Cellularandmolecularaspectsofendotoxinreactions(內(nèi)毒素反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制)，第145-156頁(yè)。14〗Ulrich(2000)參考文獻(xiàn)1的第16章(第273-282頁(yè))。15]Johnson等(1999)JMedChem42:4640-9。16]Baldrick等(2002)RegulatoryToxicolPharmacol35:398-413。17〗WO94/21292。18]WO94/00153。19]WO97/01640/20]W096/26741。21]WO93/19780。22]美國(guó)專利第6,375,945號(hào)。23]WO00細(xì)62。24]Meraldi等(2003)Vaccine21:2485-2491。25]Pajak等(20(B)Vaccine21:836-842。26]Brandenburg等(2000)EurJBiochem267:3370-7。27]Johnson等(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278。28]Evans等(2003)ExpertRevVaccine2:219-229。29]美國(guó)專利第6,764,840號(hào)。30]美國(guó)專利申請(qǐng)第2005/0107600號(hào)。31]Lien等(2001)JBiol.Chem276:1873-80。32]WO03/011223。33]Wong等(2003)JClinPharmacol43(7):735-42。34]US2005/0215517。35]Costa等(1997)Rev.Inst.Med.trop.S.Paulo第39巻，第1期SaoPauloEne。36]Vanlandschoot等(2005)JGenVirol86:323-31。37]Hilleman(1993)HepatitisBvaccinesinclinicalpractice(臨床實(shí)踐中的乙肝疫第17-40頁(yè)，ISBN0-8247-8780-3。「38]Gerin等(1969)JVirol4:163?！?9]Gerin等(1969)JVirol7:569。[40]Siebke等(1972)ActaPatholMicrobiolScansectB80:935。[41]Pillot等(1976)JClinMicrobiol4:205。[42]Duimel和Krijnen(1972)VoxSang23:249。[43]Neurath等(1974)PNASUSA71:2663。[44]Charm和Wong(1975)BiotechnolBioeng16:593。[45]美國(guó)專利第4,857,317號(hào)。[46]美國(guó)專利第4,683,294號(hào)。[47]Houwen等(Y91S)JImmunolMethods8:185。[48]Sitrin等(1993)HepatitisBvaccinesinclinicalpractice(臨床實(shí)踐中的乙肝疫第83-101頁(yè)，ISBN0-8247-8780-3。[49]Wampler等(1985)PNASUSA82:6830-4。[50]Chi等(1994)AnnNYAcadSci721:365-73。[51]Agraz等(1994)JChromatogrA672:25-33。[52]Mason等(1992)PNASUSA89:11745-9。[53]Demi等(1999)JVirolMethods79:205-17。[54]Ibarra等(1999)JChromatogrBBiomedSciAppl735:271-7。[55]WO90/10058。[56]日本專利申請(qǐng)第JP63239234號(hào)。[57]美國(guó)專利第4,694,074號(hào)。[58]EP-0341733。[59]美國(guó)專利第5,242,812號(hào)。[60]俄羅斯專利申請(qǐng)第RU-2128707號(hào)。[61]Hardy等(2000)JBiotechnol77:157-67。[62]Dogan等(2000)BiotechnolProg16:435-41。[63]Berkower等(2004)Virology321(1):75曙S6。[64]Eckhart等(1996)JGenVirol77:2001-8。[65]vonBrunn等(1991)Vaccine9(7):477-84。[66]Vreden等(1991)AmJTropMedHyg45(5):533陽(yáng)8。[67]Moelans等(1995)MolBiochemParasitol72(1-2):179-92。[68]Stoute等(1997)NEnglJMed336(2):86-91。[69]Wunderlich和delPortillo(2000)MolMed6(3):238-45。[70]美國(guó)專利第5,928,902號(hào)[71]WO93/10152。[72]Nony等(2001)Vaccine27:3645-51。[73]WO02/12287。[74]WO03脇094。[75]Desombere等(1998)TissueAntigens51:593-604。[76]McDermott等(1997)TissueAntigens50:8-14。[77]Traquina等(1996)JInfectDis174:1168-75。權(quán)利要求1.一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟，混合(i)含有表面活性劑的抗原性組分和(ii)脂肪族佐劑組分，得到所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于1000∶1的組合物。2.—種免疫原性組合物，其中(a)所述組合物包含抗原組分和脂肪族佐劑組分；(b)所述抗原組分包含表面活性劑；和(C)所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于1000:1。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑包含可代謝油。4.如權(quán)利要求3所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑包含鯊烯和聚山梨酯80的亞微米水包油乳劑。5.如權(quán)利要求1或2所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑包含含有脂肪酸部分的分子。6.如權(quán)利要求5所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑是3-脫氧酰基化的單磷?；|(zhì)A('3D-MPL')。7.如權(quán)利要求6所述的方法或組合物，其特征在于，所述3D-MPL是?；潭炔煌姆肿拥幕旌衔铩?.如權(quán)利要求6或7所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑包括9.如權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述3D-MPL是顆粒形式。10.如權(quán)利要求9所述的方法或組合物，其特征在于，所述顆?？蛇^(guò)濾除菌。11.如權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述3D-MPL與鋁鹽聯(lián)用。12.如權(quán)利要求ll所述的方法或組合物，其特征在于，所述鋁鹽是磷酸鋁。13.如權(quán)利要求12所述的方法或組合物，其特征在于，所述3D-MPL吸附于所述鋁鹽上。14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述表面活性劑是聚氧乙烯山梨聚糖酯。15.如權(quán)利要求14所述的方法或組合物，其特征在于，所述酯是聚山梨酯20。16.如權(quán)利要求14或15所述的方法或組合物，其特征在于，所述表面活性劑的濃度不高于50嗎/ml。17.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述抗原是病毒表面抗原。18.如權(quán)利要求17所述的方法或組合物，其特征在于，所述抗原是在表面活性劑存在下純化的顆粒乙型肝炎表面抗原('HBsAg')。19.如權(quán)利要求18所述的方法或組合物，其特征在于，所述HBsAg是在酵母細(xì)胞中表達(dá)的。20.如權(quán)利要求19所述的方法或組合物，其特征在于，所述酵母是釀酒酵母。21.如權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述HBsAg是非糖基化的，和/或包括磷脂酰肌醇。22.如權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述HBsAg來(lái)自乙型肝炎病毒的adw2亞型。23.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述抗原是包含病毒表面抗原和異源抗原的雜交蛋白。24.如權(quán)利要求23所述的方法或組合物，其特征在于，所述病毒表面抗原是HBsAg，所述異源抗原是癥疾抗原。25.如權(quán)利要求24所述的方法或組合物，其特征在于，所述雜交蛋白包含HBsAg和惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)孢子體蛋白的片段。26.如權(quán)利要求25所述的方法或組合物，其特征在于，所述雜交蛋白包含惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)孢子體蛋白的C端部分、環(huán)孢子體蛋白優(yōu)勢(shì)免疫區(qū)的四個(gè)或多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列和HBsAg。27.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于500:1。28.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于50:1。29.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述脂肪族佐劑是3D-MPL,所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比為2.5:1-25:1。30.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述組合物的滲透壓為200mOsm/kg-400mOsm/kg。31.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述組合物包含磷酸鹽緩沖液。32.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其特征在于，所述組合物的pH為6.0-7.0。33.(i)包含表面活性劑的抗原組分和(ii)脂肪族佐劑在生產(chǎn)施用于患者的藥物中的應(yīng)用，其中(ii)中所述脂肪族佐劑與(i)中所述表面活性劑的重量比小于1000:1。34.—種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括以下步驟混合(i)含有聚山梨酯20的HBsAg組分和(ii)含有吸附于磷酸鋁的3D-MPL的佐劑組分，得到所述3D-MPL與聚山梨酯20的重量比小于1000:1的組合物。35.—種免疫原性組合物，其中(a)所述組合物含有HBsAg、聚山梨酯20、3D-MPL和磷酸鋁佐劑；和(b)所述3D-MPL與聚山梨酯20的重量比小于1000:1。36.—種制備免疫原性組合物的方法，其中(a)所述組合物包含抗原和脂肪族佐劑；和(b)在不存在表面活性劑的情況下基本純化所述抗原。全文摘要疫苗組合物中包含脂肪族佐劑會(huì)引起難以包含某些抗原性組分，特別是包含表面活性劑組分的抗原。制備含有抗原和脂肪族佐劑的免疫原性組合物的方法包括在不存在表面活性劑的情況下基本純化抗原。不能避免采用表面活性劑時(shí)，混合以下組分(i)含有表面活性劑的抗原組分和(ii)脂肪族佐劑組分，得到所述脂肪族佐劑與所述表面活性劑的重量比小于1000∶1的組合物。文檔編號(hào)A61K39/39GK101267835SQ200680034084公開(kāi)日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年8月2日優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日發(fā)明者M(jìn)·肯托尼申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限公司